RU2563347C2 - Method of cultivating stem cells, preventing their spontaneous differentiation (versions) - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: inventions relate to field of cell biology, pharmacology and medicine. Described method of cultivating stem cells, which includes their spontaneous differentiation. Method includes preparation of pectin solution with concentration to 5% and etherification degree not higher than 50%; its application on base, formation of pectin matrix is carried out in presence of solution of cross-linking agent of ionic type. As solution of cross-linking agent of ionic type composition is used, which contains soluble calcium salt, sodium chloride, and buffer system based on components, which are non-toxic for cells. Introduction after application of pectin solution on base of additional operations for removal of pectin excess, washing base and its drying makes it possible to form matrix of different thickness from hydrogel layer to thin film. Different bases can be used in method as substrate. In other version of method implementation pectin solution with concentration to 5% and etherification degree not higher than 50%, prepared on isotonic solution is used. Introduction of cell culture is performed before matrix formation with further mixing; cross-linking agent of ionic type (CLA), prepared on isotonic solution, is then added to obtained mixture with further mixing. Said version of method implementation makes it possible to more largely approach process of cell cultivation to natural conditions, under which cells are in three-dimensional surrounding by extracellular matrix molecules.

EFFECT: claimed methods considerably extend versions of their application in cell technologies as they make it possible to obtain coatings of various thickness and structure on surfaces of different types.

10 cl, 7 dwg, 10 ex

Description

Изобретения относятся к области клеточной биологии, фармакологии и медицины, в частности к способам культивирования стволовых клеток, исключающим их спонтанную дифференцировку и позволяющим получать культуры, обогащенные мультипотентными клетками для последующего их применения в клеточной терапии широкого круга заболеваний, и может быть использовано как в научных исследованиях, так и в медицине.The invention relates to the field of cell biology, pharmacology and medicine, in particular to methods for culturing stem cells that exclude their spontaneous differentiation and allow to obtain cultures enriched with multipotent cells for their subsequent use in cell therapy of a wide range of diseases, and can be used in scientific research so in medicine.

Стволовые клетки используются в научно-исследовательских целях в качестве моделей и в практических целях в медицине для лечения заболеваний и травм, при которых организм не в состоянии самостоятельно восстановить утраченные ткани и органы. В обоих случаях, прежде чем применять культуру стволовых клеток, требуется нарастить определенную биомассу клеток, обладающих сходным фенотипом и мультипотентными свойствами. На данном этапе основным препятствующим фактором является спонтанная дифференцировка клеток, которые прикрепляются к подложке, распластываются и приобретают черты определенного типа клеток, теряя способность к дифференцировке в другие типы. Поиск веществ и условий культивирования стволовых клеток (способов), препятствующих их спонтанной дифференцировке, является актуальной задачей современной клеточной биологии и медицины.Stem cells are used for research purposes as models and for practical purposes in medicine for the treatment of diseases and injuries in which the body is not able to independently repair the lost tissues and organs. In both cases, before applying the stem cell culture, it is required to increase a certain biomass of cells with a similar phenotype and multipotent properties. At this stage, the main obstacle is the spontaneous differentiation of cells that attach to the substrate, spread out and acquire features of a certain type of cells, losing the ability to differentiate into other types. The search for substances and conditions for the cultivation of stem cells (methods) that impede their spontaneous differentiation is an urgent task of modern cell biology and medicine.

Первым подходом для стимуляции стволовых клеток к размножению было культивирование на фидерном слое фибробластов (Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts //Science. 1998. Vol.282 (5391). P. 1145-1147). Известный метод позволяет получать быстро пролиферирующие культуры стволовых клеток, в том числе эмбриональных стволовых клеток, исключая их спонтанную дифференцировку. Однако использование дополнительных клеточных линий создает определенные трудности. Системы сокультивирования увеличивают издержки производства и малопригодны для крупномасштабного культивирования. К тому же необходимы отделение и очистка стволовых клеток от клеток-фидеров.The first approach to stimulate stem cells to propagate was to cultivate fibroblasts on the feeder layer ( Thomson JA ., Itskovitz-Eldor J. , Shapiro SS ., Waknitz MA ., Swiergiel JJ ., Marshall VS. , Jones JM . Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. Vol. 282 (5391). P. 1145-1147). The known method allows to obtain rapidly proliferating cultures of stem cells, including embryonic stem cells, excluding their spontaneous differentiation. However, the use of additional cell lines creates certain difficulties. Co-cultivation systems increase production costs and are not suitable for large-scale cultivation. In addition, separation and purification of stem cells from feeder cells are necessary.

Последующие исследования были направлены на разработку методов культивирования плюрипотентных стволовых клеток с сохранением их недифференцированного состояния и плюрипотентности без использования клеток-фидеров. Известен способ культивирования эмбриональных стволовых клеток на поверхности Матригеля или ламинина с добавлением среды, кондиционированной клетками МЭФ (мышиные эмбриональные фибробласты), что способствует длительному культивированию эмбриональных стволовых клеток человека с сохранением их недифференцированного состояние и плюрипотентности (Xu C., Inokuma M.S., Denham J., Golds K., Kundu P., Gold J.D., Carpenter M.K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells //Nature. 2001. Vol.19. P/971-974; WO 01/51616, МПК C12N 15/09, C12 15/10, опубл. 19.07.2001). В данном способе культивирования не используются клетки-фидеры, поэтому не требуется отделение вспомогательной линии (МЭФ) на заключительном этапе. Однако использование продукта жизнедеятельности животных клеток для культивирования клеток человека нежелательно вследствие опасности загрязнения инфекционными агентами и антигенами. Матригель, используемый в данном способе в качестве подложки для культивирования, является матриксом, получаемым из опухолевых клеток (BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix) и никогда не будет допущен к применению в области регенеративной медицины из-за его потенциальных канцерогенных свойств.Subsequent studies were aimed at developing methods for culturing pluripotent stem cells while maintaining their undifferentiated state and pluripotency without the use of feeder cells. A known method of culturing embryonic stem cells on the surface of Matrigel or laminin with the addition of medium conditioned with MEF cells (mouse embryonic fibroblasts), which contributes to the long-term cultivation of human embryonic stem cells while maintaining their undifferentiated state and pluripotency (Xu C., Inokuma MS, Denham J. , Golds K., Kundu P., Gold JD, Carpenter MK Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells // Nature. 2001. Vol.19. P / 971-974; WO 01/51616, IPC C12N 15/09 C12 15/10, published July 19, 2001). In this cultivation method, feeder cells are not used, therefore, separation of the auxiliary line (MEF) at the final stage is not required. However, the use of animal waste products for the cultivation of human cells is undesirable due to the risk of contamination with infectious agents and antigens. The matrix used in this method as a substrate for cultivation is a matrix obtained from tumor cells (BD Matrigel ™ Basement Membrane Matrix) and will never be approved for use in the field of regenerative medicine because of its potential carcinogenic properties.

Известно несколько способов культивирования стволовых клеток, препятствующих их спонтанной дифференцировке, заключающихся в применении комбинации различных ростовых факторов, добавляемых в питательную среду. Одним из них является способ культивирования эмбриональных стволовых клеток в бессывороточной среде, содержащей фактор роста bFGF/FGF-2 или фактор стволовых клеток (далее называемый SCF) (WO 03/020920, МПК A61K 35/12, A61P 43/00, C12N 5/00, опубл. 13.03.2003). Недостатком данного метода является тот факт, что способ позволяет получать культуры, в которых максимум содержится 70% недифференцированных клеток.There are several methods for culturing stem cells that prevent their spontaneous differentiation, which include the use of a combination of various growth factors added to the nutrient medium. One of them is a method for culturing embryonic stem cells in a serum-free medium containing growth factor bFGF / FGF-2 or stem cell factor (hereinafter referred to as SCF) (WO 03/020920, IPC A61K 35/12, A61P 43/00, C12N 5 / 00, published on March 13, 2003). The disadvantage of this method is the fact that the method allows to obtain cultures in which the maximum contains 70% of undifferentiated cells.

Также сообщалось о способе поддержания недифференцированного состояния эмбриональных стволовых клеток человека добавлением bFGF/FGF-2 и антагониста костного морфогенетического белка Noggin (Xu R., Peck R.M., Li D.S., Feng X., Ludwig T., Thomson J.A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells //Nature methods. 2005. Vol.2(3). P. 185-190).A method was also reported for maintaining the undifferentiated state of human embryonic stem cells by adding bFGF / FGF-2 and a bone marrow morphogenetic protein antagonist Noggin (Xu R., Peck RM, Li DS, Feng X., Ludwig T., Thomson JA Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells // Nature methods. 2005. Vol. 2 (3). P. 185-190).

Отдельно было показано, что простое добавление ингибитора гликогенсинтазы-киназы (GSK)-3 к культуральной среде может эффективно поддерживать недифференцированное состояние эмбриональных стволовых клеток мыши и человека без добавления факторов роста или подобных им и без использования клеток-фидеров (Sato N., Meijer L., Skaltsounis L., Greengard P., Brivanlou A.H. Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor //Nature Med. 2004. Vol.10 (1). P. 55-63).It has been separately shown that the simple addition of a glycogen synthase kinase inhibitor (GSK) -3 to the culture medium can effectively maintain the undifferentiated state of mouse and human embryonic stem cells without adding growth factors or the like and without using feeder cells (Sato N., Meijer L ., Skaltsounis L., Greengard P., Brivanlou AH Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor // Nature Med. 2004. Vol.10 (1). P. 55-63).

Известны также другие способы поддержания недифференцированного состояния стволовых клеток, в том числе гемопоэтических стволовых клеток, основанные на активации или ингибировании того или иного сигнального пути. Например, воздействие лиганда сигнального пути Notch (delta-like protein) в виде растворенного фактора либо иммобилизованного на подложке или стромальных клетках, ингибирует дифференцировку гемопоэтических и других типов стволовых клеток (EP1004669A1, МПК С07K 14/475, C12N 15/19, опубл. 31.05.2005; US6613565, МПК А61K 38/00, А61K 38/18, 02.09.2003). Однако в патенте EP1004669A1 указано, что таким образом ингибируется не только дифференцировка клеток, но и пролиферация, что нежелательно на этапах наращивания культуры.Other methods are also known for maintaining an undifferentiated state of stem cells, including hematopoietic stem cells, based on the activation or inhibition of one or another signaling pathway. For example, exposure to a Notch signaling pathway ligand (delta-like protein) in the form of a dissolved factor or immobilized on a substrate or stromal cells inhibits the differentiation of hematopoietic and other types of stem cells (EP1004669A1, IPC C07K 14/475, C12N 15/19, publ. 31.05 .2005; US6613565, IPC A61K 38/00, A61K 38/18, 09/02/2003). However, in the patent EP1004669A1 it is indicated that in this way not only the differentiation of cells, but also proliferation is inhibited, which is undesirable at the stages of culture growth.

