RU2812484C1 - Штамм бактерий Bacillus licheniformis - продуцент кератиназы - Google Patents
Штамм бактерий Bacillus licheniformis - продуцент кератиназы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812484C1 RU2812484C1 RU2023123400A RU2023123400A RU2812484C1 RU 2812484 C1 RU2812484 C1 RU 2812484C1 RU 2023123400 A RU2023123400 A RU 2023123400A RU 2023123400 A RU2023123400 A RU 2023123400A RU 2812484 C1 RU2812484 C1 RU 2812484C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacillus licheniformis
- keratinase
- strain
- keratin
- producer
- Prior art date
Links
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 title claims abstract description 30
- 108010059345 keratinase Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 4
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 abstract description 33
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 abstract description 19
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 101710200191 Feather keratin Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001530 keratinolytic effect Effects 0.000 description 3
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- -1 monosubstituted potassium phosphate Chemical class 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical class [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000187761 Streptomyces albidoflavus Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 2
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N L-lanthionine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CSC[C@H](N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- IMSOBGJSYSFTKG-PKPIPKONSA-N Lysinoalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNCC(N)C(O)=O IMSOBGJSYSFTKG-PKPIPKONSA-N 0.000 description 1
- 241000272458 Numididae Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000122973 Stenotrophomonas maltophilia Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N bromochloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Br GEHJBWKLJVFKPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N meso-lanthionine Natural products OC(=O)C(N)CSCC(N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013515 script Methods 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052979 sodium sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- GRVFOGOEDUUMBP-UHFFFAOYSA-N sodium sulfide (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[S-2] GRVFOGOEDUUMBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для переработки кератинсодержащего сырья, преимущественно кератина пера, полученного от птицеперерабатывающей промышленности. Предложен штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 ВКПМ В-14244 - продуцент кератиназы. Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 является природным изолятом, выделен из естественных условий - воды Балтийского залива. Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении нового штамма Bacillus licheniformis - продуцента кератиназы, способного ферментировать перо до аминокислот и пептидов в среде с единственным источником углерода в виде пера сельскохозяйственной птицы. 3 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для переработки кератинсодержащего сырья, преимущественно кератина пера, полученного от птицеперерабатывающей промышленности.
Кератин представляет собой волокнистый и нерастворимый структурный белок, сильно сшитый дисульфидными, водородными и гидрофобными связями, что обеспечивает механическую стабильность и устойчивость к действию распространенных протеолитических ферментов, таких как пепсин, трипсин и папаин. Кератинолитические ферменты имеют важное применение в биотехнологических процессах для разработки экологически чистых процессов и для обработки кератинсодержащих отходов птицеводческой и кожевенной промышленности. После гидролиза перья можно использовать в качестве удобрения, кормовой добавки, обогащенной такими аминокислотами, как серии, цистеин и пролин. Процесс обработки кератиназой заменяет использование сульфида натрия в процессе удаления волос в кожевенной промышленности [Radha, S., & Gunasekaran, P. (2007). Cloning and expression of keratinase gene in Bacillus megateriumand optimization of fermentation conditions for the production of keratinase by recombinant strain. Journal of Applied Microbiology, 103(4), 1301-1310. doi: 10.1111/j.1365-2672.2007.03372.x].
Известен способ получения кератинового монопродукта, предназначенного для использования в ветеринарии, медицине, косметологии, биотехнологии, пищевой промышленности, а также в качестве белковой кормовой добавки к основному рациону животных и птиц, заключающийся в том, что исходный кератинсодержащий материал обрабатывают раствором соляной кислоты и пероксида водорода (см. RU 2679884 С1, опубл. 14.02.2019, Бюл. №5, МПК С08Н 1/06, A23K 10/26).
Однако представленный образец разрушает кератин пера в экстремальных условиях химического гидролиза, которые могут привести к потере незаменимых аминокислот, таких как лизин, метионин и триптофан; между тем, эти условия могут вызывать образование непитательных аминокислот, таких как лизиноаланин, лантионин и др. Указанный недостаток решается благодаря обработки пера ферментами, а также микроорганизмами, включая бактерии, актиномицеты, грибы.
