RU2809011C1 - Способ получения комплекса водорастворимых пептидов, обладающих антиоксидантной активностью - Google Patents
Способ получения комплекса водорастворимых пептидов, обладающих антиоксидантной активностью Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809011C1 RU2809011C1 RU2022118845A RU2022118845A RU2809011C1 RU 2809011 C1 RU2809011 C1 RU 2809011C1 RU 2022118845 A RU2022118845 A RU 2022118845A RU 2022118845 A RU2022118845 A RU 2022118845A RU 2809011 C1 RU2809011 C1 RU 2809011C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- temperature
- hours
- water
- acetic acid
- centrifugation
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 title abstract description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 42
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 241000721191 Clarias gariepinus Species 0.000 claims abstract description 14
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 11
- 241001233037 catfish Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 abstract description 4
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 abstract description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 abstract 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 3
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- RPHLQSHHTJORHI-UHFFFAOYSA-N Adrenochrome Chemical compound O=C1C(=O)C=C2N(C)CC(O)C2=C1 RPHLQSHHTJORHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238366 Cephalopoda Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010011145 Fushi Tarazu Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000004472 Myostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 241000238371 Sepiidae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000009993 protective function Effects 0.000 description 1
- 230000006950 reactive oxygen species formation Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к пищевой промышленности. Предложен способ получения комплекса водорастворимых пептидов путем уксуснокислой экстракции сырья. В качестве сырья используют эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отобранную от свежей или замороженной рыбы, а в качестве экстрагента - 3÷4-кратный объем 3%-ного масс. раствора уксусной кислоты, содержащий 0,1÷0,3% масс. неорганической соли, выбранной из CaCl2, MgO2, FeCl3, MgSO4, FeSO4. Экстракцию ведут в режиме ультразвуковой кавитационной обработки в течение 15÷20 мин при температуре +4°С и продолжают при постоянном перемешивании от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин каждые 10÷12 часов, далее надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают в течение 5÷10 часов при температуре +4°С неорганическим сорбентом, в качестве которого используют активированный уголь, взятый в количестве 0,5% масс. от массы экстракта. Отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое и затем обрабатывают 1,2÷2-кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения пептидов. Способ позволяет получить комплекс водорастворимых пептидов с молекулярной массой от 350 до 9000 Да без примесей высокомолекулярных белков, содержащий все незаменимые аминокислоты и обладающий высокой антиоксидантной активностью, из эпидермальной слизи африканского сома Clarias gariepinus. 2 ил., 5 пр.
Description
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к способам получения биологически активных добавок (БАД) из отхода рыбоперерабатывающей промышленности, в частности к получению БАД на основе водорастворимых пептидов эпидермальной слизи африканского сома Clarias gariepinus, содержащих все незаменимые аминокислоты и обладающих высокой антиоксидантной активностью.
Применение рыбного сырья, в частности сома Clarias gariepinus, для получения эффективных пептидных препаратов на сегодняшний день недостаточно разработано, несмотря на потенциальную привлекательность данного объекта исследования в связи с ростом производства и расширением возможностей рыбоперерабатывающей промышленности
Африканский сом интересен тем, что это бесчешуйчатая рыба, у которой защитную функцию выполняет эпидермальная слизь. Именно этот факт обуславливает многочисленные жизненно важные свойства слизи. По нашему мнению, пептидный комплекс, выделенный из кожного секрета сома, будет обладать в первую очередь регенерирующим и бактериостатическим действием.
Известен способ получения иммуностимулятора из молок лососевых рыб (патент РФ 2091073,1997), представляющий собой замораживание сырья, измельчение, экстрагирование 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка, центрифугирование, ультра- и диафильтрацию экстракта в растворе 0,9% хлорида натрия с рН 6,0-6,5 через пористый материал с пределом разделения 5000 Да, стерилизацию и лиофильное высушивание.
