RU2810057C2

RU2810057C2 - Aldehyde modified hyaluronic acid, method of its preparation and its use

Info

Publication number: RU2810057C2
Application number: RU2021113180A
Authority: RU
Inventors: Патрик ПЛИТТ; Колин ДРАБЕ; Сибилла МЮЛЛЕР; Радован ВУКИЧЕВИЧ; Йенс НОЙБАУЭР; Шарлотта РЕЙТЕР
Original assignee: Мерц Фарма Гмбх Энд Ко. Кгаа
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2023-12-21

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: following is described: a group of inventions including a modified hyaluronic acid derivative (variants), a method of production of a modified hyaluronic acid derivative, the use of a modified hyaluronic acid derivative for in situ production of a cross-linked hydrogel for aesthetic medicine for the treatment of wrinkles and skin folds, the use of a modified hyaluronic acid derivative for in situ in vitro preparation of cross-linked hydrogel, cross-linked hydrogel (options), method for obtaining cross-linked hydrogel (options), kit for in situ preparation of cross-linked hydrogel.

EFFECT: invention expands the arsenal of modified hyaluronic acid derivatives.

32 cl, 4 dwg, 8 tbl, 7 ex

Description

Настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, способам его получения и его применению. Новое модифицированное производное гиалуроновой кислоты характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.The present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative, methods for its preparation and its use. The new modified hyaluronic acid derivative is characterized in that the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[1] Инъекционные филлеры сегодня используют для многих терапевтических и эстетических целей для увеличения объема мягких тканей. В эстетической медицине кожные филлеры все больше используют для омоложения лица и некоторых зон тела. Они обеспечивают возможность улучшения черт лица (например, щек и губ), уменьшения морщин (например, носогубных складок) и складок, а также могут восстанавливать часть утраченного объема и эластичности кожи и подлежащих тканей, которые возникают с возрастом. Это делает кожу более гладкой и объемной и, таким образом, кожа выглядит моложе.[1] Injectable fillers are used today for many therapeutic and aesthetic purposes to increase soft tissue volume. In aesthetic medicine, dermal fillers are increasingly used to rejuvenate the face and certain areas of the body. They provide the ability to improve facial features (such as cheeks and lips), reduce wrinkles (such as nasolabial folds) and folds, and can restore some of the lost volume and elasticity of the skin and underlying tissues that occurs with age. This makes the skin smoother and more voluminous and thus makes the skin look younger.

[2] Для применения в качестве филлеров для мягких тканей известно множество материалов. Большинство указанных материалов оказывают временный эффект (примерно от трех до восемнадцати месяцев), поскольку они ресорбируются в организме (например, коллаген, гиалуроновая кислота (HA), поли-L-молочная кислота (PLLA)). Также существует небольшое количество перманентных (т.е. неабсорбируемых) филлеров, таких как одобренный FDA материал-филлер на основе полиметилметкарилатных гранул (микросфер PMMA). Некоторые из известных филлеров для мягких тканей содержат лидокаин (местный анестезирующий агент), который добавляют для облегчения боли или дискомфорта, связанных с инъекцией.[2] A variety of materials are known for use as soft tissue fillers. Most of these materials have a temporary effect (approximately three to eighteen months) as they are resorbed in the body (eg, collagen, hyaluronic acid (HA), poly-L-lactic acid (PLLA)). There are also a small number of permanent (ie, non-absorbable) fillers available, such as the FDA-approved polymethyl methcarylate bead filler material (PMMA microspheres). Some of the known soft tissue fillers contain lidocaine (a local anesthetic) which is added to relieve pain or discomfort associated with the injection.

[3] Сегодня наиболее распространенным материалом, используемым в наполнителях для мягких тканей во всем мире, является гиалуроновая кислота (HA). Это обусловлено ее превосходной способностью создавать объем и благоприятным профилем безопасности. HA представляет собой природный гликозаминогликан, присутствующий во внеклеточном матриксе, например, дермы, и состоит из чередующихся остатков β-D-(1→3) глюкуроновой кислоты (GlcUA) и β-D-(1→4)-N-ацетилглюкозамина (GIcNAc). HA может соединяться с водой и набухать с образованием геля, создавая эффект разглаживания/наполнения. В большинстве случаев HA, используемая в кожных филлерах, является поперечно-сшитой для продления ее действия в организме (до восемнадцати месяцев).[3] Today, the most common material used in soft tissue fillers worldwide is hyaluronic acid (HA). This is due to its superior volume-creating ability and favorable safety profile. HA is a naturally occurring glycosaminoglycan present in the extracellular matrix, such as the dermis, and is composed of alternating β-D-(1→3) glucuronic acid (GlcUA) and β-D-(1→4) -N -acetylglucosamine (GIcNAc) residues ). HA can combine with water and swell to form a gel, creating a smoothing/plumping effect. In most cases, the HA used in dermal fillers is cross-linked to prolong its action in the body (up to eighteen months).

[4] В данной области техники известны различные подходы к поперечному сшиванию для ковалентного связывания полимерных цепей молекул полисахаридов (например, HA) друг с другом с образованием матрицы материала-филлера с меж- и внутримолекулярными поперечными связями. Широко используемый подход заключается в химическом сшивании с применением химических агентов. Указанные агенты обычно взаимодействуют с гидроксильными и/или карбоксильными функциональными группами полисахарида. Традиционно используемые сшивающие агенты включают, без ограничения, DVS (дивинилсульфон), ди- или полифункциональные эпоксиды (например, диглицидиловый эфир 1,4-бутандиола (BDDE)), 1,2-бис(2,3-эпоксипропокси)этилен (EGDGE) и 1,2,7,8-диэпоксиоктан (DEO)), сшивающие агенты на основе ПЭГ (например, тетраглицидиловый эфир пентаэритрита (PETGE)), бискарбодиимиды (BCDI) (например, фениленбис-(этил)-карбодиимид и 1,6-гексаметиленбис-(этилкарбодиимид)), диаминные или полиаминные сшивающие агенты (например, гексаметилендиамин (HMDA) и 3-[3-(3-аминопропокси)-2,2-бис(3-аминопропоксиметил)пропокси]пропиламин (4 AA)), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS), 1-(2,3-эпоксипропил)-2,3-эпоксициклогексан, эпихлоргидрин, альдегиды (например, формальдегид и глутаральдегид) и гидразиды (бис-, трис- и поливалентные гидразиддные соединения, например, дигидразид адипиновой кислоты (ADH)).[4] Various cross-linking approaches are known in the art to covalently link polymer chains of polysaccharide molecules (eg, HA) to each other to form a filler material matrix with inter- and intramolecular cross-links. A widely used approach is chemical cross-linking using chemical agents. These agents typically react with the hydroxyl and/or carboxyl functional groups of the polysaccharide. Traditionally used crosslinkers include, but are not limited to, DVS (divinyl sulfone), di- or polyfunctional epoxides (e.g., 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE)), 1,2-bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene (EGDGE) and 1,2,7,8-diepoxyoctane (DEO)), PEG-based cross-linkers (e.g. pentaerythritol tetraglycidyl ether (PETGE)), biscarbodiimides (BCDI) (e.g. phenylenebis-(ethyl)-carbodiimide and 1,6- hexamethylenebis(ethylcarbodiimide)), diamine or polyamine crosslinkers (e.g. hexamethylenediamine (HMDA) and 3-[3-(3-aminopropoxy)-2,2-bis(3-aminopropoxymethyl)propoxy]propylamine (4 AA)), bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS), 1-(2,3-epoxypropyl)-2,3-epoxycyclohexane, epichlorohydrin, aldehydes (e.g. formaldehyde and glutaraldehyde) and hydrazides (bis-, tris- and polyvalent hydrazide compounds, e.g. adipic acid dihydrazide (ADH)).

[5] Другие способы, которые используют для поперечного сшивания инъекционных гидрогелей полисахаридов, включают применение метакрилированных полимеров для фотохимического сшивания (Möller et al., Int. J. Artif. Organs 2011, 34:93-102), поперечного сшивания с присоединением Михаэля (Shu et al., Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311), поперечного сшивания по реакции с основанием Шиффа (Tan et al., Biomaterials 2009, 30:2499-2506), подходов «клик»-химии с применением реакций типа тиоленового взаимодействия или азид-алкинового циклоприсоединения (Hoyle et al., Chem. Soc. Rev. 2010, 39:1355-1387; van Dijk et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20:2001-2016). В данной области техники известны также фото-сшитые филлеры на основе полисахаридов для наполнения мягких тканей (см., например, US 2011/069475). Кроме того, в данной области техники изучена этерификация карбоксильных функциональных групп кислотных полисахаридов с гидроксильными группами молекул тех же или других полисахаридов с образованием «внутренних» меж- и/или внутримолекулярных поперечных связей на основе сложного эфира (упоминаемых как «ауто-сшитый полимер» или «ACP»). Кроме того, в US 2006/0084759 описан тирамин-модифицированный и поперечно-сшитый материал гидрогеля HA, в котором поперечное сшивание обеспечено дитираминовыми связями, опосредованными пероксидазой, которое может происходить in vivo.[5] Other methods that are used to cross-link injectable polysaccharide hydrogels include the use of methacrylated polymers for photochemical cross-linking (Möller et al., Int. J. Artif. Organs 2011, 34:93-102), Michael addition cross-linking ( Shu et al., Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311), Schiff base cross-linking (Tan et al., Biomaterials 2009, 30:2499-2506), click chemistry approaches using thiolene type reactions or azide-alkyne cycloaddition (Hoyle et al., Chem. Soc. Rev. 2010, 39:1355-1387; van Dijk et al., Bioconjug. Chem. 2009, 20:2001-2016). Photo-crosslinked polysaccharide-based fillers for soft tissue filling are also known in the art (see, for example, US 2011/069475). In addition, the art has explored the esterification of the carboxyl functional groups of acidic polysaccharides with the hydroxyl groups of the same or other polysaccharide molecules to form "internal" inter- and/or intramolecular ester cross-links (referred to as "auto-crosslinked polymer" or "ACP") Additionally, US 2006/0084759 describes a tyramine-modified and cross-linked HA hydrogel material in which cross-linking is provided by peroxidase-mediated dityramine linkages that can occur in vivo .

[6] Наиболее широко распространенным подходом к получению поперечно-сшитых филлеров является осуществление сшивания с помощью BDDE. Однако BDDE и продукты его разложения являются низкомолекулярными соединениями, которые вредны с токсикологической точки зрения и, следовательно, их необходимо тщательно удалять из готового продукта. Верхний предел содержания BDDE в кожных филлерах (для большинства рынков) составляет менее 2 м.д. Таким образом, необходимо удостовериться, что по существу все молекулы BDDE (и продукты его разложения) удалены из продукта. Следовательно, важной, но и весьма трудоемкой частью процесса получения филлера, сшитого с помощью BDDE, является его очистка после поперечного сшивания. Широко используемой технологией очистки является диализ. Однако даже несмотря на то, что диализ весьма эффективен для удаления нежелательных токсичных примесей (т.е. BDDE и продуктов его разложения), он является весьма трудоемким, т.е. часто занимает до нескольких дней. Таким образом, получение филлеров, сшитых с помощью BDDE, состоит из множества достаточно сложных технологических стадий, занимающих много времени, обычно несколько дней, что существенно увеличивает стоимость готового продукта. Кроме того, поскольку диализ по большей части проводят вручную, он является потенциальным источником контаминации геля. Таким образом, весьма востребованы способы получения поперечно-сшитых филлеров, преодолевающих вышеуказанные недостатки.[6] The most widely accepted approach to obtain cross-linked fillers is cross-linking using BDDE. However, BDDE and its degradation products are low molecular weight compounds that are toxicologically harmful and therefore must be carefully removed from the finished product. The upper limit for BDDE in dermal fillers (for most markets) is less than 2 ppm. Thus, it is necessary to ensure that substantially all BDDE molecules (and its degradation products) are removed from the product. Therefore, an important but also very labor-intensive part of the process of obtaining BDDE cross-linked filler is its purification after cross-linking. A widely used purification technology is dialysis. However, even though dialysis is very effective in removing unwanted toxic contaminants (i.e. BDDE and its breakdown products), it is very labor intensive, i.e. often takes up to several days. Thus, the production of fillers cross-linked using BDDE consists of many rather complex technological stages that take a lot of time, usually several days, which significantly increases the cost of the finished product. In addition, since dialysis is largely performed manually, it is a potential source of gel contamination. Thus, methods for producing cross-linked fillers that overcome the above-mentioned disadvantages are in great demand.

[7] Кроме того, обычные предварительно полученные гидрогели часто имеют недостаток, который заключается в их высокой вязкости, что затрудняет их инъекцию через тонкие иглы. Одним из подходов к решению указанной проблемы заключается в использовании композиций гидрогеля, гелеобразование которых происходит in situ. Такие композиции инъецируют в ткань в жидкой форме, а не в форме предварительно полученного геля, и в результате поперечного сшивания в месте инъекции образуется гель, сшитый in situ. Другим подходом к решению указанной проблемы является добавлением смазывающей фазы (например, несшитого полисахарида, например, HA) к поперечно-сшитому гидрогелю, что обеспечивает уменьшение усилия при инъекции. Однако показано, что если инъецируемый гидрогель имеет достаточно низкую вязкость, то смазывающая фаза не является обязательно необходимой.[7] In addition, conventional preformed hydrogels often have the disadvantage of being highly viscous, which makes them difficult to inject through fine needles. One approach to solving this problem is to use hydrogel compositions, the gelation of which occurs in situ . Such compositions are injected into tissue in liquid form rather than as a preformed gel, and cross-linking at the injection site results in an in situ cross-linked gel. Another approach to solve this problem is to add a lubricating phase (eg, non-cross-linked polysaccharide, such as HA) to the cross-linked hydrogel, which reduces the injection force. However, it has been shown that if the injected hydrogel has a sufficiently low viscosity, then a lubricating phase is not necessarily necessary.

[8] Во многих гелях, образующихся in situ, используют модифицированное альдегидом производное полисахарида (например, HA), которое подвергается поперечному сшиванию in situ с другим производным полисахарида (например, HA), с образованием поперечно-сшитого геля. Кроме того, использование модифицированного альдегидом производного полисахарида (например, HA), которое образует поперечно-сшитый гель при взаимодействии с другим комплементарным производным полисахарида (например, HA), позволяет преодолеть вышеупомянутые проблемы, связанные с поперечным сшиванием BDDE, поскольку BDDE не требуется. Таким образом, модифицированные альдегидом производные полисахарида (например, HA), являются перспективными кандидатами для получения сшитых филлеров без BDDE.[8] Many in situ gels use an aldehyde-modified polysaccharide derivative (eg, HA) that is cross-linked in situ with another polysaccharide derivative (eg, HA) to form a cross-linked gel. Additionally, the use of an aldehyde-modified polysaccharide derivative (eg, HA) that forms a cross-linked gel when reacted with another complementary polysaccharide derivative (eg, HA) overcomes the aforementioned problems associated with cross-linking BDDE, since BDDE is not required. Thus, aldehyde-modified polysaccharide derivatives (eg, HA) are promising candidates for the preparation of cross-linked fillers without BDDE.

[9] В этом отношении может быть сделана ссылка на WO 00/016818, где описано in situ получение гидрогеля посредством поперечного сшивания альдегид- (или амин-) функционализированного производного HA (например, адипиновый дигидразидо-HA) с гомо- или гетеробифункциональным сшивающим агентом (например, сшивающим агентом на основе бифункционального N-гидроксисукцинимидного эфира, такого как (SPA)₁-ПЭГ). Кроме того, в WO 2011/100469 описан поперечно-сшитый гидрогель HA для применения в качестве стекловидного биоматериала-заменителя, полученного взаимодействием окисленной HA, содержащей альдегидные функциональные группы (окси-HA), и дигидразидным сшивающим агентом, например, дигидразидом адипиновой кислоты (ADH). В WO 2009/108100 описан гидрогель на основе HA, полученный in situ посредством смешивания модифицированной альдегидом HA и сшивающего агента на основе модифицированного гидразидом поливинилового спирта (PVAH) с образованием поперечно-сшитой структуры, содержащей множество гидроксильных групп.[9] In this regard, reference may be made to WO 00/016818, which describes the in situ preparation of a hydrogel by cross-linking an aldehyde (or amine) functionalized HA derivative (e.g. adipic dihydrazido-HA) with a homo- or heterobifunctional cross-linker (eg, a bifunctional N -hydroxysuccinimide ester cross-linker such as (SPA) ₁ -PEG). Furthermore, WO 2011/100469 describes a cross-linked HA hydrogel for use as a glassy biomaterial substitute prepared by reacting oxidized HA containing aldehyde functional groups (hydroxy-HA) and a dihydrazide cross-linker, e.g. adipic acid dihydrazide (ADH). ). WO 2009/108100 describes an HA hydrogel prepared in situ by mixing aldehyde-modified HA and a polyvinyl alcohol hydrazide (PVAH) cross-linker to form a cross-linked structure containing multiple hydroxyl groups.

[10] Кроме того, в WO 2011/069475 описан способ получения производного альдегид-HA, содержащего альдегидную группу, посредством окисления первичной гидроксильной группы у C6 глюкозаминного повторяющегося звена с применением системы TEMPO (2,2,6,6-тетраметил-пиперидинилоксил)совместного окислителя, и использования указанного производного альдегид-HA для получения поперечно-сшитых гидрогелей HA посредством взаимодействия с диаминным соединением (например, гександиамином) или амин-HA (например, гександиамин-замещенной HA). Кроме того, в WO 2017/063749 описано применение первого производного гиалуроновой кислоты и второго производного гиалуроновой кислоты, причем первое производное гиалуроновой кислоты функционализировано гидразидным фрагментом, а второе производное гиалуроновой кислоты функционализировано альдегидным фрагментом, для in situ образования поперечно-сшитого гидрогеля в требуемом месте. Второе альдегид-функционализированное производное гиалуроновой кислоты может быть получено окислением первичной гидроксильной группы (-CH₂OH) до альдегидной группы (-CHO).[10] In addition, WO 2011/069475 describes a method for preparing an aldehyde-HA derivative containing an aldehyde group by oxidizing the primary hydroxyl group at the C6 glucosamine repeat unit using the TEMPO (2,2,6,6-tetramethyl-piperidinyloxyl) system. a co-oxidant, and using said aldehyde-HA derivative to prepare cross-linked HA hydrogels by reacting with a diamine compound (eg, hexanediamine) or amine-HA (eg, hexanediamine-substituted HA). Furthermore, WO 2017/063749 describes the use of a first hyaluronic acid derivative and a second hyaluronic acid derivative, wherein the first hyaluronic acid derivative is functionalized with a hydrazide moiety and the second hyaluronic acid derivative is functionalized with an aldehyde moiety, for in situ formation of a cross-linked hydrogel at a desired site. A second aldehyde-functionalized hyaluronic acid derivative can be prepared by oxidizing the primary hydroxyl group (-CH ₂ OH) to an aldehyde group (-CHO).

[11] Кроме того, в непатентной литературе также описаны гели, полученные in situ с использованием альдегид-модифицированного производного полисахарида. Например, в публикации Dahlmann et al. (Biomaterials 2013, 34:940-951) описаны совершенно определенные альгинатные и HA гидрогели, поперечно сшиваемые in situ, для выращивания ткани миокарда. Указанные гидрогели получают взаимодействием альдегид- и гидразид-функционализированного альгината и HA в присутствии человеческого коллагена I типа и клеток сердца новорожденных крыс (NRHC) с получением биосинтетической сердечной ткани на основе гидрогеля, поперечно-сшитого гидразоном. Кроме того, в публикации Ossipov et al. (Biomacromolecules 2010, 11:2247-2254) описан синтез гидразид-функционализированной HA с применением специфического симметричного дифункционального реагента, имеющего центральную двухвалентную защитную группу, которая может подвергаться реакции амидного типа с карбоксилатным остаткам HA в водном растворе. Гидразид-функционализированная HA может быть использована для in situ получения гидрогеля на основе гидразона HA посредством смешивания с альдегидным производным HA.[11] In addition, gels prepared in situ using an aldehyde-modified polysaccharide derivative have also been described in the non-patent literature. For example, Dahlmann et al. (Biomaterials 2013, 34:940-951) describe specific in situ cross-linked alginate and HA hydrogels for growing myocardial tissue. These hydrogels are prepared by reacting aldehyde- and hydrazide-functionalized alginate and HA in the presence of human type I collagen and neonatal rat heart cells (NRHC) to obtain biosynthetic cardiac tissue based on hydrazone cross-linked hydrogel. In addition, the publication by Ossipov et al. (Biomacromolecules 2010, 11:2247-2254) describes the synthesis of hydrazide-functionalized HA using a specific symmetrical difunctional reagent having a central divalent protecting group that can undergo an amide-type reaction with the carboxylate moieties of HA in aqueous solution. Hydrazide-functionalized HA can be used for the in situ preparation of hydrazone HA hydrogel by mixing with an aldehyde derivative of HA.

[12] В публикации Varghese et al. (J. Am. Chem. Soc. 2009, 131:8781-8783) описано производное HA, которое дважды функционализировано гидразидной группой и аминометилен-бисфосфонатной группой и способно ковалентно связывать бисфосфонат (BP; антиостеокластическое и антинеопластическое низкомолекулярное лекарственное соединение). Смешивание указанной дважды функционализированной HA с альдегид-функционализированной HA приводит к in situ образованию гидрогеля HA, пригодного для инъекции, для контролируемого высвобождения лекарственного соединения BP в месте имплантации. В публикации Oommen et al. (Adv. Funct. Mater 2013, 323:1273-1280) описан гидрогель HA, полученный смешиванием альдегидного производного HA с карбодигидразид- (CDH) функционализированным производным HA с получением гидрогеля HA с гидразонными связями. Дополнительно описано, что in situ образование гидрогеля HA в присутствии терапевтического белка (например, рекомбинантного человеческого фактора роста BMP-2) приводит к образованию гидрогеля для in vivo применения, который может обеспечивать доставку факторов роста для регенерации костной ткани.[12] Varghese et al . (J. Am. Chem. Soc. 2009, 131:8781-8783) describes an HA derivative that is doubly functionalized with a hydrazide group and an aminomethylene bisphosphonate group and is capable of covalently binding a bisphosphonate (BP; an anti-osteoclastic and anti-neoplastic small molecule drug compound). Mixing said dual-functionalized HA with aldehyde-functionalized HA results in in situ formation of an injectable HA hydrogel for controlled release of the BP drug compound at the implantation site. The publication by Oommen et al . (Adv. Funct. Mater 2013, 323:1273-1280) describes an HA hydrogel prepared by mixing an aldehyde derivative of HA with a carbodihydrazide (CDH) functionalized derivative of HA to produce a hydrazone-linked HA hydrogel. It is further disclosed that in situ formation of an HA hydrogel in the presence of a therapeutic protein (eg, recombinant human growth factor BMP-2) results in a hydrogel for in vivo use that can deliver growth factors for bone regeneration.

[13] Однако обычно используемые способы присоединения альдегидных функциональных групп к гиалуроновой кислоте имеют ряд недостатков. Например, внедрение альдегидных групп посредством периодатного окисления нефункционализированной гиалуроновой кислоты обычно приводит к разрыву циклических сахаридных колец полисахаридного скелета, что снижает общую стабильность гиалуроновой кислоты и увеличивает нежелательную гибкость полисахаридного скелета. В частности, традиционно используемые реакции для внедрения альдегидных функциональных групп в гиалуроновую кислоту, например, окисление с применением периодата натрия, занимают много времени и/или трудны для контролирования с точки зрения нежелательного окисления групп карбоновой кислоты.[13] However, commonly used methods for attaching aldehyde functional groups to hyaluronic acid have several disadvantages. For example, the introduction of aldehyde groups through periodate oxidation of non-functionalized hyaluronic acid typically results in disruption of the cyclic saccharide rings of the polysaccharide backbone, which reduces the overall stability of the hyaluronic acid and increases the undesirable flexibility of the polysaccharide backbone. In particular, traditionally used reactions to introduce aldehyde functional groups into hyaluronic acid, such as oxidation using sodium periodate, are time-consuming and/or difficult to control in terms of unwanted oxidation of carboxylic acid groups.

[14] Кроме того, не существует универсального филлера, который подходит для всех областей применения или для каждого пациента. Например, для разных применений необходимы гели с разной жесткостью/твердостью (часто описываемой с помощью модуля упругости). С учетом относительно высоких динамических напряжений, возникающих при движении мышц лица, для коррекции в области носогубных складок и морщин марионетки (от уголков губ к подбородку) обычно необходимы гели более высокой жесткостью. Напротив, гели меньшей жесткости лучше подходят для тех областей, где стойкость к деформации не является критичной или где анатомия не требует жесткости, а важны объем и пластичность, например, в губах (см., например, Kablik et al., Dermatol Surg, 2009, 35, 302-312).[14] Additionally, there is no universal filler that is suitable for all applications or for every patient. For example, different applications require gels with different stiffness/hardness (often described by elastic modulus). Given the relatively high dynamic stresses that occur during facial muscle movement, correction in the area of nasolabial folds and marionette lines (from the corners of the lips to the chin) usually requires gels of higher rigidity. In contrast, lower-stiffness gels are better suited for areas where resistance to deformation is not critical or where the anatomy does not require stiffness but volume and plasticity are important, such as in the lips (see, for example, Kablik et al., Dermatol Surg, 2009 , 35, 302-312).

