RU2809003C2 - Methods of isolating and cultivating human retinal progenitor cells - Google Patents

Abstract

FIELD: pharmaceutical industry; medical industry.

SUBSTANCE: group of inventions relates to a method of isolating primary retinal cells from a human sample and to a method of culturing isolated primary human retinal cells to obtain a population of non-immortalized human retinal progenitor cells. A method of isolating primary retinal cells from a human sample, being one or a pair of human eyeballs obtained from a human donor, wherein the said one or pair of human eyeballs have normal morphology including intact eyeball(s), clear cornea, normal shape, or any of these combination comprising the following: (a) isolating a retinal sample comprising a plurality of primary retinal cells from a human sample within 8 hours of collecting one or a pair of eyeballs from a human donor, wherein the human donor is a fetus with a gestational age of between 12 weeks and 28 weeks, (b) mechanically dissociating the plurality of primary retinal cells in the retinal sample isolated at step (a), without treating the plurality of primary retinal cells with protease, resulting in a separated cell suspension and cell aggregates, and (c) determining the viability, number and morphology of primary retinal cells obtained from a retinal sample, where there are at least 30×10⁶ viable primary retinal cells obtained. A method of culturing isolated primary human retinal cells to obtain a population of non-immortalized human retinal progenitor cells includes: (a) plating into one or more culture flasks or coated plates containing culture medium, in a first passage, a plurality of primary retinal cells obtained by the method described above, with obtaining a plurality of cultured retinal cells; (b) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture media in a second passage of a plurality of cultured retinal cells obtained in the first passage; (c) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture medium in the third passage of a plurality of cultured retinal cells obtained in the second passage; and (d) cryopreservation of multiple cultured retinal cells; wherein one or more coated culture flasks are inoculated at a density of 0.5×10⁴ cells per square centimeter (cm²) to 5×10⁶ cells per cm², the seeding density in the first passage is greater than the seeding density in the second passage, and the seeding density in the second passage is greater than the seeding density in the third passage, resulting in a population of non-immortalized human retinal progenitor cells, where the culture the medium includes enhanced DMEM/F12, KnockOut DEMEM/F12, UltraCULTURE, ReNcell or neurobasal medium, and wherein the culture medium is further supplemented with at least one of the following: N-2, B27, Stempro, EGF, bFGF, GlutaMAX I, L-glutamine or gentamicin.

EFFECT: above methods, containing a combination of an 8-hour restriction after collecting eyeballs and a purely mechanical dissociation step, can effectively increase the number of cells, reduce the risk of cell lysis, increase cell viability, and increase the final yield.

19 cl, 2 dwg, 6 ex

Description

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИRELATED APPLICATIONS

[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США 62/737,622, поданной 27 сентября 2018 года, содержание которой полностью включено посредством отсылки.[001] This application claims priority to U.S. Provisional Patent Application No. 62/737,622, filed September 27, 2018, the contents of which are incorporated by reference in their entirety.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF TECHNOLOGY TO WHICH THE INVENTION RELATES

[002] Изобретение, описанное в настоящем документе, в целом относится к области биологии стволовых клеток и регенеративной медицины. В альтернативных вариантах осуществления в настоящем документе предложены способы выделения первичных клеток сетчатки, полученных или выделенных из человеческого образца. В альтернативных вариантах осуществления предложены композиции и способы лечения, уменьшения тяжести или профилактики заболевания или патологии сетчатки; улучшения фотопического (дневного) зрения; улучшения остроты зрения, улучшения функции желтого пятна, улучшения поля зрения или улучшения скотопического (ночного) зрения путем введения ретинальных клеток-предшественников или регенерации желтого пятна и/или восстановления функции скотопического зрения.[002] The invention described herein generally relates to the field of stem cell biology and regenerative medicine. In alternative embodiments, provided herein are methods for isolating primary retinal cells obtained or isolated from a human sample. In alternative embodiments, compositions and methods are provided for treating, reducing the severity of, or preventing a disease or pathology of the retina; improving photopic (daytime) vision; improving visual acuity, improving macular function, improving visual field, or improving scotopic (night) vision by introducing retinal progenitor cells or macular regeneration and/or restoring scotopic vision function.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[003] Дегенерация сетчатки глаза относится к ухудшению состояния или дегенерации, вызванной прогрессирующим и необратимым снижением количества и гибелью фоторецепторных клеток в сетчатке. Гибель фоторецепторных клеток может привести к слепоте. Таким образом, в уровне техники существует потребность в эффективных способах лечения для восстановления поврежденных и потерянных фоторецепторных клеток и восстановления зрительной функции.[003] Retinal degeneration refers to the deterioration or degeneration caused by the progressive and irreversible decline in the number and death of photoreceptor cells in the retina. The death of photoreceptor cells can lead to blindness. Thus, there is a need in the art for effective treatments to restore damaged and lost photoreceptor cells and restore visual function.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[004] В изобретении предложены способы выделения первичных клеток сетчатки, полученных или ранее полученных из образца человека путем: (а) обработки полученного образца или использования уже обработанного образца тканей сетчатки глаза человека гестационного возраста от приблизительно 12 недель до приблизительно 28 недель, (b) механической диссоциации полученного образца, (c) определения жизнеспособности и количества первичных клеток сетчатки, полученных из образца, и (d) подтверждения морфологии полученных первичных клеток сетчатки или использования первичных клеток сетчатки с подтвержденной для создания диссоциированной суспензии клеток и скоплений клеток.[004] The invention provides methods for isolating primary retinal cells obtained or previously obtained from a human sample by: (a) processing the obtained sample or using an already processed sample of human retinal tissue of about 12 weeks to about 28 weeks of gestational age, (b) mechanically dissociating the resulting sample, (c) determining the viability and number of primary retinal cells obtained from the sample, and (d) confirming the morphology of the resulting primary retinal cells or using confirmed primary retinal cells to create a dissociated cell suspension and cell aggregates.

[005] В некоторых вариантах осуществления способов согласно настоящему описанию ткань сетчатки человека получают из одного или пары глазных яблок человека. В некоторых вариантах осуществления способов согласно изобретению глазное яблоко(и) имеет нормальную морфологию, включая интактные глазные яблоки, прозрачную роговицу и/или нормальную форму. В некоторых вариантах осуществления фетальное глазное яблоко (содержащее ткань сетчатки человека) хранят в среде RPMI-1640 с L-глутамином и хранят во льду сразу после изъятия органов у донора. В любом из этих способов сохраненную ткань сетчатки человека доставляют и используют в течение определенного периода времени после изъятия. В различных вариантах осуществления ткань сетчатки человека транспортируют во льду и доставляют в пределах окна транспортировки. В качестве неограничивающего примера окно транспортировки может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 26 или более часов (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5 или 26 часов), например от приблизительно 4,5 до приблизительно 21,5 часов (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21 или 21,5) или от приблизительно 7 до приблизительно 26 часов (например, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5 или 26 часов).[005] In some embodiments of the methods described herein, human retinal tissue is obtained from one or a pair of human eyeballs. In some embodiments of the methods of the invention, the eyeball(s) have normal morphology, including intact eyeballs, a clear cornea, and/or a normal shape. In some embodiments, the fetal eyeball (containing human retinal tissue) is stored in RPMI-1640 with L-glutamine and stored on ice immediately after organ removal from the donor. In any of these methods, preserved human retinal tissue is delivered and used within a certain period of time after removal. In various embodiments, human retinal tissue is transported on ice and delivered within the transport window. By way of non-limiting example, the transport window may be from about 1 to about 26 or more hours (e.g., 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22, 5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, or 26 hours), such as from about 4.5 to about 21.5 hours (for example, 1, 1.5, 2, 2.5 , 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11 , 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19 .5, 20, 20.5, 21, or 21.5) or from about 7 to about 26 hours (e.g., 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5 or 26 hours).

[006] В некоторых вариантах осуществления способов согласно изобретению обработка полученного образца в этапе (а) включает: (i) после изъятия органов, извлечение глазного яблока (яблок) из среды RPMI-1640 и промывку от 1 до 5 раз (например, 1 , 2, 3, 4 или 5 раз) охлажденным во льду фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавкой антибиотиков, (ii) удаление зрительного нерва и мезенхимальной ткани из глазного яблока для удаления всех экстраокулярных клеток, (iii) промывку глазного яблока охлажденным льдом PBS с добавкой антибиотиков, (iv) прокол глазного яблока по краю роговицы с помощью иглы, (v) круговой разрез по краю роговицы микрохирургическими ножницами, (vi) удаление хрусталика, роговицы и ассоциированного стекловидного тела, (vii) отделение сетчатки от слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) с получением отделенной сетчатки, (viii) помещение отделенной сетчатки в чашку Петри, содержащую охлажденную льдом среду или PBS с добавкой антибиотика.[006] In some embodiments of the methods of the invention, processing the resulting sample in step (a) includes: (i) after organ removal, removing the eyeball(s) from the RPMI-1640 medium and washing 1 to 5 times (e.g., 1. 2, 3, 4, or 5 times) with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with antibiotics, (ii) removal of the optic nerve and mesenchymal tissue from the eyeball to remove all extraocular cells, (iii) rinsing the eyeball with ice-cold PBS with the addition of antibiotics, (iv) puncture of the eyeball along the edge of the cornea with a needle, (v) circular incision along the edge of the cornea with microsurgical scissors, (vi) removal of the lens, cornea and associated vitreous body, (vii) separation of the retina from the retinal pigment epithelium layer (PES) to obtain a separated retina, (viii) placing the separated retina in a Petri dish containing ice-cold medium or PBS supplemented with an antibiotic.

[007] В некоторых вариантах осуществления способов согласно настоящему изобретению механическая диссоциация на этапе (b) включает механическую диссоциацию сетчатки(ок), полученной в этапе (а), путем: (i) переноса сетчатки в коническую пробирку, (ii) механическую диссоциацию сетчатки(ок) с получением диссоциированных сетчаток, (iii) промывки чашки Петри бессывороточной средой с добавкой антибиотика и переноса среды, содержащей любые остаточные диссоциированные фрагменты сетчатки, в коническую пробирку, содержащую диссоциированную сетчатку(ки), (iv) осаждения диссоциированной сетчатки(ок) с помощью центрифугирования и (v) удаления супернатанта. В некоторых вариантах осуществления механическую диссоциацию сетчатки проводят путем ресуспендирования стерильной пипеткой. В некоторых вариантах осуществления диссоциированную сетчатку осаждают с помощью центрифугирования при температуре от приблизительно 10 до приблизительно 1000×g в течение периода от приблизительно 0 до приблизительно 30 минут при температуре от 1 до 50°C.[007] In some embodiments of the methods of the present invention, mechanical dissociation in step (b) includes mechanical dissociation of the retina(s) obtained in step (a) by: (i) transferring the retina into a conical tube, (ii) mechanical dissociation of the retina (ok) obtaining dissociated retinas, (iii) washing the Petri dish with serum-free medium supplemented with antibiotic and transferring the medium containing any residual dissociated retinal fragments into a conical tube containing the dissociated retinal(s), (iv) sedimenting the dissociated retinal(s) by centrifugation and (v) removal of the supernatant. In some embodiments, mechanical dissociation of the retina is accomplished by resuspension with a sterile pipette. In some embodiments, the dissociated retina is pelleted by centrifugation at a temperature of from about 10 to about 1000 xg for a period of from about 0 to about 30 minutes at a temperature of from 1 to 50°C.

[008] В некоторых вариантах осуществления способов согласно изобретению этап определения жизнеспособности и количества первичных клеток сетчатки в этапе (c) включает: (i) ресуспендирование осажденной ткани сетчатки, полученной в этапе (b), в охлажденной льдом бессывороточной среде с добавкой антибиотиков, (ii) определение количества и жизнеспособности клеток сетчатки и скоплений клеток сетчатки, полученных в результате механической диссоциации ткани сетчатки, (iii) посев клеток в покрытые фибронектином флаконы или планшеты для культивирования клеток, содержащие бессывороточную среду с добавкой антибиотиков, (iv) инкубирование содержащих клетки сетчатки флаконов или планшетов при температуре от 10 до 50°C. В некоторых вариантах осуществления количество и жизнеспособность клеток определяют с помощью счетчика клеток NC-200. В некоторых вариантах осуществления подсчитанное количество клеток составляет от приблизительно 1 до приблизительно 1000000000 клеток. В некоторых вариантах осуществления процент жизнеспособных подсчитанных клеток составляет от приблизительно 10 до приблизительно 100. В некоторых вариантах осуществления во флаконы или планшеты сеют от приблизительно 1 до приблизительно 1000000000 клеток. В некоторых вариантах осуществления инкубирование флаконов или планшетов, содержащих клетки сетчатки, проводят при 37°C в атмосфере, содержащей от 0 до 30% CO₂ и от 0 до 50% O₂.[008] In some embodiments of the methods of the invention, the step of determining the viability and number of primary retinal cells in step (c) includes: (i) resuspending the pelleted retinal tissue obtained in step (b) in ice-cold serum-free medium supplemented with antibiotics, ( ii) determining the number and viability of retinal cells and retinal cell aggregates resulting from mechanical dissociation of retinal tissue, (iii) plating the cells into fibronectin-coated cell culture flasks or plates containing serum-free medium supplemented with antibiotics, (iv) incubating the containing retinal cells vials or tablets at temperatures from 10 to 50°C. In some embodiments, cell number and viability are determined using an NC-200 cell counter. In some embodiments, the counted number of cells is from about 1 to about 1000000000 cells. In some embodiments, the percentage of viable cells counted is from about 10 to about 100. In some embodiments, from about 1 to about 1000,000,000 cells are seeded into flasks or plates. In some embodiments, incubation of vials or plates containing retinal cells is carried out at 37°C in an atmosphere containing from 0 to 30% CO ₂ and from 0 to 50% O ₂ .

[009] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения этап (d) включает подтверждение, что ретинальные клетки, посеянные во флаконы или планшеты для культур клеток, состоят из скоплений ретинальных клеток, состоящих из приблизительно от 1 до приблизительно 100 клеток.[009] In some embodiments of the methods of the invention, step (d) includes confirming that the retinal cells seeded in the cell culture flasks or plates consist of retinal cell aggregates consisting of from about 1 to about 100 cells.

[0010] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения антибиотиком, используемым для добавления в PBS или бессывороточную среду, является гентамицин. В некоторых вариантах осуществления антибиотик используется в концентрации от приблизительно 0 до приблизительно 10000 мкг/мл.[0010] In some embodiments of the methods of the invention, the antibiotic used to add to the PBS or serum-free medium is gentamicin. In some embodiments, the antibiotic is used at a concentration of from about 0 to about 10,000 μg/ml.

[0011] В изобретении предложены способы выделения первичных ретинальных клеток из человеческого образца, включающие: (a) выделение образца сетчатки, включающего множество первичных ретинальных клеток, из человеческого образца, где человеческий образец получен от человека-донора гестационного возраста от приблизительно 12 недель до приблизительно 28 недель, (b) механическую диссоциацию множества первичных ретинальных клеток в ретинальном образце, выделенном в этапе (a), без расщепления множество первичных ретинальных клеток протеазой, с получением в результате выделенной суспензии клеток и скоплений клеток, и (c) определение жизнеспособности, количества и морфологии первичных ретинальных клеток из образца сетчатки, где получают по меньшей мере 30×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток.[0011] The invention provides methods for isolating primary retinal cells from a human sample, comprising: (a) isolating a retinal sample comprising a plurality of primary retinal cells from a human sample, wherein the human sample is obtained from a human donor of a gestational age of from about 12 weeks to about 28 weeks, (b) mechanically dissociating the plurality of primary retinal cells in the retinal sample isolated in step (a), without protease digestion of the plurality of primary retinal cells, resulting in an isolated cell suspension and cell aggregates, and (c) determining viability, quantity and the morphology of primary retinal cells from the retinal sample, wherein at least 30×10 ⁶ viable primary retinal cells are obtained.

[0012] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения человеческий образец представляет собой одно или пару человеческих глазных яблок. В некоторых вариантах осуществления глазное яблоко(и) обладает нормальной морфологией, включающей интактное глазное яблоко(и), прозрачную роговицу, нормальную форму или любую комбинацию этого. В некоторых вариантах осуществления человеческий образец помещается в среду для транспортировки культуры клеток после изъятия у человека-донора перед этапом (a). В некоторых вариантах осуществления среда для транспортировки культуры клеток включает RPMI-1640 с L-глутамином или улучшенную DMEM/F12. В некоторых вариантах осуществления среда для транспортировки культуры клеток включает гентамицин в концентрации от приблизительно 0,5 до 50 микрограммов на миллилитр (мл), необязательно среда для транспортировки культуры клеток включает приблизительно 50 микрограммов на миллилитр гентамицина. В некоторых вариантах осуществления человеческий образец хранят приблизительно при 1-8°C непосредственно после помещения в среду для транспортировки культуры клеток, например, помещают в лед.[0012] In some embodiments of the methods of the invention, the human sample is one or a pair of human eyeballs. In some embodiments, the eyeball(s) have normal morphology, including intact eyeball(s), clear cornea, normal shape, or any combination thereof. In some embodiments, the human sample is placed in cell culture transport medium after removal from a human donor prior to step (a). In some embodiments, the cell culture transport medium includes RPMI-1640 with L-glutamine or enhanced DMEM/F12. In some embodiments, the cell culture transport medium includes gentamicin at a concentration of from about 0.5 to 50 micrograms per milliliter (mL), optionally the cell culture transport medium includes about 50 micrograms per milliliter of gentamicin. In some embodiments, the human sample is stored at approximately 1-8°C immediately after being placed in a cell culture transport medium, such as placed on ice.

[0013] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения человеческий образец используют в течение от приблизительно 7 до приблизительно 26 часов после изъятия у человека-донора.[0013] In some embodiments of the methods of the invention, the human sample is used within about 7 to about 26 hours after removal from the human donor.

[0014] В некоторых вариантах осуществления способов согласно настоящему описанию выделение образца сетчатки из человеческого образца в этапе (а) включает: (i) извлечение одного или пары человеческих глазных яблок из среды для транспортировки культуры, (ii) промывку одного или пары человеческих глазных яблок фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавкой антибиотика при температуре приблизительно 1-8°C, (iii) удаление зрительного нерва и мезенхимальной ткани из одного или пары человеческих глазных яблок, (iv) промывку одного или пары человеческих глазных яблок PBS с добавкой антибиотика при температуре приблизительно 1-8°C, (v) прокол каждого из одного или пары глазных яблок по краю роговицы с помощью иглы, (vi) круговой разрез по краю роговицы одного или пары человеческих глазных яблок, (vii) удаление хрусталика, роговицы и ассоциированного стекловидного тела из одного или пары человеческих глазных яблок, (viii) отделение сетчатки(ок) от слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) с получением отделенной сетчатки или пары отделенных сетчаток, и (ix) помещение отделенной сетчатки или пары отделенных сетчаток при температуре приблизительно 1-8°C в культуральную среду или PBS, где в культуральную среду или PBS добавлен антибиотик. В некоторых вариантах осуществления этап (ii) повторяют 1-5 раз или 3 раза. В некоторых вариантах осуществления в этапе (iii) удаляют некоторое количество или все экстраокулярные клетки.[0014] In some embodiments of the methods herein, isolating the retinal sample from the human sample in step (a) comprises: (i) removing one or a pair of human eyeballs from the culture transport medium, (ii) washing the one or pair of human eyeballs phosphate buffered saline (PBS) supplemented with antibiotic at approximately 1-8°C, (iii) removing optic nerve and mesenchymal tissue from one or a pair of human eyeballs, (iv) washing one or pair of human eyeballs with PBS supplemented with antibiotic at a temperature of approximately 1-8°C, (v) puncture each of one or a pair of human eyeballs along the edge of the cornea with a needle, (vi) a circular incision along the edge of the cornea of one or a pair of human eyeballs, (vii) removing the lens, cornea and associated vitreous from one or a pair of human eyeballs, (viii) separating the retina(s) from the retinal pigment epithelium (RPE) layer to produce a separated retina or pair of separated retinas, and (ix) placing the separated retina or pair of separated retinas at a temperature of approximately 1-8°C in culture medium or PBS, where the antibiotic is added to the culture medium or PBS. In some embodiments, step (ii) is repeated 1-5 times or 3 times. In some embodiments, step (iii) removes some or all of the extraocular cells.

[0015] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения механическая диссоциация множества первичных ретинальных клеток в этапе (b) включает: (i) перенос образца сетчатки в пробирку, (ii) механическую диссоциацию образца сетчатки с получением множества отделенных первичных ретинальных клеток, (iii) осаждение множества отделенных первичных ретинальных клеток с помощью центрифугирования и (iv) удаление супернатанта. В некоторых вариантах осуществления механическую диссоциацию сетчатки выполняют путем суспендирования с помощью стерильной пипетки. В некоторых вариантах осуществления суспендирование выполняют от 2 до 50 раз, от 2 до 10 раз или от 4 до 8 раз. В некоторых вариантах осуществления множество разделенных первичных ретинальных клеток осаждают с помощью центрифугирования приблизительно при 140×g в течение приблизительно 3 минут при 4°C. В некоторых вариантах осуществления способы включают промывку множества отделенных первичных ретинальных клеток культуральной средой или PBS с добавкой антибиотика после этапа (ii) и перед этапом (iii).[0015] In some embodiments of the methods of the invention, mechanical dissociation of the plurality of primary retinal cells in step (b) includes: (i) transferring the retinal sample into a tube, (ii) mechanically dissociating the retinal sample to obtain a plurality of separated primary retinal cells, (iii) sedimentation multiple separated primary retinal cells by centrifugation and (iv) removal of the supernatant. In some embodiments, mechanical dissociation of the retina is performed by suspension using a sterile pipette. In some embodiments, the suspension is performed 2 to 50 times, 2 to 10 times, or 4 to 8 times. In some embodiments, a plurality of separated primary retinal cells are pelleted by centrifugation at approximately 140×g for approximately 3 minutes at 4°C. In some embodiments, the methods include washing a plurality of separated primary retinal cells with culture medium or PBS supplemented with an antibiotic after step (ii) and before step (iii).

[0016] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения множество разделенные первичные ретинальные клетки включают одиночные клетки и скопления клеток.[0016] In some embodiments of the methods of the invention, the plurality of separated primary retinal cells includes single cells and cell clusters.

[0017] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения определение жизнеспособности, количества и морфологии первичных ретинальных клеток в этапе (c) включает: (i) ресуспендирование осажденных первичных ретинальных клеток из этапа (b) в охлажденной до приблизительно 1-8°C культуральной среде с добавкой антибиотика, (ii) посев множества отделенных ретинальных клеток в один или более флаконов или планшетов с покрытием для культур клеток, содержащих культуральную среду, где в среду для культивирования клеток необязательно добавлен антибиотик, (iii) инкубирование множества отделенных ретинальных клеток при 10-50°C, где инкубирование необязательно проходит при 37°C, и (iv) определение количества и жизнеспособности первичных ретинальных клеток и скоплений ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления количество и жизнеспособность первичных ретинальных клеток определяют с помощью счетчика клеток NC-200 при использовании метода подсчета агрегированных клеток, гемоцитометра или трипанового синего. В некоторых вариантах осуществления количество жизнеспособных первичных ретинальных клеток составляет от приблизительно 20×10⁶ до приблизительно 1×10⁹ жизнеспособных первичных ретинальных клеток или от приблизительно 73-147×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления процент жизнеспособных клеток от подсчитанных клеток составляет от приблизительно 10% до приблизительно 100% или от приблизительно 68% до приблизительно 85%.[0017] In some embodiments of the methods of the invention, determining the viability, number and morphology of primary retinal cells in step (c) includes: (i) resuspending the pelleted primary retinal cells from step (b) in a culture medium cooled to about 1-8°C with adding an antibiotic, (ii) seeding a plurality of separated retinal cells into one or more coated cell culture flasks or plates containing a culture medium, wherein an antibiotic is optionally added to the cell culture medium, (iii) incubating the plurality of separated retinal cells at 10-50 °C, where incubation is optionally at 37°C, and (iv) determining the number and viability of primary retinal cells and retinal cell aggregates. In some embodiments, the number and viability of primary retinal cells are determined using an NC-200 cell counter using the aggregate cell counting method, hemocytometer, or trypan blue. In some embodiments, the number of viable primary retinal cells is from about 20×10 ⁶ to about 1×10 ⁹ viable primary retinal cells, or from about 73-147×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the percentage of viable cells of the cells counted is from about 10% to about 100%, or from about 68% to about 85%.

[0018] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения посев во флаконы или планшеты производят в этапе (ii) с использованием от приблизительно 1 до приблизительно 1000000000 клеток.[0018] In some embodiments of the methods of the invention, seeding into flasks or plates is performed in step (ii) using from about 1 to about 1000000000 cells.

[0019] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения множество отделенных ретинальных клеток инкубируют при: (1) приблизительно 37°C в атмосфере с содержанием 0-30% CO₂ и 0-50% O₂; (2) приблизительно 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 20%; или (3) приблизительно 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 3%. В некоторых вариантах осуществления множество отделенных ретинальных клеток инкубируют при 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 3%.[0019] In some embodiments of the methods of the invention, a plurality of separated retinal cells are incubated at: (1) approximately 37°C in an atmosphere containing 0-30% CO ₂ and 0-50% O ₂ ; (2) approximately 37°C in an atmosphere containing less than or equal to 5% CO ₂ and less than or equal to 20% O ₂ ; or (3) approximately 37°C in an atmosphere containing less than or equal to 5% CO ₂ and less than or equal to 3% O ₂ . In some embodiments, the plurality of separated retinal cells are incubated at 37°C in an atmosphere containing less than or equal to 5% CO ₂ and less than or equal to 3% O ₂ .

[0020] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения определение жизнеспособности, количества и морфологии первичных ретинальных клеток в этапе (c) включает: (i) визуальное исследование множества отделенных ретинальных клеток под микроскопом и (ii) подтверждение, что множество ретинальных клеток, посеянных во флаконы или планшеты для культур клеток, включает группы скоплений ретинальных клеток, состоящие от приблизительно 2 до приблизительно 1000 клеток.[0020] In some embodiments of the methods of the invention, determining the viability, number and morphology of primary retinal cells in step (c) includes: (i) visually examining the plurality of separated retinal cells under a microscope and (ii) confirming that the plurality of retinal cells seeded in the vials or cell culture plates, includes groups of retinal cell clusters consisting of from about 2 to about 1000 cells.

[0021] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения бессывороточная среда включает: (a) улучшенную DMEM/F12, (b) добавку N-2, (c) EGF (рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека), (d) bFGF (основной фактор роста фибробластов) и/или (e) GlutaMAX I.[0021] In some embodiments of the methods of the invention, the serum-free medium includes: (a) enhanced DMEM/F12, (b) N-2 supplement, (c) EGF (recombinant human epidermal growth factor), (d) bFGF (basic fibroblast growth factor ) and/or (e) GlutaMAX I.

[0022] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения культуральная среда не содержит сыворотку. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает полную среду. В некоторых вариантах осуществления среда включает среду Игла в модификации Дульбекко DMEM/F12, улучшенную DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, Нейробазальную среду, ReNcell или среду Ultraculture. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает улучшенную DMEM/F12. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает добавку N-2 и GlutaMAX-I. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает B27, B27 XenoFree или Stempro. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает добавки, поддерживающие выживание или рост клеток. В некоторых вариантах осуществления добавки, поддерживающие выживание или рост клеток, выбраны из группы, состоящей из L-глутамина, рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), других факторов роста и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антибиотик включает гентамицин в концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мкг/мл, где концентрация гентамицина необязательно составляет приблизительно 30 мкг/мл.[0022] In some embodiments of the methods of the invention, the culture medium does not contain serum. In some embodiments, the culture medium includes complete medium. In some embodiments, the medium includes Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMEM/F12, Enhanced DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, Neurobasal Medium, ReNcell, or Ultraculture Medium. In some embodiments, the culture medium includes enhanced DMEM/F12. In some embodiments, the culture medium includes N-2 supplement and GlutaMAX-I. In some embodiments, the culture medium includes B27, B27 XenoFree, or Stempro. In some embodiments, the culture medium includes additives that support cell survival or growth. In some embodiments, the supplements that support cell survival or growth are selected from the group consisting of L-glutamine, recombinant human epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), other growth factors, and combinations thereof. In some embodiments, the antibiotic comprises gentamicin at a concentration of from about 0.5 to about 50 μg/ml, where the concentration of gentamicin is optionally about 30 μg/ml.

[0023] В изобретении предложен способ культивирования выделенных первичных человеческих ретинальных клеток для получения популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, включающий: (a) культивирование суспензии выделенных первичных ретинальных клеток в бессывороточной среде в культуральных флаконах или планшетах, покрытых не содержащим ксеногенных компонентов (xeno-free) фибронектином, орнитином, полилизином или ламинином, при стандартных уровнях кислорода в течение приблизительно 4-6 пассажей, (b) последующее культивирование суспензии в бессывороточной среде при низких уровнях кислорода в течение приблизительно 3-6 пассажей, где клетки пассируют при конфлюентности от 40% до 90% и обрабатывают ферментом при каждом пассаже для диссоциации клеток и добавления свежей культуральной среды, и (c) последующую криоконсервацию клеток, с получением в результате популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников.[0023] The invention provides a method for culturing isolated primary human retinal cells to obtain a population of non-immortalized human retinal progenitor cells, comprising: (a) culturing a suspension of isolated primary retinal cells in a serum-free medium in culture flasks or plates coated with a non-xeno -free) fibronectin, ornithine, polylysine or laminin, at standard oxygen levels for approximately 4-6 passages, (b) subsequent culture of the suspension in serum-free medium at low oxygen levels for approximately 3-6 passages, where the cells are passaged at confluency from 40% to 90% and treated with enzyme at each passage to dissociate the cells and add fresh culture medium, and (c) subsequent cryopreservation of the cells, resulting in a population of non-immortalized human retinal progenitor cells.

[0024] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения, после последующего культивирования суспензии при низких уровнях кислорода, клеткам позволяют расти без пассирования в течение некоторого периода времени при стандартных уровнях кислорода. В некоторых вариантах осуществления период времени между пассажами составляет 3-5 дней (например, 3, 4 или 5 дней).[0024] In some embodiments of the methods of the invention, after subsequent suspension culture at low oxygen levels, the cells are allowed to grow without passaging for a period of time at standard oxygen levels. In some embodiments, the time period between passages is 3-5 days (eg, 3, 4, or 5 days).

[0025] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения ферментативный раствор, используемый для разделения клеток, включает трипсин или эквивалент. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют в первом пассаже с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, и ЭДТА в соотношении приблизительно 1:4. В некоторых вариантах осуществления трипсин или эквивалент и ЭДТА присутствуют в соотношении приблизительно 1:3, 1:3,1, 1:3,2, 1:3,3, 1:3,4, 1:3,5, 1:3,6, 1:3,7, 1:3,8, 1:3,9, 1:4,0, 1:4,1, 1:4,2, 1:4,3, 1:4,4, 1:4,5, 1:4,6, 1:4,7, 1:4,8, 1:4,9 или 1:5,0 в первом пассаже. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют в первом пассаже с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS в соотношении приблизительно 1:1:3. В некоторых вариантах осуществления трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении приблизительно 1:1:2, 1:1:2,1, 1:1:2,2, 1:1:2,3, 1:1:2,4, 1:1:2,5, 1:1:2,6, 1:1:2,7, 1:1:2,8, 1:1:2,9, 1:1:3,0, 1:1:3,1, 1:1:3,2, 1:1:3,3, 1:1:3,4, 1:1:3,5, 1:1:3,6, 1:1:3,7, 1:1:3,8, 1:1:3,9 или 1:1:4,0 в первом пассаже. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют в первом пассаже в течение 6-10 минут приблизительно при 37°C. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют во втором пассаже с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS в соотношении приблизительно 1:1:3. В некоторых вариантах осуществления трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении приблизительно 1:1:2, 1:1:2,1, 1:1:2,2, 1:1:2,3, 1:1:2,4, 1:1:2,5, 1:1:2,6, 1:1:2,7, 1:1:2,8, 1:1:2,9, 1:1:3,0, 1:1:3,1, 1:1:3,2, 1:1:3,3, 1:1:3,4, 1:1:3,5, 1:1:3,6, 1:1:3,7, 1:1:3,8, 1:1:3,9 или 1:1:4,0 во втором пассаже. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют во втором пассаже с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент и ЭДТА в соотношении приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления, трипсин или эквивалент и ЭДТА присутствуют в соотношении приблизительно 1:0,5, 1:0,6, 1:0,7, 1:0,8, 1:0,9, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4 или 1:1,5 во втором пассаже. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют во втором пассаже в течение 4-8 минут приблизительно при 37°C. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют в третьем пассаже и всех последующих пассажах с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент и ЭДТА в соотношении приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления трипсин или эквивалент и ЭДТА присутствуют в соотношении приблизительно 1:0,5, 1:0,6, 1:0,7, 1:0,8, 1:0,9, 1:1, 1:1,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4 или 1:1,5 в третьем и всех последующих пассажах. В некоторых вариантах осуществления клетки разделяют в третьем и всех последующих пассажах в течение 4-8 минут при 37°C. В некоторых вариантах осуществления трипсин или эквивалент включает TrypLE, например TrypLE Express или TrypLE Select. В некоторых вариантах осуществления диссоциацию останавливают добавлением избытка DMEM или PBS. В некоторых вариантах осуществления количество и жизнеспособность клеток определяют после диссоциации. В некоторых вариантах осуществления количество и жизнеспособность клеток определяют с помощью счетчика клеток NC-200.[0025] In some embodiments of the methods of the invention, the enzymatic solution used to separate cells includes trypsin or equivalent. In some embodiments, the cells are separated in the first passage using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent and EDTA in a ratio of approximately 1:4. In some embodiments, trypsin or equivalent and EDTA are present in a ratio of approximately 1:3, 1:3.1, 1:3.2, 1:3.3, 1:3.4, 1:3.5, 1:3 ,6, 1:3.7, 1:3.8, 1:3.9, 1:4.0, 1:4.1, 1:4.2, 1:4.3, 1:4.4 , 1:4.5, 1:4.6, 1:4.7, 1:4.8, 1:4.9 or 1:5.0 in the first passage. In some embodiments, the cells are separated in the first passage using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent, EDTA and DPBS in a ratio of approximately 1:1:3. In some embodiments, trypsin or equivalent, EDTA and DPBS are present in a ratio of approximately 1:1:2, 1:1:2.1, 1:1:2.2, 1:1:2.3, 1:1:2 ,4, 1:1:2.5, 1:1:2.6, 1:1:2.7, 1:1:2.8, 1:1:2.9, 1:1:3.0 , 1:1:3.1, 1:1:3.2, 1:1:3.3, 1:1:3.4, 1:1:3.5, 1:1:3.6, 1 :1:3.7, 1:1:3.8, 1:1:3.9 or 1:1:4.0 in the first passage. In some embodiments, the cells are separated in the first passage for 6-10 minutes at approximately 37°C. In some embodiments, the cells are separated in a second passage using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent, EDTA and DPBS in a ratio of approximately 1:1:3. In some embodiments, trypsin or equivalent, EDTA and DPBS are present in a ratio of approximately 1:1:2, 1:1:2.1, 1:1:2.2, 1:1:2.3, 1:1:2 ,4, 1:1:2.5, 1:1:2.6, 1:1:2.7, 1:1:2.8, 1:1:2.9, 1:1:3.0 , 1:1:3.1, 1:1:3.2, 1:1:3.3, 1:1:3.4, 1:1:3.5, 1:1:3.6, 1 :1:3.7, 1:1:3.8, 1:1:3.9 or 1:1:4.0 in the second passage. In some embodiments, the cells are separated in a second passage using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent and EDTA in a ratio of approximately 1:1. In some embodiments, trypsin or equivalent and EDTA are present in a ratio of approximately 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1, 1: 1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4 or 1:1.5 in the second passage. In some embodiments, the cells are separated in a second passage for 4-8 minutes at approximately 37°C. In some embodiments, cells are separated at the third passage and all subsequent passages using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent and EDTA in a ratio of approximately 1:1. In some embodiments, trypsin or equivalent and EDTA are present in a ratio of approximately 1:0.5, 1:0.6, 1:0.7, 1:0.8, 1:0.9, 1:1, 1:1 ,1, 1:1,2, 1:1,3, 1:1,4 or 1:1,5 in the third and all subsequent passages. In some embodiments, cells are separated in the third and all subsequent passages for 4-8 minutes at 37°C. In some embodiments, trypsin or equivalent includes TrypLE, such as TrypLE Express or TrypLE Select. In some embodiments, the dissociation is stopped by adding excess DMEM or PBS. In some embodiments, cell number and viability are determined after dissociation. In some embodiments, cell number and viability are determined using an NC-200 cell counter.

[0026] В изобретении предложены способы культивирования выделенных первичных человеческих ретинальных клеток для получения популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, где способы включают: (а) посев в одной или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральную среду, в первом пассаже множества первичных ретинальных клеток, полученных способом, описанным в настоящем документе, с получением множества культивируемых ретинальных клеток; (b) посев в одной или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральную среду, во втором пассаже множества культивируемых ретинальных клеток, полученных в первом пассаже; (c) посев в одну или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральную среду, в третьей пассаже множества культивируемых ретинальных клеток, полученных во втором пассаже; и (d) криоконсервацию множества культивируемых ретинальных клеток, где одну или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием засевают при плотности от приблизительно 1×10⁴ клеток на квадратный сантиметр (см²) до приблизительно 2×10⁶ клеток/см², плотность посева при первом пассаже больше, чем плотность посева при втором пассаже, и плотность посева во втором пассаже больше, чем плотность посева в третьем пассаже, с получением в результате популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников.[0026] The invention provides methods for culturing isolated primary human retinal cells to obtain a population of non-immortalized human retinal progenitor cells, where the methods include: (a) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture medium in the first passage of the set primary retinal cells obtained by the method described herein to obtain a plurality of cultured retinal cells; (b) seeding in one or more culture flasks or coated plates containing culture medium, in a second passage, a plurality of cultured retinal cells obtained in the first passage; (c) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture medium in the third passage of a plurality of cultured retinal cells obtained in the second passage; and (d) cryopreserving a plurality of cultured retinal cells, wherein one or more culture flasks or coated plates are seeded at a density of from about 1 x 10 ⁴ cells per square centimeter (cm ² ) to about 2 x 10 ⁶ cells/cm ² seeding density at the first passage is greater than the seeding density at the second passage, and the seeding density at the second passage is greater than the seeding density at the third passage, resulting in a population of non-immortalized human retinal progenitor cells.

[0027] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения способы дополнительно включают посев в одну или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральную среду, в одном или более последующих пассажах множества культивируемых ретинальных клеток, полученных в непосредственно предшествующем пассаже.[0027] In some embodiments of the methods of the invention, the methods further comprise seeding one or more culture flasks or coated plates containing the culture medium in one or more subsequent passages of a plurality of cultured retinal cells obtained in the immediately preceding passage.

[0028] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения культуральные флаконы или планшеты покрыты не содержащим ксеногенных компонентов фибронектином, орнитином, полилизином, ламинином или их комбинацией.[0028] In some embodiments of the methods of the invention, culture flasks or plates are coated with xenogeneic-free fibronectin, ornithine, polylysine, laminin, or a combination thereof.

[0029] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения множество первичных или культивируемых ретинальных клеток культивируют при: (1) приблизительно 37°C в атмосфере, содержащей 0-30% CO₂ и 0-50% O₂, (2) приблизительно 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и содержанием O₂ меньше или равным 20%; или (3) приблизительно 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и содержанием O₂ меньше или равным 3%. В некоторых вариантах осуществления множество первичных или культивируемых ретинальных клеток культивируют приблизительно при 37°C в атмосфере с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и содержанием O₂ меньше или равным 3%. В некоторых вариантах осуществления период времени между двумя последовательными пассажами составляет 2-8 дней, 3-6 дней, 4-5 дней или 3-4 дня. В некоторых вариантах осуществления период времени между двумя последовательными пассажами составляет 3-4 дня.[0029] In some embodiments of the methods of the invention, a plurality of primary or cultured retinal cells are cultured at: (1) approximately 37°C in an atmosphere containing 0-30% CO ₂ and 0-50% O ₂ , (2) approximately 37°C in an atmosphere with a CO ₂ content of less than or equal to 5% and an O ₂ content of less than or equal to 20%; or (3) approximately 37°C in an atmosphere with a CO ₂ content of less than or equal to 5% and an O ₂ content of less than or equal to 3%. In some embodiments, a plurality of primary or cultured retinal cells are cultured at approximately 37°C in an atmosphere of less than or equal to 5% CO ₂ and less than or equal to 3% O ₂ . In some embodiments, the time period between two consecutive passages is 2-8 days, 3-6 days, 4-5 days, or 3-4 days. In some embodiments, the time period between two consecutive passages is 3-4 days.