Аналогом также может служить и инозитол-3-фосфатный путь, причем одни авторы описывают способ культивирования стволовых клеток, предполагающий ингибирование инозитол-3-фосфат киназы совместно с воздействием ростового фактора TGFβ (US20070281355, МПК C12N 5/0735, опубл. 06.12.2007), другие ограничиваются только ингибитором инозитол-3-фосфат киназы (US20050054103, МПК C12N 15/85, C12N 501/405, опубл. 10.03.2005). Еще одна группа исследователей предлагает применение ингибитора фосфотензина (PTEN) и вышеупомянутой гликогенсинтазы-киназы (GSK)-3 для поддержания недифференцированного состояния и пролиферации стволовых клеток (US20120309088, МПК C12N 5/071, C12N 5/0789, опубл. 06.12.2012). Есть данные о том, что фосфотензин (PTEN) является антионкогеном (Leslie N.R., K Downes C.P. PTEN function: how normal cells control it and tumour cells lose it //Biochem J. 2004. Vol.382. P. 1-11), следовательно, ингибирование этого фактора может повысить риск канцерогенеза.The inositol-3-phosphate pathway can also serve as an analogue, with some authors describing a method for stem cell cultivation involving the inhibition of inositol-3-phosphate kinase in conjunction with the growth factor TGFβ (US20070281355, IPC C12N 5/0735, publ. December 6, 2007) , others are limited only by an inhibitor of inositol-3-phosphate kinase (US20050054103, IPC C12N 15/85, C12N 501/405, publ. 10.03.2005). Another group of researchers proposes the use of a phosphotensin inhibitor (PTEN) and the aforementioned glycogen synthase kinase (GSK) -3 to maintain an undifferentiated state and stem cell proliferation (US20120309088, IPC C12N 5/071, C12N 5/0789, published 06.12.2012). There is evidence that phosphotensin (PTEN) is an anti-oncogen ( Leslie NR, K Downes CP PTEN function: how normal cells control it and tumor cells lose it // Biochem J. 2004. Vol.382. P. 1-11), therefore, inhibition of this factor may increase the risk of carcinogenesis.

Как видно из представленных данных, большинство способов ингибирования спонтанной дифференцировки и экспансии стволовых клеток основаны на модулировании сигнальными путями в клетке. Несмотря на позитивные результаты, полученные исследователями в экспериментах, такие подходы могут привести к неконтролируемым результатам на практике. Несмотря на активное изучение механизмов передачи сигналов в клетке и большой массив накопленных данных, внутриклеточный сигналинг, по-прежнему, остается не до конца изученным. Воздействие, на какой либо компонент сигнального пути приводит к запуску каскада реакций, которые впоследствии могут привести к нежелательным результатам.As can be seen from the data presented, most methods of inhibiting spontaneous differentiation and expansion of stem cells are based on modulation of signaling pathways in the cell. Despite the positive results obtained by the researchers in the experiments, such approaches can lead to uncontrolled results in practice. Despite an active study of the mechanisms of signal transmission in the cell and a large array of accumulated data, intracellular signaling, as before, remains not fully understood. Exposure to any component of the signaling pathway leads to the launch of a cascade of reactions that can subsequently lead to undesirable results.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению по технической сущности и достигаемому результату является способ культивирования стволовых клеток, исключающий спонтанную дифференцировку нейральных стволовых клеток в культуре путем культивирования их на поверхности агарозного геля (Zheng X., Yang X., Liu W., Shen G., Pan D., Luo M. A novel method for culturing neural stem cells //In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal (2007) 43:155-158). Данный способ предполагает покрытие культуральной посуды гелем на основе агарозы, относящейся к классу полисахаридов.Closest to the claimed technical solution according to the technical essence and the achieved result is a method of culturing stem cells, excluding spontaneous differentiation of neural stem cells in culture by culturing them on the surface of an agarose gel (Zheng X., Yang X., Liu W., Shen G., Pan D., Luo M. A novel method for culturing neural stem cells // In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal (2007) 43: 155-158). This method involves coating the culture dishes with gel based on agarose, which belongs to the class of polysaccharides.

Способ осуществлялся следующим образом: 1 грамм агарозы смешивали с 70 мл фосфатно-солевого буфера и автоклавировали, полученный раствор, охлажденный до 70°C, разливали в полистироловые культуральные флаконы (25 см²) так, чтобы покрыть дно флакона. После формирования геля добавляли 5 мл среды DMEM/F12 (1:1, Gibco, Grand Island, NY). Через 2 часа посуда была готова для культивирования.The method was carried out as follows: 1 gram of agarose was mixed with 70 ml of phosphate-buffered saline and autoclaved, the resulting solution cooled to 70 ° C was poured into polystyrene culture bottles (25 cm ² ) so as to cover the bottom of the bottle. After gel formation, 5 ml of DMEM / F12 medium (1: 1, Gibco, Grand Island, NY) was added. After 2 hours, the dishes were ready for cultivation.

Нейральные стволовые клетки, изолированные из гиппокампа новорожденных крыс, высевали во флаконы, покрытые агарозой, в количестве 5×10⁶/мл. Культуральная среда включала следующие компоненты: среда DMEM/F12, добавка B27 (1:50, Gibco), человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор роста ЭФР (20 нг/мл, Gibco), основной фактор роста фибробластов ФРФ (20 нг/мл, Gibco). Среду меняли каждые 2-3 дня. Пассаж осуществляли через неделю. Отделяли нейросферы, инкубировали в ФСБ, содержащем 0,05% трипсин и 0,012% ЭДТА в течение 30 мин. Затем пипетированием дезагрегировали нейросферы, центрифугировали клеточную суспензию и высевали клетки той же плотностью. Нейральные стволовые клетки, культивируемые на поверхности агарозного геля, сохраняли округлую морфологию, сохраняя при этом приемлемый уровень пролиферации, не отличимый от контрольной культуры. 99,36% клеток в культуре оставались нестин-позитивными в течение 3 месяцев культивирования, что свидетельствовало о сохранении их статуса нейральных стволовых клеток. Также клетки сохраняли свойство мультипотентности - при переводе культуры в условия, стимулирующие дифференцировку, нейральные стволовые клетки дифференцировались в нейроны и глиальные клетки.Neural stem cells isolated from the hippocampus of newborn rats were seeded in agarose-coated vials in an amount of 5 × 10 ⁶ / ml. The culture medium included the following components: DMEM / F12 medium, supplement B27 (1:50, Gibco), human recombinant epidermal growth factor EGF (20 ng / ml, Gibco), the main growth factor fibroblast growth factor (20 ng / ml, Gibco). The environment was changed every 2-3 days. Passage was carried out after a week. Neurospheres were separated, incubated in PBS containing 0.05% trypsin and 0.012% EDTA for 30 minutes. Then, neurospheres were disaggregated by pipetting, the cell suspension was centrifuged, and the cells were seeded with the same density. Neural stem cells cultured on the surface of the agarose gel maintained a rounded morphology, while maintaining an acceptable level of proliferation, indistinguishable from a control culture. 99.36% of the cells in the culture remained nestin-positive for 3 months of cultivation, which indicated the preservation of their status of neural stem cells. Also, the cells retained the multipotency property — when the culture was transferred to conditions that stimulated differentiation, the neural stem cells differentiated into neurons and glial cells.

К недостаткам способа, выбранного в качестве прототипа, следует отнести:The disadvantages of the method selected as a prototype include:

- ограниченное применение, предназначенное исключительно для создания толстых гидрогелевых покрытий на ровной поверхности;- limited use, intended exclusively for the creation of thick hydrogel coatings on a flat surface;

- трудность получения тонких пленочных покрытий из-за высокой вязкости растворов агарозы и высокой температуры плавления гелей;- the difficulty of obtaining thin film coatings due to the high viscosity of agarose solutions and the high melting point of the gels;

- ограниченное применение гидрогелей на основе агарозы в системах трехмерного культивирования стволовых клеток, поскольку при процессе извлечения биомассы наработанных клеток (харвестинг) требуется дополнительное введение ферментного препарата, что снижает жизнеспособность клеток;- limited use of agarose-based hydrogels in three-dimensional stem cell cultivation systems, since the process of biomass extraction of the accumulated cells (harvesting) requires additional administration of an enzyme preparation, which reduces cell viability;

- небольшой срок хранения основы для последующего культивирования клеток, т.к. высыхание и последующее быстрое набухание геля из агарозы приводит к его разрушению.- short shelf life of the base for subsequent cell cultivation, because drying and subsequent rapid swelling of the gel from agarose leads to its destruction.

Задачей изобретения является создание нового физиологичного способа культивирования стволовых клеток, препятствующего их спонтанной дифференцировке, и значительно расширяющего варианты его применения в клеточных технологиях, которые позволяют получать покрытия различной толщины и структуры на поверхностях разного вида.The objective of the invention is the creation of a new physiological method for the cultivation of stem cells, preventing their spontaneous differentiation, and significantly expanding the options for its use in cell technology, which allows to obtain coatings of various thicknesses and structures on surfaces of various kinds.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе культивирования стволовых клеток, препятствующем их спонтанной дифференцировке, который включает приготовление раствора полисахарида, нанесение раствора полисахарида на основу, формирование на ней полисахаридного матрикса и высев культуры клеток, согласно изобретению, в качестве полисахарида берут раствор пектина с концентрацией до 5% и степенью этерификации не более 50%. Формирование полисахаридного матрикса ведут в присутствии раствора поперечно-сшивающего агента ионного типа.The problem is solved in that in the known method of cultivating stem cells that prevents their spontaneous differentiation, which includes preparing a polysaccharide solution, applying a polysaccharide solution to the base, forming a polysaccharide matrix on it and plating the cell culture according to the invention, take a pectin solution as a polysaccharide concentration up to 5% and degree of esterification no more than 50%. The formation of the polysaccharide matrix is carried out in the presence of a solution of an ionic type cross-linking agent.

Использование в качестве полисахарида для формирования матрикса высокогидрофильного природного полисахарида - пектина - позволило разработать новый способ культивирования стволовых клеток, препятствующий их спонтанной дифференцировке. Пектин является не только биосовместимым и нетоксичным для клеток и животных, но и позволяет получать матриксные покрытия различной толщины и на поверхностях разной геометрии и структуры.The use of a highly hydrophilic natural polysaccharide - pectin as a polysaccharide for matrix formation allowed us to develop a new method for stem cell cultivation that prevents their spontaneous differentiation. Pectin is not only biocompatible and non-toxic for cells and animals, but also allows you to get matrix coatings of various thicknesses and on surfaces of different geometry and structure.

В качестве полисахарида берут пектин со степенью этерификации до 50%, что означает, что не менее 50% всех карбоксильных групп галактуроновой кислоты, являющейся основным мономером молекулы пектина, находятся в свободном состоянии, т.е. не этерифицированы метиловым эфиром. Пектин со степенью этерификации до 50% получают методом щелочной деэтерификации из высокоэтерифицированного цитрусового, яблочного или иного вида пектина любым известным способом, в частности, согласно методике Ренарда (Renard C.M.G.C., Thibault J.F. Structure and properties of apple and sugar beet pectins extracted by chelating agents //Carbohydr. Res. -1993.- Vol.244.- P.99), Ильиной (Ильина И.А. Научные основы технологии модифицированных пектинов. Краснодар, 2001. 148-156 с), Донговски (Dongowski G, Lorenz A. Unsaturated oligogalacturonic acids are generated by in vitro treatment of pectin with human feacal flora. Carbohydr Res 1998; 314:237-244) или согласно методу, зарегистрированному в патенте RU №2262865 , МПК A23L1/0524, опубл. 27.10.2005.Pectin with an esterification degree of up to 50% is taken as a polysaccharide, which means that at least 50% of all carboxyl groups of galacturonic acid, which is the main monomer of the pectin molecule, are in a free state, i.e. not esterified with methyl ether. Pectin with an esterification degree of up to 50% is obtained by alkaline deesterification from a highly esterified citrus, apple or other type of pectin by any known method, in particular, according to the Renard method (Renard CMGC, Thibault JF Structure and properties of apple and sugar beet pectins extracted by chelating agents / / Carbohydr. Res. -1993.- Vol.244.- P.99), Ilyina (Ilyina I.A. Scientific basis of the technology of modified pectins. Krasnodar, 2001. 148-156 s), Dongowski (Dongowski G, Lorenz A. Unsaturated oligogalacturonic acids are generated by in vitro treatment of pectin with human feacal flora. Carbohydr Res 1998; 314: 237-244) or according to the method registered in patent RU No. 2262865, IPC A23L1 / 0524, publ. 10/27/2005.