Известен способ получения иммуностимулятора из ганглий кальмара и каракатицы (патент РФ 2091072, 1997), включающий гомогенизацию сырья в воде, подкисленной уксусной кислотой до рН 3,5-4,5 и содержащей 0,1% хлористого цинка, отделение надосадочной жидкости, стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с размером пор 0,8; 0,45; 0,22 мкм, концентрирование стерильного фильтрата в 5,5 раз на ультрафильтрационной установке через пористый материал с пределом разделения 1000-5000 Да с последующей очисткой в подщелоченной до рН 9-10 воде, повторное концентрирование на том же пористом материале и стерилизацию, лиофильное высушивание.
Недостатками этих способов являются:
- применение дорогостоящего ультрафильтрационного оборудования;
- отсутствие технологической операции по отделению веществ с молекулярной массой более 10000-15000 Да, что приводит к присутствию в препарате высокомолекулярных примесей, снижающих активность препарата и проявляющих аллергический эффект.
Известен способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород (Патент РФ №2409291, 2011) включающий экстракцию 5-30-ти кратным избытком дистиллированной воды с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и последующей очисткой жидкой фракции, содержащей целевой продукт, 0,3%-ным раствором хитозана в 3%-ном растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 и с последующим инкубированием смеси в течение 2-3 ч, двойным разделением на твердую и жидкую фракции с последующим объединением жидких фракций. Недостатком этого способа является низкий выход целевого продукта и большой объем экстрагента.
Известен способ получения пептидного комплекса из печени рыб тресковых пород (Патент РФ №2472517, 2013), включающий экстракцию 5-20-ти кратным избытком смеси вода-масло, инкубирование, разделение на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия, с последующим высушиванием жидкой фракции и очисткой сухого продукта органическим растворителем. Недостатком способа является применение растительного масла для экстракции и органического растворителя для высушивания, что значительно удорожает процесс.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому является способ получения иммуностимулятора пептидной природы из нервной ткани морских гидробионтов и БАД на его основе (Патент РФ №2635625, 2017), включающий экстрагирование сырья 3%-ным раствором уксусной кислоты в течение 35-48 ч с последующим добавлением раствора бикарбоната натрия до рН=8,0-8,5 и 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, отделение надосадочной жидкости на центрифуге при 5000 об/мин, добавление к фугату сульфата аммония до 30% концентрации раствора и повторное центрифугирование и диафильтрацию фугата. В результате получают раствор конечного вещества с Mw от 1000 до 15000 Да. Недостатком способа является сложность процесса и большое количество химических реагентов.
Технической задачей изобретения является разработка способа получения комплекса водорастворимых пептидов с молекулярной массой от 350 до 9000 Да без примесей высокомолекулярных белков, содержащего все незаменимые аминокислоты и обладающего высокой антиоксидантной активностью, из эпидермальной слизи африканского сома Clarias gariepinus.
Способ заключается в том, что эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отобранную от свежей или предварительно замороженной рыбы, заливают 3÷4-х кратным объемом 3%-ного масс. раствора уксусной кислоты, содержащего 0,1-0,3% масс. неорганической соли, выбранной из CaCl2, MgCl2, FeC13, MgSO4, FeSO4, подвергают ультразвуковой кавитационной обработке в течение 15-20 мин при температуре +4°С. Экстракцию продолжают от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин. каждые 10÷12 часов. По окончании экстракции надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают активированным углем, который берут в количестве 0,5% масс. от массы экстракта. Сорбцию ведут в течение 5÷10 часов при температуре +4°С. Отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое, а затем обрабатывают 1,5÷2-х кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения пептидов. Осадок пептидов выделяют фильтрованием с последующей лиофилизацией. Полученный продукт представляет собой порошок белого цвета хорошо растворимый в воде.
При этом в качестве целевого продукта получают пептидный комплекс с содержанием низкомолекулярной пептидной фракции от 70 до 90% с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 350 до 9000 Да, что достигается описываемой последовательностью технологических операций и условиями их осуществления, включая температурные, временные и технические характеристики, а также использованием предлагаемых реагентов, включая исходное сырье.