Благодаря широкому спектру активности кератиназы считаются эффективной альтернативой химическим и термическим способам обработки вторичных отходов различных промышленных производств, богатых белком [Akram, F., ul Haq, I., & Jabbar, Z. Production and characterization of a novel thermo-and detergent stable keratinase from Bacillus sp. NKSP-7 with perceptible applications in leather processing and laundry industries. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 164: 371-383. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.07.146]. Микробные кератинолитические ферменты позволяют расщеплять кератин в мягких условиях, в результате чего образуются гидролизаты кератина, содержащие неповрежденные аминокислоты и пептиды [Holkar, С.R., Jain, S.S., Jadhav, A.J., & Pinjari, D.V. Valorization of keratin-based waste. Process Safety and Environmental Protection, 2018, 115: 85-98. doi: 10.1016/j.psep.2017.08.045].
Bacillus licheniformis BBE 11-1 и Stenotrophomonas maltophilia BBE 11-1 были использованы для разложения 50 г/л отходов куриного пера. Скорость разложения составила 35,4% и 22,8% за 96 ч, соответственно. Скорость деградации при совместном использовании культур достигла 55,2% из-за более высокой активности кератиназы и протеазы. При совместном культивировании в ферментере объемом 3 л при контроле растворенного кислорода и температуры скорость деградации была значительно увеличена до 81,8%, а коэффициент конверсии составил 70,0% за 48 ч. Гидролизаты проявляли антиоксидантную активность и содержали большое количество аминокислот (895,89 мг/дл3) и растворимых пептидов [Peng, Z., Мао, X., Zhang, J., Du, G., & Chen, J. Effective biodegradation of chicken feather waste by co-cultivation of keratinase producing strains. Microbial cell factories, 2019, 18(1), 84. doi: 10.1186/s12934-019-1134-9].
Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis-60 BKM B-2366 Д - продуцент щелочной протеазы (см. RU 2303066 С1, опубл. 20.07.2007, Бюл. №20, МПК C12N 9/56, C12N 1/20, C12R 1/66). Однако штамм Bacillus licheniformis-60 обладает высокой продуктивностью преимущественно в отношении комплекса щелочных протеаз, необходимых для гидролиза растительных белков, и гораздо в меньшей степени в отношении фермента кератиназы, специфично гидролизующего кератиноподобные белки которые отличаются устойчивостью к деградации обычными протеолитическими ферментами.
Известен штамм Bacillus licheniformis BKM В-2220Д - продуцент кератиназы (сериновой протеазы), раскрытый в патенте RU 2177994 С2, опубл. 10.01.2002, Бюл. №1, МПК C12N 1/20, C12N 9/56, C12R 1/10, который может быть использован в микробиологической промышленности для производства ферментных препаратов, применяемых в легкой промышленности и в сельском хозяйстве, где требуется гидролиз нативного кератина. Штамм Bacillus licheniformis BKM В-222ОД обладает повышенной способностью к биосинтезу кератиназы и продуцирует не менее шести внеклеточных ферментов, в том числе щелочную протеазу и а-амилазу, которые усиливают гидролизующий эффект кератиназного препарата. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 40°С в течение 48-72 ч, рН среды 7,5-7,8.
Однако для штамма Bacillus licheniformis BKM В-2220Д нет информации о возможности его роста на питательной среде с единственным источником углерода в виде пера птицы.
Были выделены четыре микроорганизма Bacillus licheniformis В-740, Bacillus pumilus В-508, Bacillus subtilis АТСС 6051 и Streptomyces albidoflavus АТСС 25422, обладающие максимально выраженными производственными признаками: концентрация биомассы при культивировании данных штаммов равнялась 335,0 1×10-3 КОЕ/г, уровень кератинолитической активности продуцируемых штаммами ферментов - в среднем 30 Е/мг белка, показатель накопления белка в биомассе от 65,2 до 76,5% и степень гидролиза белка от 78,4 до 79,4% [Дмитриева А.И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. №4 С. 602-615].