[15] Однако свойства, например, жесткость гидрогеля, полученного из модифицированного альдегидом производного полисахарида (например, HA) и комплементарного производного полисахарида (например, HA) (поперечно-сшитого in situ, т.е. после инъекции двух комплементарных полисахаридных производных; или поперечно-сшитого in vitro, т.е. до инъекции), в значительной степени зависит от свойств конкретного модифицированного полисахарида (например, модифицированной гиалуроновой кислоты), в частности, от его молекулярной массы и степени модификации. Например, модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота, имеющая очень низкую степень альдегидной модификации (т.е. очень небольшое количество альдегидных групп), будет иметь относительно небольшое количество образованных поперечных связей и, следовательно, полученный гель будет достаточно мягким. Таким образом, для разных областей применения используют разные альдегид-модифицированные гиалуроновые кислоты. Если модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота, обеспечивающая «более мягкие» гидрогели (например, модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота с низкой степенью модификации), может быть использована для филлеров для губ, то модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота, обеспечивающая «более твердые» гидрогели (например, модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота с высокой степенью модификации), может быть использована для филлеров для носогубных складок или морщин марионетки.[15] However, the properties, e.g. stiffness, of a hydrogel prepared from an aldehyde-modified polysaccharide derivative (eg, HA) and a complementary polysaccharide derivative (eg, HA) (cross-linked in situ , i.e., after injection of two complementary polysaccharide derivatives; or cross-linked in vitro , i.e. before injection), largely depends on the properties of the particular modified polysaccharide (for example, modified hyaluronic acid), in particular, on its molecular weight and degree of modification. For example, aldehyde-modified hyaluronic acid having a very low degree of aldehyde modification (ie very few aldehyde groups) will have a relatively small number of cross-links formed and therefore the resulting gel will be quite soft. Thus, different aldehyde-modified hyaluronic acids are used for different applications. While aldehyde-modified hyaluronic acid providing "softer" hydrogels (e.g., low-modified aldehyde-modified hyaluronic acid) can be used for lip fillers, aldehyde-modified hyaluronic acid providing "harder" hydrogels (e.g., aldehyde-modified Highly modified hyaluronic acid) can be used for fillers for nasolabial folds or marionette lines.

[16] Таким образом, в целом, весьма востребованы способы получения модифицированной гиалуроновой кислоты, например, модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, для in vitro или in situ получения поперечно-сшитых гелей, которые обеспечивают возможность изменения (точного подбора) свойств готовой гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом. В частности, необходимы способы, обеспечивающие возможность простого изменения свойств готовой гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом, без существенного изменения общего способа синтеза, т.е. с сохранением большинства параметров без изменений при изменении лишь легко регулируемых параметров, например, концентрации исходных материалов, количества окислительного агента и времени реакции. При наличии такого способа можно использовать одинаковые или схожие экспериментальные условия для получения различных гиалуроновых кислот, модифицированных альдегидом, демонстрирующих разные свойства (например, различную степень модификации и молекулярную массу).[16] Thus, in general, methods for producing modified hyaluronic acid, for example, aldehyde-modified hyaluronic acid, for in vitro or in situ production of cross-linked gels, which provide the ability to change (precisely select) the properties of the finished hyaluronic acid modified aldehyde. In particular, methods are needed that make it possible to easily change the properties of the finished aldehyde-modified hyaluronic acid without significantly changing the overall synthesis method, i.e. with most parameters remaining unchanged while only easily adjustable parameters are changed, such as the concentration of starting materials, the amount of oxidizing agent and reaction time. With such a method, it is possible to use the same or similar experimental conditions to obtain different aldehyde-modified hyaluronic acids exhibiting different properties (eg, different degrees of modification and molecular weight).

ЗАДАЧА ИЗОБРЕТЕНИЯOBJECTIVE OF THE INVENTION

[17] С учетом вышеизложенного, задачей настоящего изобретения является обеспечение универсального и удобного способа получения модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, подходящей для in vitro или in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты. Кроме того, задачей настоящего изобретения является обеспечение такой гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом, которая особенно подходит для применения в эстетической медицине. Кроме того, задачей настоящего изобретения является обеспечение гидрогеля, полученного из гиалуроновой кислоты, модифицированной альдегидом, который особенно подходит для применения в эстетической медицине.[17] In view of the above, it is an object of the present invention to provide a universal and convenient method for preparing aldehyde-modified hyaluronic acid suitable for in vitro or in situ production of cross-linked hyaluronic acid hydrogel. It is further an object of the present invention to provide such aldehyde-modified hyaluronic acid which is particularly suitable for use in aesthetic medicine. It is further an object of the present invention to provide a hydrogel derived from aldehyde-modified hyaluronic acid which is particularly suitable for use in aesthetic medicine.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[18] Вышеуказанная задача решена посредством обеспечения нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты (также упоминаемого в данном документе как «модифицированное альдегидом производное гиалуроновой кислоты» или «альдегид-модифицированная гиалуроновая кислота») и способа его получения. Новое модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит группу -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена, которая модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO, и подходит для in vitro и in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля при его взаимодействии со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты.[18] The above object is achieved by providing a new modified hyaluronic acid derivative (also referred to herein as “aldehyde-modified hyaluronic acid derivative” or “aldehyde-modified hyaluronic acid”) and a method for producing the same. The new modified hyaluronic acid derivative contains a -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit, which is modified to an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO, and is suitable for in vitro and in situ obtaining a cross-linked hydrogel by reacting it with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the new modified hyaluronic acid derivative.

[19] Указанные два функционализированных полисахаридных производных (т.е. новое модифицированное производное гиалуроновой кислоты и второе полисахаридное производное) можно инъецировать вместе в жидкой форме, что обеспечивает возможность совместной инъекции с малым усилием выдавливания даже через тонкие иглы. Желательно, чтобы в результате in situ образования геля не образовывались вредные побочные продукты. Единственным побочным продуктом является вода, которая без труда абсорбируется образованным гидрогелем и/или окружающими тканями. Кроме того, образованный in situ гидрогель обладает требуемыми свойствами с точки зрения интеграции в ткань, улучшения кожи, способности обеспечивать форму ткани и способности к объемообразованию.[19] These two functionalized polysaccharide derivatives (ie, the new modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative) can be injected together in liquid form, allowing co-injection with low extrusion force even through fine needles. It is desirable that no harmful by-products are formed as a result of in situ gelation. The only by-product is water, which is easily absorbed by the formed hydrogel and/or surrounding tissues. In addition, the in situ formed hydrogel has desirable properties in terms of tissue integration, skin enhancement, tissue shaping ability, and volumizing ability.

[20] Кроме того, было неожиданно обнаружено, что новое альдегид-модифицированное производное гиалуроновой кислоты подходит для in vitro получения поперечно-сшитых гелей посредством взаимодействия со вторым, комплементарным производным полисахарида, предпочтительно также производным гиалуроновой кислоты. В частности, обнаружено, что свойства такого полученного геля можно регулировать не только через свойства отдельных производных (например, степень модификации и молекулярную массу), но и посредством подбора концентраций соответствующих полисахаридных производных в среде, используемой для поперечного сшивания.[20] In addition, it has been surprisingly discovered that the novel aldehyde-modified hyaluronic acid derivative is suitable for in vitro preparation of cross-linked gels by reaction with a second, complementary polysaccharide derivative, preferably also a hyaluronic acid derivative. In particular, it has been found that the properties of such a resulting gel can be controlled not only through the properties of the individual derivatives (eg degree of modification and molecular weight), but also by adjusting the concentrations of the corresponding polysaccharide derivatives in the cross-linking medium.

[21] Преимущественно, альдегидная группа, имеющая структуру -CH₂-O-CH₂-CHO, является достаточно длинной для обеспечения оптимальной стерической доступности для поперечного сшивания, но и достаточно короткой, чтобы не слишком увеличивать эластичность поперечно-сшитого геля. Это обусловливает особенную пригодность нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты для in situ получения гелей в широком диапазоне значений жесткости. Например, использование нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты с высокой степенью модификации (т.е. с большим количеством альдегидных групп) приводит к образованию большого количества (вследствие большого количества стерически доступных альдегидных групп) относительно коротких поперечных связей, что обусловливает получение относительно твердого геля.[21] Advantageously, the aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO is long enough to provide optimal steric accessibility for cross-linking, but short enough so as not to unduly increase the elasticity of the cross-linked gel. This makes the new modified hyaluronic acid derivative particularly suitable for in situ production of gels over a wide range of hardness values. For example, the use of a novel highly modified hyaluronic acid derivative (i.e., with a large number of aldehyde groups) results in the formation of a large number (due to the large number of sterically accessible aldehyde groups) of relatively short cross-links, resulting in a relatively hard gel.

[22] Модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению может быть получено из модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которая характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH посредством окисления указанной группы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидную группу, имеющую структуру -CH₂-O-CH₂-CHO. Предложенный новый способ получения нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты позволяет избежать недостатков обычно используемых способов получения альдегид-модифицированных производных гиалуроновой кислоты, таких как продолжительное время реакции, резкое снижение молекулярной массы гиалуроновой кислоты или нежелательное окисление до группы карбоновой кислоты.[22] The modified hyaluronic acid derivative according to the present invention can be obtained from glycerol-modified hyaluronic acid, which is characterized in that the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to a moiety of the following formula -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH by oxidation of said -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH group into an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO. The proposed new method for producing a new modified hyaluronic acid derivative avoids the disadvantages of commonly used methods for producing aldehyde-modified hyaluronic acid derivatives, such as long reaction times, a sharp decrease in the molecular weight of hyaluronic acid or undesirable oxidation to a carboxylic acid group.

[23] Показано, что при использовании предложенного способа можно без труда регулировать свойства нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты, изменяя лишь базовые параметры, такие как концентрация исходного материала, количество окислительного агента и время реакции. Например, изменяя концентрацию исходного материала, количество окислительного агента и/или время реакции, можно точно регулировать степень модификации и/или молекулярную массу полученного нового модифицированного производного гиалуроновой кислоты.[23] It has been shown that when using the proposed method, it is possible to easily regulate the properties of the new modified hyaluronic acid derivative by changing only basic parameters, such as the concentration of the starting material, the amount of the oxidizing agent and the reaction time. For example, by varying the concentration of the starting material, the amount of oxidizing agent and/or the reaction time, the degree of modification and/or molecular weight of the resulting new modified hyaluronic acid derivative can be precisely controlled.

[24] В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, где группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO. Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры[24] In a first aspect , the present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative wherein the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ - CHO. Preferably, the modified hyaluronic acid derivative contains at least one disaccharide unit of the following structure

где Ac означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, или иона щелочноземельного металла.where Ac is -C(O)CH ₃ and R is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, or an alkaline earth metal ion.

[25] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного производного HA согласно настоящему изобретению. Предложенный способ включает следующие стадии: a) обеспечение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которое характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH; b) растворение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты в водной среде с получением солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином; c) приведение во взаимодействие указанной солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, с окислительным агентом, предпочтительно периодатом, более предпочтительно периодатом натрия, для превращения по меньшей мере части указанных групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидные группы, имеющие формулу -CH₂-O-CH₂-CHO, с получением модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты.[25] In a second aspect , the present invention relates to a method for producing a modified HA derivative according to the present invention. The proposed method includes the following steps: a) providing glycerol-modified hyaluronic acid, which is characterized in that the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to a fragment of the following formula -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH; b) dissolving glycerol-modified hyaluronic acid in an aqueous medium to obtain solubilized glycerin-modified hyaluronic acid; c) reacting said solubilized glycerol-modified hyaluronic acid with an oxidizing agent, preferably periodate, more preferably sodium periodate, to convert at least a portion of said -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups into aldehyde groups having the formula -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO, to obtain an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative.

[26] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, полученному способом согласно настоящему изобретению.[26] In a third aspect, the present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to the present invention.

[27] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для применения в эстетической медицине.[27] In a fourth aspect , the present invention relates to the use of a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by a method according to the present invention for in situ production of a cross-linked hydrogel for use in aesthetic medicine.

[28] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, для получения предварительно образованного поперечно-сшитого гидрогеля.[28] In a fifth aspect , the present invention relates to the use of a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to the present invention to obtain a preformed cross-linked hydrogel.

[29] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированному производному гиалуроновой кислоты, полученному способом согласно настоящему изобретению, для применения для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для терапевтического применения.[29] In a sixth aspect , the present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to the present invention, for use in the in situ production of a cross-linked hydrogel for therapeutic use.

[30] Модифицированное производное гиалуроновой кислоты обычно используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты, причем второй полисахарид предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, и указанная нуклеофильная функциональная группа предпочтительно представляет собой гидразидную функциональную группу, и при этом второй полисахарид более предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено, имеющее следующую структуру:[30] The modified hyaluronic acid derivative is typically used in conjunction with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified hyaluronic acid derivative, the second polysaccharide preferably being a hyaluronic acid derivative, and said nucleophilic functional group is preferably a hydrazide functional group, and the second polysaccharide is more preferably a hyaluronic acid derivative containing at least one disaccharide unit having the following structure:

где «Ac» является таким, как указано выше.where "Ac" is as above.

[31] В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, содержащему следующее структурное звено:[31] In a seventh aspect, the present invention relates to a cross-linked hydrogel containing the following structural unit:

где «Ac» и R являются такими, как указано выше.where "Ac" and R are as above.

[32] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, полученному посредством приведения в контакт альдегид-модифицированного производного HA согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, и второго полисахаридного производного, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного HA, описанного в настоящем документе.[32] In an eighth aspect , the present invention relates to a cross-linked hydrogel obtained by contacting an aldehyde-modified HA derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to the present invention and a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified HA derivative described herein.

[33] В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу, предпочтительно к косметологическому способу получения поперечно-сшитого гидрогеля, который включает следующие стадии: a) обеспечение первого раствора предшественника, содержащего модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом согласно настоящему изобретению, и отдельно от него второго раствора предшественника, содержащего второе полисахаридное производное, описанное в данном документе; b) смешивание первого раствора предшественника и второго раствора предшественника с получением смеси, способной к поперечному сшиванию in situ; и c) инъекция смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в целевое место организма пациента с получением поперечно-сшитого геля в целевом месте.[33] In a ninth aspect, the present invention relates to a method, preferably a cosmetic method, for producing a cross-linked hydrogel, which includes the following steps: a) providing a first precursor solution containing a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to the present invention, and separately therefrom a second precursor solution containing a second polysaccharide derivative described herein; b) mixing the first precursor solution and the second precursor solution to obtain a mixture capable of in situ cross-linking; and c) injecting the mixture capable of in situ cross-linking into a target site of the patient's body to produce a cross-linked gel at the target site.

[34] В десятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения поперечно-сшитого гидрогеля, предпочтительно предварительно полученного поперечно-сшитого гидрогеля.[34] In a tenth aspect, the present invention relates to a method for producing a cross-linked hydrogel, preferably a pre-formed cross-linked hydrogel.

[35] В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к набору для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля, содержащему (i) первый контейнер, содержащий первый раствор предшественника, который содержит модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом согласно настоящему изобретению, и (ii) второй контейнер, содержащий второй раствор предшественника, который содержит второе полисахаридное производное, описанное в настоящем документе, и необязательно (iii) инструкции по применению.[35] In an eleventh aspect , the present invention relates to a kit for in situ production of a cross-linked hydrogel, comprising (i) a first container containing a first precursor solution that contains a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by a method according to the present invention, and (ii) a second container containing a second precursor solution that contains a second polysaccharide derivative described herein, and optionally (iii) instructions for use.

[36] Конкретные варианты реализации настоящего изобретения изложены далее в прилагаемой формуле изобретения.[36] Specific embodiments of the present invention are set forth below in the accompanying claims.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS

[37] Для более полного понимания настоящего изобретения сделана ссылка на следующее описание и сопроводительные графические материалы, где:[37] For a more complete understanding of the present invention, reference is made to the following description and accompanying drawings, where:

[38] На фиг. 1 представлена иллюстративная хроматограмма, полученная для определения молекулярной массы.[38] In FIG. 1 shows an illustrative chromatogram obtained for molecular weight determination.

[39] На фиг. 2 представлен иллюстративный спектр ¹H ЯМР альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты с тирозиновой меткой.[39] In FIG. 2 shows an exemplary ¹ H NMR spectrum of an aldehyde-modified tyrosine-labeled hyaluronic acid derivative.

[40] На фиг. 3 представлен динамический модуль упругости (G’) гелей 1 и 2, которые хранили при 40°C.[40] In FIG. 3 shows the dynamic modulus of elasticity (G') of gels 1 and 2, which were stored at 40°C.

[41] На фиг. 4 представлен коэффициент потерь (tanδ) гелей 1 и 2, которые хранили при 40°C.[41] In FIG. Figure 4 shows the loss coefficient (tanδ) of gels 1 and 2, which were stored at 40°C.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[42] Настоящее изобретение основано на неожиданно обнаруженном факте, что модифицированная альдегидом гиалуроновая кислота может быть без труда получена из модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты. В частности, обнаружено, что получение модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты из модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты не имеет недостатков, обычно встречающихся при получении модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, таких как резкое снижение молекулярной массы, продолжительное время реакции и нежелательные побочные реакции (например, окисление до карбоновой кислоты). Более того, было обнаружено, что свойства полученного производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, можно без труда модифицировать (точно регулировать) посредством изменения лишь базовых параметров, таких как концентрация исходного материала, количество окислительного агента и время реакции.[42] The present invention is based on the unexpected discovery that aldehyde-modified hyaluronic acid can be easily prepared from glycerol-modified hyaluronic acid. In particular, it has been found that the preparation of aldehyde-modified hyaluronic acid from glycerol-modified hyaluronic acid does not have the disadvantages typically encountered in the preparation of aldehyde-modified hyaluronic acid, such as a sharp decrease in molecular weight, long reaction time and undesirable side reactions (for example, oxidation to carboxylic acid ). Moreover, it has been found that the properties of the resulting aldehyde-modified hyaluronic acid derivative can be easily modified (precisely controlled) by changing only basic parameters such as the concentration of the starting material, the amount of oxidizing agent and the reaction time.

[43] В частности, обнаружено, что степень модификации и молекулярную массу получаемого производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, можно точно регулировать посредством изменения концентрации исходного материала (т.е. концентрации модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты), количества окислительного агента и времени реакции. Это особенно предпочтительно, поскольку степень модификации и молекулярная масса готового производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, напрямую влияют на характеристики гелеобразования указанного производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом. Таким образом, с применением лишь одного общего способа синтеза могут быть получены производные гиалуроновой кислоты, модифицированные альдегидом, с различными свойствами и, следовательно, обеспечивающие получение поперечно-сшитых гелей с разными свойствами, например, твердостью.[43] In particular, it has been found that the modification degree and molecular weight of the resulting aldehyde-modified hyaluronic acid derivative can be precisely controlled by changing the concentration of the starting material (ie, the concentration of glycerol-modified hyaluronic acid), the amount of the oxidizing agent, and the reaction time. This is particularly preferred since the degree of modification and molecular weight of the finished aldehyde-modified hyaluronic acid derivative directly influence the gelling characteristics of said aldehyde-modified hyaluronic acid derivative. Thus, using just one general synthetic route, aldehyde-modified hyaluronic acid derivatives can be prepared with different properties and therefore providing cross-linked gels with different properties, eg hardness.

[44] Кроме того, было обнаружено, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению особенно подходит для in situ и in vitro образования поперечно-сшитого гидрогеля, т.е. оно демонстрирует подходящие свойства поперечного сшивания. В частности, обнаружено, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению демонстрирует подходящие свойства поперечного сшивания со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты. В этом отношении установлено, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и указанное второе полисахаридное подвергаются быстрому и эффективному поперечному сшиванию с образованием ковалентно сшитого гидрогеля, например, в требуемом месте организма. Для инициации реакции поперечного сшивания не нужны ни добавки, ни катализаторы, ни изменение рН, ни УФ излучение, а также любые другие внешние факторы воздействия (или «активаторы»). В частности, не используют или нет необходимости в сшивающем агенте. Единственным побочным продуктом, образующемся в реакции поперечного сшивания, обычно является вода, которая легко абсорбируется гидрогелем и/или окружающими тканями, если сшивание происходит in situ. [44] In addition, it has been found that the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention is particularly suitable for in situ and in vitro formation of cross-linked hydrogel, i.e. it exhibits suitable cross-linking properties. In particular, it has been found that the modified hyaluronic acid derivative of the present invention exhibits suitable cross-linking properties with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified hyaluronic acid derivative. In this regard, it has been found that the modified hyaluronic acid derivative of the present invention and said second polysaccharide undergo rapid and efficient cross-linking to form a covalently cross-linked hydrogel, for example, at the desired site in the body. No additives, catalysts, pH changes, UV radiation, or any other external factors (or “activators”) are needed to initiate the cross-linking reaction. In particular, no crosslinking agent is used or is not necessary. The only byproduct generated from the cross-linking reaction is usually water, which is readily absorbed by the hydrogel and/or surrounding tissue if cross-linking occurs in situ.

[45] В данном контексте термин «модифицированная глицерином гиалуроновая кислота» относится к гиалуроновой кислоте, которая характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH. Модифицированная глицерином гиалуроновая кислота доступна в продаже у компании HTL Biotech, Франция, или может быть получена прививкой глицидола на гиалуроновую кислоту в соответствии со следующей схемой реакции:[45] As used herein, the term "glycerol-modified hyaluronic acid" refers to hyaluronic acid which is characterized in that the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to a moiety of the following formula -CH ₂ - O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH. Glycerol-modified hyaluronic acid is available commercially from HTL Biotech, France, or can be prepared by grafting glycidol onto hyaluronic acid according to the following reaction scheme:

[46] Предпочтительно, помимо групп -OH, связанных с углеродом C6 в звене GIcNac, другие группы не подвергаются модификации в результате реакции с глицидолом. Предпочтительно, модифицированная глицерином гиалуроновая кислота содержит от 1 до 100, предпочтительно от 2 до 50, более предпочтительно от 5 до 20 и наиболее предпочтительно от 10 до 20 групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в гиалуроновой кислоте. Показано, что такая степень модификации особенно подходит для дальнейшего получения производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, согласно настоящему изобретению, которое имеет требуемую степень (альдегидной) модификации для получения поперечно-сшитого гидрогеля для применения в эстетической медицине, посредством взаимодействия с комплементарным вторым полисахаридным производным, предпочтительно производным гиалуроновой кислоты. Следует обратить внимание на то, что в контексте настоящего изобретения другие функциональные группы гиалуроновой кислоты, т.е. другие группы -OH и группы -COOH, в частности, другие (вторичные) группы -OH, могут быть модифицированы глицерином, хотя и в гораздо меньшей степени. Однако в контексте настоящего изобретения глицерин-содержащий фрагмент предпочтительно присутствует только, по существу только или преимущественно у атома углерода C6 звена GIcNac.[46] Preferably, other than the -OH groups bonded to the C6 carbon in the GIcNac unit, other groups are not modified by reaction with glycidol. Preferably, the glycerol-modified hyaluronic acid contains from 1 to 100, preferably from 2 to 50, more preferably from 5 to 20 and most preferably from 10 to 20 -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups per 100 N- acetyl-D-glucosamine units present in hyaluronic acid. This degree of modification has been shown to be particularly suitable for the further preparation of the aldehyde-modified hyaluronic acid derivative according to the present invention, which has the required degree of (aldehyde) modification to obtain a cross-linked hydrogel for use in aesthetic medicine, through reaction with a complementary second polysaccharide derivative, preferably a hyaluronic acid derivative. It should be noted that in the context of the present invention, other functional groups of hyaluronic acid, i.e. other -OH groups and -COOH groups, in particular other (secondary) -OH groups, can be modified with glycerol, although to a much lesser extent. However, in the context of the present invention, the glycerol-containing moiety is preferably present only, substantially only or predominantly at the C6 carbon atom of the GIcNac unit.

[47] В данном контексте термин «in situ» означает в месте введения, т.е. внутри организма пациента. Таким образом, для получения гидрогеля «in situ», т.е. в месте введения, модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению обычно вводят вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, или указанные соединения иным образом вводят вместе в определенном положении (целевом месте) в организме пациента, например, в положении, нуждающемся в наращивании ткани по эстетическим причинам, и оставляют для ковалентного сшивания в очаге совместной инъекции. В контексте настоящего изобретения термины «in situ» и «in vivo» могут быть использованы взаимозаменяемо. «Пациент» в значении согласно настоящему изобретению может быть любым индивидуумом или субъектом, например, млекопитающим и предпочтительно человеком, нуждающимся в «лечении» определенного состояния, статуса или заболевания, например, с косметической, эстетической или терапевтической целью. Таким образом, следует понимать, что термин «лечение» в данном контексте не только относится к терапевтическому/медицинскому лечению, но и включает, например, косметическое и эстетическое лечение.[47] In this context, the term “ in situ ” means at the site of administration, i.e. inside the patient's body. Thus, to obtain a hydrogel “ in situ ”, i.e. at the site of administration, the modified hyaluronic acid derivative of the present invention is typically administered together with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified hyaluronic acid derivative of the present invention, or such compounds otherwise are injected together in a specific position (target site) in the patient's body, for example, in a position requiring tissue augmentation for aesthetic reasons, and are left to covalently cross-link at the site of co-injection. In the context of the present invention, the terms " in situ " and " in vivo " can be used interchangeably. A “patient” as used herein can be any individual or subject, for example a mammal and preferably a human, in need of “treatment” for a particular condition, status or disease, for example for cosmetic, aesthetic or therapeutic purposes. Thus, it should be understood that the term "treatment" in this context not only refers to therapeutic/medical treatment, but also includes, for example, cosmetic and aesthetic treatment.

