RU2814138C1 - Method of co-cultivating of three-dimensional cell cultures of human lower respiratory tract to obtain cellular model for in vitro studies - Google Patents
Method of co-cultivating of three-dimensional cell cultures of human lower respiratory tract to obtain cellular model for in vitro studies Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814138C1 RU2814138C1 RU2023115780A RU2023115780A RU2814138C1 RU 2814138 C1 RU2814138 C1 RU 2814138C1 RU 2023115780 A RU2023115780 A RU 2023115780A RU 2023115780 A RU2023115780 A RU 2023115780A RU 2814138 C1 RU2814138 C1 RU 2814138C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- cultivation
- culture
- mrc5
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 claims abstract description 9
- 210000000424 bronchial epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 7
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 5
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 claims description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 2
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000009343 monoculture Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 231100000512 nanotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, токсикологии и может использоваться для экспресс-тестирования взаимодействия вредных веществ с биологическими объектами при проведении исследований в фармакологических, токсикологических и биологических лабораториях.The invention relates to the field of medicine, toxicology and can be used for rapid testing of the interaction of harmful substances with biological objects when conducting research in pharmacological, toxicological and biological laboratories.
Важной особенностью всех тканей является то, что клетки растут в трех измерениях и находятся в постоянном взаимодействии друг с другом и межклеточной средой. Традиционно используемые культуры клеток представляют собой упрощенные двухмерные модели одного вида клеток. Взаимодействие выбранных клеток в трехмерной совместной культуре имитирует процессы, происходящие в нативной легочной ткани, адекватно отражая воздействие вредных веществ на нижние респираторные пути и респираторный отдел легочной системы. Предполагается, что разрабатываемая совместная сфероидная культура является более чувствительной моделью для проведения токсикологических тестов по сравнению с монокультурой.An important feature of all tissues is that cells grow in three dimensions and are in constant interaction with each other and the intercellular environment. Traditionally used cell cultures are simplified two-dimensional models of a single cell type. The interaction of selected cells in a three-dimensional co-culture mimics the processes occurring in native lung tissue, adequately reflecting the effects of harmful substances on the lower respiratory tract and respiratory part of the pulmonary system. The co-spheroid culture being developed is expected to be a more sensitive model for toxicology testing compared to monoculture.
Способ может быть использован как база для разработки скрининговых тестов в токсикологических лабораториях Роспотребнадзора и других. На данный момент в лабораториях такого типа токсические эффекты различных веществ и материалов исследуются преимущественно на лабораторных животных, что повышает стоимость эксперимента и снижает скорость получения результатов. Кроме этого, предлагаемая модель имитирует респираторный тракт человека, в то время как результаты, полученные на животных, не всегда коррелируют с эффектами в человеческом организме.The method can be used as a basis for the development of screening tests in toxicological laboratories of Rospotrebnadzor and others. At the moment, in laboratories of this type, the toxic effects of various substances and materials are studied mainly on laboratory animals, which increases the cost of the experiment and reduces the speed of obtaining results. In addition, the proposed model simulates the human respiratory tract, while results obtained in animals do not always correlate with effects in the human body.
Известна «Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro, способ получения указанной модели и ее применение для определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия вдыхаемых продуктов» (Патент RU №2772642, МПК C12N 5/071, C12N 5/0784 - 23.05.2022, Бюл. №15), где культивирование четырех типов клеток (альвеолоциты, эндотелиальные клетки, дендритоподобные клетки, макрофагоподобные клетки) в лунке, оснащенной пористой мембраной, разделяющей апикальный и базолатеральный компартменты. Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro может быть использована для определения сенсибилизирующего действия вдыхаемых веществ.Known is “A three-dimensional model of the alveolar lung in vitro, a method for obtaining this model and its use for determining and/or predicting the sensitizing effect of inhaled products” (Patent RU No. 2772642, IPC C12N 5/071, C12N 5/0784 - 05/23/2022, Bull. No. 15), where the cultivation of four types of cells (alveolocytes, endothelial cells, dendritic-like cells, macrophage-like cells) in a well equipped with a porous membrane separating the apical and basolateral compartments. A three-dimensional in vitro model of the alveolar lung can be used to determine the sensitizing effects of inhaled substances.