Использование низкоэтерифицированного пектина (со степенью этерификации до 50%) позволяет проводить гелеобразование при нейтральном рН и физиологичной температуре, что очень важно при культувировании клеток живых организмов. В то время как высокоэтерифицированные пектины (со степенью этерификации более 50%) формируют гели в кислых условиях (рН ~ 3.6) и высокой концентрации сахарозы (более 55%), эти условия являются нефизиологическими условиями и неприемлемы при работе с клеточными культурами.The use of low esterified pectin (with an esterification degree of up to 50%) allows gelation at a neutral pH and physiological temperature, which is very important when culturing cells of living organisms. While highly esterified pectins (with an esterification degree of more than 50%) form gels under acidic conditions (pH ~ 3.6) and a high concentration of sucrose (more than 55%), these conditions are non-physiological conditions and are unacceptable when working with cell cultures.

Повышение концентрации пектина выше 5% значительно затрудняет формирование матрикса, так как при растворении образуются слишком вязкие растворы.Increasing the concentration of pectin above 5% significantly complicates the formation of the matrix, since dissolving produces too viscous solutions.

Формирование полисахаридного матрикса в присутствии раствора поперечно-сшивающего агента ионного типа обеспечивает получение высокогидрофильного матрикса - гидрогеля, имитирующего естественный внеклеточный матрикс животных, который является оптимальным для культивирования клеток. Данный гидрогель формируется за счет поперечного сшивания молекул пектина двухвалентными катионами, которые связывают отрицательно заряженные карбоксильные группы низкоэтерифицированного пектина.The formation of a polysaccharide matrix in the presence of a solution of an ionic type cross-linking agent provides a highly hydrophilic matrix - a hydrogel that mimics the natural extracellular matrix of animals, which is optimal for cell culture. This hydrogel is formed due to the crosslinking of pectin molecules by divalent cations that bind the negatively charged carboxyl groups of low esterified pectin.

Для достижения заявленного технического результата в качестве поперечно-сшивающего агента ионного типа (ПСА) в предлагаемом способе целесообразно использовать композицию, содержащую растворимую соль кальция, хлорид натрия и буферную систему на основе нетоксичных для клеток компонентов.To achieve the claimed technical result, it is advisable to use a composition containing a soluble calcium salt, sodium chloride and a buffer system based on components non-toxic to cells in the proposed method as a cross-linking agent of ionic type (PSA).

Присутствующая в ПСА растворимая соль кальция является источником ионов кальция - двухвалентных катионов, обеспечивающих поперечное сшивание, в результате чего образуется гидрогель. Формирование геля возможно и в присутствие любых других двухвалентных катионов, например, магния, цинка, меди. Однако ионы кальция являются наиболее удобными в случае создания гелей для культивирования клеток, так как кальций не только нетоксичен для клеток, но и необходим для их нормального функционирования, к тому же он является важным компонентом внутриклеточного сигналинга.The soluble calcium salt present in PSA is a source of calcium ions - divalent cations providing cross-linking, resulting in the formation of a hydrogel. The formation of the gel is possible in the presence of any other divalent cations, for example, magnesium, zinc, copper. However, calcium ions are most convenient in the case of creating gels for culturing cells, since calcium is not only non-toxic to cells, but also necessary for their normal functioning, moreover, it is an important component of intracellular signaling.

В качестве растворимой соли кальция в раствор ПСА могут вводиться хлорид кальция, нитрат кальция и др.As a soluble calcium salt, calcium chloride, calcium nitrate, etc. can be introduced into the PSA solution.

Экспериментально установлено, что введение в раствор поперечно-сшивающего агента растворимой соли кальция в концентрации до 10 мМ, обеспечивает ассоциацию молекул пектина и формирование геля, поддерживает физиологическую концентрацию ионов кальция и не создает при этом условий гиперкальциемии в системе культивирования, что может быть губительно для клеток. Связывание ионов кальция молекулами низкоэтерифицированного пектина необходимо не только для формирования высокогидрофильного матрикса, но требуется еще для предотвращения возможной абсорбции кальция из питательной среды.It was experimentally established that the introduction of a soluble calcium salt in a concentration of up to 10 mM into the solution of the cross-linking agent ensures the association of pectin molecules and gel formation, maintains the physiological concentration of calcium ions and does not create hypercalcemia conditions in the culture system, which can be detrimental to cells . The binding of calcium ions by low esterified pectin molecules is necessary not only for the formation of a highly hydrophilic matrix, but is also required to prevent the possible absorption of calcium from the nutrient medium.

Введение в состав ПСА хлорида натрия в концентрации 150 мМ позволяет поддерживать изотоничность раствора ПСА.The introduction of sodium chloride at a concentration of 150 mM into the PSA composition allows the isotonicity of the PSA solution to be maintained.

А использование в составе ПСА буферной системы на основе нетоксичных для клеток компонентов обеспечивает физиологическую кислотность матрикса, поддерживая рН от 7.2 до 7.6.And the use of a buffer system based on components non-toxic to cells as part of the PSA ensures the physiological acidity of the matrix, maintaining a pH from 7.2 to 7.6.

В качестве буферной системы на основе нетоксичных для клеток компонентов могут быть использованы, в частности, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), титрованная гидроксидом натрия; буфер на основе трис(гидроксиметил)аминометана, титрованного соляной кислотой.As a buffer system based on components non-toxic to cells, in particular, 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) titrated with sodium hydroxide can be used; buffer based on tris (hydroxymethyl) aminomethane titrated with hydrochloric acid.

Заявленный способ позволяет также в качестве ПСА использовать питательную среду для культивирования клеток, содержащую ионы кальция, с необходимыми ростовыми добавками, рекомендованными для работы с данной культурой. В качестве питательной среды для культивирования клеток могут использоваться, в частности, среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), комплексная среда DMEM/F12, специализированная среда Neurobasal, среда N2B27. А в качестве ростовых добавок могут быть применены фетальная бычья сыворотка, различные белковые ростовые факторы, такие как эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор ингибирования лейкемии (LIF) и др.The claimed method also allows, as a PSA, to use a nutrient medium for cell culture containing calcium ions with the necessary growth additives recommended for working with this culture. As a culture medium for cell cultivation, in particular, Dulbecco's Eagle medium (DMEM), DMEM / F12 complex medium, Neurobasal specialized medium, N2B27 medium can be used. Fetal bovine serum, various protein growth factors, such as epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), leukemia inhibition factor (LIF), etc. can be used as growth additives.

Введение данных добавок обеспечивается использованием пектинов, способных формировать коллоидные растворы и гели при физиологической температуре, что является дополнительным преимуществом заявляемого способа по сравнению с прототипом, в котором используют агарозу. Для поддержания препаратов агарозы в состоянии водных коллоидных растворов, необходимых для смешивания с ростовыми добавками, нужна температура, как правило, превышающая 37°С, что может привести к денатурации ростовых добавок.The introduction of these additives is provided by the use of pectins capable of forming colloidal solutions and gels at physiological temperature, which is an additional advantage of the proposed method compared to the prototype, which use agarose. To maintain agarose preparations in the state of aqueous colloidal solutions required for mixing with growth additives, a temperature is usually required, which is usually higher than 37 ° C, which can lead to the denaturation of growth additives.

Заявляемый способ значительно расширяет варианты применения в клеточных технологиях, позволяет культивировать различные виды клеток, благодаря особенностям пектина, использовать различную основу для нанесения полисахарида, позволяет формировать матрикс в различной форме и различной толщины.The inventive method significantly expands the applications in cell technology, allows you to cultivate different types of cells, thanks to the features of pectin, use a different base for applying the polysaccharide, allows you to form a matrix in different shapes and different thicknesses.

Удаление избытка раствора пектина после нанесения его на основу перед формированием матрикса позволяет получать гелевое покрытие, имеющее толщину в среднем 0,05 − 0,5 мм, что облегчает для экспериментатора наблюдение за живыми клетками в культуре.Removing the excess pectin solution after applying it to the substrate before forming the matrix allows you to get a gel coating having an average thickness of 0.05 - 0.5 mm, which makes it easier for the experimenter to observe living cells in culture.

Более тонкие пленки, менее 0,05 мм, матриксного покрытия могут быть получены введением дополнительного этапа промывки после нанесения и удаления избытка раствора пектина. Использование на практике таких пленок позволяет проводить анализ клеточных культур с помощью конфокального лазерного микроскопа, обычно имеющего ограничения по глубине проникновения луча.Thinner films, less than 0.05 mm, of a matrix coating can be obtained by introducing an additional washing step after application and removal of excess pectin solution. The practical use of such films allows the analysis of cell cultures using a confocal laser microscope, usually having limitations on the depth of penetration of the beam.

Введение операции высушивания основы обеспечивает хранение основы в течение длительного времени, что позволяет вести промышленную наработку основ для дальнейшего использования. Срок хранения основ, приготовленных заявленным способом, составляет не менее одного года.The introduction of the operation of drying the base provides storage of the base for a long time, which allows for industrial production of bases for further use. The shelf life of the bases prepared by the claimed method is at least one year.

Проведение лиофильной сушки пектинового матрикса, сформированного в присутствии раствора ПСА, позволяет получить пористые губки. Пористые губки представляют собой трехмерно организованный матрикс, что значительно расширяет сферу его применения для культивирования клеток в разных системах.Freeze drying of a pectin matrix formed in the presence of a PSA solution allows porous sponges to be obtained. Porous sponges are a three-dimensionally organized matrix, which significantly expands the scope of its application for cell cultivation in different systems.

Для культивирования стволовых клеток в качестве основы могут использоваться либо подложки стеклянные или полимерные, либо сосуды для культивирования клеток.For stem cell cultivation, either glass or polymer substrates or cell culture vessels can be used as the basis.

В качестве полимерной подложки можно использовать пластмассовые покровные стекла, пленки из эластичных полимеров, вставки с развитыми поверхностями для высокоэффективного промышленного или полупромышленного культивирования в биореакторах, полимерные сферы и волокна.As the polymer substrate, you can use plastic coverslips, films of elastic polymers, inserts with developed surfaces for highly efficient industrial or semi-industrial cultivation in bioreactors, polymer spheres and fibers.

В качестве стеклянной подложки могут быть использованы стеклянные покровные и предметные стекла для микроскопии, стеклянные пластины различного формата, стеклянные сферы и волокна. Использование покровных стекол для культивирования клеток облегчает процесс проведения иммуноцитохимического анализа. Тонкое покрытие в виде пленки пектинового матрикса позволяет анализировать полученные препараты с применением конфокального микроскопа и получать микрофотографии высокого разрешения.As the glass substrate can be used glass coverslips and microscope slides, glass plates of various sizes, glass spheres and fibers. The use of coverslips for cell culture facilitates the process of immunocytochemical analysis. A thin coating in the form of a film of pectin matrix allows one to analyze the obtained preparations using a confocal microscope and obtain high-resolution micrographs.

В качестве сосудов для культивирования клеток могут быть использованы многолуночные планшеты, чашки Петри, флаконы для культивирования клеток, биореакторы различных типов.As vessels for culturing cells, multi-well plates, Petri dishes, vials for culturing cells, and bioreactors of various types can be used.