[48] В данном контексте термин «in vitro» означает вне организма человека или животного. Аналогично, термин «предварительно полученный гидрогель», «предварительно полученный гель» или т.п. в данном контексте относится к гидрогелю, который получен вне организма человека или животного. Таким образом, следует понимать, что термины «предварительно полученный» и «in vitro» описывают, что гидрогель получен вне организма человека или животного до инъекции. Таким образом, гель, который получен «in vitro», является «предварительно полученным» гелем, т.е. гелем, который получен вне организма человека или животного.[48] In this context, the term " in vitro " means outside the human or animal body. Likewise, the term "preformed hydrogel", "preformed gel" or the like. in this context refers to a hydrogel that is obtained outside the human or animal body. Thus, it should be understood that the terms “pre-formed” and “ in vitro ” describe that the hydrogel is produced outside the human or animal body prior to injection. Thus, a gel that is produced " in vitro " is a "preformed" gel, i.e. a gel that is obtained outside the human or animal body.

[49] В данном контексте термин «искусственный контейнер» относится к любому контейнеру, который не является организмом человека или животного или его частью. Предпочтительно, искусственный контейнер изготовлен из небиологического материала, предпочтительно стеклянного или пластикового материала, более предпочтительно из стекла.[49] As used herein, the term “artificial container” refers to any container that is not a human or animal body or part thereof. Preferably, the artificial container is made of a non-biological material, preferably glass or plastic material, more preferably glass.

[50] В контексте настоящего изобретения термин «совместная инъекция» обычно означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и указанное второе полисахаридное производное инъецируют вместе в форме одной жидкой композиции, например, раствора, в требуемое место тела пациента. Термин «пригодный для инъекций» или «инъекционный» в данном контексте означает, что композиция, образующая гидрогель in situ, может быть выдавлена из шприца или шприцевой системы. В частности, термин «совместная инъекция» предпочтительно означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и указанное второе полисахаридное производное смешивают, в частности, однородно смешивают до их выхода через кончик иглы и попадания в целевое место тела пациента, и затем инъецируют в форме смеси в целевое место тела пациента. В контексте настоящего изобретения термины «инъекция» или «совместная инъекция» могут относиться к интра-, интер- или субдермальной инъекции, или к подкожной инъекции. Кроме того, термин «игла» в данном контексте включает или является синонимом «канюли» или любых других иглоподобных элементов, подходящих для инъекции.[50] In the context of the present invention, the term "co-injection" generally means that the modified hyaluronic acid derivative of the present invention and said second polysaccharide derivative are injected together in the form of a single liquid composition, such as a solution, at a desired location on the patient's body. The term "injectable" or "injectable" as used herein means that the composition forming the hydrogel in situ can be extruded from a syringe or syringe system. In particular, the term "co-injection" preferably means that the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention and said second polysaccharide derivative are mixed, particularly mixed homogeneously until they exit through the tip of the needle and enter the target site of the patient's body, and then injected in the form mixture to the target location of the patient's body. In the context of the present invention, the terms "injection" or "co-injection" may refer to intra-, inter- or subdermal injection, or subcutaneous injection. In addition, the term “needle” as used herein includes or is synonymous with “cannula” or any other needle-like elements suitable for injection.

[51] Термины «гидрогель» или «гель» в данном контексте означают набухшую в воде трехмерную сетчатую структуру, состоящую из ковалентно сшитых полимерных цепей. Предпочтительно, поперечно-сшитый (или «гелеобразный») гидрогель является когезивным. Термин «когезивный» или «когезивность» в контексте настоящего изобретения определяют как способность материала (например, гидрогеля) не подвергаться диссоциации вследствие аффинности его молекул друг к другу. Когезивность является ключевой характеристикой гелевых имплантатов (например, in situ превращенных в гель гидрогелей, описанных в настоящем документе) и считается необходимой для сохранения интактности твердой и жидкой фаз геля и, следовательно, целостности геля. В контексте настоящего изобретения когезивность полисахаридного гидрогеля, в частности, гидрогеля на основе HA, может быть определена по шкале когезивности Гаварда-Сундарама (Sundaram et al., Plast. Reconstr. Surg. 136:678-686, 2015).[51] The terms “hydrogel” or “gel” in this context refer to a water-swollen three-dimensional network structure consisting of covalently cross-linked polymer chains. Preferably, the cross-linked (or "gelled") hydrogel is cohesive. The term "cohesive" or "cohesiveness" in the context of the present invention is defined as the ability of a material (eg, a hydrogel) not to dissociate due to the affinity of its molecules for each other. Cohesiveness is a key characteristic of gel implants (eg, in situ gelled hydrogels described herein) and is considered necessary to maintain the integrity of the solid and liquid phases of the gel and, therefore, the integrity of the gel. In the context of the present invention, the cohesiveness of a polysaccharide hydrogel, in particular an HA-based hydrogel, can be determined by the Havard-Sundaram cohesiveness scale (Sundaram et al. , Plast. Reconstr. Surg. 136:678-686, 2015).

[52] Термин «самопроизвольный» или «самопроизвольно» в данном контексте относится к тому факту, что альдегидная группа модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и нуклеофильная группа второго полисахаридного производного образуют ковалентную связь без каких-либо внешних воздействий (также называемых «активаторами»), таких как нагревание или УФ свет. В частности, обнаружено, что гидрогель может самопроизвольно образовываться в условиях in vivo, т.е. после совместной инъекции в требуемое место организма пациента, без каких-либо внешних воздействий (также называемых «активаторами»), таких как нагревание или УФ свет, что приводит к in situ образованию поперечно-сшитого полисахаридного гидрогеля в требуемом месте.[52] The term "spontaneous" or "spontaneous" in this context refers to the fact that the aldehyde group of the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention and the nucleophilic group of the second polysaccharide derivative form a covalent bond without any external influences (also called "activators" ), such as heat or UV light. In particular, it was found that the hydrogel can spontaneously form under in vivo conditions, i.e. after co-injection into the desired site of the patient's body, without any external influences (also called "activators"), such as heat or UV light, resulting in in situ formation of a cross-linked polysaccharide hydrogel at the desired site.

[53] В контексте настоящего изобретения образованный in situ (или in vivo) гидрогель, в целом, подходит для применения и/или действует как филлер мягких тканей. Термин «филлер мягких тканей» в данном контексте, в целом, относится к материалу, выполненному с возможностью заполнения полостей и/или увеличения объема в зонах недостатка мягкой ткани. Он включает, например, увеличение объема, наполнение или замену мягких тканей. В данном контексте термин «мягкая ткань», в целом, относится к тканям, которые соединяют, поддерживают или окружают другие структуры и органы тела. Мягкие ткани включают, например, мышцы, сухожилия (пучки волокон, которые соединяют мышцы с костями), волокнистые ткани, жир, кровеносные сосуды, нервы и синовиальные ткани (ткани вокруг суставов). В контексте настоящего изобретения филлер мягкой ткани предпочтительно представляет собой кожный филлер.[53] In the context of the present invention, the hydrogel formed in situ (or in vivo) is generally suitable for use and/or functions as a soft tissue filler. The term "soft tissue filler" as used herein generally refers to a material designed to fill cavities and/or add volume to areas of soft tissue deficiency. This includes, for example, volumizing, filling or replacing soft tissues. As used herein, the term "soft tissue" generally refers to tissues that connect, support, or surround other structures and organs of the body. Soft tissues include, for example, muscles, tendons (bundles of fibers that connect muscles to bones), fibrous tissue, fat, blood vessels, nerves, and synovial tissue (tissue around joints). In the context of the present invention, the soft tissue filler is preferably a dermal filler.

[54] В первом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, где группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.[54] In a first aspect , the present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative wherein the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ - CHO.

[55] Как указано выше, было обнаружено, что предложенное модифицированное производное гиалуроновой кислоты демонстрирует подходящие свойства поперечного сшивания. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что подходящие свойства поперечного сшивания обусловлены стерическими свойствами альдегидной группы, внедренной способом согласно настоящему изобретению, т.е. группы -CH₂-OH по меньшей мере одного звена GIcNAc, модифицированной до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO. В частности, полагают, что указанная альдегидная группа является достаточно длинной для обеспечения оптимальной стерической доступности для поперечного сшивания, но и достаточно короткой, чтобы не слишком увеличивать эластичность поперечно-сшитого геля.[55] As stated above, it was found that the proposed modified hyaluronic acid derivative exhibits suitable cross-linking properties. Without being limited to any particular theory, it is believed that the suitable cross-linking properties are due to the steric properties of the aldehyde group introduced by the method of the present invention, i.e. -CH ₂ -OH group of at least one GIcNAc unit modified to an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO. In particular, it is believed that said aldehyde group is long enough to provide optimal steric accessibility for cross-linking, but short enough not to unduly increase the elasticity of the cross-linked gel.

[56] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты не содержит других химических модификаций, кроме альдегидной группы, предпочтительно альдегидной группы, присутствующей у атома углерода C6 звена GIcNAc и имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.[56] Preferably, the modified hyaluronic acid derivative contains no other chemical modifications other than an aldehyde group, preferably an aldehyde group present at the C6 carbon atom of the GIcNAc unit and having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO.

[57] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению имеет степень модификации от 1,0% до 20,0%, более предпочтительно от 1,0% до 15,0%, еще более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, еще более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, еще более предпочтительно от 2,0% до 6,9%. Степень модификации (MoD) определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHO, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты. Например, MoD 15,0% означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит 15 групп -CH₂-O-CH₂-CHO на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев. MoD 37,0% означает, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит 37 групп -CH₂-O-CH₂-CHO на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев и т.д. Обнаружено, что такая достаточно низкая степень модификации особенно подходит для получения гидрогелей для применения в эстетической медицине, где необходимы гидрогели со сравнительно низкой вязкостью. Кроме того, такие низковязкие гидрогели все еще пригодны для инъекции через тонкие иглы, чтоб обеспечивает возможность in vitro получения гидрогеля (т.е. образования предварительно полученного гидрогеля), свойства которого могут быть тщательно определены и проверены до инъекции, что однако невозможно, если гидрогель получен in situ.[57] Preferably, the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention has a modification degree of 1.0% to 20.0%, more preferably 1.0% to 15.0%, even more preferably 1.0% to 10. 0%, even more preferably from 1.5% to 10.0%, even more preferably from 1.5% to 8.0%, even more preferably from 1.8% to 7.0%, even more preferably from 2 .0% to 6.9%. The degree of modification (MoD) is defined as the number of -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO groups divided by the total number of N-acetyl-D-glucosamine units present in the modified hyaluronic acid derivative. For example, a MoD of 15.0% means that the modified hyaluronic acid derivative contains 15 -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO groups per 100 N-acetyl-D-glucosamine units. MoD 37.0% means that the modified hyaluronic acid derivative contains 37 -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO groups per 100 N-acetyl-D-glucosamine units, etc. It has been found that such a fairly low degree of modification is particularly suitable for the preparation of hydrogels for use in aesthetic medicine, where hydrogels with a relatively low viscosity are required. In addition, such low-viscosity hydrogels are still suitable for injection through fine needles to allow in vitro production of a hydrogel (i.e., the formation of a preformed hydrogel), the properties of which can be carefully determined and tested before injection, which, however, is not possible if the hydrogel obtained in situ .

[58] Поскольку твердость (или жесткость; например, описанная модулем упругости) гидрогеля, полученного из модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, зависит от количества и плотности поперечных связей, образованных в указанном гидрогеле, а количество и плотность поперечных связей, образованных в указанном гидрогеле, напрямую зависит от степени модификации модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, то степень модификации напрямую влияет на твердость гидрогеля, полученного из модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению. Таким образом, степень модификации является важной характеристикой модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению.[58] Since the hardness (or stiffness; for example, described by the elastic modulus) of the hydrogel obtained from the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention depends on the number and density of cross-links formed in said hydrogel, and the number and density of cross-links formed in said hydrogel directly depends on the degree of modification of the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention, the degree of modification directly affects the hardness of the hydrogel obtained from the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention. Thus, the degree of modification is an important characteristic of the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention.

[59] Степень модификации (MoD) может быть определена спектрометрическими и/или спектроскопическими аналитическими методами, такими как ¹H ЯМР, УФ/вид. и ИК, титрование, ВЭЖХ, эксклюзионная хроматография, измерение вязкости, среди прочих. Обычно степень модификации определяют с помощью ¹H ЯМР. Иллюстративный способ определения MoD представлен в разделе «Примеры».[59] The degree of modification (MoD) can be determined by spectrometric and/or spectroscopic analytical methods such as ¹ H NMR, UV/Vis. and IR, titration, HPLC, size exclusion chromatography, viscosity measurement, among others. Typically, the degree of modification is determined using ¹ H NMR. An illustrative method for defining MoD is presented in the Examples section.

[60] Молекулярная масса (также упоминаемая как молярная масса) является другой важной характеристикой модифицированного производного гиалуроновой кислоты, которая напрямую влияет на свойства геля, полученного из него. Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, более предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, еще более предпочтительно 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа.[60] Molecular weight (also referred to as molar mass) is another important characteristic of a modified hyaluronic acid derivative, which directly affects the properties of the gel obtained from it. Preferably, the modified hyaluronic acid derivative has a weight average molecular weight of 0.1 to 2.5 MDa, more preferably 0.2 to 1.5 MDa, even more preferably 0.4 to 1.3 MDa, even more preferably 0. 6 to 1.1 MDa.

[61] Все числовые значения в данном документе, выражающие «молекулярную массу», «молярную массу», «среднюю молекулярную массу», «среднюю молярную массу», «средний молекулярный вес» и «средний молярный вес» полисахаридов (например, HA), следует понимать как означающие средневесовую молекулярную массу (или среднемассовую молекулярную массу, или средневесовую молярную массу) или M _w (w - масса) в Дальтонах (Да). Средневесовую молярную массу (M_w) определяют следующим образом: M_w =Σ_iN_iM_i ²/Σ_iN_iM_i, где N_i представляет собой количество молекул с молярной массой M_i.[61] All numerical values herein expressing "molecular weight", "molar mass", "average molecular weight", "average molar mass", "average molecular weight" and "average molar weight" of polysaccharides (e.g., HA) , should be understood to mean weight-average molecular weight (or weight-average molecular weight, or weight-average molar mass) or M _w (w - mass) in Daltons (Da). The weight average molar mass (M _w ) is determined as follows: M _w =Σ _i N _i M _i ² /Σ _i N _i M _i , where N _i represents the number of molecules with molar mass M _i .

[62] В данном контексте могут быть использованы различные способы определения молекулярной массы HA, такие как измерение характеристической вязкости (например, Европейская фармакопея 7.0 - гиалуроновая кислота, монография № 1472, 01/2011), капиллярный электрофорез (CE) (например, в соответствии с Kinoshita et al., Biomed. Chromatogr., 2002, 16:141-45), гель-проникающая хроматография (ГПХ) (например, в соответствии с Kim et al., Food Chem., 2008, 109:63-770) и многоугловое рассеяние лазерного излучения, комбинированное с эксклюзионной хроматографией (SEC-MALLS) (например, в соответствии с Hokputsa et al., Eur. Biophys. J. Biophys. Lett., 2003, 32:450-456).[62] In this context, various methods for determining the molecular weight of HA can be used, such as intrinsic viscosity measurements (e.g. European Pharmacopoeia 7.0 - hyaluronic acid, monograph No. 1472, 01/2011), capillary electrophoresis (CE) (e.g. according to from Kinoshita et al., Biomed. Chromatogr., 2002, 16:141-45), gel permeation chromatography (GPC) (eg, according to Kim et al., Food Chem., 2008, 109:63-770) and multi-angle laser scattering combined with size exclusion chromatography (SEC-MALLS) (eg, according to Hokputsa et al., Eur. Biophys. J. Biophys. Lett., 2003, 32:450-456).

[63] В контексте настоящего изобретения средневесовую молекулярную массу (M_w) полимеров HA предпочтительно определяют гель-проникающей хроматографией (ГПХ) или вискозиметрией по уравнению Марка-Хаувинка. Технология ГПХ включает элюирование раствора полимера через матрицу из упакованных полимерных частиц при давлении до нескольких мегапаскаль (МПа). Как известно специалистам в данной области техники, использование стандартов с низкой дисперсностью обеспечивает возможность корреляции времени удерживания с молярной массой.[63] In the context of the present invention, the weight average molecular weight (M _w ) of the HA polymers is preferably determined by gel permeation chromatography (GPC) or Mark-Houwink viscometry. GPC technology involves eluting a polymer solution through a matrix of packed polymer particles at pressures up to several megapascals (MPa). As is known to those skilled in the art, the use of low dispersion standards allows retention time to be correlated with molar mass.

[64] В контексте настоящего изобретения среднечисловую молярную массу (M_w) также можно определять по уравнению Марка-Хаувинка, несмотря на тот факт, что обычно оно относится к средневязкостной молярной массе или M_v. Уравнение Марка-Хаувинка определяет взаимосвязь между характеристической вязкостью (η) и молекулярной массой M и обеспечивает возможность определения молекулярной массы полимера по данным характеристической вязкости и наоборот. В контексте настоящего изобретения характеристическую вязкость предпочтительно измеряют способом, описанным в Европейской фармакопее 7.0 (гиалуроновая кислота, монография № 1472, 01/2011). В контексте настоящего изобретения средняя молекулярная масса предпочтительно представляет собой средневязкостную молекулярную массу (M_n), которая может быть рассчитана на основании характеристической вязкости по уравнению Марка-Хаувинка.[64] In the context of the present invention, the number average molar mass (M _w ) can also be determined by the Mark-Houwink equation, despite the fact that it usually refers to the viscosity average molar mass or M _v . The Mark-Houwink equation defines the relationship between intrinsic viscosity (η) and molecular weight M and provides the ability to determine the molecular weight of a polymer from intrinsic viscosity data and vice versa. In the context of the present invention, the intrinsic viscosity is preferably measured by the method described in European Pharmacopoeia 7.0 (hyaluronic acid, monograph No. 1472, 01/2011). In the context of the present invention, the average molecular weight is preferably the viscosity average molecular weight (M _n ), which can be calculated based on the intrinsic viscosity using the Mark-Houwink equation.

[η] = K x Mη^a,[η] = K x Mη ^a ,

где [η] = характеристическая вязкость в м³/кг, Mη = средневязкостная молекулярная масса, K = 2,26 × 10^-5, и a = 0,796, причем, как указано выше, характеристическую вязкость предпочтительно измеряют в соответствии со способом, описанным в Европейской фармакопее 7.0 (гиалуроновая кислота, монография № 1472, 01/2011).where [η] = intrinsic viscosity in m ³ /kg, Mη = viscosity average molecular weight, K = 2.26 × 10 ^-5 , and a = 0.796, and, as stated above, the intrinsic viscosity is preferably measured in accordance with the method described in European Pharmacopoeia 7.0 (hyaluronic acid, monograph No. 1472, 01/2011).

[65] Пример определения молекулярной массы также представлен в разделе «Примеры».[65] An example of molecular weight determination is also presented in the Examples section.

[66] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры[66] Preferably, the modified hyaluronic acid derivative contains at least one disaccharide unit of the following structure

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, или иона щелочноземельного металла. Следует понимать, что вместо протонированной формы (т.е. R = H), группа карбоновой кислоты также может существовать в депротонированной форме (т.е. R = отрицательный заряд) без какого-либо конкретного противоиона, присутствующего для уравновешивания отрицательного заряда. Такая ситуация возникает, например, в растворе, когда противоион, уравновешивающий отрицательный заряд, сольватирован и расположен в статистической близости от депротонированной карбоновой кислоты.where "Ac" means -C(O)CH ₃ and R is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, or an alkaline earth metal ion. It should be understood that instead of a protonated form (i.e. R = H), a carboxylic acid group can also exist in a deprotonated form (i.e. R = negative charge) without any particular counterion present to balance the negative charge. This situation occurs, for example, in solution, when the counterion, balancing the negative charge, is solvated and located in statistical proximity to the deprotonated carboxylic acid.

[67] Модифицированное производное гиалуроновой кислоты может дополнительно содержать по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры[67] The modified hyaluronic acid derivative may further contain at least one disaccharide unit of the following structure

где «Ac» является таким, как указано выше, и R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, иона щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.wherein "Ac" is as defined above, and R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ are independently selected from H and -CH ₂ -CHO, and R ⁵ is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, an alkaline earth ion metal and -CH ₂ -CHO, provided that at least one of R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ is -CH ₂ -CHO, and if R ¹ is -CH ₂ -CHO , then at least one of R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ is -CH ₂ -CHO.

[68] Предпочтительно, количество альдегидных групп, присутствующих у атома углерода C6 звена GIcNAc (т.е. R¹ = -CH₂-CHO), деленное на общее количество альдегидных групп, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты (включая альдегидные группы, присутствующие у атома C6 звена GIcNAc), равно от 0,60 до 1, предпочтительно от 0,65 до 1, более предпочтительно от 0,70 до 1, еще более предпочтительно от 0,75 до 1, еще более предпочтительно от 0,80 до 1, еще более предпочтительно от 0,85 до 1, еще более предпочтительно от 0,90 до 1, еще более предпочтительно от 0,95 до 1, еще более предпочтительно от 0,97 до 1, еще более предпочтительно от 0,98 до 1, еще более предпочтительно от 0,99 до 1, наиболее предпочтительно 1.[68] Preferably, the number of aldehyde groups present at the C6 carbon atom of the GIcNAc unit (i.e. R ¹ = -CH ₂ -CHO) divided by the total number of aldehyde groups present in the modified hyaluronic acid derivative (including aldehyde groups present at the C6 atom of the GIcNAc unit), is from 0.60 to 1, preferably from 0.65 to 1, more preferably from 0.70 to 1, even more preferably from 0.75 to 1, even more preferably from 0.80 to 1, even more preferably from 0.85 to 1, even more preferably from 0.90 to 1, even more preferably from 0.95 to 1, even more preferably from 0.97 to 1, even more preferably from 0.98 to 1, even more preferably from 0.99 to 1, most preferably 1.

[69] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению. Предложенный способ включает следующие стадии: a) обеспечение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которое характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH; b) растворение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты в водной среде с получением солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином; c) приведение во взаимодействие указанной солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, с окислительным агентом для превращения по меньшей мере части указанных групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидные группы, имеющие формулу -CH₂-O-CH₂-CHO, с получением модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты.[69] In a second aspect, the present invention relates to a method for producing a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention. The proposed method includes the following steps: a) providing glycerol-modified hyaluronic acid, which is characterized in that the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to a fragment of the following formula -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH; b) dissolving glycerol-modified hyaluronic acid in an aqueous medium to obtain solubilized glycerol-modified hyaluronic acid; c) reacting said solubilized glycerol-modified hyaluronic acid with an oxidizing agent to convert at least a portion of said -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups into aldehyde groups having the formula -CH ₂ -O- CH ₂ -CHO, to obtain an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative.

[70] Предпочтительно, окислительный агент представляет собой периодат или ацетат свинца (IV), предпочтительно периодат. Более предпочтительно, окислительный агент представляет собой периодат натрия.[70] Preferably, the oxidizing agent is lead(IV) periodate or acetate, preferably periodate. More preferably, the oxidizing agent is sodium periodate.

[71] Как указано выше, было обнаружено, что предложенный способ согласно настоящему изобретению не имеет недостатков, которые обычно возникают при получении модифицированной альдегидом гиалуроновой кислоты, таких как резкое снижение молекулярной массы, продолжительное время реакции и нежелательные побочные реакции (например, окисление до карбоновой кислоты). Например, было обнаружено, что даже при использовании в качестве окислительного агента периодата натрия, который, как известно, окисляет полимерный скелет, что приводит к разрушению полимерного скелета и к уменьшению молекулярной массы гиалуроновой кислоты, в способе согласно настоящему изобретению не происходит или происходит незначительное окисление полимерного скелета.[71] As stated above, it has been found that the proposed method according to the present invention does not have the disadvantages that usually arise in the production of aldehyde-modified hyaluronic acid, such as a sharp decrease in molecular weight, long reaction time and undesirable side reactions (for example, oxidation to carboxylic acid). acids). For example, it has been found that even when sodium periodate is used as an oxidizing agent, which is known to oxidize the polymer skeleton, resulting in the destruction of the polymer skeleton and a decrease in the molecular weight of hyaluronic acid, little or no oxidation occurs in the method according to the present invention. polymer skeleton.

[72] Причина такого неожиданного протекания процесса заключается в следующем: Периодат предпочтительно взаимодействует с цис-диолами, а не с транс-диолами; для окисления транс-диолов периодатом необходимы относительно жесткие условия и/или продолжительное время реакции. В то время как гидроксильные группы полимерного скелета транс-ориентированы относительно друг друга, группы -OH глицеринового фрагмента (например, -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH) вращаются свободно. Таким образом, вицинальный диол глицеринового фрагмента свободно доступен для окисления периодатом, и реакция окисления (т.е. стадия c)) может быть осуществлена в мягких условиях за относительно короткое время, в результате чего не происходит окисление полимерного скелета. Например, было обнаружено, что реакция окисления на стадии c) может быть осуществлена менее чем за один час, даже за 10 минут.[72] The reason for this unexpected process is as follows: Periodate preferentially reacts with cis-diols rather than trans-diols; Oxidation of trans-diols with periodate requires relatively harsh conditions and/or long reaction times. While the hydroxyl groups of the polymer backbone are trans-oriented relative to each other, the -OH groups of the glycerol moiety (eg -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH) rotate freely. Thus, the vicinal diol of the glycerol moiety is freely available for oxidation by the periodate, and the oxidation reaction (ie step c)) can be carried out under mild conditions in a relatively short time, resulting in no oxidation of the polymer backbone. For example, it has been found that the oxidation reaction in step c) can be carried out in less than one hour, even in 10 minutes.