[0030] В некоторых вариантах осуществления способов согласно изобретению множество первичных ретинальных клеток разделяют в первом пассаже с использованием первого ферментативного раствора, содержащего: (1) трипсин или его эквивалент и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), или (2) трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS. В некоторых вариантах осуществления эквивалентом трипсина является TrypLE. В некоторых вариантах осуществления (1) TrypLE и ЭДТА присутствуют в соотношении 1:4 в первом ферментативном растворе или (2) TrypLE, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении 1:1:3. В некоторых вариантах осуществления множество первичных ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-20 минут, приблизительно 6-10 минут или приблизительно 7-8 минут, приблизительно при 37°C. В некоторых вариантах осуществления множество первичных ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 7-8 минут, приблизительно при 37°C.[0030] In some embodiments of the methods of the invention, a plurality of primary retinal cells are separated in a first passage using a first enzymatic solution containing: (1) trypsin or equivalent and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), or (2) trypsin or equivalent, EDTA and D.P.B.S. In some embodiments, the trypsin equivalent is TrypLE. In some embodiments, (1) TrypLE and EDTA are present in a 1:4 ratio in the first enzyme solution or (2) TrypLE, EDTA and DPBS are present in a 1:1:3 ratio. In some embodiments, a plurality of primary retinal cells are separated for about 5-20 minutes, about 6-10 minutes, or about 7-8 minutes, at about 37°C. In some embodiments, a plurality of primary retinal cells are separated within approximately 7-8 minutes, at approximately 37°C.

[0031] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения множество культивируемых ретинальных клеток разделяют во втором пассаже с использованием второго ферментативного раствора, включающего: (1) трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS, или (2) трипсин или эквивалент и DPBS. В некоторых вариантах осуществления эквивалентом трипсина является TrypLE. В некоторых вариантах осуществления (1) TrypLE, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении 1:1:3 во втором ферментативном растворе, или (2) TrypLE и DPBS присутствуют в отношении 1:1 во втором ферментативном растворе. В некоторых вариантах осуществления множество культивируемых ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-20 минут, приблизительно 6-10 минут или приблизительно 7-8 минут, приблизительно при 37°C. В некоторых вариантах осуществления множество культивируемых ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-6 минут приблизительно при 37°C.[0031] In some embodiments of the methods of the invention, a plurality of cultured retinal cells are separated in a second passage using a second enzymatic solution comprising: (1) trypsin or equivalent, EDTA and DPBS, or (2) trypsin or equivalent and DPBS. In some embodiments, the trypsin equivalent is TrypLE. In some embodiments, (1) TrypLE, EDTA, and DPBS are present in a 1:1:3 ratio in the second enzyme solution, or (2) TrypLE and DPBS are present in a 1:1 ratio in the second enzyme solution. In some embodiments, the plurality of cultured retinal cells are separated for about 5-20 minutes, about 6-10 minutes, or about 7-8 minutes, at about 37°C. In some embodiments, a plurality of cultured retinal cells are separated for about 5-6 minutes at approximately 37°C.

[0032] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения множество культивируемых ретинальных клеток разделяют по меньшей мере в третьем или последующем пассаже с использованием третьего ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент и DPBS. В некоторых вариантах осуществления эквивалент трипсина включает TrypLE. В некоторых вариантах осуществления TrypLE и DPBS присутствуют в соотношении 1:1 в третьем ферментативном растворе. В некоторых вариантах осуществления множество культивируемых ретинальных клеток разделяют в течение приблизительно 5-10 минут или приблизительно 5-7 минут приблизительно при 37°C по меньшей мере в третьем или последующем пассаже. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере третий или последующий пассаж включает 3-5 пассажей.[0032] In some embodiments of the methods of the invention, a plurality of cultured retinal cells are separated in at least a third or subsequent passage using a third enzymatic solution comprising trypsin or equivalent and DPBS. In some embodiments, the trypsin equivalent includes TrypLE. In some embodiments, TrypLE and DPBS are present in a 1:1 ratio in the third enzyme solution. In some embodiments, the plurality of cultured retinal cells are separated for about 5-10 minutes or about 5-7 minutes at about 37°C in at least the third or subsequent passage. In some embodiments, at least the third or subsequent passage includes 3-5 passages.

[0033] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения способы включают определение количества и жизнеспособности клеток после разделения множества культивируемых ретинальных клеток после второго пассажа. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% клеток являются жизнеспособными.[0033] In some embodiments of the methods of the invention, the methods include determining the number and viability of cells after separating a plurality of cultured retinal cells after a second passage. In some embodiments, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the cells are viable.

[0034] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения c клетки сеют в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/см² в первом пассаже, от приблизительно 0,1×10⁶ до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/см² во втором пассаже, от приблизительно 0,03×10⁶ до приблизительно 0,2×10⁶ клеток/см² в третьем пассаже и от приблизительно 10000 до приблизительно 60000 клеток/см² в четвертом и последующих пассажах.[0034] In some embodiments of the methods of the invention, c cells are seeded into culture flasks or plates at a density of from about 0.5 x 10 ⁶ to about 3.0 x 10 ⁶ cells/cm ² in the first passage, from about 0.1 x 10 ⁶ to about 0.5 x 10 ⁶ cells/cm ² in the second passage, from about 0.03 x 10 ⁶ to about 0.2 x 10 ⁶ cells/cm ² in the third passage, and from about 10,000 to about 60,000 cells/cm ² in the fourth and subsequent passages.

[0035] В изобретении предложены способы криоконсервации ретинальных клеток-предшественников, полученных с применением способов изобретения, включающие: (i) ферментативное разделение клеток с использованием трипсина, (ii) остановку диссоциации избытком культуральной среды или улучшенной DMEM/F12, (iii) центрифунгирование клеток с ускорением от 10×g до 10000×g в течение 1-30 минут, (iv) ресуспендирование клеток в культуральной среде и определение общего количества и жизнеспособности клеток, (v) добавление среды для криоконсервации с получением конечной концентрации диметилсульфоксида (ДМСО) от 5 до 30%, (vi) деление множества клеток на аликвоты в каждый криофлакон, (vii) замораживание каждого флакона при использовании программируемого криозамораживателя (CRF) и (viii) помещение каждого флакона с клетками в жидкий N₂.[0035] The invention provides methods for the cryopreservation of retinal progenitor cells obtained using the methods of the invention, including: (i) enzymatic separation of cells using trypsin, (ii) arresting dissociation with excess culture medium or improved DMEM/F12, (iii) centrifugation of cells with acceleration from 10×g to 10,000×g for 1-30 minutes, (iv) resuspension of cells in culture medium and determination of total cell number and viability, (v) addition of cryopreservation medium to obtain a final concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) of 5 up to 30%, (vi) aliquoting multiple cells into each cryovial, (vii) freezing each vial using a programmable cryofreezer (CRF), and (viii) placing each vial of cells in liquid N ₂ .

[0036] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения этап криоконсервации выполняют путем: (a) ферментативного разделения клеток при использовании 1:1 трипсина или эквивалента и DPBS, (b) остановки диссоциации избытком DMEM или PBS, (c) осаждения клеток с помощью центрифугирования при 10-10000 g в течение 1-30 минут, (d) ресуспендирования клеток в бессывороточной среде и определения общего количества и жизнеспособности клеток, (e) добавления среды для криоконсервации с получением конечной концентрации ДМСО от 5 до 30%, (f) деление клеток на аликвоты по 0,2-100×10⁶ клеток в каждый криофлакон, (g) замораживания каждого флакона при -80°C в течение 6-72 часов и (h) помещения каждого флакона с клетками в жидкий N₂.[0036] In some embodiments of the methods of the invention, the cryopreservation step is performed by: (a) enzymatic cell separation using 1:1 trypsin or equivalent and DPBS, (b) arresting dissociation with excess DMEM or PBS, (c) pelleting cells by centrifugation at 10-10,000 g for 1-30 minutes, (d) resuspending cells in serum-free medium and determining total cell number and viability, (e) adding cryopreservation medium to obtain a final DMSO concentration of 5 to 30%, (f) cell division aliquot 0.2-100×10 ⁶ cells into each cryovial, (g) freezing each vial at -80°C for 6-72 hours and (h) placing each vial of cells in liquid N ₂ .

[0037] В некоторых вариантах осуществления способов криоконсервации согласно изобретению эквивалент трипсина в этапе (i) включает TrypLE. В некоторых вариантах осуществления среда для криоконсервации включает культуральную среду и 10% ДМСО. В некоторых вариантах осуществления множество клеток в этапе (vi) составляет от приблизительно 0,5×10⁶ до 50×10⁶ клеток на криофлакон или от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток на мл культуральной среды и ДМСО.[0037] In some embodiments of the cryopreservation methods of the invention, the trypsin equivalent in step (i) includes TrypLE. In some embodiments, the cryopreservation medium includes culture medium and 10% DMSO. In some embodiments, the cell count in step (vi) is from about 0.5 x 10 ⁶ to about 50 x 10 ⁶ cells per cryofialk or from about 0.5 x 10 ⁶ to about 20 x 10 ⁶ cells per ml of culture medium and DMSO .

[0038] В некоторых вариантах осуществления способов изобретения клетки и/или скопления клеток культивируют вместе с добавками, которые поддерживают выживание или рост клеток. В некоторых вариантах осуществления добавки, которые поддерживают выживание или рост клеток, выбраны из группы, состоящей из L-глутамина, человеческих рекомбинантных факторов роста, состоящих из EGF и bFGF (Invitrogen) и других факторов роста.[0038] In some embodiments of the methods of the invention, cells and/or cell aggregates are cultured along with additives that support cell survival or growth. In some embodiments, supplements that support cell survival or growth are selected from the group consisting of L-glutamine, human recombinant growth factors consisting of EGF and bFGF (Invitrogen), and other growth factors.

[0039] В альтернативных вариантах осуществления предложены фармацевтические композиции, включающие ретинальную клетку-предшественника или популяцию или множество неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, выделенных способом согласно любому из предыдущих пунктов, и необязательно также включающие фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.[0039] In alternative embodiments, pharmaceutical compositions are provided comprising a retinal progenitor cell or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells isolated by a method according to any of the preceding paragraphs, and optionally also including a pharmaceutically acceptable excipient.

[0040] В альтернативных вариантах осуществления в настоящем документе предложены наборы, включающие ретинальную клетку-предшественника или популяцию или множество неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, выделенных способом согласно любому из предыдущих пунктов.[0040] In alternative embodiments, provided herein are kits comprising a retinal progenitor cell or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells isolated by a method according to any of the preceding paragraphs.

[0041] В альтернативных вариантах осуществления предложены способы лечения, уменьшения тяжести или предупреждения заболевания или патологии сетчатки, улучшения фотопического (дневного) зрения, улучшения коррекции остроты зрения, улучшения функции желтого пятна, улучшения поля зрения или улучшения скотопического (ночного) зрения, включающие: (a) введение или уже выполненное введение нуждающемуся в этом индивиду ретинальной клетки-предшественника или популяции или множества неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, выделенных способом согласно любому из предыдущих пунктов; или (b) (i) получение или использование уже полученной ретинальной клетки-предшественника или популяции или множества неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, выделенных способом согласно любому из предыдущих пунктов; и (ii) введение или уже выполненное введение ретинальной клетки-предшественника или популяции или множества неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников нуждающемуся в этом индивиду.[0041] In alternative embodiments, methods are provided for treating, reducing the severity of, or preventing a retinal disease or pathology, improving photopic (daytime) vision, improving corrected visual acuity, improving macular function, improving visual field, or improving scotopic (night) vision, including: (a) administering or having administered to an individual in need thereof a retinal progenitor cell or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells isolated by the method of any of the preceding paragraphs; or (b) (i) obtaining or using an already obtained retinal progenitor cell or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells isolated by a method according to any of the preceding paragraphs; and (ii) administering, or having already administered, a retinal progenitor cell or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells to an individual in need thereof.

[0042] В альтернативных вариантах осуществления предложены применения ретинальной клетки-предшественника или популяции или множества неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, выделенных способом согласно любому из предыдущих пунктов, при производстве лекарственного средства для лечения, уменьшения тяжести или предупреждения заболевания или патологии сетчатки, улучшения фотопического (дневного) зрения, улучшения коррекции остроты зрения, улучшения функции желтого пятна, улучшения поля зрения или улучшения скотопического (ночного) зрения.[0042] Alternative embodiments provide the use of a retinal progenitor cell or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells isolated by a method according to any of the preceding paragraphs in the manufacture of a medicament for treating, reducing the severity or preventing a retinal disease or pathology, improving photopic (daytime) vision, improved corrected visual acuity, improved macular function, improved visual field, or improved scotopic (night) vision.

[0043] В альтернативных вариантах осуществления предложены ретинальные клетки-предшественники или популяция или множество неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, выделенные способом согласно любому из предыдущих пунктов, для применения при лечении, уменьшении тяжести или предупреждении заболевания или патологии сетчатки, улучшении фотопического (дневного) зрения, улучшении коррекции остроты зрения, улучшении функции желтого пятна, улучшении поля зрения или улучшении скотопического (ночного) зрения.[0043] In alternative embodiments, retinal progenitor cells or a population or plurality of non-immortalized human retinal progenitor cells isolated by a method according to any of the preceding paragraphs are provided for use in treating, reducing the severity of, or preventing retinal disease or pathology, improving photopic (daylight) vision, improved corrected visual acuity, improved macular function, improved visual field, or improved scotopic (night) vision.

[0044] Любой из представленных выше аспектов можно комбинировать с любым другим аспектом настоящего изобретения.[0044] Any of the above aspects can be combined with any other aspect of the present invention.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0045] ФИГ. 1 представляет собой линейную диаграмму, на которой показано среднее количество ретинальных клеток-предшественников при каждом пассаже. Ретинальные клетки-предшественники выделяли из образцов глазного яблока с использованием протокола A или протокола B и обрабатывали либо в тот же день (7 часов, 8 часов), либо после транспортировки в течение ночи (24 часа). P означает номер пассажа; d означает номер дня. Точки данных представляют собой теоретический расчет среднего количества всех ретинальных клеток-предшественников, выделенных с использованием одного и того же протокола и культивируемых в одинаковых условиях.[0045] FIG. 1 is a line graph showing the average number of retinal progenitor cells at each passage. Retinal progenitor cells were isolated from eyeball samples using Protocol A or Protocol B and processed either same day (7 hours, 8 hours) or after overnight transport (24 hours). P means passage number; d means day number. Data points represent a theoretical calculation of the average number of all retinal progenitor cells isolated using the same protocol and cultured under the same conditions.

[0046] ФИГ. 2 является таблицей, описывающей условия эксперимента и условия пассажа с использованием Протокола B и сравнивающей их с предыдущим способом культивирования (Протокол A). P означает номер пассажа; d означает номер дня; T означает TrypLE Select (Invitrogen); E означает ЭДТА (Invitrogen); P означает фосфатно-солевой буферный раствор по Дульбекко или DPBS (Invitrogen).[0046] FIG. 2 is a table describing the experimental conditions and passage conditions using Protocol B and comparing them with the previous culture method (Protocol A). P means passage number; d means day number; T stands for TrypLE Select (Invitrogen); E is for EDTA (Invitrogen); P stands for Dulbecco's phosphate buffered saline or DPBS (Invitrogen).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

[0047] При транспортировке фетальных глазных яблок (и ассоциированной ткани сетчатки) во льду на большие расстояния время транспортировки может быть довольно значительным. В течение этого времени ткань сетчатки становится все более хрупкой, при этом потенциальная жизнеспособность формирующих ее клеток постепенно снижается. Это создает проблему для производства клеток, когда ткань необходимо получать из удаленной точки, поскольку на получение конечного продукта (в течение любого установленного времени в культуре) влияет количество жизнеспособных клеток, полученных из каждой сетчатки. Однако преимуществом повышенной хрупкости ткани можно воспользоваться и исключить некоторые этапы, которые в ином случае использовались бы для выделения клеток сетчатки. В частности, можно исключить использование трипсина для разрушения ткани сетчатки, так как ткань можно разрушить всего лишь при осторожном суспендировании. Такую операцию легче выполнить, и она сокращает время, затрачиваемое от получения ткани до помещения в инкубатор. Кроме того, использование ЭДТА во время первичного пассирования также снижает нагрузку на клетки в этот критический период при их восстановлении в культуре. При разделении сетчатки на более мелкие фрагменты в ходе последовательных пассажей без попыток разделить их на отдельные клетки на более поздних этапах процесса, жизнеспособность повышается еще больше, и выполнение процесса становится менее рискованным. По мере повышения жизнеспособности клеток трипсин можно систематически вводить в процесс пассирования без отрицательного влияния на выход.[0047] When transporting fetal eyeballs (and associated retinal tissue) in ice over long distances, transport times can be quite significant. During this time, the retinal tissue becomes increasingly fragile, and the potential viability of the cells that form it gradually decreases. This poses a problem for cell production when tissue must be obtained from a distant location, since the final product (for any given time in culture) is affected by the number of viable cells obtained from each retina. However, it is possible to take advantage of the increased fragility of the tissue and eliminate some of the steps that would otherwise be used to isolate retinal cells. In particular, the use of trypsin to destroy retinal tissue can be ruled out, since the tissue can only be destroyed by careful suspension. This operation is easier to perform and reduces the time taken from tissue receipt to placement in the incubator. In addition, the use of EDTA during primary passaging also reduces the stress on cells during this critical period during their recovery in culture. By dividing the retina into smaller fragments over successive passages without attempting to separate them into individual cells later in the process, viability is further enhanced and the process becomes less risky to perform. As cell viability increases, trypsin can be systematically introduced into the passaging process without negatively affecting yield.

[0048] В частности, если исходная ткань подвергается значительно более длительному времени транспортировки, чем это было ранее, это может отрицательно влиять на ожидаемый выход клеток. Тогда как непосредственно бороться с изменениями в ткани может быть сложно, протокол выделения и раннего культивирования клеток может быть изменен, чтобы устранить источники потери клеток и, таким образом, повысить конечный выход.[0048] In particular, if the source tissue is subjected to significantly longer transport times than previously experienced, this may negatively impact the expected cell yield. While it may be difficult to directly address tissue changes, the cell isolation and early culture protocol can be modified to eliminate sources of cell loss and thus improve final yield.

[0049] Способы выделения ретинальных клеток, описанные в настоящем документе, обладают множеством преимуществ по сравнению с предыдущими способами, в которых существует длительный временной интервал между получением ткани и началом культивирования ткани. Способы, описанные в настоящем документе, обладают преимуществами, которые включают, без ограничения перечисленным: (1) улучшенный выход, (2) простоту выполнения, поскольку исключается ферментативная стадия, (3) более низкий риск лизиса клеток с выходом ДНК и связанной с этим потерей клеток, (4) более быстрый процесс от выделения ткани до инкубатора и (5) повышение жизнеспособности клеток во время раннего пассирования.[0049] The methods for isolating retinal cells described herein have many advantages over previous methods in which there is a long time interval between tissue acquisition and the start of tissue culture. The methods described herein have advantages that include, but are not limited to: (1) improved yield, (2) ease of execution since an enzymatic step is eliminated, (3) lower risk of cell lysis with DNA release and associated loss cells, (4) faster process from tissue isolation to incubator, and (5) increased cell viability during early passaging.

ОпределенияDefinitions

[0050] Для облегчения понимания данного описания ниже определен ряд терминов. Терминология в настоящем документе используется для описания конкретных вариантов осуществления изобретения, описанного в настоящем документе, но при этом ее использование не ограничивает изобретение, за исключением представленного в формуле изобретения.[0050] To facilitate understanding of this description, a number of terms are defined below. The terminology herein is used to describe specific embodiments of the invention described herein, but its use does not limit the invention except as set forth in the claims.

[0051] Любой из аспектов и вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, можно комбинировать с любым другим аспектом или вариантом осуществления, как раскрыто в настоящем документе.[0051] Any of the aspects and embodiments described herein can be combined with any other aspect or embodiment as disclosed herein.

[0052] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое обычно известно среднему специалисту в области, к которой относится изобретение. Хотя другие исследования, композиции, способы и наборы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут применяться при практической реализации настоящего изобретения, в настоящем документе описаны примерные материалы и способы. Следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена исключительно для описания конкретных аспектов и не служит для ограничения.[0052] Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly known to one of ordinary skill in the art to which the invention relates. Although other studies, compositions, methods and kits similar or equivalent to those described herein may be used in the practice of the present invention, exemplary materials and methods are described herein. It should be understood that the terminology used herein is intended solely to describe specific aspects and is not intended to be limiting.

[0053] В настоящем описании "включает", "включающий", "содержащий", "имеющий" и т.п. могут иметь значение в соответствии с Патентным правом США и могут означать "включает", "включающий" и т.п.; термины "состоящий по существу из" или "состоит по существу" также имеют значение в соответствии с Патентным правом США, причем эти термины являются открытыми, допуская присутствие большего, чем было указано, при условии, что основные или новые свойства того, что было указано, не изменяются из-за присутствия большего, чем то, что было указано, но исключают варианты осуществления из предшествующего уровня техники.[0053] As used herein, “includes,” “comprising,” “comprising,” “having,” and the like. may have the meaning under US Patent Law and may mean “includes”, “including”, etc.; the terms "consisting essentially of" or "consisting essentially of" also have meaning under US Patent Law, and these terms are open-ended, allowing for more than what is stated, provided that the essential or novel properties of what is stated , are not modified by the presence of more than what was stated, but exclude embodiments from the prior art.

[0054] Если прямо не указано или не очевидно из контекста, следует понимать, что при использовании в настоящем документе термины "a", "an" и "the" включают единственное или множественное число.[0054] Unless expressly stated or obvious from context, the terms “a,” “an,” and “the” are understood to include the singular or plural when used herein.

[0055] Если прямо не указано или не очевидно из контекста, следует понимать, что термин "или" при использовании в настоящем документе является включительным.[0055] Unless expressly stated or obvious from the context, the term “or” as used herein should be understood to be inclusive.

[0056] При использовании в настоящем документе в других контекстах термин "приблизительно", если не указано иное, относится к указанному значению, например количеству, дозе, температуре, времени, проценту и т.д., +/-10%, +/-9%, +/-8%, +/-7%, +/-6%, +/-5%, +/-4%, +/-3%, +/-2% или +/-1%.[0056] When used herein in other contexts, the term "about", unless otherwise indicated, refers to a specified value, such as amount, dose, temperature, time, percentage, etc., +/-10%, +/ -9%, +/-8%, +/-7%, +/-6%, +/-5%, +/-4%, +/-3%, +/-2% or +/-1 %.

[0057] При использовании в настоящем документе термины "пациент" или "субъект" и т.п. попеременно используются в настоящем документе для обозначения любого млекопитающего, включая людей, домашних животных и сельскохозяйственных животных, а также зоопарковых, спортивных и домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки и животные для использования в сельском хозяйстве, в том числе рогатый скот, овцы, свиньи и козы. Одним из примеров млекопитающего является человек, включая взрослых, детей и пожилых лиц. Субъектом также может быть домашнее животное, включая собак, кошек и лошадей. Примеры сельскохозяйственных животных включают рогатый скот и коз.[0057] As used herein, the terms "patient" or "subject" or the like. used interchangeably herein to refer to any mammal, including humans, pets and farm animals, as well as zoo, sporting and companion animals such as dogs, horses, cats and animals for agricultural use, including cattle, sheep , pigs and goats. One example of a mammal is a human, including adults, children and the elderly. The subject may also be a domestic animal, including dogs, cats and horses. Examples of farm animals include cattle and goats.

[0058] Термины "лечить", "лечение" и т.п. при использовании в настоящем документе, если не указано иное, относятся к лечению, регрессии, ослаблению, облегчению, минимизации, ингибированию процесса, подавлению, остановке и/или предотвращению заболевания, нарушения или состояния, к которым применяется такой термин, или одного или более (то есть не обязательно всех) симптомов такого заболевания, нарушения или состояния, и включает введение любой из композиций, фармацевтических композиций или лекарственных форм, описанных в настоящем документе, для предотвращения появления симптомов или осложнений, облегчения симптомов или осложнений, замедления прогрессирования и/или устранения заболевания, состояния или нарушения. В альтернативных вариантах осуществления лечение обеспечивает излечение или улучшение состояния.[0058] The terms “treat”, “treating”, etc. as used herein, unless otherwise indicated, refer to the treatment, regression, attenuation, alleviation, minimization, inhibition, suppression, arrest and/or prevention of the disease, disorder or condition to which such term applies, or one or more ( i.e., not necessarily all) symptoms of such disease, disorder or condition, and includes the administration of any of the compositions, pharmaceutical compositions or dosage forms described herein to prevent the onset of symptoms or complications, alleviate symptoms or complications, slow progression and/or eliminate diseases, conditions or disorders. In alternative embodiments, the treatment provides a cure or improvement of the condition.

[0059] При использовании в настоящем документе "предупреждение" или "профилактика" означает полное или частичное предотвращение или облегчение, или контроль, или уменьшение или остановку продукции или возникновения состояния или события, например, заболевания, нарушения или состояния, которое нужно предотвратить.[0059] As used herein, “prevention” or “prevention” means completely or partially preventing or alleviating or controlling or reducing or stopping the production or occurrence of a condition or event, such as a disease, disorder or condition to be prevented.

[0060] При использовании в настоящем документе термины "очищенный" или "обогащенный" и т.п. означают, что клетки или популяции клеток удалены из их нормального тканевого окружения и присутствуют в более высокой концентрации по сравнению с нормальным тканевым окружением. Таким образом, "очищенная" или "обогащенная" популяция клеток может дополнительно включать типы клеток в дополнение к ретинальным клеткам-предшественникам и может включать дополнительные тканевые компоненты, при этом термин "очищенный" или "обогащенный" не указывает обязательно на присутствие только клеток-предшественников или исключает присутствие других типов клеток.[0060] As used herein, the terms "purified" or "enriched" and the like. mean that cells or populations of cells are removed from their normal tissue environment and are present in higher concentrations compared to the normal tissue environment. Thus, a “purified” or “enriched” cell population may further include cell types in addition to retinal progenitor cells and may include additional tissue components, and the term “purified” or “enriched” does not necessarily indicate the presence of progenitor cells only or excludes the presence of other cell types.

[0061] В некоторых вариантах осуществления популяции ретинальных клеток-предшественников, как раскрыто в настоящем документе, могут быть по меньшей мере на 5% чистыми, по меньшей мере на 10% чистыми, по меньшей мере на 15% чистыми, по меньшей мере на 20% чистыми, по меньшей мере на 25% чистыми, по меньшей мере на 30% чистыми, по меньшей мере на 35% чистыми, по меньшей мере на 40% чистыми, по меньшей мере на 45% чистыми, по меньшей мере на 50% чистыми, по меньшей мере на 55% чистыми, по меньшей мере на 60% чистыми, по меньшей мере на 65% чистыми, по меньшей мере на 70% чистыми, по меньшей мере на 75% чистыми, по меньшей мере на 80% чистыми, по меньшей мере на 85% чистыми, по меньшей мере на 90% чистыми, по меньшей мере на 95% чистыми, по меньшей мере на 96% чистыми, по меньшей мере на 97% чистыми, по меньшей мере на 98% чистыми, по меньшей мере на 99% чистыми или чистыми на любое приращение между 5% и 99% (например, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% ретинальных клеток-предшественников).[0061] In some embodiments, retinal progenitor cell populations as disclosed herein may be at least 5% pure, at least 10% pure, at least 15% pure, at least 20 % pure, at least 25% pure, at least 30% pure, at least 35% pure, at least 40% pure, at least 45% pure, at least 50% pure , at least 55% pure, at least 60% pure, at least 65% pure, at least 70% pure, at least 75% pure, at least 80% pure, according to at least 85% pure, at least 90% pure, at least 95% pure, at least 96% pure, at least 97% pure, at least 98% pure, at least 99% pure or pure by any increment between 5% and 99% (e.g. 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32 %, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65% , 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% of retinal progenitor cells).

[0062] "Маркер" относится к любой молекуле, которую можно наблюдать или обнаруживать. Например, маркер может включать, без ограничения, нуклеиновую кислоту, такую как транскрипт определенного гена, полипептидный продукт гена, не являющийся продуктом гена полипептид, гликопротеин, углевод, гликолипид, липид, липопротеин или малую молекулу (например, молекулы, имеющие молекулярную массу меньше 10000 дальтон). В альтернативных вариантах осуществления ретинальные клетки-предшественники могут характеризоваться присутствием одного или нескольких маркеров, которые могут экспрессироваться на поверхности клеток в популяции клеток ("маркер клеточной поверхности"), внутри клеток в популяции клеток (т.е. в ядре или цитоплазме клетки) и/или экспрессироваться на уровне РНК или белка в качестве "генетического" маркера.[0062] "Marker" refers to any molecule that can be observed or detected. For example, a marker may include, but is not limited to, a nucleic acid such as a specific gene transcript, a polypeptide gene product, a non-gene product polypeptide, glycoprotein, carbohydrate, glycolipid, lipid, lipoprotein, or small molecule (e.g., molecules having a molecular weight of less than 10,000 dalton). In alternative embodiments, retinal progenitor cells may be characterized by the presence of one or more markers that may be expressed on the surface of cells in a population of cells (“cell surface marker”), within cells in a population of cells (i.e., in the nucleus or cytoplasm of the cell), and /or expressed at the RNA or protein level as a “genetic” marker.

[0063] Термины "экспрессировать" и "экспрессия" при использовании в настоящем документе относятся к транскрипции и/или трансляции последовательности нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Уровень экспрессии представляющего интерес требуемого продукта/белка, например маркера, в клетке-хозяине может быть определен или подвергнут "скринингу" либо на основе количества соответствующей мРНК, которая присутствует в клетке, либо количества представляющего интерес требуемого полипептида/белка, кодируемого выбранной последовательностью, как в настоящих примерах. Например, мРНК, транскрибируемая с выбранной последовательности, может быть количественно определена или обнаружена с помощью Нозерн-блот-гибридизации, защиты РНК от действия рибонуклеаз, гибридизации in situ с клеточной РНК, анализа на микроматрицах или с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Белки, кодируемые выбранной последовательностью, могут быть обнаружены или определены количественно с помощью различных методов на основе антител, например, метода ИФА, вестерн-блоттинга, радиоиммуноанализа, иммунопреципитации, анализа биологической активности белка, иммуноокрашивания белка (включая, например, иммуногистохимию и иммуноцитохимию), проточной цитометрии или сортировки клеток с активированной флуоресценцией ("FACS") или с помощью гомогенного флуоресцентного анализа с временным разрешением (HTRF).[0063] The terms “express” and “expression” as used herein refer to the transcription and/or translation of a nucleic acid sequence in a host cell. The level of expression of the desired product/protein of interest, such as a marker, in a host cell can be determined or "screened" either based on the amount of the corresponding mRNA that is present in the cell or the amount of the desired polypeptide/protein of interest encoded by the selected sequence, such as in real examples. For example, the mRNA transcribed from a selected sequence can be quantified or detected by Northern blot hybridization, ribonuclease protection of the RNA, in situ hybridization with cellular RNA, microarray analysis, or reverse transcription polymerase chain reaction (RT). -PCR). Proteins encoded by the selected sequence can be detected or quantified using various antibody-based methods, for example, ELISA, Western blotting, radioimmunoassay, immunoprecipitation, protein biological activity assay, protein immunostaining (including, for example, immunohistochemistry and immunocytochemistry), flow cytometry or fluorescence-activated cell sorting ("FACS") or homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF) analysis.

Ретинальные клетки-предшественники (RPC)Retinal progenitor cells (RPC)

[0064] Выделение, анализ и применение ретинальных клеток-предшественников млекопитающих подробно описаны в заявке WO2012/158910, содержание которой включено в настоящий документ посредством отсылки во всей полноте.[0064] The isolation, analysis and use of mammalian retinal progenitor cells are described in detail in WO2012/158910, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.

[0065] При эмбриональном развитии позвоночных сетчатка и зрительный нерв формируются в виде отростков развивающегося мозга, поэтому сетчатка считается частью центральной нервной системы (ЦНС) и фактически является мозговой тканью. Сетчатка представляет собой слоистую структуру с несколькими слоями нейронов, соединенных синапсами. От ближайшего к самому дальнему от стекловидного тела, т.е. от ближайшего к передней части головы по направлению к внутренней и задней части головы, слои сетчатки включают: (1) внутреннюю ограничивающую мембрану, включающую подошвы клеток Мюллера, (2) слой нервных волокон, содержащий аксоны ядер ганглионарных клеток, (3) слой ганглионарных клеток, содержащий ядра ганглионарных клеток, аксоны которых становятся волокном зрительного нерва, (4) внутренний сплетениевидный слой, который содержит синапсы между аксонами биполярных клеток и дендритами ганглионарных и амакриновых клеток, (5) внутренний ядерный слой, который содержит ядра и окружающие клеточные тела (перикарионы) биполярных клеток, (6) внешний сплетениевидный слой, содержащий проекции палочек и колбочек, заканчивающиеся сферулой палочки и ножкой колбочки, соответственно, (7) внешний ядерный слой, который содержит тела клеток палочек и колбочек, (8) внешнюю ограничивающую мембрану, которая отделяет части внутренних сегментов фоторецепторов от их клеточного ядра, (9) слой фоторецепторов и (10) пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), который представляет собой один слой гексагональных клеток. Нейроны, которые непосредственно чувствительны к свету, представляют собой фоторецепторные клетки, состоящие в основном из двух типов: палочек и колбочек. Палочки функционируют в основном при слабом освещении и обеспечивают черно-белое зрение, а колбочки поддерживают дневное зрение и восприятие цвета. Третий тип фоторецепторов, светочувствительная ганглионарная клетка, важен для рефлексных реакций на яркий дневной свет.[0065] During embryonic development of vertebrates, the retina and optic nerve form as extensions of the developing brain, so the retina is considered part of the central nervous system (CNS) and is actually brain tissue. The retina is a layered structure with several layers of neurons connected by synapses. From closest to farthest from the vitreous, i.e. from closest to the front of the head toward the inside and back of the head, the layers of the retina include: (1) the internal limiting membrane containing the Müller cell bases, (2) the nerve fiber layer containing the axons of the ganglion cell nuclei, (3) the ganglion cell layer , containing the nuclei of ganglion cells, the axons of which become the optic nerve fiber, (4) the inner plexus-like layer, which contains synapses between the axons of bipolar cells and the dendrites of ganglion and amacrine cells, (5) the inner nuclear layer, which contains the nuclei and surrounding cell bodies (perikaryons ) bipolar cells, (6) the outer plexus-like layer containing the projections of the rods and cones, ending in the rod spherule and cone stalk, respectively, (7) the outer nuclear layer, which contains the cell bodies of the rods and cones, (8) the outer limiting membrane, which separates parts of the inner segments of the photoreceptors from their cell nucleus, (9) the photoreceptor layer and (10) the retinal pigment epithelium (RPE), which is a single layer of hexagonal cells. Neurons that directly sense light are photoreceptor cells, consisting primarily of two types: rods and cones. Rods function primarily in low light and provide black-and-white vision, while cones support daytime vision and color perception. A third type of photoreceptor, the light-sensitive ganglion cell, is important for reflex responses to bright daylight.

[0066] Донорские фетальные ретинальные клетки (например, ретинальные клетки-предшественники, описанные в настоящем документе) могут оказывать трофическое влияние на сетчатку реципиента, особенно включая колбочки реципиента. Этот трофический эффект является не только нейропротекторным, но также оказывает быстрое восстанавливающее действие на оставшиеся клетки сетчатки реципиента, что определяется улучшением зрительной функции. Донорские клетки способны интегрироваться в сетчатку и, посредством клеточной дифференцировки, заменять фоторецепторы (которые могут присутствовать в ограниченном количестве). Общий эффект заключается в быстром и устойчивом восстановлении и сохранении клинически значимой степени зрительной функции сетчатки, которая в ином случае неизбежно будет утеряна, в результате чего пациент полностью ослепнет. Таким образом, любые из композиций и способов, описанных в настоящем документе, могут применяться для быстрого и устойчивого восстановления и сохранения клинически значимой степени зрительной функции сетчатки у млекопитающего, например человека. Например, любые из композиций и способов, описанных в настоящем документе, могут оказывать клинически значимое трофическое влияние на поврежденную сетчатку или оказывать регенеративное влияние на макулярную и/или скотопическую зрительную функцию.[0066] Donor fetal retinal cells (eg, the retinal progenitor cells described herein) can have a trophic effect on the recipient's retina, especially including the recipient's cones. This trophic effect is not only neuroprotective, but also has a rapid restorative effect on the remaining cells of the recipient's retina, which is determined by an improvement in visual function. Donor cells are able to integrate into the retina and, through cellular differentiation, replace photoreceptors (which may be present in limited numbers). The overall effect is the rapid and sustained restoration and preservation of a clinically significant degree of retinal visual function that would otherwise inevitably be lost, leaving the patient completely blind. Thus, any of the compositions and methods described herein can be used to rapidly and sustainably restore and maintain a clinically significant degree of retinal visual function in a mammal, such as a human. For example, any of the compositions and methods described herein may have a clinically significant trophic effect on the damaged retina or have a regenerative effect on macular and/or scotopic visual function.

[0067] Клетки в композициях и популяциях, описанных в настоящем документе, представляют собой популяцию близко родственных клеток, а не выделенный один тип клеток.[0067] The cells in the compositions and populations described herein are a population of closely related cells and not a single cell type isolated.

[0068] Хотя эти клетки, по сути, не являются стволовыми клетками (потому что они не соответствуют определению для истинных стволовых клеток), они являются незрелыми и/или пластичными. Однако такие клетки не могут (без дополнительной манипуляции) приводить к образованию зародышевого слоя и/или не могут (без дополнительной манипуляции) приводить к образованию всех трех (3) зародышевых слоев.[0068] Although these cells are not, per se, stem cells (because they do not meet the definition of true stem cells), they are immature and/or plastic. However, such cells cannot (without additional manipulation) result in the formation of a germ layer and/or cannot (without additional manipulation) result in the formation of all three (3) germ layers.

[0069] Кроме того, эти клетки запрограммированы к образованию ткани или клеток сетчатки. Таким образом, эти клетки могут экспрессировать прогениторные маркеры и ретинальные маркеры.[0069] In addition, these cells are programmed to form retinal tissue or cells. Thus, these cells may express progenitor markers and retinal markers.

[0070] Ретинальные клетки-предшественники не плюрипотентные и могут оказаться мультипотентными. Однако, поскольку клетки никогда не культивировали в плюрипотентном состоянии, они более безопасные. Хотя в некоторых вариантах осуществления фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих могут быть получены искусственно из плюрипотентных клеточных линий, они необязательно не содержат популяцию остаточных плюрипотентных типов клеток.[0070] Retinal progenitor cells are not pluripotent and may be multipotent. However, because the cells have never been cultured in a pluripotent state, they are safer. Although in some embodiments, fetal retinal cells or mammalian RPC cells may be artificially derived from pluripotent cell lines, they are not necessarily free of a population of residual pluripotent cell types.

[0071] Клетки, описанные в настоящем документе, являются ретинальными клетками-предшественниками (RPC), которые можно отличить от нервных прогениторных и/или нервных стволовых клеток (NSC). В частности, такие фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих являются мультипотентными, но не эквивалентны NSC. Например, фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих происходят не из головного мозга, а из сетчатки глаза. Кроме того, из фетальных ретинальных клеток или клеток RPC млекопитающих образуются фоторецепторы, тогда как из прогениторных клеток головного мозга фоторецепторы формируются плохо. Аналогичным образом, в отличие от NSC, фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих являются мультипотентными, но из них не образуются (без дополнительной манипуляции) олигодендроциты. Например, из фетальных ретинальных клеток или клеток RPC млекопитающих образуются (в ходе дифференцировки) ретинальные клетки, включая фоторецепторы, но не образуются олигодендроциты.[0071] The cells described herein are retinal progenitor cells (RPCs), which can be distinguished from neural progenitor cells and/or neural stem cells (NSCs). In particular, such mammalian fetal retinal cells or RPC cells are multipotent but are not equivalent to NSCs. For example, mammalian fetal retinal cells or RPC cells do not originate from the brain, but from the retina of the eye. In addition, photoreceptors are formed from fetal retinal cells or mammalian RPC cells, whereas photoreceptors are poorly formed from brain progenitor cells. Likewise, unlike NSCs, mammalian fetal retinal cells or RPC cells are multipotent but do not generate (without further manipulation) oligodendrocytes. For example, fetal retinal cells or mammalian RPC cells produce (during differentiation) retinal cells, including photoreceptors, but do not form oligodendrocytes.

[0072] Фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих получают (или могут быть получены) из фетальной нервной сетчатки млекопитающего, не из реснитчатого края, реснитчатого эпителия или ПЭС. Кроме того, фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих не развиваются из дифференцированных глиальных клеток Мюллера и, по сути, не являются постмитотическими предшественниками, не являются стволовыми клетками и/или не являются ни одним выделенным типом клеток.[0072] Mammalian fetal retinal cells or RPC cells are (or can be) obtained from the fetal neural retina of a mammal, not from the ciliated margin, ciliated epithelium or RPE. In addition, fetal retinal cells or mammalian RPC cells do not develop from differentiated Müller glial cells and, as such, are not postmitotic progenitors, are not stem cells, and/or are not any distinct cell type.

[0073] Фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих не были обнаружены у эмбриона на ранней стадии развития (например, в бластоцисте). Кроме того, фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих не обнаружены в каком бы то ни было полезном количестве у нормального зрелого млекопитающего (например, человека).[0073] Mammalian fetal retinal cells or RPC cells have not been found in the embryo at an early stage of development (eg, in the blastocyst). In addition, fetal retinal cells or mammalian RPC cells are not found in any useful quantity in a normal mature mammal (eg, human).