Возможность использования основ различных типов для формирования пектинового матрикса на их поверхности значительно расширяет возможности культивирования клеток в условиях, препятствующих их дифференцировки, и позволяет получать биомассу стволовых клеток в различных системах культивирования.The possibility of using various types of bases for the formation of a pectin matrix on their surface greatly expands the possibilities of cell cultivation under conditions that impede their differentiation, and allows the production of stem cell biomass in various cultivation systems.

Поставленная задача решается также тем, что в известном способе культивирования стволовых клеток, препятствующем их спонтанной дифференцировке, включающем внесение раствора полисахарида в сосуд для культивирования клеток, формирование матрикса и внесение культуры клеток, согласно изобретению, в качестве полисахарида берут раствор пектина с концентрацией до 5% и степенью этерификации не более 50%, приготовленный на изотоническом растворе. Внесение культуры клеток выполняют перед формированием матрикса с последующим перемешиванием, к полученной смеси добавляют поперечно-сшивающий агент ионного типа (ПСА), приготовленный на изотоническом растворе, и перемешивают.The problem is also solved by the fact that in the known method of culturing stem cells, preventing their spontaneous differentiation, including the introduction of a polysaccharide solution into a cell culture vessel, the formation of a matrix and the introduction of a cell culture, according to the invention, a pectin solution with a concentration of up to 5% is taken as a polysaccharide and a degree of esterification of not more than 50%, prepared in an isotonic solution. The introduction of cell culture is performed before the formation of the matrix, followed by stirring, to the resulting mixture add a cross-linking agent of ionic type (PSA), prepared in an isotonic solution, and mix.

Внесение культивируемых клеток в раствор пектина перед формированием матрикса позволяет в большей степени приблизить процесс культивирования клеток к естественным условиям, при которых клетки находятся в трехмерном окружении молекул внеклеточного матрикса.The introduction of cultured cells into a pectin solution before the formation of the matrix makes it possible to bring the cell cultivation process closer to the natural conditions under which the cells are in a three-dimensional environment of extracellular matrix molecules.

Приготовление пектина и ПСА на изотоническом растворе обеспечивает поддержание физиологической среды для культивируемых клеток.The preparation of pectin and PSA in isotonic solution ensures the maintenance of the physiological environment for the cultured cells.

Для доказательства работоспособности заявленного способа используют культуру нейральных стволовых клеток, полученных из эмбрионального мозга крыс. Полученные культуры эмбриональных клеток вентрального среднего мозга, гиппокампа и обонятельных луковиц 15-дневных эмбрионов крыс активно пролиферируют в среде с добавлением 12% эмбриональной телячьей сыворотки и образуют многочисленные нейросферы, типичный вид которых представлен на фиг. 1А. Культуры проявляют хорошую жизнеспособность, которая в среднем составляет 84±9%. Клетки способны к дифференцировке в основные клеточные типы нервной ткани - нейроны и глиальные клетки - при снижении концентрации сыворотки до 2% (фиг. 1Б, В), что подтверждается микрофотографиями, полученными с помощью микроскопа Zeiss Axiovert 200M с применением метода дифференциального интерференционного контраста. Альтернативно применяют бессывороточное культивирование. Клетки культивируют в среде Neurobasal с добавкой B-27 без витамина А и ростовыми факторами: 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF).To prove the efficiency of the claimed method, a culture of neural stem cells obtained from rat embryonic brain is used. The obtained cultures of embryonic cells of the ventral midbrain, hippocampus, and olfactory bulbs of 15-day-old rat embryos actively proliferate in medium supplemented with 12% fetal calf serum and form numerous neurospheres, a typical view of which is shown in FIG. 1A. Cultures show good viability, which averages 84 ± 9%. Cells are capable of differentiation into the main cellular types of nerve tissue - neurons and glial cells - with a decrease in serum concentration of up to 2% (Fig. 1B, C), which is confirmed by microphotographs obtained using a Zeiss Axiovert 200M microscope using the differential interference contrast method. Alternatively, serum-free culture is used. Cells were cultured in Neurobasal medium supplemented with vitamin B-27 without vitamin A and growth factors: 10 ng / ml epidermal growth factor (EGF) 20 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF).

В другом случае используют культуру эмбриональных стволовых клеток мыши, культивируемых в бессывороточной среде N2B27 с добавлением 1000 ед./мл фактора ингибирования лейкемии (LIF) и 10 нг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP 4).In another case, a mouse embryonic stem cell culture is used, cultured in serum-free N2B27 medium supplemented with 1000 units / ml leukemia inhibition factor (LIF) and 10 ng / ml bone morphogenetic protein 4 (BMP 4).

Жизнеспособность культивируемых клеток оценивают с помощью окраски трипановым синим и подсчета количества клеток в камере Горяева.The viability of cultured cells is assessed by trypan blue staining and counting the number of cells in the Goryaev chamber.

Дифференцировку оценивают по морфологии клеток. Дифференцированными считают распластанные клетки с округлым телом, формирующие отростки - клетки глиального направления дифференцировки, либо клетки отросчатой формы с гранулярной цитоплазмой - клетки нейронального направления дифференцировки. Клетки сферической формы, слабо адгезированные на субстрате, не формирующие отростков, считают недифференцированными. Дополнительно к оценке общих морфологических признаков применяют типирование клеток методами иммуноцитохимии с помощью специфических антител: недифференцированные нейральные клетки выявляют антителам против нестина, клетки нейронального направления маркируют антителами против β-III-тубулина, олигодендроциты выявляют с помощью антител против маркера O4, астроциты выявляют антителами против кислого фибриллярного белка. Подсчитывают количество недифференцированных клеток в процентах от общего количества клеток на субстрате.Differentiation is evaluated by cell morphology. Differentiated are flattened cells with a rounded body that form processes - cells of the glial direction of differentiation, or process cells with a granular cytoplasm - cells of the neuronal direction of differentiation. Cells of a spherical shape, weakly adhering to the substrate, not forming processes, are considered undifferentiated. In addition to assessing common morphological characters, cell typing is used by immunocytochemistry using specific antibodies: undifferentiated neural cells are detected by anti-nestin antibodies, neuronal cells are labeled with anti-β-III-tubulin antibodies, oligodendrocytes are detected with anti-O4 marker antibodies, and astrocytes are detected with anti-acid antibodies fibrillar protein. Count the number of undifferentiated cells as a percentage of the total number of cells on the substrate.

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Пример 1.Example 1

Готовят 5% раствор пектина со степенью этерификации 27,4%. Для этого 5 г пектина вносят в 95 мл дистиллированной воды и растворяют при постоянном перемешивании при температуре 90°С до получения однородного раствора, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин. Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА), содержащий: 12 мМ CaCl₂, 300 мМ NaCl, 40 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4.A 5% pectin solution with an esterification degree of 27.4% is prepared. For this, 5 g of pectin is added to 95 ml of distilled water and dissolved with constant stirring at a temperature of 90 ° C until a homogeneous solution is obtained, cooled to room temperature, and the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is sterilized by autoclaving at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes. A solution of a cross-linking agent (PSA) is prepared containing: 12 mM CaCl ₂ , 300 mM NaCl, 40 mM HEPES-NaOH, pH 7.4.

Приготовленный раствор пектина охлаждают до комнатной температуры и дозатором наносят на основу, в качестве которой берут планшет для культивирования клеток.The prepared pectin solution is cooled to room temperature and the dispenser is applied to the base, which is taken as a tablet for cell culture.

В лунки 96-луночного планшета для культивирования клеток вносят 5% раствор пектина в количестве 50 мкл, затем добавляют раствор ПСА количестве 50 мкл и смешивают, в результате чего формируется матрикс в виде слоя гидрогеля толщиной 1-2 мм. Затем к сформированному матриксу добавляют питательную среду ДМЕМ (среда Игла в модификации Дульбекко) и инкубируют 2 ч. Среду меняют на среду с 2% эмбриональной сывороткой, создавая таким образом условия, стимулирующие дифференцировку клеток. На поверхность полученного матрикса наносят нейральные стволовые клетки плотностью 1,25×10⁴/см². Культивируют клетки в течение 14 суток, среду меняют раз в 3 суток. В качестве контроля анализируют нейральные стволовые клетки, культивируемые на поверхности лунок планшета для культивирования клеток, непокрытых матриксом.A 50% pectin solution in an amount of 50 μl was added to the wells of a 96-well cell culture plate, then a 50 μl PSA solution was added and mixed, resulting in the formation of a matrix in the form of a 1-2 mm thick hydrogel layer. Then, DMEM medium (Needle medium modified by Dulbecco) is added to the formed matrix and incubated for 2 hours. The medium is changed to medium with 2% fetal serum, thereby creating conditions that stimulate cell differentiation. Neural stem cells with a density of 1.25 × 10 ⁴ / cm ² are applied to the surface of the obtained matrix. Cells are cultured for 14 days, the medium is changed every 3 days. As a control, neural stem cells cultured on the surface of the wells of a plate for culturing cells uncovered by a matrix are analyzed.

В полученной культуре жизнеспособность клеток составляет 77±6%. В контрольной культуре наблюдается адгезия нейросфер и дифференцировка клеток по периферии нейросфер, формирование отросчатых клеток (фиг. 2А). Как видно из фиг. 2Б, в культуре нейральных клеток на поверхности пектинового матрикса отростчатые клетки практически отсутствуют. Культуры представлены плотными нейросферами с редким высеванием клеток по периферии; формирование отростков и выраженных признаков дифференцировки не наблюдается при культивировании на поверхности пектина со степенью этерификации 27,4%. Количество недифференцированных клеток в культуре составляет 96-97%.In the resulting culture, the cell viability is 77 ± 6%. In the control culture, adhesion of the neurospheres and differentiation of cells along the periphery of the neurospheres, the formation of process cells are observed (Fig. 2A). As can be seen from FIG. 2B, in the culture of neural cells on the surface of the pectin matrix, process cells are practically absent. Cultures are represented by dense neurospheres with rare seeding of cells on the periphery; the formation of processes and pronounced signs of differentiation is not observed during cultivation on the surface of pectin with a degree of esterification of 27.4%. The number of undifferentiated cells in the culture is 96-97%.

Таким образом, даже в условиях, стимулирующих дифференцировку, нейральные стволовые клетки сохраняют недифференцированное состояние при культивировании на поверхности матрикса, состоящего из пектина.Thus, even under conditions that stimulate differentiation, neural stem cells maintain an undifferentiated state when cultured on the surface of a matrix consisting of pectin.

Пример 2.Example 2

Готовят 1% раствор пектина со степенью этерификации 1,2%. Для этого 1 г пектина вносят в 95 мл дистиллированной воды и растворяют при постоянном перемешивании при температуре 90°С до получения однородного раствора, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор пектина стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин. Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА) следующего состава: 3 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4.A 1% pectin solution with an esterification degree of 1.2% is prepared. For this, 1 g of pectin is introduced into 95 ml of distilled water and dissolved with constant stirring at a temperature of 90 ° C until a homogeneous solution is obtained, cooled to room temperature, and the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The pectin solution is autoclaved under 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes. Prepare a solution of a cross-linking agent (PSA) of the following composition: 3 mm CaCl ₂ , 150 mm NaCl, 20 mm HEPES-NaOH, pH 7.4.