В качестве сырья для получения пептидного комплекса была выбрана эпидермальная слизь африканского сома Clarias gariepinus из-за биологической роли кожного секрета в жизнедеятельности рыбы данного вида, а также из-за того, что данная ткань по факту является отходом рыбоперерабатывающего производства. При этом она достаточно легко может быть собрана как с живой, так и с замороженной рыбы и не нуждается в предварительном измельчении перед процессом экстракции.
Выбор в качестве экстрагента растворов ряда солей в уксусной кислоте обусловлен тем, что в процессе технологических операций указанные соединения полностью удаляются и не загрязняют целевой продукт. Приведенные выше соли представляют собой соли биологически значимых металлов и в приведенных концентрациях способствуют осаждению высокомолекулярных белков и балластных веществ, содержащихся в слизи.
Применение в качестве сорбента активированного угля позволяет устранить неприятный запах выделенного экстракта и далее целевого продукта.
Предлагаемая технология мягкого упаривания под вакуумом позволяет значительно сконцентрировать экстракт, что впоследствии приводит к существенному (в 3-5 раз) снижению количества применяемого в качестве осадителя пептидов - ацетона.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлен ИК-спектр комплекса пептидов, на фиг. 2 - 2-D масс-спектрограмма комплекса пептидов, где каждая точка соответствует пептиду в координатах «молекулярная масса» - «время удерживания». Способ осуществляется следующим образом.
Эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отобранную от свежей или предварительно замороженной рыбы, заливают 3÷4-х кратным объемом 3%-ного масс, раствора уксусной кислоты, содержащего 0,1-0,3% масс, неорганической соли, выбранной из CaCl2, MgC12, FeCl3, MgSO4, FeSO4. Полученный раствор подвергают ультразвуковой кавитационной обработке на ультразвуковом диспергаторе «ULTRASONIK GENERATOR IL10 - 0,63» в течение 15-20 мин при температуре +4°С. Экстракцию продолжают от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин. каждые 10÷12 часов. По окончании экстракции надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают неорганическим сорбентом, в качестве которого используют активированный уголь, который берут в количестве 0,5% масс. от массы экстракта. Сорбцию ведут в течение 5÷10 часов при температуре +4°С. Отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое, а затем обрабатывают 1,2÷2-х кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения пептидов. Осадок пептидов выделяют фильтрованием с последующей лиофилизацией на лиофильной сушилке Alpha 1-2 LD plus, производства MartinChrist (Германия).
Пептидная природа выделенного продукта подтверждается методом ИК-спектроскопии с помощью ИК-фурье спектрометра Perkin Elmer Frontier в диапазоне волновых чисел 400-4000 см-1, с разрешением 1 см- 1, (сканов-20). ИК-спектры снимают в таблетке с KBr. Находят следующие характеристические полосы поглощения: амид А - ок. 3300, амид В - ок. 3100, амид -1650; амид II - 1537 см-1. Приведенные полосы однозначно указывают на белковую природу полученного продукта, что дополнительно подтверждается сравнением полученного спектра с библиотечными аналогами.
Хроматографическое исследование пептидных комплексов. Разделение пептидов полученных экстрактов проводят с использованием хроматографической системы Ultimate 3000 RS system (производство Dionex). Исследуемые образцы экстрактов растворяют в воде, содержащей 5% муравьиной кислоты и 5% ацетонитрила, и разделяют на хроматографической колонке HypersilGold (100×1 мм, С18, 3 μm, производство ThermoScientific) со скоростью 0,1 мл/мин. Элюирование пептидов проводят с использованием смеси растворителей «А» (0,1% (об) раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде) и «В» (0,1% (об) раствор муравьиной кислоты в 95% (об) растворе ацетонитрила в воде) в следующем режиме: 5% В в течение 10 мин, далее с применением линейного градиента растворителя В (от 5 до 60%) в течение 45 мин с последующей стадией промывки (промывка 10 мин 100% растворителем В) и стадией уравновешивания (промывка 10 мин 5% растворителем В). Полученные серии многозарядных ионов для анализируемых пиков также подтверждают пептидную природу анализируемых веществ. В частности, в исследованных экстрактах обнаруживается «пептидный шум» с диапазоном масс порядка 300-9000 Да
Антиоксидантную активность выделенных комплексов оценивают по их способности ингибировать аутоокисление адреналина in vitro и тем самым предотвращать образование активных форм кислорода (Патент РФ №2144674, 2000).