Недостатком модели является отсутствие фибробластных клеток, играющих основную роль в поддержании целостности структуры легочной ткани путем пролиферации и восстановления поврежденных участков, а также необходимость использования специальных пористых мембран для разделения компартментов.The disadvantage of the model is the absence of fibroblast cells, which play a major role in maintaining the integrity of the lung tissue structure through proliferation and restoration of damaged areas, as well as the need to use special porous membranes to separate compartments.
Известен способ сокультивирования клеточных культур дыхательных путей человека (альвеолоциты, тучные клетки, эндотелиальные клетки, макрофагоподобные клетки) в 3D-условиях, описанные в литературе [Klein SG, Serchi Т, Hoffmann L, Blomeke В, Gutleb AC. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organisation at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Part Fibre Toxicol. 2013; 10:31. Published 2013 Jul 26. doi:10.1186/1743-8977-10-31]. В качестве метода трехмерного сокультивирования в научной статье выбран метод air-liquid interface (ALI, культивирование на границе раздела воздух-жидкость), который позволяет получать клетки с морфологией, релевантной физиологическим условиям.There is a known method for co-cultivating cell cultures of the human respiratory tract (alveolocytes, mast cells, endothelial cells, macrophage-like cells) in 3D conditions, described in the literature [Klein SG, Serchi T, Hoffmann L, Blomeke B, Gutleb AC. An improved 3D tetraculture system mimicking the cellular organization at the alveolar barrier to study the potential toxic effects of particles on the lung. Part Fiber Toxicol. 2013; 10:31. Published 2013 Jul 26. doi:10.1186/1743-8977-10-31]. The air-liquid interface (ALI) method was chosen as a three-dimensional co-culture method in the scientific article, which allows one to obtain cells with a morphology relevant to physiological conditions.
Недостатком описанной модели также является отсутствие фибробластных клеток. Способ культивирования на границе раздела воздух-жидкость требует использования ряда дорогостоящих расходных материалов и реактивов и специальных экспозиционных камер, воспроизводящих контролируемое воздействие аэрозолей на клетки, а также необходимым условием является специальная подготовка оператора.A disadvantage of the described model is also the absence of fibroblast cells. The method of cultivation at the air-liquid interface requires the use of a number of expensive consumables and reagents and special exposure chambers that reproduce the controlled effect of aerosols on cells, and a necessary condition is special training of the operator.
Сфероидные культуры клеток широко используются в области изучения рака как объекты, моделирующие опухоли. В литературе описан способ культивирования сфероидов из двух типов клеточных культур (клетки альвеолярного эпителия и фибробласты) с использованием планшетов с низкоадгезионной поверхностью [Movia D., Prina-Mello A. Nanotoxicity in Cancer Research: Technical Protocols and Considerations for the Use of 3D Tumour Spheroids // Unraveling the Safety Profile of Nanoscale Particles and Materials. Chapter 5. Edited by Gomes A.C., Sarria M.P. IntechOpen. 2017]. Данный способ был разработан авторами в качестве подхода для получения модели, отражающей взаимодействие опухолевых клеток с близлежащими здоровыми стромальными тканями. Формировали сфероиды клеток аденокарциномы человека А549 путем центрифугирования 1 мл клеточной суспензии в концентрации 1×106 клеток/мл и перемещения клеточного осадка в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью. Совместную культуру получали наслаиванием четырехдневных сфероидов опухолевых клеток А549 на монослой фибробластов MRC5-SV40. Недостатком описанного способа является использование монослойных клеток в сочетании со сфероидами, из-за чего не достигается морфология фибробластов, характерная для условий in vivo.Spheroid cell cultures are widely used in the field of cancer research as tumor modeling objects. The literature describes a method for culturing spheroids from two types of cell cultures (alveolar epithelial cells and fibroblasts) using plates with a low-adhesive surface [Movia D., Prina-Mello A. Nanotoxicity in Cancer Research: Technical Protocols and Considerations for the Use of 3D Tumor Spheroids // Unraveling the Safety Profile of Nanoscale Particles and Materials. Chapter 5. Edited by Gomes AC, Sarria MP IntechOpen. 2017]. This method was developed by the authors as an approach to obtain a model reflecting the interaction of tumor cells with nearby healthy stromal tissues. Spheroids of human adenocarcinoma A549 cells were formed by centrifuging 1 ml of cell suspension at a concentration of 1×10 6 cells/ml and moving the cell sediment into the well of a 96-well plate with a low-adhesive surface. A co-culture was obtained by layering four-day-old spheroids of A549 tumor cells onto a monolayer of MRC5-SV40 fibroblasts. The disadvantage of the described method is the use of monolayer cells in combination with spheroids, which is why fibroblast morphology characteristic of in vivo conditions is not achieved.