[73] Кроме того, было обнаружено, что свойства полученного модифицированного производного гиалуроновой кислоты по первому аспекту можно без труда модифицировать (точно регулировать) посредством изменения лишь базовых параметров, например, концентрации исходного материала, количества окислительного агента и времени реакции.[73] In addition, it has been found that the properties of the obtained modified hyaluronic acid derivative in the first aspect can be easily modified (precisely controlled) by changing only the basic parameters, such as the concentration of the starting material, the amount of the oxidizing agent and the reaction time.

[74] Предпочтительно, способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает одну или более следующих стадий:[74] Preferably, the method according to the present invention further includes one or more of the following steps:

d) прекращение реакции на стадии c), предпочтительно посредством добавления этиленгликоля;d) stopping the reaction in step c), preferably by adding ethylene glycol;

e) очистка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, предпочтительно посредством осаждения модифицированного производного гиалуроновой кислоты в органическом растворителе, предпочтительно этаноле, изопропаноле или их смеси, повторное растворение осадка в солевом растворе и повторное осаждение модифицированного производного гиалуроновой кислоты в указанном органическом растворителе;e) purifying the modified hyaluronic acid derivative, preferably by precipitating the modified hyaluronic acid derivative in an organic solvent, preferably ethanol, isopropanol or a mixture thereof, re-dissolving the precipitate in saline and re-precipitating the modified hyaluronic acid derivative in said organic solvent;

f) сушка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного на стадии e).f) drying the modified hyaluronic acid derivative obtained in step e).

[75] Предпочтительно, модифицированная глицерином гиалуроновая кислота имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 5,0 МДа, более предпочтительно от 1,0 до 3,0 МДа, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 МДа, еще более предпочтительно от 1,1 до 1,9, еще более предпочтительно от 1,2 до 1,8 МДа, еще более предпочтительно от 1,3 до 1,7 МДа, еще более предпочтительно от 1,4 до 1,6 МДа. Модифицированная глицерином гиалуроновая кислота также может иметь средневесовую молекулярную массу от 2,0 до 5,0 МДа, или от 2,5 до 5,0 МДа, или от 3,0 до 5,0 МДа, или от 3,0 до 4,5 МДа, или от 3,0 до 4,0 МДа.[75] Preferably, the glycerol-modified hyaluronic acid has a weight average molecular weight of 0.1 to 5.0 MDa, more preferably 1.0 to 3.0 MDa, more preferably 1.0 to 2.0 MDa, even more preferably from 1.1 to 1.9, even more preferably from 1.2 to 1.8 MDa, even more preferably from 1.3 to 1.7 MDa, even more preferably from 1.4 to 1.6 MDa. Glycerol-modified hyaluronic acid may also have a weight average molecular weight of 2.0 to 5.0 MDa, or 2.5 to 5.0 MDa, or 3.0 to 5.0 MDa, or 3.0 to 4. 5 MDa, or 3.0 to 4.0 MDa.

[76] Также предпочтительно, модифицированная глицерином гиалуроновая кислота имеет степень модификации от 5 до 25%, предпочтительно от 10 до 20%. В данном случае степень модификации определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированной глицерином гиалуроновой кислоте. Например, MoD 25,0% означает, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота содержит 25 групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев. MoD 50,0% означает, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота содержит 50 групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH на 100 N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев и т.д. Показано, что такая степень модификации особенно подходит для получения альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты, имеющего требуемую (достаточно низкую) степень альдегидной модификации для получения поперечно-сшитого гидрогеля для применения в эстетической медицине.[76] Also preferably, the glycerol-modified hyaluronic acid has a modification degree of 5 to 25%, preferably 10 to 20%. In this case, the degree of modification is defined as the number of -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups divided by the total number of N-acetyl-D-glucosamine units present in the glycerol-modified hyaluronic acid. For example, a MoD of 25.0% means that glycerol-modified hyaluronic acid contains 25 -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups per 100 N-acetyl-D-glucosamine units. MoD 50.0% means that glycerol modified hyaluronic acid contains 50 -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups per 100 N-acetyl-D-glucosamine units, etc. This degree of modification has been shown to be particularly suitable for the preparation of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative having the required (sufficiently low) degree of aldehyde modification to obtain a cross-linked hydrogel for use in aesthetic medicine.

[77] Предпочтительно, стадию c) проводят при температуре от 4 до 35 °С, более предпочтительно от 15 до 35 °С, еще более предпочтительно от 20 до 30 °С, еще более предпочтительно от 20 до 25 °С, еще более предпочтительно от 21 до 23 °С, еще более предпочтительно примерно 22 °С. Показано, что такие относительно низкие температуры реакции обеспечивают получение альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению с подходящей степенью модификации для получения гидрогелей для применения в эстетической медицине.[77] Preferably, step c) is carried out at a temperature of from 4 to 35 °C, more preferably from 15 to 35 °C, even more preferably from 20 to 30 °C, even more preferably from 20 to 25 °C, even more preferably from 21 to 23 °C, even more preferably about 22 °C. Such relatively low reaction temperatures have been shown to provide the aldehyde-modified hyaluronic acid derivative of the present invention with a suitable degree of modification for the preparation of hydrogels for use in aesthetic medicine.

[78] Также предпочтительно, стадию c) проводят на протяжении от 5 до 120 минут, предпочтительно от 5 до 65 минут, более предпочтительно от 10 до 60 минут, еще более предпочтительно от 10 до 50 минут, еще более предпочтительно от 10 до 40 минут, еще более предпочтительно от 10 до 30 минут, еще более предпочтительно от 10 до 20 минут. Показано, что такое относительно короткое время реакции также обеспечивает получение альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, которое имеет «правильную» степень модификации для получения гидрогелей для применения в эстетической медицине.[78] Also preferably, step c) is carried out for 5 to 120 minutes, preferably 5 to 65 minutes, more preferably 10 to 60 minutes, even more preferably 10 to 50 minutes, even more preferably 10 to 40 minutes , even more preferably from 10 to 30 minutes, even more preferably from 10 to 20 minutes. This relatively short reaction time has also been shown to provide the aldehyde-modified hyaluronic acid derivative of the present invention, which has the “correct” degree of modification to produce hydrogels for use in aesthetic medicine.

[79] Было обнаружено, что степень (альдегидной) модификации увеличивается при увеличении времени реакции, а молекулярная масса полученного модифицированного производного гиалуроновой кислоты немного снижается при увеличении времени реакции.[79] It was found that the degree of (aldehyde) modification increases with increasing reaction time, and the molecular weight of the resulting modified hyaluronic acid derivative decreases slightly with increasing reaction time.

[80] Кроме того, предпочтительно, окислительный агент, предпочтительно периодат натрия, присутствует в количестве от 0,01 до 0,5 молярного эквивалента, предпочтительно от 0,01 до 0,3 молярного эквивалента, более предпочтительно от 0,04 до 0,3 молярного эквивалента, еще более предпочтительно от 0,04 до 0,1 молярного эквивалента относительно молярного количества дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином.[80] Moreover, preferably, the oxidizing agent, preferably sodium periodate, is present in an amount of 0.01 to 0.5 molar equivalent, preferably 0.01 to 0.3 molar equivalent, more preferably 0.04 to 0. 3 molar equivalents, even more preferably 0.04 to 0.1 molar equivalent, based on the molar amount of disaccharide repeat units of glycerol-modified hyaluronic acid.

[81] Обнаружено, что степень (альдегидной) модификации увеличивается с увеличением количества окислительного агента, а молекулярная масса уменьшается при увеличении количества окислительного агента.[81] It was found that the degree of (aldehyde) modification increases with increasing amount of oxidizing agent, and the molecular weight decreases with increasing amount of oxidizing agent.

[82] Кроме того, гиалуроновая кислота, модифицированная глицерином, предпочтительно присутствует в количестве от 2 до 50 г/л, предпочтительно от 2 до 40 г/л, более предпочтительно от 3 до 38 г/л, более предпочтительно от 4 до 36 г/л относительно общего объема реакционной смеси.[82] Moreover, the glycerol-modified hyaluronic acid is preferably present in an amount of 2 to 50 g/L, preferably 2 to 40 g/L, more preferably 3 to 38 g/L, more preferably 4 to 36 g /l relative to the total volume of the reaction mixture.

[83] Обнаружено, что степень (альдегидной) модификации увеличивается с увеличением количества гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, а молекулярная масса уменьшается при увеличении количества гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином.[83] The degree of (aldehyde) modification was found to increase with increasing amount of glycerol-modified hyaluronic acid, and the molecular weight decreased with increasing amount of glycerol-modified hyaluronic acid.

[84] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты, полученному способом, описанным во втором аспекте.[84] In a third aspect, the present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method described in the second aspect.

[85] Также в данном аспекте, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты не содержит других химических модификаций, кроме альдегидной группы, предпочтительно альдегидной группы, присутствующей у атома углерода C6 звена GIcNac и имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO.[85] Also in this aspect, preferably, the modified hyaluronic acid derivative contains no other chemical modifications other than an aldehyde group, preferably an aldehyde group present at the C6 carbon atom of the GIcNac unit and having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO.

[86] Кроме того, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, имеет степень модификации от 1,0% до 20,0%, более предпочтительно от 1,0% до 15,0%, еще более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, еще более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, еще более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, еще более предпочтительно от 2,0% до 6,9%.[86] Moreover, preferably, the modified hyaluronic acid derivative obtained by the method described in the second aspect has a modification degree of 1.0% to 20.0%, more preferably 1.0% to 15.0%, even more preferably from 1.0% to 10.0%, even more preferably from 1.5% to 10.0%, even more preferably from 1.5% to 8.0%, even more preferably from 1.8% to 7 .0%, even more preferably from 2.0% to 6.9%.

[87] Кроме того, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, более предпочтительно от 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа.[87] Moreover, preferably, the modified hyaluronic acid derivative obtained by the method described in the second aspect has a weight average molecular weight of 0.1 to 2.5 MDa, preferably 0.2 to 1.5 MDa, more preferably 0 .4 to 1.3 MDa, even more preferably 0.6 to 1.1 MDa.

[88] Кроме того, предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры[88] Moreover, preferably, the modified hyaluronic acid derivative obtained by the method described in the second aspect contains at least one disaccharide unit of the following structure

где «Ac» является таким, как указано выше, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, или иона щелочноземельного металла. Здесь также следует понимать, что вместо протонированной формы (т.е. R = H), группа карбоновой кислоты также может существовать в депротонированной форме (т.е. R = отрицательный заряд) без какого-либо конкретного противоиона, присутствующего для уравновешивания отрицательного заряда.where "Ac" is as defined above, and R is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, or an alkaline earth metal ion. It should also be understood here that instead of a protonated form (i.e. R = H), the carboxylic acid group can also exist in a deprotonated form (i.e. R = negative charge) without any particular counterion present to balance the negative charge .

[89] Кроме того, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом, описанным во втором аспекте, может дополнительно содержать по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры[89] In addition, the modified hyaluronic acid derivative obtained by the method described in the second aspect may further contain at least one disaccharide unit of the following structure

[90] Кроме того, также в данном аспекте, предпочтительно количество альдегидных групп, присутствующих у атома углерода C6 звена GIcNAc (т.е. R¹ = -CH₂-CHO), деленное на общее количество альдегидных групп, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты (включая альдегидные группы, присутствующие у атома C6 звена GIcNAc), равно от 0,60 до 1, предпочтительно от 0,65 до 1, более предпочтительно от 0,70 до 1, еще более предпочтительно от 0,75 до 1, еще более предпочтительно от 0,80 до 1, еще более предпочтительно от 0,85 до 1, еще более предпочтительно от 0,90 до 1, еще более предпочтительно от 0,95 до 1, еще более предпочтительно от 0,97 до 1, еще более предпочтительно от 0,98 до 1, еще более предпочтительно от 0,99 до 1, наиболее предпочтительно 1.[90] In addition, also in this aspect, it is preferable that the number of aldehyde groups present at the C6 carbon atom of the GIcNAc unit (i.e., R ¹ = -CH ₂ -CHO) divided by the total number of aldehyde groups present in the modified hyaluronic acid derivative acid (including aldehyde groups present at the C6 atom of the GIcNAc unit), is from 0.60 to 1, preferably from 0.65 to 1, more preferably from 0.70 to 1, even more preferably from 0.75 to 1, more more preferably from 0.80 to 1, even more preferably from 0.85 to 1, even more preferably from 0.90 to 1, even more preferably from 0.95 to 1, even more preferably from 0.97 to 1, more more preferably from 0.98 to 1, even more preferably from 0.99 to 1, most preferably 1.

[91] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля в области эстетической медицины.[91] In a fourth aspect, the present invention relates to the use of a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention for in situ production of a cross-linked hydrogel in the field of aesthetic medicine.

[92] Применение в области эстетической медицины согласно настоящему изобретению не является терапевтическим. Предпочтительно, применение в области эстетической медицины согласно настоящему изобретению не является хирургическим.[92] The application in the field of aesthetic medicine according to the present invention is not therapeutic. Preferably, the application in the field of aesthetic medicine according to the present invention is not surgical.

[93] Предпочтительно, модифицированное производное гиалуроновой кислоты, описанное в первом и третьем аспектах, используют для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для обработки морщин и складок кожи, включая межбровные морщины, носогубные складки, складки на подбородке, морщины марионетки, нижнюю часть овала лица, морщины на щеках, окологубные морщины и «гусиные лапки», атрофические рубцы, шрамы, виски, подкожное крепление бровей, жировые подушки на скулах и щеках, слезные борозды, нос, губы, щеки, подбородок, окологубную зону, подглазничную область и лицевую асимметрию.[93] Preferably, the modified hyaluronic acid derivative described in the first and third aspects is used to in situ prepare a cross-linked hydrogel for the treatment of wrinkles and skin folds, including glabellar lines, nasolabial folds, chin folds, marionette lines, lower oval face, wrinkles on the cheeks, peri-labial wrinkles and crow's feet, atrophic scars, scars, temples, subcutaneous attachment of the eyebrows, fat pads on the cheekbones and cheeks, tear troughs, nose, lips, cheeks, chin, peri-labial area, infraorbital area and facial asymmetry.

[94] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к применению модифицированного (альдегидом) производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению или модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного способом согласно настоящему изобретению, для получения предварительно образованного поперечно-сшитого гидрогеля.[94] In a fifth aspect , the present invention relates to the use of a modified (aldehyde) hyaluronic acid derivative according to the present invention or a modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to the present invention to obtain a preformed cross-linked hydrogel.

[95] Гидрогель предпочтительно получают посредством приведения во взаимодействие модифицированного (альдегидом) производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами. Использование модифицированного (альдегидом) производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению для получения поперечно-сшитого гидрогеля имеет множество преимуществ по сравнению с традиционно используемыми способами получения на основе BDDE. Во-первых, поскольку не используются токсичные химические соединения, и предпочтительно в качестве побочного продукта образуется только вода, необходимо меньше времени на очистку полученного гидрогеля и, следовательно, процесс получения, в целом, гораздо проще и быстрее. Кроме того, поскольку очистка является потенциальным источником контаминации, может быть существенно снижен риск контаминации.[95] The hydrogel is preferably prepared by reacting an (aldehyde) modified hyaluronic acid derivative of the present invention with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups. The use of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative according to the present invention to produce a cross-linked hydrogel has many advantages over traditionally used BDDE-based production methods. Firstly, since no toxic chemicals are used and preferably only water is produced as a by-product, less time is required to purify the resulting hydrogel and therefore the overall production process is much simpler and faster. In addition, since cleaning is a potential source of contamination, the risk of contamination can be significantly reduced.

[96] Кроме того, поскольку для применения в эстетической медицине необходим достаточно низковязкий гидрогель, было обнаружено, что образованный предварительно полученный гидрогель демонстрирует достаточно высокую способность проходить через тонкие иглы при инъекции. Однако если необходимо уменьшить усилие при инъекции, в качестве смазывающей фазы может быть добавлен несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновая кислота. [96] In addition, since a sufficiently low-viscosity hydrogel is required for aesthetic medical applications, the preformed hydrogel has been found to exhibit sufficiently high ability to pass through fine needles when injected. However, if it is necessary to reduce the injection force, a non-crosslinked polysaccharide, preferably hyaluronic acid, can be added as a lubricating phase.

[97] Гидрогель предпочтительно получают в буферной среде, предпочтительно в физиологическом буфере, более предпочтительно в фосфатном буфере, или цитратном буфере, или ацетатном буфере, еще более предпочтительно в фосфатном буфере. Предпочтительно, буфер находится в искусственном контейнере.[97] The hydrogel is preferably prepared in a buffer medium, preferably in a physiological buffer, more preferably in a phosphate buffer or citrate buffer or acetate buffer, even more preferably in a phosphate buffer. Preferably, the buffer is in an artificial container.

[98] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному производному гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению для применения для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для терапевтического применения, предпочтительно для лечения стрессового недержания мочи, сухости влагалища, везикоуретерального рефлюкса, недостаточности голосовых связок и медиализации голосовых связок.[98] In a sixth aspect, the present invention relates to a modified hyaluronic acid derivative according to the present invention for use in the in situ preparation of a cross-linked hydrogel for therapeutic use, preferably for the treatment of stress urinary incontinence, vaginal dryness, vesicoureteral reflux, vocal cord insufficiency and vocal medialization ligaments

[99] Предпочтительно, и это относится ко всем аспектам применения гидрогеля, полученного из производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, согласно настоящему изобретению, модифицированное производное гиалуроновой кислоты используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного HA.[99] Preferably, and this applies to all aspects of the use of a hydrogel derived from an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative according to the present invention, the modified hyaluronic acid derivative is used together with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bonding to one or more aldehyde groups of the modified HA derivative.

[100] Предпочтительно, и это относится ко всем аспектам применения второго полисахаридного производного, второе полисахаридное производное получено из природного полисахарида или полусинтетического полисахарида. Конкретные примеры подходящих полисахаридов включают целлюлозу, декстран, крахмал, альгинат, гиалуроновую кислоту, пектин, хитин, сульфат хондроитина, сульфат дерматана, гепарин, сульфат гепарина, гепарозан и т.п.[100] Preferably, and this applies to all aspects of use of the second polysaccharide derivative, the second polysaccharide derivative is derived from a natural polysaccharide or a semi-synthetic polysaccharide. Specific examples of suitable polysaccharides include cellulose, dextran, starch, alginate, hyaluronic acid, pectin, chitin, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparin, heparin sulfate, heparosan and the like.

[101] Особенно предпочтительно, второе полисахаридное производное представляет собой производное гиалуроновой кислоты. В таком случае нуклеоифильная функциональная группа предпочтительно присоединена к скелету гиалуроновой кислоты через группу карбоновой кислоты фрагмента D-глюкуроновой кислоты.[101] Particularly preferably, the second polysaccharide derivative is a hyaluronic acid derivative. In such a case, the nucleophilic functional group is preferably attached to the hyaluronic acid skeleton through the carboxylic acid group of the D-glucuronic acid moiety.

[102] Предпочтительно, нуклеофильная функциональная группа, способная образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного HA, представляет собой амино, аминоокси, карбазатный или гидразидный фрагмент, и предпочтительно представляет собой гидразидный фрагмент.[102] Preferably, the nucleophilic functional group capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified HA derivative is an amino, aminooxy, carbazate or hydrazide moiety, and is preferably a hydrazide moiety.

[103] Термин «гидразидный фрагмент» в данном контексте включает гидразидную функциональную группу и группы или остатки с концевым гидразидным фрагментом, обычно имеющие общее количество атомов углерода не более 15, 10, 5, 4, 3 или 2. Гидразидный фрагмент предпочтительно представляет собой гидразидный (т.е. [полисахарид]-C(O)-NH-NH₂) или дигидразидный фрагмент, в частности, дигидразидный фрагмент общей формулы[103] The term "hydrazide moiety" as used herein includes the hydrazide functionality and hydrazide-terminated groups or residues typically having a total carbon number of no more than 15, 10, 5, 4, 3, or 2. The hydrazide moiety is preferably a hydrazide moiety. (i.e. [polysaccharide]-C(O)-NH-NH ₂ ) or a dihydrazide moiety, in particular a dihydrazide moiety of the general formula

[полисахарид]-C(=O)-NH-NH-R¹-C(=O)-NH-NH₂ [polysaccharide]-C(=O)-NH-NH-R ¹ -C(=O)-NH-NH ₂

где R¹ = ковалентная связь, C(=O), C(=O)-O-R² , (C=O)-R², причем R² = линейная или разветвленная C₁, C₂, C₃, C₄, C₅ или C₆ алкильная или алкенильная группа. Особенно предпочтительным для применения согласно настоящему описанию является карбодигидразид (CDH). Если CDH использован в качестве гидразидного фрагмента и связан с карбоксильной группой полисахарида, то полученный модифицированный полисахарид имеет следующий фрагмент с концевым боковым гидразидом: полисахарид-C(=O)-R, где R представляет собой -NH-NH-C(=O)-NH-NH₂.where R ¹ = covalent bond, C(=O), C(=O)-OR ² , (C=O)-R ² , and R ² = linear or branched C ₁ , C ₂ , C ₃ , C ₄ , _C5 or _C6 alkyl or alkenyl group. Particularly preferred for use herein is carbodihydrazide (CDH). If CDH is used as the hydrazide moiety and is linked to the carboxyl group of the polysaccharide, the resulting modified polysaccharide has the following moiety with a terminal hydrazide pendant: polysaccharide-C(=O)-R, where R is -NH-NH-C(=O) -NH-NH ₂ .

[104] Предпочтительно, нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного присоединена к полисахаридному скелету через свободную группу карбоновой кислоты полисахарида, из которого получено второе полисахаридное производное. Модификация группы карбоновой кислоты может быть осуществлена любым способом, известным в данной области техники, с использованием растворимого в воде связующего реагента. Например, подходящий способ включает применение стандартной химии карбодиимидов, например, использование EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) в качестве связующего агента для связывания фрагмента с концевым гидразидом с карбоксильной группой с образованием соответствующих ацилгидразидов полисахаридов (см., например, WO 95/15168). Другие подходящие связующие реагенты представляют собой триазиновые соединения, такие как DMTMM (4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид; см, например, WO 2016/097211), активные сложные эфиры, такие как N,N-дисукцинимидилкарбонат, и соли тетраметиламиния (например, HATU).[104] Preferably, the nucleophilic functional group of the second polysaccharide derivative is attached to the polysaccharide skeleton through a free carboxylic acid group of the polysaccharide from which the second polysaccharide derivative is derived. Modification of the carboxylic acid group can be accomplished by any method known in the art using a water-soluble coupling reagent. For example, a suitable method involves using standard carbodiimide chemistry, such as using EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) as a coupling agent to couple the terminal hydrazide moiety to the carboxyl group to form the corresponding polysaccharide acylhydrazides (see, for example WO 95/15168). Other suitable coupling reagents are triazine compounds such as DMTMM (4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride; see, for example, WO 2016/097211), active esters such as N,N -disuccinimidyl carbonate, and tetramethylaminium salts (eg HATU).

[105] Предпочтительно, второй полисахарид представляет собой производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено, имеющее следующую структуру:[105] Preferably, the second polysaccharide is a hyaluronic acid derivative containing at least one disaccharide unit having the following structure:

[106] При приведении в контакт друг с другом альдегидная группа модифицированного производного гиалуроновой кислоты и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производства самопроизвольно образуют ковалентную связь при совместной инъекции модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в требуемое место тела субъекта, с образованием поперечно-сшитого гидрогеля в требуемом месте. Альтернативно, альдегидная группа модифицированного производного гиалуроновой кислоты и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного самопроизвольно образуют ковалентную связь при приведении их в контакт in vitro. В таком случае модифицированное производное гиалуроновой кислоты и второй полисахарид предпочтительно находятся в буфере, указанном выше, причем указанный буфер предпочтительно находится в искусственном контейнере.[106] When brought into contact with each other, the aldehyde group of the modified hyaluronic acid derivative and the nucleophilic functional group of the second polysaccharide derivative spontaneously form a covalent bond when the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative are co-injected into the desired location of the subject's body, forming a cross-linked hydrogel in the required place. Alternatively, the aldehyde group of the modified hyaluronic acid derivative and the nucleophilic functional group of the second polysaccharide derivative spontaneously form a covalent bond when brought into contact in vitro . In such a case, the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide are preferably in the buffer specified above, said buffer being preferably in an artificial container.

[107] В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, содержащему следующее структурное звено:[107] In a seventh aspect, the present invention relates to a cross-linked hydrogel containing the following structural unit:

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, и иона щелочноземельного металла.where "Ac" means -C(O)CH ₃ and R is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, and an alkaline earth metal ion.