[0074] Кроме того, ретинальные клетки-предшественники не персистируют в течение всей жизни организма. Однако такие фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих обнаружены в своей нативной численности в развивающейся (фетальной) сетчатке млекопитающего (например, человека).[0074] In addition, retinal progenitor cells do not persist throughout the life of the organism. However, such mammalian fetal retinal cells or RPC cells are found in their native abundance in the developing (fetal) retina of a mammal (eg, human).

[0075] Хотя фетальные ретинальные клетки или RPC млекопитающих являются в основном митотическими при культивировании в условиях пролиферации, малые количества постмитотических клеток также могут быть включены в любую из композиций и популяций, описанных в настоящем документе.[0075] Although mammalian fetal retinal cells or RPCs are primarily mitotic when cultured under proliferative conditions, small amounts of post-mitotic cells may also be included in any of the compositions and populations described herein.

[0076] Фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих являются иммунологически переносимыми в качестве глазных аллотрансплантатов у неродственных млекопитающих, например, человека. Таким образом, RPC имеют низкую иммуногенность при введении в глаз. В качестве неограничивающего примера такие фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих можно трансплантировать в полость стекловидного тела или в субретинальное пространство млекопитающего или человека, для лечебной и/или профилактической терапии зрения или болезней сетчатки.[0076] Mammalian fetal retinal cells or RPC cells are immunologically transferable as ocular allografts in unrelated mammals, such as humans. Thus, RPCs have low immunogenicity when administered into the eye. By way of non-limiting example, such mammalian fetal retinal cells or RPC cells can be transplanted into the vitreous cavity or subretinal space of a mammal or human for therapeutic and/or prophylactic therapy of vision or retinal diseases.

[0077] В альтернативных вариантах осуществления фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих не связаны с риском (или существенным риском) образования опухоли или другого нежелательного роста клеток.[0077] In alternative embodiments, fetal retinal cells or mammalian RPC cells are not associated with a risk (or significant risk) of tumor formation or other unwanted cell growth.

[0078] Фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих можно культивировать в виде сфер или адгерентных монослоев, или в виде сфер и затем монослоев, и/или в виде комбинации сфер и монослоев. Однако сферы не требуются, и в некоторых вариантах осуществления клетки пересаживают в виде разделенных клеток, а не в виде сфер, или в виде смеси разделенных клеток и сфер. Фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих содержат пересаженные клетки, которые сливаются в стекловидном теле и, необязательно, могут становиться сферами.[0078] Mammalian fetal retinal cells or RPC cells can be cultured as spheres or adherent monolayers, or as spheres and then monolayers, and/or as a combination of spheres and monolayers. However, spheres are not required, and in some embodiments, cells are transplanted as divided cells rather than spheres, or as a mixture of separated cells and spheres. Mammalian fetal retinal cells or RPC cells contain transplanted cells that fuse in the vitreous and optionally become spheres.

[0079] В альтернативных вариантах осуществления ретинальные клетки-предшественники и содержащие их популяции клеток не являются бессмертными, причем они не могут быть иммортализованы или принудительно иммортализованы. Хотя клетки не пролиферируют неограниченно, типичные способы культивирования клеток, описанные в данном документе, могут увеличивать скорость и длительность пролиферации и/или могут значительно повышать выход донорских клеток для донорства данной ткани. При использовании в настоящем документе "иммортализованная" клеточная линия является клеточной линией, которая может делиться бесконечно долго, тогда как "неиммортализованная" клеточная линия способна делиться в течение ограниченного количества пассажей. Например, неиммортализованные ретинальные клетки-предшественники могут делиться в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более пассажей.[0079] In alternative embodiments, retinal progenitor cells and cell populations containing them are not immortal, nor can they be immortalized or involuntarily immortalized. Although cells do not proliferate indefinitely, typical cell culture methods described herein can increase the rate and duration of proliferation and/or can significantly increase the yield of donor cells for donation of a given tissue. As used herein, an "immortalized" cell line is a cell line that can divide indefinitely, whereas a "non-immortalized" cell line is able to divide for a limited number of passages. For example, non-immortalized retinal progenitor cells can divide within 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 25, 30 or more passages.

[0080] RPC могут быть генетически немодифицированными клетками или они могут быть генетически модифицированы (например, стабильно, транзиентно или индуцируемо трансформированы) с использованием любого способа(ов), известного в уровне техники. Например, ретинальные клетки-предшественники могут быть генетически модифицированы для экспрессии одной или более гетерологичных или экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот, представляющих интерес. Последовательность нуклеиновой кислоты может быть "экзогенной", что означает, что она является чужеродной по отношению к клетке, в которую вводят вектор, или что последовательность гомологична последовательности в клетке, но находится в положении внутри нуклеиновой кислоты клетки-хозяина, в котором такая последовательность обычно не присуствует. Последовательности нуклеиновых кислот включают плазмиды, ампликоны, кДНК, мРНК, антисмысловую РНК, миРНК, но не ограничены этими примерами. Термин "ген" относится к функциональной единице нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, полипептид или пептид. Как будет понятно специалистам в данной области, данный функциональный термин включает геномные последовательности, последовательности кДНК и менее крупные сконструированные генные сегменты, которые экспрессируют белки, полипептиды, домены, пептиды, слитые белки и мутанты или могут быть адаптированы для их экспрессии.[0080] RPCs may be genetically unmodified cells, or they may be genetically modified (eg, stably, transiently, or inducibly transformed) using any method(s) known in the art. For example, retinal progenitor cells can be genetically modified to express one or more heterologous or exogenous nucleic acid sequences of interest. The nucleic acid sequence may be "exogenous", meaning that it is foreign to the cell into which the vector is introduced, or that the sequence is homologous to a sequence in the cell but is in a position within the host cell nucleic acid in which such sequence is normally found. not present. Nucleic acid sequences include, but are not limited to, plasmids, amplicons, cDNA, mRNA, antisense RNA, siRNA. The term "gene" refers to a functional nucleic acid unit encoding a protein, polypeptide or peptide. As will be understood by those skilled in the art, this functional term includes genomic sequences, cDNA sequences and smaller engineered gene segments that express or can be adapted to express proteins, polypeptides, domains, peptides, fusion proteins and mutants.

[0081] Для генетического изменения клеток может использоваться любая методология, известная в данной области. Одним из примеров метода является вставка гена в клетки ткани с помощью рекомбинантного вирусного вектора. Для введения фрагмента экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующего терапевтическое средство, в клетки-мишени и/или ткань могут использовать любой из различных векторов, таких как вирусные векторы, плазмидные векторы, линейная ДНК и т.д., как известно в данной области. Такие векторы могут вводить, например, с использованием любого метода из инфицирования, трансдукции, трансфекции, трансфекции, опосредованной фосфатом кальция, трансфекции, опосредованной DEAE-декстраном, электропорации, трансфекции, опосредованной липосомами, доставки биологических генов, липосомальной доставки генов при использовании фузогенных и анионных липосом (которые являются альтернативой применению катионных липосом), прямой инъекции, рецептор-опосредованного захвата, магнитопорации, ультразвука и других, известных в данной области.[0081] Any methodology known in the art can be used to genetically alter cells. One example of a method is the insertion of a gene into tissue cells using a recombinant viral vector. Any of various vectors, such as viral vectors, plasmid vectors, linear DNA, etc., as known in the art, can be used to introduce an exogenous nucleic acid fragment encoding a therapeutic agent into target cells and/or tissue. Such vectors can be administered, for example, using any method of infection, transduction, transfection, calcium phosphate-mediated transfection, DEAE-dextran-mediated transfection, electroporation, liposome-mediated transfection, biological gene delivery, liposomal gene delivery using fusogenic and anionic liposomes (which are an alternative to the use of cationic liposomes), direct injection, receptor-mediated uptake, magnetoporation, ultrasound, and others known in the art.

[0082] При использовании в настоящем документе "вектор" относится к несущей молекуле нуклеиновой кислоты, в которую может быть встроена последовательность нуклеиновой кислоты для введения в клетку, где она может реплицироваться. Векторы включают плазмиды, космиды, вирусы (бактериофаги, вирусы животных и вирусы растений) и искусственные хромосомы (например, YAC). Специалист в данной области будет хорошо осведомлен о конструировании вектора с помощью стандартных рекомбинантных технологий, которые описаны в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences. Помимо кодирования модифицированного полипептида, вектор может кодировать немодифицированные полипептидные последовательности, такие как метку или направляющую молекулу. Подходящие векторы, кодирующие такие слитые белки, включают векторы pIN, векторы, кодирующие полигистидиновую метку, и векторы pGEX для применения в создании растворимых слитых белков глутатион-S-трансферазы (GST) для последующей очистки и разделения или отщепления.[0082] As used herein, “vector” refers to a carrier nucleic acid molecule into which a nucleic acid sequence can be inserted for introduction into a cell where it can be replicated. Vectors include plasmids, cosmids, viruses (bacteriophages, animal viruses, and plant viruses), and artificial chromosomes (eg, YAC). One skilled in the art will be well aware of vector construction using standard recombinant technologies as described in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. & Wiley-Intersciences. In addition to encoding a modified polypeptide, the vector may encode unmodified polypeptide sequences, such as a tag or a targeting molecule. Suitable vectors encoding such fusion proteins include pIN vectors, vectors encoding a polyhistidine tag, and pGEX vectors for use in generating soluble glutathione S-transferase (GST) fusion proteins for subsequent purification and separation or cleavage.

[0083] Векторы могут быть сконструированы в первую очередь для введения в клетки гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ген, который "функционально связан" или находится под контролем одной или более контрольных последовательностей. "Промотор" относится к одному или нескольким модулям контроля транскрипции, которые сгруппированы вокруг сайта инициации для РНК-полимеразы II и других белков-активаторов транскрипции. Любая комбинация промотора/энхансера (согласно базе данных эукариотических промоторов EPDB) также может использоваться для направления экспрессии представляющей интерес молекулы нуклеиновой кислоты (т.е. конститутивной, индуцируемой, репрессируемой, тканеспецифической). Также векторы могут содержать селективный маркер для облегчения работы с ними in vitro или ex vivo. Векторы также могут содержать сигнал полиаденилирования, который может быть получен из гена гормона роста человека (hGH), гена гормона роста крупного рогатого скота (BGH) или SV40. Кроме того, векторы могут также содержать участки внутренней посадки рибосомы (IRES), которые используются для создания мультигенных или полицистронных информационных последовательностей. Элементы IRES способны обходить модель сканирования рибосом при трансляции, зависимой от 5-метилированных кэпов, и инициировать трансляцию во внутренних участках (Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1988) Nature 334(6180): 320-325). Элементы IRES могут быть связаны с гетерологичными открытыми рамками считывания. Несколько открытых рамок считывания могут транскрибироваться вместе, причем каждая из них разделена IRES с получением полицистронных транскриптов. Благодаря элементу IRES каждая открытая рамка считывания доступна рибосомам для эффективной трансляции. Несколько генов могут быть эффективно экспрессироваться с использованием одного промотора/энхансера для транскрипции одного транскрипта.[0083] Vectors can be designed primarily to introduce into cells a heterologous nucleic acid molecule, such as a gene, that is "operably linked" or under the control of one or more control sequences. “Promoter” refers to one or more transcriptional control modules that are grouped around the initiation site for RNA polymerase II and other transcription activator proteins. Any promoter/enhancer combination (according to the eukaryotic promoter database EPDB) can also be used to direct the expression of a nucleic acid molecule of interest (ie, constitutive, inducible, repressible, tissue specific). Vectors may also contain a selectable marker to facilitate their handling in vitro or ex vivo . The vectors may also contain a polyadenylation signal, which may be derived from the human growth hormone (hGH) gene, bovine growth hormone (BGH) gene, or SV40. In addition, vectors may also contain internal ribosome entry sites (IRES), which are used to create multigene or polycistronic information sequences. IRES elements are able to bypass the ribosome scanning model of 5-methylated cap-dependent translation and initiate translation at internal sites (Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1988) Nature 334(6180): 320-325). IRES elements can be associated with heterologous open reading frames. Multiple open reading frames can be transcribed together, each separated by an IRES to produce polycistronic transcripts. Thanks to the IRES element, each open reading frame is accessible to ribosomes for efficient translation. Multiple genes can be efficiently expressed using a single promoter/enhancer to transcribe a single transcript.

[0084] В некоторых вариантах осуществления вектор является вирусным вектором. Вирусные векторы, известные в уровне техники, включают, без ограничения перечисленными, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, векторы на основе вируса осповакцины, векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV), векторы на основе вируса полиомы, альфавирусные векторы, рабдовирусные векторы, лентивирусные векторы, векторы на основе вируса Эпштейна-Барр, пикорнавирусные векторы или герпесвирусные векторы. В таких вариантах осуществления, когда вирусный вектор является AAV вектором, может использоваться любой серотип AAV вектора, известный в данной области. Например, AAV вектор может быть AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 или AAV9. AAV можно псевдотипировать, смешивая капсидный белок и вирусный геном из разных серотипов вируса (например, инвертированные концевые повторы из одного серотипа AAV и капсид из другого серотипа).[0084] In some embodiments, the vector is a viral vector. Viral vectors known in the art include, but are not limited to, adenoviral vectors, retroviral vectors, vaccinia virus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, polyoma virus vectors, alphaviral vectors, rhabdoviral vectors, lentiviral vectors, Epstein-Barr virus vectors, picornavirus vectors or herpesvirus vectors. In such embodiments, when the viral vector is an AAV vector, any serotype of AAV vector known in the art can be used. For example, the AAV vector may be AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 or AAV9. AAV can be pseudotyped by mixing the capsid protein and viral genome from different virus serotypes (e.g., inverted terminal repeats from one AAV serotype and a capsid from another serotype).

[0085] В других вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты может быть заключена в липосомный или липидный состав. Липосомы представляют собой везикулярные структуры, характеризующиеся бислойной фосфолипидной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы содержат несколько липидных слоев, которые разделены водной средой. Они образуются спонтанно при суспендировании фосфолипидов в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самоорганизации с образованием замкнутых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh, P. C. and Bachhawat, B. K. (1991) Targeted Diagn. Ther. 4: 87-103). Одним из примеров коммерчески доступных липосом или липидных составов является липофектамин (Invitrogen). Другие примеры включают FuGENE (Promega), PromoFectin (PromoKine), Affectene (Qiagen), Polyfect (Qiagen), Superfect (Qiagen) и TransMessenger (Qiagen).[0085] In other embodiments, the nucleic acid sequence may be contained in a liposomal or lipid formulation. Liposomes are vesicular structures characterized by a phospholipid bilayer membrane and an internal aqueous environment. Multilayer liposomes contain several lipid layers that are separated by an aqueous medium. They form spontaneously when phospholipids are suspended in excess aqueous solution. Lipid components self-organize into closed structures and trap water and solutes between lipid bilayers (Ghosh, P. C. and Bachhawat, B. K. (1991) Targeted Diagn. Ther. 4: 87-103). One example of commercially available liposomes or lipid formulations is Lipofectamine (Invitrogen). Other examples include FuGENE (Promega), PromoFectin (PromoKine), Affectene (Qiagen), Polyfect (Qiagen), Superfect (Qiagen), and TransMessenger (Qiagen).

Выделение первичных ретинальных клетокIsolation of primary retinal cells

[0086] В настоящем документе предложены способы выделения, культивирования и/или применения диссоциированных суспензий эмбриональных ретинальных клеток, например, человеческих первичных ретинальных клеток из образца. В различных вариантах осуществления суспензии эмбриональных ретинальных клеток не включают ткань или каркасы. Также предложены способы выделения и анализа ретинальных клеток-предшественников и композиций, содержащих такие клетки, которые получены из донорской ткани, выращены в культуре и включены в композицию для введения субъекту или пациенту.[0086] Provided herein are methods for isolating, culturing and/or using dissociated suspensions of fetal retinal cells, such as human primary retinal cells, from a sample. In various embodiments, the fetal retinal cell suspensions do not include tissue or scaffolds. Also provided are methods for isolating and analyzing retinal progenitor cells and compositions containing such cells that are obtained from donor tissue, grown in culture, and included in a composition for administration to a subject or patient.

[0087] Описанные в настоящем документе способы выделения первичных ретинальных клеток из человеческого образца не требуют применения протеазы для расщепления множества первичных ретинальных клеток, что приводит к большему количеству жизнеспособных первичных ретинальных клеток по сравнению со способом, в котором используется протеаза или комбинация механического разделения и обработки протеазой.[0087] Methods for isolating primary retinal cells from a human sample described herein do not require the use of a protease to digest multiple primary retinal cells, resulting in a higher number of viable primary retinal cells compared to a method that uses a protease or a combination of mechanical separation and processing protease.

[0088] В одном аспекте изобретения предложен способ выделения первичных ретинальных клеток из человеческого образца, включающий: (a) выделение образца сетчатки, включающего множество первичных ретинальных клеток из человеческого образца, (b) механическое разделение множества первичных ретинальных клеток в образце сетчатки, выделенном в этапе (a), с получением в результате разделенной суспензии клеток и скоплений клеток и (c) определение жизнеспособности, количества, морфологии или их комбинации первичных ретинальных клеток из образца сетчатки. Человеческие образцы выделяют у людей-доноров. Возраст донора может составлять от 17 до приблизительно 20 неделей. В некоторых вариантах осуществления способы выделения первичных ретинальных клеток, описанных в настоящем документе, позволяют получать по меньшей мере 30×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, которые затем культивируют с получением ретинальных клеток-предшественников.[0088] In one aspect of the invention, there is provided a method for isolating primary retinal cells from a human sample, comprising: (a) isolating a retinal sample including a plurality of primary retinal cells from the human sample, (b) mechanically separating the plurality of primary retinal cells in the retinal sample isolated in step (a), resulting in a separated cell suspension and cell aggregates; and (c) determining the viability, number, morphology, or combination thereof of primary retinal cells from the retinal sample. Human samples are isolated from human donors. The donor can be between 17 and approximately 20 weeks old. In some embodiments, the methods for isolating primary retinal cells described herein produce at least 30×10 ⁶ viable primary retinal cells, which are then cultured to produce retinal progenitor cells.

[0089] В некоторых вариантах осуществления образец является глазом или парой глаз, выделенных от млекопитающего, например мыши, крысы, кролика, кошки, собаки, обезьяны, нечеловеческого примата или человека. В некоторых вариантах осуществления образец получен от сельскохозяйственного животного, например лошади, коровы или овцы.[0089] In some embodiments, the sample is an eye or pair of eyes isolated from a mammal, such as a mouse, rat, rabbit, cat, dog, monkey, non-human primate, or human. In some embodiments, the sample is obtained from a farm animal, such as a horse, cow, or sheep.

[0090] Образцы, используемые для выделения и/или культивирования популяций клеток, могут быть забраны у здоровых субъектов (т.е. лиц, не страдающих заболеванием сетчатки), у больных субъектов и могут включать не только популяции свежевыделенных клеток сетчатки, но и замороженные популяции клеток сетчатки. Источники включают, без ограничения, целые глаза или ткани сетчатки или другие источники, полученные из эмбриональных, фетальных, детских или взрослых тканей. Способы, описанные в настоящем документе, могут включать дополнительные процедуры обогащения или очистки или этапы выделения клеток путем положительной селекции на другие маркеры, специфические для клеток-предшественников сетчатки. Ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток могут быть получены или забраны у любых видов млекопитающих или субъектов, например человека, примата, лошади, крупного рогатого скота, свиньи, собаки, кошки, хорька, кролика, грызуна, например, мыши, крысы, хомяка и т.д.[0090] The samples used to isolate and/or culture cell populations may be collected from healthy subjects (i.e., individuals without retinal disease), diseased subjects, and may include not only freshly isolated retinal cell populations, but also frozen retinal cell populations. Sources include, without limitation, whole eyes or retinal tissues or other sources derived from embryonic, fetal, pediatric or adult tissues. The methods described herein may include additional enrichment or purification procedures or steps of isolating cells by positive selection for other markers specific for retinal progenitor cells. Retinal progenitor cells and cell populations can be obtained or harvested from any mammalian species or subject, e.g., human, primate, horse, bovine, pig, dog, cat, ferret, rabbit, rodent, e.g. mouse, rat, hamster, and etc.

[0091] В некоторых вариантах осуществления клетки собирают из фетальной сетчатки млекопитающего на стадии, после которой формируется сетчатка, но до того как внешние фоторецепторные сегменты полностью сформируются в сетчатке и до завершения или существенного завершения васкуляризации сетчатки. Стадии, как правило, располагаются между фетальными гестационными возрастами от приблизительно 12 недель до приблизительно 28 недель (например, приблизительно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 недель) человеческого плода. В некоторых вариантах осуществления стадия может соответствовать гестационному возрасту от 17 недель до приблизительно 20 недель. В случае нечеловеческих клеток более крупных млекопитающих, таких как кошачьи или свиные ретинальные клетки-предшественники, стадии, как правило, располагаются между фетальными гестационными возрастами от приблизительно 3 недель до приблизительно 11 недель (например, приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 недель). См., например, Anand-Apte, B. and Hollyfield, J. G. "Developmental Anatomy of the Retinal and Choroidal Vasculature", The Retina and Its Disorders, Besharse, J. and Bok, D., Academic Press, (2001). Однако клетки могут быть также получены из послеродовой или неонатальной ткани млекопитающего.[0091] In some embodiments, cells are collected from the fetal retina of a mammal at a stage after which the retina is formed, but before the photoreceptor outer segments are fully formed in the retina and before retinal vascularization is complete or substantially complete. Stages typically range between fetal gestational ages from approximately 12 weeks to approximately 28 weeks (e.g., approximately 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 or 28 weeks) of a human fetus. In some embodiments, the stage may correspond to a gestational age of 17 weeks to about 20 weeks. In the case of larger mammalian non-human cells, such as feline or porcine retinal progenitor cells, the stages typically range between fetal gestational ages of about 3 weeks to about 11 weeks (e.g., about 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 weeks). See, for example, Anand-Apte, B. and Hollyfield, J. G. "Developmental Anatomy of the Retinal and Choroidal Vasculature", The Retina and Its Disorders, Besharse, J. and Bok, D., Academic Press, (2001). However, the cells can also be obtained from postnatal or neonatal tissue of a mammal.

[0092] В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой человеческий образец. В некоторых вариантах осуществления человеческий образец представляет собой одно или пару глазных яблок человека-донора. В некоторых вариантах осуществления гестационный возраст человека-донора составляет от приблизительно 12 недель до приблизительно 28 недель. В некоторых вариантах осуществления гестационный возраст человека-донора составляет от приблизительно 17 недель до приблизительно 20 недель. В некоторых вариантах осуществления использование более узкого возрастного диапазона доноров улучшает единообразие конечного выхода клеток-предшественников сетчатки во время производства.[0092] In some embodiments, the sample is a human sample. In some embodiments, the human sample is one or a pair of eyeballs from a human donor. In some embodiments, the gestational age of the human donor is between about 12 weeks and about 28 weeks. In some embodiments, the gestational age of the human donor is between about 17 weeks and about 20 weeks. In some embodiments, using a narrower donor age range improves the uniformity of the final yield of retinal progenitor cells during production.

[0093] В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой одно или пару человеческих фетальных глазных яблок. В некоторых вариантах осуществления глазные яблоки обладают нормальной морфологией. Нормальная морфология может быть определена при визуальном наблюдении на предмет таких особенностей, как интактное глазное яблоко(и), прозрачная роговица, нормальная форма или любая комбинация этих особенностей.[0093] In some embodiments, the sample is one or a pair of human fetal eyeballs. In some embodiments, the eyeballs have normal morphology. Normal morphology can be determined by visual observation for features such as intact eyeball(s), clear cornea, normal shape, or any combination of these features.

[0094] В некоторых вариантах осуществления человеческую ткань сетчатки могут перевозить во льду и доставлять в окне транспортировки. Окно транспортировки может включать удерживание клеток в пункте назначения или пункте отправления в течение некоторого периода времени, например, во льду или в холодильнике при температуре приблизительно 1-8°C или приблизительно 4°C. В некоторых вариантах осуществления окно транспортировки составляет приблизительно 1-40 часов, приблизительно 7-40 часов, приблизительно 1-34 часа, приблизительно 7-34 часа, приблизительно 1-26 часов, приблизительно 4-26 часов, приблизительно 7-26 часов, приблизительно 8-26 часов, приблизительно 4-18 часов, приблизительно 7-18 часов или приблизительно 8-18 часов. В некоторых вариантах осуществления окно транспортировки составляет приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 2,5 часа, приблизительно 3 часа, приблизительно 3,5 часа, приблизительно 4 часа, приблизительно 4,5 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 5,5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 6,5 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 7,5 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 8,5 часов, приблизительно 9 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 11 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 13, часы, приблизительно 14 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 17 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 19 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 21 час, приблизительно 22 часа, приблизительно 23 часа, приблизительно 24 часа, приблизительно 25 часов или приблизительно 26 часов. В качестве неограничивающего примера окно транспортировки может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 26 (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5 или 26), например, от приблизительно 4,5 до приблизительно 21,5 часов (например, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21 или 21,5) или от приблизительно 7 до приблизительно 26 часов (например, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5 или 26 часов).[0094] In some embodiments, human retinal tissue may be transported on ice and delivered within a transport window. The transport window may involve keeping the cells at the destination or origin for a period of time, for example, in ice or in a refrigerator at a temperature of about 1-8°C or about 4°C. In some embodiments, the transport window is approximately 1-40 hours, approximately 7-40 hours, approximately 1-34 hours, approximately 7-34 hours, approximately 1-26 hours, approximately 4-26 hours, approximately 7-26 hours, approximately 8-26 hours, approximately 4-18 hours, approximately 7-18 hours or approximately 8-18 hours. In some embodiments, the transport window is about 1 hour, about 2 hours, about 2.5 hours, about 3 hours, about 3.5 hours, about 4 hours, about 4.5 hours, about 5 hours, about 5.5 hours , approximately 6 hours, approximately 6.5 hours, approximately 7 hours, approximately 7.5 hours, approximately 8 hours, approximately 8.5 hours, approximately 9 hours, approximately 10 hours, approximately 11 hours, approximately 12 hours, approximately 13, hours, approximately 14 hours, approximately 15 hours, approximately 16 hours, approximately 17 hours, approximately 18 hours, approximately 19 hours, approximately 20 hours, approximately 21 hours, approximately 22 hours, approximately 23 hours, approximately 24 hours, approximately 25 hours or approximately 26 hours. By way of non-limiting example, the transport window may be from about 1 to about 26 (e.g., 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6 ,5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5 , 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23 , 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, or 26), for example, from about 4.5 to about 21.5 hours (for example, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11, 5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, or 21.5) or from about 7 to about 26 hours (e.g., 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11 ,5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5 , 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5 or 26 hours).

[0095] В некоторых вариантах осуществления образец помещают в среду для культивирования клеток млекопитающих после забора у донора. Среды для культивирования клеток млекопитающих, которые могут использоваться во время транспортировки образца, включают как базальные среды для культур клеток, так и комплексные среды для культур клеток. Неограничивающие примеры базальных сред для культур клеток, используемых во время транспортировки, включают, без ограничения, минимальную питательную среду Игла, ADC-1, LPM (без бычьего сывороточного альбумина), F10 (Хэма), F12 (Хэма), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, среду BGJ (с и без модификации Фиттона-Джексона), базальную среду Игла (BME - с добавкой солевой основы Эрла), среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM - без сыворотки), улучшенную DMEM/F-12, Яманэ, IMEM-20, среду Игла в модификации Глазго (GMEM), среду Лейбовица L-15, среду Маккоя 5А, среду M199 (M199E - с солевой основой Эрла), среду M199 (M199H - с солевой основой Хэнкса), минимальную питательную среду Игла (MEM - с солевой основой Эрла), минимальную питательную среду Игла (MEM-H - с солевой основой Хэнкса) и минимальную питательную среду Игла (MEM-NAA с заменимыми аминокислотами), среди других многочисленных, включая среду 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153 и Ultraculture. В некоторых вариантах осуществления среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает RPMI-1640. В некоторых вариантах осуществления среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает RPMI 1640 с добавкой L-глутамина. В некоторых вариантах осуществления среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает улучшенную DMEM/F-12. В некоторых вариантах осуществления питательная среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает полную среду. Например, питательная среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает базальную среду с одной или более из добавок N-2, B27 XenoFree, B27, StemPro, эпидермального фактора роста (EGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF) или GlutaMAX I. В некоторых вариантах осуществления среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает один или несколько антибиотиков. Например, среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает гентамицин в концентрации приблизительно 30-100 микрограммов (мкг) на миллилитр (мл) или от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления среда для клеточной культуры, используемая для транспортировки, включает гентамицин в концентрации приблизительно 50 мкг/мл.[0095] In some embodiments, the sample is placed in a mammalian cell culture medium after collection from a donor. Mammalian cell culture media that can be used during sample transport include both basal cell culture media and complex cell culture media. Non-limiting examples of cell culture basal media used during transport include, but are not limited to, Eagle's minimal essential medium, ADC-1, LPM (no bovine serum albumin), F10, F12, DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ medium (with and without Fitton-Jackson modification), basal Eagle's medium (BME - with the addition of Earl's salt base), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM - without serum), improved DMEM/F-12, Yamane, IMEM- 20, Glasgow modified Eagle's medium (GMEM), Leibowitz's L-15 medium, McCoy's 5A medium, M199 medium (M199E - with Earl's salt base), M199 medium (M199H - with Hanks' salt base), Eagle's minimal nutrient medium (MEM - with Earle's salt base), Eagle's minimal essential medium (MEM-H - with Hanks' salt base) and Eagle's minimal essential medium (MEM-NAA with nonessential amino acids), among numerous others including medium 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066 , NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153, and Ultraculture. In some embodiments, the cell culture medium used for transport includes RPMI-1640. In some embodiments, the cell culture medium used for transport includes RPMI 1640 supplemented with L-glutamine. In some embodiments, the cell culture medium used for transport includes enhanced DMEM/F-12. In some embodiments, the cell culture medium used for transport includes complete medium. For example, the cell culture medium used for transport includes basal medium supplemented with one or more of N-2, B27 XenoFree, B27, StemPro, epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) or GlutaMAX I supplements. In some embodiments, the cell culture medium used for transport includes one or more antibiotics. For example, the cell culture medium used for transport includes gentamicin at a concentration of about 30 to 100 micrograms (μg) per milliliter (ml) or from about 0.5 to about 50 μg/ml. In some embodiments, the cell culture medium used for transport includes gentamicin at a concentration of approximately 50 μg/ml.

[0096] В некоторых вариантах осуществления человеческий образец хранят приблизительно при 1-8°C непосредственно после помещения в среду для транспортировки культуры клеток. В некоторых вариантах осуществления человеческий образец хранят приблизительно при 4°C непосредственно после помещения в среду для транспортировки культуры клеток. Например, человеческий образец хранят во льду непосредственно после помещения в среду для транспортировки культуры клеток.[0096] In some embodiments, the human sample is stored at approximately 1-8°C immediately after placement in cell culture transport media. In some embodiments, the human sample is stored at approximately 4°C immediately after placement in cell culture transport media. For example, a human sample is stored on ice immediately after being placed in cell culture transport media.

[0097] В изобретении предложены способы выделения образца сетчатки, включающего множество первичных ретинальных клеток из человеческого образца, например, образца, включающего одно или пару глазных яблок от человека-донора гестационного возраста приблизительно 12-28 недель.[0097] The invention provides methods for isolating a retinal sample comprising a plurality of primary retinal cells from a human sample, for example, a sample comprising one or a pair of eyeballs from a human donor of approximately 12-28 weeks gestational age.

[0098] Ретинальные клетки-предшественники могут быть очищены от других компонентов ткани после или параллельно с обработкой образца ткани. Например, клетки-предшественники могут быть очищены от других клеток и компонентов ткани после культивирования образца ткани в условиях, подходящих для роста клеток, и в течение времени, достаточного для того, чтобы клетки могли прикрепиться к чашке для культивирования. В некоторых вариантах осуществления очистка клеток включает получение клеток, которые мигрируют из образца ткани во время культивирования и присутствуют в культуральной среде или слабо прикреплены к фибронектину или другому субстрату или слою питающих клеток. Эти клетки могут быть получены стандартными методами, такими как удаление и центрифугирование среды для осаждения содержащихся в ней клеток и промывка клеток, оставшихся в чашке для культивирования, таким раствором, как фосфатно-солевой буфер (PBS) или сбалансированный солевой раствор Хенкса, для удаления этих клеток, слабо прикрепленных в виде слоя адгерентных клеток. Затем этот промывочный раствор можно центрифугировать с получением клеток. Очистка ретинальных клеток-предшественников и популяций клеток может дополнительно включать отделение клеток от некоторых нерастворимых тканевых компонентов, включая остаточный тканевый материал, такой как липиды. Клетки могут быть отделены от других тканевых компонентов любыми способами, известными и доступными в данной области, включая, например, применение градиентов плотности, центрифугирования, сортировки с помощью проточной цитометрии или магнитного разделения клеток (MACS) и фильтрации, или их комбинаций. Примеры конкретных способов очистки клеток известны и описаны в данной области, например, в патентах США 6,777,231. Методы негативного разделения также могут использоваться для удаления одного или нескольких конкретных типов клеток.[0098] Retinal progenitor cells can be purified from other tissue components after or in parallel with processing of the tissue sample. For example, progenitor cells can be purified from other cells and tissue components after culturing the tissue sample under conditions suitable for cell growth and for a period of time sufficient to allow the cells to attach to the culture dish. In some embodiments, cell purification involves obtaining cells that migrate from the tissue sample during culture and are present in the culture medium or loosely attached to fibronectin or other substrate or feeder cell layer. These cells can be obtained by standard methods such as removing and centrifuging the medium to pellet the cells contained therein and washing the cells remaining in the culture dish with a solution such as phosphate buffered saline (PBS) or Hanks' balanced salt solution to remove these cells loosely attached in the form of a layer of adherent cells. This wash solution can then be centrifuged to obtain the cells. Purification of retinal progenitor cells and cell populations may further involve separating the cells from certain insoluble tissue components, including residual tissue material such as lipids. Cells can be separated from other tissue components by any methods known and available in the art, including, for example, the use of density gradients, centrifugation, flow cytometric sorting or magnetic cell separation (MACS) and filtration, or combinations thereof. Examples of specific methods for purifying cells are known and described in the art, for example, in US patents 6,777,231. Negative separation techniques can also be used to remove one or more specific cell types.

[0099] Ткань может также быть обработана или "разделена". Например, ткань, такую как одно или пара глазных яблок, могут обрабатывать или разрезать для выделения сетчатки, после чего сетчатки разделяют для получения множества первичных ретинальных клеток и скоплений клеток. Затем такие первичные ретинальные клетки и скопления клетки культивируют, как описано в настоящем документе, с получением множества ретинальных клеток-предшественников.[0099] The fabric may also be treated or "split". For example, tissue, such as one or a pair of eyeballs, can be processed or cut to isolate the retina, after which the retinas are separated to obtain multiple primary retinal cells and cell aggregates. Such primary retinal cells and cell clusters are then cultured as described herein to produce a variety of retinal progenitor cells.

[00100] Таким образом, в изобретении предложены способы выделения образца сетчатки, включающего множество первичных ретинальных клеток, из человеческого образца. Человеческий образец включает, например, одно или пару глазных яблок от человека-донора гестационного возраста приблизительно от 12 до 28 недель. В некоторых вариантах осуществления способы включают: (i) извлечение одного или пары человеческих глазных яблок из среды для транспортировки культуры, (ii) промывку одного или пары человеческих глазных яблок фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавкой антибиотика и температурой приблизительно 1-8°C, (iii) удаление зрительного нерва и мезенхимальной ткани из одного или пары человеческих глазных яблок, (iv) промывку одного или пары человеческих глазных яблок PBS с температурой приблизительно 1-8°C и добавкой антибиотика, (v) прокол каждого из одного или пары человеческих глазных яблок по краю с помощью иглы, (vi) круговой разрез по краю роговицы края того или пары человеческих глазных яблок, например с помощью пары микрохирургических ножниц, (vii) удаление хрусталика, роговицы и ассоциированного стекловидного тела из одного или пары человеческих глазных яблок, (viii) отделение сетчатки (сетчаток) от слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) с получением отделенной сетчатки или пары отделенных сетчаток, и (ix) помещение отделенной сетчатки или пары отделенных сетчаток в культуральную среду или PBS с температурой приблизительно 1-8°C, где культуральная среда или PBS содержат антибиотик. Промывание (или промывка) образца на различных этапах можно повторить 1-5 раз или больше. Например, образец могут промывать 1, 2, 3, 4 или 5 раз. В некоторых вариантах осуществления образец сетчатки, полученный с применением способов, описанных в настоящем документе, не содержит или по существу не содержит экстраокулярных клеток.[00100] Thus, the invention provides methods for isolating a retinal sample comprising a plurality of primary retinal cells from a human sample. A human sample includes, for example, one or a pair of eyeballs from a human donor of approximately 12 to 28 weeks' gestational age. In some embodiments, the methods include: (i) removing one or a pair of human eyeballs from the culture transport medium, (ii) washing one or a pair of human eyeballs with phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with an antibiotic at a temperature of approximately 1-8°C C, (iii) removing the optic nerve and mesenchymal tissue from one or a pair of human eyeballs, (iv) washing one or a pair of human eyeballs with PBS at approximately 1-8°C and adding antibiotic, (v) puncturing each of one or of a pair of human eyeballs along the edge using a needle, (vi) a circular incision along the edge of the cornea of the edge of one or a pair of human eyeballs, for example using a pair of microsurgical scissors, (vii) removal of the lens, cornea and associated vitreous from one or a pair of human eyeballs apples, (viii) separating the retina(s) from the retinal pigment epithelium (RPE) layer to obtain a separated retina or pair of separated retinas, and (ix) placing the separated retina or pair of separated retinas in culture medium or PBS at a temperature of approximately 1-8°C C, where the culture medium or PBS contains an antibiotic. Washing (or washing) the sample at various stages can be repeated 1-5 times or more. For example, the sample may be washed 1, 2, 3, 4 or 5 times. In some embodiments, a retinal sample obtained using the methods described herein contains no or substantially no extraocular cells.

[00101] В некоторых вариантах осуществления образцы сетчатки, выделенные с применением способов, описанных в настоящем документе, разделяют с получением выделенных клеток сетчатки и скоплений клеток сетчатки, которые культивируют с применением ретинальных клеток-предшественников. В некоторых вариантах осуществления диссоциация образца сетчатки является механической. В некоторых вариантах осуществления диссоциация включает: (i) перенос образца сетчатки в пробирку, (ii) механическую диссоциацию образца сетчатки с получением множества разделенных первичных ретинальных клеток, (iii) осаждение множества разделенных первичных ретинальных клеток с помощью центрифугирования, и (iv) удаление супернатанта. Механическая диссоциация может быть осуществлена любыми способами, известными в данной области, включающими, без ограничения, суспендирование стерильной пипеткой. В некоторых вариантах осуществления суспендирование выполняют несколько раз, например от 2 до 50 раз, от 2 до 10 раз или от 2 до 8 раз, или до тех пор, пока образец сетчатки не будет разбит на скопления клеток подходящего размера. В некоторых вариантах осуществления суспендирование проводят от 4 до 8 раз.[00101] In some embodiments, retinal samples isolated using the methods described herein are separated to produce isolated retinal cells and retinal cell aggregates, which are cultured using retinal progenitor cells. In some embodiments, the dissociation of the retinal sample is mechanical. In some embodiments, the dissociation comprises: (i) transferring the retinal sample into a tube, (ii) mechanically dissociating the retinal sample to produce a plurality of separated primary retinal cells, (iii) pelleting the plurality of separated primary retinal cells by centrifugation, and (iv) removing the supernatant . Mechanical dissociation can be accomplished by any means known in the art, including, without limitation, suspension with a sterile pipette. In some embodiments, suspension is performed multiple times, such as 2 to 50 times, 2 to 10 times, or 2 to 8 times, or until the retinal sample is broken down into cell clusters of an appropriate size. In some embodiments, the suspension is performed 4 to 8 times.

[00102] В некоторых вариантах осуществления диссоциация образца сетчатки включает расщепление протеазой. В некоторых вариантах осуществления диссоциация образца сетчатки включает расщепление протеазой и механическую диссоциацию. В некоторых вариантах осуществления протеазой является трипсин. Подходящие композиции трипсина известны средним специалистам в данной области и включают, без ограничения, TrypLE (Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (Invitrogen) и TrypLE Express (Invitrogen). Например, выделенные сетчатки могут пипетировать в неразведенный TrypLE Express. Активность протеаз, таких как трипсин, можно нейтрализовать добавлением избытка среды без протеаз для остановки реакции. Например, 5×, 10×, 15× или 20× избыток культуральной среды можно добавлять к смеси, включающей разделенные сетчатки.[00102] In some embodiments, dissociation of the retinal sample includes protease digestion. In some embodiments, dissociation of the retinal sample includes protease digestion and mechanical dissociation. In some embodiments, the protease is trypsin. Suitable trypsin compositions are known to those of ordinary skill in the art and include, but are not limited to, TrypLE (Thermo Fisher Scientific), TrypLE Select (Invitrogen) and TrypLE Express (Invitrogen). For example, isolated retinas can be pipetted into undiluted TrypLE Express. The activity of proteases such as trypsin can be neutralized by adding excess protease-free media to stop the reaction. For example, a 5×, 10×, 15×, or 20× excess of culture medium can be added to the mixture comprising the separated retinas.