Наиболее близким подходом, принятым за прототип, является способ сокультивирования эпителиоподобных клеток аденокарциномы протоков молочной железы человека MCF-7 с фибробластами легких MRC5-SV40 в 96-луночных планшетах с поверхностью, покрытой 1% агарозой, также описанный в литературе [Yakavets, I., Francois, A., Benoit, A. et al. Advanced co-culture 3D breast cancer model for investigation of fibrosis induced by external stimuli: optimization study. Sci Rep 10, 21273 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78087-7]. Целью авторов было создание сфероидной модели опухоли молочной железы, в соответствии с которой были подобраны клеточные линии и их соотношение и засевные условия. Засевали MCF-7 в концентрации 1000 или 2500 клеток/лунку и через 24 часа добавляли фибробласты MRC5-SV40 в соотношении 1:1 или 1:3 по сравнению с количеством эпителиальных клеток. В данном способе использованы опухолевые клетки аденокарциномы протоков молочной железы, из-за чего подход не подходит для оценки взаимодействия вредных веществ с дыхательной системой человека.The closest approach adopted for the prototype is the method of co-cultivation of epithelial-like human mammary ductal adenocarcinoma cells MCF-7 with lung fibroblasts MRC5-SV40 in 96-well plates with a surface coated with 1% agarose, also described in the literature [Yakavets, I., Francois, A., Benoit, A. et al. Advanced co-culture 3D breast cancer model for investigation of fibrosis induced by external stimuli: optimization study. Sci Rep 10, 21273 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-78087-7]. The authors' goal was to create a spheroid model of a breast tumor, according to which cell lines and their ratio and seeding conditions were selected. MCF-7 was seeded at a concentration of 1000 or 2500 cells/well and after 24 hours MRC5-SV40 fibroblasts were added at a ratio of 1:1 or 1:3 compared to the number of epithelial cells. This method uses tumor cells of mammary ductal adenocarcinoma, which is why the approach is not suitable for assessing the interaction of harmful substances with the human respiratory system.
Задачей заявленного изобретения является получение трехмерной модели клеточных культур нижних дыхательных путей человека, состоящей из двух типов клеток, а именно клеток бронхиального эпителия и фибробластов легких, с применением планшетов с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном для дальнейшего использования в токсикологических лабораториях для тестирования взаимодействия вредных веществ с биологическими объектами.The objective of the claimed invention is to obtain a three-dimensional model of cell cultures of the human lower respiratory tract, consisting of two types of cells, namely bronchial epithelial cells and lung fibroblasts, using plates with a low-adhesive surface and a round bottom for further use in toxicology laboratories for testing the interaction of harmful substances with biological objects.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение трехмерной сфероидной модели клеточных культур нижних дыхательных путей человека, состоящей из клеток бронхиального эпителия и фибробластов легких.The technical result of the claimed invention is the production of a three-dimensional spheroid model of cell cultures of the human lower respiratory tract, consisting of bronchial epithelial cells and lung fibroblasts.