[108] В соответствии с предпочтительным вариантом реализации, поперечно-сшитый гидрогель представляет собой предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель. Предпочтительно, указанный предварительно полученный гидрогель находится в системе доставки, готовой для применения, такой как предварительно наполненный шприц. Предпочтительно, указанный предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель является стерильным и готовым для инъекции в тело пациента, предпочтительно в эстетических целях. Гидрогель предпочтительно стерилизуют влажным жаром (например, в автоклаве). Предпочтительно, гидрогелем сначала наполняют систему доставки, например, шприц, и затем подвергают стерилизации полученную систему доставки, готовую для применения, такую как предварительно наполненный шприц. Предпочтительно, указанный предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновую кислоту, в качестве смазывающей фазы. Смазывающая фаза снижает усилие при инъекции через тонкие иглы, обычно используемые в области эстетической медицины, и обеспечивает возможность инъекции гидрогелей через тонкие иглы, несмотря на то, что они находятся в поперечно-сшитой форме. Предпочтительно, несшитый полисахарид присутствует в количестве от 1% до 30% мас. относительно общего количества полисахарида, более предпочтительно т 5% мас. до 20% мас., еще более предпочтительно от 7% мас. до 5% мас., еще более предпочтительно от 8% мас. до 12% мас., еще более предпочтительно от 9% мас. до 11% мас., еще более предпочтительно примерно 10% мас. Также предпочтительно, указанный предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит местные анестезирующие агенты, предпочтительно лидокаин, полиспирты (также упоминаемые как полиолы), витамины, соли щелочных металлов и щелочноземельных металлов, металлы, антиоксиданты, аминокислоты и керамические частицы, предпочтительным анестетиком является лидокаин. Предпочтительно, местный анестезирующий агент присутствует в количестве от 0,05% мас. до 2% мас. относительно общей массы полисахарида, более предпочтительно от 0,1% мас. до 1% мас., еще более предпочтительно от 0,1% мас. до 0,8% мас., еще более предпочтительно от 0,1% мас. до 0,6% мас., еще более предпочтительно от 0,1% мас. до 0,4% мас., еще более предпочтительно от 0,2% мас. до 0,4% мас., еще более предпочтительно примерно 0,3% мас. Предпочтительно, полиол присутствует в количестве от 0,5% мас. до 5,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., еще более предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас., еще более предпочтительно от 1,8% мас. до 2,2% мас., еще более предпочтительно примерно 2,0% мас. Предпочтительно, полиол представляет собой маннит.[108] According to a preferred embodiment, the cross-linked hydrogel is a pre-formed cross-linked hydrogel. Preferably, said preformed hydrogel is in a ready-to-use delivery system, such as a pre-filled syringe. Preferably, said preformed cross-linked hydrogel is sterile and ready for injection into the patient's body, preferably for aesthetic purposes. The hydrogel is preferably sterilized by moist heat (eg, in an autoclave). Preferably, the hydrogel is first filled into a delivery system, such as a syringe, and then the resulting delivery system, such as a pre-filled syringe, is sterilized. Preferably, said preformed cross-linked hydrogel further contains a non-cross-linked polysaccharide, preferably hyaluronic acid, as a lubricating phase. The lubricating phase reduces the injection force through fine needles commonly used in the field of aesthetic medicine and allows hydrogels to be injected through fine needles despite being in a cross-linked form. Preferably, the non-crosslinked polysaccharide is present in an amount of from 1% to 30% by weight. relative to the total amount of polysaccharide, more preferably 5% wt. up to 20% wt., even more preferably from 7% wt. up to 5% wt., even more preferably from 8% wt. up to 12% wt., even more preferably from 9% wt. up to 11% wt., even more preferably about 10% wt. Also preferably, said preformed cross-linked hydrogel further contains local anesthetic agents, preferably lidocaine, polyalcohols (also referred to as polyols), vitamins, alkali metal and alkaline earth metal salts, metals, antioxidants, amino acids and ceramic particles, the preferred anesthetic being lidocaine. Preferably, the local anesthetic agent is present in an amount of from 0.05% wt. up to 2% wt. relative to the total weight of the polysaccharide, more preferably from 0.1% wt. up to 1% wt., even more preferably from 0.1% wt. up to 0.8% wt., even more preferably from 0.1% wt. up to 0.6% wt., even more preferably from 0.1% wt. up to 0.4% wt., even more preferably from 0.2% wt. up to 0.4% wt., even more preferably about 0.3% wt. Preferably, the polyol is present in an amount of from 0.5% wt. up to 5.0% wt., more preferably from 1.0% wt. up to 3.0% wt., even more preferably from 1.5% wt. up to 2.5% wt., even more preferably from 1.8% wt. up to 2.2% wt., even more preferably about 2.0% wt. Preferably, the polyol is mannitol.

[109] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к поперечно-сшитому гидрогелю, полученному посредством приведения в контакт модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению и второго полисахаридного производного, указанного выше, причем поперечно-сшитый гидрогель предпочтительно содержит следующее структурное звено:[109] In an eighth aspect , the present invention relates to a cross-linked hydrogel obtained by contacting the modified hyaluronic acid derivative of the present invention and the second polysaccharide derivative mentioned above, wherein the cross-linked hydrogel preferably contains the following structural unit:

[110] Предпочтительно, поперечно-сшитый гидрогель, описанный в седьмом и восьмом аспектах, имеет динамический модуль упругости при 1 Гц от 50 до 1000 Па, более предпочтительно от 50 до 500 Па, еще более предпочтительно от 50 до 300 Па, еще более предпочтительно от 50 до 150 Па или от 150 до 300 Па. Динамический модуль упругости может быть определено посредством реологических измерений, проведенных при 25 °С при колебательном напряжении 1 Па с использованием частотного сканирования от 1,0 до 10 Гц.[110] Preferably, the cross-linked hydrogel described in the seventh and eighth aspects has a dynamic modulus at 1 Hz of 50 to 1000 Pa, more preferably 50 to 500 Pa, even more preferably 50 to 300 Pa, even more preferably from 50 to 150 Pa or from 150 to 300 Pa. The dynamic modulus of elasticity can be determined by rheological measurements carried out at 25 °C under an oscillatory stress of 1 Pa using a frequency scan from 1.0 to 10 Hz.

[111] В соответствии с одним вариантом реализации, приведение в контакт осуществляют in situ, т.е. внутри тела пациента. В соответствии с другим вариантом реализации, приведение в контакт осуществляют in vitro, т.е. за пределами тела человека или животного, предпочтительно в буферной среде, описанной выше. Предпочтительно, буферная среда находится в искусственном контейнере.[111] According to one embodiment, the contacting is carried out in situ , i.e. inside the patient's body. According to another embodiment, the contacting is carried out in vitro, i.e. outside the human or animal body, preferably in the buffer environment described above. Preferably, the buffer medium is in an artificial container.

[112] В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу, предпочтительно к косметологическому способу получения поперечно-сшитого гидрогеля. Предложенный способ включает следующие стадии: a) обеспечение первого раствора предшественника, содержащего модифицированное производное гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению, и отдельно от него второго раствора предшественника, содержащего второе полисахаридное производное, описанное выше; b) смешивание первого раствора предшественника и второго раствора предшественника с получением смеси, способной к поперечному сшиванию in situ; и c) инъекция смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в целевое место организма пациента с получением поперечно-сшитого геля в целевом месте.[112] In a ninth aspect, the present invention relates to a method, preferably a cosmetic method, for producing a cross-linked hydrogel. The proposed method includes the following steps: a) providing a first precursor solution containing the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention, and separately therefrom a second precursor solution containing the second polysaccharide derivative described above; b) mixing the first precursor solution and the second precursor solution to obtain a mixture capable of in situ cross-linking; and c) injecting the mixture capable of in situ cross-linking into a target site of the patient's body to produce a cross-linked gel at the target site.

[113] Предпочтительно, первый раствор предшественника и второй раствор предшественника, обеспечиваемые на стадии a), являются стерильными.[113] Preferably, the first precursor solution and the second precursor solution provided in step a) are sterile.

[114] Термин «стерилизованный» или «стерильный» в данном контексте относится к тепловой стерилизации, в частности, к стерилизации влажным жаром (например, паровой стерилизации) и предпочтительно относится к автоклавированию. Автоклавирование можно осуществлять при температуре от 120 °С до 132 °С в течение от 0,3 минуты до 20 минут, или при температуре от 121 °С до 130 °С в течение от 0,5 минуты до 10 минут, например, при температуре 121 °С в течение от 0,5 минуты до 2 минут.[114] The term “sterilized” or “sterile” as used herein refers to heat sterilization, particularly moist heat sterilization (eg, steam sterilization), and preferably refers to autoclaving. Autoclaving can be carried out at a temperature of 120°C to 132°C for 0.3 minutes to 20 minutes, or at a temperature of 121°C to 130°C for 0.5 minutes to 10 minutes, e.g. 121 °C for 0.5 minutes to 2 minutes.

[115] Смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, полученная на стадии b) без труда выдавливают через тонкие иглы, прилагая небольшое усилие для инъекции, обеспечивая, например, улучшение кожи, придание коже формы или оптимальный эффект увеличения объема. Это преимущественно обеспечивает возможность применения тонких игл, что, в свою очередь, повышает комфорт пациента (уменьшение боли при инъекции, снижение противодавления) и дополнительно обеспечивает возможность практикующему специалисту точно и безопасно (без закупоривания сосудов) инъецировать гидрогель в требуемые целевые зоны, такие как различные слои кожи.[115] The in situ cross-linkable mixture obtained in step b) is easily extruded through fine needles with little injection force, providing, for example, skin enhancement, skin shaping or an optimal volumizing effect. This advantageously enables the use of fine needles, which in turn improves patient comfort (reduced injection pain, reduced back pressure) and further enables the practitioner to accurately and safely (without occluding blood vessels) inject the hydrogel into the required target areas, such as various layers of skin.

[116] Смешивание и инъекцию можно осуществлять с помощью двухкамерного шприца, описанного ниже в данном документе, или любой другой подходящей шприцевой системы, в которой первый и второй растворы предшественников физически разделены до одновременного выдавливания и одновременного смешивания и инъекции смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, через иглу (или канюлю) в тело пациента. Таким образом, совместная инъекция должна быть осуществлена настолько быстро, чтобы избежать предварительного поперечного сшивания до введения смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в целевое место организма. С другой стороны, время гелеобразования должно быть достаточно коротким во избежание распространения смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в окружающие ткани.[116] Mixing and injection can be accomplished using a dual chamber syringe described later herein, or any other suitable syringe system in which the first and second precursor solutions are physically separated prior to simultaneous extrusion and simultaneous mixing and injection of the cross-linkable mixture in situ , through a needle (or cannula) into the patient's body. Thus, co-injection must be carried out so quickly as to avoid pre-cross-linking before introducing the in situ cross-linking mixture into the target site of the body. On the other hand, the gelation time must be short enough to prevent the in situ cross-linking mixture from spreading into the surrounding tissue.

[117] Таким образом, предпочтительно, на стадии a) первый и второй растворы предшественников находятся в различных камерах многокамерного шприца, предпочтительно двухкамерного шприца, и смешивание на стадии b) происходит во время выдавливания из указанного многокамерного шприца.[117] Thus, preferably, in step a) the first and second precursor solutions are in different chambers of a multi-chamber syringe, preferably a dual-chamber syringe, and mixing in step b) occurs during extrusion from said multi-chamber syringe.

[118] Термин «многокамерный шприц» в данном контексте означает шприц, который содержит по меньшей мере две отдельные камеры и может иметь два или более поршней. Термин «двухкамерная шприцевая система» в данном контексте означает любую систему или устройство, обычно шприц, которое содержит две отдельные камеры и может иметь один или два поршня. Кроме того, многокамерная, например, двухкамерная шприцевая система обычно содержит колпачок наконечника, или иглу или канюлю с колпачком иглы или без него для закрывания конца(ов) шприцевой системы. Камеры обычно имеют емкость резервуара для вмещения достаточного количества первого и второго растворов предшественников. Камеры могут быть изготовлены из стекла, пластика или любого другого подходящего материала, и могут иметь разную геометрию, внутренние диаметры, состав материалов, прозрачность и т.д. Кроме того, многокамерная шприцевая система может представлять собой двухкамерную шприцевую систему в форме шприца, имеющего два шприца, соединенных как одно целое, т.е. две камеры, соединенных как одно целое, и моно- или двухпоршневой блок для выдавливания содержимого из камер. Кроме того, шприцевая система может содержать две камеры, соединенные разъемным образом, и два или один поршень, соединенный разъемным образом.[118] The term "multi-chamber syringe" as used herein means a syringe that contains at least two separate chambers and may have two or more pistons. The term "dual chamber syringe system" in this context means any system or device, typically a syringe, that contains two separate chambers and may have one or two pistons. In addition, a multi-chamber, eg, dual-chamber syringe system typically includes a tip cap, or a needle or cannula, with or without a needle cap, to cover the end(s) of the syringe system. The chambers typically have a reservoir capacity to hold sufficient quantities of the first and second precursor solutions. Chambers can be made of glass, plastic or any other suitable material, and can have different geometries, internal diameters, material composition, transparency, etc. Moreover, the multi-chamber syringe system may be a dual-chamber syringe system in the form of a syringe having two syringes connected as one unit, i.e. two chambers connected as one unit, and a mono- or double-piston unit for squeezing the contents out of the chambers. In addition, the syringe system may contain two chambers connected in a detachable manner and two or one piston connected in a detachable manner.

[119] Кроме того, первый раствор предшественника и/или второй раствор предшественника может содержать дополнительные вещества, такие как клетки, включая стволовые клетки и адипоциты, жиры, липиды, факторы роста, цитокины, лекарственные соединения и биоактивные вещества. Более конкретно, первый раствор предшественника и/или второй раствор предшественника могут содержать местные анестезирующие агенты, полиспирты (также упоминаемые как полиолы), витамины, соли щелочных металлов и щелочноземельных металлов, металлы, антиоксиданты, аминокислоты и керамические частицы.[119] In addition, the first precursor solution and/or the second precursor solution may contain additional substances such as cells, including stem cells and adipocytes, fats, lipids, growth factors, cytokines, drug compounds and bioactive substances. More specifically, the first precursor solution and/or the second precursor solution may contain local anesthetic agents, polyalcohols (also referred to as polyols), vitamins, alkali metal and alkaline earth metal salts, metals, antioxidants, amino acids, and ceramic particles.

[120] В контексте настоящего изобретения добавление местного анестетика особенно желательно с учетом его способности устранять боль при инъекции. Иллюстративные местные анестезирующие агенты включают, но не ограничиваются ими, амбукамин, амоланон, амилокаин, беноксинат, бензокаин, бетоксикаин, бифенамин, бупивакаин, бутакаин, бутамбен, бутаниликаин, бутетамин, бутоксикаин, картикаин, хлорпрокаин, кокаэтилен, кокаин, циклометикаин, дибукаин, диметизоквин, диметокаин, диперодон, дицикломин, экгонидин, экгонин, этилхлорид, этидокаин, бета-эукаин, эупроцин, феналкомин, формокаин, гексилкаин, гидрокситетракаин, изобутил-п-аминобензоат, мезилат лейцинокаина, левоксадрол, лидокаин, мепивакаин, меприлкаин, метабутоксикаин, метилхлорид, миртекаин, наепаин, октокаин, ортокаин, оксетазаин, паретоксикаин, фенакаин, фенол, пиперокаин, пиридокаин, полидоканол, прамоксин, прилокаин, прокаин, пропанокаин, пропаракаин, пропипокаин, пропоксикаин, псевдококаин, пиррокаин, ропивакаин, салициловый спирт, тетракаин, толикаин, тримекаин, золамин и их соли.[120] In the context of the present invention, the addition of a local anesthetic is particularly desirable in view of its ability to eliminate injection pain. Exemplary local anesthetic agents include, but are not limited to, ambucamine, amolanone, amylocaine, benoxinate, benzocaine, betoxycaine, biphenamine, bupivacaine, butacaine, butamben, butanilicaine, butetamine, butoxycaine, carticaine, chloroprocaine, cocaethylene, ***e, cyclomethicaine, dibucaine, dimetizoquin , dimethocaine, diperodone, dicyclomine, ecgonidine, ecgonine, ethyl chloride, etidocaine, beta-eucaine, euprocin, phenalcomine, formocaine, hexylcaine, hydroxytetracaine, isobutyl-p-aminobenzoate, leucinocaine mesylate, levoxadrol, lidocaine, mepivacaine, meprilcaine, meta butoxycaine, methyl chloride, mirtecaine, naepaine, octocaine, orthocaine, oxetazaine, parethoxycaine, phenacaine, phenol, piperocaine, pyridocaine, polidocanol, pramoxine, prilocaine, procaine, propanocaine, proparacaine, propipocaine, propoxycaine, pseudo***e, pyrrocaine, ropivacaine, salicylic alcohol, tetracaine, tolicaine, trimecaine , zolamine and their salts.

[121] Предпочтительно, анестезирующий агент представляет собой лидокаин, например, в форме лидокаин.HCl. Первый и/или второй раствор предшественника может иметь концентрацию лидокаина, например, от 0,05% мас. до 8,0% мас., от 0,1% мас. до 4,0% мас., от 0,2% мас. до 3,0% мас., от 0,3% мас. до 2,0% мас. или от 0,4% мас. до 1,0% мас.[121] Preferably, the anesthetic agent is lidocaine, for example in the form of lidocaine.HCl. The first and/or second precursor solution may have a lidocaine concentration of, for example, from 0.05% wt. up to 8.0% wt., from 0.1% wt. up to 4.0% wt., from 0.2% wt. up to 3.0% wt., from 0.3% wt. up to 2.0% wt. or from 0.4% wt. up to 1.0% wt.

[122] Подходящие полиолы для применения согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, глицерин, маннит, сорбит, пропиленгликоль, эритрит, ксилит, мальтит и лактит. Особенно подходящими для применения согласно настоящему изобретению являются маннит и глицерин. Кроме того, полиол предпочтительно представляет собой гликоль, необязательно в комбинации с одним или более вышеупомянутыми полиольными соединениями, в частности, маннитом. Подходящие витамины включают витамин C, витамин E и витамины группы B, т.е. один или более витаминов B₂, B₃, B₅, B₆, B₇, B₉ и B₁₂. Витамины могут присутствовать для стимуляции и поддержания клеточного метаболизма и, следовательно, для ускорения выработки коллагена. Особенно предпочтительным для применения согласно настоящему изобретению является витамин C, витамин E и витамин B₆. Предпочтительная соль для применения в композиции филлера мягких тканей представляет собой цинковую соль. Керамические частицы предпочтительно представляют собой гидроксиапатитовые частицы, т.е. частицы гидроксиапатита кальция (CaHA).[122] Suitable polyols for use in the present invention include, but are not limited to, glycerin, mannitol, sorbitol, propylene glycol, erythritol, xylitol, maltitol, and lactitol. Particularly suitable for use according to the present invention are mannitol and glycerin. Moreover, the polyol is preferably a glycol, optionally in combination with one or more of the above-mentioned polyol compounds, in particular mannitol. Suitable vitamins include vitamin C, vitamin E and B vitamins, i.e. one or more vitamins B ₂ , B ₃ , B ₅ , B ₆ , B ₇ , B ₉ and B ₁₂ . Vitamins may be present to stimulate and maintain cellular metabolism and therefore accelerate collagen production. Particularly preferred for use according to the present invention are vitamin C, vitamin E and vitamin B ₆ . A preferred salt for use in the soft tissue filler composition is a zinc salt. The ceramic particles are preferably hydroxyapatite particles, i.e. calcium hydroxyapatite (CaHA) particles.

[123] Альтернативно, первый раствор предшественника состоит из модифицированного производного гиалуроновой кислоты, и/или второй раствор предшественника состоит из второго полисахаридного производного.[123] Alternatively, the first precursor solution consists of a modified hyaluronic acid derivative, and/or the second precursor solution consists of a second polysaccharide derivative.

[124] Кроме того, первый раствор предшественника может состоять из модифицированного производного гиалуроновой кислоты и водного буферного раствора, и/или второй раствор предшественника может состоять из второго полисахаридного производного и водного буферного раствора.[124] In addition, the first precursor solution may consist of a modified hyaluronic acid derivative and an aqueous buffer solution, and/or the second precursor solution may consist of a second polysaccharide derivative and an aqueous buffer solution.

[125] Количество модифицированного производного гиалуроновой кислоты, присутствующего в первом растворе предшественника, может составлять от 0,1% мас. до 5,0% мас., предпочтительно от 0,5% мас. до 4,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., и наиболее предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас., и количество второго полисахаридного производного, присутствующего во втором растворе предшественника, может составлять от 0,1% мас. до 5,0% мас., предпочтительно от 0,5% мас. до 4,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., и наиболее предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас. Кроме того массовое соотношение модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного, которые вводят совместной инъекцией, предпочтительно составляет от 15:85 до 85:15, более предпочтительно от 30:70 до 70:30, и наиболее предпочтительно от 40:60 до 60:40 или 50:50 (модифицированного производного гиалуроновой кислоты ко второму полисахаридному производному).[125] The amount of the modified hyaluronic acid derivative present in the first precursor solution may range from 0.1% by weight. up to 5.0% wt., preferably from 0.5% wt. up to 4.0% wt., more preferably from 1.0% wt. up to 3.0% wt., and most preferably from 1.5% wt. to 2.5% wt., and the amount of the second polysaccharide derivative present in the second solution of the precursor may be from 0.1% wt. up to 5.0% wt., preferably from 0.5% wt. up to 4.0% wt., more preferably from 1.0% wt. up to 3.0% wt., and most preferably from 1.5% wt. up to 2.5% wt. Moreover, the weight ratio of the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative that are co-injected is preferably 15:85 to 85:15, more preferably 30:70 to 70:30, and most preferably 40:60 to 60: 40 or 50:50 (modified hyaluronic acid derivative to the second polysaccharide derivative).

[126] Первый и второй растворы предшественников обычно имеют низкую комплексную вязкость от 0,001 Па⋅с до 5,0 Па⋅с, в частности, от 0,005 Па⋅с до 3,0 Па⋅с, предпочтительно от 0,01 Па⋅с до 2,0 Па⋅с, более предпочтительно от 0,1 Па⋅с до 1,8 Па⋅с, по результатам колебательных реологических измерений при 1 Гц и 25 °С. Кроме того, первый и второй растворы предшественников могут характеризоваться низким усилием инъекции от 0,01 Н до 15 Н, предпочтительно от 0,1 Н до 10 Н, более предпочтительно от 0,5 Н до 7,5 Н, и наиболее предпочтительно от 0,01 Н до 50 Н или от 1,0 Н до 5,0 Н, при измерении через иглу 30G (TSK Laboratory) при скорости выдавливания примерно 0,21 мм/с с использованием стандартного стеклянного шприца объемом 1,0 мл (BD Hypak SCF, длинный шприц RF-PRTC объемом 1 мл, ISO 11040, внутренний диаметр 6,35 мм).[126] The first and second precursor solutions typically have a low complex viscosity of from 0.001 Pa⋅s to 5.0 Pa⋅s, in particular from 0.005 Pa⋅s to 3.0 Pa⋅s, preferably from 0.01 Pa⋅s up to 2.0 Pa⋅s, more preferably from 0.1 Pa⋅s to 1.8 Pa⋅s, based on the results of oscillatory rheological measurements at 1 Hz and 25 °C. In addition, the first and second precursor solutions may have a low injection force of from 0.01 N to 15 N, preferably from 0.1 N to 10 N, more preferably from 0.5 N to 7.5 N, and most preferably from 0 .01 N to 50 N or 1.0 N to 5.0 N, measured through a 30G needle (TSK Laboratory) at an extrusion rate of approximately 0.21 mm/s using a standard 1.0 mL glass syringe (BD Hypak SCF, 1ml RF-PRTC long syringe, ISO 11040, 6.35mm ID).

[127] Смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, предпочтительно имеет комплексную вязкость от 0,1 Па⋅с до 100 Па⋅с, или от 0,1 Па⋅с до 75 Па⋅с, или от 1,0 Па⋅с до 75 Па⋅с, более предпочтительно от 1 Па⋅с до 50 Па⋅с, или от 5 Па⋅с до 50 Па⋅с, при измерении так, как описано выше. Кроме того, усилие инъекции указанной композиции предпочтительно составляет от 0,01 Н до 20 Н, или от 0,01 до 10 Н, более предпочтительно от 0,1 Н до 10 Н, и наиболее предпочтительно от 1,0 Н до 5,0 Н, при измерении так, как описано выше.[127] The in situ cross-linkable mixture preferably has a complex viscosity of 0.1 Pa s to 100 Pa s, or 0.1 Pa s to 75 Pa s, or 1.0 Pa s s to 75 Pa⋅s, more preferably from 1 Pa⋅s to 50 Pa⋅s, or from 5 Pa⋅s to 50 Pa⋅s, when measured as described above. Moreover, the injection force of said composition is preferably from 0.01 N to 20 N, or from 0.01 to 10 N, more preferably from 0.1 N to 10 N, and most preferably from 1.0 N to 5.0 H, when measured as described above.

[128] Смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, которая попадает в тело пациента, т.е. смесь двух растворов предшественников, предпочтительно имеет общее содержание модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного от 0,1% мас до 5,0% мас. [128] A mixture capable of in situ cross-linking that enters the patient's body, i.e. a mixture of two precursor solutions preferably has a total content of the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative from 0.1 wt% to 5.0 wt%.

[129] В соответствии с настоящим изобретением, общее количество гидразид- и альдегид-функционализированных производных HA, присутствующих в жидкой композиции, предпочтительно составляет от 0,1% мас. до 5,0% мас., в частности, от 0,5% мас. до 4,0% мас., более предпочтительно от 1,0% мас. до 3,0% мас., и наиболее предпочтительно от 1,5% мас. до 2,5% мас. Кроме того, модифицирующее отношение гидразид-функционализированного производного HA к альдегид-функционализированному производному HA предпочтительно составляет от 15:85 до 75:25, более предпочтительно от 25:75 до 60:40, особенно предпочтительно от 40:60 до 60:40, и наиболее предпочтительно составляет 50:50.[129] In accordance with the present invention, the total amount of hydrazide- and aldehyde-functionalized HA derivatives present in the liquid composition is preferably from 0.1% by weight. up to 5.0% wt., in particular from 0.5% wt. up to 4.0% wt., more preferably from 1.0% wt. up to 3.0% wt., and most preferably from 1.5% wt. up to 2.5% wt. Moreover, the modifying ratio of the hydrazide-functionalized HA derivative to the aldehyde-functionalized HA derivative is preferably 15:85 to 75:25, more preferably 25:75 to 60:40, particularly preferably 40:60 to 60:40, and most preferably it is 50:50.