В качестве основы используют флакон для культивирования клеток из полистирольного пластика. Раствором пектина, имеющего комнатную температуру, заполняют флакон для культивирования клеток, инкубируют 2 часа. Затем полностью удаляют раствор пектина из флакона. Флакон заполняют раствором ПСА, инкубируют 2 часа при комнатной температуре, удаляют ПСА. Сформированный матрикс представляет собой пленку толщиной около 0,25±0,05 мм, покрывающую внутреннюю поверхность флакона для культивирования клеток. На подготовленный матрикс наносят питательную среду ДМЕМ и инкубируют 1 ч для уравновешивания состава матрикса основными компонентами среды. После инкубирования питательную среду меняют на среду ДМЕМ с 12% эмбриональной сывороткой, создавая условия, типичные для поддержания активно пролиферирующих культур столовых клеток. Затем производят посев клеток плотностью 1,25×10⁴/см². Культивируют клетки в течение 10 суток, при этом питательную среду меняют через каждые трое суток.As a basis, use a bottle for culturing cells from polystyrene plastic. A solution of pectin, having room temperature, fill the cell culture vial, incubated for 2 hours. Then the pectin solution is completely removed from the vial. The vial is filled with a PSA solution, incubated for 2 hours at room temperature, PSA is removed. The formed matrix is a film with a thickness of about 0.25 ± 0.05 mm, covering the inner surface of the cell culture vial. DMEM nutrient medium is applied to the prepared matrix and incubated for 1 h to balance the matrix composition with the main components of the medium. After incubation, the culture medium is changed to DMEM medium with 12% fetal serum, creating the conditions typical for maintaining actively proliferating table cell cultures. Then produce inoculation of cells with a density of 1.25 × 10 ⁴ / cm ² . Cells are cultured for 10 days, while the nutrient medium is changed every three days.

В качестве контроля анализируют нейральные стволовые клетки, культивируемые на поверхности лунок планшета для культивирования клеток, непокрытых матриксом. В контрольной культуре клетки формировали нейросферы с умеренно выраженной адгезией и дифференцировкой клеток.As a control, neural stem cells cultured on the surface of the wells of a plate for culturing cells uncovered by a matrix are analyzed. In the control culture, cells formed neurospheres with moderate adhesion and cell differentiation.

Исследуемая культура на пектиновом матриксе представляла собой поля разрозненных слабо адгезированных клеток сферической формы. Такие клетки в отдельных случаях образовывали небольшие ассоциации из 5-15 клеток, что можно наблюдать на представленных микрофотографиях (фиг. 3). В исследуемых культурах на матриксе, состоящем из пектина со степенью этерификации 1,2%, отсутствовали признаки начала дифференцировки - плотная адгезия, образование отростков будущих нейронов или глиальных клеток на протяжении 10 суток эксперимента. Количество недифференцированных клеток в культуре составило 99%.The studied culture on the pectin matrix was a field of scattered, weakly adhering spherical cells. Such cells in some cases formed small associations of 5-15 cells, which can be observed in the presented micrographs (Fig. 3). In the studied cultures, on the matrix consisting of pectin with a degree of esterification of 1.2%, there were no signs of differentiation beginning - tight adhesion, the formation of processes of future neurons or glial cells during 10 days of the experiment. The number of undifferentiated cells in the culture was 99%.

Таким образом, в условиях, обычно создаваемых для эффективного наращивания биомассы стволовых клеток, матрикс на основе пектина эффективно подавляет дифференцировку клеток, сохраняя мультипотентные культуры.Thus, under conditions usually created for the effective growth of stem cell biomass, a pectin-based matrix effectively suppresses cell differentiation while preserving multipotent cultures.

Пример 3.Example 3

Готовят 1% раствор пектина со степенью этерификации 50,0%. Для этого 1 г пектина вносят в 95 мл дистиллированной воды и растворяют при постоянном перемешивании при температуре 90°С до получения однородного раствора, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин.A 1% pectin solution with an esterification degree of 50.0% is prepared. For this, 1 g of pectin is introduced into 95 ml of distilled water and dissolved with constant stirring at a temperature of 90 ° C until a homogeneous solution is obtained, cooled to room temperature, and the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is sterilized by autoclaving at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes.

Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА) следующего состава: 10 мМ Ca(NO₃)₂, 150 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН=7,2.Prepare a solution of a cross-linking agent (PSA) of the following composition: 10 mm Ca (NO ₃ ) ₂ , 150 mm NaCl, 50 mm Tris-HCl, pH = 7.2.

Раствор пектина, охлажденного до комнатной температуры, вносят в лунки 96-луночного планшета для культивирования клеток в количестве 100 мкл, инкубируют 2 часа. Затем дозатором полностью удаляют раствор пектина из лунок. Планшет оставляют открытым в асептических условиях ламинарного шкафа до полного высыхания раствора. Подготовленный таким образом планшет стерильно упаковывают, хранят при комнатной температуре в течение 12 месяцев в недоступном для света месте. Перед использованием подготовленного планшета для культивирования клеток в лунки планшета вносят ПСА в количестве 100 мкл, инкубируют 2 часа при комнатной температуре, удаляют ПСА. Сформированный пектиновый матрикс представляет собой пленку толщиной 0,09 мм. На подготовленный матрикс наносят 100 мкл питательной среды Neurobasal (Invitrogen) и инкубируют 1 ч. Среду меняют на среду Neurobasal с добавкой B-27 без витамина А и ростовыми факторами (10 нг/мл эпидермального фактора роста, 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов) и помещают в лунки планшета нейральные стволовые клетки плотностью 1,25×10⁴ /см². Культивируют клетки в течение 10 суток, среду меняют раз в 3 суток.A solution of pectin, cooled to room temperature, is added to the wells of a 96-well cell culturing plate in an amount of 100 μl, incubated for 2 hours. Then, the pectin solution from the wells is completely removed with the dispenser. The tablet is left open under the aseptic conditions of the laminar cabinet until the solution has completely dried. Thus prepared tablet is sterilely packaged, stored at room temperature for 12 months, out of the reach of light. Before using the prepared plate for cell culture, PSA is added to the wells of the plate in an amount of 100 μl, incubated for 2 hours at room temperature, PSA is removed. Formed pectin matrix is a film with a thickness of 0.09 mm 100 μl of Neurobasal culture medium (Invitrogen) was applied to the prepared matrix and incubated for 1 h. The medium was changed to Neurobasal medium supplemented with B-27 without vitamin A and growth factors (10 ng / ml of epidermal growth factor, 20 ng / ml of basic fibroblast growth factor ) and put into the wells of the tablet neural stem cells with a density of 1.25 × 10 ⁴ / cm ² . Cells are cultured for 10 days, the medium is changed every 3 days.

Культуры нейральных стволовых клеток трех отделов эмбрионального мозга крыс проявляли сходные свойства при культивировании на поверхности пленки из пектина со степенью этерификации 50,0%. Отличительной чертой таких культур явилось формирование конгломератов, для которых была отмечена разобщенная структура со слабо выраженными контактами «клетка-клетка». Часть клеток таких ассоциаций россыпью располагалась по периферии более плотной части конгломератов, кроме того, значительная доля клеток в культурах была спорадически распределена между конгломератами (фиг. 4). Среди части свободно рассеянных элементов встречались веретеновидные и отростчатые клетки с первыми признаками дифференцировки, однако их доля не превышала 1-2% от общего числа клеток в культуре. 98-99% клеток в культуре сохраняло сферическую морфологию, т.е. культивированные клетки оставались недифференцированными. Количество живых клеток в культуре составило 81±7%.Neural stem cell cultures of three departments of rat embryonic brain showed similar properties when cultured on the surface of a pectin film with an degree of esterification of 50.0%. A distinctive feature of such cultures was the formation of conglomerates, for which a fragmented structure with weakly expressed cell-to-cell contacts was noted. Some of the cells of such associations were scattered along the periphery of the denser part of the conglomerates, in addition, a significant proportion of the cells in the cultures were sporadically distributed between the conglomerates (Fig. 4). Among part of the freely scattered elements, spindle-shaped and process cells with the first signs of differentiation were found, but their proportion did not exceed 1-2% of the total number of cells in the culture. 98-99% of the cells in the culture retained spherical morphology, i.e. cultured cells remained undifferentiated. The number of living cells in the culture was 81 ± 7%.

Пример 4.Example 4

Готовят 0,5% раствор пектина со степенью этерификации 18,8%. Для этого 0,5 г пектина вносят в 95 мл дистиллированной воды и растворяют при постоянном перемешивании при температуре 90°С до получения однородного раствора, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин. Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА) следующего состава: 3 мМ Ca(NO₃)₂, 150 мМ NaCl, 50 мМ трис-HCl, рН 7,4.Prepare a 0.5% solution of pectin with a degree of esterification of 18.8%. To do this, 0.5 g of pectin is added to 95 ml of distilled water and dissolved with constant stirring at a temperature of 90 ° C until a homogeneous solution is obtained, cooled to room temperature, and the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is sterilized by autoclaving at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes. Prepare a solution of a cross-linking agent (PSA) of the following composition: 3 mm Ca (NO ₃ ) ₂ , 150 mm NaCl, 50 mm Tris-HCl, pH 7.4.

В качестве основы берут покровные стекла, которые тщательно моют, обрабатывают горячей (90°С) концентрированной соляной кислотой в течение 15 мин, промывают в проточной воде, дистиллированной воде, сушат, стерилизуют в сухожаровом шкафу при температуре 180°С и хранят в стерильных условиях. Стерильные оптические стекла инкубируют 1 час в растворе пектина, охлажденного до комнатной температуры, в закрытых чашках Петри. Проводят промывку стекол сменой 3-5 порций раствора Дульбекко. Стекла вынимают пинцетом, удаляют избыток раствора влаги прикосновением края стекла к стерильной фильтровальной бумаге. Высушивают стекла в течение 30 мин в горизонтальном положении на решетчатой платформе из тефлона. Подготовленные таким образом стеклянные подложки, покрытые раствором пектина, хранят в течение 12 месяцев.The base covers are glass coverslips that are thoroughly washed, treated with hot (90 ° C) concentrated hydrochloric acid for 15 minutes, washed in running water, distilled water, dried, sterilized in a dry oven at a temperature of 180 ° C and stored under sterile conditions . Sterile optical glasses were incubated for 1 hour in a solution of pectin, cooled to room temperature, in closed Petri dishes. The glasses are washed by changing 3-5 portions of Dulbecco's solution. The glasses are removed with tweezers, the excess moisture solution is removed by touching the edge of the glass to sterile filter paper. Glass is dried for 30 min in a horizontal position on a lattice platform of Teflon. Thus prepared glass substrates coated with a solution of pectin are stored for 12 months.

Подготовленные стекла, покрытые пектинами, раскладывают в лунки культуральных планшетов и инкубируют в растворе ПСА в течение 2 часов при комнатной температуре. В результате на стеклянной подложке образуется пектиновый матрикс в виде тонкой пленки, толщиной около 0,02 мм. В лунки планшета вносят питательную среду ДМЕМ (среда Игла в модификации Дульбекко) и инкубируют 1 ч. Среду меняют на среду с 2% эмбриональной сывороткой и помещают в лунки планшета нейральные стволовые клетки эмбрионального мозга плотностью 1,25×10⁴/см². В качестве контроля используют полистирольный пластик дна планшета. Культивируют клетки в течение 14 суток, среду меняют раз в 3 суток. Живые клетки визуализируют при помощи красителя флуоресцеина диацетата, мертвые клетки окрашивают ядерным красителем пропидием иодидом. Препараты анализируют на конфокальном сканирующем микроскопе LSM 510 Meta (CarlZeiss) с применением лазеров, генерирующих излучение в области 488 нм (для флуоресфеина диацетата) и 546 нм (для пропидия иодида).The prepared glasses coated with pectins are laid in the wells of the culture plates and incubated in a PSA solution for 2 hours at room temperature. As a result, a pectin matrix in the form of a thin film with a thickness of about 0.02 mm is formed on a glass substrate. Nutrient medium DMEM (Needle medium modified by Dulbecco) is introduced into the wells of the plate and incubated for 1 h. The medium is changed to medium with 2% fetal serum and neural embryonic brain stem cells with a density of 1.25 × 10 ⁴ / cm ² are placed in the wells of the tablet. As control use polystyrene plastic bottom of the tablet. Cells are cultured for 14 days, the medium is changed every 3 days. Living cells are visualized with the dye fluorescein diacetate, dead cells are stained with nuclear dye propidium iodide. The preparations were analyzed on a LSM 510 Meta confocal scanning microscope (CarlZeiss) using lasers generating radiation in the region of 488 nm (for fluoresphein diacetate) and 546 nm (for propidium iodide).