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что для получения трехмерной сфероидной модели трехмерных клеточных культур нижних дыхательных путей человека проводят монослойное культивирование неопухолевых клеточных линий бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40 в культуральных чашках в 7,5 мл питательной среды DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков пенициллина и стрептомицина в течение 2-4 пассажей, далее по достижении 80-90% конфлентности клеточного монослоя проводят пересев клеток в 96-луночные планшеты с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном, для чего отбирают кондиционированную культуральную среду из культуральных чашек с монослоем выбранных клеток, промывают чашку 4 мл фосфатно-солевого раствора Дульбекко, добавляют 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25% на чашку и инкубируют при 37°С в течение 3-5 минут для культуры BEAS-2B и в течение 5-6 минут для культуры MRC5-SV40, нейтрализуют ферментативную реакцию добавлением культуральной среды ДМЕМ из расчета 4 мл на чашку, собирают суспензии клеток в соответствующие центрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 оборотов в минуту в течение 3 минут, аспирируют надосадочную жидкость и добавляют 2 мл культуральной среды для ресуспендирования, проводят подсчет жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим на счетчике клеток, при жизнеспособности клеток не менее 70% готовят суспензии обоих типов с концентрацией 0,3×105 жизнеспособных клеток/мл и добавляют в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью 100 мкл суспензии, содержащей 3000 клеток в соотношении клеток бронхиального эпителия BEAS-2B и фибробластов легких MRC5-SV40 1:2 (33 мкл и 67 мкл полученных суспензий клеток BEAS-2B и MRC5-SV40, соответственно), планшет помещают в инкубатор при условиях 37°С, 5% CO2 и постоянной влажности, клетки формируют характерные плотные сфероиды без некротического ядра с диаметром 30-40 мкм уже через 24 часа культивирования, через 48-72 часа культивирования добавляют 50 мкл культуральной среды DMEM для сохранения количества жизнеспособных клеток выше 70% до 120-144 часов культивирования.The technical result of the claimed invention is achieved due to the fact that to obtain a three-dimensional spheroid model of three-dimensional cell cultures of the human lower respiratory tract, monolayer cultivation of non-tumor cell lines of bronchial epithelium BEAS-2B and lung fibroblasts MRC5-SV40 is carried out in culture dishes in 7.5 ml of DMEM nutrient medium with the addition of 10% fetal calf serum and the antibiotics penicillin and streptomycin for 2-4 passages, then, upon reaching 80-90% confluence of the cell monolayer, the cells are reseeded into 96-well plates with a low-adhesive surface and a round bottom, for which a conditioned culture medium is selected from culture dishes with a monolayer of selected cells, wash the dish with 4 ml of Dulbecco's phosphate saline solution, add 1 ml of trypsin-EDTA solution 0.25% per dish and incubate at 37°C for 3-5 minutes for BEAS-2B culture and in for 5-6 minutes for the MRC5-SV40 culture, neutralize the enzymatic reaction by adding DMEM culture medium at the rate of 4 ml per dish, collect cell suspensions in appropriate centrifuge tubes and centrifuge at 1000 rpm for 3 minutes, aspirate the supernatant and add 2 ml of culture medium for resuspension, count viable cells after staining with trypan blue on a cell counter, with cell viability of at least 70%, prepare suspensions of both types with a concentration of 0.3×10 5 viable cells/ml and add to the well of a 96-well plate with low-adhesive surface of 100 μl of a suspension containing 3000 cells in a ratio of bronchial epithelial cells BEAS-2B and lung fibroblasts MRC5-SV40 1:2 (33 μl and 67 μl of the resulting suspensions of BEAS-2B and MRC5-SV40 cells, respectively), the plate is placed in an incubator under conditions of 37°C, 5% CO2 and constant humidity, cells form characteristic dense spheroids without a necrotic core with a diameter of 30-40 µm after 24 hours of cultivation; after 48-72 hours of cultivation, 50 µl of DMEM culture medium is added to maintain the number of viable cells above 70% up to 120-144 hours of cultivation.
Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи.The set of essential features provides a solution to the stated technical problem.
Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:Details, features, and advantages of the present invention follow from the following description of the implementation of the claimed technical solution using the drawings, which show:
Фиг. 1 - конфокальная микроскопия сфероидов совместной клеточной культуры BEAS-2B и MRC5-SV40 через 72 часа культивирования в засевной концентрации 3000 клеток в соотношении 1:2. Окрашивание Syto9/propidium iodide (live/dead - зеленые/красные);Fig. 1 - confocal microscopy of spheroids of a joint cell culture of BEAS-2B and MRC5-SV40 after 72 hours of cultivation at a seeding concentration of 3000 cells in a 1:2 ratio. Syto9/propidium iodide staining (live/dead - green/red);
Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.
Для получения сфероидов используются клетки неопухолевой природы бронхиального эпителия человека BEAS-2B и фибробласты легких человека MRC5-SV40.To obtain spheroids, non-tumor human bronchial epithelial cells BEAS-2B and human lung fibroblasts MRC5-SV40 are used.
Культивирование выбранных клеточных линий проводили в CO2-инкубаторе при стандартных условиях: 37°С, 5% CO2, постоянная влажность. Монослойные клетки культивировали в течение 2-4 пассажей в стандартных культуральных чашках (100 мм × 20 мм, Servicebio, Китай) в 7,5 мл культуральной среды DMEM с глутамином, с содержанием глюкозы 4,5 г/л, с пируватом натрия (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (BioSera, Южная Америка) и антибиотиков пенициллина и стрептомицина (25000 Ед и 25000 мкг, 100-кратный лиофилизированный препарат, ПанЭко, Россия).Cultivation of selected cell lines was carried out in a CO2 incubator under standard conditions: 37°C, 5% CO2, constant humidity. Monolayer cells were cultured for 2-4 passages in standard culture dishes (100 mm × 20 mm, Servicebio, China) in 7.5 ml of DMEM culture medium with glutamine, with a glucose content of 4.5 g/l, with sodium pyruvate (PanEco , Russia) with the addition of 10% fetal calf serum (BioSera, South America) and the antibiotics penicillin and streptomycin (25,000 U and 25,000 mcg, 100-fold lyophilized preparation, PanEco, Russia).
На 2-4 пассаже по достижении 80-90%) конфлюэнтности клеточного монослоя проводили пересев клеток в 96-луночные планшеты из полистирола с низкоадгезионной поверхностью и круглым дном (SPL3D™ Cell Floater, SPL Life Sciences, Южная Корея). Кондиционированную культуральную среду полностью отбирали пипеткой, промывали чашку 4 мл стерильного фосфатно-солевого раствора Дульбекко с солями кальция и магния (ПанЭко, Россия). Добавляли 1 мл раствора трипсина-ЭДТА 0,25% (ПанЭко, Россия) на чашку и инкубировали при 37°С в течение 3-5 минут для культуры BEAS-2B и в течение 5-6 минут для культуры MRC5-SV40 под контролем микроскопа. Добавляли культуральную среду для нейтрализации ферментативной реакции трипсина-ЭДТА из расчета 4 мл на чашку. Собирали суспензии клеток в соответствующие центрифужные пробирки и помещали в центрифугу на 3 минуты при 1000 оборотов в минуту. Аспирировали надосадочную жидкость из центрифужных пробирок. Добавляли 2 мл культуральной среды для ресуспендирования. Смешивали 10 мкл полученной суспензии