[130] Инъецированная смесь, способная к поперечному сшиванию in situ, быстро и эффективно подвергается поперечному сшиванию in situ с образованием ковалентно сшитого гидрогеля в требуемом месте тела. Для инициации реакции поперечного сшивания не нужны ни добавки, ни катализаторы, ни изменение рН, ни УФ излучение, а также любые другие внешние факторы воздействия (или «активаторы»). В частности, не используют или нет необходимости в сшивающем агенте. Единственным побочным продуктом, образующемся в реакции поперечного сшивания, обычно является вода, которая легко абсорбируется гидрогелем и/или окружающими тканями.[130] The injected mixture, capable of in situ cross-linking, quickly and efficiently undergoes in situ cross-linking to form a covalently cross-linked hydrogel at the desired location of the body. No additives, catalysts, pH changes, UV radiation, or any other external factors (or “activators”) are needed to initiate the cross-linking reaction. In particular, no crosslinking agent is used or is not necessary. The only byproduct produced from the cross-linking reaction is usually water, which is readily absorbed by the hydrogel and/or surrounding tissues.

[131] Кроме того, образованный in situ поперечно-сшитый гидрогель демонстрирует благоприятные механические, химические и реологические свойства для применения в качестве материала филлера мягких тканей. В частности, он имеет высокую способность к созданию объема. Кроме того, in situ сшитый гидрогель согласно настоящему изобретению имеет пролонгированное время пребывания in vivo, сохраняя при этом способность к биоразложению. Кроме того, он может при необходимости содержать анестезирующие агенты (например, лидокаин) и различные другие компоненты (например, клетки, включая стволовые клетки и адипоциты, жиры, липиды, факторы роста и витамины). Таким образом, композиция, способная к поперечному сшиванию in situ, согласно настоящему изобретению особенно подходит для применения в качестве кожного филлера для эстетических целей.[131] In addition, the in situ formed cross-linked hydrogel exhibits favorable mechanical, chemical, and rheological properties for use as a soft tissue filler material. In particular, it has a high ability to create volume. In addition, the in situ cross-linked hydrogel of the present invention has a prolonged in vivo residence time while maintaining biodegradability. In addition, it may optionally contain anesthetic agents (eg, lidocaine) and various other components (eg, cells, including stem cells and adipocytes, fats, lipids, growth factors and vitamins). Thus, the in situ cross-linkable composition of the present invention is particularly suitable for use as a dermal filler for aesthetic purposes.

[132] В десятом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения поперечно-сшитого гидрогеля. Следует понимать, что предложенный способ осуществляют за пределами тела человека или животного. Или иными словами: Поперечно-сшитый гидрогель, полученный предложенным способом, представляет собой предварительно полученный поперечно-сшитый гидрогель. Предложенный способ включает следующие стадии:[132] In a tenth aspect, the present invention relates to a method for producing a cross-linked hydrogel. It should be understood that the proposed method is carried out outside the human or animal body. Or in other words: The cross-linked hydrogel obtained by the proposed method is a pre-prepared cross-linked hydrogel. The proposed method includes the following stages:

Стадия a): Обеспечение буфера, указанного выше.Stage a): Providing the buffer specified above.

Стадия b): Добавление модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению (или полученного в соответствии со способом согласно настоящему изобретению) и добавление второго полисахаридного производного, описанного выше, в указанный буфер. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты и второе полисахаридное производное можно добавлять в буфер одновременно или последовательно в любом возможном порядке. Необязательно, в буфер на стадии b) может быть добавлен несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновая кислота. Несшитый полисахарид также можно добавлять одновременно или последовательно с любым из модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного.Step b): Adding the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention (or obtained in accordance with the method according to the present invention) and adding the second polysaccharide derivative described above to said buffer. The modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative can be added to the buffer simultaneously or sequentially in any possible order. Optionally, a non-crosslinked polysaccharide, preferably hyaluronic acid, can be added to the buffer in step b). The non-crosslinked polysaccharide can also be added simultaneously or sequentially with any of the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative.

Стадия c): Поперечное сшивание модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в указанном буфере с получением поперечно-сшитого геля.Step c): Cross-linking the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative in said buffer to obtain a cross-linked gel.

Стадия d): Необязательное добавление несшитого полисахарида, как указано выше.Step d): Optional addition of non-crosslinked polysaccharide as above.

Стадия е): Необязательно просеивание и дегазирование гидрогеля, полученного на стадии c) или d).Step e): Optionally sieving and degassing the hydrogel obtained in step c) or d).

Стадия f): Необязательное наполнение контейнера, предпочтительно шприца, более предпочтительно готового для применения шприца гидрогелем, полученным на стадии c), d) или e).Step f): Optionally filling a container, preferably a syringe, more preferably a ready-to-use syringe, with the hydrogel obtained in step c), d) or e).

Стадия g): Необязательная стерилизация контейнера, содержащего гель, полученного на стадии f).Step g): Optional sterilization of the container containing the gel obtained in step f).

[133] Предпочтительно, стадия d) является частью предложенного способа. Также предпочтительно, стадии e), f) и g) являются частью предложенного способа. Более предпочтительно, стадии d), e), f) и g) являются частью предложенного способа.[133] Preferably, step d) is part of the proposed method. Also preferably, steps e), f) and g) are part of the proposed method. More preferably, steps d), e), f) and g) are part of the proposed method.

[134] Способ получения поперечно-сшитого гидрогеля согласно настоящему изобретению является весьма преимущественным по сравнению со способом получения поперечно-сшитого гидрогеля на основе BDDE. В частности, предложенный способ существенно проще и менее подвержен ошибкам. Это обусловлено тем, что в то время как способ получения гидрогеля на основе BDDE включает следующие общие стадии:[134] The method for producing a cross-linked hydrogel according to the present invention is highly advantageous compared with the method for producing a BDDE-based cross-linked hydrogel. In particular, the proposed method is significantly simpler and less error-prone. This is due to the fact that while the method for producing a BDDE-based hydrogel includes the following general steps:

1. Растворение HA1. Dissolution of HA

2. Добавление BDDE2. Adding BDDE

3. Реакция поперечного сшивания при повышенной температуре3. Cross-linking reaction at elevated temperature

4. Нейтрализация4. Neutralization

5. Наполнение диализных пробирок5. Filling dialysis tubes

6. Диализ против буфера (например, PBS)6. Dialysis against buffer (eg PBS)

7. Регулирование концентрации геля и добавление добавок (например, смазывающей фазы, лидокаина и т.д.)7. Adjusting the gel concentration and adding additives (for example, lubricating phase, lidocaine, etc.)

8. Просеивание и дегазирование8. Sifting and degassing

9. Наполнение шприца9. Filling the syringe

10. Стерилизация, 10. Sterilization,

способ согласно настоящему изобретению включает лишь следующие общие стадии:The method according to the present invention involves only the following general steps:

1. Растворение обоих компонентов в буфере1. Dissolving both components in buffer

2. Добавление смазывающей фазы, при ее использовании2. Adding a lubricating phase, if used

3. Ожидание (реакция поперечного сшивания протекает уже при комнатной температуре)3. Waiting (the cross-linking reaction already occurs at room temperature)

4. Просеивание и дегазирование4. Sifting and degassing

5. Наполнение шприца5. Filling the syringe

6. Стерилизация.6. Sterilization.

Таким образом, способ согласно настоящему изобретению включает существенно меньшее количество технологических стадий, в результате способ согласно настоящему изобретению существенно проще, быстрее и, следовательно, дешевле. Кроме того, поскольку в способе согласно настоящему изобретению может быть исключена диализная очистка, которая относительно подвержена ошибкам, то способ согласно настоящему изобретению характеризуется существенно меньшим риском контаминации. Кроме того, поскольку в способе согласно настоящему изобретению не требуется вредный BDDE, то способ согласно настоящему изобретению несет меньше риска для здоровья и окружающей среды.Thus, the method according to the present invention includes a significantly smaller number of technological steps, as a result, the method according to the present invention is significantly simpler, faster and, therefore, cheaper. In addition, since the method of the present invention can eliminate dialysis purification, which is relatively error-prone, the method of the present invention has a substantially lower risk of contamination. In addition, since the method of the present invention does not require harmful BDDE, the method of the present invention poses less risk to health and the environment.

[135] Обнаружено, что свойства, в частности, реологические свойства геля можно точно регулировать посредством степени модификации модифицированного производного гиалуроновой кислоты (а также второго полисахаридного производного). Кроме того, свойства, в частности, реологические свойства геля можно точно регулировать посредством изменения концентрации полимера в буфере. В целом, высокая концентрация полимера приводит к получению поперечно-сшитого гидрогеля с высоким динамическим модулем упругости (G’). Предпочтительно, концентрация модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению в буфере составляет от 1 г/л до 40 г/л, более предпочтительно от 2 г/л до 30 г/л, еще более предпочтительно от 5 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 10 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 12 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 15 г/л до 25 г/л. Предпочтительно, концентрация второго полисахаридного производного в буфере составляет от 1 г/л до 40 г/л, более предпочтительно от 2 г/л до 30 г/л, еще более предпочтительно от 5 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 10 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 12 г/л до 25 г/л, еще более предпочтительно от 15 г/л до 25 г/л.[135] It has been found that the properties, in particular the rheological properties of the gel, can be precisely controlled by the degree of modification of the modified hyaluronic acid derivative (as well as the second polysaccharide derivative). In addition, the properties, in particular the rheological properties of the gel, can be precisely controlled by changing the concentration of the polymer in the buffer. In general, high polymer concentration results in a cross-linked hydrogel with a high dynamic elastic modulus (G'). Preferably, the concentration of the modified hyaluronic acid derivative according to the present invention in the buffer is from 1 g/L to 40 g/L, more preferably from 2 g/L to 30 g/L, even more preferably from 5 g/L to 25 g/L , even more preferably from 10 g/L to 25 g/L, even more preferably from 12 g/L to 25 g/L, even more preferably from 15 g/L to 25 g/L. Preferably, the concentration of the second polysaccharide derivative in the buffer is from 1 g/L to 40 g/L, more preferably from 2 g/L to 30 g/L, even more preferably from 5 g/L to 25 g/L, even more preferably from 10 g/L to 25 g/L, even more preferably from 12 g/L to 25 g/L, even more preferably from 15 g/L to 25 g/L.

[136] Предпочтительно, поперечное сшивание на стадии c) осуществляют в течение от 1 часа до 24 часов, более предпочтительно от 2 часов до 20 часов, еще более предпочтительно от 2 часов до 18 часов, еще более предпочтительно от 2 часов до 16 часов, еще более предпочтительно от 3 часов до 16 часов, еще более предпочтительно от 4 часов до 15 часов, еще более предпочтительно от 4 часов до 14 часов, еще более предпочтительно от 5 часов до 12 часов, еще более предпочтительно 6 часов до 10 часов, еще более предпочтительно от 7 часов до 9 часов, еще более предпочтительно примерно 8 часов.[136] Preferably, the cross-linking in step c) is carried out for 1 hour to 24 hours, more preferably 2 hours to 20 hours, even more preferably 2 hours to 18 hours, even more preferably 2 hours to 16 hours, even more preferably from 3 hours to 16 hours, even more preferably from 4 hours to 15 hours, even more preferably from 4 hours to 14 hours, even more preferably from 5 hours to 12 hours, even more preferably 6 hours to 10 hours, still more preferably from 7 hours to 9 hours, even more preferably about 8 hours.

[137] Предпочтительно, поперечное сшивание на стадии c) осуществляют при температуре от 20°С до 35°С, более предпочтительно от 20°С до 30°С, еще более предпочтительно от 20°С до 25°С.[137] Preferably, the cross-linking in step c) is carried out at a temperature of from 20°C to 35°C, more preferably from 20°C to 30°C, even more preferably from 20°C to 25°C.

[138] В соответствии с предпочтительным вариантом реализации, на стадии b) добавляют несшитый полисахарид. В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации, несшитый полисахарид добавляют на стадии d). В соответствии с другим предпочтительным вариантом реализации, несшитый полисахарид добавляют на стадиях b) и d). Предпочтительно, несшитый полисахарид добавляют на стадии b) и/или d), так что он присутствует в конечной концентрации от 1% мас. до 30% мас. относительно общего количества полисахарида, более предпочтительно от 5% мас. до 20% мас., еще более предпочтительно от 7% мас. до 15% мас., еще более предпочтительно от 8% мас. до 12% мас., еще более предпочтительно от 9% мас. до 11% мас., еще более предпочтительно примерно 10% мас.[138] In a preferred embodiment, in step b) the non-crosslinked polysaccharide is added. According to another preferred embodiment, the non-crosslinked polysaccharide is added in step d). According to another preferred embodiment, the non-crosslinked polysaccharide is added in steps b) and d). Preferably, the non-crosslinked polysaccharide is added in step b) and/or d), so that it is present in a final concentration of 1% wt. up to 30% wt. relative to the total amount of polysaccharide, more preferably from 5% wt. up to 20% wt., even more preferably from 7% wt. up to 15% wt., even more preferably from 8% wt. up to 12% wt., even more preferably from 9% wt. up to 11% wt., even more preferably about 10% wt.

[139] В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к набору для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля, содержащему (i) первый контейнер, содержащий первый раствор предшественника, описанный выше, и (ii) второй контейнер, содержащий второй раствор предшественника, описанный выше.[139] In an eleventh aspect, the present invention provides a kit for in situ production of a cross-linked hydrogel, comprising (i) a first container containing a first precursor solution described above, and (ii) a second container containing a second precursor solution described above.

[140] Следует понимать, что к данному аспекту также относятся различные варианты реализации первого и второго растворов предшественников, описанные выше. Они включают, например, предпочтительное присутствие первого и второго растворов предшественников в различных камерах многокамерного шприца, предпочтительно двухкамерного шприца. Система многокамерного шприца, содержащая первый и второй растворы предшественников в различных камерах, также может быть упомянута как «система доставки».[140] It should be understood that this aspect also includes the various embodiments of the first and second precursor solutions described above. These include, for example, the preferred presence of the first and second precursor solutions in different chambers of a multi-chamber syringe, preferably a dual-chamber syringe. A multi-chamber syringe system containing first and second precursor solutions in different chambers may also be referred to as a "delivery system".

[141] Предложенный набор может дополнительно содержать инструкции по применению.[141] The proposed kit may additionally contain instructions for use.

[142] Термин «контейнер» не имеет специального ограничения и включает, например, стеклянные или пластиковые бутылки, флаконы, карпулы или любой другой герметичный контейнер.[142] The term “container” is not particularly limited and includes, for example, glass or plastic bottles, vials, carpules or any other sealed container.

[143] «Инструкции по применению» предпочтительно представляют собой инструкции по применению в эстетических или терапевтических целях, в частности, для замены или заполнения биологической ткани, или увеличения объема биологической ткани с эстетической или терапевтической целью, как описано в данном документе, или, особенно предпочтительно, инструкции по применению в качестве кожного филлера для эстетического применения.[143] "Instructions for use" are preferably instructions for use for aesthetic or therapeutic purposes, in particular for replacing or filling biological tissue, or augmenting biological tissue for aesthetic or therapeutic purposes, as described herein, or, especially preferably instructions for use as a dermal filler for aesthetic use.

[144] Далее настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.[144] The present invention is further illustrated by the following non-limiting examples.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[145] Химические реагенты[145] Chemical reagents

Химические реагенты, использованные в контексте настоящего изобретения, приобретали у следующих поставщиков и использовали без дополнительной очистки:The chemicals used in the context of the present invention were purchased from the following suppliers and used without further purification:

МатериалMaterial ПоставщикProvider Модифицированная глицерином HA (Mw =1,4 МДа, MoD = 10-20%)Glycerol modified HA (Mw = 1.4 MDa, MoD = 10-20%) HTL BiotechnologyHTL Biotechnology HAH.A. HTL BiotechnologyHTL Biotechnology Модифицированная гидразидом HAHydrazide modified HA Merz Pharmaceuticals GmbH
Синтезирована способом D’Este et al.,Merz Pharmaceuticals GmbH
Synthesized by the method of D'Este et al. Carbohydr. Polym. 2014, 108:239-246Carbohydr. Polym. 2014, 108:239-246 Периодат натрияSodium periodate MerckMerck ЭтиленгликольEthylene glycol Sigma AldrichSigma Aldrich NaClNaCl MerckMerck Этанол (денатурированный 1% метилэтилкетоном)Ethanol (denatured with 1% methyl ethyl ketone) VWRVWR Очищенная водаPurified water Merz GmbH & Co. KGaAMerz GmbH & Co. KGaA Гидразид тирозинаTyrosine hydrazide Sigma AldrichSigma Aldrich

[146] Оборудование[146] Equipment

В контексте настоящего изобретения использовали следующее лабораторное оборудование:In the context of the present invention, the following laboratory equipment was used:

ОборудованиеEquipment ОписаниеDescription Система очищенной водыPurified water system ELIX 20ELIX 20 Различное лабораторное оборудованиеVarious laboratory equipment Весы, мензурки, мешалки, пипеткиScales, beakers, stirrers, pipettes Вакуумная печьVacuum oven Memmert VO400Memmert VO400 РеометрRheometer Реометр Anton Paar Physica MCR 302 Rheometer Anton Paar Physica MCR 302 АвтоклавAutoclave Systec HX 150Systec HX 150

[147] Общий способ синтеза производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, согласно настоящему изобретению[147] General method for synthesizing an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative according to the present invention

Модифицированную глицерином HA (в форме порошка или волокон) взвешивании, добавляли необходимое количество растворителя (очищенной воды или буфера) и перемешивали смесь с получением однородного раствора полимера. Затем добавляли окислительный агент (периодат натрия) и энергично перемешивали раствор в течение требуемого времени. Для остановки реакции добавляли гаситель (например, вицинальный диол (1,2-диол), предпочтительно этиленгликоль), затем добавляли NaCl. Осуществляли очистку, выливая реакционную смесь в органический растворитель (например, этанол или изопропанол). Собирали осадок и снова растворяли в солевом растворе, затем проводили повторное осаждение в органическом растворителе (например, этаноле). Продукт собирали, промывали органическим растворителем (например, этанолом) и сушили под вакуумом в течение некоторого времени (например, в течение ночи).Glycerol-modified HA (in powder or fiber form) was weighed, the required amount of solvent (purified water or buffer) was added and the mixture was mixed to obtain a homogeneous polymer solution. The oxidizing agent (sodium periodate) was then added and the solution was vigorously stirred for the required time. A quencher (eg vicinal diol (1,2-diol), preferably ethylene glycol) was added to stop the reaction, then NaCl was added. Purification was carried out by pouring the reaction mixture into an organic solvent (eg ethanol or isopropanol). The precipitate was collected and redissolved in saline, followed by reprecipitation in an organic solvent (eg ethanol). The product was collected, washed with an organic solvent (eg ethanol) and dried under vacuum for some time (eg overnight).

Определение характеристикDefinition of characteristics

[148] 1. Молекулярная масса[148] 1. Molecular weight

Молекулярную массу материала определяли с помощью эксклюзионной хроматографии в сочетании с многоугловым рассеянием света, рефрактометрического детектора и вискозиметра. Образец получали посредством растворения 2 мг высушенной модифицированной HA в 10 мл буфера PBS в течение 4 часов при 25°С и получением концентрации 0,2 мг/мл. Затем раствор образца фильтровали через 0,45 мкм фильтр в пробирку объемом 1,8 мл для хроматографии. Затем 50 мкл полученного раствора вводили в систему (элюент буфер PBS, скорость потока 0,7 мл/мин, температура колонки 35 °С). Иллюстративная хроматограмма представлена на фиг. 1.The molecular weight of the material was determined using size exclusion chromatography combined with multi-angle light scattering, a refractometric detector and a viscometer. The sample was prepared by dissolving 2 mg of dried modified HA in 10 ml of PBS buffer for 4 hours at 25°C to obtain a concentration of 0.2 mg/ml. The sample solution was then filtered through a 0.45 μm filter into a 1.8 mL chromatography tube. Then 50 μl of the resulting solution was introduced into the system (eluent buffer PBS, flow rate 0.7 ml/min, column temperature 35 °C). An exemplary chromatogram is shown in FIG. 1 .

[149] 2. Степень модификации[149] 2. Degree of modification

Степень модификации альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты согласно настоящему изобретению измеряли с помощью ¹H ЯМР. А именно, полученное альдегид-модифицированное производное гиалуроновой кислоты сначала метили гидразидом тирозина: 66 мг альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты растворяли в 15 мл воды, затем добавляли 88 мг гидразида тирозина. Реакцию проводили в течение 20 часов и затем добавляли 150 мг NaCl. Реакционную смесь осаждали в 75 мл этанола. Осадок собирали и растворяли в солевом растворе (150 мг NaCl в 15 мл воды). Снова проводили осаждение в этаноле. Твердое вещество собирали и сушили под вакуумом. Затем меченое производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом, обрабатывали для проведения измерения ¹H ЯМР, расщепляя 20 мг материала с помощью 300 единиц гиалуронидазы при 40°С в течение ночи. Затем определяли MoD, сравнивая площадь пика при около 6,9 м.д. (ароматические протоны гидразида тирозина) с площадью пика при около 2,0 м.д. (протоны -CH₃ в полимерном скелете). Иллюстративный спектр ¹H ЯМР альдегид-модифицированного производного гиалуроновой кислоты с тирозиновой меткой представлен на фиг. 2.The degree of modification of the aldehyde-modified hyaluronic acid derivative according to the present invention was measured using ¹ H NMR. Namely, the resulting aldehyde-modified hyaluronic acid derivative was first labeled with tyrosine hydrazide: 66 mg of the aldehyde-modified hyaluronic acid derivative was dissolved in 15 ml of water, then 88 mg of tyrosine hydrazide was added. The reaction was carried out for 20 hours and then 150 mg of NaCl was added. The reaction mixture was precipitated in 75 ml of ethanol. The precipitate was collected and dissolved in saline solution (150 mg NaCl in 15 ml water). Precipitation was again carried out in ethanol. The solid was collected and dried under vacuum. The labeled aldehyde-modified hyaluronic acid derivative was then processed for ¹ H NMR measurements by digesting 20 mg of the material with 300 units of hyaluronidase at 40° C. overnight. The MoD was then determined by comparing the peak area at about 6.9 ppm. (aromatic protons of tyrosine hydrazide) with a peak area at about 2.0 ppm. (protons -CH ₃ in the polymer skeleton). An exemplary ¹ H NMR spectrum of a tyrosine-labeled aldehyde-modified hyaluronic acid derivative is shown in FIG. 2 .

[150] Пример 1 (вливание концентрации исходного материала (модифицированной глицерином HA) на молекулярную массу и MoD модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты)[150] Example 1 (infusion of starting material concentration (glycerol-modified HA) onto the molecular weight and MoD of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative)

Реакцию проводили в соответствии с общим способом, описанным выше. Время реакции поддерживали постоянным, 10 минут, использовали 0,1 экв. NaIO₄ и проводили реакцию при 22°С. Изменяли концентрацию модифицированной глицерином HA.The reaction was carried out according to the general method described above. The reaction time was kept constant at 10 minutes and 0.1 equiv was used. NaIO ₄ and carried out the reaction at 22°C. The concentration of glycerol-modified HA was varied.

Влияние модифицированной глицерином HA на свойства полученных материалов показано в следующей таблице:The effect of glycerol-modified HA on the properties of the resulting materials is shown in the following table:

ПримерExample c (модифицированной глицерином HA) / г л^-1 c (glycerol modified HA) / g l ^-1 MoD / %MoD/% Mw / МДаMw/MDa 1.11.1 44 2,12.1 1,11.1 1.21.2 1212 4,54.5 0,90.9 1.31.3 2424 5,75.7 0,70.7 1.41.4 3636 6,16.1 0,60.6

[151] Пример 1.1[151] Example 1.1

Брали навеску 1,49 г модифицированной глицерином HA (потери при высушивании (LoD) составили 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,074 г (0,35 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления быстро добавляли 3,9 мл (69 ммоль) этиленгликоля. Затем при перемешивании добавляли 1,75 г NaCl до получения однородной смеси и осаждали раствор в 1,75 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 1,75 г NaCl и растворяли компоненты в 350 мл воды. Однородную смесь выливали в 1,75 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 2,1% (моль/моль) и Mw 1,1 МДа.We weighed 1.49 g of glycerol-modified HA (loss on drying (LoD) was 6.2%), then added 315 g of water and stirred the mixture for 16 hours at 22°C to obtain a homogeneous solution. 0.074 g (0.35 mmol) of sodium periodate dissolved in 35 g of water was then added and the mixture was stirred vigorously for 10 minutes at 22°C. To stop the oxidation, 3.9 ml (69 mmol) of ethylene glycol was quickly added. Then, with stirring, 1.75 g of NaCl was added until a homogeneous mixture was obtained, and the solution was precipitated in 1.75 L of ethanol. The polymer was collected, placed in a clean cup, 1.75 g of NaCl was added and the components were dissolved in 350 ml of water. The homogeneous mixture was poured into 1.75 L of fresh ethanol, the solid was collected and the product was dried under vacuum to obtain a white fibrous material. Material properties: MoD 2.1% (mol/mol) and Mw 1.1 MDa.