Однако для данных штаммов Bacillus licheniformis В-740, Bacillus pumilus В-508, Bacillus subtilis АТСС 6051 и Streptomyces albidoflavus АТСС 25422 не предоставлена информации о возможности их культивировать на питательной среде с единственным источником углерода в виде пера птицы.
Известны штаммы Bacillus licheniformis O.W.U. 138В и 88В, а также другие штаммы, способные разлагать перо диких птиц. Например, штаммы и кератиназы, продуцируемые этими штаммами, полезны для деградации отходов пера, полученных при промышленной переработке домашней птицы; производства кормов для животных, удобрений или природного газа из отходов птицеводства; и чистки некоторых тканей (см. US 5877000 А, опубл. 02.03.1999, МПК C12N 9/56, US 6214576 В1, опубл. 10.04.2001, МПК C12N 9/56).
Однако представленные образцы штаммов Bacillus licheniformis О. W.U. 138В и 88В не могут расти на питательной среде с единственным источником углерода в виде пера птицы.
Наиболее близким аналогом к заявляемому штамму по совокупности существенных признаков и достигаемому техническому результату является штамм Bacillus licheniformis БАЛ-1, депонированный в Биоресурсный Центр Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКГТМ) НИЦ Курчатовский институт под номером В-14243, дата депонирования 30 мая 2022 года.
При выращивании на питательной среде с внесением единственного источника углерода в виде пера птицы конечная концентрация клеток достигает 1×106 КОЕ/мл. При ферментации пера в течение 72 ч при 28°С и постоянном перемешивании имеет кератиназную активность 16,2 KU/мл.
Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-1 не обладает достаточной кератиназной активностью и спектром выделяемых кератиназ для разрушения свободных кератинов в культуральной жидкости, имеет большое количество фенотипов, появляющихся в процессе ферментации.
Задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении нового штамма Bacillus licheniformis, продуцирующего кератиназу, способную перерабатывать перо сельскохозяйственной птицы.
Согласно ГОСТ 18473-88 Птицеводство. Термины и определения: к сельскохозяйственной птице относится птица, разводимая с целью получения от нее яиц, мяса, пера, пуха. Так, к сельскохозяйственной птице относятся: куры, индейки, цесарки, утки, гуси, перепела и голуби.
Технический результат предлагаемого изобретения состоит в получении нового штамма Bacillus licheniformis - продуцента кератиназы, способного ферментировать перо до аминокислот и пептидов в среде с единственным источником углерода в виде пера сельскохозяйственной птицы.
Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ Курчатовский институт под номером В-14244, дата депонирования 30 мая 2022 года. Штамм способен храниться в лиофильном виде при температуре 4-6°С.
Условия хранения штамма.
Полученный из коллекции штамм высевают в условиях асептики на триптиказеино-соевый агар (г/л): триптон - 17; соевый пептон - 3; хлорид натрия - 5; фосфат калия двузамещенный - 2,5; глюкоза - 2,5; вода очищенная - до 1000 мл; агар - 12. Среду автоклавируют при 121°С 15 мин.
На данной питательной среде штамм способен храниться в течении одного месяца при температуре 2-8°С.
Характеристика штамма.
Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 является природным изолятом, выделен из естественных условий - воды Балтийского залива.
Факультативный анаэроб. Температурный диапазон роста - 10-55°С, колонии на триптиказеино-соевом агаре слабовыпуклые, сухие, непрозрачные, белесые, полиморфные, диаметром 5-7 мм, врастающие в питательную среду.