Определение проводилось на спектрометре УФ/видимой области спектра UV - 1800 (фирмы «Shimadzu») в режиме «Photometric» при длине волны 347 нм в кювете с длинной светопоглощающего слоя 1 см.
В спектрофотометрическую кювету к 2 мл карбонатного буфера, рН 10,65, при комнатной температуре (не ниже 15°С), добавляют 100 мкл 0.1% раствора адреналина (230 мкМ) и определенное количество водного раствора исследуемого пептида. Происходит аутоокисление адреналина, которое регистрируют не по образованию адренохрома, а по ранее появляющемуся продукту окисления адреналина, поглощающему при длине волны 347 нм.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение пептидного комплекса из эпидермальной слизи замороженной рыбы Clarias gariepinus.
1 кг эпидермальной слизи, снятой с замороженной рыбы Clarias gariepinus, заливают 3 кг раствора 3% масс. уксусной кислоты с предварительно растворенными в ней 3 кг хлорида кальция, тщательно перемешивают и полученную смесь обрабатывают на ультразвуковой установке «ULTRASONIK GENERATOR IL10 - 0,63» в течение 15 мин при температуре +4°С. Смесь выдерживают в течение 48 час при температуре +4°С и постоянном перемешивании. Через каждые 10 часов смесь подвергают ультразвуковой обработке в течение 10 мин при температуре +4°С. По окончании экстракции смесь центрифугируют, а к полученному фугату добавляют активированный уголь в количестве 18 г. Сорбцию ведут 5 час при температуре +4°С и постоянном перемешивании. По окончании процесса отработанный уголь также отделяют центрифугированием, а надосадочную жидкость упаривают под вакуумом при температуре +10°С до достижения объема в 1,5 литра. К полученному таким образом концентрату добавляют 2 кг холодного ацетона и оставляют на 24 часа при температуре +4°С для достижения полноты осаждения пептидной фракции. Выпавший осадок пептидной фракции отделяют фильтрованием, а затем подвергают лиофильной сушке. Выход пептидного препарата 31 г (3,1%).
Пример 2. Получение пептидного комплекса из эпидермальной слизи свежей рыбы Clarias gariepinus.
Способ осуществляется как в примере 1. Выход пептидного препарата 21 г (2,1%).
Пример 3. Получение пептидного комплекса из эпидермальной слизи свежей или замороженной рыбы Clarias gariepinus.
Способ осуществляется как в примерах 1 и 2, в качестве раствора экстрагента используют 3% масс, водный раствор уксусной кислоты в количестве 3 кг с предварительно растворенной в ней 3 г одной из следующих солей: MgCl2, FeCl3, MgSO4, FeSO4 Выходы пептидного препарата составили соответственно: 22 г (2,2%), 19 г (1,9%), 25 г, (2,5%), 28 г (2,8%).