На фиг. 5 представлены комбинированные изображения живых (зеленые) и мертвых (красные) клеток. При культивировании нейральных стволовых клеток на поверхности стекол, покрытых пленкой из пектина, в культуре сохранялось до 99% недифференцированных клеток, которые представлены на фиг. 5А. Количество живых клеток в культурах составило 79±3%. В контрольной культуре на поверхности полистирольного пластика клетки в составе нейросфер дифференцировались и формировали отростки, что подтверждается микрофотографиями, представленными на фиг. 5Б.In FIG. 5 shows combined images of living (green) and dead (red) cells. When culturing neural stem cells on the surface of glasses coated with a pectin film, up to 99% of undifferentiated cells, which are presented in FIG. 5A. The number of living cells in cultures was 79 ± 3%. In the control culture, on the surface of the polystyrene plastic, the cells in the neurospheres differentiated and formed processes, which is confirmed by microphotographs presented in FIG. 5 B.

Пример 5.Example 5

Готовят 0,05% раствор пектина со степенью этерификации 18,8%. Для этого 0,05 г пектина вносят в 95 мл дистиллированной воды и растворяют при постоянном перемешивании при температуре 90°С до получения однородного раствора, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин.A 0.05% pectin solution with an esterification degree of 18.8% is prepared. To do this, 0.05 g of pectin is added to 95 ml of distilled water and dissolved with constant stirring at a temperature of 90 ° C until a homogeneous solution is obtained, cooled to room temperature, and the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is sterilized by autoclaving at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes.

В качестве основы берут стерильные пластмассовые покровные стекла, которые стекла инкубируют 1 час в растворе пектинов в закрытых чашках Петри. Стекла вынимают пинцетом. Проводят промывку стекол раствором Дульбекко, удаляют избыток раствора влаги прикосновением края стекла к стерильной фильтровальной бумаге. Высушивают стекла в течение 40 мин в горизонтальном положении на игольчатой платформе и хранят в течение 6 месяцев при комнатной температуре в недоступном для света месте.As a basis, sterile plastic coverslips are taken, which glasses are incubated for 1 hour in a solution of pectins in closed Petri dishes. Glasses are taken out with tweezers. The glasses are washed with Dulbecco's solution, the excess moisture solution is removed by touching the edge of the glass to sterile filter paper. Glass is dried for 40 minutes in a horizontal position on a needle platform and stored for 6 months at room temperature, out of the reach of light.

Подготовленные пластмассовые подложки раскладывают в лунки 24-луночного планшета. В лунки вносят 500 мкл ПСА, в качестве которого берут питательную среду N2B27, и инкубируют 1 ч. В результате получают пектиновый матрикс на полимерной подложке в виде тонкой пленки толщиной 0,01 мм. Затем среду меняют на среду N2B27 с добавлением 1000 ед./мл фактора ингибирования лейкемии (LIF) и 10 нг/мл костного морфогенетического белка 4 (BMP 4) и помещают в лунки планшета эмбриональные стволовые клетки мыши плотностью 1,25×10⁴ /см². В качестве контроля используют полистирольный пластик дна планшета. Культивируют клетки в течение 7 суток, среду меняют раз в 3 суток.Prepared plastic substrates are laid in the wells of a 24-well plate. 500 μl of PSA was added to the wells, as a nutrient medium N2B27, and incubated for 1 h. The result was a pectin matrix on a polymer substrate in the form of a thin film 0.01 mm thick. Then the medium is changed to N2B27 medium with the addition of 1000 units / ml leukemia inhibition factor (LIF) and 10 ng / ml bone morphogenetic protein 4 (BMP 4) and mouse embryonic stem cells with a density of 1.25 × 10 ⁴ / cm are placed in the wells of the tablet ² . As control use polystyrene plastic bottom of the tablet. Cells are cultured for 7 days, the medium is changed every 3 days.

При культивировании эмбриональных клеток мыши на поверхности пленки из пектина со степенью этерификации 18,8% клетки не проявляли признаков дифференцировки - клетки имели сферическую морфологию и не формировали отростков. Клетки формировали крупные сфероидные ассоциации. Жизнеспособность культуры составила 80 ± 8%. В культуре не наблюдали клеток с признаками дифференцировки. Подавляющее число клеток находилось в составе сфероидных колоний, рассеянные одиночные клетки.When culturing mouse embryonic cells on the surface of a pectin film with an esterification degree of 18.8%, the cells did not show signs of differentiation - the cells had a spherical morphology and did not form processes. Cells formed large spheroid associations. The viability of the culture was 80 ± 8%. No cells with signs of differentiation were observed in the culture. The overwhelming number of cells was part of spheroid colonies, scattered single cells.

Пример 6.Example 6

Готовят 3% раствор пектина со степенью этерификации 27,4%. Для этого 3 г пектина растворяют в 95 мл 150 мМ раствора NaCl (изотонический раствор) при постоянном перемешивании при температуре 90°С, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин.A 3% pectin solution with an esterification degree of 27.4% is prepared. To do this, 3 g of pectin is dissolved in 95 ml of a 150 mM NaCl solution (isotonic solution) with constant stirring at a temperature of 90 ° C, cooled to room temperature, the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is sterilized by autoclaving at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes.

Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА), содержащий: 12 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 40 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4.A solution of a cross-linking agent (PSA) is prepared containing: 12 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 40 mM HEPES-NaOH, pH 7.4.

Раствор пектина вносят в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток в количестве 250 мкл. Затем в лунки вносят нейральные стволовые клетки в количестве 1х10⁵ клеток на лунку. В лунку добавляют 250 мкл раствора ПСА, добавляют ростовые факторы (10 нг/мл эпидермального фактора роста, 20 нг/мл основного фактора роста фибробластов) и тщательно перемешивают аспирацией, оставляют в покое на 30 мин для формирования матрикса. Сформированный матрикс представляет собой пектиновый гидрогель. Затем в лунки планшета на сформированный гидрогель вносят 500 мкл питательной среды Neurobasal с добавкой B-27 без витамина А и ростовыми факторами. Культивируют клетки в течение 14 суток, среду меняют раз в 3 суток. Препараты анализируют на микроскопе Zeiss Axiovert 200M с применением метода дифференциального контраста.A pectin solution is added to the wells of a 24-well cell culture plate in an amount of 250 μl. Then, neural stem cells in the amount of 1x10 ⁵ cells per well are introduced into the wells. 250 μl of PSA solution is added to the well, growth factors (10 ng / ml of epidermal growth factor, 20 ng / ml of the main fibroblast growth factor) are added and thoroughly mixed by aspiration, left alone for 30 min to form a matrix. The formed matrix is a pectin hydrogel. Then, 500 μl of Neurobasal nutrient medium supplemented with B-27 without vitamin A and growth factors was added to the wells of the plate on the formed hydrogel. Cells are cultured for 14 days, the medium is changed every 3 days. The preparations are analyzed on a Zeiss Axiovert 200M microscope using the differential contrast method.

В данном примере нейральные стволовые клетки были иммобилизованы внутри гидрогелей толщиной 4-5 мм, приготовленных в лунках планшета для культивирования клеток. Клетки сохраняли сферическую морфологию на протяжении всего срока эксперимента и не проявляли признаков дифференцировки. Количество живых клеток составило 82±3%.In this example, neural stem cells were immobilized inside hydrogels 4-5 mm thick prepared in the wells of a cell culture plate. Cells retained spherical morphology throughout the duration of the experiment and showed no signs of differentiation. The number of living cells was 82 ± 3%.

Затем культивированные клетки извлекали из гидрогелей, инкубируя матрикс в 5% растворе цитрата натрия. Жизнеспособность клеток после извлечения из гелей составила 76±5%.Then, the cultured cells were removed from the hydrogels by incubating the matrix in a 5% sodium citrate solution. Cell viability after extraction from the gels was 76 ± 5%.

Пример 7.Example 7

Готовят 3% раствор пектина со степенью этерификации 27,4%. Для этого 3 г пектина растворяют в 95 мл 150 мМ раствора NaCl при постоянном перемешивании при температуре 90°С, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°С) в течение 30 мин.A 3% pectin solution with an esterification degree of 27.4% is prepared. To do this, 3 g of pectin is dissolved in 95 ml of a 150 mM NaCl solution with constant stirring at a temperature of 90 ° C, cooled to room temperature, the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is sterilized by autoclaving at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes.

Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА), содержащий: 12 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 40 мМ HEPES-NaOH, рН 7,4.A solution of a cross-linking agent (PSA) is prepared containing: 12 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 40 mM HEPES-NaOH, pH 7.4.

Приготовленный раствор пектина дозатором наносят на основу, в качестве которой берут планшет для культивирования клеток.The prepared pectin solution is applied by the dispenser to the base, which is taken as a tablet for cell culture.

В лунки 96-луночного планшета для культивирования клеток вносят 3% раствор пектина в количестве 50 мкл, затем добавляют раствор ПСА количестве 50 мкл и смешивают, в результате чего получают слой гидрогеля толщиной 1-2 мм. Затем слой гидрогеля подвергают лиофильной сушке, в результате получают пектиновый матрикс в виде пористой губки. Перед использованием к сформированному пектиновому матриксу добавляют питательную среду ДМЕМ (среда Игла в модификации Дульбекко) и инкубируют 2 ч. Затем среду меняют на среду с 2% эмбриональной сывороткой. На поверхность полученного матрикса наносят нейральные стволовые клетки плотностью 1,25×10⁴/см². Культивируют клетки в течение 14 суток, среду меняют раз в 3 суток. В качестве контроля анализируют мезенхимальные стволовые клетки, культивируемые на поверхности полистирольного пластика дна планшета.A 50% pectin solution in an amount of 50 μl was added to the wells of a 96-well cell culture plate, then a 50 μl PSA solution was added and mixed, resulting in a 1-2 mm thick hydrogel layer. Then the hydrogel layer is freeze-dried, resulting in a pectin matrix in the form of a porous sponge. Before use, DMEM culture medium (Eagle medium modified by Dulbecco) is added to the formed pectin matrix and incubated for 2 hours. Then, the medium is changed to medium with 2% fetal serum. Neural stem cells with a density of 1.25 × 10 ⁴ / cm ² are applied to the surface of the obtained matrix. Cells are cultured for 14 days, the medium is changed every 3 days. As a control, mesenchymal stem cells cultured on the surface of the polystyrene plastic of the bottom of the tablet are analyzed.

При культивировании нейральных стволовых клеток на поверхности пористой губки из пектина со степенью этерификации 27,4% 95% клеток не проявляли признаков дифференцировки - клетки имели сферическую морфологию и не формировали отростков. Жизнеспособность культуры составила 82 ± 6%.When culturing neural stem cells on the surface of a porous pectin sponge with an esterification degree of 27.4%, 95% of the cells showed no signs of differentiation - the cells had a spherical morphology and did not form processes. The viability of the culture was 82 ± 6%.