Клетки представляют собой грамположительные одиночные подвижные палочки размером 0,6-0,8 и 0,2-0,3 мкм, спорообразующие. Оптимальная температура роста 28°С. В логарифмической фазе роста образуются цепочки из 2-3-х клеток более вытянутой формы. В стационарной фазе роста цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму. Штамм гидролизует казеин и крахмал, разжижает желатин.
Идентификация штамма Bacillus licheniformis БАЛ-2 была проведена на основании морфологических и физиолого-биохимических характеристик. Также была определенна нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК. Гомология с нуклеотидной последовательностью гена 16S рРНК штамма Bacillus licheniformis QT445 составила 97,06%.
Вид Bacillus licheniformis одобрен Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) как GRAS (Generally Recognized As Safe), что означает, что штаммы этого вида, как и продуцируемые ими протеазы, могут безопасно и без ограничений применяться для пищевых биотехнологий [URL: https://www.cfsanappsexternal.fda.gov/scripts/fdcc/?set=GRASNotices&sort=GRN_No&order=DESC&startrow=1&type=basic&search=Bacillus%201icheniformis (дата обращения 01.08.2023)].
Штамм способен расти на среде с единственным источником углерода в виде пера сельскохозяйственной птицы. В колбу, содержащую 100 мл минерально-питательной среды (состав среды в г/л: фосфат калия однозамещенный - 2, сульфат аммония - 2, сульфат магния семиводный - 0,125, хлорид натрия - 0,5, сульфат железа (II) семиводный - 0,002, вода очищенная - до 100 мл, рН среды 7,5) вносили 5 г измельченного пера сельскохозяйственной птицы, а также штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2. Инокулят штамма Bacillus licheniformis вносился до конечной концентрации 1×106 КОЕ/мл. Ферментация пера проводилась в течение 72 ч при температуре 28°С при постоянном перемешивании. По окончании процесса ферментации визуально наблюдалось изменение оптической плотности (помутнение среды), что свидетельствовало об увеличении количества микроорганизмов в культуральной среде. Кроме того, было замечено изменение консистенции перьевого сырья в сторону повышения пластичности (размягчения), что представлено на фиг. 1.
Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 не заменяется фенотипами, появляющимися во время ферментации, является продуцентом кератиназ. Кератиназная активность штамма составляет 18,3 KU/мл.
Кератиназную активность штамма определяли следующим образом: раствор кератина готовили по Grywnowicz et al., 1989. Образец перьев сельскохозяйственной птицы весом 10 г нагревали в обратном холодильнике при температуре 100°С в течение 2 ч с 500 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Кератин, экстрагированный ДМСО, содержал 1-2% белка. Солюбилизированный кератин осаждали добавлением двух объемов холодного ацетона с температурой - 90°С на объем раствора кератина. Эту смесь оставляли в холодильнике на 2 ч, чтобы обеспечить максимальное осаждение кератина. По истечении этого времени смесь центрифугировали при 6000 g, а затем осадок промывали четырьмя объемами воды на объем осадка. Затем осадок суспендировали в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0 или рН 8,0.
Протеолитическую активность субстрата из кератина перьев (KS) измеряли с использованием суспензии кератина, содержащей 2% белка в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, с 0,01 М MgCl2. Порцию 1 мл раствора фермента добавляли к 1 мл суспензии KS в реакционном буфере. После 1 ч инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 2 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, после чего раствор фильтровали. Одна единица протеолитической активности определялась как количество фермента, которое вызывало увеличение поглощения на 0,01 между образцом и контролем при 280 нм. Контроль: 1 мл суспензии KS в реакционном буфере после 1 ч инкубации с добавлением 2 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора фермента.
Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 способен разлагать кератин пера до незаменимых аминокислот, что подтверждается данными тонкослойной бумажной хроматографии (фиг. 2). Было выявлено присутствие следующих аминокислот в культуральной жидкости ферментированного сырья: лизин, метионин, треонин, валин, фенилаланин. Наблюдалась большая цветовая насыщенность пятен аминокислот в культуральной жидкости штамма Bacillus licheniformis БАЛ-2, указывающая на большую степень деградации кератина до аминокислот.
Штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2 способен переводить неусвояемый кератин в перевариваемые пептиды, что подтверждено методом двумерного электрофореза с масс-спектрометрией ферментированного пера (фиг. 3).
Преимущество нового ферментного концентрата заключается в эффективном воздействия на перо сельскохозяйственной птицы с целью деградации пера до перевариваемых белков и незаменимых аминокислот.
Применение нового ферментного концентрата существенно повысит степень рентабельности производства за счет снижения себестоимости кормового сырья, полученного от деградации измельченного пера сельскохозяйственной птицы, и обогащения незаменимых аминокислотами, появившимися в процессе деградации.
Пример 1.
В колбу, содержащую 100 мл минерально-питательной среды (состав среды в г/л: фосфат калия однозамещенный - 2, сульфат аммония - 2, сульфат магния семиводный - 0,125, хлорид натрия - 0,5, сульфат железа (II) семиводный - 0,002, рН 7,5) вносили 5 г измельченного пера сельскохозяйственной птицы, а также штамм Bacillus licheniformis БАЛ-2. Посевной материал штамма Bacillus licheniformis вносился до конечной концентрации 1×106 КОЕ/мл. Ферментация пера проводилась в течение 72 ч при 28°С.
Последующий пересев в колбы на 750 мл со средой, состоящей из следующих компонентов сухих веществ (г/л): измельченное перо - 50; фосфат калия однозамещенный - 2,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния семиводный - 0,125; хлорид натрия - 0,5; сульфат железа (2) семиводный - 0,002; вода очищенная - до 250 мл.
Пересев осуществляют при рН, равном 7,5; температуре 26-28°С; при скорости вращения мешалки - 160-180 об/мин. Кератиназная активность через 72 ч культивирования составила 23,6 KU/мл.
Пример 2.
Культивирование осуществляется в промышленном ферментере. Перо сельскохозяйственной птицы измельчается в промышленной мясорубке до фракции 1-2 мм.
Перед внесением инокулята происходит мойка и стерилизации ферментера - пустой ферментер наполняют горячей водой 90-95°С, мойка проходит в течение 30 минут. Затем в течение 30 минут аппараты промывают 3-5% раствором кальцинированной соды, после их ополаскивают горячей водой с температурой 70-85°С.
Состав среды для накопления инокулята (г/л): измельченное перо сельскохозяйственной птицы - 50; фосфат калия однозамещенный - 2,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния семиводный - 0,125; хлорид натрия - 0,5; сульфат железа (2) семиводный - 0,002. Посевной материал получают как описано в примере 1. Посевной материал вносят до конечной концентрации 1×106 КОЕ/мл; время выращивания посевного материала - 36,5 ч; при рН 7,5; температуре 28°С; скорость работы мешалки 39,5 об/ч. Кератиназная активность определялась через 36,5 ч культивирования и составила 32,4 KU/мл.
Пример 3.
Культивирование осуществляется в промышленном ферментере. Получали посевной материал как описано в примере 2, расход посевного материала для ферментера рассчитывается к полезному объему ферментера и составляет 5%, время ферментации 72 ч при скорости мешалки 80 об/ч, при избыточном давлении 40 кПа, непрерывной аэрации среды стерильным воздухом (расход воздуха 60 м3/л среды в час). Посевная линия и штуцер отбора проб в течение всего периода ферментации должен находится под паром. При нормальных условиях роста конечное значение рН среды должно быть 6,9-7,2 при температуре 28°С.
Питательная среда для ферментера компонуется в реактор-смеситель, подается через нагревательную колонку и выдерживатель. Состав среды сухих веществ (г/л): пера сельскохозяйственной птицы - 50; фосфат калия однозамещенный - 2,0; сульфат аммония - 2,0; сульфат магния семиводный - 0,125; хлорид натрия - 0,5; сульфат железа (2) семиводный - 0,002. Куриное перо измельчалось аналогично примеру 2.