[152] Пример 1.4[152] Example 1.4

Брали навеску 13,4 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,663 г (3,1 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления быстро добавляли 34,7 мл (620 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 2800 мл воды и 16 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 16 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 16 г NaCl и растворяли компоненты в 3000 мл воды. Однородную смесь выливали в 16 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 6,1% (моль/моль) и Mw 0,6 МДа.A sample of 13.4 g of glycerol-modified HA (LoD 6.2%) was taken, then 315 g of water was added and the mixture was stirred for 16 hours at 22°C to obtain a homogeneous solution. 0.663 g (3.1 mmol) of sodium periodate dissolved in 35 g of water was then added and the mixture was vigorously stirred for 10 minutes at 22°C. To stop the oxidation, 34.7 ml (620 mmol) of ethylene glycol was quickly added. Then 2800 ml of water and 16 g of NaCl were added, stirred until a homogeneous mixture was obtained, and the solution was precipitated in 16 l of ethanol. The polymer was collected, placed in a clean cup, 16 g of NaCl was added and the components were dissolved in 3000 ml of water. The homogeneous mixture was poured into 16 L of fresh ethanol, the solid was collected and the product was dried under vacuum to obtain a white fibrous material. Material properties: MoD 6.1% (mol/mol) and Mw 0.6 MDa.

[153] Пример 2 (вливание количества окислительного агента (периодата натрия) на молекулярную массу и MoD модифицированного альдегидом производного гиалуроновой кислоты)[153] Example 2 (infusion of an amount of oxidizing agent (sodium periodate) onto the molecular weight and MoD of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative)

Реакцию проводили в соответствии с общим способом, описанным выше. Концентрацию модифицированной глицерином HA в реакционной смеси поддерживали постоянной при 12 г/л, время реакции составляло 10 минут, и реакцию проводили при комнатной температуре. Единственным параметром, который изменяли, было количество периодата натрия. Свойства полученных материалов представлены в следующей таблице (где указано количество эквивалентов NaIO₄ относительно молярной массы дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином):The reaction was carried out according to the general method described above. The concentration of glycerol-modified HA in the reaction mixture was kept constant at 12 g/L, the reaction time was 10 minutes, and the reaction was carried out at room temperature. The only parameter that was changed was the amount of sodium periodate. The properties of the resulting materials are presented in the following table (indicating the number of equivalents of NaIO ₄ relative to the molar mass of disaccharide repeating units of glycerol-modified hyaluronic acid):

ПримерExample экв. NaIO₄ eq. NaIO ₄ MoD / %MoD/% Mw / МДаMw/MDa 2.12.1 0,050.05 2,92.9 1,01.0 2.22.2 0,10.1 4,54.5 0,90.9 2.32.3 0,150.15 5,95.9 0,80.8 2.42.4 0,20.2 6,86.8 0,60.6

[154] Пример 2.1 [154] Example 2.1

Брали навеску 4,48 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,11 г (0,51 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления добавляли 11,6 мл (207 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 700 мл воды и 5,25 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 5 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 5,25 г NaCl и растворяли компоненты в 1000 мл воды. Однородную смесь выливали в 5 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 2,9% (моль/моль) и Mw 1,0 МДа.A sample of 4.48 g of glycerol-modified HA (LoD 6.2%) was taken, then 315 g of water was added and the mixture was stirred for 16 hours at 22°C to obtain a homogeneous solution. 0.11 g (0.51 mmol) of sodium periodate dissolved in 35 g of water was then added and the mixture was vigorously stirred for 10 minutes at 22°C. To stop the oxidation, 11.6 ml (207 mmol) of ethylene glycol was added. Then 700 ml of water and 5.25 g of NaCl were added, stirred until a homogeneous mixture was obtained, and the solution was precipitated in 5 liters of ethanol. The polymer was collected, placed in a clean cup, 5.25 g of NaCl was added and the components were dissolved in 1000 ml of water. The homogeneous mixture was poured into 5 L of fresh ethanol, the solid was collected and the product was dried under vacuum to obtain a white fibrous material. Material properties: MoD 2.9% (mol/mol) and Mw 1.0 MDa.

[155] Пример 2.4[155] Example 2.4

Брали навеску 4,48 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 315 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,44 г (2,1 ммоль) периодата натрия, растворенного в 35 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 10 минут при 22°С. Для прекращения окисления добавляли 11,6 мл (207 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 700 мл воды и 5,25 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 5 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 5,25 г NaCl и растворяли компоненты в 1000 мл воды. Однородную смесь выливали в 5 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 6,8% (моль/моль) и Mw 0,6 МДа.A sample of 4.48 g of glycerol-modified HA (LoD 6.2%) was taken, then 315 g of water was added and the mixture was stirred for 16 hours at 22°C to obtain a homogeneous solution. 0.44 g (2.1 mmol) of sodium periodate dissolved in 35 g of water was then added and the mixture was vigorously stirred for 10 minutes at 22°C. To stop the oxidation, 11.6 ml (207 mmol) of ethylene glycol was added. Then 700 ml of water and 5.25 g of NaCl were added, stirred until a homogeneous mixture was obtained, and the solution was precipitated in 5 liters of ethanol. The polymer was collected, placed in a clean cup, 5.25 g of NaCl was added and the components were dissolved in 1000 ml of water. The homogeneous mixture was poured into 5 L of fresh ethanol, the solid was collected and the product was dried under vacuum to obtain a white fibrous material. Material properties: MoD 6.8% (mol/mol) and Mw 0.6 MDa.

[156] Пример 3 (влияние времени реакции на молекулярную массу и MoD производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом)[156] Example 3 (Effect of reaction time on molecular weight and MoD of aldehyde-modified hyaluronic acid derivative)

Реакцию проводили в соответствии с общим способом, описанным выше. Концентрацию HA, модифицированной глицерином, в реакционной смеси поддерживали постоянной при 12 г/л, использовали 0,1 экв. NaIO₄ и проводили реакцию при 22°С. Единственным параметром, который изменяли, было время реакции. Свойства полученных материалов представлены в следующей таблице:The reaction was carried out according to the general method described above. The concentration of glycerol-modified HA in the reaction mixture was kept constant at 12 g/L, 0.1 equiv was used. NaIO ₄ and carried out the reaction at 22°C. The only parameter that was changed was reaction time. The properties of the resulting materials are presented in the following table:

ПримерExample Время реакции / мин.Reaction time / min. MoD / %MoD/% Mw / МДаMw/MDa 3.13.1 1010 4,54.5 0,90.9 3.23.2 1515 5,75.7 0,70.7 3.33.3 2020 5,95.9 0,80.8 3.43.4 6060 6,16.1 0,70.7

[157] Пример 3.4[157] Example 3.4

Брали навеску 4,93 г модифицированной глицерином HA (LoD 6,2%), затем добавляли 345 г воды и перемешивали смесь в течение 16 часов при 22°С с получением однородного раствора. Затем добавляли 0,22 г (1,0 ммоль) периодата натрия, растворенного в 39 г воды, и энергично перемешивали смесь в течение 60 минут при 22°С. Для прекращения окисления добавляли 12,7 мл (227 ммоль) этиленгликоля. Затем добавляли 770 мл воды и 6 г NaCl, перемешивали до получения однородной смеси и осаждали раствор в 6 л этанола. Собирали полимер, помещали в чистую чашку, добавляли 6 г NaCl и растворяли компоненты в 1100 мл воды. Однородную смесь выливали в 6 л свежего этанола, собирали твердое вещество и сушили продукт под вакуумом с получением белого волокнистого материала. Свойства материала: MoD 6,1% (моль/моль) и Mw 0,7 МДа.A sample of 4.93 g of glycerol-modified HA (LoD 6.2%) was taken, then 345 g of water was added and the mixture was stirred for 16 hours at 22°C to obtain a homogeneous solution. 0.22 g (1.0 mmol) of sodium periodate dissolved in 39 g of water was then added and the mixture was stirred vigorously for 60 minutes at 22°C. To stop the oxidation, 12.7 ml (227 mmol) of ethylene glycol was added. Then 770 ml of water and 6 g of NaCl were added, stirred until a homogeneous mixture was obtained, and the solution was precipitated in 6 l of ethanol. The polymer was collected, placed in a clean cup, 6 g of NaCl was added and the components were dissolved in 1100 ml of water. The homogeneous mixture was poured into 6 L of fresh ethanol, the solid was collected and the product was dried under vacuum to obtain a white fibrous material. Material properties: MoD 6.1% (mol/mol) and Mw 0.7 MDa.

[158] Пример 4: Применение производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, для получения [158] Example 4: Use of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative to produce in situin situ гидрогелей hydrogels

Гиалуроновую кислоту, содержащую альдегидные группы, можно использовать для получения in situ гидрогелей, способных к поперечному сшиванию. А именно, натриевая соль гиалуроновой кислоты, содержащая альдегидную группу (электрофильную группу), может ковалентно взаимодействовать с полисахаридом, содержащим нуклеофильную группу (например, гидразидную группу), с образованием in situ поперечно-сшитого геля. В зависимости от степени модификации и от молекулярной массы производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, могут быть получены гели с различными реологическими свойствами.Hyaluronic acid containing aldehyde groups can be used to prepare in situ hydrogels capable of cross-linking. Namely, the sodium salt of hyaluronic acid containing an aldehyde group (electrophilic group) can covalently react with a polysaccharide containing a nucleophilic group (eg, a hydrazide group) to form a cross-linked gel in situ . Depending on the degree of modification and the molecular weight of the aldehyde-modified hyaluronic acid derivative, gels with different rheological properties can be obtained.

Для проверки характеристик гелеобразования полученного производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, материал растворяли в воде или буфере, наполняли им стеклянные шприцы и стерилизовали. Таким же образом, натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом, также растворяли в воде или буфере, наполняли шприцы и стерилизовали. Затем смешивали содержимое двух растворов и оставляли полимеры для поперечного сшивания (химического взаимодействия) друг с другом. А именно, гидразидная группа одного полимера вступала во взаимодействие с альдегидной группой другого материала, и в результате образования гидразонной связи (см. приведенную ниже схему) получали гель. Описывали характеристики полученных гелей, измеряя их реологические свойства через 24 часа после смешивания. Динамический модуль упругости (G') измеряли при 25°С, используя реометр, оснащенный системой с геометрией типа «конус-плита» (диаметр 50 мм, угол 0,1°, CP50-1, размер зазора 0,1 мм). Образцы подвергали осцилляции при напряжении 1 Па, используя частотное сканирование от 0,1 до 10 Гц, при этом указанные значения получены при 1 Гц.To test the gelation characteristics of the resulting aldehyde-modified hyaluronic acid derivative, the material was dissolved in water or buffer, filled into glass syringes and sterilized. In the same way, the sodium salt of hydrazide-modified hyaluronic acid was also dissolved in water or buffer, filled into syringes and sterilized. The contents of the two solutions were then mixed and the polymers were left to cross-link (chemically react) with each other. Namely, the hydrazide group of one polymer reacted with the aldehyde group of another material, and as a result of the formation of a hydrazone bond (see the diagram below), a gel was obtained. The characteristics of the resulting gels were described by measuring their rheological properties 24 hours after mixing. The dynamic modulus of elasticity (G') was measured at 25°C using a rheometer equipped with a cone-plate geometry system (50 mm diameter, 0.1° angle, CP50-1, 0.1 mm gap size). The samples were oscillated at 1 Pa using a frequency scan from 0.1 to 10 Hz, with the reported values obtained at 1 Hz.

Пример 4.1: Example 4.1 :

Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом (материал из примера 1.1: MoD = 2,1%, Mw = 1,1 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом (MoD = 2,1%, Mw = 1,3 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (буфер содержал 0,6% мас. лидокаина и имел рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин). Затем в пустом стеклянном шприце взвешивали 0,6 г раствора производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, после чего добавляли 0,6 г раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом. Шприц закрывали ограничителем хода поршня, соединяли с пустым шприцем через люэровский наконечник и выдавливали содержимое из одного шприца в другой 40 раз. Затем содержимое шприца закрывали и ожидали завершение поперечного сшивания при 22°С в течение 24 часов. Затем измеряли реологические свойства геля. Значение динамического модуля упругости геля достигло 68 Па.An aldehyde-modified hyaluronic acid derivative (material from Example 1.1: MoD = 2.1%, Mw = 1.1 MDa) was dissolved in 3 mM phosphate buffer (pH 7), filled into a glass syringe and steam sterilized (127°C, 6 ,5 minutes.). Sodium salt of hydrazide-modified hyaluronic acid (MoD = 2.1%, Mw = 1.3 MDa) was dissolved in 3 mM phosphate buffer (buffer containing 0.6 wt% lidocaine and pH 7), filled into a glass syringe and sterilized steam (127°C, 6.5 min). Then, 0.6 g of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative solution was weighed into an empty glass syringe, after which 0.6 g of a hydrazide-modified hyaluronic acid sodium salt solution was added. The syringe was closed with a piston stroke limiter, connected to an empty syringe through a luer lock, and the contents were squeezed out from one syringe to another 40 times. The contents of the syringe were then capped and cross-linking was allowed to complete at 22°C for 24 hours. The rheological properties of the gel were then measured. The value of the dynamic modulus of elasticity of the gel reached 68 Pa.

Пример 4.2: Example 4.2 :

Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом (материал из примера 2,1: MoD = 2,9%, Mw = 1,0 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом (MoD = 2,1%, Mw = 1,3 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (буфер содержал 0,6% мас. лидокаина и имел рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Затем в пустом стеклянном шприце взвешивали 0,6 г раствора производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, после чего добавляли 0,6 г раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом. Шприц закрывали ограничителем хода поршня, соединяли с пустым шприцем через люэровский наконечник и выдавливали содержимое из одного шприца в другой 40 раз. Затем содержимое шприца закрывали и ожидали завершение поперечного сшивания при 22°С в течение 24 часов. Затем измеряли реологические свойства геля. Значение динамического модуля упругости геля достигло 164 Па.The aldehyde modified hyaluronic acid derivative (material from Example 2.1: MoD = 2.9%, Mw = 1.0 MDa) was dissolved in 3 mM phosphate buffer (pH 7), filled into a glass syringe and steam sterilized (127°C , 6.5 min.). Sodium salt of hydrazide-modified hyaluronic acid (MoD = 2.1%, Mw = 1.3 MDa) was dissolved in 3 mM phosphate buffer (buffer containing 0.6% wt. lidocaine and pH 7), filled into a glass syringe and sterilized steam (127°C, 6.5 min.). Then, 0.6 g of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative solution was weighed into an empty glass syringe, after which 0.6 g of a hydrazide-modified hyaluronic acid sodium salt solution was added. The syringe was closed with a piston stroke limiter, connected to an empty syringe through a luer lock, and the contents were squeezed out from one syringe to another 40 times. The contents of the syringe were then capped and cross-linking was allowed to complete at 22°C for 24 hours. The rheological properties of the gel were then measured. The value of the dynamic modulus of elasticity of the gel reached 164 Pa.

Пример 4.3: Example 4.3 :

Производное гиалуроновой кислоты, модифицированное альдегидом (материал из примера 2,4: MoD = 6,8%, Mw = 0,6 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Натриевую соль гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом (MoD = 2,1%, Mw = 1,3 МДа), растворяли в 3 мМ фосфатном буфере (буфер содержал 0,6% мас. лидокаина и имел рН 7), наполняли стеклянный шприц и стерилизовали паром (127°C, 6,5 мин.). Затем в пустом стеклянном шприце взвешивали 0,6 г раствора производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом, после чего добавляли 0,6 г раствора натриевой соли гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом. Шприц закрывали ограничителем хода поршня, соединяли с пустым шприцем через люэровский наконечник и выдавливали содержимое из одного шприца в другой 40 раз. Затем содержимое шприца закрывали и ожидали завершение поперечного сшивания при 22 °С в течение 24 часов. Затем измеряли реологические свойства геля. Значение динамического модуля упругости геля достигло 277 Па.The aldehyde modified hyaluronic acid derivative (material from Example 2.4: MoD = 6.8%, Mw = 0.6 MDa) was dissolved in 3 mM phosphate buffer (pH 7), filled into a glass syringe and steam sterilized (127°C , 6.5 min.). Sodium salt of hydrazide-modified hyaluronic acid (MoD = 2.1%, Mw = 1.3 MDa) was dissolved in 3 mM phosphate buffer (buffer containing 0.6% wt. lidocaine and pH 7), filled into a glass syringe and sterilized steam (127°C, 6.5 min.). Then, 0.6 g of an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative solution was weighed into an empty glass syringe, after which 0.6 g of a hydrazide-modified hyaluronic acid sodium salt solution was added. The syringe was closed with a piston stroke limiter, connected to an empty syringe through a luer lock, and the contents were squeezed out from one syringe to another 40 times. The contents of the syringe were then capped and cross-linking was allowed to complete at 22°C for 24 hours. The rheological properties of the gel were then measured. The value of the dynamic modulus of elasticity of the gel reached 277 Pa.

[159] Пример 5 (важность применения HA, модифицированной глицерином, в реакции окисления)[159] Example 5 (importance of using glycerol-modified HA in the oxidation reaction)

Известно, что альдегидные группы могут быть внедрены в структуру углеводов посредством окисления периодатом натрия. Однако необходимое время реакции для такого синтеза является продолжительным, и реакция приводит к существенному уменьшению молекулярной массы полимера вследствие окисления полимерного скелета. Во избежание этого можно использовать для окисления HA, модифицированную глицерином, поскольку боковые глицериновые звенья более доступны для окисления, чем гидроксильные группы скелета HA. Для подтверждения этого проводили окисление нативной HA и HA, модифицированной глицерином, в одинаковых условиях и проверяли их свойства. Условия реакции: концентрация полимера: 12 г/л; температура реакции: 22°С и 0,1 экв. периодата натрия (относительно количества повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты). Характеристики гелеобразования окисленной нативной HA и окисленной HA, модифицированной глицерином, представлены в следующей таблице:It is known that aldehyde groups can be introduced into the structure of carbohydrates through oxidation with sodium periodate. However, the required reaction time for such a synthesis is long, and the reaction results in a significant decrease in the molecular weight of the polymer due to oxidation of the polymer backbone. To avoid this, glycerol-modified HA can be used for oxidation, since the glycerol side units are more accessible to oxidation than the hydroxyl groups of the HA skeleton. To confirm this, native HA and glycerol-modified HA were oxidized under the same conditions and their properties were checked. Reaction conditions: polymer concentration: 12 g/l; reaction temperature: 22°C and 0.1 eq. sodium periodate (relative to the number of repeating units of hyaluronic acid). The gelation characteristics of oxidized native HA and oxidized HA modified with glycerol are presented in the following table:

HAH.A. Время реакции / мин.Reaction time / min. G’ / ПаG' / Pa модифицированная глицерином HAglycerol modified HA 1010 138,0138.0 нативная HAnative HA 1010 0,30.3 модифицированная глицерином HAglycerol modified HA 6060 304,1304.1 нативная HAnative HA 6060 0,20.2

Полученные результаты демонстрируют, что в мягких условиях, использованных для окисления модифицированной глицерином HA, нативная HA не может обеспечивать получение материала, способного образовывать гель при его смешивании с раствором гиалуроновой кислоты, модифицированной гидразидом.The results obtained demonstrate that, under the mild conditions used to oxidize glycerol-modified HA, native HA cannot produce a material capable of forming a gel when mixed with a hydrazide-modified hyaluronic acid solution.

[160] Пример 6 (получение предварительно образованных гидрогелей)[160] Example 6 (preparation of preformed hydrogels)

Получали два геля с различными концентрациями [10 мг/мл (пример 6,1); 20 мг/мл (пример 6.2)].Two gels with different concentrations were obtained [10 mg/ml (example 6.1); 20 mg/ml (example 6.2)].

Пример 6.1Example 6.1

2,5 г модифицированной гидразидом HA (средняя молекулярная масса 1,5 МДа и степень модификации 2,1%) и 2,5 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; средняя молекулярная масса 1,1 МДа и степень модификации 4,3%) взвешивали в чашке Kenwood, затем добавляли 450 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7, с содержанием 2% мас. маннита и 0,3% мас. лидокаина). Смесь перемешивали в течение 8 часов, затем добавляли 50 мл раствора, содержащего несшитую HA в концентрации 10 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, и затем наполняли полученным продуктом шприцы и стерилизовали при 127°С в течение 6,5 минут. Описывали характеристики геля, измеряя реологические свойства (до и после стерилизации), усилие выдавливания (после стерилизации), рН и осмоляльность. Полученные данные представлены в следующей таблице:2.5 g hydrazide modified HA (average molecular weight 1.5 MDa and degree of modification 2.1%) and 2.5 g aldehyde modified HA (prepared in accordance with the present invention; average molecular weight 1.1 MDa and degree of modification 4 .3%) were weighed in a Kenwood dish, then 450 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7, containing 2% wt. mannitol and 0.3% wt. lidocaine) was added. The mixture was stirred for 8 hours, then 50 ml of a solution containing non-crosslinked HA at a concentration of 10 mg/ml in 10 mm phosphate buffer was added, and then the resulting product was filled into syringes and sterilized at 127°C for 6.5 minutes. The characteristics of the gel were characterized by measuring rheological properties (before and after sterilization), extrusion force (after sterilization), pH and osmolality. The data obtained is presented in the following table:

ПродуктProduct Концентрация полимера / мг⋅мл^-1 Polymer concentration / mg⋅ml ^-1 G’ до стерилизации / ПаG’ before sterilization / Pa G’ после стерилизации / ПаG’ after sterilization / Pa Усилие выдавливания / Н (игла 30G TSK)Extrusion force/N (30G TSK needle) pHpH Осмоляльность / мОсм⋅кг^-1 Osmolality/mOsm⋅kg ^-1 Гель, полученный в примере 6.1Gel obtained in example 6.1 1010 152152 2424 28,428.4 6,866.86 341341

Пример 6.2Example 6.2

5,0 г модифицированной гидразидом HA (средняя молекулярная масса 1,5 МДа и степень модификации 2,1%) и 5,0 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; средняя молекулярная масса 1,1 МДа и степень модификации 4,3%) взвешивали в чашке Kenwood, затем добавляли 450 мл 10 мМ фосфатного буфера (рН 7, с содержанием 2% мас. маннита и 0,3% мас. лидокаина). Смесь перемешивали в течение 8 часов, затем добавляли 50 мл раствора, содержащего несшитую HA в концентрации 20 мг/мл в 10 мМ фосфатном буфере, и затем наполняли полученным продуктом шприцы и стерилизовали при 127 °С в течение 6,5 минут. Описывали характеристики геля, измеряя реологические свойства (до и после стерилизации), усилие выдавливания (после стерилизации), рН и осмоляльность. Полученные данные представлены в следующей таблице:5.0 g hydrazide modified HA (average molecular weight 1.5 MDa and degree of modification 2.1%) and 5.0 g aldehyde modified HA (prepared in accordance with the present invention; average molecular weight 1.1 MDa and degree of modification 4 .3%) were weighed in a Kenwood dish, then 450 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7, containing 2% wt. mannitol and 0.3% wt. lidocaine) was added. The mixture was stirred for 8 hours, then 50 ml of a solution containing non-crosslinked HA at a concentration of 20 mg/ml in 10 mM phosphate buffer was added, and then the resulting product was filled into syringes and sterilized at 127 °C for 6.5 minutes. The characteristics of the gel were characterized by measuring rheological properties (before and after sterilization), extrusion force (after sterilization), pH and osmolality. The data obtained is presented in the following table:

ПродуктProduct Концентрация полимера / мг⋅мл^-1 Polymer concentration / mg⋅ml ^-1 G’ до стерилизации / ПаG’ before sterilization / Pa G’ после стерилизации / ПаG’ after sterilization / Pa Усилие выдавливания / Н (игла 27G TSK)Extrusion force/N (27G TSK needle) pHpH Осмоляльность / мОсм⋅кг^-1 Osmolality/mOsm⋅kg ^-1 Гель, полученный в примере 6.2Gel obtained in example 6.2 2020 823823 243243 23,423.4 6,776.77 371371

Как показано в примерах 6.1 и 6.2, свойства полученного гидрогеля можно точно регулировать, просто изменяя концентрацию полимера.As shown in Examples 6.1 and 6.2, the properties of the resulting hydrogel can be precisely controlled simply by changing the polymer concentration.

[161] Пример 7 (теплостойкость гелей, полученных способом согласно настоящему изобретению)[161] Example 7 (heat resistance of gels obtained by the method according to the present invention)

Для испытания теплостойкости предварительно образованных гелей, полученных способом согласно настоящему изобретению, получали два состава и помещали в печь при 40°С. Реологические свойства геля определяли в разные моменты времени (0, 3, 6, 9 и 12 недель).To test the heat resistance of the preformed gels obtained by the method according to the present invention, two formulations were prepared and placed in an oven at 40°C. The rheological properties of the gel were determined at different time points (0, 3, 6, 9 and 12 weeks).

Гель 1:Gel 1:

0,45 г модифицированной гидразидом HA (молекулярная масса 1,8 МДа и степень модификации 3,7%) растворяли в шприце в солевом растворе, содержащем 0,6% мас. лидокаина. Во втором шприце растворяли 0,45 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; молекулярная масса 1,2 МДа и степень модификации 3,7%) в 30 мл 25 мМ буфера PBS (который содержал 1,25 г маннита).0.45 g of hydrazide-modified HA (molecular weight 1.8 MDa and degree of modification 3.7%) was dissolved in a syringe in a saline solution containing 0.6% wt. lidocaine. In a second syringe, 0.45 g of aldehyde-modified HA (prepared in accordance with the present invention; molecular weight 1.2 MDa and degree of modification 3.7%) was dissolved in 30 ml of 25 mM PBS buffer (which contained 1.25 g of mannitol).