клеток и 10 мкл красителя трипанового синего. Проводили автоматический подсчет жизнеспособных клеток после окрашивания трипановым синим (Bio-Rad, США) с использованием счетчика клеток (С100, RWD Life Science, Китай)). Жизнеспособность клеток должна быть не менее 70%.At passages 2-4, upon reaching 80-90%) confluency of the cell monolayer, cells were reseeded into 96-well polystyrene plates with a low-adhesive surface and a round bottom (SPL3D™ Cell Floater, SPL Life Sciences, South Korea). The conditioned culture medium was completely removed with a pipette, and the dish was washed with 4 ml of sterile Dulbecco's phosphate saline solution with calcium and magnesium salts (PanEco, Russia). 1 ml of trypsin-EDTA solution 0.25% (PanEko, Russia) was added per dish and incubated at 37°C for 3-5 minutes for the BEAS-2B culture and for 5-6 minutes for the MRC5-SV40 culture under microscope control . Culture medium was added to neutralize the trypsin-EDTA enzymatic reaction at a rate of 4 ml per plate. Cell suspensions were collected into appropriate centrifuge tubes and placed in a centrifuge for 3 minutes at 1000 rpm. The supernatant was aspirated from centrifuge tubes. 2 ml of culture medium was added for resuspension. 10 μl of the resulting cell suspension and 10 μl of trypan blue dye were mixed. Viable cells were automatically counted after staining with trypan blue (Bio-Rad, USA) using a cell counter (C100, RWD Life Science, China). Cell viability should be at least 70%.
С учетом количества жизнеспособных клеток, проводили расчеты и готовили суспензии клеток двух типов с концентрацией 0,3×105 жизнеспособных клеток/мл, что соответствует концентрации 3000 клеток на 100 мкл культуральной среды в лунке. Добавляли 33 мкл и 67 мкл полученных суспензий клеток BEAS-2B и MRC5-SV40, соответственно, в лунку 96-луночного планшета с низкоадгезионной поверхностью, что соответствовало засевному соотношению клеток BEAS-2B и MRC5-SV40 1:2 (Фиг. 1). Планшет помещали в инкубатор при условиях 37°С, 5% CO2 и постоянной влажности, сфероиды начинали формироваться через 24 часа культивирования. Клетки формировали характерные плотные сфероиды без некротического ядра с диаметром 30-40 мкм. При добавлении 50 мкл культуральной среды DMEM через 48-72 часа культивирования сфероиды сохраняли количество жизнеспособных клеток выше 70% до 120-144 часов культивирования (Фиг. 1).Taking into account the number of viable cells, calculations were carried out and suspensions of two types of cells were prepared with a concentration of 0.3×10 5 viable cells/ml, which corresponds to a concentration of 3000 cells per 100 μl of culture medium in a well. 33 μl and 67 μl of the resulting suspensions of BEAS-2B and MRC5-SV40 cells, respectively, were added to the well of a 96-well plate with a low-adhesive surface, corresponding to a seeding ratio of BEAS-2B and MRC5-SV40 cells of 1:2 (Fig. 1). The plate was placed in an incubator under conditions of 37°C, 5% CO2 and constant humidity, spheroids began to form after 24 hours of cultivation. The cells formed characteristic dense spheroids without a necrotic core with a diameter of 30-40 µm. When 50 μl of DMEM culture medium was added after 48-72 hours of culture, the spheroids maintained viable cell counts above 70% until 120-144 hours of culture (Figure 1).