[00103] Диссоциацию могут проводить путем физической диссоциации и/или обработки препаратом фермента, который способствует освобождению клеток от других компонентов ткани с получением "разделенной суспензии" клеток и/или скоплений клеток. Примеры таких ферментов включают, без ограничения перечисленными, матриксные металлопротеиназы, клострипаин, папаин, трипсин, трипсиноподобные протеазы, пепсин, пепсиноподобные протеазы, протеазы нейтрального типа и коллагеназы. Подходящие протеолитические ферменты описаны в патентах США 5,079,160; 6,589,728; 5,422,261; 5,424,208 и 5,322,790. Например, ферментный препарат может включать трипсин отдельно или в комбинации с одним или более дополнительными ферментами. Ферментативную диссоциацию могут проводить в сочетании с физической диссоциацией, например, измельчением, пипетированием, гомогенизацией, растиранием, замораживанием-оттаиванием, осмотическим шоком, для удаления нежелательных клеток или соединительной ткани и, в конечном итоге, с получением культур одиночных клеток или скоплений клеток, которые можно определить по размеру, т.е. "мелкие", "средние" и "крупные". Размер скоплений клеток является субъективным и может изменяться в зависимости от изобретения, раскрытого в настоящем документе. Выделенные первичные ретинальные клетки, описанные в настоящем документе, включают выделенные клетки и скопления клеток. Скопления выделенных первичных ретинальных клеток могут включать приблизительно 2-5000 клеток, 2-4000 клеток, 2-3000 клеток, 2-2000 клеток, 2-1000 клеток, 2-100 клеток, 50-5000 клеток, 50-4000 клеток, 50-3000 клеток, 50-2000 клеток, 50-1000 клеток, 50-100 клеток, 500-5000 клеток или 500-1000 клеток.[00103] Dissociation may be accomplished by physical dissociation and/or treatment with an enzyme preparation that promotes the release of cells from other tissue components to produce a “compartmental suspension” of cells and/or cell aggregates. Examples of such enzymes include, but are not limited to, matrix metalloproteinases, clostripain, papain, trypsin, trypsin-like proteases, pepsin, pepsin-like proteases, neutral type proteases, and collagenases. Suitable proteolytic enzymes are described in US patents 5,079,160; 6,589,728; 5,422,261; 5,424,208 and 5,322,790. For example, the enzyme preparation may include trypsin alone or in combination with one or more additional enzymes. Enzymatic dissociation can be performed in combination with physical dissociation, such as grinding, pipetting, homogenization, trituration, freeze-thaw, osmotic shock, to remove unwanted cells or connective tissue and ultimately produce cultures of single cells or clusters of cells that can be determined by size, i.e. "small", "medium" and "large". The size of the cell aggregates is subjective and may vary depending on the invention disclosed herein. The isolated primary retinal cells described herein include isolated cells and cell aggregates. Clusters of isolated primary retinal cells may include approximately 2-5000 cells, 2-4000 cells, 2-3000 cells, 2-2000 cells, 2-1000 cells, 2-100 cells, 50-5000 cells, 50-4000 cells, 50- 3000 cells, 50-2000 cells, 50-1000 cells, 50-100 cells, 500-5000 cells or 500-1000 cells.

[00104] Композиции, включающие множества выделенных первичных ретинальных клеток, могут осаждать с помощью центрифугирования, чтобы сконцентрировать клетки, промыть клетки или заменить среду для культивирования клеток. Например, множества разделенных первичных ретинальных клеток могут промывать культуральной средой или PBS, необязательно с добавкой антибиотика. Множества разделенных первичных ретинальных клеток могут осаждать с помощью центрифугирования от приблизительно 100×g (центробежное ускорение) до приблизительно 1000×g, от приблизительно 100×g до приблизительно 500×g и от приблизительно 140×g до приблизительно 300×g. В некоторых вариантах осуществления множество разделенных первичных ретинальных клеток осаждают с помощью центрифугирования приблизительно при 140×g. В некоторых вариантах осуществления множество разделенных первичных ретинальных клеток осаждают с помощью центрифугирования приблизительно при 300×g. Центрифугирование могут проводить приблизительно от 1 минуты до 30 минут. Например, композиции, включающие множества выделенных первичных ретинальных клеток, могут центрифугировать в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 или 30 минут. Центрифугирование могут проводить при любой температуре, требуемой для поддержания жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции, включающие множества выделенных первичных ретинальных клеток, центрифугируют при температуре приблизительно от 0°C до 50°C. В некоторых вариантах осуществления композиции, включающие множества выделенных первичных ретинальных клеток, центрифугируют приблизительно при 4°C. В некоторых вариантах осуществления композиции, включающие множества выделенных первичных ретинальных клеток, центрифугируют приблизительно при 18-24°C. В некоторых вариантах осуществления композиции, включающие множества выделенных первичных ретинальных клеток, центрифугируют приблизительно при 37°C.[00104] Compositions comprising pluralities of isolated primary retinal cells can be pelleted by centrifugation to concentrate the cells, wash the cells, or replace the cell culture medium. For example, multiple separated primary retinal cells may be washed with culture medium or PBS, optionally supplemented with an antibiotic. The plurality of separated primary retinal cells can be pelleted by centrifugation from about 100 x g (centrifugal acceleration) to about 1000 x g, from about 100 x g to about 500 x g, and from about 140 x g to about 300 x g. In some embodiments, a plurality of separated primary retinal cells are pelleted by centrifugation at approximately 140×g. In some embodiments, a plurality of separated primary retinal cells are pelleted by centrifugation at approximately 300×g. Centrifugation can be carried out for approximately 1 minute to 30 minutes. For example, compositions comprising multiple isolated primary retinal cells may be centrifuged for about 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, or 30 minutes. Centrifugation can be carried out at any temperature required to maintain cell viability. In some embodiments, compositions comprising pluralities of isolated primary retinal cells are centrifuged at a temperature of from about 0°C to about 50°C. In some embodiments, the compositions comprising the plurality of isolated primary retinal cells are centrifuged at approximately 4°C. In some embodiments, the compositions comprising the plurality of isolated primary retinal cells are centrifuged at approximately 18-24°C. In some embodiments, the compositions comprising the plurality of isolated primary retinal cells are centrifuged at approximately 37°C.

[00105] В некоторых вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, способы включают: (i) ресуспендирование разделенных осажденных первичных ретинальных клеток в культуральной среде с температурой приблизительно 1-8°C с добавкой антибиотика, (ii) посев множества разделенных ретинальных клеток в одну или более флаконов или планшетов для культур клеток с покрытием, содержащих культуральную среду, где в среду для культуры клеток необязательно добавлен антибиотик, (iii) инкубирование множества разделенных ретинальных клеток приблизительно при 10-50°C, где инкубирование необязательно проходит приблизительно при 37°C, и (iv) определение количества и жизнеспособности первичных ретинальных клеток и скоплений ретинальных клеток. Флаконы или планшеты могут засевать при любой подходящей плотности. Например, во флаконы или планшеты могут сеять от приблизительно 1 до приблизительно 1000000000 клеток. В альтернативе флаконы или планшеты могут засевать при плотности от приблизительно 10000 до приблизительно 5×10⁶ клеток на квадратный сантиметр (см²). В качестве другой альтернативы флаконы или планшеты могут засевать при плотности от приблизительно 0,50×10⁶ до приблизительно 2,5×10⁶ клеток на квадратный сантиметр (см²). В качестве другой альтернативы флаконы или планшеты могут засевать при плотности от приблизительно 0,82×10⁶ до приблизительно 2,06×10⁶ клеток на квадратный сантиметр (см²). В качестве другой альтернативы флаконы или планшеты могут засевать при плотности от приблизительно 0,1×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 3×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 4×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 5×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 6×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 7×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 8×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 9×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 10×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,2×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,2×10⁶ до приблизительно 5×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,2×10⁶ до приблизительно 4×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,2×10⁶ до приблизительно 3×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,2×10⁶ до приблизительно 2×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 5×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 4×10⁶ клеток за см², от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 3×10⁶ клеток за см² или от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 2,5×10⁶ клеток за см².[00105] In some embodiments of the methods described herein, the methods include: (i) resuspending separated, pelleted primary retinal cells in a culture medium at a temperature of approximately 1-8° C. supplemented with an antibiotic, (ii) seeding a plurality of separated retinal cells in one or more coated cell culture flasks or plates containing a culture medium, wherein an antibiotic is optionally added to the cell culture medium, (iii) incubating a plurality of separated retinal cells at about 10-50°C, wherein the incubation is optionally at about 37°C C, and (iv) determination of the number and viability of primary retinal cells and retinal cell aggregates. Vials or plates can be inoculated at any suitable density. For example, from about 1 to about 100,000,000 cells can be seeded into vials or plates. Alternatively, flasks or plates can be seeded at densities of from about 10,000 to about 5×10 ⁶ cells per square centimeter (cm ² ). As another alternative, flasks or plates can be seeded at a density of from about 0.50 x 10 ⁶ to about 2.5 x 10 ⁶ cells per square centimeter (cm ² ). As another alternative, flasks or plates can be seeded at a density of from about 0.82 x 10 ⁶ to about 2.06 x 10 ⁶ cells per square centimeter (cm ² ). As another alternative, flasks or plates can be seeded at a density of from about 0.1 x 10 ⁶ to about 20 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 1 x 10 ⁶ to about 20 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 2 ×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 3×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 4×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 5×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 6×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 7×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 8×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , approximately 9×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , approximately 10×10 ⁶ to approximately 20×10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.2 x 10 ⁶ to about 10 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.2 x 10 ⁶ to about 5 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.2 x 10 ⁶ to about 4 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.2 x 10 ⁶ to about 3 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.2 x 10 ⁶ to about 2 x 10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.5 ×10 ⁶ to approximately 10×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 0.5×10 ⁶ to approximately 5×10 ⁶ cells per cm ² , from approximately 0.5×10 ⁶ to approximately 4×10 ⁶ cells per cm ² , from about 0.5x10 ⁶ to about 3x10 ⁶ cells per cm ² or from about 0.5x10 ⁶ to about 2.5x10 ⁶ cells per cm ² .

[00106] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают от приблизительно 20×10⁶ до приблизительно 1×10⁹ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 20×10⁶ до приблизительно 1×10⁸ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 20×10⁶ до приблизительно 1×10⁷ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 30×10⁶ до приблизительно 1×10⁹ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 30×10⁶ до приблизительно 1×10⁸ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 30×10⁶ до приблизительно 1×10⁷ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 20×10⁶ до приблизительно 147×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, от приблизительно 20×10⁶ до приблизительно 100×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток или от приблизительно 73×10⁶ до приблизительно 147×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 20×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 30×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 35×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 30×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 45×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 50×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток. В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в настоящем документе, дают по меньшей мере приблизительно 20×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 30×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 40×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 50×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 60×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 70×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 80×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 90×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 100×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 120×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 140×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 145×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 147×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 150×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 170×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток, по меньшей мере приблизительно 190×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток или по меньшей мере приблизительно 200×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток.[00106] In some embodiments, the methods described herein produce from about 20x10 ⁶ to about 1x10 ⁹ viable primary retinal cells, from about 20x10 ⁶ to about 1x10 ⁸ viable primary retinal cells, from about 20x10 ⁶ to about 1x10 ⁷ viable primary retinal cells, from about 30x10 ⁶ to about 1x10 ⁹ viable primary retinal cells, from about 30x10 ⁶ to about 1x10 ⁸ viable primary retinal cells, from about 30x10 ⁶ to about 1x10 ⁷ viable primary retinal cells, from about 20x10 ⁶ to about 147x10 ⁶ viable primary retinal cells, from about 20x10 ⁶ to about 100x10 ⁶ viable primary retinal cells or from about 73x10 ⁶ to about 147x10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 20×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 30×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 35×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 30×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 45×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 50×10 ⁶ viable primary retinal cells. In some embodiments, the methods described herein produce at least about 20 x 10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 30 x 10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 40 x 10 ⁶ viable primary retinal cells , at least about 50×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 60×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 70×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 80×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 90×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 100×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 120×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 140×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 145×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 147×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 150×10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 170× 10 ⁶ viable primary retinal cells, at least about 190×10 ⁶ viable primary retinal cells, or at least about 200×10 ⁶ viable primary retinal cells.

Морфология, количество и жизнеспособность клетокMorphology, number and cell viability

[00107] В настоящем документе предложены способы определения жизнеспособности, количества и морфологии первичных ретинальных клеток из образца сетчатки, и ретинальных клеток-предшественников, полученных из первичных ретинальных клеток.[00107] Provided herein are methods for determining the viability, number, and morphology of primary retinal cells from a retinal sample, and retinal progenitor cells derived from primary retinal cells.

[00108] Морфологию клеток можно определить с помощью световой микроскопии при использовании любого подходящего метода. Подходящие методы световой микроскопии известны специалистам в данной области и включают, без ограничения перечисленными, дифференциальную интерференционную контрастную микроскопию, микроскопию Номарского, микроскопию с модуляционным контрастом Хоффмана и их вариации, флуоресцентную микроскопию и конфокальную микроскопию. Необязательно может использоваться гистохимическое окрашивание на один или более маркеров выделенных первичных ретинальных клеток.[00108] Cell morphology can be determined by light microscopy using any suitable method. Suitable light microscopy techniques are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, differential interference contrast microscopy, Nomarski microscopy, Hoffman modulated contrast microscopy and variations thereof, fluorescence microscopy and confocal microscopy. Optionally, histochemical staining for one or more markers of the isolated primary retinal cells may be used.

[00109] Количество и жизнеспособность клеток можно измерять с помощью автоматического счетчика клеток NC200 (Chemometec) и метода подсчета агрегированных клеток. Альтернативно или дополнительно, количество клеток и их жизнеспособность можно измерять с использованием трипанового синего или гемоцитометра.[00109] Cell number and viability can be measured using the NC200 automatic cell counter (Chemometec) and the aggregated cell counting method. Alternatively or additionally, cell number and viability can be measured using trypan blue or a hemocytometer.

[00110] В некоторых вариантах осуществления процент жизнеспособных подсчитанных клеток составляет от приблизительно 10% до приблизительно 100% или от приблизительно 68% до приблизительно 85%.[00110] In some embodiments, the percentage of viable cells counted is from about 10% to about 100%, or from about 68% to about 85%.

[00111] Фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих экспрессируют количественно разные профили генов, например, как описано в настоящем документе; или они экспрессируют количественно разные профили растворимых факторов; или они экспрессируют количественно разные профили поверхностных маркеров. Более того, фетальные ретинальные клетки или клетки RPC млекопитающих имеют генный профиль, который не является фиксированным, постоянным или неизменным. Скорее они имеют генный профиль, который в культуре динамически изменяется количественно в зависимости от времени.[00111] Mammalian fetal retinal cells or RPC cells express quantitatively different gene profiles, for example, as described herein; or they express quantitatively different profiles of soluble factors; or they express quantitatively different profiles of surface markers. Moreover, mammalian fetal retinal cells or RPC cells have a gene profile that is not fixed, constant or unchanging. Rather, they have a gene profile that dynamically changes quantitatively over time in culture.

[00112] Изобретение, раскрытое в настоящем документе, относится к популяции клеток, содержащей ретинальные клетки-предшественники млекопитающего, которые выделены в соответствии с определенным способом культивирования клеток и которые экспрессируют характеристические маркеры. Популяция клеток может быть культурой клеток, выделенных у млекопитающего и выращенных in vitro. Например, культура может включать суспензию клеток или адгерентных клеток, культивируемых в культуральном планшете, чашке, флаконе или биореакторе. Образец может быть гомогенным или гетерогенным, что может быть определено по экспрессии одного или более маркеров, как определено в настоящем документе. Популяция клеток, описанная в настоящем документе, представляет собой смешанную популяцию клеток и может содержать смесь недифференцированных и дифференцированных клеток. Относительные уровни экспрессии маркеров, характеристических для ретинальных клеток-предшественников, определенных в настоящем документе, у клеток в популяции могут отличаться.[00112] The invention disclosed herein relates to a population of cells comprising mammalian retinal progenitor cells that are isolated according to a specific cell culture method and that express characteristic markers. The cell population may be a culture of cells isolated from a mammal and grown in vitro . For example, the culture may include a suspension of cells or adherent cells cultured in a culture plate, dish, flask, or bioreactor. A sample may be homogeneous or heterogeneous, as determined by the expression of one or more markers as defined herein. The population of cells described herein is a mixed population of cells and may contain a mixture of undifferentiated and differentiated cells. The relative levels of expression of markers characteristic of retinal progenitor cells defined herein may differ among cells in a population.

[00113] Ретинальные клетки-предшественники могут характеризоваться по экспрессии молекулярных маркеров, включая маркеры клеточной поверхности и неповерхностные ("генетические") маркеры. Хотя в данной области принято называть клетки "положительными" или "отрицательными" на конкретный маркер, фактические уровни экспрессии определяют количественно. Количество молекул на клеточной поверхности (или расположенных где-либо в другом месте) может отличаться на несколько порядков, но при этом все же может быть охарактеризовано как "положительное". Специалистам в данной области также понятно, что клетка, отрицательная при окрашивании, т.е. когда уровень связывания специфичного к маркеру реагента не отличается заметно от контроля, например, контроля, совпадающего по изотипу, может экспрессировать минорные количества маркера. Анализ уровня мечения ("окрашивания") позволяет проводить тонкие различия между популяциями клеток. Интенсивность окрашивания клеток можно контролировать с помощью проточной цитометрии, где лазеры определяют количественные уровни флуорохрома (которые пропорциональны количеству маркера клеточной поверхности, связанного со специфичными реагентами, например антителами). Проточная цитометрия, или FACS, также может применяться для разделения популяций клеток по интенсивности связывания с конкретным реагентом, а также другим параметрам, таким как размер клеток и светорассеяние. Хотя абсолютный уровень окрашивания может отличаться в зависимости от конкретного флуорохрома и препарата реагента, данные можно нормализовать по контролю.[00113] Retinal progenitor cells can be characterized by the expression of molecular markers, including cell surface markers and non-surface (“genetic”) markers. Although it is common practice in the art to refer to cells as “positive” or “negative” for a particular marker, actual expression levels are quantified. The number of molecules on the cell surface (or located elsewhere) can vary by several orders of magnitude, but can still be characterized as “positive.” It will also be understood by those skilled in the art that a cell that is negative for staining, i.e. when the level of binding of a marker-specific reagent does not differ markedly from the control, for example, an isotype-matched control may express minor amounts of the marker. Analysis of the level of labeling ("staining") allows subtle distinctions between cell populations. The intensity of cell staining can be monitored using flow cytometry, where lasers detect quantitative levels of fluorochrome (which are proportional to the amount of cell surface marker bound to specific reagents, such as antibodies). Flow cytometry, or FACS, can also be used to separate cell populations based on the intensity of binding to a particular reagent, as well as other parameters such as cell size and light scattering. Although the absolute level of staining may vary depending on the specific fluorochrome and reagent preparation, the data can be normalized to the control.

[00114] Для нормализации распределения по контролю каждую клетку регистрируют как точку данных, имеющую определенную интенсивность окрашивания. Эти точки данных могут отображать на логарифмической шкале, где единицей измерения является условная интенсивность окрашивания. Например, самые яркие окрашенные клетки в образце могут быть на 4 log порядка более интенсивными, чем неокрашенные клетки. При таком отображении клетки, попадающие в наиболее высокий логарифм интенсивности окрашивания, являются яркими, а клетки с самой низкой интенсивностью - отрицательными. Клетки с "низким" положительным окрашиванием имеют уровень окрашивания выше яркости изотипически совпадающего контроля, но не такой интенсивный, как у наиболее ярко окрашенных клеток, обычно встречающиеся в популяции. Низкоположительные клетки могут обладать уникальными свойствами, которые отличаются от отрицательных и ярко окрашенных положительных клеток образца. В альтернативном контроле могут использовать субстрат, имеющий определенную плотность маркера на своей поверхности, например, промышленно изготовленную сферу или линию клеток, которые обеспечивают положительный контроль интенсивности.[00114] To normalize the distribution to the control, each cell is recorded as a data point having a certain staining intensity. These data points can be displayed on a logarithmic scale, where the unit of measurement is the conditional intensity of the staining. For example, the brightest stained cells in a sample may be 4 log orders of magnitude more intense than unstained cells. In this display, cells falling in the highest logarithm of staining intensity are bright, and cells with the lowest intensity are negative. Cells with “low” positive staining have a level of staining higher than the brightness of the isotype-matched control, but not as intense as that of the most brightly stained cells typically found in the population. Low-positive cells may have unique properties that differ from the negative and brightly stained positive cells in the sample. An alternative control may use a substrate that has a specific density of marker on its surface, such as a commercially manufactured bead or cell line that provides a positive intensity control.

[00115] Экспрессия маркеров может изменяться во время культивирования ткани сетчатки, из которой происходят ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток. Например, на различия в экспрессии маркеров могут влиять условия культивирования, такие как уровни кислорода (например, показатели атмосферного кислорода или "нормоксические" условия; или условия с низким содержанием кислорода, также известные как "гипоксические" условия). В качестве неограничивающего примера условия с низким содержанием кислорода могут включать приблизительно 0,5-10% кислорода (например, приблизительно 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5%, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10%). В некоторых вариантах осуществления условия с низким содержанием кислорода могут включать приблизительно 0,5-5%, приблизительно 1-5% или приблизительно 1-3%. Специалистам в данной области известно, что экспрессия маркеров ретинальных клеток-предшественников и популяций клеток не является статической и может изменяться в зависимости от одного или нескольких условий культивирования, например, культуральной среды, уровней кислорода, количества пассажей, времени культивирования и т.д.[00115] Expression of markers can change during culture of retinal tissue from which retinal progenitor cells and cell populations are derived. For example, differences in marker expression may be influenced by culture conditions such as oxygen levels (eg, atmospheric oxygen levels or “normoxic” conditions; or low oxygen conditions, also known as “hypoxic” conditions). By way of non-limiting example, low oxygen conditions may include about 0.5-10% oxygen (e.g., about 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 , 5, 5.5, 6, 6.5%, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 or 10%). In some embodiments, low oxygen conditions may include about 0.5-5%, about 1-5%, or about 1-3%. Those skilled in the art will recognize that the expression of retinal progenitor cell markers and cell populations is not static and may vary depending on one or more culture conditions, such as culture medium, oxygen levels, number of passages, culture time, etc.

[00116] Ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток могут экспрессировать один или больше, два или больше, три или больше, четыре или больше, пять или больше, шесть или больше, семь или больше, восемь или больше, девять или больше, десять или больше, одиннадцать или больше, двенадцать или больше, тринадцать или больше, пятнадцать или больше, шестнадцать или больше, семнадцать или больше, восемнадцать или больше, девятнадцать или больше, двадцать или больше, двадцать пять или больше, тридцать или больше маркеров, определенных в настоящем документе, или любое промежуточное приращение до пятидесяти или более маркеров.[00116] Retinal progenitor cells and cell populations may express one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more, ten or more, eleven or more, twelve or more, thirteen or more, fifteen or more, sixteen or more, seventeen or more, eighteen or more, nineteen or more, twenty or more, twenty five or more, thirty or more markers defined in herein, or any intermediate increment of fifty or more tokens.

Культивирование первичных ретинальных клеток и ретинальных клеток-предшественников (RPC)Cultivation of primary retinal cells and retinal progenitor cells (RPCs)

[00117] В настоящем документе предложены способы культивирования первичных ретинальных клеток и ретинальных клеток-предшественников с целью получения популяций ретинальных клеток-предшественников для трансплантации и терапевтических применений.[00117] Provided herein are methods for culturing primary retinal cells and retinal progenitor cells to obtain retinal progenitor cell populations for transplantation and therapeutic applications.

[00118] Способы, описанные в настоящем документе, могут обеспечивать получение больших количеств жизнеспособных клеток. Например, способы, описанные в настоящем документе, могут давать приблизительно 1 миллиард ретинальных клеток-предшественников или больше при сборе. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% клеток являются жизнеспособными.[00118] The methods described herein can provide large quantities of viable cells. For example, the methods described herein can produce approximately 1 billion retinal progenitor cells or more per harvest. In some embodiments, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, or at least 90% of the cells are viable.

[00119] В некоторых вариантах осуществления донорские клетки могут культивировать без антибиотиков во избежание изменения клеток. Кроме того, без антибиотиков возможно использовать клетки после очень малого числа пассажей, так как можно исключить скрытую микробную контаминацию. В альтернативных вариантах осуществления применение клеток после малого числа пассажей связано с низким риском перерождения и/или образования опухолей. Кроме того, применение клеток после малого числа пассажей наиболее приближено к естественным клеткам, присутствующим в развивающейся сетчатке.[00119] In some embodiments, donor cells may be cultured without antibiotics to avoid cell alteration. In addition, without antibiotics it is possible to use cells after a very small number of passages, since latent microbial contamination can be excluded. In alternative embodiments, use of cells after a low number of passages is associated with a low risk of degeneration and/or tumor formation. In addition, the use of cells after a small number of passages is most similar to the natural cells present in the developing retina.

[00120] В некоторых вариантах осуществления первичные ретинальные клетки и ретинальные клетки-предшественники культивируют с использованием антибиотика. Подходящие антибиотики включают, без ограничения перечисленными, пенициллин, стрептомицин и гентамицин. В некоторых вариантах осуществления антибиотик включает гентамицин. В некоторых вариантах осуществления гентамицин присутствует в концентрации приблизительно 0,5-50 мкг/мл, например, приблизительно 0,5-40 мкг/мл, приблизительно 5-50 мкг/мл или приблизительно 5-35 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления гентамицин присутствует в концентрации приблизительно 50 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления гентамицин присутствует в концентрации приблизительно 30 мкг/мл.[00120] In some embodiments, primary retinal cells and retinal progenitor cells are cultured using an antibiotic. Suitable antibiotics include, but are not limited to, penicillin, streptomycin and gentamicin. In some embodiments, the antibiotic includes gentamicin. In some embodiments, gentamicin is present at a concentration of about 0.5-50 μg/ml, such as about 0.5-40 μg/ml, about 5-50 μg/ml, or about 5-35 μg/ml. In some embodiments, gentamicin is present at a concentration of approximately 50 μg/ml. In some embodiments, gentamicin is present at a concentration of approximately 30 μg/ml.

[00121] Для роста и культивирования RPC могут использоваться любые подходящие базальные среды. Культура клеток описывает процесс, с помощью которого клетки выращивают в контролируемых условиях, как правило, вне их естественного окружения. Популяции клеток выращивают или культивируют в любой среде для культивирования клеток, известной в данной области. Термин "базальная среда" относится к любой среде, которая может поддерживать рост клеток. Базальная среда содержит стандартные неорганические соли, такие как цинк, железо, магний, кальций и калий, витамины, глюкозу, буферную систему и ключевые аминокислоты. Базальная среда, которая может использоваться в настоящем изобретении, включает, без ограничения перечисленным, минимальную питательную среду Игла, ADC-1, LPM (без бычьего сывороточного альбумина), F10 (Хэма), F12 (Хэма), DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, среду BGJ (с и без модификации Фиттона-Джексона), базальную среду Игла (BME - с добавкой солевой основы Эрла), среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM - без сыворотки), Яманэ, IMEM-20, среду Игла в модификации Глазго (GMEM), среду Лейбовица L-15, среду Маккоя 5А, среду M199 (M199E - с солевой основой Эрла), среду M199 (M199H - с солевой основой Хэнкса), минимальную питательную среду Игла (MEM - с солевой основой Эрла), минимальную питательную среду Игла (MEM-H - с солевой основой Хэнкса) и минимальную питательную среду Игла (MEM-NAA с заменимыми аминокислотами), среди других многочисленных, включая среду 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153 и Ultraculture. В альтернативных вариантах осуществления среды для применения при культивировании ретинальных клеток-предшественников, раскрытых в настоящем документе, представляют собой улучшенную DMEM/F12 и Ultraculture. Некоторые из этих сред коротко описаны в Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", стр. 62-72.[00121] Any suitable basal media may be used for growth and culture of RPCs. Cell culture describes the process by which cells are grown under controlled conditions, usually outside their natural environment. Cell populations are grown or cultured in any cell culture medium known in the art. The term "basal medium" refers to any medium that can support cell growth. The basal medium contains standard inorganic salts such as zinc, iron, magnesium, calcium and potassium, vitamins, glucose, a buffer system and key amino acids. Basal media that can be used in the present invention include, but are not limited to, Eagle's minimal essential medium, ADC-1, LPM (no bovine serum albumin), F10, F12, DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ medium (with and without Fitton-Jackson modification), basal Eagle's medium (BME - with the addition of Earle's salt base), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM - without serum), Yamane, IMEM-20, Glasgow modified Eagle's medium (GMEM) ), Leibowitz L-15 medium, McCoy 5A medium, M199 medium (M199E - with Earle's salt base), M199 medium (M199H - with Hanks' salt base), Eagle's minimal nutrient medium (MEM - with Earle's salt base), minimal nutrient medium Needle (MEM-H - with Hanks' salt base) and Needle's minimal essential medium (MEM-NAA with nonessential amino acids), among numerous others, including medium 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB 75261, MAB 8713 , DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153, and Ultraculture. In alternative embodiments, media for use in culturing retinal progenitor cells disclosed herein are enhanced DMEM/F12 and Ultraculture. Some of these media are briefly described in Methods in Enzymology, Volume LVIII, "Cell Culture", pp. 62-72.

[00122] В некоторых вариантах осуществления питательная среда включает среду Игла в модификации Дульбекко DMEM/F12, улучшенную DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, нейробазальные среды, ReNcell или Ultraculture. В некоторых вариантах осуществления среда включает DMEM/F12.[00122] In some embodiments, the culture medium includes Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM/F12, enhanced DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, neurobasal media, ReNcell, or Ultraculture. In some embodiments, the medium includes DMEM/F12.

[00123] "Кондиционированная среда" относится к среде, которая изменена по сравнению с базовой или базальной средой. Например, кондиционирование среды может включать повышение или снижение уровней молекул, таких как питательные вещества и/или факторы роста, относительно исходных уровней, присутствующих в базовой среде. Среду можно кондиционировать, позволяя клеткам определенных типов расти или поддерживая их в среде при определенных условиях в течение определенного периода времени. Например, среду можно кондиционировать, позволяя ретинальным клеткам-предшественникам размножаться, дифференцироваться или поддерживаться в среде с определенным составом при определенной температуре в течение определенного количества часов. Специалистам в данной области техники будет понятно, что многочисленные комбинации клеток, типов сред, продолжительности и условий окружающей среды можно использовать для получения почти бесконечного множества кондиционированных сред.[00123] "Conditioned medium" refers to a medium that is modified from the base or basal medium. For example, conditioning the medium may involve increasing or decreasing the levels of molecules, such as nutrients and/or growth factors, relative to the baseline levels present in the basal medium. The medium can be conditioned by allowing certain types of cells to grow or maintaining them in the medium under certain conditions for a certain period of time. For example, the medium can be conditioned to allow the retinal progenitor cells to proliferate, differentiate, or be maintained in a medium of a particular composition at a certain temperature for a certain number of hours. Those skilled in the art will appreciate that numerous combinations of cells, media types, durations, and environmental conditions can be used to produce an almost endless variety of conditioned media.

[00124] Примеры дополнительных компонентов или добавок для культур клеток включают, без ограничения, ингредиенты, частично или полностью заменяющие сыворотку при поддержании выживания или роста клеток. Например, добавки могут включать инсулин, трансметаллопротеины, микроэлементы, витамины или другие факторы. Эти факторы обычно не включают в состав базальной среды, но их предоставляет сыворотка, обычно используемая при культивировании клеток. Дополнительный компонент или добавка может включать по меньшей мере один или больше из следующих компонентов, которые поддерживают рост клеток: один или более инсулинов или их заменителей, один или более трансметаллопротеинов или их заменителей, один или более микроэлементов (например, селен, железо, цинк, медь, кобальт, хром, иод, фторид, марганец, молибден, ванадий, никель, олово), один или более витаминов (например, витамин C, витамин E, витамин A, группа витаминов B), одна или более солей (например, соли натрия, соли магния, соли кальция или фосфатные соли), один или более буферов (например, фосфатно-солевой буфер, буфер HEPES), одна или более аминокислот (например, L-глутамин), один или более гормонов, гормоноподобные соединения или факторы роста (такие как, например, трансферрин, EGF, NGF, ECGF, PDGF, FGF, IGF, LIF, интерлейкины, интерфероны, TGF и/или VEGF, глюкагон, кортикостероиды, вазопрессин, простагландины и другие факторы роста), сывороточный альбумин или его заменители, один или более углеводов (глюкоза, галактоза, фруктоза, манноза, рибоза, гликолитические метаболиты), один или более антибиотиков и/или антимикотиков (например, пенициллин, стрептомицин, фунгизон) и один или более липидов (например, свободные и связанные с белками жирные кислоты, триглицериды, фосфолипиды, холестерин, этаноламин). Пример дополнительного компонента включает добавку N-2 (N2). Многие коммерческие добавки-заменители сыворотки, такие как KnockOut Serum Replacement (KOSR), N2, B27, StemPro (иногда именуемый в настоящем документе Stempro), добавка инсулин-трансферрин-селен (ITS) и G5, хорошо известны и легко доступны специалистам в данной области техники. Такие добавки характеризуются четко определенными ингредиентами, поэтому концентрации их компонентов могут быть определены на основе их процентного содержания в среде. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает эпидермальный фактор роста человека (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF).[00124] Examples of additional components or additives for cell culture include, but are not limited to, ingredients that partially or completely replace serum in supporting cell survival or growth. For example, supplements may include insulin, transmetalloproteins, trace minerals, vitamins, or other factors. These factors are not usually included in the basal medium, but are provided by the serum commonly used in cell culture. The additional component or supplement may include at least one or more of the following components that support cell growth: one or more insulins or substitutes therefor, one or more transmetalloproteins or substitutes thereof, one or more micronutrients (e.g., selenium, iron, zinc, copper, cobalt, chromium, iodine, fluoride, manganese, molybdenum, vanadium, nickel, tin), one or more vitamins (e.g. vitamin C, vitamin E, vitamin A, B vitamins), one or more salts (e.g. sodium, magnesium salts, calcium salts or phosphate salts), one or more buffers (eg, phosphate-buffered saline, HEPES buffer), one or more amino acids (eg, L-glutamine), one or more hormones, hormone-like compounds or growth factors (such as, for example, transferrin, EGF, NGF, ECGF, PDGF, FGF, IGF, LIF, interleukins, interferons, TGF and/or VEGF, glucagon, corticosteroids, vasopressin, prostaglandins and other growth factors), serum albumin or its substitutes , one or more carbohydrates (glucose, galactose, fructose, mannose, ribose, glycolytic metabolites), one or more antibiotics and/or antimycotics (e.g., penicillin, streptomycin, fungizone), and one or more lipids (e.g., free and protein-bound fatty acids, triglycerides, phospholipids, cholesterol, ethanolamine). An example of an additional component includes additive N-2 (N2). Many commercial whey replacement supplements, such as KnockOut Serum Replacement (KOSR), N2, B27, StemPro (sometimes referred to herein as Stempro), insulin-transferrin-selenium (ITS) supplement, and G5, are well known and readily available to those skilled in the art. field of technology. Such additives are characterized by clearly defined ingredients, so the concentrations of their components can be determined based on their percentage in the medium. In some embodiments, the culture medium includes human epidermal growth factor (EGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF).

[00125] В качестве неограничивающего примера клетки и/или небольшие клеточные скопления культивируют в стерильном окружении, содержащем бессывороточную среду или среду с сывороткой, а также антибиотики и противогрибковые средства, или без антибиотиков или противогрибковых средств, в течение не больше чем приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более пассажей. Клетки и/или небольшие клеточные скопления культивируют в базальной культуральной среде (например, среде Игла в модификации Дульбекко: питательной смеси F-12^TM (DMEM/F12^TM) или в улучшенной среде DMEM/F12^TM (Gibco-Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad Calif.)), или в средах ULTRACULTURE^TM (BioWhittaker-Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD), необязательно с добавкой N2 (Invitrogen) или B27, или B27 XenoFree (Invitrogen), L-глутамином или GlutaMax, или GlutaMAX-I (Invitrogen), и человеческими рекомбинантными факторами роста, включающими, например, EGF и bFGF (Invitrogen), или другими факторами роста. Например, среда DMEM/F12^TM используется для клеток человека, а среда ULTRACULTURE^TM используется для клеток кошек или собак.[00125] As a non-limiting example, cells and/or small cell aggregates are cultured in a sterile environment containing serum-free or serum-containing media and antibiotics and antifungals, or without antibiotics or antifungals, for no more than about 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 or more passages. Cells and/or small cell aggregates are cultured in basal culture medium (for example, Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ^TM (DMEM/F12 ^TM ) or in improved DMEM/F12 ^TM medium (Gibco-Invitrogen-Life Technologies, Carlsbad Calif.)), or in ULTRACULTURE ^TM media (BioWhittaker-Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD), optionally supplemented with N2 (Invitrogen) or B27, or B27 XenoFree (Invitrogen), L-glutamine or GlutaMax, or GlutaMAX- I (Invitrogen), and human recombinant growth factors including, for example, EGF and bFGF (Invitrogen), or other growth factors. For example, DMEM/F12 ^™ medium is used for human cells, and ULTRACULTURE ^™ medium is used for cat or dog cells.

[00126] В некоторых вариантах осуществления клетки и/или скопления клеток культивируют в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 пассажей. В некоторых вариантах осуществления клетки и/или скопления клеток культивируют в течение больше чем 5 пассажей. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает среду Игла в модификации Дульбекко DMEM/F12, улучшенную DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, нейробазальные среды, ReNcell и среды Ultraculture. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает улучшенную DMEM/F12.[00126] In some embodiments, cells and/or cell clusters are cultured for at least 1, 2, 3, 4, or 5 passages. In some embodiments, cells and/or cell clusters are cultured for more than 5 passages. In some embodiments, the culture medium includes Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM/F12, enhanced DMEM/F12, Knockout DMEM/F12, neurobasal media, ReNcell, and Ultraculture media. In some embodiments, the culture medium includes enhanced DMEM/F12.

[00127] В некоторых вариантах осуществления питательная среда включает улучшенную DMEM/F12, добавку N-2, GlutaMAX I, рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF). В некоторых вариантах осуществления культуральная среда дополнительно включает B27, B27 XenoFree или StemPro. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда включает гентамицин в концентрации приблизительно 30 мкг/мл.[00127] In some embodiments, the culture medium includes enhanced DMEM/F12, N-2 supplement, GlutaMAX I, recombinant human epidermal growth factor (EGF), and basic fibroblast growth factor (bFGF). In some embodiments, the culture medium further includes B27, B27 XenoFree, or StemPro. In some embodiments, the culture medium includes gentamicin at a concentration of approximately 30 μg/ml.

[00128] Культуральные среды также необязательно могут включать добавку альбумина, человеческого или кошачьего, или собачьего альбумина, или рекомбинантного альбумина, или альбумина. В качестве неограничивающего примера альбумин могут добавлять в количестве до начальной концентрации приблизительно 1,0 мг/мл.[00128] The culture media may also optionally include the addition of albumin, human or feline, or canine albumin, or recombinant albumin, or albumin. By way of non-limiting example, albumin may be added to an initial concentration of approximately 1.0 mg/ml.

[00129] Культуры ретинальных клеток-предшественников млекопитающих могут быть получены в среде с пониженным содержанием сыворотки или без сыворотки. Примеры сыворотки включают фетальную бычью сыворотку, телячью сыворотку, сыворотку новорожденных телят, козью сыворотку, лошадиную сыворотку, человеческую сыворотку, кроличью сыворотку, крысиную сыворотку, мышиную сыворотку, помимо прочего. При некоторых условиях культивирования концентрации сыворотки могут изменяться от приблизительно 0,05% об/об до приблизительно 20% об/об (например, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 5, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5 или 20%). Например, в некоторых процессах дифференцирования концентрация сыворотки в среде может составлять меньше чем приблизительно 0,05% (об/об), меньше, чем приблизительно 0,1% (об/об), меньше чем приблизительно 0,2% (об/об), меньше чем приблизительно 0,3% (об/об), меньше чем приблизительно 0,4% (об/об), меньше чем приблизительно 0,5% (об/об), меньше чем приблизительно 0,6% (об/об), меньше чем приблизительно 0,7% (об/об), меньше чем приблизительно 0,8% (об/об), меньше чем приблизительно 0,9% (об/об), меньше чем приблизительно 1% (об/об), меньше чем приблизительно 2% (об/об), меньше чем приблизительно 3% (об/об), меньше чем приблизительно 4% (об/об), меньше чем приблизительно 5% (об/об), меньше чем приблизительно 6% (об/об), меньше чем приблизительно 7% (об/об), меньше чем приблизительно 8% (об/об), меньше чем приблизительно 9% (об/об), меньше чем приблизительно 10% (об/об), меньше чем приблизительно 15% (об/об) или меньше чем приблизительно 20% (об/об). В некоторых вариантах осуществления ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток, включая ретинальные клетки-предшественники, выращивают без сыворотки ("бессывороточный"), без заменителя сыворотки и/или без какого-либо дополнительного компонента.[00129] Cultures of mammalian retinal progenitor cells can be established in serum-reduced or serum-free media. Examples of serum include fetal bovine serum, bovine serum, newborn calf serum, goat serum, horse serum, human serum, rabbit serum, rat serum, mouse serum, among others. Under some culture conditions, serum concentrations may vary from about 0.05% v/v to about 20% v/v (e.g., 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30 , 0.35, 0.40, 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0.90, 1 , 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 5, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9 ,5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5 , 18, 18.5, 19, 19.5 or 20%). For example, in some differentiation processes, the concentration of serum in the medium may be less than about 0.05% (v/v), less than about 0.1% (v/v), less than about 0.2% (v/v) ), less than about 0.3% (v/v), less than about 0.4% (v/v), less than about 0.5% (v/v), less than about 0.6% (v/v) /v), less than about 0.7% (v/v), less than about 0.8% (v/v), less than about 0.9% (v/v), less than about 1% (v/v) /v), less than about 2% (v/v), less than about 3% (v/v), less than about 4% (v/v), less than about 5% (v/v), less than about 6% (v/v), less than about 7% (v/v), less than about 8% (v/v), less than about 9% (v/v), less than about 10% (v/v) v), less than about 15% (v/v) or less than about 20% (v/v). In some embodiments, retinal progenitor cells and populations of cells, including retinal progenitor cells, are grown without serum ("serum-free"), without a serum substitute, and/or without any additional component.