Пример 8.Example 8

Готовят 1,5% раствор пектина со степенью этерификации 1,2%. Для этого 1,5 г пектина вносят в 95 мл дистиллированной воды и растворяют при постоянном перемешивании при температуре 90°C до получения однородного раствора, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000 g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор пектина стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°C) в течение 30 мин. Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА) следующего состава: 3 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 20 мМ HEPES-NaOH, pH 7,4.Prepare a 1.5% solution of pectin with a degree of esterification of 1.2%. For this, 1.5 g of pectin is introduced into 95 ml of distilled water and dissolved with constant stirring at a temperature of 90 ° C until a homogeneous solution is obtained, cooled to room temperature, and the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000 g to remove trace amounts of undissolved impurities. The pectin solution is autoclaved under 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes. Prepare a solution of a cross-linking agent (PSA) of the following composition: 3 mm CaCl ₂ , 150 mm NaCl, 20 mm HEPES-NaOH, pH 7.4.

В качестве основы используют флакон для культивирования клеток из полистирольного пластика. Раствором пектина, имеющего комнатную температуру, заполняют флакон для культивирования клеток, инкубируют 2 часа. Затем полностью удаляют раствор пектина из флакона. Флакон заполняют раствором ПСА, инкубируют 2 часа при комнатной температуре, удаляют ПСА. Сформированный матрикс представляет собой пленку толщиной около 0,3-0,07 мм, покрывающую внутреннюю поверхность флакона для культивирования клеток. На подготовленный матрикс наносят питательную среду ДМЕМ с низкой концентрацией глюкозы (0,1%) и инкубируют 1 ч для уравновешивания состава матрикса основными компонентами среды. После инкубирования питательную среду меняют на среду ДМЕМ с низкой концентрацией глюкозы (0,1%) с добавлением 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов b (bFGF), 10% сыворотки крови человека (human serum), создавая условия, типичные для поддержания активно пролиферирующих культур мезенхимных столовых клеток человека. Затем производят посев мезенхимных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга, плотностью 1,5×10⁴/см². Культивируют клетки в течение 12 суток, при этом питательную среду меняют через каждые двое суток.As a basis, use a bottle for culturing cells from polystyrene plastic. A solution of pectin, having room temperature, fill the cell culture vial, incubated for 2 hours. Then the pectin solution is completely removed from the vial. The vial is filled with a PSA solution, incubated for 2 hours at room temperature, PSA is removed. The formed matrix is a film with a thickness of about 0.3-0.07 mm, covering the inner surface of the cell culture vial. DMEM with a low glucose concentration (0.1%) is applied to the prepared matrix and incubated for 1 h to balance the composition of the matrix with the main components of the medium. After incubation, the nutrient medium is changed to DMEM medium with a low glucose concentration (0.1%) with the addition of 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 10 ng / ml fibroblast growth factor b (bFGF), 10% human serum (human serum), creating conditions typical for maintaining actively proliferating cultures of human mesenchymal table cells. Then, sowing of human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow with a density of 1.5 × 10 ⁴ / cm ² . Cells are cultured for 12 days, while the nutrient medium is changed every two days.

В качестве контроля анализируют мезенхимные стволовые клетки, культивируемые на поверхности лунок планшета для культивирования клеток, непокрытых матриксом. В контрольной культуре клетки формировали слой клеток с выраженной адгезией и признаками дифференцировки клеток.As a control, mesenchymal stem cells cultured on the surface of the wells of a plate for culturing cells uncoated with a matrix are analyzed. In the control culture, cells formed a layer of cells with pronounced adhesion and signs of cell differentiation.

Исследуемая культура на пектиновом матриксе представляла собой поля разрозненных слабо адгезированных клеток сферической формы, часть клеток характеризовалась веретеновидной формой или имела небольшое число отростков. Такие клетки в отдельных случаях образовывали ассоциации. В исследуемых культурах на матриксе, состоящем из пектина со степенью этерификации 1,2%, отсутствовали признаки начала дифференцировки и большая часть клеточной популяции через 12 суток культивирования маркировалась антителами против CD105 и CD166 антигенов. Количество недифференцированных клеток в культуре составило 98%. The studied culture on the pectin matrix was a field of scattered, weakly adhering cells of a spherical shape, some of the cells were characterized by a fusiform shape or had a small number of processes. Such cells in some cases formed associations. In the studied cultures, on the matrix consisting of pectin with a degree of esterification of 1.2%, there were no signs of the onset of differentiation and most of the cell population after 12 days of cultivation was marked with antibodies against CD105 and CD166 antigens. The number of undifferentiated cells in the culture was 98%.

Таким образом, в условиях, обычно создаваемых для эффективного наращивания биомассы стволовых клеток, матрикс на основе пектина эффективно подавляет дифференцировку клеток, сохраняя мультипотентные культуры мезенхимных стволовых клеток.Thus, under conditions usually created for the effective growth of stem cell biomass, a pectin-based matrix effectively suppresses cell differentiation while preserving multipotent cultures of mesenchymal stem cells.

Пример 9.Example 9

Готовят 3% раствор пектина со степенью этерификации 27,4%. Для этого 3 г пектина растворяют в 95 мл 150 мМ раствора NaCl (изотонический раствор) при постоянном перемешивании при температуре 90°C, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000 g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°C) в течение 30 мин.A 3% pectin solution with an esterification degree of 27.4% is prepared. To do this, 3 g of pectin is dissolved in 95 ml of a 150 mM NaCl solution (isotonic solution) with constant stirring at a temperature of 90 ° C, cooled to room temperature, the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000 g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is autoclaved at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes.

Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА), содержащий: 12 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 40 мМ HEPES-NaOH, pH 7,4.Prepare a solution of a cross-linking agent (PSA) containing: 12 mm CaCl ₂ , 150 mm NaCl, 40 mm HEPES-NaOH, pH 7.4.

Раствор пектина вносят в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток в количестве 250 мкл. Затем в лунки вносят по 1×10⁵ мезенхимных стволовых клеток крыс линии Wistar, выделенных из костного мозга бедренной и большеберцовой костей. В лунку добавляют 250 мкл раствора ПСА, добавляют 10 нг/мл фактора роста фибробластов b (bFGF), и тщательно перемешивают аспирацией, оставляют в покое на 30 мин для формирования матрикса. Сформированный матрикс представляет собой пектиновый гидрогель. Затем в лунки планшета на сформированный гидрогель вносят 500 мкл питательной среды DMEM с низким содержанием глюкозы (0,1%) с добавкой 10% фетальной бычьей сывороткой, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Культивируют клетки в течение 14 суток, среду меняют раз в 2 суток. Препараты анализируют на микроскопе Olympus IX83 с применением метода фазового контраста, а также метода флуоресцентной микроскопии.A pectin solution is added to the wells of a 24-well cell culture plate in an amount of 250 μl. Then, 1 × 10 ⁵ mesenchymal stem cells of Wistar rats isolated from the bone marrow of the femur and tibia are introduced into the wells. 250 μl of a PSA solution was added to the well, 10 ng / ml fibroblast growth factor b (bFGF) was added, and thoroughly mixed by aspiration, left alone for 30 minutes to form a matrix. The formed matrix is a pectin hydrogel. Then, 500 μl of low glucose DMEM culture medium with 0.1% supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin are added to the wells of the plate on the generated hydrogel. Cells are cultured for 14 days, the medium is changed every 2 days. The preparations are analyzed on an Olympus IX83 microscope using the phase contrast method, as well as fluorescence microscopy.

В данном примере мезенхимные стволовые клетки крысы были иммобилизованы внутри гидрогелей толщиной 4-5 мм, приготовленных в лунках планшета для культивирования клеток. Клетки сохраняли сферическую морфологию, часть клеток формировали отростки по мере культивирования. Для выявления жизнеспособности клеток внутри гелей проводили маркирование 2 мкМ Calcein AM и 50 мкг/мл пропидия йодидом с визуализацией результатов методом флуоресцентной микроскопии. Количество живых клеток составило 89%. Для выявления маркеров стволовых клеток проводили фиксацию образцов 4% формальдегидом на изотоническом солевом растворе, образцы отмывали от фиксатора, инкубировали в растворе криопротектора и получали препараты-срезы толщиной 25 мкм на криотоме Thermo, проводили иммуноцитохимическое выявление маркеров мезенхимных стволовых клеток CD90, CD44 с докрашиванием ядер DAPI по стандартной методике. Выявили, что после In this example, rat mesenchymal stem cells were immobilized inside 4-5 mm thick hydrogels prepared in the wells of a cell culture plate. The cells retained spherical morphology, some of the cells formed processes as they were cultured. To detect cell viability, the gels were labeled with 2 μM Calcein AM and 50 μg / ml propidium iodide with visualization of the results by fluorescence microscopy. The number of living cells was 89%. To identify stem cell markers, samples were fixed with 4% formaldehyde in isotonic saline, the samples were washed from the fixative, incubated in a cryoprotectant solution and 25 μm thick sections were prepared on a Thermo cryotome, immunocytochemical detection of CD90 and CD44 mesenchymal stem cell markers was carried out by staining DAPI by standard method. Revealed that after

14 суток культивирования не менее 82% клеточной популяции маркировалась антителами против указанных антигенов, что свидетельствует о сохранении культурой значительного пула мезенхимальных стволовых клеток.14 days of cultivation, at least 82% of the cell population was labeled with antibodies against these antigens, which indicates the preservation of a significant pool of mesenchymal stem cells by the culture.

Пример 10.Example 10

Готовят 3% раствор пектина со степенью этерификации 1,2%. Для этого 3 г пектина растворяют в 95 мл 150 мМ раствора NaCl (изотонический раствор) при постоянном перемешивании при температуре 90°C, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 100 мл. Полученный раствор центрифугируют в течение 20 мин при 3000 g для удаления следовых количеств нерастворенных примесей. Раствор полисахарида стерилизуют автоклавированием в условиях 0,7 атм (115°C) в течение 30 мин.A 3% pectin solution with an esterification degree of 1.2% is prepared. To do this, 3 g of pectin is dissolved in 95 ml of a 150 mM NaCl solution (isotonic solution) with constant stirring at a temperature of 90 ° C, cooled to room temperature, the solution volume is adjusted to 100 ml. The resulting solution was centrifuged for 20 min at 3000 g to remove trace amounts of undissolved impurities. The polysaccharide solution is autoclaved at 0.7 atm (115 ° C) for 30 minutes.

Готовят раствор поперечно-сшивающего агента (ПСА), содержащий: 6 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 40 мМ HEPES-NaOH, pH 7,4.A solution of a crosslinking agent (PSA) is prepared containing: 6 mM CaCl ₂ , 150 mM NaCl, 40 mM HEPES-NaOH, pH 7.4.

Раствор пектина вносят в лунки 24-луночного планшета для культивирования клеток в количестве 250 мкл. Затем в лунки вносят стволовые клетки человека, изолированные из обонятельной слизистой оболочки после биопсии носовой перегородки, предварительно рекультивированные в ходе трех пересевов культуры, в количестве 1×10⁵ клеток на лунку. В лунку добавляют 250 мкл раствора ПСА, добавляют ростовые факторы (50 нг/мл эпидермального фактора роста, 50 нг/мл основного фактора роста фибробластов) и тщательно перемешивают аспирацией, оставляют в покое на 30 мин для формирования матрикса. Сформированный матрикс представляет собой пектиновый гидрогель. Затем в лунки планшета на сформированный гидрогель вносят 500 мкл питательной среды Neurobasal с добавкой В-27 без витамина А и ростовыми факторами. Культивируют клетки в течение 14 суток, среду меняют раз в 3 суток. Препараты анализируют на микроскопе Olympus IX83 с применением метода фазового контраста, а также метода флуоресцентной микроскопии.A pectin solution is added to the wells of a 24-well cell culture plate in an amount of 250 μl. Then, human stem cells, isolated from the olfactory mucosa after a nasal septum biopsy, are pre-recultured during three culture passages, in the amount of 1 × 10 ⁵ cells per well. 250 μl of PSA solution is added to the well, growth factors (50 ng / ml epidermal growth factor, 50 ng / ml of the main fibroblast growth factor) are added and thoroughly mixed by aspiration, left alone for 30 min to form a matrix. The formed matrix is a pectin hydrogel. Then, 500 μl of Neurobasal nutrient medium supplemented with B-27 without vitamin A and growth factors was added to the wells of the plate on the formed hydrogel. Cells are cultured for 14 days, the medium is changed every 3 days. The preparations are analyzed on an Olympus IX83 microscope using the phase contrast method, as well as fluorescence microscopy.