Шприцы, содержащие раствор HA-гидразида и раствор HA-альдегида, соединяли с помощью люэровского наконечника и энергично перемешивали их содержимое. Затем полученной однородной смесью наполняли стеклянные шприцы BD и стерилизовали при 127°С в течение 6,5 мин. Шприцы с гелем помещали в печь при 40 °С.Syringes containing HA-hydrazide solution and HA-aldehyde solution were connected using a luer lock and their contents were vigorously mixed. The resulting homogeneous mixture was then filled into BD glass syringes and sterilized at 127°C for 6.5 minutes. Syringes with gel were placed in an oven at 40 °C.

Гель 2:Gel 2:

0,45 г модифицированной гидразидом HA (молекулярная масса 1,8 МДа и степень модификации 3,7%) растворяли в шприце в солевом растворе, содержащем 0,6% мас. лидокаина. Во втором шприце растворяли 0,45 г модифицированной альдегидом HA (полученной в соответствии с настоящим изобретением; молекулярная масса 1,2 МДа и степень модификации 3,7%) в 30 мл 3 мМ буфера PBS (без маннита).0.45 g of hydrazide-modified HA (molecular weight 1.8 MDa and degree of modification 3.7%) was dissolved in a syringe in a saline solution containing 0.6% wt. lidocaine. In a second syringe, 0.45 g of aldehyde-modified HA (prepared according to the present invention; molecular weight 1.2 MDa and degree of modification 3.7%) was dissolved in 30 ml of 3 mM PBS buffer (without mannitol).

Шприцы, содержащие раствор HA-гидразида и раствор HA-альдегида, соединяли с помощью люэровского наконечника и энергично перемешивали их содержимое. Затем полученной смесью наполняли стеклянные шприцы и стерилизовали при 127°С в течение 6,5 мин. Шприцы с гелем помещали в печь при 40°С.Syringes containing HA-hydrazide solution and HA-aldehyde solution were connected using a luer lock and their contents were vigorously mixed. The resulting mixture was then filled into glass syringes and sterilized at 127°C for 6.5 minutes. Syringes with gel were placed in an oven at 40°C.

Результаты представлены на фиг. 3 и 4. Показано, что оба геля демонстрируют одинаковую и высокую теплостойкость.The results are presented in Fig. 3 and 4. It was shown that both gels exhibit the same and high heat resistance.

Claims

1. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты, в котором группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до альдегидной группы, имеющей структуру -CH₂-O-CH₂-CHO, причем указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры1. A modified hyaluronic acid derivative, in which the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to an aldehyde group having the structure -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO, wherein said modified hyaluronic acid derivative acid contains at least one disaccharide unit of the following structure

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из водорода, иона щелочного металла и иона щелочноземельного металла.where "Ac" means -C(O)CH ₃ and R is selected from hydrogen, an alkali metal ion and an alkaline earth metal ion.

2. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 1, отличающееся тем, что ион щелочного металла представляет собой Na.2. Modified derivative of hyaluronic acid according to claim 1, characterized in that the alkali metal ion is Na.

3. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 1 или 2, отличающееся тем, что степень модификации составляет от 1,0% до 20,0%, предпочтительно от 1,0% до 15,0%, более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, более предпочтительно от 2,0% до 6,9%, степень модификации определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHO, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты, и/или тем, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, более предпочтительно от 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа.3. Modified hyaluronic acid derivative according to claim 1 or 2, characterized in that the degree of modification is from 1.0% to 20.0%, preferably from 1.0% to 15.0%, more preferably from 1.0% up to 10.0%, more preferably from 1.5% to 10.0%, more preferably from 1.5% to 8.0%, more preferably from 1.8% to 7.0%, more preferably from 2, 0% to 6.9%, the degree of modification is defined as the number of -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO groups divided by the total number of N-acetyl-D-glucosamine units present in the modified hyaluronic acid derivative and/or those that the modified hyaluronic acid derivative has a weight average molecular weight of from 0.1 to 2.5 MDa, preferably from 0.2 to 1.5 MDa, more preferably from 0.4 to 1.3 MDa, even more preferably from 0.6 to 1.1 MDa.

4. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры4. Modified hyaluronic acid derivative according to any one of paragraphs. 1-3, additionally containing at least one disaccharide unit of the following structure

где R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, иона щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.wherein R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ are independently selected from H and -CH ₂ -CHO, and R ⁵ is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, an alkaline earth metal ion and -CH ₂ -CHO, provided that that at least one of R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ is -CH ₂ -CHO, and if R ¹ is -CH ₂ -CHO, then at least one of R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ represents -CH ₂ -CHO.

5. Способ получения модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4, включающий следующие стадии:5. A method for producing a modified hyaluronic acid derivative according to any one of claims. 1-4, including the following stages:

a) обеспечение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты, которая характеризуется тем, что группа -CH₂-OH по меньшей мере одного N-ацетил-D-глюкозаминного звена модифицирована до фрагмента следующей формулы -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH;a) providing glycerol-modified hyaluronic acid, which is characterized in that the -CH ₂ -OH group of at least one N-acetyl-D-glucosamine unit is modified to a moiety of the following formula -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH ;

b) растворение модифицированной глицерином гиалуроновой кислоты в водной среде с получением солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином;b) dissolving glycerol-modified hyaluronic acid in an aqueous medium to obtain solubilized glycerin-modified hyaluronic acid;

c) приведение во взаимодействие указанной солюбилизированной гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином, с окислительным агентом, предпочтительно периодатом, более предпочтительно периодатом натрия, для превращения по меньшей мере части указанных групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH в альдегидные группы, имеющие формулу -CH₂-O-CH₂-CHO, с получением производного гиалуроновой кислоты, модифицированного альдегидом.c) reacting said solubilized glycerol-modified hyaluronic acid with an oxidizing agent, preferably periodate, more preferably sodium periodate, to convert at least a portion of said -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups into aldehyde groups having the formula -CH ₂ -O-CH ₂ -CHO, to obtain an aldehyde-modified hyaluronic acid derivative.

6. Способ по п. 5, дополнительно включающий одну или более следующих стадий:6. The method according to claim 5, further comprising one or more of the following steps:

d) необязательное прекращение реакции на стадии c), предпочтительно посредством добавления вицинального диола (1,2-диола), более предпочтительно этиленгликоля;d) optionally stopping the reaction in step c), preferably by adding a vicinal diol (1,2-diol), more preferably ethylene glycol;

e) необязательная очистка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, предпочтительно посредством осаждения модифицированного производного гиалуроновой кислоты в органическом растворителе, предпочтительно этаноле, изопропаноле или их смеси, повторное растворение осадка в солевом растворе и повторное осаждение модифицированного производного гиалуроновой кислоты в указанном органическом растворителе;e) optionally purifying the modified hyaluronic acid derivative, preferably by precipitating the modified hyaluronic acid derivative in an organic solvent, preferably ethanol, isopropanol or a mixture thereof, redissolving the precipitate in saline and re-precipitating the modified hyaluronic acid derivative in said organic solvent;

f) необязательная сушка модифицированного производного гиалуроновой кислоты, полученного на стадии e).f) optionally drying the modified hyaluronic acid derivative obtained in step e).

7. Способ по п. 5 или 6, отличающийся тем, что модифицированная глицерином гиалуроновая кислота имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 5,0 МДа, предпочтительно от 1,0 до 3,0 МДа, более предпочтительно от 1,0 до 2,0 МДа, еще более предпочтительно от 1,1 до 1,9 МДа, еще более предпочтительно от 1,2 до 1,8 МДа, еще более предпочтительно от 1,3 до 1,7 МДа, еще более предпочтительно от 1,4 до 1,6 МДа и/или степень модификации от 5 до 25%, предпочтительно от 10 до 20%, степень модификации определяют как количество групп -CH₂-O-CH₂-CHOH-CH₂OH, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в гиалуроновой кислоте, модифицированной глицерином, 7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that the glycerol-modified hyaluronic acid has a weight-average molecular weight of from 0.1 to 5.0 MDa, preferably from 1.0 to 3.0 MDa, more preferably from 1.0 to 2.0 MDa, even more preferably from 1.1 to 1.9 MDa, even more preferably from 1.2 to 1.8 MDa, even more preferably from 1.3 to 1.7 MDa, even more preferably from 1. 4 to 1.6 MDa and/or degree of modification from 5 to 25%, preferably from 10 to 20%, the degree of modification is defined as the number of -CH ₂ -O-CH ₂ -CHOH-CH ₂ OH groups divided by the total amount of N -acetyl-D-glucosamine units present in glycerol-modified hyaluronic acid,

и/или тем, чтоand/or the fact that

(i) стадию c) проводят при температуре от 4 до 35°С, предпочтительно от 15 до 35°С, более предпочтительно от 20 до 30°С, еще более предпочтительно от 20 до 25°С, еще более предпочтительно примерно от 21 до 23°С, еще более предпочтительно примерно 22°С; и/или(i) step c) is carried out at a temperature of from 4 to 35°C, preferably from 15 to 35°C, more preferably from 20 to 30°C, even more preferably from 20 to 25°C, even more preferably from about 21 to 23°C, even more preferably about 22°C; and/or

(ii) стадию c) проводят на протяжении от 5 до 120 минут, предпочтительно от 5 до 65 минут, более предпочтительно от 10 до 60 минут, еще более предпочтительно от 10 до 50 минут, еще более предпочтительно от 10 до 40 минут, еще более предпочтительно от 10 до 30 минут, еще более предпочтительно от 10 до 20 минут; и/или(ii) step c) is carried out for 5 to 120 minutes, preferably 5 to 65 minutes, more preferably 10 to 60 minutes, even more preferably 10 to 50 minutes, even more preferably 10 to 40 minutes, even more preferably from 10 to 30 minutes, even more preferably from 10 to 20 minutes; and/or

(iii) окислительный агент присутствует в количестве от 0,01 до 0,5 молярного эквивалента, предпочтительно от 0,01 до 0,3 молярного эквивалента, более предпочтительно от 0,04 до 0,3 молярного эквивалента, еще более предпочтительно от 0,04 до 0,1 относительно молярного количества дисахаридных повторяющихся звеньев гиалуроновой кислоты, модифицированной глицерином; и/или(iii) the oxidizing agent is present in an amount of from 0.01 to 0.5 molar equivalent, preferably from 0.01 to 0.3 molar equivalent, more preferably from 0.04 to 0.3 molar equivalent, even more preferably from 0. 04 to 0.1 relative to the molar amount of disaccharide repeating units of hyaluronic acid modified with glycerol; and/or

(iv) указанная гиалуроновая кислота, модифицированная глицерином, присутствует в количестве от 2 до 50 г/л, предпочтительно от 2 до 40 г/л, более предпочтительно от 3 до 38 г/л, более предпочтительно от 4 до 36 г/л.(iv) said glycerol-modified hyaluronic acid is present in an amount of 2 to 50 g/L, preferably 2 to 40 g/L, more preferably 3 to 38 g/L, more preferably 4 to 36 g/L.

8. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты, полученное способом по любому из пп. 5-7, причем указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структуры8. Modified hyaluronic acid derivative obtained by the method according to any one of claims. 5-7, wherein said modified hyaluronic acid derivative contains at least one disaccharide unit of the following structure

где «Ac» означает -C(O)CH₃, и R выбран из H, иона щелочного металла и иона щелочноземельного металла.where "Ac" means -C(O)CH ₃ and R is selected from H, an alkali metal ion and an alkaline earth metal ion.

9. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 8, отличающееся тем, что ион щелочноземельного металла представляет собой Na.9. Modified hyaluronic acid derivative according to claim 8, characterized in that the alkaline earth metal ion is Na.

10. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по п. 8 или 9, отличающееся тем, что указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты10. Modified hyaluronic acid derivative according to claim 8 or 9, characterized in that said modified hyaluronic acid derivative

(i) имеет степень модификации от 1,0% до 20%, предпочтительно от 1,0% до 15,0%, более предпочтительно от 1,0% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 10,0%, более предпочтительно от 1,5% до 8,0%, более предпочтительно от 1,8% до 7,0%, более предпочтительно от 2,0% до 6,9%, степень модификации определяют как количество групп CH₂-O-CH₂-CHO, деленное на общее количество N-ацетил-D-глюкозаминных звеньев, присутствующих в модифицированном производном гиалуроновой кислоты, и/или(i) has a modification degree of from 1.0% to 20%, preferably from 1.0% to 15.0%, more preferably from 1.0% to 10.0%, more preferably from 1.5% to 10, 0%, more preferably 1.5% to 8.0%, more preferably 1.8% to 7.0%, more preferably 2.0% to 6.9%, the degree of modification is defined as the number of CH ₂ groups -O-CH ₂ -CHO divided by the total amount of N-acetyl-D-glucosamine units present in the modified hyaluronic acid derivative, and/or

(ii) имеет средневесовую молекулярную массу от 0,1 до 2,5 МДа, предпочтительно от 0,2 до 1,5 МДа, более предпочтительно от 0,4 до 1,3 МДа, еще более предпочтительно от 0,6 до 1,1 МДа(ii) has a weight average molecular weight of from 0.1 to 2.5 MDa, preferably from 0.2 to 1.5 MDa, more preferably from 0.4 to 1.3 MDa, even more preferably from 0.6 to 1, 1 MDa

иAnd

необязательно дополнительно содержит по меньшей мере одно дисахаридное звено следующей структурыoptionally further contains at least one disaccharide unit of the following structure

где R¹, R², R³ и R⁴ независимо выбраны из H и -CH₂-CHO, и R⁵ выбран из водорода, иона щелочного металла, предпочтительно Na, соли щелочноземельного металла и -CH₂-CHO, при условии, что по меньшей мере один из R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO, и если R¹ представляет собой -CH₂-CHO, то по меньшей мере один из R², R³, R⁴ и R⁵ представляет собой -CH₂-CHO.wherein R ¹ , R ² , R ³ and R ⁴ are independently selected from H and -CH ₂ -CHO, and R ⁵ is selected from hydrogen, an alkali metal ion, preferably Na, an alkaline earth metal salt and -CH ₂ -CHO, provided that that at least one of R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ is -CH ₂ -CHO, and if R ¹ is -CH ₂ -CHO, then at least one of R ² , R ³ , R ⁴ and R ⁵ represents -CH ₂ -CHO.

11. Применение модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для эстетической медицины для обработки морщин и складок кожи, включая межбровные морщины, носогубные складки, складки на подбородке, морщины марионетки, нижнюю часть овала лица, морщины на щеках, окологубные морщины и «гусиные лапки», атрофические рубцы, шрамы, виски, подкожное крепление бровей, жировые подушки на скулах и щеках, слезные борозды, нос, губы, щеки, подбородок, окологубную зону, подглазничную область и/или лицевую асимметрию.11. The use of a modified hyaluronic acid derivative according to any one of paragraphs. 1-4 and 8-10 for the in situ preparation of cross-linked hydrogel for aesthetic medicine for the treatment of wrinkles and skin folds, including glabellar wrinkles, nasolabial folds, chin folds, marionette lines, lower oval face, cheek wrinkles, peri-labial wrinkles and “crow’s feet”, atrophic scars, scars, temples, subcutaneous attachment of the eyebrows, fat pads on the cheekbones and cheeks, tear troughs, nose, lips, cheeks, chin, peri-labial area, infraorbital area and/or facial asymmetry.

12. Применение модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 для in vitro получения поперечно-сшитого гидрогеля, причем указанное модифицированное производное гиалуроновой кислоты используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты.12. The use of a modified hyaluronic acid derivative according to any one of paragraphs. 1-4 and 8-10 for in vitro production of a cross-linked hydrogel, wherein said modified hyaluronic acid derivative is used together with a second polysaccharide derivative which contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified derivative hyaluronic acid.

13. Модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 для применения для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля для терапевтического применения, предпочтительно для лечения стрессового недержания мочи, сухости влагалища, везикоуретерального рефлюкса, недостаточности голосовых связок и/или медиализации голосовых связок.13. Modified hyaluronic acid derivative according to any one of paragraphs. 1-4 and 8-10 for use in the in situ preparation of a cross-linked hydrogel for therapeutic use, preferably for the treatment of stress urinary incontinence, vaginal dryness, vesicoureteral reflux, vocal cord insufficiency and/or vocal cord medialization.

14. Применение по любому из пп. 11-12 или модифицированное производное гиалуроновой кислоты для применения по п. 13, отличающиеся тем, что модифицированное производное гиалуроновой кислоты используют вместе со вторым полисахаридным производным, которое содержит одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты, причем второе полисахаридное производное предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, и указанная нуклеофильная функциональная группа предпочтительно представляет собой гидразидную функциональную группу, и при этом второй полисахарид более предпочтительно представляет собой производное гиалуроновой кислоты, содержащее по меньшей мере одно дисахаридное звено, имеющее следующую структуру:14. Application according to any one of paragraphs. 11-12 or a modified hyaluronic acid derivative for use according to claim 13, characterized in that the modified hyaluronic acid derivative is used together with a second polysaccharide derivative that contains one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified a hyaluronic acid derivative, wherein the second polysaccharide derivative is preferably a hyaluronic acid derivative, and said nucleophilic functional group is preferably a hydrazide functional group, and wherein the second polysaccharide is more preferably a hyaluronic acid derivative containing at least one disaccharide unit having the following structure:

15. Применение по п. 14 или модифицированное производное гиалуроновой кислоты для применения по п. 14, отличающиеся тем, что15. Use according to claim 14 or a modified hyaluronic acid derivative for use according to claim 14, characterized in that

(i) альдегидная группа модифицированного производного HA и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного самопроизвольно образуют ковалентную связь при совместной инъекции модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в требуемое место тела субъекта, с образованием поперечно-сшитого гидрогеля в требуемом месте, или(i) the aldehyde group of the modified HA derivative and the nucleophilic functional group of the second polysaccharide derivative spontaneously form a covalent bond upon co-injection of the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative at a desired site on the body of a subject, forming a cross-linked hydrogel at the desired site, or

(ii) альдегидная группа модифицированного производного HA и нуклеофильная функциональная группа второго полисахаридного производного самопроизвольно образуют ковалентную связь при приведении в контакт модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного, причем предпочтительно модифицированное производное HA и второе полисахаридное производное находятся в буферной среде, предпочтительно в физиологической буферной среде.(ii) the aldehyde group of the modified HA derivative and the nucleophilic functional group of the second polysaccharide derivative spontaneously form a covalent bond when the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative are brought into contact, preferably the modified HA derivative and the second polysaccharide derivative are in a buffer environment, preferably in a physiological buffer environment.

16. Поперечно-сшитый гидрогель, содержащий следующее структурное звено:16. Cross-linked hydrogel containing the following structural unit:

17. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 16, отличающийся тем, что указанный поперечно-сшитый гидрогель представляет собой поперечно-сшитый гидрогель, полученный in vitro.17. The cross-linked hydrogel according to claim 16, characterized in that said cross-linked hydrogel is a cross-linked hydrogel obtained in vitro .

18. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 17, отличающийся тем, что указанный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит несшитый полисахарид, предпочтительно гиалуроновую кислоту, и/или тем, что указанный поперечно-сшитый гидрогель дополнительно содержит анестезирующий агент, предпочтительно лидокаин.18. The cross-linked hydrogel according to claim 17, characterized in that said cross-linked hydrogel further contains a non-cross-linked polysaccharide, preferably hyaluronic acid, and/or in that said cross-linked hydrogel further contains an anesthetic agent, preferably lidocaine.

19. Поперечно-сшитый гидрогель, полученный посредством приведения в контакт модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 и второго полисахаридного производного, содержащего одну или более нуклеофильных функциональных групп, способных образовывать ковалентную связь с одной или более альдегидными группами модифицированного производного гиалуроновой кислоты, причем указанное второе полисахаридное производное представляет собой производное гиалуроновой кислоты, и указанная нуклеофильная функциональная группа предпочтительно представляет собой гидразидную функциональную группу, причем указанный поперечно-сшитый гидрогель содержит следующее структурное звено:19. Cross-linked hydrogel obtained by bringing into contact a modified hyaluronic acid derivative according to any one of claims. 1-4 and 8-10 and a second polysaccharide derivative containing one or more nucleophilic functional groups capable of forming a covalent bond with one or more aldehyde groups of the modified hyaluronic acid derivative, wherein said second polysaccharide derivative is a hyaluronic acid derivative, and said nucleophilic functional the group is preferably a hydrazide functional group, wherein said cross-linked hydrogel contains the following structural unit:

20. Поперечно-сшитый гидрогель по любому из пп. 16-19, отличающийся тем, что ион щелочного металла представляет собой Na.20. Cross-linked hydrogel according to any one of paragraphs. 16-19, characterized in that the alkali metal ion is Na.

21. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 19, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт осуществляют in situ.21. Cross-linked hydrogel according to claim 19, characterized in that said bringing into contact is carried out in situ .

22. Поперечно-сшитый гидрогель по п. 19, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт осуществляют in vitro, причем указанное приведение в контакт предпочтительно осуществляют в буфере, предпочтительно физиологическом буфере.22. The cross-linked hydrogel according to claim 19, characterized in that said contacting is carried out in vitro , and said contacting is preferably carried out in a buffer, preferably a physiological buffer.

23. Способ получения поперечно-сшитого гидрогеля, включающий следующие стадии:23. A method for producing a cross-linked hydrogel, including the following steps:

a) обеспечение первого раствора предшественника, содержащего модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10, и отдельно от него второго раствора предшественника, содержащего второе полисахаридное производное;a) providing a first precursor solution containing a modified hyaluronic acid derivative according to any one of claims. 1-4 and 8-10, and separately from it a second precursor solution containing a second polysaccharide derivative;

b) смешивание первого раствора предшественника и второго раствора предшественника с получением смеси, способной к поперечному сшиванию in situ; иb) mixing the first precursor solution and the second precursor solution to obtain a mixture capable of in situ cross-linking; And

c) инъекция смеси, способной к поперечному сшиванию in situ, в требуемое место тела пациента с получением поперечно-сшитого геля в требуемом месте.c) injecting the mixture capable of in situ cross-linking into a desired location on the patient's body to produce a cross-linked gel at the desired location.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что на стадии a) первый раствор предшественника и второй раствор предшественника находятся в различных камерах многокамерного шприца, и смешивание на стадии b) происходит во время выдавливания из указанного многокамерного шприца.24. The method according to claim 23, characterized in that in step a) the first precursor solution and the second precursor solution are in different chambers of a multi-chamber syringe, and mixing in step b) occurs during extrusion from said multi-chamber syringe.

25. Способ получения поперечно-сшитого гидрогеля, включающий следующие стадии:25. A method for producing a cross-linked hydrogel, including the following steps:

a) обеспечение буфера;a) providing a buffer;

b) добавление модифицированного производного гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10 и добавление в буфер второго полисахаридного производного;b) adding a modified hyaluronic acid derivative according to any one of claims. 1-4 and 8-10 and adding a second polysaccharide derivative to the buffer;

c) поперечное сшивание модифицированного производного гиалуроновой кислоты и второго полисахаридного производного в указанном буфере с получением поперечно-сшитого гидрогеля.c) cross-linking the modified hyaluronic acid derivative and the second polysaccharide derivative in said buffer to obtain a cross-linked hydrogel.

26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что стадия b) дополнительно включает добавление в буфер несшитого полисахарида, причем указанный несшитый полисахарид представляет собой гиалуроновую кислоту.26. The method of claim 25, wherein step b) further comprises adding a non-cross-linked polysaccharide to the buffer, said non-cross-linked polysaccharide being hyaluronic acid.

27. Способ по п. 25 или 26, дополнительно включающий добавление несшитого полисахарида к поперечно-сшитому гидрогелю, полученному на стадии c).27. The method according to claim 25 or 26, further comprising adding the non-cross-linked polysaccharide to the cross-linked hydrogel obtained in step c).

28. Способ по любому из пп. 25-27, дополнительно включающий просеивание и дегазирование гидрогеля, полученного на стадии c).28. Method according to any one of paragraphs. 25-27, further comprising sieving and degassing the hydrogel obtained in step c).

29. Способ по любому из пп. 25-28, дополнительно включающий наполнение контейнера, предпочтительно шприца, более предпочтительно готового для применения шприца гидрогелем, полученным на стадии c).29. Method according to any one of paragraphs. 25-28, further comprising filling a container, preferably a syringe, more preferably a ready-to-use syringe, with the hydrogel obtained in step c).

30. Способ по п. 29, дополнительно включающий стерилизацию контейнера, содержащего гель.30. The method of claim 29, further comprising sterilizing the container containing the gel.

31. Набор для in situ получения поперечно-сшитого гидрогеля, содержащий (i) первый контейнер, содержащий первый раствор предшественника, который содержит модифицированное производное гиалуроновой кислоты по любому из пп. 1-4 и 8-10, и (ii) второй контейнер, содержащий второй раствор предшественника, который содержит второе полисахаридное производное.31. A kit for in situ production of a cross-linked hydrogel, comprising (i) a first container containing a first precursor solution that contains a modified hyaluronic acid derivative according to any one of claims. 1-4 and 8-10, and (ii) a second container containing a second precursor solution that contains a second polysaccharide derivative.

32. Набор по п. 31, дополнительно содержащий (iii) инструкции по применению.32. The kit according to claim 31, additionally containing (iii) instructions for use.