[00130] Ретинальные клетки-предшественники или популяция клетки, содержащее ретинальные клетки-предшественники, культивируют в условиях отсутствия "ксеногенных" компонентов. "Свободный от ксеногенных компонентов" или "не содержащий ксеногенных компонентов" относится к условиям, когда клетки некоторого вида (например, человеческие клетки) выращивают или культивируют только в присутствии человеческих продуктов или добавок (например, человеческого сывороточного альбумина, человеческой сывороткы), но без продуктов, полученных из других видов. Это особенно важно для клеток, которые применяют для трансплантации у человека. Клетки, которые были подвергнуты контакту с различными неопределенными продуктами животного происхождения, нежелательны для клинических применений из-за повышенного риска отторжения трансплантата, иммунных реакций и вирусных или бактериальных инфекций, прионов и даже неуточненных зоонозов. Кроме того, в случае применения у всех млекопитающих, включая медицинское применение или применение у не относящихся к человеку млекопитающих (например, ветеринарное применение), клетки проверяют на нормальный кариотип или присутствие инфекции или контаминации, например, микоплазмой, грамотрицательными бактериями (например, тест на эндотоксин), грибами и т.п. Клетки могут также иссследовать на туморогенность или перерождение в злокачественный фенотип с помощью анализа активности теломеразы, экспрессии гена hTERT и роста в мягком агаре или образования опухоли у голых мышей. Такие анализы известны в уровне техники и хорошо знакомы квалифицированному специалисту.[00130] Retinal progenitor cells or a population of cells containing retinal progenitor cells are cultured under conditions free of “xenogeneic” components. "Free of xenogeneic components" or "free of xenogeneic components" refers to conditions where cells of some kind (eg, human cells) are grown or cultured only in the presence of human products or supplements (eg, human serum albumin, human serum), but without products obtained from other species. This is especially important for cells that are used for transplantation into humans. Cells that have been exposed to various unspecified animal products are undesirable for clinical applications due to an increased risk of transplant rejection, immune reactions and viral or bacterial infections, prions and even unspecified zoonoses. Additionally, for use in all mammals, including medical use or use in non-human mammals (e.g., veterinary use), the cells are tested for normal karyotype or the presence of infection or contamination, e.g., mycoplasma, gram-negative bacteria (e.g., test for endotoxin), mushrooms, etc. Cells can also be examined for tumorigenicity or transformation into a malignant phenotype by assaying telomerase activity, hTERT gene expression, and growth in soft agar or tumor formation in nude mice. Such assays are known in the art and are well known to those skilled in the art.

[00131] Ретинальные клетки-предшественники или популяции клеток, содержащие ретинальные клетки-предшественники, могут культивировать на слоях питающих клеток (например, эмбриональных или зрелых фибробластов) или в присутствии внеклеточных матриксных каркасов или субстратов, таких как коллаген, энтактин (нидоген), гепаринсульфат-протеогликаны, фибронектин, ламинин, желатин или Matrigel. Например, коллаген PURECOL^® известен в качестве стандарта всех коллагенов по чистоте (содержание коллагена >99,9%), функциональности и наиболее близок к нативному коллагену из всех доступных. Коллаген PURECOL^® приблизительно на 97% состоит из коллагена I типа, а остальную часть составляет коллаген III типа, и является идеальным для покрытия поверхностей, обеспечивая получение тонких слоев для культивирования клеток, или для применения в качестве твердого геля. Другим примером каркаса или субстрата, известного в данной области, является CELLstart (Invitrogen).[00131] Retinal progenitor cells or populations of cells containing retinal progenitor cells can be cultured on layers of feeder cells (eg, embryonic or mature fibroblasts) or in the presence of extracellular matrix scaffolds or substrates such as collagen, entactin (nidogen), heparin sulfate -proteoglycans, fibronectin, laminin, gelatin or Matrigel. For example, PURECOL ^® collagen is known as the standard of all collagens in purity (collagen content >99.9%), functionality and is the closest to native collagen available. PURECOL ^® collagen consists of approximately 97% type I collagen with the remainder being type III collagen, and is ideal for coating surfaces, providing thin layers for cell culture, or for use as a solid gel. Another example of a scaffold or substrate known in the art is CELLstart (Invitrogen).

[00132] В некоторых вариантах осуществления условия культивирования клеток могут включать выращивание клеток в инкубаторе, установленном на 37°C, 5% CO₂. Первичные ретинальные клетки, ретинальные клетки-предшественники или содержащие их популяции клеток можно культивировать при нормоксических или атмосферных условиях (приблизительно 20% O₂) и можно также выращивать в условиях, которые приближенно соответствуют уровням кислорода развивающейся сетчатки плода во время беременности, т.е. при условиях "низкого" содержания O₂ или "гипоксических" условиях, например, 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% или 10% кислорода или любое промежуточное приращение. В некоторых вариантах осуществления условия культивирования клеток могут включать выращивание клеток в инкубаторе, установленном на: (1) 37°C, при 0-30% CO₂ и 0-50% O₂, (2) 37°C, с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 20%; или (3) 37°C, с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 3%.[00132] In some embodiments, cell culture conditions may include growing cells in an incubator set at 37°C, 5% CO ₂ . Primary retinal cells, retinal progenitor cells, or populations of cells containing them can be cultured under normoxic or atmospheric conditions (approximately 20% O ₂ ) and can also be grown under conditions that approximate the oxygen levels of the developing fetal retina during pregnancy, i.e. under "low" _O2 or "hypoxic" conditions, e.g. 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4, 5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% or 10% oxygen or any increment in between . In some embodiments, cell culture conditions may include growing cells in an incubator set at: (1) 37°C, 0-30% CO ₂ and 0-50% O ₂ , (2) 37°C, containing CO ₂ less than or equal to 5% and O ₂ less than or equal to 20%; or (3) 37°C, with CO ₂ less than or equal to 5% and O ₂ less than or equal to 3%.

[00133] Плотность при посеве относится к количеству клеток на объем культуральной среды или к количеству клеток на см² в адгерентной культуре. Аналогичным термином в данном контексте является "конфлюентность", который обычно используется в качестве показателя количества клеток в чашке или флаконе для культуры клеток и относится к покрытию чашки или флакона клетками. Например, 100-процентная конфлюентность означает, что чашка полностью покрыта клетками, и поэтому не остается свободного места для роста клеток; тогда как 50-процентная конфлюентность означает, что покрыта приблизительно половина чашки и для роста клеток все еще остается свободное место.[00133] Seeding density refers to the number of cells per volume of culture medium or the number of cells per cm ² in an adherent culture. A similar term in this context is “confluence,” which is typically used as a measure of the number of cells in a cell culture dish or flask and refers to the coverage of the dish or flask with cells. For example, 100 percent confluency means that the dish is completely covered with cells, leaving no free space for cells to grow; whereas 50% confluency means that approximately half the plate is covered and there is still room for cells to grow.

[00134] В некоторых вариантах осуществления способы включают первый пассаж, включающий посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 3,0×10⁶ клеток на квадратный сантиметр (см²), от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 5,0×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,55×10⁶ до приблизительно 4,0×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,55×10⁶ до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,55×10⁶ до приблизительно 2,5×10⁶ клеток/см² или от приблизительно 0,55×10⁶ до приблизительно 2,1×10⁶ клеток/см². В некоторых вариантах осуществления первый пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/см². В некоторых вариантах осуществления первый пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,59×10⁶ до приблизительно 2,29×10⁶ клеток/см².[00134] In some embodiments, the methods include a first passage involving seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.5 x 10 ⁶ to about 3.0 x 10 ⁶ cells per square centimeter (cm ² ), from about 0 .5×10 ⁶ to approximately 5.0×10 ⁶ cells/cm ² , from approximately 0.55×10 ⁶ to approximately 4.0×10 ⁶ cells/cm ² , from approximately 0.55×10 ⁶ to approximately 3 .0x10 ⁶ cells/cm ² , from about 0.55x10 ⁶ to about 2.5x10 ⁶ cells/cm ² or from about 0.55x10 ⁶ to about 2.1x10 ⁶ cells/cm ² . In some embodiments, the first passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.5 x 10 ⁶ to about 3.0 x 10 ⁶ cells/cm ² . In some embodiments, the first passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.59 x 10 ⁶ to about 2.29 x 10 ⁶ cells/cm ² .

[00135] В некоторых вариантах осуществления способы включают второй пассаж, включающий посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,05×10⁶ до приблизительно 1×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,07×10⁶ до приблизительно 0,80×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,10×10⁶ до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,10×10⁶ до приблизительно 0,4×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,13×10⁶ до приблизительно 0,35×10⁶ клеток/см² или от приблизительно 0,14×10⁶ до приблизительно 0,32×10⁶ клеток/см². В некоторых вариантах осуществления второй пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,1×10⁶ до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/см². В некоторых вариантах осуществления второй пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,14×10⁶ до приблизительно 0,43×10⁶ клеток/см².[00135] In some embodiments, the methods include a second passage comprising seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.05 x 10 ⁶ to about 1 x 10 ⁶ cells/cm ² , from about 0.07 x 10 ⁶ to approximately 0.80×10 ⁶ cells/cm ² , approximately 0.10×10 ⁶ to approximately 0.5×10 ⁶ cells/cm ² , approximately 0.10×10 ⁶ to approximately 0.4×10 ⁶ cells /cm ² , from about 0.13x10 ⁶ to about 0.35x10 ⁶ cells/cm ² or from about 0.14x10 ⁶ to about 0.32x10 ⁶ cells/cm ² . In some embodiments, the second passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.1 x 10 ⁶ to about 0.5 x 10 ⁶ cells/cm ² . In some embodiments, the second passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.14 x 10 ⁶ to about 0.43 x 10 ⁶ cells/cm ² .

[00136] В некоторых вариантах осуществления способы включают третий пассаж, включающий посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,01×10⁶ до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,02×10⁶ до приблизительно 0,45×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,03×10⁶ до приблизительно 0,40×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,04×10⁶ до приблизительно 0,30×10⁶ клеток/см², от приблизительно 0,05×10⁶ до приблизительно 0,20×10⁶ клеток/см² или от приблизительно 0,05×10⁶ до приблизительно 0,10×10⁶ клеток/см². В некоторых вариантах осуществления третий пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,03×10⁶ до приблизительно 0,2×10⁶ клеток/см². В некоторых вариантах осуществления третий пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,05×10⁶ до приблизительно 0,1×10⁶ клеток/см².[00136] In some embodiments, the methods include a third passage comprising seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.01 x 10 ⁶ to about 0.5 x 10 ⁶ cells/cm ² , from about 0.02 x 10 ⁶ to about 0.45x10 ⁶ cells/cm ² , from about 0.03x10 ⁶ to about 0.40x10 ⁶ cells/cm ² , from about 0.04x10 ⁶ to about 0.30x10 ⁶ cells/cm ² , from about 0.05x10 ⁶ to about 0.20x10 ⁶ cells/cm ² or from about 0.05x10 ⁶ to about 0.10x10 ⁶ cells/cm ² . In some embodiments, the third passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.03 x 10 ⁶ to about 0.2 x 10 ⁶ cells/cm ² . In some embodiments, the third passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 0.05 x 10 ⁶ to about 0.1 x 10 ⁶ cells/cm ² .

[00137] В некоторых вариантах осуществления способы включают четвертый и, необязательно, последующие пассажи, где четвертый и последующие пассажи включают посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 10000 до приблизительно 60000 клеток/см², от приблизительно 10000 до приблизительно 50000 клеток/см², от приблизительно 10000 до приблизительно 40000 клеток/см², от приблизительно 20000 до приблизительно 60000 клеток/см², от приблизительно 20000 до приблизительно 50000 клеток/см² или от приблизительно 20000 до приблизительно 40000 клеток/см². В некоторых вариантах осуществления четвертый пассаж включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 10000 до приблизительно 60000 клеток/см². В некоторых вариантах осуществления четвертый проход включает посев клеток в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 20000 до приблизительно 40000 клеток/см².[00137] In some embodiments, the methods include a fourth and optionally subsequent passages, wherein the fourth and subsequent passages include seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 10,000 to about 60,000 cells/cm ² , from about 10,000 to about 50,000 cells /cm ² , from about 10,000 to about 40,000 cells/cm ² , from about 20,000 to about 60,000 cells/cm ² , from about 20,000 to about 50,000 cells/cm ² or from about 20,000 to about 40,000 cells/cm ² . In some embodiments, the fourth passage involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 10,000 to about 60,000 cells/cm ² . In some embodiments, the fourth pass involves seeding cells into culture flasks or plates at a density of from about 20,000 to about 40,000 cells/cm ² .

[00138] В некоторых вариантах осуществления способы включают посев клеток в культуральные флаконы при более высоких плотностях, чем при предыдущих пассажах, и при более низких плотностях, чем при последующих пассажах. Без ограничения теорией, считается, что во время первых нескольких пассажей клетки превращаются из скоплений клеток в одиночные клетки, при этом такое постепенное превращение из скоплений в клетки способствует увеличенной жизнеспособности клетки согласно способам, описанным в настоящем документе. В последующих пассажах сеют одиночные клетки, при этом плотность посева быстро снижается, и затем становится постоянной. В качестве неограничивающего примера, клетки сеют в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 3,0×10⁶ клеток/см² в первом пассаже, от приблизительно 0,1×10⁶ до приблизительно 0,5×10⁶ клеток/см² во втором пассаже, от приблизительно 0,03×10⁶ до приблизительно 0,2×10⁶ клеток/см² в третьем пассаже и от приблизительно 10000 до приблизительно 60000 клеток/см² в четвертом и последующих пассажах. В качестве дополнительного неограничивающего примера, клетки сеют в культуральные флаконы или планшеты при плотности от приблизительно 0,59×10⁶ до приблизительно 2,29×10⁶ клеток/см² в первом пассаже, от приблизительно 0,14×10⁶ до приблизительно 0,32×10⁶ клеток/см² во втором пассаже, от приблизительно 0,05×10⁶ до приблизительно 0,1×10⁶ клеток/см² в третьем пассаже и от приблизительно 20000 до приблизительно 40000 клеток/см² в четвертом и последующих пассажах.[00138] In some embodiments, the methods include seeding cells into culture flasks at higher densities than previous passages and at lower densities than subsequent passages. Without being limited by theory, it is believed that during the first few passages cells convert from clumps of cells to single cells, with such gradual conversion from clumps to cells resulting in increased cell viability according to the methods described herein. In subsequent passages, single cells are seeded, while the seeding density quickly decreases and then becomes constant. As a non-limiting example, cells are seeded into culture flasks or plates at a density of from about 0.5 x 10 ⁶ to about 3.0 x 10 ⁶ cells/cm ² in the first passage, from about 0.1 x 10 ⁶ to about 0. 5 x 10 ⁶ cells/cm ² in the second passage, from approximately 0.03 x 10 ⁶ to approximately 0.2 x 10 ⁶ cells/cm ² in the third passage, and from approximately 10,000 to approximately 60,000 cells/cm ² in the fourth and subsequent passages passages. As a further non-limiting example, cells are seeded into culture flasks or plates at a density of from about 0.59 x 10 ⁶ to about 2.29 x 10 ⁶ cells/cm ² in the first passage, from about 0.14 x 10 ⁶ to about 0 .32 x 10 ⁶ cells/cm ² in the second passage, from about 0.05 x 10 ⁶ to about 0.1 x 10 ⁶ cells/cm ² in the third passage, and from about 20,000 to about 40,000 cells/cm ² in the fourth and subsequent passages.

[00139] В некоторых вариантах осуществления период времени между непосредственно последовательными пассажами составляет 2-8 дней, 3-6 дней, 4-5 дней или 3-4 дня. В некоторых вариантах осуществления период времени между пассажами составляет 4 дня. В некоторых вариантах осуществления период времени между непосредственно последовательными пассажами составляет 3 дня.[00139] In some embodiments, the time period between immediately successive passages is 2-8 days, 3-6 days, 4-5 days, or 3-4 days. In some embodiments, the time period between passages is 4 days. In some embodiments, the period of time between immediately successive passages is 3 days.

[00140] В некоторых вариантах осуществления протокол пассирования включает целевые пороговые значения для количеств жизнеспособных клеток, причем культивирование клеток прекращают, если эти целевые пороговые значения не достигаются. Например, культивирование клеток может быть прекращено в конце пассажа 3 (P3), если получено меньше 90 миллионов, 100 миллионов, 110 миллионов, 120 миллионов, 130 миллионов, 140 миллионов или 150 миллионов жизнеспособных клеток. В качестве дополнительного примера культивирование клеток может быть прекращено в конце пассажа 4 (P4), если получено меньше 200 миллионов, меньше 250 миллионов, меньше 300 миллионов, меньше 350 миллионов, меньше 400 миллионов, меньше 450 миллионов или меньше 500 миллионов жизнеспособных клеток.[00140] In some embodiments, the passaging protocol includes target thresholds for viable cell counts, with cell culture terminated if the target thresholds are not reached. For example, cell culture may be terminated at the end of passage 3 (P3) if less than 90 million, 100 million, 110 million, 120 million, 130 million, 140 million, or 150 million viable cells are obtained. As a further example, cell culture may be terminated at the end of passage 4 (P4) if less than 200 million, less than 250 million, less than 300 million, less than 350 million, less than 400 million, less than 450 million, or less than 500 million viable cells are obtained.

[00141] Пассирование (также известный как субкультивирование или разделение клеток) включает перенос небольшого количества клеток в новый сосуд. Клетки можно культивировать в течение более длительного времени, если их регулярно разделяют, поскольку это позволяет избежать старения, связанного с длительной высокой плотностью клеток. Суспензионные культуры легко пассировать небольшим количеством культуры, содержащей несколько клеток, разведенных в большем объеме свежей среды. Для адгеретных культур сначала клетки необходимо отделить от поверхности. Обычно это делают при использовании смеси фермента, такой как трипсин-ЭДТА или эквивалент трипсина и ЭДТА, или неферментного раствора, такого как Cell Dissociation Buffer; в любом случае для этой цели доступны различные ферментные или неферментные смеси или препараты. Затем небольшое количество отделенных клеток можно использовать для посева новой культуры.[00141] Passaging (also known as subculture or cell separation) involves transferring a small number of cells into a new vessel. Cells can be cultured for longer periods if they are regularly separated, as this avoids the senescence associated with prolonged high cell densities. Suspension cultures can easily be passaged with a small amount of culture containing a few cells diluted in a larger volume of fresh medium. For adherent cultures, cells must first be separated from the surface. This is usually done using an enzyme mixture such as trypsin-EDTA or a trypsin-EDTA equivalent, or a non-enzyme solution such as Cell Dissociation Buffer; in any case, various enzymatic or non-enzymatic mixtures or preparations are available for this purpose. A small number of separated cells can then be used to seed a new culture.

[00142] В некоторых вариантах осуществления клетки обрабатывают раствором, содержащим трипсин или его эквивалент, который отличается при первом, втором и третьем пассажах. В примерном протоколе клетки обрабатывают первым ферментным раствором, содержащим TrypLE и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в соотношении 1:4, при первом пассаже, вторым ферментным раствором, содержащим TrypLE, ЭДТА и фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) в соотношении 1:1:3, при втором пассаже и третьим ферментным раствором, содержащим TrypLE и DPBS в соотношении 1:1, при третьем и каждом последующем пассаже. В следующем примерном протоколе клетки обрабатывают первым ферментным раствором, содержащим TrypLE, ЭДТА и PBS в соотношении 1:1:3, при первом пассаже, вторым ферментным раствором, содержащим TrypLE и DPBS в соотношении 1:1, при втором пассаже и третьим ферментным раствором, содержащим TrypLE и DPBS в соотношении 1:1, при третьем и каждом последующем пассаже. Клетки могут обрабатывать растворами трипсина или эквивалента в течение приблизительно 5-20 минут, приблизительно 6-10 минут, приблизительно 5-10 минут, приблизительно 7-8 минут или приблизительно 5-7 минут. Жизнеспособность, количество и/или морфология клеток могут определять при любом пассаже. Например, жизнеспособность и количество клеток можно определять при пассажах 3 и 4, чтобы решить, следует ли прекращать культивирование клеток, или для определения плотности посева клеток. Большинство первичных клеточных культур имеют ограниченное время существования и не могут пролиферировать бесконечно. После определенного числа удвоений популяции (так называемого предела Хейфлика) клетки подвергаются процессу старения и перестают делиться, при этом в целом сохраняя жизнеспособность. В некоторых вариантах осуществления ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток можно культивировать не больше чем в течение 10 пассажей, например, в течение одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти пассажей. В некоторых вариантах осуществления RPC пассируют примерно 4-6 (например, 4, 5 или 6) раз в условиях стандартного содержания кислорода и, необязательно, далее культивируют в течение примерно 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) пассажей в условиях низкого содержания кислорода.[00142] In some embodiments, the cells are treated with a solution containing trypsin or its equivalent, which is different for the first, second and third passages. In an exemplary protocol, cells are treated with a first enzyme solution containing TrypLE and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) in a 1:4 ratio at the first passage, and a second enzyme solution containing TrypLE, EDTA and Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) in a 1:1 ratio: 3, at the second passage and the third enzyme solution containing TrypLE and DPBS in a 1:1 ratio, at the third and each subsequent passage. In the following exemplary protocol, cells are treated with a first enzyme solution containing TrypLE, EDTA and PBS in a 1:1:3 ratio in the first passage, a second enzyme solution containing TrypLE and DPBS in a 1:1 ratio in the second passage, and a third enzyme solution. containing TrypLE and DPBS in a 1:1 ratio at the third and each subsequent passage. Cells can be treated with solutions of trypsin or equivalent for about 5-20 minutes, about 6-10 minutes, about 5-10 minutes, about 7-8 minutes, or about 5-7 minutes. Cell viability, number and/or morphology can be determined at any passage. For example, cell viability and number can be determined at passages 3 and 4 to decide whether to stop culturing cells or to determine cell seeding density. Most primary cell cultures have a limited lifespan and cannot proliferate indefinitely. After a certain number of population doublings (the so-called Hayflick limit), cells undergo the aging process and stop dividing, while generally remaining viable. In some embodiments, retinal progenitor cells and cell populations can be cultured for no more than 10 passages, such as one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine, or ten passages. In some embodiments, the RPCs are passaged about 4-6 (e.g., 4, 5, or 6) times under standard oxygen conditions and optionally further cultured for about 1-10 (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10) passages under low oxygen conditions.

[00143] В альтернативных вариантах осуществления клетки могут пассировать (в условиях стандартного содержания кислорода, в условиях низкого содержания кислорода и/или в их любых комбинациях) больше 5 раз, например, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать или больше пассажей. В некоторых вариантах осуществления ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток культивируют приблизительно 5-32 (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32) пассажей. Специалистам в данной области известно, что другие способы, известные в уровне техники, можно применять для культивирования клеток больше 32 пассажей (т.е. 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 или более пассажей).[00143] In alternative embodiments, cells may be passaged (under standard oxygen conditions, under low oxygen conditions, and/or any combination thereof) more than 5 times, such as six, seven, eight, nine, ten, eleven, twelve, thirteen, fourteen, fifteen, sixteen, seventeen, eighteen, nineteen, twenty or more passages. In some embodiments, approximately 5-32 retinal progenitor cells and cell populations are cultured (e.g., 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or 32) passages. Those skilled in the art will recognize that other methods known in the art can be used to culture cells beyond 32 passages (i.e., 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 or more passages).

[00144] Любой подходящий контейнер, такой как флакон, планшет или многоуровневые флаконы, можно использовать для пассажа клеток с применением способов, описанных в настоящем документе. Примеры флаконов включают флаконы Т25 и Т75. Многоуровневые флаконы CellStacks (CS) представляют собой устанавливаемые друг на друга камеры для культивирования, выпускаемые, например, компанией Corning. В некоторых вариантах осуществления флакон, планшет или многоуровневые флаконы могут иметь покрытие. Флаконы, планшеты и многоуровневые флаконы могут быть покрыты фибронектином, орнитином, полилизином или ламинином, разведенными в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS). В некоторых вариантах осуществления флаконы, планшеты или многоуровневые флаконы покрыты фибронектином. В некоторых вариантах осуществления фибронектин не содержит ксеногенных компонентов. Необязательно флакон, планшет или многоуровневый флакон могут промывать культуральной средой перед помещением в них клеток.[00144] Any suitable container, such as a vial, plate, or tiered vials, can be used to passage cells using the methods described herein. Examples of vials include T25 and T75 vials. CellStacks (CS) stacked flasks are stackable culture chambers available from, for example, Corning. In some embodiments, the vial, tablet, or tiered vials may be coated. Vials, plates, and stacked vials can be coated with fibronectin, ornithine, polylysine, or laminin diluted in Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS). In some embodiments, the vials, plates, or stacked vials are coated with fibronectin. In some embodiments, fibronectin does not contain xenogeneic components. Optionally, the vial, plate, or stacked vial may be washed with culture medium before cells are placed therein.

[00145] В различных вариантах осуществления образец клеток исследуют на присутствие патогена, бактерий, эндотоксина, гриба, микоплазмы, вируса, вируса гепатита или вируса ВИЧ. Образец клеток также могут исследовать на наличие нормального кариотипа; жизнеспособность; и/или онкогенность. Необязательно образец клеток не демонстрирует повышенную активность теломеразы.[00145] In various embodiments, a sample of cells is examined for the presence of a pathogen, bacteria, endotoxin, fungus, mycoplasma, virus, hepatitis virus, or HIV virus. The cell sample may also be examined for a normal karyotype; viability; and/or oncogenicity. Optionally, the cell sample does not demonstrate increased telomerase activity.

[00146] В любом из этих способов клетки сетчатки и/или ткань сетчатки могут замораживать либо до, либо после выделения, отбора и/или культивирования. Замораживание клеток могут выполнять при использовании любых криоконсервантов и/или методик, обычно используемых в данной области. Замороженные клетки можно размораживать перед применением с использованием любого протокола, известного в данной области.[00146] In any of these methods, retinal cells and/or retinal tissue can be frozen either before or after isolation, selection and/or culture. Cell freezing can be performed using any cryopreservatives and/or techniques commonly used in the art. Frozen cells can be thawed before use using any protocol known in the art.

[00147] Жизнеспособность клеток могут исследовать до их применения в любом из способов, описанных в настоящем документе. В альтернативных вариантах осуществления, в качестве неограничивающих примеров, перед криоконсервацией по меньшей мере 70% (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) клеток являются жизнеспособными. После размораживания, в альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере 70% (например, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) клеток являются жизнеспособными. Аналогичным образом, после восстановления клеточной культуры, в альтернативных вариантах осуществления, по меньшей мере 70% (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) клеток являются жизнеспособными. Определение количества жизнеспособных клеток на любой стадии находится в пределах обычного уровня квалификации в данной области.[00147] Cell viability may be examined prior to use in any of the methods described herein. In alternative embodiments, by way of non-limiting examples, at least 70% before cryopreservation (e.g., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%) cells are viable. After thawing, in alternative embodiments, at least 70% (e.g., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%) cells are viable. Likewise, after reconstitution of the cell culture, in alternative embodiments, at least 70% (e.g., 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%) cells are viable. Determining the number of viable cells at any stage is within the normal skill level in the art.

[00148] Таким образом, в изобретении предложены способы криоконсервации множества ретинальных клеток-предшественников, полученных с применением способов выделения и культивирования, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способы включают: (i) ферментативную диссоциацию клеток с использованием трипсина или эквивалента, (ii) остановку диссоциации избытком культуральной среды или улучшенной DMEM/F12, (iii) центрифунгирование клеток с ускорением от 10×g до 10000×g в течение 1-30 минут, (iv) ресуспендирование клеток в культуральной среде и определение общего количества клеток и жизнеспособности, (v) добавление среды для криоконсервации с получением конечной концентрации диметилсульфоксида (ДМСО) от 5 до 30%, (vi) деление множества клеток на аликвоты в каждый криофлакон, (vii) замораживание каждого флакона с использованием программируемого криозамораживателя, и (viii) помещение каждого флакона с клетками в жидкий N₂. Может использоваться любой подходящий метод замораживания, известный в уровне техники. Например, клетки могут замораживать с использованием контейнера для замораживания Cryo 1C, помещенного в морозильную камеру на -80°C. В некоторых вариантах осуществления эквивалентом трипсина является TrypLE, такой как TrypLE Express или TrypLE Select (например, ThermoFisher или Invitrogen). В некоторых вариантах осуществления среда для криоконсервации включает культуральную среду и 20% ДМСО. В некоторых вариантах осуществления среду для криоконсервации добавляют к клеткам и культуральной среде клеток в соотношении 1:1 с получением конечной концентрации ДМСО 10%. В некоторых вариантах осуществления множество ретинальных клеток-предшественников делят на аликвоты и замораживают в количестве приблизительно от 0,5×10⁶ до 50×10⁶ клеток на криофлакон. В некоторых вариантах осуществления множество ретинальных клеток-предшественников делят на аликвоты и замораживают в количестве от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 40×10⁶ клеток на мл среды (например, культуральной среды с 10% ДМСО), от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 40×10⁶ клеток на мл среды, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 10×10⁶ до приблизительно 30×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 10×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 10×10⁶ клеток/мл среды, от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 8×10⁶ клеток/мл среды или от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 5×10⁶ клеток/мл среды. В некоторых вариантах осуществления множество ретинальных клеток-предшественников делят на аликвоты и замораживают в количестве от приблизительно 0,5×10⁶ до приблизительно 20×10⁶ клеток/мл среды. В некоторых вариантах осуществления множество ретинальных клеток-предшественников делят на аликвоты и замораживают в количестве от приблизительно 2×10⁶ до приблизительно 8×10⁶ клеток/мл среды. В некоторых вариантах осуществления множество ретинальных клеток-предшественников делят на аликвоты и замораживают в количестве приблизительно 10×10⁶ клеток/мл среды. В некоторых вариантах осуществления криофлакон содержит приблизительно 1 мл, приблизительно 2 мл, приблизительно 3 мл, приблизительно 4 мл, приблизительно 5 мл, приблизительно 6 мл, приблизительно 7 мл, приблизительно 8 мл, приблизительно 9 мл или приблизительно 10 мл среды для криоконсервирования (например, культуральной среды с ДМСО) и ретинальные клетки-предшественники. В некоторых вариантах осуществления криофлакон содержит приблизительно 1 мл среды и ретинальные клетки-предшественники. В некоторых вариантах осуществления криофлакон содержит приблизительно 5 мл среды и ретинальные клетки-предшественники.[00148] Thus, the invention provides methods for cryopreserving multiple retinal progenitor cells obtained using the isolation and culture methods described herein. In some embodiments, the methods include: (i) enzymatic dissociation of cells using trypsin or equivalent, (ii) arresting dissociation with excess culture medium or enhanced DMEM/F12, (iii) centrifuging cells at 10×g to 10,000×g for 1-30 minutes, (iv) resuspend cells in culture medium and determine total cell number and viability, (v) add cryopreservation medium to obtain a final concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) of 5 to 30%, (vi) aliquot multiple cells into each cryo-vial, (vii) freezing each vial using a programmable cryo-freezer, and (viii) placing each vial containing cells in liquid N ₂ . Any suitable freezing method known in the art may be used. For example, cells can be frozen using a Cryo 1C freezing container placed in a -80°C freezer. In some embodiments, the trypsin equivalent is TrypLE, such as TrypLE Express or TrypLE Select (eg, ThermoFisher or Invitrogen). In some embodiments, the cryopreservation medium includes culture medium and 20% DMSO. In some embodiments, cryopreservation medium is added to the cells and cell culture medium in a 1:1 ratio to produce a final DMSO concentration of 10%. In some embodiments, a plurality of retinal progenitor cells are aliquoted and frozen in an amount of from about 0.5 x 10 ⁶ to 50 x 10 ⁶ cells per cryovial. In some embodiments, the plurality of retinal progenitor cells are aliquoted and frozen in an amount of from about 0.5 x 10 ⁶ to about 40 x 10 ⁶ cells per ml of medium (e.g., culture medium with 10% DMSO), from about 0.5 ×10 ⁶ to about 20x10 ⁶ cells/ml of medium, from about 0.5x10 ⁶ to about 10x10 ⁶ cells/ml of medium, from about 1x10 ⁶ to about 40x10 ⁶ cells per ml of medium, from about 1x10 ⁶ to about 20x10 ⁶ cells/ml of medium, from about 1x10 ⁶ to about 10x10 ⁶ cells/ml of medium, from about 10x10 ⁶ to about 30x10 ⁶ cells/ml of medium , from about 10x10 ⁶ to about 20x10 ⁶ cells/ml of medium, from about 2x10 ⁶ to about 10x10 ⁶ cells/ml of medium, from about 2x10 ⁶ to about 8x10 ⁶ cells/ml medium or from about 2x10 ⁶ to about 5x10 ⁶ cells/ml of medium. In some embodiments, the plurality of retinal progenitor cells are aliquoted and frozen in an amount of from about 0.5 x 10 ⁶ to about 20 x 10 ⁶ cells/ml of medium. In some embodiments, the plurality of retinal progenitor cells are aliquoted and frozen in an amount of from about 2x10 ⁶ to about 8x10 ⁶ cells/ml of medium. In some embodiments, the plurality of retinal progenitor cells are aliquoted and frozen in an amount of approximately 10×10 ⁶ cells/ml of medium. In some embodiments, the cryovial contains about 1 ml, about 2 ml, about 3 ml, about 4 ml, about 5 ml, about 6 ml, about 7 ml, about 8 ml, about 9 ml, or about 10 ml of cryopreservation medium (eg , culture medium with DMSO) and retinal progenitor cells. In some embodiments, the cryofial contains approximately 1 ml of medium and retinal progenitor cells. In some embodiments, the cryofial contains approximately 5 ml of medium and retinal progenitor cells.

[00149] В некоторых вариантах осуществления состав конечного продукта, как было показано, сохраняет оптимальную жизнеспособность (например, по меньшей мере 85%) в течение до 4 часов или больше (например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или больше) при хранении во льду (например, при 0-4°C). Это, в свою очередь, позволяет локально транспортировать препарат клеток в региональные клинические центры.[00149] In some embodiments, the final product formulation has been shown to maintain optimal pot life (e.g., at least 85%) for up to 4 hours or more (e.g., 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or more) when stored on ice (eg, 0-4°C). This, in turn, allows local transport of the cell preparation to regional clinical centers.

[00150] Дальнейшее размножение клеток в условиях низкого содержания кислорода можно применять для значительного повышения выхода клеток после каждого изъятия у донора. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки могут пассировать в общей сложности 5-12 (т.е. 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) или более раз. В качестве неограничивающего примера, в одном варианте осуществления, это может включать вторичное размножение в условиях низкого содержания кислорода 3-6 пассажей (т.е. 3, 4, 5 или 6), которое происходит после 4-6 пассажей (т.е. 4, 5 или 6) в условиях стандартного содержания кислорода. Однако специалистам будет очевидно, что общее количество пассажей может составлять приблизительно 1-32 или больше пассажей (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или больше), и это может включать вторичное размножение в учловиях низкого содержания кислорода 1-20 или больше пассажей (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или больше). Определение подходящего общего количества пассажей, а также количества пассажей при низком содержании кислорода находится в объеме средней квалификации в данной области. Использование таких вторичных пассажей культуры при низком содержании кислорода значительно повышает выход из рабочего банка hRPC (например, таких, которые получены в результате культивирования в условиях стандартного содержания кислорода). Например, клетки из банка стандартного нормального содержания кислорода могут размораживать и затем размножать еще 1-20 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) пассажей в условиях низкого содержания кислорода.[00150] Further cell expansion under low oxygen conditions can be used to significantly increase cell yield after each donor removal. For example, in some embodiments, cells may be passaged a total of 5-12 (ie, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12) or more times. As a non-limiting example, in one embodiment, this may involve secondary propagation under low oxygen conditions of 3-6 passages (i.e. 3, 4, 5 or 6) which occurs after 4-6 passages (i.e. 4, 5 or 6) under standard oxygen conditions. However, it will be apparent to those skilled in the art that the total number of passages may be approximately 1-32 or more passages (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 or more), and this may include secondary reproduction in low oxygen conditions 1 -20 or more passages (for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 or more) . Determining the appropriate total number of passages, as well as the number of passages at low oxygen levels, is within the scope of ordinary skill in the art. The use of such secondary culture passages at low oxygen significantly increases the yield from a working hRPC bank (eg, those obtained from culture under standard oxygen conditions). For example, cells from a standard normal oxygen bank may be thawed and then expanded 1-20 more (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17, 18, 19 or 20) passages under low oxygen conditions.

[00151] Хотя можно использовать меньше пассажей клеток при низком содержании кислорода, полученный выход, скорее всего, будет ниже. Более того, хотя также можно использовать больше пассажей клеток при низком содержании кислорода, это потенциально может вызывать повышенный риск того, что полученный продукт окажется непригодным из-за потенциального фенотипического изменения с потерей эффективности и/или накопления нежелательных генетических аномалий.[00151] Although it is possible to use fewer cell passages at low oxygen levels, the resulting yield will likely be lower. Moreover, while it is also possible to use more cell passages at low oxygen levels, this could potentially pose an increased risk of the resulting product being unusable due to potential phenotypic change with loss of potency and/or accumulation of undesirable genetic abnormalities.

[00152] После вторичных пассажей культуры при низком содержании кислорода, в некоторых вариантах осуществления, ретинальные клетки-предшественники подвергаются "периоду восстановления", в котором им позволяют расти в условиях стандартного содержания кислорода в течение короткого периода времени, от 1 часа до 5 дней (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 или 120 часов). В альтернативных вариантах осуществления в этот период восстановления клеткам позволяют расти, не подвергая дальнейшему пассированию.[00152] After secondary culture passages at low oxygen, in some embodiments, the retinal progenitor cells undergo a “recovery period” in which they are allowed to grow under standard oxygen conditions for a short period of time, from 1 hour to 5 days ( i.e. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 or 120 hours). In alternative embodiments, during this recovery period the cells are allowed to grow without further passaging.

[00153] Таким образом, в одном неограничивающем примере ретинальные клетки-предшественники для применения в любых из композиций и способов, описанных в настоящем документе, могут быть получены с применением "гибридного" метода, включающего: (a) культивирование в условиях стандартного содержания кислорода в течение некоторого числа пассажей, с последующим (b) культивированием в условиях низкого содержания кислорода в течение некоторого числа пассажей, необязательно с последующим (c) культивированием в условиях стандартного содержания кислорода в течение заданного периода времени без какого-либо дальнейшего пассирования. Определение подходящего числа пассажей в условиях стандартного содержания кислорода и/или в условиях низкого содержания кислорода, а также подходящей длительности периода восстановления находится в рамках среднего уровня квалификации в данной области.[00153] Thus, in one non-limiting example, retinal progenitor cells for use in any of the compositions and methods described herein can be obtained using a "hybrid" method comprising: (a) culturing under standard oxygen conditions in for a number of passages, followed by (b) culture under low oxygen conditions for a number of passages, optionally followed by (c) culture under standard oxygen conditions for a specified period of time without any further passage. Determining the appropriate number of passages under standard oxygen conditions and/or low oxygen conditions, as well as the appropriate length of recovery period, is within the average skill level in the art.

[00154] Получаемый в результате клеточный продукт, полученный с применением этой новой методики культивирования, был протестирован in vitro и на животных, при этом наблюдали результаты, аналогичные результатам с клеточным продуктом, который не подвергали вторичному культивированию при низком содержании кислорода.[00154] The resulting cell product obtained using this new culture technique was tested in vitro and in animals, and similar results were observed to the cell product that was not subjected to secondary culture at low oxygen levels.

[00155] Специалистам в данной области известно, что добавление такого вторичного компонента низкого содержания кислорода в общий процесс способствует автоматизации способов производства, поскольку не нужны сложные процедуры, такие как начальное разрезание и посев в планшеты, причем выполненное пассирование будет полностью стандартизированным с клетками, которые сильно пролиферируют.[00155] It is known to those skilled in the art that the addition of such a low oxygen content secondary component to the overall process facilitates the automation of production methods since complex procedures such as initial cutting and plate plating are not required, and the passaging performed will be completely standardized with cells that proliferate greatly.