Пример 4. Определение состава пептидного комплекса методом хромато-масс-спектрометрии
Масс-спектрометрический (МС) анализ осуществляют с использованием масс-спектрометра Q-Exactive (ThermoScientific, Германия) с. аэрозольным источником ионов «HESI» с напряжением ионизации 3.5 kV и температурой капилляра 256°С. Предварительное сканирование проводят при разрешении 70000, диапазон сканирования - 200-1500 m/z, целевые значения AGC - 1×106, максимальное время впрыскивания - 50 мс. Фрагментацию пептидных квазимолекулярных ионов в режиме HCD (high-energycollisiondissociation) с последующей регистрацией первичных фрагментов в режиме тандемного сканирования (MS/MS) выполняют для 10 наиболее часто встречающихся ионов при нормированной энергии столкновения - 30, динамическом исключении - 10 с. Сканирование MS/MS образующихся ионов проводят с разрешением 17.500, целевые значения составили 105, максимальное время впрыска - 100 мс, окно изоляции - 2.0. Последовательности пептидов определяют программным обеспечением Proteome Discoverer 1.4 с использованием базы данных аминокислотных последовательностей UniProt. В составе комплекса были найдены пептидные фрагменты различных классов белков протеома Clarias gariepinus: бета-актины, семейство цитохрома, белки теплового шока, миостатин, нейропептид и др., факторы элонгации, Фуши-Таразу и др.
В составе пептидов, обнаруженных в комплексе, были найдены все незаменимые аминокислоты (Phe, Val, Thr, Trp, Met, Leu, He, Lys, His) и условно незаменимые (Arg, Cys, Gly, Gin, Pro, Tyr).
Пример 5. Определение антиоксидантной активности пептидных комплексов.
Определение проводят на спектрометре УФ/видимой области спектра UV - 1800 (фирмы «Shimadzu») в режиме «Photometric» при длине волны 347 нм в кювете с длинной светопоглощающего слоя 1 см.
Для определения антиоксидантной активности готовят 0,1% масс, водные растворы пептидных комплексов. К 2 мл карбонатного буфера с рН=10,65, при комнатной температуре добавляют 100 мкл 0.1% раствора адреналина (230 мкМ) и 5, 10, 15 или 20 мкл раствора пептидного комплекса. Раствор фотометрируют относительно карбонатного буфера в течение 30 мин с интервалом в 30 с. В качестве контрольного используют аналогичный раствор адреналина без добавления раствора пептида.
Антиоксидантную активность (АА) исследуемых пептидных комплексов выражают в процентах ингибирования аутоокисления адреналина и вычисляют по формуле:
где, D1 - оптическая плотность буферированного раствора адреналина, содержащего пептид,
D2 - оптическая плотность контрольного раствора адреналина в буфере.
Антиоксидантная активность пептидных комплексов, выделенных с помощью уксуснокислой экстракции с применением солей CaCl2, MgCl2, FeCl3, MgSO4, FeSO4, составляет (в среднем) соответственно: 55, 58, 34, 39, 41%.
Claims (1)
- Способ получения комплекса водорастворимых пептидов путем уксуснокислой экстракции сырья, отличающийся тем, что в качестве сырья используют эпидермальную слизь африканского сома Clarias gariepinus, отборанную от свежей или замороженной рыбы, а в качестве экстрагента - 3÷4-кратный объем 3%-ного масс. раствора уксусной кислоты, содержащий 0,1÷0,3% масс. неорганической соли, выбранной из СаСl2, MgCl2, FeCl3, MgSO4, FeSO4, при этом экстракцию ведут в режиме ультразвуковой кавитационной обработки в течение 15÷20 мин при температуре +4°С и продолжают при постоянном перемешивании от 24 до 48 часов с регулярной кавитационной обработкой в течение 10 мин каждые 10÷12 часов, далее надосадочную жидкость отделяют центрифугированием и обрабатывают в течение 5÷10 часов при температуре +4°С неорганическим сорбентом, в качестве которого используют активированный уголь, взятый в количестве 0,5% масс. от массы экстракта, после чего отработанный сорбент отделяют фильтрованием или центрифугированием, а полученный прозрачный фильтрат упаривают под вакуумом при температуре +4÷10°С до сокращения его объема вдвое и затем обрабатывают 1,2÷2-кратным избытком ацетона и оставляют еще на сутки при температуре +4°С для полного осаждения водорастворимых пептидов с молекулярной массой от 350 до 9000 Да.