При проведении токсикологических экспериментов добавление изучаемых веществ или материалов может быть осуществлено на 2-3 день культивирования со временем экспозиции до 72 часов.When conducting toxicological experiments, the addition of the studied substances or materials can be carried out on the 2-3rd day of cultivation with an exposure time of up to 72 hours.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2814138C1 true RU2814138C1 (en) | 2024-02-22 |
Family
ID=
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU563436A1 (en) * | 1975-09-05 | 1977-06-30 | Институт биологической физики | Method of cultivating cells of animal tissue |
| RU2563347C2 (en) * | 2013-06-11 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук | Method of cultivating stem cells, preventing their spontaneous differentiation (versions) |
| RU2665793C2 (en) * | 2012-07-24 | 2018-09-04 | Ниссан Кемикал Индастриз, Лтд. | Composition of the culture medium and method of culturing of the cell or tissue using the specified composition |
| RU2724956C1 (en) * | 2019-10-29 | 2020-06-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" | Method of cell co-cultivation for formation of an in vitro model of the hematoencephalic barrier |
| RU2731314C1 (en) * | 2019-10-30 | 2020-09-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for production of spheroids for cartilage repair |
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU563436A1 (en) * | 1975-09-05 | 1977-06-30 | Институт биологической физики | Method of cultivating cells of animal tissue |
| RU2665793C2 (en) * | 2012-07-24 | 2018-09-04 | Ниссан Кемикал Индастриз, Лтд. | Composition of the culture medium and method of culturing of the cell or tissue using the specified composition |
| RU2563347C2 (en) * | 2013-06-11 | 2015-09-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук | Method of cultivating stem cells, preventing their spontaneous differentiation (versions) |
| RU2724956C1 (en) * | 2019-10-29 | 2020-06-29 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" | Method of cell co-cultivation for formation of an in vitro model of the hematoencephalic barrier |
| RU2731314C1 (en) * | 2019-10-30 | 2020-09-01 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Центр Медицинских Исследований И Разработок" (Ооо "Мц Миир") | Method for production of spheroids for cartilage repair |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5725560B2 (en) | Cell evaluation system using cell sheet and method of using the same | |
| US11920163B2 (en) | Method for culturing a subpopulation of circulating epithelial tumour cells from a body fluid | |
| US20140154735A1 (en) | Tumour cell and tissue culture | |
| US20230407266A1 (en) | Primary culture method | |
| US20090325216A1 (en) | Process for the Preparation of Multicellular Spheroids | |
| CN111040997A (en) | Prostate cancer organoid culture and cryopreservation method with tumor immune microenvironment | |
| JP6953894B2 (en) | Three-dimensional liver tissue structure and its manufacturing method | |
| CN106676074B (en) | Method for in-vitro amplification of liver cancer stem cells | |
| RU2814138C1 (en) | Method of co-cultivating of three-dimensional cell cultures of human lower respiratory tract to obtain cellular model for in vitro studies | |
| CN116904545A (en) | High-content lung injury evaluation system based on human lung organoids | |
| CN110499279B (en) | Method for inducing human urinary stem cells to differentiate into liver cells | |
| EP2739971A1 (en) | In vitro tumor metastasis model | |
| CN106754753B (en) | Virus culture method | |
| Thiel et al. | Efficient Transfection of Primary Cells Relevant for Cardiovascular Research by nucleofection® | |
| CN114214282A (en) | Method for culturing lung tumor organoid | |
| CN109897817B (en) | Method for separating immune cells and application thereof | |
| CN113957053A (en) | Method for screening traditional Chinese medicine active ingredients of anti-intestinal cancer stem cells by using human intestinal cancer organoid | |
| CN114214284B (en) | Method for culturing kidney tumor organoids | |
| Xie et al. | Cell repelling agar@ paper interface assisted probing of the tumor spheroids infiltrating natural killer cells | |
| LU505383B1 (en) | Microfluidic chip for screening migration of mesenchymal stem cell (msc) to tumor, and preparation method and use method thereof | |
| CN113999812B (en) | Malignant transformant of mouse embryo fibroblast and application thereof | |
| WO2024034576A1 (en) | Method for culturing cancer organoid and method for screening test substance | |
| CN1471586A (en) | Ex vivo generation of functional leukemia cells in a three-dimensional bioreactor | |
| CN114634964A (en) | Method for screening breast cancer targeted drugs | |
| CN117511875A (en) | Kit for constructing tumor model, tumor model and construction method of tumor model |