[00156] RPC можно дополнительно получать посредством конверсии существующих RPC в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) с последующей экспансией в более примитивном, пролиферативном состоянии. Затем иПСК можно повторно дифференцировать обратно в RPC с использованием любого метода(ов), известного в данной области. В такой ситуации предыдущий эпигенетический импринтинг, представленный в виде RPC, помогает перенаправлять клетки обратно в их исходное состояние, увеличивая, таким образом, выход RPC и/или способствуя безопасности аллогенного продукта с высоким выходом (то есть, путем предотвращения контаминации плюрипотентными клетками). Такая методика экспансии может обеспечить очень большой и потенциально бесконечный (не подверженный старению) источник RPC, полученный из клинически подтвержденных образцов RPC, без необходимости повторного получения фетальной ткани.[00156] RPCs can be further generated by converting existing RPCs into induced pluripotent stem cells (iPSCs) followed by expansion into a more primitive, proliferative state. The iPSCs can then be redifferentiated back into RPCs using any method(s) known in the art. In such a situation, previous epigenetic imprinting, represented by RPC, helps to redirect cells back to their original state, thereby increasing RPC yield and/or contributing to the safety of the high-yield allogeneic product (i.e., by preventing contamination by pluripotent cells). This expansion technique can provide a very large and potentially infinite (non-aging) source of RPC derived from clinically validated RPC samples without the need to re-obtain fetal tissue.

[00157] RPC могут быть дополнительно получены из линии плюрипотентных клеток, будь то одна такая линия, полученная из RPC, как указано выше, или нет. Такое происхождение может включать частичную дифференцировку в "эмбриоидные тельца", содержащие примитивные структуры сетчатки, т.е. производные глазного бокала, из которых могут быть получены, очищены и затем размножены RPC.[00157] RPCs may further be derived from a pluripotent cell line, whether one such RPC-derived line as described above or not. Such an origin may involve partial differentiation into “embryoid bodies” containing primitive retinal structures, i.e. optic cup derivatives from which RPCs can be prepared, purified and then propagated.

[00158] Подобные способы могут проводить с использованием аутологичных клеток, когда донорские клетки для иПСК получают из эпителия реснитчатого тела или из радужной оболочки, поскольку обе этих ткани доступны для хирурга и имеют импринтинг развития, который перекрывается с сетчаткой (хотя и не является полностью таким же).[00158] Similar methods can be carried out using autologous cells, where the donor cells for iPSCs are obtained from the epithelium of the ciliary body or from the iris, since both of these tissues are accessible to the surgeon and have developmental imprinting that overlaps with the retina (though not completely the same). same).

Композиции и составыCompositions and formulations

[00159] Ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток, описанные в настоящем документе, могут быть включены в композицию для введения любыми различными способами, в том числе перорально, парентерально, ингаляционно в виде спрея, назально, наружно, интратекально, интрацеребрально, эпидурально, интракраниально или ректально. Композиции и составы, раскрытые в настоящем документе, могут содержать фармацевтически или ветеринарно приемлемые жидкости, носители, адъюванты и растворители и могут иметь форму жидкостей, таблеток, капсул, имплантатов, аэрозолей, гелей, липосом, наночастиц и т.п.[00159] The retinal progenitor cells and cell populations described herein can be formulated for administration by any variety of routes, including orally, parenterally, inhalation spray, nasally, topically, intrathecally, intracerebrally, epidurally, intracranially or rectally. The compositions and formulations disclosed herein may contain pharmaceutically or veterinary acceptable liquids, carriers, adjuvants and solvents and may be in the form of liquids, tablets, capsules, implants, aerosols, gels, liposomes, nanoparticles and the like.

[00160] Ретинальные клетки-предшественники и популяции клеток могут вводить субъекту в форме фармацевтических или ветеринарных композиций. Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным единицам и композициям, которые не вызывают нежелательных, аллергических или других неблагоприятных реакций при введении животному или человеку. При использовании в настоящем документе "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые возможные водные и неводные носители, которые включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло и пригодные для инъекций органические сложные эфиры, такие как этилолеат.[00160] Retinal progenitor cells and cell populations may be administered to a subject in the form of pharmaceutical or veterinary compositions. The phrase "pharmaceutically acceptable" refers to molecular entities and compositions that do not cause unwanted, allergic or other adverse reactions when administered to an animal or human. As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" includes any possible aqueous and non-aqueous carriers, which include water, ethanol, polyols (such as glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and suitable mixtures thereof, vegetable oils such as olive oil and injectable organic esters such as ethyl oleate.

[00161] Фармацевтически приемлемый носитель необязательно может включать белок (например, человеческий белок), который является белком, который может улучшить выживание клеток в процессе получения.[00161] The pharmaceutically acceptable carrier may optionally include a protein (eg, human protein), which is a protein that can improve cell survival during the production process.

[00162] Аналогичным образом, любые из композиций или препаратов, раскрытых в настоящем документе, также могут включать вспомогательное вещество HypoThermosol^®-FRS (HTS-FRS) (BioLife Solutions, Inc.), которое является доступным в продаже раствором/составом для гипотермического хранения, разработанным для снижения уровня некроза и апоптоза после хранения клеток, подвергающихся длительному гипотермическому (2°C-10°C) хранению (см., например, патент США 6,921,633; патент США 6,632,666; и WO 2005/009766).[00162] Likewise, any of the compositions or preparations disclosed herein may also include the excipient HypoThermosol ^® -FRS (HTS-FRS) (BioLife Solutions, Inc.), which is a commercially available solution/formulation for hypothermic storage , designed to reduce the level of necrosis and apoptosis after storage of cells subjected to long-term hypothermic (2°C-10°C) storage (see, for example, US Patent 6,921,633; US Patent 6,632,666; and WO 2005/009766).

[00163] Добавление белка и/или HTS можно использовать для увеличения времени жизнеспособности ретинальных клеток-предшественников в любом из препаратов, раскрытых в настоящем документе, до приблизительно 24 часов (т.е. приблизительно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 часа).[00163] The addition of protein and/or HTS can be used to increase the viability of retinal progenitor cells in any of the formulations disclosed herein to approximately 24 hours (i.e., approximately 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 hours).

[00164] Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем применения материалов для получения покрытия, таких как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и при использовании поверхностно-активных веществ. Такие композиции также могут содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и дисперсанты. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечивать как процедурами стерилизации, так и путем включения различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабена, хлорбутанола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включать в композиции изотонические вещества, такие как сахара, хлорид натрия и т.п. Кроме того, пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы можно обеспечить путем включения веществ, замедляющих абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин. Они должны быть стабильными в условиях производства и хранения и должны быть предохранены от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Применение таких сред и веществ для фармацевтически активных субстанций хорошо известно в данной области.[00164] Proper fluidity can be maintained, for example, by the use of coating materials such as lecithin, by maintaining the desired particle size in the case of dispersions and by the use of surfactants. Such compositions may also contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers and dispersants. Prevention of the presence of microorganisms can be achieved both by sterilization procedures and by the inclusion of various antibacterial and antifungal agents, for example, paraben, chlorobutanol, sorbic acid, etc. It may also be desirable to include isotonic substances such as sugars, sodium chloride and the like in the compositions. In addition, prolonged absorption of the injectable pharmaceutical form can be achieved by including absorption retarding agents such as aluminum monostearate and gelatin. They must be stable under the conditions of production and storage and must be protected from the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. The use of such media and substances for pharmaceutically active substances is well known in the art.

[00165] Субъекту надлежит вводить эффективное количество ретинальных клеток-предшественников или популяций клеток. "Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к такому количеству композиции, которое производит требуемый эффект. Эффективное количество будет зависеть, например частично, от доставляемой молекулы или вещества (в данном случае ретинальных клеток-предшественников или популяций клеток), от показания, по которому применяют терапевтическое средство, от пути введения и размера (массы тела, площади поверхности тела или размера органа), и состояния (возраста и общего состояния здоровья) субъекта или пациента. Соответственно, лечащий врач или терапевт может подбирать дозу и изменять способ введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Эффективное количество конкретного средства для определенной цели можно определять с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области. Для любой композиции, определенной в настоящем документе, эффективное количество может быть оценено первоначально либо в анализах с культурами клеток, либо в моделях на животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки, свиньи или обезьяны. Модель на животных также может использоваться для определения подходящего диапазона концентраций и пути введения. Такую информацию затем можно использовать для определения подходящих доз и способов введения человеку.[00165] The subject must be administered an effective amount of retinal progenitor cells or populations of cells. "Effective amount" or "therapeutically effective amount" refers to that amount of the composition that produces the desired effect. The effective amount will depend, for example, in part, on the molecule or substance delivered (in this case, retinal progenitor cells or cell populations), the indication for which the therapeutic agent is used, the route of administration and the size (body weight, body surface area or organ size ), and the condition (age and general health) of the subject or patient. Accordingly, the attending physician or therapist can adjust the dose and modify the route of administration to obtain the optimal therapeutic effect. The effective amount of a particular agent for a particular purpose can be determined using methods well known to those skilled in the art. For any composition defined herein, the effective amount can be assessed initially either in cell culture assays or in animal models such as mice, rats, rabbits, dogs, pigs or monkeys. An animal model can also be used to determine the appropriate concentration range and route of administration. Such information can then be used to determine appropriate dosages and routes of administration to humans.

[00166] Примеры эффективных количеств композиций, описанных в настоящем документе, включают суспензии клеток в объеме 5 мкл, 10 мкл, 15 мкл, 20 мкл, 25 мкл, 50 мкл, 100 мкл, 150 мкл, 200 мкл, 250 мкл, 300 мкл, 350 мкл, 400 мкл, 450 мкл, 500 мкл или с любым промежуточным приращением, до 5000 мкл (5 мл) (например. 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 3950, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 4950 или 5000 мкл).[00166] Examples of effective amounts of the compositions described herein include cell suspensions in volumes of 5 μl, 10 μl, 15 μl, 20 μl, 25 μl, 50 μl, 100 μl, 150 μl, 200 μl, 250 μl, 300 μl , 350 µl, 400 µl, 450 µl, 500 µl or any increments in between, up to 5000 µl (5 ml) (eg 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2 050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150, 3200, 3250, 3 300, 3350, 3400, 3450, 3500, 3550, 3600, 3650, 3700, 3750, 3800, 3850, 3900, 3950, 4000, 4050, 4100, 4150, 4200, 4250, 4300, 4350, 4400, 4450, 4500, 4 550, 4600, 4650, 4700, 4750, 4800, 4850, 4900, 4950 or 5000 µl).

[00167] Нижние и верхние границы значений объема лимитированы системой и/или способом доставки. См., например, Kayikcuiglu, O. R. et al, (2006) Retina 26(9): 1089-90. Например, верхняя граница значений объема при введении без витрэктомии составляет приблизительно 200 мкл из-за увеличения внутриглазного давления. Верхняя граница объема при введении с витрэктомией в полость стекловидного тела ограничена объемом полости стекловидного тела и может содержать до 5 мл или больше. Верхняя граница субретинальной инъекции может составлять до 200 мкл из-за отслоения сетчатки. В альтернативных вариантах осуществления эти объемы включают приблизительно от 1000 до 10 миллионов клеток на дозу или 1000-2000 клеток на дозу, 2000-3000 клеток на дозу, 3000-4000 клеток на дозу, 400-5000 клеток на дозу, 5000-6000 клеток на дозу, 6000-7000 клеток на дозу, 7000-8000 клеток на дозу, 8000-9000 клеток на дозу, 9000-10000 клеток на дозу, 10000-15000 клеток на дозу, 15000-20000 клеток на дозу, 20000-25000 клеток на дозу, 25000-30000 клеток на дозу, 30000-35000 клеток на дозу, 35000-40000 клеток на дозу, 40000-45000 клеток на дозу, 45000-50000 клеток на дозу, 50000-55000 клеток на дозу, 55000-60000 клеток на дозу, 60000-65000 клеток на дозу, 65000-70000 клеток на дозу, 70000-75000 клеток на дозу, 75000-80000 клеток на дозу, 80000-85000 клеток на дозу, 85000-90000 клеток на дозу, 90000-95000 клеток на дозу, 95000-100000 клеток на дозу, 100000-125000 клеток на дозу, 125000-150000 клеток на дозу, 150000-200000 клеток на дозу, 200000-250000 клеток на дозу, 250000-300000 клеток на дозу, 300000-350000 клеток на дозу, 350000-400000 клеток на дозу, 400000-450000 клеток на дозу, 450000-500000 клеток на дозу, 500000-550000 клеток на дозу, 550000-600000 клеток на дозу, 600000-650000 клеток на дозу, 650000-700000 клеток на дозу, 700000-750000 клеток на дозу, 750000-800000 клеток на дозу, 800000-850000 клеток на дозу, 850000-900000 клеток на дозу, 900000-950000 клеток на дозу, 950000-1000000 клеток на дозу или любое промежуточное приращение от 1000 клеток и до 10 миллионов клеток на дозу. Дозы, конечно, могут изменяться в зависимости от частоты и длительности введения. В альтернативных вариантах осуществления доза клеток в композициях, описанных в настоящем документе, содержит большое количество клеток в малом объеме, такое как, например, 0,5 миллиона клеток в 100 мкл. Количество клеток можно посчитывать с помощью любого способа, известного в уровне техники, такого как гемоцитометр, спектрофотометрия, счетчиком Коултера, проточная цитометрия и т.д. Дозу могут вводить однократно или могут вводить в течение курса из нескольких процедур лечения.[00167] The lower and upper limits of the volume values are limited by the system and/or delivery method. See, for example, Kayikcuiglu, O. R. et al, (2006) Retina 26(9): 1089-90. For example, the upper limit of volume values when administered without vitrectomy is approximately 200 μl due to the increase in intraocular pressure. The upper limit of the volume when injecting with vitrectomy into the vitreous cavity is limited by the volume of the vitreous cavity and can contain up to 5 ml or more. The upper limit of subretinal injection may be up to 200 µl due to retinal detachment. In alternative embodiments, these volumes include approximately 1000 to 10 million cells per dose, or 1000-2000 cells per dose, 2000-3000 cells per dose, 3000-4000 cells per dose, 400-5000 cells per dose, 5000-6000 cells per dose dose, 6000-7000 cells per dose, 7000-8000 cells per dose, 8000-9000 cells per dose, 9000-10000 cells per dose, 10000-15000 cells per dose, 15000-20000 cells per dose, 20000-25000 cells per dose , 25000-30000 cells per dose, 30000-35000 cells per dose, 35000-40000 cells per dose, 40000-45000 cells per dose, 45000-50000 cells per dose, 50000-55000 cells per dose, 55000-60000 cells per dose, 60000-65000 cells per dose, 65000-70000 cells per dose, 70000-75000 cells per dose, 75000-80000 cells per dose, 80000-85000 cells per dose, 85000-90000 cells per dose, 90000-95000 cells per dose, 95 000 -100,000 cells per dose, 100,000-125,000 cells per dose, 125,000-150,000 cells per dose, 150,000-200,000 cells per dose, 200,000-250,000 cells per dose, 250,000-300,000 cells per dose, 300,000-350,000 cells per dose, 350000- 400,000 cells per dose, 400,000-450,000 cells per dose, 450,000-500,000 cells per dose, 500,000-550,000 cells per dose, 550,000-600,000 cells per dose, 600,000-650,000 cells per dose, 650,000-700,000 cells per dose, 700000-750000 cells per dose, 750,000-800,000 cells per dose, 800,000-850,000 cells per dose, 850,000-900,000 cells per dose, 900,000-950,000 cells per dose, 950,000-1000,000 cells per dose, or any increment in between from 1000 cells to 10 million cells per dose. Doses, of course, may vary depending on the frequency and duration of administration. In alternative embodiments, the dose of cells in the compositions described herein contains a large number of cells in a small volume, such as, for example, 0.5 million cells in 100 μl. The number of cells can be counted using any method known in the art, such as hemocytometer, spectrophotometry, Coulter counter, flow cytometry, etc. The dose may be administered as a single dose or may be administered over a course of multiple treatments.

[00168] Композиции также могут быть изготовлены для парентерального введения в глаз (в частности, в полость стекловидного тела или субретинальное пространство), полость стекловидного тела или субретинальное пространство, сетчатку, головной мозг, нерв или ЦНС путем транссклеральной доставки, или с применением любого способа или протокола, известного в данной области, например, включающих транссклеральную доставку, как описано в патенте США 7,585,517; устройство доставки с замедленным высвобождением для доставки внутрь глаза пациента, как описано в патенте США 7,883,717; устройство для введения в область стекловидного тела глаза, как описано в патентах США 5,378,475 или 5,466,233; или при помощи шприца для подкожных инъекций или введения под углом, например, как описано в публикации заявок на патент США 20110112470 или 20100256597 (в которых описана микроигла для направленного введения в глаз пациента); или посредством гидрогеля гидрофильного полимера с размерами, позволяющими проникать через слезные точки, например, как описано в публикации заявки на патент США 20100209478; или устройство, обеспечивающее доступ в субретинальное пространство в глазу человека, например, как описано в публикации заявки на патент США 20100191176. Парацентез передней камеры глаза также могут выполнять, как определяет специалист в данной области. Способы не требуют ушивания глазного яблока во время и/или после процедуры, особенно в случае интравитреального введения. Однако это может быть необходимо в способах, в которых используют процедуру витрэктомии, например, при введении клеток в субретинальное пространство.[00168] The compositions may also be formulated for parenteral administration to the eye (particularly, the vitreous cavity or subretinal space), vitreous cavity or subretinal space, retina, brain, nerve, or CNS by transscleral delivery, or using any method or a protocol known in the art, for example, including transscleral delivery as described in US Pat. No. 7,585,517; a sustained release delivery device for intraocular delivery to a patient as described in US Pat. No. 7,883,717; a device for introducing into the vitreous region of the eye, as described in US patents 5,378,475 or 5,466,233; or using a hypodermic syringe or angled injection, for example, as described in US Patent Application Publication 20110112470 or 20100256597 (which disclose a microneedle for targeted insertion into a patient's eye); or by means of a hydrophilic polymer hydrogel sized to penetrate puncta, for example, as described in US Patent Application Publication 20100209478; or a device that provides access to the subretinal space in the human eye, for example, as described in US Patent Application Publication 20100191176. Paracentesis of the anterior chamber of the eye can also be performed as determined by one skilled in the art. The methods do not require suturing the eyeball during and/or after the procedure, especially in the case of intravitreal administration. However, this may be necessary in methods that use a vitrectomy procedure, for example, when introducing cells into the subretinal space.

[00169] Композиции, раскрытые в настоящем документе, также могут быть изготовлены для интратекального, внутрицеребрального, эпидурального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и/или внутриартериального введения; например, как описано в публикации заявки на патент США 200500480021; путем инъекции, но также включая различные методы инфузии. Введение могут осуществлять с использованием катетеров или насосов, например, интратекального насоса или имплантируемого медицинского устройства. В альтернативных вариантах осуществления способы также могут включать введение или трансплантацию имплантатов и искусственных органов, биореакторные системы, системы культивирования клеток, планшеты, чашки, пробирки, бутылки и флаконы и т.п., содержащие ретинальные клетки-предшественники, популяции клеток или композиции, раскрытые в настоящем документе, такие как описанные в патентах США 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,270,192; и в публикациях заявок на патент США 20040127987; 20080119909; 20080118549; 20080020015; 20070254005; 20070059335; 20060128015.[00169] The compositions disclosed herein may also be formulated for intrathecal, intracerebral, epidural, subcutaneous, intravenous, intramuscular, and/or intra-arterial administration; for example, as described in US Patent Application Publication 200500480021; by injection, but also including various infusion methods. Administration can be accomplished using catheters or pumps, such as an intrathecal pump or implantable medical device. In alternative embodiments, the methods may also include the administration or transplantation of implants and artificial organs, bioreactor systems, cell culture systems, plates, dishes, tubes, bottles and vials, and the like, containing retinal progenitor cells, cell populations or compositions disclosed herein. herein, such as those described in US Pat. Nos. 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,270,192; and US Patent Application Publications 20040127987; 20080119909; 20080118549; 20080020015; 20070254005; 20070059335; 20060128015.

[00170] Композиции, содержащие ретинальные клетки-предшественники или популяции клеток, необязательно могут вводить совместно с одним или более лекарственными средствами. Неограничивающие примеры лекарственных средств могут включать антиангиогенные средства, такие как ангиостатин, анекортава ацетат, тромбоспондин, ингибиторы VEGF-стимулируемых рецепторов тирозинкиназ и средства против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), такие как ранибизумаб и бевацизумаб, пегаптаниб, сунитиниб и сорафениб, а также любой из множества известных низкомолекулярных ингибиторов и ингибиторов транскрипции, обладающих антиангиогенным действием; классы известных офтальмологических средств, включающие: средства для лечения глаукомы, такие как антагонисты адренергических рецепторов, включающие, например, бета-блокаторы, такие как ацетбутолол, атенолол, бисопролол, карведилол, асмолол, лабеталол, надолол, пенбутолол, пиндолол, пропранолол, метипранолол, бетаксолол, картеолол, левобетаксолол, левобунолол и тимолол; агонисты адренергических рецепторов или симпатомиметические средства, такие как эпинефрин, дипивефрин, клонидин, апарклонидин и бримонидин; парасимпатомиметики или холинергические агонисты, такие как пилокарпин, карбахол, фосфолин-иод и физостигмин, салицилат, ацетилхолинхлорид, эсерин, диизопропилфторфосфат, демекария бромид); мускариновые средства; ингибиторы карбоангидразы, включая средства для наружного и/или системного применения, например, ацетозоламид, бринзоламид, дорзоламид и метазоламид, этоксзоламид, диамокс и дихлорфенамид; мидриатические/циклоплегические средства, такие как атропин, циклопентолат, сукцинилхолин, гоматропин, фенилэфрин, скополамин и тропикамид; простагландины, такие как простагландин F2-альфа, антипростагландины, предшественники простагландинов или аналоги простагландина, такие как биматопрост, латанопрост, травопрост и/или унопростон.[00170] Compositions containing retinal progenitor cells or populations of cells may optionally be co-administered with one or more drugs. Non-limiting examples of drugs may include anti-angiogenic agents such as angiostatin, anecortava acetate, thrombospondin, VEGF-stimulated receptor tyrosine kinase inhibitors and anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents such as ranibizumab and bevacizumab, pegaptanib, sunitinib and sorafenib, as well as any from a variety of known small molecule inhibitors and transcription inhibitors with antiangiogenic effects; classes of known ophthalmic agents, including: agents for the treatment of glaucoma, such as adrenergic receptor antagonists, including, for example, beta-blockers, such as acetbutolol, atenolol, bisoprolol, carvedilol, asmolol, labetalol, nadolol, penbutolol, pindolol, propranolol, methipranolol, betaxolol, carteolol, levobetaxolol, levobunolol and timolol; adrenergic agonists or sympathomimetic agents such as epinephrine, dipivefrine, clonidine, aparklonidine and brimonidine; parasympathomimetics or cholinergic agonists such as pilocarpine, carbachol, phospholine iodine and physostigmine, salicylate, acetylcholine chloride, eserine, diisopropyl fluorophosphate, demecaria bromide); muscarinics; carbonic anhydrase inhibitors, including topical and/or systemic agents, for example, acetozolamide, brinzolamide, dorzolamide and methazolamide, ethoxzolamide, diamox and dichlorphenamide; mydriatic/cycloplegic agents such as atropine, cyclopentolate, succinylcholine, homatropine, phenylephrine, scopolamine and tropicamide; prostaglandins such as prostaglandin F2-alpha, antiprostaglandins, prostaglandin precursors or prostaglandin analogs such as bimatoprost, latanoprost, travoprost and/or unoprostone.

[00171] Другие примеры лекарственных средств также могут включать, без ограничения перечисленными, противовоспалительные средства, в том числе, например, глюкокортикоиды и кортикостероиды, такие как бетаметазон, кортизон, дексаметазон, дексаметазон-21-фосфат, метилпреднизолон, преднизолон-21-фосфат, преднизолона ацетат, преднизолон, флуорометолон, лотепреднол, медризон, флуоцинолона ацетонид, триамцинолона ацетонид, триамцинолон, беклометазон, будесонид, флунизолид, фторметолон, флутиказон, флудрокортизон, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, лотепреднол, римексолон и нестероидные противовоспалительные средства, в том числе, например, аспирин, диклофенак, флурбипрофен, ибупрофен, бромфенак, непафенак и кеторолак, салицилат, индометацин, наксопрен, пироксикам и набуметон, дифлунизал, этодолак, фенопрофен, флурбипрофен, индометацин, кетопрофен, меклофенамат, мефенамовую кислоту, мелоксикам, набуметон, оксапрозин, пироксикам, салсалат, сулиндак и толметин; ингибиторы ЦОГ-2, такие как целекоксиб, рофекоксиб и валдекоксиб; противоинфекционные или противомикробные средства, такие как антибиотики, в том числе, например, тетрациклин, хлортетрациклин, бацитрацин, неомицин, полимиксин, грамицидин, цефалексин, окситетрациклин, хлорамфеникол, рифампицин, ципрофлоксацин, тобрамицин, гентамицин, эритромицин, пенициллин, сульфаниламиды, сульфадиазин, сульфацетамид, сульфаметизол, сульфизоксазол, нитрофуразон, пропионат натрия, аминогликозиды, такие как гентамицин, тобрамицин, амикацин и стрептомицин; фторхинолоны, такие как ципрофлоксацин, гатифлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин; бацитрацин, эритромицин, фузидовая кислота, неомицин, полимиксин B, грамицидин, триметоприм и сульфацетамид; противогрибковые средства, такие как амфотерицин B, каспофунгин, клотримазол, флуконазол, итраконазол, кетоконазол, вориконазол, тербинафин, нистатин и миконазол; противомалярийные средства, такие как хлорохин, атоваквон, мефлохин, примахин, хинидин и хинин; противомикобактериальные средства, такие как этамбутол, изониазид, пиразинамид, рифампин и рифабутин; и/или противопаразитарные средства, такие как альбендазол, мебендазол, тиобендазол, метронидазол, пирантел, атоваквон, йодохинол, ивермектин, паромицин, празиквантел и триметрексат.[00171] Other examples of drugs may also include, but are not limited to, anti-inflammatory drugs, including, for example, glucocorticoids and corticosteroids such as betamethasone, cortisone, dexamethasone, dexamethasone-21-phosphate, methylprednisolone, prednisolone-21-phosphate, prednisolone acetate, prednisolone, fluorometholone, loteprednol, medrisone, fluocinolone acetonide, triamcinolone acetonide, triamcinolone, beclomethasone, budesonide, flunisolide, fluorometholone, fluticasone, fludrocortisone, hydrocortisone, hydrocortisone acetate, loteprednol, rimexolone and not steroidal anti-inflammatory drugs, including, for example, aspirin, diclofenac, flurbiprofen, ibuprofen, bromfenac, nepafenac and ketorolac, salicylate, indomethacin, naxoprene, piroxicam and nabumetone, diflunisal, etodolac, fenoprofen, flurbiprofen, indomethacin, ketoprofen, meclofenamate, mefenamic acid, meloxicam, nabumetone, oxaprozin , piroxicam, salsalate , sulindac and tolmetin; COX-2 inhibitors such as celecoxib, rofecoxib and valdecoxib; anti-infective or antimicrobial agents such as antibiotics, including, for example, tetracycline, chlortetracycline, bacitracin, neomycin, polymyxin, gramicidin, cephalexin, oxytetracycline, chloramphenicol, rifampicin, ciprofloxacin, tobramycin, gentamicin, erythromycin, penicillin, sulfonamides, sulfadiazine, sulfacetamide , sulfamethizole, sulfisoxazole, nitrofurazone, sodium propionate, aminoglycosides such as gentamicin, tobramycin, amikacin and streptomycin; fluoroquinolones such as ciprofloxacin, gatifloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, norfloxacin, ofloxacin; bacitracin, erythromycin, fusidic acid, neomycin, polymyxin B, gramicidin, trimethoprim and sulfacetamide; antifungals such as amphotericin B, caspofungin, clotrimazole, fluconazole, itraconazole, ketoconazole, voriconazole, terbinafine, nystatin and miconazole; antimalarials such as chloroquine, atovaquone, mefloquine, primaquine, quinidine and quinine; antimycobacterial agents such as ethambutol, isoniazid, pyrazinamide, rifampin and rifabutin; and/or antiparasitics such as albendazole, mebendazole, thiobendazole, metronidazole, pyrantel, atovaquone, iodoquinol, ivermectin, paromycin, praziquantel and trimetrexate.

[00172] Другие примеры лекарственных средств также могут включать, без ограничения перечисленными, противовирусные средства, такие как идоксуридин, трифтортимидин, ацикловир, цидофовир, фамцикловир, ганцикловир, валацикловир, валганцикловир, видарабин, трифлуридин и фоскарнет; ингибиторы протеаз, такие как ритонавир, саквинавир, лопинавир, индинавир, атазанавир, ампренавир и нелфинавир; нуклеотидные/нуклеозидные/ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, такие как абакавир, ddl, 3TC, d4T, ddC, тенофовир и эмтрицитабин, делавирдин, эфавиренз и невирапин; другие противовирусные средства, такие как интерфероны, рибавирин и трифлуридин; антибактериальные средства, включая кабапенемы, такие как эртапенем, имипенем и меропенем; цефалоспорины, такие как цефадроксил, цефазолин, цефдинир, цефдиторен, цефалексин, цефаклор, цефепим, цефоперазон, цефотаксим, цефотетан, цефокситин, цефподоксим, цефпрозил, цефтаксидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефтриаксон, цефуроксим и лоракарбеф; другие макролиды и кетолиды, такие как азитромицин, кларитромицин, диритромицин и телитромицин; пенициллины (с клавуланатом и без), в том числе амоксициллин, ампициллин, пивампициллин, диклоксациллин, нафциллин, оксациллин, пиперациллин и тикарциллин; тетрациклины, такие как доксициклин, миноциклин и тетрациклин; и/или другие антибактериальные средства, такие как азтреонам, хлорамфеникол, клиндамицин, линезолид, нитрофурантоин и ванкомицин.[00172] Other examples of drugs may also include, but are not limited to, antivirals such as idoxuridine, trifluorothymidine, acyclovir, cidofovir, famciclovir, ganciclovir, valacyclovir, valganciclovir, vidarabine, trifluridine, and foscarnet; protease inhibitors such as ritonavir, saquinavir, lopinavir, indinavir, atazanavir, amprenavir and nelfinavir; nucleotide/nucleoside/non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors such as abacavir, ddl, 3TC, d4T, ddC, tenofovir and emtricitabine, delavirdine, efavirenz and nevirapine; other antivirals such as interferons, ribavirin and trifluridine; antibacterial agents, including cabapenems such as ertapenem, imipenem and meropenem; cephalosporins such as cefadroxil, cefazolin, cefdinir, cefditoren, cephalexin, cefaclor, cefepime, cefoperazone, cefotaxime, cefotetan, cefoxitin, cefpodoxime, cefprozil, ceftaxidime, ceftibuten, ceftizoxime, ceftriaxone, ce furoxime and loracarbef; other macrolides and ketolides such as azithromycin, clarithromycin, dirithromycin and telithromycin; penicillins (with and without clavulanate), including amoxicillin, ampicillin, pivampicillin, dicloxacillin, nafcillin, oxacillin, piperacillin and ticarcillin; tetracyclines such as doxycycline, minocycline and tetracycline; and/or other antibacterial agents such as aztreonam, chloramphenicol, clindamycin, linezolid, nitrofurantoin and vancomycin.

[00173] Другие примеры лекарственных средств также могут включать, без ограничения перечисленными, иммуномодулирующие средства, такие как противоаллергические средства, в том числе, например, хромогликат натрия, антазолин, метапирилин, хлорфенирамин, цетризин, пириламин, профенпиридамин; алдеслейкин, адалимумаб, азатиоприн, базиликсимаб, даклизумаб, этанерцепт, гидроксихлорохин, инфликсимаб, лефлуномид, метотрексат, микофенолата мофетил и сульфасалазин; антигистаминные средства, такие как азеластин, эмедастин, лоратадин, дезлоратадин, цетиризин, дифенгидрамин, хлорфенирамин, дексхлорфенирамин, клемастин, ципрогептадин, фексофенадин, гидроксизин, прометазин и левокабастин; иммунологические средства (например, вакцины и иммуностимуляторы); средства, стабилизирующие тучные клетки, такие как кромолин натрия, кетотифен, лодоксамид, недокримил, олопатадин и пемироласт, средства для абляции цилиарного тела, такие как гентимицин и цидофовир; и другие офтальмологические средства, такие как вертепорфин, пропаракаин, тетракаин, циклоспорин и пилокарпин; ингибиторы рецепторов гликопротеинов клеточной поверхности; антиконгестанты, такие как фенилэфрин, нафазолин, тетрагидразолин; липиды или гипотензивные липиды; дофаминергические агонисты и/или антагонисты, такие как хинпирол, фенолдопам и ибопамин; ингибиторы вазоспазма; сосудорасширяющие средства; гипотензивные средства; ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ); антагонисты рецептора ангиотензина-1, такие как олмесартан; ингибиторы микротрубочек; ингибиторы молекулярных моторов (динеина и/или кинезина); средства, регулирующие актиновый цитоскелет, такие как цитохалазин, латрункулин, свинхолид A, этакриновая кислота, H-7 и ингибиторы Rho-киназы (ROCK); ингибиторы ремоделирования; модуляторы внеклеточного матрикса, такие как трет-бутилгидрохинолон и AL-3037A; агонисты и/или антагонисты аденозиновых рецепторов, такие как N-6-циклофексиладенозин и (R)-фенилизопропиладенозин; агонисты серотонина; гормональные средства, такие как эстрогены, эстрадиол, прогестагенные гормоны, прогестерон, инсулин, кальцитонин, паратиреоидный гормон, пептид и вазопрессин, рилизинг-факторы гипоталамуса; антагонисты фактора роста или факторы роста, в том числе, например, эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов, трансформирующий фактор роста бета, соматотропин, фибронектин, фактор роста соединительной ткани, костные морфогенетические белки (BMP), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор линии глиальных клеток (GDNF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и фактор роста нервов (NGF); и/или цитокины, такие как интерлейкины, CD44, кохлин, остеопонтин, плеотропин, мидкин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и сывороточные амилоиды, такие как сывороточный амилоид А.[00173] Other examples of drugs may also include, but are not limited to, immunomodulatory agents such as antiallergic agents, including, for example, sodium cromoglycate, antazoline, metapyriline, chlorpheniramine, cetrizine, pyrilamine, profenpyridamine; aldesleukin, adalimumab, azathioprine, basiliximab, daclizumab, etanercept, hydroxychloroquine, infliximab, leflunomide, methotrexate, mycophenolate mofetil and sulfasalazine; antihistamines such as azelastine, emedastine, loratadine, desloratadine, cetirizine, diphenhydramine, chlorpheniramine, dexchlorpheniramine, clemastine, cyproheptadine, fexofenadine, hydroxyzine, promethazine and levocabastine; immunological agents (for example, vaccines and immunostimulants); mast cell stabilizing agents such as cromolyn sodium, ketotifen, lodoxamide, nedokrimil, olopatadine and pemirolast; ciliary body ablation agents such as gentimycin and cidofovir; and other ophthalmic agents such as verteporfin, proparacaine, tetracaine, cyclosporine and pilocarpine; cell surface glycoprotein receptor inhibitors; anticongestants such as phenylephrine, naphazoline, tetrahydrazoline; lipids or antihypertensive lipids; dopaminergic agonists and/or antagonists such as quinpirole, fenoldopam and ibopamine; vasospasm inhibitors; vasodilators; antihypertensive drugs; angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitors; angiotensin-1 receptor antagonists such as olmesartan; microtubule inhibitors; inhibitors of molecular motors (dynein and/or kinesin); actin cytoskeleton regulating agents such as cytochalasin, latrunculin, swincholide A, ethacrynic acid, H-7 and Rho kinase (ROCK) inhibitors; remodeling inhibitors; extracellular matrix modulators such as tert-butylhydroquinolone and AL-3037A; adenosine receptor agonists and/or antagonists such as N-6-cyclofexyladenosine and (R)-phenylisopropyl adenosine; serotonin agonists; hormonal agents such as estrogens, estradiol, progestogen hormones, progesterone, insulin, calcitonin, parathyroid hormone, peptide and vasopressin, hypothalamic releasing factors; growth factor antagonists or growth factors, including, for example, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor, transforming growth factor beta, somatotropin, fibronectin, connective tissue growth factor, bone morphogenetic proteins (BMPs), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), ciliary neurotrophic factor (CNTF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), insulin-like growth factor (IGF) and nerve growth factor (NGF); and/or cytokines such as interleukins, CD44, cochlin, osteopontin, pleotropin, midkine, vascular endothelial growth factor (VEGF) and serum amyloids such as serum amyloid A.

[00174] Другие терапевтические средства могут включать, без ограничения перечисленными, нейропротекторные средства, такие как любезол, нимодипин и родственные соединения, включая средства, улучшающие кровообращение, блокаторы натриевых каналов, ингибиторы глутамата, такие как мемантин, нейротрофические факторы, ингибиторы синтазы оксида азота; ловушки свободных радикалов или антиоксиданты; хелатообразующие соединения; ингибиторы связанных с апоптозом протеаз; соединения, которые снижают синтез нового белка; радиотерапевтические средства; средства фотодинамической терапии; средства генотерапии; генетические модуляторы; и средства для лечения синдрома сухого глаза, такие как циклоспорин A, противомикробные средства и гиалуронат натрия; альфа-блокаторы, такие как доксазозин, празозин и теразозин; блокаторы кальциевых каналов, такие как амлодипин, бепридил, дилтиазем, фелодипин, исрадипин, никардипин, нифедипин, нисолдипин и верапамил; другие антигипертензивные средства, такие как клонидин, диазоксид, фенолдопан, гидралазин, миноксидил, нитропруссид, феноксибензамин, эпопростенол, толазолин, трепростинил и средства на основе нитратов; антикоагулянты, включая гепарины и гепариноиды, такие как гепарин, далтепарин, эноксапарин, тинзапарин и фондапаринукс; другие антикоагулянты, такие как гирудин, апротинин, аргатробан, бивалирудин, дезирудин, лепирудин, варфарин и ксимелагатран; и/или антиагрегантные средства, такие как абциксимаб, клопидогрел, дипиридамол, оптифибатид, тиклопидин и тирофибан.[00174] Other therapeutic agents may include, but are not limited to, neuroprotective agents such as lubesol, nimodipine and related compounds including circulatory agents, sodium channel blockers, glutamate inhibitors such as memantine, neurotrophic factors, nitric oxide synthase inhibitors; free radical scavengers or antioxidants; chelating compounds; inhibitors of apoptosis-related proteases; compounds that reduce new protein synthesis; radiotherapeutics; photodynamic therapy products; gene therapy agents; genetic modulators; and agents for the treatment of dry eye syndrome, such as cyclosporine A, antimicrobial agents and sodium hyaluronate; alpha blockers such as doxazosin, prazosin and terazosin; calcium channel blockers such as amlodipine, bepridil, diltiazem, felodipine, isradipine, nicardipine, nifedipine, nisoldipine and verapamil; other antihypertensive agents such as clonidine, diazoxide, phenoldopane, hydralazine, minoxidil, nitroprusside, phenoxybenzamine, epoprostenol, tolazoline, treprostinil and nitrate-based agents; anticoagulants, including heparins and heparinoids such as heparin, dalteparin, enoxaparin, tinzaparin and fondaparinux; other anticoagulants such as hirudin, aprotinin, argatroban, bivalirudin, desirudin, lepirudin, warfarin and ximelagatran; and/or antiplatelet agents such as abciximab, clopidogrel, dipyridamole, optifibatide, ticlopidine and tirofiban.

[00175] Другие терапевтические средства могут включать, без ограничения перечисленными, ингибиторы простагландина PDE-5 и другие простагландиновые средства, такие как алпростадил, карбопрост, силденафил, тадалафил и варденафил; ингибиторы тромбина; антитромбогенные средства; средства, препятствующие агрегации тромбоцитов; тромболитики и/или фибринолитики, такие как алтеплаза, анистреплаза, ретеплаза, стрептокиназа, тенектеплаза и урокиназа; антипролиферативные средства, такие как сиролимус, такролимус, эверолимус, зотаролимус, паклитаксел и микофеноловая кислота; гормональные средства, в том числе левотироксин, флуоксиместрон, метилтестостерон, нандролон, оксандролон, тестостерон, эстрадиол, эстрон, эстропипат, кломифен, гонадотропины, гидроксипрогестерон, левоноргестрел, медроксипрогестерон, мегестрол, мифепристон, норэтиндрон, окситоцин, прогестерон, ралоксифен и тамоксифен; противоопухолевые средства, в том числе алкилирующие средства, такие как кармустин, ломустин, мелфалан, цисплатин, фторурацил 3, и средства, подобные прокарбазиновым антибиотикам, такие как блеомицин, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, митомицин и пликамицин; антипролиферативные средства (такие как 1,3-цис-ретиноевая кислота, 5-фторурацил, таксол, рапамицин, митомицин C и цисплатин); антиметаболиты, такие как цитарабин, флударабин, гидроксимочевина, меркаптопурин и 5-флуроурацил (5-ФУ); иммуномодулирующие средства, такие как алдеслейкин, иматиниб, ритуксимаб и тозитумомаб; ингибиторы митоза доцетаксел, этопозид, винбластин и винкристин; радиоактивные вещества, такие как стронций-89; и/или другие противоопухолевые средства, такие как иринотекан, топотекан и митотан.[00175] Other therapeutic agents may include, but are not limited to, PDE-5 prostaglandin inhibitors and other prostaglandin agents such as alprostadil, carboprost, sildenafil, tadalafil and vardenafil; thrombin inhibitors; antithrombogenic agents; agents that prevent platelet aggregation; thrombolytics and/or fibrinolytics such as alteplase, anistreplase, reteplase, streptokinase, tenecteplase and urokinase; antiproliferative agents such as sirolimus, tacrolimus, everolimus, zotarolimus, paclitaxel and mycophenolic acid; hormonal agents, including levothyroxine, fluoxymestron, methyltestosterone, nandrolone, oxandrolone, testosterone, estradiol, estrone, estropipate, clomiphene, gonadotropins, hydroxyprogesterone, levonorgestrel, medroxyprogesterone, megestrol, mifepristone, norethindrone, oxytocin, progesterone, raloxifene, etc. oxyphene; antineoplastic agents, including alkylating agents such as carmustine, lomustine, melphalan, cisplatin, fluorouracil 3, and procarbazine antibiotic-like agents such as bleomycin, daunorubicin, doxorubicin, idarubicin, mitomycin and plicamycin; antiproliferative agents (such as 1,3-cis-retinoic acid, 5-fluorouracil, taxol, rapamycin, mitomycin C and cisplatin); antimetabolites such as cytarabine, fludarabine, hydroxyurea, mercaptopurine, and 5-fluorouracil (5-FU); immunomodulatory agents such as aldesleukin, imatinib, rituximab and tositumomab; mitosis inhibitors docetaxel, etoposide, vinblastine and vincristine; radioactive substances such as strontium-89; and/or other antineoplastic agents such as irinotecan, topotecan and mitotane.