Количество вносимого измельченного сырья рассчитывается как содержание абсолютно сухого вещества (измельченного сырья), умноженного на фактическую влажность и внесенного в ферментер в двойном количестве, - при влажности сырья в 65,7% и содержании абсолютно сухих веществ 50 г/л будет вноситься: 171,6 г/л.
Кератиназная активность определялась через 72 ч культивирования и составила 48,6 KU/мл.
Пример 4.
Полученную культуральную среду, как описано в примере 3, очищают от компонентов среды и бактериальной биомассы методом фильтр-пресса для последующего концентрирования в вакуум-выпарных установках при температуре 50-55°С до 1/4 объема содержания сухих веществ. Полученный данным способом концентрат обладает кератиназной активность 291,6 KU/мл.
Claims (1)
- Штамм бактерий Bacillus licheniformis БАЛ-2 ВКПМ В-14244 - продуцент кератиназы.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812484C1 true RU2812484C1 (ru) | 2024-01-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2177994C2 (ru) * | 2000-01-17 | 2002-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент кератиназы |
| RU2303066C1 (ru) * | 2005-11-14 | 2007-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis-продуцент щелочной протеазы |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2177994C2 (ru) * | 2000-01-17 | 2002-01-10 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент кератиназы |
| RU2303066C1 (ru) * | 2005-11-14 | 2007-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм бактерий bacillus licheniformis-продуцент щелочной протеазы |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PFLEIDER, E., et al. Microorganisms in processing of leather, 1988 p. 730-739, In H. J. Rehm (ed. ), Biotechnology, vol. 6b. Special microbial processes. VCH Verlagsgeselschaft mbH, Weinheim, Germany. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | Keratinolytic activity of Bacillus megaterium F7-1, a feather-degrading mesophilic bacterium | |
| CN100419072C (zh) | 一种角蛋白酶的产生菌及其制备方法 | |
| CN108004169B (zh) | 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用 | |
| Lo et al. | Production of keratinolytic enzyme by an indigenous feather–degrading strain Bacillus cereus Wu2 | |
| CN103834603A (zh) | 一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114921385B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在饲料添加和无抗养殖中的应用 | |
| CN105733999B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis FJ-3-16及其应用 | |
| CN110317748A (zh) | 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用 | |
| US6214576B1 (en) | Bacteria useful for degrading keratin | |
| Tarrant et al. | Proteolytic enzyme preparation from Pseudomonas fragi: its action on pig muscle | |
| CN108203729B (zh) | 一种巨藻抗氧化肽的制备方法 | |
| Suharti et al. | Keratinase production by Bacillus sp. MD24 in sub-merge and solid state fermentation | |
| RU2812484C1 (ru) | Штамм бактерий Bacillus licheniformis - продуцент кератиназы | |
| Nurkhasanah | Preliminary study on keratinase fermentation by Bacillus sp. MD24 under solid state fermentation | |
| CN104560817A (zh) | 一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌utm102 及其应用 | |
| Pissuwan et al. | Production of keratinase by Bacillus sp. FK 28 isolated in Thailand | |
| Rahayu et al. | Quality of chicken feather processed in different conditions | |
| Tamilmani et al. | Production of an extra cellular feather degrading enzyme by Bacillus licheniformis isolated from poultry farm soil in Namakkal district (Tamilnadu) | |
| CN113862169B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在羽毛降解中的应用 | |
| CN115772482A (zh) | 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌、菌剂及其应用 | |
| Jahan et al. | Screening of keratinolytic bacteria from poultry wastes | |
| Coello et al. | Kocuria rosea as a new feather degrading bacteria | |
| CN110506839A (zh) | 一种羽毛粉添加剂、制备方法及其应用 | |
| Mukhtar et al. | Isolation and screening of keratinase producing bacteria from soil | |
| CN117603889B (zh) | 饲用产酸性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用 |