В данном примере стволовые клетки человека, изолированные из обонятельной слизистой оболочки были иммобилизованы внутри гидрогелей толщиной 4-5 мм, приготовленных в лунках планшета для культивирования клеток. Клетки сохраняли сферическую морфологию, мене 5% клеток формировали отростки по мере культивирования. Для выявления жизнеспособности клеток внутри гелей проводили маркирование 2 мкМ Calcein AM и 50 мкг/мл пропидия йодидом с визуализацией результатов методом флуоресцентной микроскопии. Количество живых клеток составило 92%. Для выявления маркеров стволовых клеток проводили фиксацию образцов 4% формальдегидом на изотоническом солевом растворе, образцы отмывали от фиксатора, инкубировали в растворе криопротектора и получали препараты-срезы толщиной 2 5 мкм на криотоме Thermo, проводили иммуноцитохимическое выявление маркеров стволовых клеток данного типа - CD44, Notch3, VEGF, GFAP с докрашиванием ядер DAPI по стандартной методике.In this example, human stem cells isolated from the olfactory mucosa were immobilized inside hydrogels 4-5 mm thick prepared in the wells of a cell culture plate. The cells retained spherical morphology, less than 5% of the cells formed processes as they were cultured. To detect cell viability, the gels were labeled with 2 μM Calcein AM and 50 μg / ml propidium iodide with visualization of the results by fluorescence microscopy. The number of living cells was 92%. To identify stem cell markers, samples were fixed with 4% formaldehyde in isotonic saline, the samples were washed from the fixative, incubated in a cryoprotectant solution and sliced preparations with a thickness of 2.5 μm were used on a Thermo cryotome, and immunocytochemical detection of stem cell markers of this type — CD44, Notch3 , VEGF, GFAP with staining DAPI cores according to standard methods.

Выявили, что после 14 суток культивирования не менее 87% клеточной популяции дифференциально маркировалась антителами против указанных антигенов, что свидетельствует о сохранении культурой значительного пула стволовых клеток.It was revealed that after 14 days of culturing, at least 87% of the cell population was differentially labeled with antibodies against these antigens, which indicates that the culture retained a significant pool of stem cells.

Как видно из результатов, представленных в примерах, заявленный способ культивирования стволовых клеток обеспечивает достижение поставленной задачи. Он позволяет получать матриксное покрытие в виде слоя гидрогеля толщиной около 1-2 мм (пример 1), в виде пленки толщиной 0,1-0,5 мм (примеры 2, 3, 8), в виде тонкой пленки (примеры 4, 5), пористых губок (пример 7), гелей (пример 6, 9,10).As can be seen from the results presented in the examples, the claimed method of culturing stem cells ensures the achievement of the task. It allows you to get a matrix coating in the form of a hydrogel layer with a thickness of about 1-2 mm (example 1), in the form of a film with a thickness of 0.1-0.5 mm (examples 2, 3, 8), in the form of a thin film (examples 4, 5 ), porous sponges (example 7), gels (example 6, 9,10).

Способ позволяет использовать пектины с различной степенью этерификации до 50%: 1,2% (пример 2), 18,8% (примеры 4, 5), 27,4% (примеры 1, 6), 50,0% (пример 3).The method allows the use of pectins with varying degrees of esterification up to 50%: 1.2% (example 2), 18.8% (examples 4, 5), 27.4% (examples 1, 6), 50.0% (example 3 )

Способ позволяет использовать в качестве основы посуду для культивирования клеток, такую как планшеты для культивирования клеток (примеры 1, 3, 6, 7, 9, 10), флаконы для культивирования клеток (пример 2, 8), стеклянные подложки (пример 4), полимерные подложки (пример 5).The method allows you to use as a basis utensils for cell culture, such as tablets for cell culture (examples 1, 3, 6, 7, 9, 10), bottles for cell culture (example 2, 8), glass substrates (example 4), polymer substrates (example 5).

Способ позволяет проводить наработку основы, обработанной препаратами пектинов, и хранить подготовленную основу в течение длительного времени (до 18 месяцев), проводя формирование матрикса непосредственно перед культивированием клеток (примеры 3, 4, 5, 7).The method allows to produce a base treated with pectin preparations and store the prepared base for a long time (up to 18 months), conducting the formation of the matrix immediately before cell cultivation (examples 3, 4, 5, 7).

Способ позволяет вести формирование матрикса в присутствие раствора ПСА, содержащего в качестве поперечно-сшивающего агента хлорид кальция (примеры 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10), нитрат кальция (пример 3). Также формирование матрикса можно вести в присутствие питательной среды, например среды ДМЕМ, которая сама играет роль раствора ПСА (пример 5).The method allows the formation of a matrix in the presence of a PSA solution containing calcium chloride as examples of a cross-linking agent (examples 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10), calcium nitrate (example 3). Also, the formation of the matrix can be carried out in the presence of a nutrient medium, for example, DMEM, which itself plays the role of a PSA solution (example 5).

Способ позволяет подавлять дифференцировку различных типов стволовых клеток в культуре: нейральных стволовых клеток эмбрионального мозга крыс (примеры 1, 2, 3, 4, 6, 7), эмбриональных стволовых клеток мыши (примеры 5), мезенхимные стволовые клетки человека, выделенные из костного мозга (пример 8), мезенхимные стволовые клетки крысы (пример 9), стволовые клетки обонятельной слизистой человека (пример 10). Способ позволяет использовать питательную среду, подходящую для данного типа клеток - среду ДМЕМ (примеры 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9), среду Neurobasal (примеры 3, 6, 9), среду N2B27 (пример 5), добавки в виде эмбриональной сыворотки (примеры 1, 2, 4, 7, 10), ростовых факторов (примеры 3, 5, 6, 8, 9, 10), которые в том числе можно вводить непосредственно в состав матрикса (пример 6, 9, 10).The method allows to suppress the differentiation of various types of stem cells in culture: neural stem cells of rat embryonic brain (examples 1, 2, 3, 4, 6, 7), mouse embryonic stem cells (examples 5), human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow (example 8), rat mesenchymal stem cells (example 9), stem cells of the human olfactory mucosa (example 10). The method allows the use of a nutrient medium suitable for this type of cell - DMEM medium (examples 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9), Neurobasal medium (examples 3, 6, 9), N2B27 medium (example 5), additives in the form of fetal serum (examples 1, 2, 4, 7, 10), growth factors (examples 3, 5, 6, 8, 9, 10), which can also be added directly to the matrix (example 6, 9, 10).

Любой из вышеописанных вариантов осуществления способа позволяет эффективно подавлять спонтанную дифференцировку стволовых клеток в культуре, сохраняя стволовые клетки, способные к дальнейшему росту и дифференцировке.Any of the above embodiments of the method can effectively suppress the spontaneous differentiation of stem cells in culture, while maintaining stem cells capable of further growth and differentiation.

Claims (10)

1. Способ культивирования стволовых клеток млекопитающих, препятствующий их спонтанной дифференцировке, включающий приготовление раствора полисахарида, нанесение раствора полисахарида на основу, формирование на ней полисахаридного матрикса и высев культуры клеток, отличающийся тем, что в качестве полисахарида берут раствор пектина с концентрацией до 5% и степенью этерификации не более 50%; формирование полисахаридного матрикса ведут в присутствии раствора поперечно-сшивающего агента ионного типа.1. A method of culturing mammalian stem cells that impedes their spontaneous differentiation, including preparing a polysaccharide solution, applying a polysaccharide solution to a substrate, forming a polysaccharide matrix on it and plating a cell culture, characterized in that a pectin solution with a concentration of up to 5% is taken as a polysaccharide and degree of esterification no more than 50%; the formation of the polysaccharide matrix is carried out in the presence of a solution of an ionic type cross-linking agent. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после нанесения раствора полисахарида на основу избыток раствора полисахарида удаляют.2. The method according to p. 1, characterized in that after applying the polysaccharide solution to the base, the excess polysaccharide solution is removed. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после нанесения раствора полисахарида на основу избыток раствора полисахарида удаляют и основу промывают.3. The method according to p. 1, characterized in that after applying the polysaccharide solution to the base, the excess polysaccharide solution is removed and the base is washed. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после нанесения раствора полисахарида на основу избыток раствора полисахарида удаляют, после чего основу высушивают.4. The method according to p. 1, characterized in that after applying the polysaccharide solution to the base, the excess polysaccharide solution is removed, after which the base is dried. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после нанесения раствора полисахарида на основу, избыток раствора полисахарида удаляют, основу промывают и высушивают.5. The method according to p. 1, characterized in that after applying the polysaccharide solution to the base, the excess polysaccharide solution is removed, the base is washed and dried. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве раствора поперечно-сшивающего агента ионного типа используют композицию, содержащую растворимую соль кальция, натрия хлорид, и буферную систему на основе нетоксичных для клеток компонентов.6. The method according to p. 1, characterized in that as a solution of a cross-linking agent of ionic type, a composition containing a soluble salt of calcium, sodium chloride, and a buffer system based on components non-toxic to cells are used. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве раствора поперечно-сшивающего агента ионного типа используют питательную среду для клеток, содержащую ионы кальция.7. The method according to p. 1, characterized in that as a solution of a cross-linking agent of the ionic type, a nutrient medium for cells containing calcium ions is used. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после формирования пектинового матрикса его подвергают лиофильной сушке.8. The method according to p. 1, characterized in that after the formation of the pectin matrix, it is subjected to freeze drying. 9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве основы для формирования матрикса используют либо подложки стеклянные или полимерные, либо сосуды для культивирования клеток.9. The method according to p. 1, characterized in that as the basis for the formation of the matrix using either glass or polymer substrates, or vessels for culturing cells. 10. Способ культивирования стволовых клеток млекопитающих, препятствующий их спонтанной дифференцировке, включающий приготовление раствора полисахарида, внесение раствора полисахарида в сосуд для культивирования клеток, формирование полисахаридного матрикса и высев культуры клеток, отличающийся тем, что в качестве полисахарида берут раствор пектина с концентрацией до 5% и степенью этерификации не более 50%, приготовленного на изотоническом растворе, высев культуры клеток выполняют перед формированием полисахаридного матрикса с последующим перемешиванием, к полученной смеси добавляют поперечно-сшивающий агент ионного типа, приготовленный на изотоническом растворе. 10. A method of culturing mammalian stem cells that impedes their spontaneous differentiation, including preparing a polysaccharide solution, introducing a polysaccharide solution into a cell culture vessel, forming a polysaccharide matrix and plating a cell culture, characterized in that a pectin solution with a concentration of up to 5% is taken as a polysaccharide and the degree of esterification of not more than 50% prepared in an isotonic solution, seeding of cell cultures is performed before the formation of the polysaccharide matrix with after uyuschim stirring, and thereto is added the crosslinking agent is of ionic type, prepared in isotonic solution.

Images