Введение RPC и способы леченияRPC Introduction and Treatment Methods

[00176] Также в настоящем документе предложены способы и применения культивированных ретинальных клеток-предшественников, полученных в виде суспензии клеток и применяемых в качестве аллогенных трансплантатов для лечения пациентов с заболеванием сетчатки. Например, в настоящем документе предложены клеточные терапии, включающие или состоящие из применения культивированных гетерогенных популяций клеток из незрелой сетчатки млекопитающего, например, человека.[00176] Also provided herein are methods and uses of cultured retinal progenitor cells obtained as a cell suspension and used as allogeneic grafts for the treatment of patients with retinal disease. For example, provided herein are cell therapies including or consisting of the use of cultured heterogeneous populations of cells from the immature retina of a mammal, such as a human.

[00177] Популяции клеток и соответствующие композиции, описанные в настоящем документе, могут быть предоставлены субъекту или пациенту множеством различных способов. В качестве неограничивающего примера их могут доставлять локально, например, в участок фактического или потенциального повреждения или заболевания. В некоторых вариантах осуществления их вводят с использованием шприца или иглы для инъекции композиций в участок возможного или фактического повреждения или заболевания. В других вариантах осуществления их вводят системно, например, вводят в кровоток внутривенно или внутриартериально. Конкретный путь введения в значительной степени будет зависеть от локализации и характера заболевания или повреждения, подлежащего лечению или профилактике. Таким образом, способы, описанные в настоящем документе, включают получение популяции или композиции клеток любым известным и доступным способом или путем, включающим, без ограничения перечисленными, внутриглазное, пероральное, парентеральное, внутривенное, внутриартериальное, интраназальное и внутримышечное введение.[00177] The cell populations and corresponding compositions described herein can be provided to a subject or patient in a variety of different ways. By way of non-limiting example, they may be delivered locally, for example, to the site of actual or potential injury or disease. In some embodiments, they are administered using a syringe or needle to inject the compositions into the site of possible or actual injury or disease. In other embodiments, they are administered systemically, for example, introduced into the bloodstream intravenously or intra-arterially. The specific route of administration will largely depend on the location and nature of the disease or injury being treated or prevented. Thus, the methods described herein include obtaining a population or composition of cells by any known and available method or route, including, but not limited to, intraocular, oral, parenteral, intravenous, intraarterial, intranasal and intramuscular administration.

[00178] Определение подходящих доз и схем лечения может быть с легкостью выполнено на основе информации, общеизвестной в данной области, и полученной врачом.[00178] Determination of suitable dosages and treatment regimens can be readily accomplished based on information generally known in the art and obtained by the physician.

[00179] В качестве неограничивающего примера доза клеток может составлять от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,5 миллиона клеток (например, 0,3, 0,31, 0,32, 0,33, 0,34, 0,35, 0,36, 0,37, 0,38, 0,39, 0,4, 0,41, 0,42, 0,43, 0,44, 0,45, 0,46, 0,47, 0,48, 0,49 или 0,5 миллиона клеток) или 0,5-3 миллиона клеток (например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3 миллиона клеток).[00179] As a non-limiting example, the cell dose can be from about 0.3 to about 0.5 million cells (e.g., 0.3, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.41, 0.42, 0.43, 0.44, 0.45, 0.46, 0.47, 0, 48, 0.49 or 0.5 million cells) or 0.5-3 million cells (eg 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 , 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2 .4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 or 3 million cells).

[00180] Результаты эффективности, наблюдаемые для обоих диапазонов доз, примерно одинаковы. Однако существует возможный повышенный риск, что при больших дозах (например, 2-9 миллионов клеток) клетки будут персистировать на зрительной оси, приликрепляться к задней мембране хрусталика и/или попадать в переднюю камеру (псевдогипопион), если в глазу пациента ослаблены цилиарные связки. Более того, специалистам в данной области будет очевидна вероятность того, что продолжительность выживания трансплантата может быть пропорциональна дозе и, таким образом, исходному размеру трансплантата.[00180] The efficacy results observed for both dose ranges are approximately the same. However, there is a possible increased risk that at larger doses (eg, 2-9 million cells) cells will persist on the visual axis, adhere to the posterior lens membrane, and/or enter the anterior chamber (pseudohypopyon) if the patient's eye has weakened ciliary ligaments. Moreover, those skilled in the art will recognize the possibility that the duration of graft survival may be proportional to the dose and thus to the initial graft size.

[00181] Частота введения доз аллогенных hRPC в полость стекловидного тела будет иметь большое значение. В различных вариантах осуществления последующие дозы (т.е. "повторные дозы") можно вводить в один и тот же глаз пациента или в другой глаз. Повторное введение во второй глаз как в моделях на животных, так и у ряда пациентов было выполнено без последующих иммунных осложнений, что позволяет предположить, что введение повторных доз будет хорошо переноситься при двустороннем введении (и, предположительно, в тот же глаз, как выполняли на животных до 3 раз).[00181] The frequency of dosing of allogeneic hRPC into the vitreous cavity will be of great importance. In various embodiments, subsequent doses (ie, "repeat doses") may be administered to the same eye of the patient or to a different eye. Repeated dosing in the second eye, both in animal models and in a number of patients, has been performed without subsequent immune complications, suggesting that repeat dosing will be well tolerated when administered bilaterally (and presumably in the same eye as performed in animals up to 3 times).

[00182] Трансплантаты могут выживать у пациентов с RP в течение года и более. Однако, поскольку они имеют тенденцию исчезать из стекловидного тела приблизительно через 1-1,5 года, это указывает на то, что введение повторной дозы в течение приблизительно 1-2 лет может быть не таким агрессивным и, фактически, в большинстве случаев, в будущем может стать нормой.[00182] Grafts can survive for a year or more in patients with RP. However, since they tend to disappear from the vitreous after approximately 1-1.5 years, this indicates that repeat dosing over approximately 1-2 years may not be as aggressive and, in fact, in most cases, in the future may become the norm.

[00183] В любом из способов, раскрытых в настоящем документе, лечение может включать одно лечение или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более) курсов лечения. В частности, для профилактических целей в некоторых вариантах осуществления предусмотрено, что очищенные популяции клеток вводят после стресса, который потенциально мог вызывать повреждение сетчатки.[00183] In any of the methods disclosed herein, treatment may include one treatment or multiple (eg, 2, 3, 4, 5, 6 or more) courses of treatment. In particular, for prophylactic purposes, some embodiments provide that purified cell populations are administered following stress that could potentially cause retinal damage.

[00184] В одном варианте осуществления популяции и композиции клеток могут вводить локально в виде однократной инъекции в полость стекловидного тела или субретинальное пространство субъекта.[00184] In one embodiment, cell populations and compositions may be administered locally as a single injection into the vitreous cavity or subretinal space of a subject.

[00185] Хотя композиции и способы, описанные в настоящем документе, не ограничиваются каким-либо конкретным механизмом действия, примерный механизм действия является диффузным и/или трофическим. Доказательства согласуются с концепцией трофического перепрограммирования отмирающих колбочек реципиента, что приводит к переключению с апоптотического пути на восстановление способности световой обработки. Этот процесс может быть прямым или косвенным. Не исключается вовлечение других тканей глаза. Этот механизм позволяет помещать трансплантат из гетерогенной смеси фетальных нервных клеток сетчатки в стекловидное тело или субретинальное пространство.[00185] Although the compositions and methods described herein are not limited to any particular mechanism of action, an exemplary mechanism of action is diffuse and/or trophic. The evidence is consistent with the concept of trophic reprogramming of dying recipient cones, resulting in a switch from the apoptotic pathway to restoration of light processing capacity. This process can be direct or indirect. Involvement of other eye tissues cannot be ruled out. This mechanism allows a graft of a heterogeneous mixture of fetal retinal nerve cells to be placed into the vitreous or subretinal space.

[00186] Введение в стекловидное тело усиливает лечебный эффект на основе диффузии. Этот механизм может позволить помещать трансплантат из гетерогенных смесей фетальных нервных клеток сетчатки вне зрительной оси, но при этом лечить желтое пятно пациента. Более того, витреальное введение используют для значительного упрощения лечения, поскольку такой пример лечения может повысить доступность для нуждающихся пациентов во всем мире. Кроме того, витреальное введение может способствовать иммунной толерантности, поскольку стекловидное тело удалено от сосудов. Специалистам в данной области будет очевидно, что введение в стекловидное тело позволяет избежать возможных осложнений при субретинальной хирургии, избежать риска общей анестезии, не требует создания отверстия (ретинотомии) в сетчатке (что повышает риск отслоения сетчатки, кровотечения) и/или не требует, чтобы сетчатка пациента подвергалась фокальной отслойке (фокальная отслойка может привести к повреждению или потере фоторецепторов, разрывам сетчатки, кровотечению, полному отслоению сетчатки, а при пигментном ретините (RP) отслойка тонкой, атрофической и адгерентной сетчатки будет сложной/рискованной процедурой).[00186] Intravitreal administration enhances the therapeutic effect based on diffusion. This mechanism may allow a graft of heterogeneous mixtures of fetal retinal nerve cells to be placed outside the visual axis while still treating the patient's macula. Moreover, vitreous administration is used to greatly simplify treatment, since this example of treatment can increase accessibility for patients in need around the world. In addition, vitreal administration may promote immune tolerance because the vitreous is removed from the blood vessels. It will be apparent to those skilled in the art that intravitreal injection avoids the potential complications of subretinal surgery, avoids the risk of general anesthesia, does not require creating a hole (retinotomy) in the retina (which increases the risk of retinal detachment, bleeding), and/or does not require that The patient's retina had undergone a focal detachment (focal detachment can result in damage or loss of photoreceptors, retinal tears, bleeding, complete retinal detachment, and in retinitis pigmentosa (RP), detaching the thin, atrophic and adherent retina would be a difficult/risky procedure).

[00187] В некоторых вариантах осуществления клетки помещают в полость стекловидного тела иглой подходящего размера и длины. В идеальном варианте шприц должен иметь минимальное мертвое пространство (например, 1 микролитр), чтобы повысить эффективность доставки и избежать потери продукта из-за удерживания в шприце. Использование короткой иглы (например, калибра 31G с длиной 5/16 дюйма (~8 мм) или 30G с длиной ¹/₂ дюйма) обеспечивает максимальное удобство (т.е. подходит для использования в клинических или амбулаторных условиях). Однако использование иглы большей длины (например, 27G или 25G с длиной 5/8 дюйма (~16 мм)) обеспечивает оптимальное размещение (при использовании операционного эндоскопа) дальше назад (кзади) в стекловидном теле, ближе к желтому пятну. Определение подходящего размера и длины иглы является рутинной практикой в данной области. При выборе иглы подходящего размера и длины важно, чтобы жизнеспособность клеток оставалась выше необходимого порогового значения после того, как клетки были пропущены через иглу.[00187] In some embodiments, the cells are placed into the vitreous cavity with a needle of appropriate size and length. Ideally, the syringe should have minimal dead space (eg, 1 microliter) to improve delivery efficiency and avoid product loss due to retention in the syringe. Using a short needle (eg, 31G at 5/16" (~8mm _{) or 30G at 1/2} ^" provides maximum convenience (i.e., suitable for use in a clinical or outpatient setting). However, using a longer needle (eg, 27G or 25G with a 5/8-inch (~16mm) length) provides optimal placement (when using an operating scope) further back (posteriorly) in the vitreous, closer to the macula. Determining the appropriate needle size and length is routine practice in the field. When selecting a needle of appropriate size and length, it is important that cell viability remains above the required threshold after the cells have been passed through the needle.

[00188] Помещение клеток в переднюю часть стекловидного тела простое и обеспечивает максимальную безопасность и удобство. Напротив, помещение в заднюю часть стекловидного тела (около заднего полюса) требует непосредственной визуализации конца иглы, чтобы избежать проникающего повреждения сетчатки. Однако это может усилить общий эффект лечения и может обеспечить оптимальное помещение и эффективность.[00188] Placement of cells into the anterior vitreous is simple and provides maximum safety and convenience. In contrast, placement into the posterior vitreous (near the posterior pole) requires direct visualization of the needle tip to avoid penetrating retinal injury. However, it may enhance the overall treatment effect and may provide optimal placement and effectiveness.

[00189] Хотя замена клеток сетчатки возможна, она не является необходимой для клинической эффективности. Точно так же миграция донорских клеток в сетчатку возможна, но не является необходимой для клинической эффективности; интеграция донорских клеток в сети сетчатки возможна, но не является необходимой для эффективности; интеграция донорских клеток во внешний ядерный слой/желтое пятно сетчатки реципиента возможна, но не является необходимой для эффективности; и/или интеграция донорских клеток в сетчатку возможна, но не является необходимой для длительного выживания трансплантата.[00189] Although replacement of retinal cells is possible, it is not necessary for clinical effectiveness. Similarly, migration of donor cells into the retina is possible but not necessary for clinical effectiveness; integration of donor cells into the retinal network is possible but not necessary for effectiveness; integration of donor cells into the outer nuclear layer/macula of the recipient retina is possible, but not necessary for effectiveness; and/or integration of donor cells into the retina is possible but not necessary for long-term graft survival.

[00190] В некоторых вариантах осуществления клетки RPC можно вводить в полость стекловидного тела, когда, необязательно, не требуется витрэктомия или субретинальная хирургия. Однако некоторые варианты осуществления могут включать необязательное применение одной или нескольких витрэктомий, кор-витрэктомии и/или витреолитического средства для удаления геля стекловидного тела и оптимизации подвижности и проникновения введенных клеток в заднюю часть стекловидного тела (например, оптимальное положение в непосредственной близости от заднего полюса глаза). В некоторых случаях хирургическая витрэктомия может улучшать размещение клеток в глазу.[00190] In some embodiments, RPC cells can be injected into the vitreous cavity when, optionally, vitrectomy or subretinal surgery is not required. However, some embodiments may optionally involve the use of one or more vitrectomies, core vitrectomies, and/or a vitreolytic agent to remove vitreous gel and optimize the motility and penetration of injected cells into the posterior vitreous (e.g., optimal location close to the posterior pole of the eye ). In some cases, surgical vitrectomy can improve the placement of cells in the eye.

[00191] Клетки также могут имплантировать (например, путем инъекции) в субретинальное пространство, или их могут имплантировать (например, путем инъекции) в глаз с применением любой стандартной процедуры внутриглазной инъекции, например, с использованием пути подкожного введения или введения под углом. В некоторых вариантах осуществления ретинотомия, внутриглазной газ или силиконовое масло не требуются.[00191] The cells may also be implanted (eg, by injection) into the subretinal space, or they may be implanted (eg, by injection) into the eye using any standard intraocular injection procedure, for example, using the subcutaneous or angled route. In some embodiments, retinotomy, intraocular gas, or silicone oil are not required.

[00192] В альтернативе, необязательно могут проводить парацентез передней камеры, в зависимости от ситуации, по определению специалиста в данной области. В некоторых вариантах осуществления ушивание глазного яблока во время и/или после процедуры не требуется.[00192] Alternatively, paracentesis of the anterior chamber may optionally be performed, depending on the situation, as determined by one skilled in the art. In some embodiments, suturing of the eyeball is not required during and/or after the procedure.

[00193] Любой из способов, раскрытых в настоящем документе, может включать этап введения композиций при поверхностной анестезией непосредственно в полость стекловидного тела без потребности в системной иммунодепрессии у субъекта. Кроме того, хотя тканевое типирование трансплантата и определение совместимости с пациентом или субъектом не требуется, его могут выполнять при необходимости, например, с помощью любых методик тканевого типирования и определения совместимости, известных специалистам в данной области.[00193] Any of the methods disclosed herein may include the step of administering the compositions under superficial anesthesia directly into the vitreous cavity without the need for systemic immunosuppression in the subject. In addition, although tissue typing of the graft and determination of compatibility with the patient or subject is not required, it can be performed if necessary, for example, using any tissue typing and compatibility testing techniques known to those skilled in the art.

[00194] Как уже отмечено, в любом из способов, описанных в настоящем документе, можно использовать только поверхностную анестезию, например, без использования местной, регионарной или общей анестезии. Однако в некоторых случаях во время введения могут дополнительно или альтернативно использовать местную, регионарную или общую анестезию. Примеры подходящих местных анестетиков, подходящих для применения в способах, раскрытых в настоящем документе, включают, без ограничения, меприкаин, пропаракаин, прилокаин, ропивакаин, бензокаин, бупивакаин, бутамбена пикрат, хлорпрокаин, кокаин, дибукаин, диметизохин, диклонин, этидокаин, гексилкаин, кетамин, лидокаин, мепивакаин, прамоксин, прокаин, тетракаин, салицилаты и их производные, сложные эфиры, соли и смеси.[00194] As already noted, in any of the methods described herein, only superficial anesthesia can be used, for example, without the use of local, regional or general anesthesia. However, in some cases, local, regional or general anesthesia may be used additionally or alternatively during insertion. Examples of suitable local anesthetics suitable for use in the methods disclosed herein include, but are not limited to, mepricaine, proparacaine, prilocaine, ropivacaine, benzocaine, bupivacaine, butambene picrate, chloroprocaine, ***e, dibucaine, dimethisoquine, dyclonine, etidocaine, hexylcaine, ketamine, lidocaine, mepivacaine, pramoxine, procaine, tetracaine, salicylates and their derivatives, esters, salts and mixtures.

[00195] В некоторых вариантах осуществления не требуется проводить никакой противовоспалительной и/или иммунной депрессии (т.е. системной иммунодепрессии). Кроме того, клинический опыт подтверждает, что это не требуется, так как в некоторых случаях выживание трансплантата можно наблюдать в течение многих месяцев, например, включая 1 год и дольше.[00195] In some embodiments, no anti-inflammatory and/or immune suppression (ie, systemic immunosuppression) is required. In addition, clinical experience confirms that this is not required, since in some cases graft survival can be observed for many months, for example, including 1 year or longer.

[00196] Впрочем, при необходимости могут включать противовоспалительную и/или иммунодепрессивную терапию в виде послеоперационных капель. Например, пациенты после инъекции могут получать наружные стероидные глазные капли с уменьшением вводимой дозы в течение 1 недели или, в альтернативе, до 2 последующих недель, если имеются клинические показания при подтверждении стойкого воспаления после лечения.[00196] However, if necessary, anti-inflammatory and/or immunosuppressive therapy may be included in the form of postoperative drops. For example, post-injection patients may receive topical steroid eye drops with a tapering dose administered over 1 week or, alternatively, up to 2 subsequent weeks if clinically indicated with evidence of persistent inflammation following treatment.

[00197] В альтернативных вариантах осуществления нет никакого строгого постельного режима, поддержания послеоперационного положения и/или потребности в принятии положения "лицом вниз". Такие способы могут выполнять амбулаторно и, скорее всего, не потребуют никакого ночного пребывания в стационаре.[00197] In alternative embodiments, there is no strict bed rest, postoperative positioning, and/or need for a face-down position. These treatments can be performed on an outpatient basis and most likely will not require any overnight hospital stay.

[00198] В некоторых вариантах осуществления изобретения во время введения голову пациента отводят назад из откинутого положения сидя, как можно ближе к горизонтальному положению, чтобы максимально увеличить оседание введенных клеток в геле стекловидного тела по направлению к заднему полюсу глаза, который является наиболее важной для зрения частью сетчатки. Пациенты должны сохранять такое положение примерно 30 минут или дольше, если пациент выдерживает это. Кроме того, после введения пациенты также должны оставаться дома, лежа на спине, смотря вверх.[00198] In some embodiments, during administration, the patient's head is pulled back from a reclined seated position, as close to horizontal as possible, to maximize the settling of injected cells in the vitreous gel toward the posterior pole of the eye, which is most important for vision. part of the retina. Patients should maintain this position for approximately 30 minutes, or longer if the patient can tolerate it. In addition, after administration, patients should also remain at home, lying on their back, looking up.

[00199] Любые из композиций и способов, описанных в настоящем документе, включающие или использующие гетерогенные смеси фетальных нервных клеток сетчатки (например, ретинальных клеток-предшественников), предназначены для лечения, уменьшения тяжести или предотвращения заболевания или патологии сетчатки, например, болезни Ашера, пигментного ретинита (RP), дегенеративного заболевания сетчатки, возрастной макулодистрофии (ВМД), влажной формы ВМД или сухой формы ВМД, географической атрофии, заболевания фоторецепторов сетчатки, диабетической ретинопатии, цистоидного макулярного отека, увеита, отслоения сетчатки, травмы сетчатки, макулярных разрывов, макулярной телеангиэктазии, травматического или ятрогенного повреждения сетчатки, заболевания ганглионарных клеток или клеток зрительного нерва, глаукомы или оптической нейропатии, ишемического заболевания сетчатки, такого как ретинопатии недоношенных, окклюзии сосудов сетчатки или ишемической оптической нейропатии; или для улучшения фотопического (дневного) зрения; или для улучшения коррекции остроты зрения, или улучшения функции желтого пятна, или улучшения поля зрения, или улучшения скотопического (ночного) зрения.[00199] Any of the compositions and methods described herein, including or using heterogeneous mixtures of fetal retinal nerve cells (e.g., retinal progenitor cells), are intended to treat, reduce the severity of, or prevent a retinal disease or pathology, e.g., Usher disease, retinitis pigmentosa (RP), degenerative retinal disease, age-related macular degeneration (AMD), wet AMD or dry AMD, geographic atrophy, retinal photoreceptor disease, diabetic retinopathy, cystoid macular edema, uveitis, retinal detachment, retinal trauma, macular holes, macular telangiectasia, traumatic or iatrogenic retinal injury, ganglion cell or optic nerve cell disease, glaucoma or optic neuropathy, ischemic retinal disease such as retinopathy of prematurity, retinal vascular occlusion or ischemic optic neuropathy; or to improve photopic (daytime) vision; or to improve corrected visual acuity, or improve macular function, or improve visual field, or improve scotopic (night) vision.

[00200] Аналогичным образом, любые из композиций или способов, описанных в настоящем документе, могут применяться для получения быстрого эффекта, наибольшей остроты зрения с коррекцией, улучшенной функции желтого пятна и/или возможности сохранения или восстановления центральной фиксации.[00200] Likewise, any of the compositions or methods described herein can be used to provide rapid relief, best-corrected visual acuity, improved macular function, and/or the ability to maintain or restore central fixation.

[00201] Использование или практическое применение любых из композиций и способов, раскрытых в настоящем документе, приводит к различным системным преимуществам, например, изменениям внешнего вида у вылеченных лиц, возможно, из-за соматических улучшений, которые могут быть связаны с влиянием света на циркадные ритмы, функцию гипофиза, высвобождение гормонов, сосудистый тонус и т.д.; улучшенное ощущение зрительных способностей; улучшенная амбулаторная независимость; улучшение самочувствия; и/или улучшение повседневной активности.[00201] The use or practice of any of the compositions and methods disclosed herein results in various systemic benefits, for example, changes in appearance in treated individuals, possibly due to somatic improvements that may be related to the effect of light on circadian rhythms. rhythms, pituitary function, hormone release, vascular tone, etc.; improved sense of visual abilities; improved ambulatory independence; improvement of well-being; and/or improvement in activities of daily living.

[00202] В альтернативных вариантах осуществления использование или практическое применение любых композиций и способов, раскрытых в настоящем документе, не приводит к развитию нежелательного роста клеток, например, опухолей; инфекциям, например, отсутствует эндофтальмит, вероятный при любой внутриглазной процедуре; передаче болезни (однако прионную инфекцию или коровье бешенство может быть сложно исключить); увеиту и/или острому отторжению трансплантата; повышенному внутриглазному давлению; закрытию угла; гипотонии; отслоению сетчатки; и/или неоваскуляризации.[00202] In alternative embodiments, the use or practice of any of the compositions and methods disclosed herein does not result in the development of undesirable cell growth, such as tumors; infections, for example, there is no endophthalmitis, which is likely with any intraocular procedure; disease transmission (however, prion infection or mad cow disease may be difficult to exclude); uveitis and/or acute transplant rejection; increased intraocular pressure; closing the corner; hypotension; retinal detachment; and/or neovascularization.

[00203] Применения и способы, описанные в настоящем документе, могут быстро и устойчиво восстанавливать и/или сохранять клинически значимые степени зрительной функции сетчатки у млекопитающих, включая, помимо прочего, улучшенное фотопическое (дневное) зрение, повышенную наибольшую остроту зрения с коррекцией, улучшенную функцию желтого пятна, сохранение или восстановление центральной фиксации, улучшенное поле зрения, улучшение скотопического (ночного) зрения, повышенную или улучшенную чувствительность к звуку и улучшение остроты зрения контралатерального глаза. Другие изменения могут включать различные системные преимущества, например, изменения внешнего вида из-за соматических улучшений, которые могут быть связаны с влиянием света на циркадные ритмы, функцию гипофиза, высвобождение гормонов, сосудистый тонус; улучшенное ощущение зрительных способностей; улучшенную амбулаторную независимость; улучшение самочувствия; и/или улучшение повседневной активности. Такие изменения зрения можно измерять с помощью способов, известных в данной области.[00203] The applications and methods described herein can rapidly and sustainably restore and/or maintain clinically significant degrees of retinal visual function in mammals, including, but not limited to, improved photopic (daytime) vision, increased best-corrected visual acuity, improved macular function, preservation or restoration of central fixation, improved visual field, improved scotopic (night) vision, increased or improved sensitivity to sound, and improved visual acuity of the contralateral eye. Other changes may include various systemic benefits, such as changes in appearance due to somatic improvements, which may be related to the effects of light on circadian rhythms, pituitary function, hormonal release, vascular tone; improved sense of visual abilities; improved ambulatory independence; improvement of well-being; and/or improvement in activities of daily living. Such changes in vision can be measured using methods known in the art.

[00204] Улучшение зрения может быть быстрым и может проявляться в течение первой недели после лечения, но может также проявляться в виде постепенного улучшения в течение более длительных периодов времени. Может происходить замещение клеток сетчатки и/или миграция донорских клеток в сетчатку, сеть сетчатки, внешний ядерный слой или желтое пятно, но это не обязательно для клинической эффективности; миграция донорских клеток в сетчатку возможна, но не обязательна для клинической эффективности.[00204] Improvement in vision may be rapid and may occur within the first week after treatment, but may also occur as gradual improvement over longer periods of time. Replacement of retinal cells and/or migration of donor cells into the retina, retinal reticulum, outer nuclear layer, or macula may occur, but is not necessary for clinical effectiveness; Migration of donor cells into the retina is possible but not required for clinical effectiveness.

[00205] Измерение изменений зрения, включая улучшение зрения в результате лечения композициями ретинальных клеток-предшественников, раскрытых в настоящем документе, может быть достигнуто с применением стандартных методов офтальмологического обследования, включая, помимо прочего, исследование глазного дна, наибольшую остроту зрения с коррекцией (BCVA), ВГД, осмотр с помощью щелевой лампы, флуоресцентную ангиографию (ФА), оптическую когерентную томографию (ОКТ), стереофотографию глазного дна, электроретинографию (ЭРГ), мелькающую электроретинографию колбочек, периметрию (поле зрения), микропериметрию, адаптацию к темноте, умение преодолевать лабиринт, оптокинетические/оптомоторные реакции, реакции зрачка, зрительные вызванные потенциалы (ЗВП) и сканирующая лазерная офтальмоскопия с адаптивной оптикой (AOSLO).[00205] Measurement of changes in vision, including improvements in vision resulting from treatment with the retinal progenitor cell compositions disclosed herein, can be achieved using standard ophthalmic examination techniques, including, but not limited to, fundus examination, best corrected visual acuity (BCVA) ), IOP, slit-lamp examination, fluorescein angiography (FA), optical coherence tomography (OCT), fundus stereophotography, electroretinography (ERG), flickering cone electroretinography, perimetry (field of view), microperimetry, dark adaptation, coping skills labyrinth, optokinetic/optomotor responses, pupillary responses, visual evoked potentials (VEPs), and adaptive scanning laser ophthalmoscopy (AOSLO).

[00206] Данные, полученные на животных in vivo, также указывают, что интравитреальные RPC являются средством воздействия на несколько типов клеток в пораженной сетчатке, включая, помимо прочего, клетки Мюллера (усиленная активация при дегенерации сетчатки и/или повышенная локальная экспрессия глутаминсинтетазы (ГС)); сосудистый компартмент при диабетической ретинопатии (меньшая проницаемость сосудов (пропотевание) и/или снижение ишемии в результате снижения уровней VEGF внутри сетчатки); усиление рекрутинга макрофагов при дегенерации сетчатки; повышенная локальная экспрессия bFGF (нейротрофического фактора) при дегенерации сетчатки; снижение экспрессии каспазы 3 (что указывает на уменьшение гибели клеток сетчатки). Таким образом, введение RPC также может быть полезным при ряде других заболеваний, нарушений и патологий сетчатки.[00206] In vivo animal data also indicate that intravitreal RPCs are a means of targeting multiple cell types in the diseased retina, including but not limited to Müller cells (increased activation in retinal degeneration and/or increased local expression of glutamine synthetase (GS) )); vascular compartment in diabetic retinopathy (less vascular permeability (sweating) and/or decreased ischemia as a result of decreased VEGF levels within the retina); increased recruitment of macrophages during retinal degeneration; increased local expression of bFGF (neurotrophic factor) in retinal degeneration; decreased caspase 3 expression (indicating decreased retinal cell death). Thus, RPC administration may also be beneficial in a number of other retinal diseases, disorders, and pathologies.

[00207] Кроме того, были получены предварительные подтверждения перекрестного эффекта лечения по показателям эффективности во втором глазу, в который не делали инъекцию. В частности, это наблюдали у крыс RCS (гистологическое восстановление фоторецепторов, а также результаты ЭРГ), а также в подгруппе пациентов (проверка остроты зрения), и, по-видимому, это свидетельствует о "гуморальном" лечебном эффекте, который может распространяться за пределы глаза, в который делали инъекцию. Возможно, что этот эффект может быть результатом диффузии цитокинов и/или экзосом через кровоток, иммуномодуляции или того и другого.[00207] In addition, there was preliminary evidence of treatment crossover in efficacy rates in the second eye that was not injected. In particular, this was observed in RCS rats (histological photoreceptor recovery as well as ERG results) and also in a subgroup of patients (visual acuity testing), and appears to indicate a “humoral” therapeutic effect that may extend beyond the eye into which the injection was given. It is possible that this effect may result from diffusion of cytokines and/or exosomes through the bloodstream, immunomodulation, or both.

[00208] Аналогичным образом, данные in vivo на животных указывают, что однократная интравитреальная инъекция только белка остеопонтина (OPN) воспроизводит некоторые, но не все лечебные эффекты, обеспечиваемые hRPC. Однако эффекты однократной дозы плейотропина (PTN) и/или мидкина отличались от эффектов, наблюдаемых при введении OPN, с точки зрения времени и специфических ответов популяций клеток сетчатки.[00208] Similarly, in vivo animal data indicate that a single intravitreal injection of osteopontin protein (OPN) alone reproduces some, but not all, of the therapeutic effects provided by hRPC. However, the effects of a single dose of pleiotropin (PTN) and/or midkine differed from those observed with OPN in terms of timing and specific responses of retinal cell populations.

[00209] Данные, полученные in vivo на животных, также указывают, что однократная интравитреальная инъекция экзосом, полученных из RPC, в некоторой степени воспроизводит лечебный эффект, обеспечиваемый hRPC.[00209] In vivo animal data also indicate that a single intravitreal injection of RPC-derived exosomes somewhat replicates the therapeutic effect provided by hRPC.

Наборы и инструкцииKits and instructions

[00210] Также предложены наборы, содержащие любую из композиций, описанных в настоящем документе (например, гетерогенную смесь фетальных нервных клеток сетчатки), подходящие для применения в любом из способов, раскрытых в настоящем документе (например, лечение заболевания или патологии сетчатки или получение или выделение гетерогенной смеси фетальных нервных клеток сетчатки), включающие инструкции по их применению. Также предложены наборы, содержащие композицию, продукт производства или смесь или культуру клеток (например, гетерогенную смесь фетальных нервных клеток сетчатки), при этом набор необязательно также включает инструкции по применению любого из способов, описанных в настоящем документе.[00210] Also provided are kits containing any of the compositions described herein (e.g., a heterogeneous mixture of fetal retinal nerve cells) suitable for use in any of the methods disclosed herein (e.g., treating a retinal disease or pathology or producing or isolation of a heterogeneous mixture of fetal retinal nerve cells), including instructions for their use. Also provided are kits containing a composition, product, or mixture or culture of cells (eg, a heterogeneous mixture of fetal retinal nerve cells), which kit optionally also includes instructions for use of any of the methods described herein.

[00211] Наборы также могут включать популяцию клеток, содержащую ретинальные клетки-предшественники млекопитающих, описанные в настоящем документе, представленные либо как клетки в культуре, свежие или замороженные, либо включенные в состав композиции для введения субъекту. Аналогичным образом, набор может дополнительно включать инструкции по применению любого из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления такие наборы могут дополнительно содержать средство, которое связывает один или более маркеров ретинальных клеток-предшественников, описанных в настоящем документе (например, антитело или олигонуклеотидный праймер), и/или базальную или кондиционированную среду. Например, подходящий набор может включать: первый контейнер, содержащий антитело, специфичное к одному или нескольким маркерам, где указанное антитело адаптировано к выделению или обнаружению, например, путем конъюгирования с флуоресцентным маркером или магнитной гранулой; и второй контейнер, содержащий базальную или кондиционированную среду. Наборы могут дополнительно включать один или более дополнительных реагентов, используемых для получения популяции клеток, как предусмотрено в настоящем документе, таких как среда для культивирования клеток, чашки для культивирования клеток, покрытые внеклеточным матриксом, и/или ферменты, подходящие для обработки ткани. Набор также может включать инструкции по применению набора для выделения, очистки и/или экспансии ретинальных клеток-предшественников или популяций клеток, полученных из образца ткани. Аналогичным образом, наборы могут дополнительно содержать средства для получения образца ткани от пациента или донора и/или контейнер для хранения полученного образца ткани.[00211] The kits may also include a population of cells containing the mammalian retinal progenitor cells described herein, presented either as cells in culture, fresh or frozen, or included in a composition for administration to a subject. Likewise, the kit may further include instructions for use of any of the methods described herein. In some embodiments, such kits may further comprise an agent that binds one or more retinal progenitor cell markers described herein (eg, an antibody or oligonucleotide primer) and/or basal or conditioned medium. For example, a suitable kit may include: a first container containing an antibody specific for one or more markers, wherein said antibody is adapted to be recovered or detected, for example by conjugation to a fluorescent marker or magnetic bead; and a second container containing basal or conditioned medium. The kits may further include one or more additional reagents used to obtain a population of cells as provided herein, such as cell culture medium, cell culture dishes coated with an extracellular matrix, and/or enzymes suitable for tissue processing. The kit may also include instructions for using the kit to isolate, purify and/or expand retinal progenitor cells or populations of cells derived from a tissue sample. Likewise, kits may further comprise means for obtaining a tissue sample from a patient or donor and/or a container for storing the resulting tissue sample.

Ветеринарные примененияVeterinary applications

[00212] Любые из композиций и способов, описанных в настоящем документе, также могут применять для ветеринарных применений. Например, выращивание кошачьих RPC и терапевтическое применение на сетчатке у кошек с дистрофией и других животных, например, любого домашнего млекопитающего, обычных одомашненных и редких диких млекопитающих, зоопарковых животных, сельскохозяйственных животных, спортивных (например, гончих собак или беговых лошадей) животных, и т.п.[00212] Any of the compositions and methods described herein may also be used for veterinary applications. For example, the cultivation of feline RPCs and therapeutic use on the retina of cats with dystrophy and other animals, such as any domestic mammal, common domesticated and rare wild mammals, zoo animals, farm animals, sporting (eg, beagle dogs or racing horses) animals, and etc.

[00213] Существует ряд домашних животных, несущих гены, вызывающие слепоту в результате обширного близкородственного скрещивания. Эти животные включают кошек, собак и лошадей, и, вероятно, другие виды.[00213] There are a number of domestic animals that carry genes that cause blindness as a result of extensive inbreeding. These animals include cats, dogs and horses, and likely other species.

[00214] Аналогичным образом, существуют болезни и поражения сетчатки, которые возникают у диких и домашних животных, у которых лечение с применением композиций и способов, описанных в настоящем документе, будет эффективным.[00214] Likewise, there are retinal diseases and lesions that occur in wild and domestic animals that will benefit from treatment using the compositions and methods described herein.

Продукты производства, имплантаты и искусственные органыManufactured products, implants and artificial organs

[00215] Также предложены имплантаты и искусственные органы, биореакторные системы, системы культивирования клеток, планшеты, чашки, пробирки, бутылки и флаконы и т.п., включающие еще одну из композиций, описанных в настоящем документе, содержащую гетерогенную смесь фетальных невральных ретинальных клеток.[00215] Also provided are implants and artificial organs, bioreactor systems, cell culture systems, plates, dishes, tubes, bottles and vials, and the like, including another of the compositions described herein containing a heterogeneous mixture of fetal neural retinal cells .

[00216] В качестве неограничивающего примера, в настоящем документе дополнительно предложен биореактор, имплантат, стент, искусственный орган или подобные устройства, содержащие гетерогенную смесь фетальных невральных ретинальных клеток; например, имплантаты, аналогичные или такие, как описанные в патентах США 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,270,192; и публикациях заявок на пат. США 20040127987; 20080119909 (описывает ушные имплантаты); 20080118549 (описывает глазные имплантаты); 20080020015 (описывает биоактивный перевязочный материал); 20070254005 (описывает биопротез сердечного клапана, сосудистые трансплантаты, имплантаты мениска); 20070059335; 20060128015 (описывает имплантаты печени).[00216] As a non-limiting example, further provided herein is a bioreactor, implant, stent, artificial organ, or similar devices containing a heterogeneous mixture of fetal retinal neural cells; for example, implants similar to or the same as those described in US Pat. No. 7,388,042; 7,381,418; 7,379,765; 7,361,332; 7,351,423; 6,886,568; 5,270,192; and publications of patent applications. USA 20040127987; 20080119909 (describes ear implants); 20080118549 (describes ocular implants); 20080020015 (describes a bioactive dressing); 20070254005 (describes bioprosthetic heart valve, vascular grafts, meniscal implants); 20070059335; 20060128015 (describes liver implants).

ПРОНУМЕРОВАННЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯNUMBERED EMBODIMENTS

[00217] Изобретение может быть определено посредством ссылки на следующие пронумерованные иллюстративные варианты осуществления:[00217] The invention may be defined by reference to the following numbered illustrative embodiments:

[00218] 1. Способ выделения первичных ретинальных клеток, полученных из человеческого образца, путем:[00218] 1. A method for isolating primary retinal cells obtained from a human sample by:

a) обработки полученного образца человеческих ретинальных тканей ио человека-донора гестационным возрастом от приблизительно 12 недель до приблизительно 28 недель,a) processing a sample of human retinal tissue obtained from a human donor of gestational age from about 12 weeks to about 28 weeks,

b) механической диссоциации полученного образца,b) mechanical dissociation of the resulting sample,

c) определения жизнеспособности и количества первичных ретинальных клеток, полученных из образца, иc) determining the viability and number of primary retinal cells obtained from the sample, and

d) подтверждения морфологии полученных первичных ретинальных клетокd) confirming the morphology of the obtained primary retinal cells

с получением разделенной суспензии клеток и скоплений клеток.to obtain a separated cell suspension and cell clumps.

[00219] 2. Способ согласно варианту осуществления 1, где человеческая ткань сетчатки получена из одного или пары человеческих глазных яблок.[00219] 2. The method of Embodiment 1, wherein the human retinal tissue is obtained from one or a pair of human eyeballs.