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809011C1 true RU2809011C1 (ru) | 2023-12-05 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1227736A1 (en) * | 1999-10-20 | 2002-08-07 | Nordur EHF | Protein hydrolysates produced with the use of marine proteases |
| RU2472517C1 (ru) * | 2012-02-01 | 2013-01-20 | Закрытое акционерное общество "Санкт-Петербургский институт фармации" | Способ получения пептидного комплекса из печени рыб тресковых пород |
| RU2635625C1 (ru) * | 2016-07-25 | 2017-11-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр" (ФГБНУ "ТИНРО-Центр") | Способ получения иммуностимулятора пептидной природы (Варианты) и БАД на его основе |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1227736A1 (en) * | 1999-10-20 | 2002-08-07 | Nordur EHF | Protein hydrolysates produced with the use of marine proteases |
| RU2472517C1 (ru) * | 2012-02-01 | 2013-01-20 | Закрытое акционерное общество "Санкт-Петербургский институт фармации" | Способ получения пептидного комплекса из печени рыб тресковых пород |
| RU2635625C1 (ru) * | 2016-07-25 | 2017-11-14 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр" (ФГБНУ "ТИНРО-Центр") | Способ получения иммуностимулятора пептидной природы (Варианты) и БАД на его основе |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ambigaipalan et al. | Bioactive peptides from shrimp shell processing discards: Antioxidant and biological activities | |
| Pezeshk et al. | Fractionation of protein hydrolysates of fish waste using membrane ultrafiltration: investigation of antibacterial and antioxidant activities | |
| Catiau et al. | Minimal antimicrobial peptidic sequence from hemoglobin alpha-chain: KYR | |
| Najafian et al. | A review of fish-derived antioxidant and antimicrobial peptides: Their production, assessment, and applications | |
| US3822348A (en) | Hormone-like substance having serum calcium reducing property | |
| CN107164444B (zh) | 具有抗氧化功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用 | |
| CN111961115B (zh) | 一种鲜味肽及其制备方法和应用 | |
| Jafarpour et al. | Characterization of cod (Gadus morhua) frame composition and its valorization by enzymatic hydrolysis | |
| Mititelu et al. | Research regarding integral processing of mussels from Black Sea | |
| CN1803836A (zh) | 海蜇胶原蛋白及其制备方法 | |
| KR101603276B1 (ko) | 방사선을 이용하여 해파리로부터 콜라겐의 분리방법 | |
| RU2409291C1 (ru) | Способ получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород | |
| RU2809011C1 (ru) | Способ получения комплекса водорастворимых пептидов, обладающих антиоксидантной активностью | |
| FR2474036A1 (fr) | Procede de production d'oligopeptides a partir de collagene | |
| SU472491A3 (ru) | Способ получени жира и протеина из растительного материала | |
| CN112679578B (zh) | 具有抗氧化性和dpp-iv抑制活性的多肽混合物及其制备方法 | |
| CN108998427B (zh) | 一种酚氧化酶活性蛋白的制备方法 | |
| CN109553677B (zh) | 基于两栖类蛙源抗菌肽的衍生肽w8及其制备方法和应用 | |
| H Natsir et al. | Enzymatic hydrolysis of collagen from yellowfin tuna bones and its potential as antibacterial agent | |
| CN110655553B (zh) | 一种芝麻来源的ace抑制肽、制备方法及其在制备降血压药物方面的应用 | |
| RU2272808C2 (ru) | Способ получения коллагена | |
| RU2563816C1 (ru) | Способ получения иммуностимулятора | |
| RU2545703C1 (ru) | Способ получения средства на основе гликозилированных полипептидов | |
| US4394374A (en) | Thymus gland extracts | |
| RU2481119C1 (ru) | Средство, обогащенное пептидами, аминокислотами и фосфолипидами |