[00220] 3. Способ согласно варианту осуществления 2, где глазное яблоко (яблоки) обладает нормальной морфологией, включающей интактные глазные яблоки, прозрачную роговицу, нормальную форму или любую комбинацию этого.[00220] 3. The method of Embodiment 2, wherein the eyeball(s) have normal morphology, including intact eyeballs, clear cornea, normal shape, or any combination thereof.

[00221] 4. Способ согласно варианту осуществления 1, где человеческую ткань сетчатки хранят в среде RPMI-1640 с L-глутамином и сразу помещают в лед после изъятия ткани у человека-донора.[00221] 4. The method of Embodiment 1, wherein the human retinal tissue is stored in RPMI-1640 with L-glutamine and immediately placed on ice after the tissue is removed from the human donor.

[00222] 5. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-4, где сохраненную человеческую ткань сетчатки доставляют и используют в течение определенного периода времени после изъятия.[00222] 5. The method according to any one of embodiments 1-4, wherein the stored human retinal tissue is delivered and used within a certain period of time after removal.

[00223] 6. Способ согласно варианту осуществления 5, где определенный период времени включает от приблизительно 7 до приблизительно 26 часов.[00223] 6. The method of Embodiment 5, wherein the specified time period comprises from about 7 to about 26 hours.

[00224] 7. Способ согласно варианту осуществления 1, где этап (a) включает:[00224] 7. The method according to embodiment 1, where step (a) includes:

a) после изъятия ткани, извлечение глазного яблока (яблок) из среды RPMI-1640 и промывку 1-5 раз охлажденным льдом фосфатно-солевым буфером (PBS) с добавкой антибиотиков,a) after tissue removal, remove the eyeball(s) from RPMI-1640 medium and wash 1-5 times with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) supplemented with antibiotics,

b) удаление зрительного нерва и мезенхимальной ткани из глазного яблока для удаления всех экстраокулярных клеток,b) removal of the optic nerve and mesenchymal tissue from the eyeball to remove all extraocular cells,

c) промывку глазного яблока охлажденным льдом PBS с добавкой антибиотиков,c) washing the eyeball with ice-cold PBS with added antibiotics,

d) прокол глазного яблока по краю роговицы с помощью иглы,d) puncturing the eyeball along the edge of the cornea with a needle,

e) круговой разрез по краю роговицы микрохирургическими ножницами,e) a circular incision along the edge of the cornea with microsurgical scissors,

f) удаление хрусталика, роговицы и ассоциированного стекловидного тела,f) removal of the lens, cornea and associated vitreous body,

g) отделение сетчатки от слоя пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) с получением отделенной сетчатки,g) separating the retina from the retinal pigment epithelium (RPE) layer to obtain a separated retina,

h) помещение отделенной сетчатки в чашку Петри, содержащую охлажденную льдом среду или PBS с добавкой антибиотика.h) placing the separated retina in a Petri dish containing ice-cold medium or PBS supplemented with antibiotic.

[00225] 8. Способ согласно варианту осуществления 1, где этап (b) включает механическое отделение сетчатки(ок), полученной на этапе (a), путем:[00225] 8. The method according to embodiment 1, wherein step (b) includes mechanically separating the retina(s) obtained in step (a) by:

a) переноса сетчатки(ок) к коническую пробирку,a) transferring the retina(s) to a conical tube,

b) механической диссоциации сетчатки(ок) с получением отделенной сетчатки,b) mechanically dissociating the retina(s) to produce a separated retina,

c) промывки чашки Петри бессывороточной средой с добавкой антибиотика и переноса среды, содержащей любые остаточные разделенные сетчатки в коническую пробирку, содержащую разделенную сетчатку(и),c) rinsing the Petri dish with serum-free medium supplemented with antibiotic and transferring the medium containing any remaining separated retinas into a conical tube containing the separated retina(s),

d) осаждения разделенной сетчатки(ок) с помощью центрифугирования, иd) sedimenting the separated retina(s) by centrifugation, and

e) удаления супернатанта.e) removing the supernatant.

[00226] 9. Способ согласно варианту осуществления 8, где механическую диссоциацию сетчатки проводят путем суспендирования стерильной пипеткой.[00226] 9. The method according to embodiment 8, wherein the mechanical dissociation of the retina is carried out by suspending with a sterile pipette.

[00227] 10. Способ согласно варианту осуществления 8, где разделенную сетчатку осаждают с помощью центрифугирования при 10-1000 g в течение периода от 0 до 30 минут при 1-50°C.[00227] 10. The method according to embodiment 8, wherein the divided retina is pelleted by centrifugation at 10-1000 g for a period of 0 to 30 minutes at 1-50°C.

[00228] 11. Способ согласно варианту осуществления 1, где этап (c) включает:[00228] 11. The method according to embodiment 1, where step (c) includes:

a) ресуспендирование осажденной ткани сетчатки из этапа (b) в охлажденной льдом бессывороточной среде с добавкой антибиотика,a) resuspending the pelleted retinal tissue from step (b) in ice-cold serum-free medium supplemented with antibiotic,

b) определение количества и жизнеспособности ретинальных клеток и скоплений ретинальных клеток, полученных в результате механической диссоциации ретинальной ткани,b) determination of the number and viability of retinal cells and clusters of retinal cells obtained as a result of mechanical dissociation of retinal tissue,

c) посев клеток в покрытые фибронектином флаконы для культур клеток, содержащие бессывороточную среду с добавкой антибиотика,c) seeding cells into fibronectin-coated cell culture flasks containing serum-free medium supplemented with antibiotics,

d) инкубирование флаконов, содержащих ретинальные клетки, при 10-50°C.d) incubating the vials containing retinal cells at 10-50°C.

[00229] 12. Способ согласно варианту осуществления 11, где количество и жизнеспособность клеток измеряют с помощью счетчика клеток NC-200.[00229] 12. The method of Embodiment 11, wherein cell number and viability are measured using an NC-200 cell counter.

[00230] 13. Способ согласно варианту осуществления 11, где подсчитанное количество клеток составляет от приблизительно 1 до приблизительно 1000000000.[00230] 13. The method of Embodiment 11, wherein the counted number of cells is from about 1 to about 1000000000.

[00231] 14. Способ согласно варианту осуществления 11, где процент жизнеспособных подсчитанных клеток составляет от приблизительно 10 до приблизительно 100.[00231] 14. The method of Embodiment 11, wherein the percentage of viable cells counted is from about 10 to about 100.

[00232] 15. Способ согласно варианту осуществления 11, где флаконы засевают от приблизительно 1 до приблизительно 1000000000 клеток.[00232] 15. The method of embodiment 11, wherein the vials are seeded with from about 1 to about 1000000000 cells.

[00233] 16. Способ согласно варианту осуществления 11, где инкубирование флаконов, содержащих ретинальные клетки, проводят при 37°C и 0-30% CO₂ и 0-50% O₂.[00233] 16. The method according to embodiment 11, wherein the incubation of the vials containing retinal cells is carried out at 37°C and 0-30% CO ₂ and 0-50% O ₂ .

[00234] 17. Способ согласно варианту осуществления 1, где этап (d) включает подтверждение, что ретинальные клетки, посеянные во флаконы для культуры клеток, состоят из скоплений ретинальных клеток, содержащих от приблизительно 1 до приблизительно 100 клеток.[00234] 17. The method of Embodiment 1, wherein step (d) includes confirming that the retinal cells seeded in the cell culture flasks consist of retinal cell aggregations containing from about 1 to about 100 cells.

[00235] 18. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-17, где антибиотиком, используемым для добавления в PBS или бессывороточную среду, является гентамицин.[00235] 18. The method of any one of embodiments 1-17, wherein the antibiotic used to add to the PBS or serum-free medium is gentamicin.

[00236] 19. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-18, где антибиотик используют в концентрации от приблизительно 0 до приблизительно 10000 мкг/мл.[00236] 19. The method of any one of embodiments 1-18, wherein the antibiotic is used at a concentration of from about 0 to about 10,000 μg/ml.

[00237] 20. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-19, где бессывороточная среда включает:[00237] 20. The method according to any one of embodiments 1-19, wherein the serum-free medium includes:

a) улучшенную DMEM/F12,a) improved DMEM/F12,

b) добавку N-2,b) additive N-2,

c) EGF (рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста),c) EGF (recombinant human epidermal growth factor),

d) bFGF (основной фактор роста фибробластов), иd) bFGF (basic fibroblast growth factor), and

e) GlutaMAX I.e) GlutaMAX I.

[00238] 21. Способ культивирования выделенных первичных человеческих ретинальных клеток с получением популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, включающий:[00238] 21. A method of culturing isolated primary human retinal cells to produce a population of non-immortalized human retinal progenitor cells, comprising:

a) культивирование суспензии выделенных первичных ретинальных клеток в бессывороточной среде в культуральных флаконах или планшетах, покрытых не содержащим ксеногенных компонентов фибронектином, орнитином, полилизином или ламинином, при стандартных уровнях кислорода в течение от приблизительно 4 до 6 пассажей,a) culturing a suspension of isolated primary retinal cells in serum-free medium in culture flasks or plates coated with xenogeneic-free fibronectin, ornithine, polylysine or laminin, at standard oxygen levels for about 4 to 6 passages,

b) последующее культивирование суспензии в бессывороточной среде при низких уровнях кислорода в течение еще приблизительно 3-6 пассажей, где клетки пассируют до 40-90% конфлюентности и обрабатывают ферментом при каждом пассаже для отделения клеток, и добавление новой культуральной среды, иb) subsequently culturing the suspension in serum-free medium at low oxygen levels for approximately 3-6 more passages, where the cells are passaged to 40-90% confluence and treated with enzyme at each passage to separate the cells, and adding new culture medium, and

c) последующую криоконсервацию клеток,c) subsequent cryopreservation of cells,

с получением в результате популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников.resulting in a population of non-immortalized human retinal progenitor cells.

[00239] 22. Способ согласно варианту осуществления 21, где, после последующего культивирования суспензии при низких уровнях кислорода клеткам позволяют расти без пассирования в течение некоторого периода времени при стандартных уровнях кислорода.[00239] 22. The method of Embodiment 21, wherein, after subsequent suspension culturing at low oxygen levels, the cells are allowed to grow without passaging for a period of time at standard oxygen levels.

[00240] 23. Способ согласно варианту осуществления 21, где период времени между пассажами составляет 3-5 дней.[00240] 23. The method according to embodiment 21, where the time period between passages is 3-5 days.

[00241] 24. Способ согласно варианту осуществления 21, где ферментативный раствор, используемый для разделения клеток, включает трипсин или эквивалент.[00241] 24. The method of Embodiment 21, wherein the enzymatic solution used for cell separation includes trypsin or equivalent.

[00242] 25. Способ согласно варианту осуществления 21, где клетки разделяют при пассаже 1 с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, и ЭДТА в соотношении 1:4, в течение 6-10 минут при 37°C.[00242] 25. The method of Embodiment 21, wherein the cells are separated at passage 1 using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent and EDTA in a ratio of 1:4 for 6-10 minutes at 37°C.

[00243] 26. Способ согласно варианту осуществления 21, где клетки разделяют при пассаже 2 с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, и DPBS в соотношении 1:1:3, в течение 4-8 минут при 37°C.[00243] 26. The method of Embodiment 21, wherein the cells are separated at passage 2 using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent and DPBS in a ratio of 1:1:3 for 4-8 minutes at 37°C.

[00244] 27. Способ согласно варианту осуществления 21, где клетки разделяют при пассаже 3 и всех последующих пассажах с использованием ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, ЭДТА и DPBS в соотношении 1:1, в течение 4-8 минут при 37°C.[00244] 27. The method of embodiment 21, wherein the cells are separated at passage 3 and all subsequent passages using an enzymatic solution comprising trypsin or equivalent, EDTA and DPBS in a 1:1 ratio for 4-8 minutes at 37°C .

[00245] 28. Способ согласно варианту осуществления 21, где диссоциацию останавливают путем добавления избытка DMEM или PBS.[00245] 28. The method of embodiment 21, wherein the dissociation is stopped by adding excess DMEM or PBS.

[00246] 29. Способ согласно варианту осуществления 21, где количество и жизнеспособность клеток определяют после диссоциации.[00246] 29. The method of Embodiment 21, wherein the cell number and viability are determined after dissociation.

[00247] 30. Способ согласно варианту осуществления 21, где количество и жизнеспособность клеток определяют с помощью счетчка клеток NC-200.[00247] 30. The method of Embodiment 21, wherein the cell number and viability are determined using an NC-200 cell counter.

[00248] 31. Способ согласно варианту осуществления 21, где криоконсервацию на этапе (c) выполняют путем:[00248] 31. The method according to embodiment 21, wherein the cryopreservation in step (c) is performed by:

a) ферментативной диссоциации клеток с использованием трипсин или эквивалента и DPBS в соотношении 1:1,a) enzymatic cell dissociation using trypsin or equivalent and DPBS in a 1:1 ratio,

b) остановки диссоциации избытком DMEM или PBS,b) stopping the dissociation with excess DMEM or PBS,

c) осаждения клеток с помощью центрифугирования при 10-10000 g в течение 1-30 минут,c) sedimentation of cells by centrifugation at 10-10000 g for 1-30 minutes,

d) ресуспендирования клеток в бессывороточной среде и определения общего количества и жизнеспособности клеток,d) resuspending the cells in serum-free medium and determining the total number and viability of the cells,

e) добавления среды для криоконсервации с получением конечной концентрации ДМСО 5-30%,e) adding cryopreservation medium to obtain a final DMSO concentration of 5-30%,

f) аликвотирования по 0,2-100×10⁶ клеток в каждый криофлакон,f) aliquoting 0.2-100×10 ⁶ cells into each cryofalk,

g) замораживания каждого флакона при -80°C в течение 6-72 часов, иg) freezing each vial at -80°C for 6-72 hours, and

h) помещения каждого флакона с клетками в жидкий N₂.h) placing each vial of cells in liquid N ₂ .

[00249] 32. Способ согласно варианту осуществления 21, где клетки и/или скопления клеток культивируют вместе с дополнительными компонентами или добавками, поддерживающими выживание или рост клеток.[00249] 32. The method of embodiment 21, wherein the cells and/or cell aggregates are cultured along with additional components or additives that support cell survival or growth.

[00250] 33. Способ согласно варианту осуществления 32, где дополнительные компоненты или добавки, поддерживающие выживание или рост клеток, выбраны из группы, состоящей из L-глутамина, человеческих рекомбинантных факторов роста, состоящих из EGF и bFGF (Invitrogen), и других факторов роста.[00250] 33. The method of embodiment 32, wherein the additional components or additives that support cell survival or growth are selected from the group consisting of L-glutamine, human recombinant growth factors consisting of EGF and bFGF (Invitrogen), and other factors growth.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1: Выделение первичных ретинальных клеток: Протокол AExample 1: Isolation of Primary Retinal Cells: Protocol A

[00251] Выделение первичных человеческих клеток сетчатки производили в соответствии с протоколом, специально оптимизированным для интервала транспортировки от 4,5 до 21,5 часов, где интервал транспортировки измеряется со времени изъятия ткани до времени получения донорской ткани.[00251] Isolation of primary human retinal cells was performed according to a protocol specifically optimized for a transport interval of 4.5 to 21.5 hours, where the transport interval is measured from the time of tissue removal to the time of receipt of donor tissue.

1. 1 или пару глазных яблок плода гестационного срока 17–18 недель, в 15 мл пробирке со средой RPMI-1640 и L-глутамином (BioWhittaker), транспортируют во льду и доставляют в течение 4,5–21,5 часов. При получении глазное яблоко(и) осматривают на предмет серьезных аномалий: глазное яблоко интактное, роговица чистая, глазное яблоко имеет нормальную форму. Этапы 2-8 выполняют в ламинарном шкафу с использованием стерильного метода.1. 1 or a pair of fetal eyeballs, 17–18 weeks gestation, in a 15 mL tube containing RPMI-1640 and L-glutamine (BioWhittaker), transported on ice and delivered within 4.5–21.5 hours. Upon receipt, the eyeball(s) are examined for major abnormalities: the eyeball is intact, the cornea is clear, and the eyeball is normal in shape. Steps 2-8 are performed in a laminar flow hood using a sterile technique.

2. Целые глазные яблоки промывают 40 мл холодного PBS, содержащего антибиотики (в пробирке 50 мл), 3 раза (в 3 разных пробирках).2. Whole eyeballs are washed with 40 ml of cold PBS containing antibiotics (in a 50 ml tube) 3 times (in 3 different tubes).

3. Зрительный нерв и оставшуюся мезенхимальную ткань удаляют. Этот подход применяют, чтобы избежать возможной контаминации ретинальных образцов клетками, происходящими из мозга. Еще раз промывают холодным PBS, содержащим антибиотики.3. The optic nerve and remaining mesenchymal tissue are removed. This approach is used to avoid possible contamination of retinal samples with brain-derived cells. Wash again with cold PBS containing antibiotics.

4. Под стереомикроскопом делают прокол лимба роговицы с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 255/8, глазное яблоко открывают по окружности, делая разрез по лимбу с помощью микрохирургических ножниц, роговицу, хрусталик и ассоциированное с ним стекловидное тело удаляют. Сетчатку осторожно отделяют от ПЭС, собирают в малую чашку Петри, содержащую ~2 мл холодной DMEM/F12.4. Under a stereomicroscope, a puncture of the corneal limbus is made using a 1 ml syringe with a 255/8 needle, the eyeball is opened around the circumference, making an incision along the limbus using microsurgical scissors, the cornea, lens and associated vitreous body are removed. The retina is carefully separated from the RPE and collected in a small Petri dish containing ~2 ml of cold DMEM/F12.

5. Сетчатку вручную дробят на мелкие фрагменты с помощью наконечника на 1 мл в чашке Петри (2-5 раз), переносят в холодную пробирку с коническим дном объемом 15 мл, чашку Петри 2-3 раза промывают 1 мл холодного PBS, добавляет в 15 мл пробирку, центрифугируют, 1000 об/мин (179×g) 5 минут, полностью удаляют супернатант пипеткой на 10 мл и полированной стеклянной пипеткой.5. The retina is manually crushed into small fragments using a 1 ml tip in a Petri dish (2-5 times), transferred to a cold 15 ml conical bottom tube, the Petri dish is washed 2-3 times with 1 ml of cold PBS, added to 15 ml tube, centrifuge, 1000 rpm (179×g) for 5 minutes, completely remove the supernatant with a 10 ml pipette and a polished glass pipette.

6. Добавляют 0,8 мл неразведенного TrypLE Express (Invitrogen) на 40 сек при комнатной температуре, мягко и медленно пипетируют 1 мл наконечником (приблизительно 10 раз), добавляют 10 мл холодной свежей среды (без сыворотки) к нейтрализованному TrypLE Express, центрифугируют, 1000 об/мин (179×g) ×4 мин, супернатант удаляют, ресуспендируют осадок в 1,5 мл холодной свежей среды (SM), пипетируют с использованием полированной стеклянной пипетки приблизительно 10 раз, добавляют еще 6,5 мл среды, определяют жизнеспособность клеток и число клеток при окрашивании трипановым синим (Invitrogen), подсчитывают с помощью Countess (Invitrogen) или вручную, приблизительно 1,3×10⁶ клеток/мл, приблизительно 92% живых клеток, приблизительно 10×10⁶ скоплений клеток/всего, приблизительно 80% малых/средних скоплений. Клетки сеют в 2 T75, покрытые фибронектином (см. пример 5), с последующим инкубированием при 37°C и 5% CO₂, 3% или 20% O₂ (необязательно инкубированием при 37°C, 5-10% CO₂ 1%-20% O₂).6. Add 0.8 ml of undiluted TrypLE Express (Invitrogen) for 40 sec at room temperature, gently and slowly pipet with a 1 ml tip (approximately 10 times), add 10 ml of cold fresh medium (without serum) to the neutralized TrypLE Express, centrifuge, 1000 rpm (179 × g) × 4 min, remove supernatant, resuspend pellet in 1.5 ml cold fresh medium (SM), pipet using a polished glass pipette approximately 10 times, add another 6.5 ml medium, determine viability cells and cell numbers by trypan blue staining (Invitrogen), counted using Countess (Invitrogen) or manually, approximately 1.3 x 10 ⁶ cells/ml, approximately 92% live cells, approximately 10 x 10 ⁶ cell clusters/total, approximately 80% small/medium clusters. Cells are seeded in 2 T75 coated with fibronectin (see example 5), followed by incubation at 37°C and 5% CO ₂ , 3% or 20% O ₂ (optional incubation at 37°C, 5-10% CO ₂ 1 %-20% O ₂ ).

Примечание: подсчет определенных клеток.Note: counting specific cells.

• Одиночные клетки: ~6-8 мкм, содержащие 1 клетку.• Single cells: ~6-8 µm containing 1 cell.

• Мелкое скопление: ~15-40 мкм, содержащие ~2-30 клетки.• Small aggregate: ~15-40 µm, containing ~2-30 cells.

• Среднее скопление: ~40-100 мкм, содержащее ~30-80 клеток.• Average cluster: ~40-100 µm, containing ~30-80 cells.

• Крупное скопление: ~100-150 мкм, содержащее >80 клеток.• Large clump: ~100-150 µm containing >80 cells.

В полученной популяции клеток: ~80-90% являются мелкими или средними скоплениями клеток, ~9-18% одиночными клетками, ~1-2% крупными скоплениями.In the resulting population of cells: ~80-90% are small or medium-sized clusters of cells, ~9-18% are single cells, ~1-2% are large clusters.

Если мелкие/средние скопления подсчитывают как "одно", общее число клеток составляет ~ 10×10⁶.If small/medium clusters are counted as “one”, the total number of cells is ~10×10 ⁶ .

Если одиночные клетки подсчитывают как "одну", общее число клеток составляет ~240×10⁶.If single cells are counted as "one", the total number of cells is ~240×10 ⁶ .

7. Вся процедура: 45 мин~1 ч 10 минут (необязательно в течение 2 часов).7. Whole procedure: 45 min~1 hour 10 minutes (optional within 2 hours).

8. Через ~1,5 часа 90% клеток оседают на дно (если ткань свежая, например, после транспортировки 4,5 часа во льду, если нет, например, после транспортировки 21,5 часа во льду, клетки оседают на дно через ~6 часов), 90% являются мелкими фрагментами ткани, 10% являются одиночными клетками. В целом 90% клеток живые (хорошие), плотность клетки будет составлять >10% конфлюентности (лучше ~20%), при оценке с помощью IncuCyte. Делают снимок.8. After ~1.5 hours, 90% of the cells settle to the bottom (if the tissue is fresh, for example, after transportation for 4.5 hours in ice, if not, for example, after transportation for 21.5 hours in ice, the cells settle to the bottom after ~ 6 hours), 90% are small tissue fragments, 10% are single cells. Overall 90% of cells are alive (good), cell density will be >10% confluency (preferably ~20%) when assessed using IncuCyte. They take a photo.

Пример 2: Выделение первичных ретинальных клеток: Протокол BExample 2: Isolation of Primary Retinal Cells: Protocol B

[00252] Выделение первичных человеческих клеток сетчатки проводили по протоколу, специально оптимизированному для интервала транспортировки 7-26 часов, где интервал транспортировки измеряют со времени изъятия ткани до времени получения донорской ткани.[00252] Isolation of primary human retinal cells was performed using a protocol specifically optimized for a transport interval of 7-26 hours, where the transport interval is measured from the time of tissue removal to the time of receipt of donor tissue.

1. 1 или пару донорских глазных яблок плода гестационного срока 17-20 недель, в пробирке объемом 15 мл, содержащей среду RPMI-1640 с L-глутамином (BioWhittaker), транспортируют во льду и доставляют в окне транспортировки 7-26 часов. Протокол может также работать при более широком транспортном окне. После получения глазное яблоко(и) осматривают на предмет серьезных аномалий: интактное глазное яблоко, прозрачная роговица, глазное яблоко должно иметь нормальную форму. В RPMI-1640 и среду для транспортировки с L-глутамином добавляют 50 мкг/мл гентамицина, чтобы предотвратить потенциальную контаминацию ткани.1. 1 or a pair of donor eyeballs from a 17-20 weeks gestation fetus, in a 15 ml tube containing RPMI-1640 medium with L-glutamine (BioWhittaker), is transported on ice and delivered within a 7-26 hour transport window. The protocol can also operate over a wider transport window. Upon receipt, the eyeball(s) are examined for major abnormalities: intact eyeball, clear cornea, eyeball should be normal in shape. 50 μg/ml gentamicin was added to RPMI-1640 and L-glutamine transport medium to prevent potential tissue contamination.

Этапы 2-8 выполняют в ламинарном боксе с биозащитой при использовании стерильного метода.Stages 2-8 are performed in a laminar flow hood with biosafety using a sterile method.

2. Интактные глазные яблоки промывают 40 мл холодного PBS, содержащего антибиотики (в пробирке объемом 50 мл), 3 раза (в 3 разных пробирках). Гентамицин используют в концентрации 30 мкг/мл. Гентамицин используют вместо пенициллина или стрептомицина, чтобы избежать исключения пациентов с аллергиями на антибиотики.2. Intact eyeballs are washed with 40 ml of cold PBS containing antibiotics (in a 50 ml tube) 3 times (in 3 different tubes). Gentamicin is used at a concentration of 30 μg/ml. Gentamicin is used instead of penicillin or streptomycin to avoid excluding patients with allergies to antibiotics.

3. Зрительный нерв и оставшуюся мезенхимальную ткань удаляют из глаза (глаз), чтобы избежать возможной контаминации ретинальных образцов экстраокулярными клетками. Еще раз промывают холодным PBS, содержащим антибиотики.3. The optic nerve and remaining mesenchymal tissue are removed from the eye(s) to avoid possible contamination of the retinal specimens with extraocular cells. Wash again with cold PBS containing antibiotics.

4. Под стереомикроскопом делают прокол глазного яблока по лимбу роговицы с помощью шприца на 1 мл с иглой 255/8, глазное яблоко открывают по окружности, делая разрез по лимбу с помощью микрохирургических ножниц, роговицу, хрусталик и ассоциированное с ним стекловидное тело удаляют. Сетчатку можно осторожно отделить от подлежащего слоя ПЭС, перенести в малую чашку Петри, содержащую приблизительно 2 мл холодной полной среды с гентамицином (30 мкг/мл гентамицина).4. Under a stereomicroscope, a puncture of the eyeball is made along the limbus of the cornea using a 1 ml syringe with a 255/8 needle, the eyeball is opened around the circumference, making an incision along the limbus using microsurgical scissors, the cornea, lens and associated vitreous body are removed. The retina can be carefully separated from the underlying RPE layer and transferred to a small Petri dish containing approximately 2 ml of cold complete gentamicin medium (30 µg/ml gentamicin).

5. Сетчатку переносят в коническую пробирку объемом 15 мл. Сетчатку дробят на мелкие фрагменты при использовании мягкого суспендирования наконечником пипетки на 1 мл (4-8 раз). Если остаточная ткань сетчатки присутствует в чашке Петри, чашку промывают 1-2 раза 1 мл холодной полной среды с гентамицином и добавляют в 15 мл пробирку, содержащую ткань сетчатки. Пробирку на 15 мл переносят в центрифугу, центрифугируют при 140×g в течение 3 минут при 4°C, аспирируют и полностью удаляют супернатант.5. The retina is transferred to a 15 ml conical tube. The retina is crushed into small fragments using gentle suspension with a 1 ml pipette tip (4-8 times). If residual retinal tissue is present in the Petri dish, the dish is washed 1-2 times with 1 ml of cold complete medium with gentamicin and added to a 15 ml tube containing the retinal tissue. The 15 ml tube is transferred to a centrifuge, centrifuged at 140×g for 3 minutes at 4°C, aspirated and the supernatant is completely removed.

6. Осадок ресуспендируют в 1,0 мл холодной свежей среды с гентамицином с помощью наконечника на 1 мл пипеткой, осторожно пипетируя суспензию 4-5 раз, добавляют еще 15 мл среды. Жизнеспособность клетки и количество клеток определяют с помощью NC-200 при использовании метода подсчета агрегированных клеток. Этот метод позволяет получать точное число клеток при сохранении скоплений клеток, которые могут быть важны для первичной культуры клеток, и превращении ткани в клетки. Жизнеспособность клеток, по предварительным расчетам, будет попадать в диапазон 68-85%, количество живых клеток должно составить примерно 73-147×10⁶. Клетки сеют в 3× флакона T25 (или 1-2 T75), предварительно покрытые фибронектином (см. Пример 5), с последующим инкубированием при 37°C и 5% CO₂, 20% O₂. (Примечание: 20% для стадии 1: ткань в фонд культур, что может быть также выполнено в условиях низкого содержания кислорода. Впрочем, цель в данном случае состояла в сохранении нового продукта в максимально близком состоянии к предыдущим продуктам, которые выращивали при уровне кислорода меньше 20%. Этап 2: фонд культур в производственный фонд, выполняли при использовании культивирования при низком уровне кислорода 3%, чтобы продлить пролиферацию клеток.)6. Resuspend the sediment in 1.0 ml of cold fresh gentamicin medium using a 1 ml pipette tip, carefully pipetting the suspension 4-5 times, add another 15 ml of medium. Cell viability and cell number are determined using NC-200 using the aggregated cell counting method. This method allows accurate cell numbers to be obtained while preserving cell aggregates that may be important for primary cell culture and converting tissue into cells. Cell viability, according to preliminary calculations, will fall in the range of 68-85%, the number of living cells should be approximately 73-147 × 10 ⁶ . Cells are seeded into 3× T25 flasks (or 1-2 T75), pre-coated with fibronectin (see Example 5), followed by incubation at 37°C and 5% CO ₂ , 20% O ₂ . (Note: 20% for stage 1: tissue to culture stock, which can also be done in low oxygen conditions. However, the goal in this case was to keep the new product as close as possible to previous products that were grown in lower oxygen levels 20%. Step 2: stock culture into production stock, performed using low oxygen culture of 3% to prolong cell proliferation.)

7. Клетки исследуют под микроскопом: культуры, как ожидают, преимущественно будут состоять из мелких и средних скоплений плюс некоторые одиночные клетки (последние с высокой вероятностью не будут нежизнеспособными).7. The cells are examined under a microscope: the cultures are expected to consist predominantly of small to medium clumps plus some single cells (the latter are likely to be nonviable).

8. Продолжительность всей процедуры выделения: приблизительно 30-60 минут (этот протокол, в котором специально не используют ферменты, значительно быстрее и проще, чем протокол выделения, основанный на применении ферментов).8. Duration of the entire isolation procedure: approximately 30-60 minutes (this protocol, which does not specifically use enzymes, is much faster and simpler than the enzyme-based isolation protocol).

Пример 3: Культура клеток: Протокол AExample 3: Cell Culture: Protocol A

[00253] Человеческие ретинальные клетки-предшественники культивировали из клеток сетчатки, выделенных согласно способу, описанному в Примере 1:[00253] Human retinal progenitor cells were cultured from retinal cells isolated according to the method described in Example 1:

1. Замена среды: 90% замена среды каждые 2 дня.1. Media replacement: 90% media replacement every 2 days.

2. Пассаж: клетки пассируют при 60-80%, необязательно 40-90%, конфлюентности, с добавлением TrypLE Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, разводят в 2 раза (эквивалент 0,125%), 5-6 минут, инкубирование при 37°C. Диссоциацию останавливают путем добавления 10 мл старой среды или холодного PBS. Жизнеспособность клеток и число клеток определяют при окрашивании трипановым синим (Invitrogen), подсчитывают с помощью Countess (Invitrogen) или вручную, жизнеспособность клеток >90%. Клетки сеют в новый, покрытый фибронектином флакон/планшет при плотности 1-6,7×10⁴/см² (ранний пассаж 6,7×10⁴ скоплений/см²), поздний пассаж: 2×10⁴/см²).2. Passage: cells are passaged at 60-80%, optionally 40-90%, confluence, with the addition of TrypLE Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, diluted 2-fold (equivalent to 0.125%) , 5-6 minutes, incubation at 37°C. Dissociation is stopped by adding 10 ml of old medium or cold PBS. Cell viability and cell number were determined by trypan blue staining (Invitrogen), counted using Countess (Invitrogen) or manually, cell viability >90%. Cells are seeded into a new fibronectin-coated vial/plate at a density of 1-6.7×10 ⁴ /cm ² (early passage 6.7×10 ⁴ clusters/cm ² ), late passage: 2×10 ⁴ /cm ² ).

3. Замораживание клеток: клетки собирают с использованием TrypLE Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, разводят в 2 раза (эквивалент 0,125%), 5-6 минут, инкубирование при 37°C. Диссоциацию останавливают путем добавления 10 мл старой среды или холодного PBS, центрифугируют, 1000 об/мин (179×g) в течение 5 минут, ресуспендируют клетки в новой среде или холодном PBS. Жизнеспособность клеток и число клеток определяют при окрашивании трипановым синим (Invitrogen), подсчитывают с помощью Countess (Invitrogen) или вручную. Центрифугируют, 1000 об/мин (179×g) в течение 5 минут, ресуспендируют клетки в среде для замораживания клеток, фасуют аликвотами по 0,5-5×10⁶ клеток в каждый криофлакон (Greiner). Помещают в Cryo 1°C контейнер для замораживания (NALGENE), помещают в замораживатель на -80°C в течение ночи (или дольше, <2 недель), переносят в резервуар с жидким азотом.3. Freezing Cells: Cells are harvested using TrypLE Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, diluted 2-fold (0.125% equivalent), 5-6 minutes, incubate at 37°C. Dissociation is stopped by adding 10 ml of old medium or cold PBS, centrifuge at 1000 rpm (179 x g) for 5 minutes, and resuspend the cells in new medium or cold PBS. Cell viability and cell number were determined by trypan blue staining (Invitrogen), counted using Countess (Invitrogen), or manually. Centrifuge at 1000 rpm (179×g) for 5 minutes, resuspend the cells in a medium for freezing cells, and pack aliquots of 0.5-5×10 ⁶ cells into each cryofalk (Greiner). Place in Cryo 1°C freezer container (NALGENE), place in freezer at -80°C overnight (or longer, <2 weeks), transfer to liquid nitrogen tank.

4. Размораживание клеток: клетки извлекают из жидкого азота, оставляют в водяной бане при 37°C на 2-3 минуты, пока не исчезнут кристаллы, быстро переносят наконечником на 1 мл в одну холодную пробирку с коническим дном объемом 15 мл, промывают флакон холодной свежей средой 2 раз, медленно добавляют 12 мл холодной свежей среды в пробирку на 15 мл, первый 1 мл - по каплям, мягко встряхивают. Центрифугируют при 800 об/мин (115 g) в течение 3 минут. Удаляют супернатант, ресуспендируют осадок клеток в свежей среде, определяют число и жизнеспособность клеток, как описано выше. Сеют в новый флакон с покрытием и инкубируют при условиях, описанных выше.4. Thawing cells: cells are removed from liquid nitrogen, left in a water bath at 37°C for 2-3 minutes until the crystals disappear, quickly transfer with a 1 ml tip into one cold 15 ml conical bottom tube, rinse the vial with cold fresh medium 2 times, slowly add 12 ml of cold fresh medium into a 15 ml test tube, the first 1 ml drop by drop, shake gently. Centrifuge at 800 rpm (115 g) for 3 minutes. The supernatant is removed, the cell pellet is resuspended in fresh medium, and the number and viability of cells are determined as described above. Sow into a new coated vial and incubate under the conditions described above.

5. Подготовка клеток к трансплантации: клетки собирают с использованием TrypLE Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, разводят в 2 раза (эквивалент 0,125%), 5-6 минут, инкубируют 37°C. Диссоциацию останавливают путем добавления 10 мл старой среды или холодного PBS. Центрифугируют, 1000 об/мин (179×g) в течение 5 минут, ресуспендируют клетки в 10 мл холодной HBSS, жизнеспособность клеток и число клеток определяют при окрашивании трипановым синим (Invitrogen), подсчитывают с помощью Countess (Invitrogen) или вручную. Центрифугируют, 1000 об/мин (179×g) в течение 5 минут, ресуспендируют клетки в холодном HBSS, с получением суспензии клеток для трансплантации, 0,5×10⁶ клеток в 100 мкл HBSS для пациента, 30000 клеток в 2 мкл HBSS для крысы.5. Prepare cells for transplantation: Cells are harvested using TrypLE Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, diluted 2-fold (0.125% equivalent), 5-6 minutes, incubate at 37°C. Dissociation is stopped by adding 10 ml of old medium or cold PBS. Centrifuge at 1000 rpm (179 x g) for 5 minutes, resuspend the cells in 10 ml of cold HBSS, cell viability and cell number are determined by trypan blue staining (Invitrogen), counted using Countess (Invitrogen) or manually. Centrifuge, 1000 rpm (179×g) for 5 minutes, resuspend the cells in cold HBSS to obtain a cell suspension for transplantation, 0.5×10 ⁶ cells in 100 μl of HBSS for the patient, 30,000 cells in 2 μl of HBSS for the patient rats.

Пример 4: Культура клеток: Протокол BExample 4: Cell Culture: Protocol B

[00254] Человеческие ретинальные клетки-предшественники культивировали из клеток сетчатки, выделенных согласно способу, описанному в Примере 2:[00254] Human retinal progenitor cells were cultured from retinal cells isolated according to the method described in Example 2:

1. Замена среды: замена 100% среды, каждые 2 дня, кроме дня 0-дня 3. Открытые системы, закрытые системы и полузакрытые системы можно использовать при замене среды и пассировании клеток. Среду необязательно можно менять ежедневно.1. Media replacement: 100% media replacement, every 2 days except day 0-day 3. Open systems, closed systems and semi-closed systems can be used when changing media and passaging cells. The medium does not necessarily need to be changed daily.

2. Пассирование: клетки пассируют каждые 4-5 дней при конфлюентности 15-95%, необязательно при конфлюентности 40-95%. Способ отличается числом пассажей. Клетки также могут пассировать каждые 3-4 дня или каждые 3-5 дней.2. Passaging: cells are passaged every 4-5 days at a confluency of 15-95%, optionally at a confluency of 40-95%. The method differs in the number of passages. Cells can also be passaged every 3-4 days or every 3-5 days.

Пассаж 1: TrypLE Select (Invitrogen) + ЭДТА (Invitrogen) в соотношении 1:4, инкубирование в течение 7-8 минут при 37°C.Passage 1: TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) in a ratio of 1:4, incubate for 7-8 minutes at 37°C.

Пассаж 2: TrypLE Select (Invitrogen) + ЭДТА (Invitrogen) + DPBS (Invitrogen) в соотношении 1:1:3, инкубирование в течение 5-6 минут при 37°C. TPassage 2: TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) + DPBS (Invitrogen) in a ratio of 1:1:3, incubate for 5-6 minutes at 37°C. T

Пассаж 3 и последующие: TrypLE Select (Invitrogen) + DPBS в соотношении 1:1, инкубирование в течение 5-7 минут при 37°C.Passage 3 and subsequent: TrypLE Select (Invitrogen) + DPBS in a 1:1 ratio, incubate for 5-7 minutes at 37°C.

Необязательно могут использовать TrypLE Express, трипсин или эквивалент, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалент в 2-кратном разведении (эквивалент 0,125%). Диссоциацию скоплений останавливают путем добавления DMEM или PBS (10 мл). Жизнеспособность клеток и число клеток определяют с помощью NC-200. Ожидаемая жизнеспособность клетки >70%. Клетки сеют в новый флакон/планшет, покрытый фибронектином, при плотности 3-67×10⁴/см² (ранний пассаж 67x104/cm2, поздний пассаж: 3×10⁴/см²).Optionally, TrypLE Express, trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent at 2-fold dilution (0.125% equivalent) may be used. The dissociation of clusters is stopped by adding DMEM or PBS (10 ml). Cell viability and cell number were determined using NC-200. Expected cell viability >70%. Cells are seeded into a new vial/plate coated with fibronectin at a density of ^3-67x104 / ^cm2 (early passage 67x104/cm2, late passage: ^3x104 /cm2 ⁾ .

3. Криоконсервация: клетки собирают с использованием TrypLE Select/Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, в 2-кратном разведении (эквивалент 0,125%), в течение 5-7 минут, инкубирование при 37°C. Диссоциацию останавливают путем добавления DMEM или PBS. Затем выполняют центрифугирование. Для пробирки объемом 50 мл: 490×g в течение 7 минут, для флакона с коническим дном объемом 500 мл, 700×g в течение 8 минут, клетки ресуспендируют в свежей среде. Жизнеспособность клеток и число клеток определяют с помощью NC200. Добавляют такое же количество 2× среды для криоконсервации (20% ДМСО) с получением конечной концентрации ДМСО 10% в суспензии клеток. Фасуют аликвотами по 0,5-10×10⁶ клеток в каждый криофлакон (Themofisher или подобный). Помещают в Cryo 1°C контейнер для замораживания (NALGENE), помещают в замораживатель на -80°C в течение ночи (или дольше, <2 недель), переносят в резервуар с жидким азотом.3. Cryopreservation: Cells are harvested using TrypLE Select/Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, 2-fold dilution (0.125% equivalent), for 5-7 minutes, incubate at 37 °C. Dissociation is stopped by adding DMEM or PBS. Then centrifugation is performed. For a 50 ml tube: 490×g for 7 minutes, for a 500 ml cone bottle, 700×g for 8 minutes, cells are resuspended in fresh medium. Cell viability and cell number were determined using NC200. The same amount of 2× cryopreservation medium (20% DMSO) is added to produce a final DMSO concentration of 10% in the cell suspension. Packed in aliquots of 0.5-10×10 ⁶ cells into each cryofilk (Themofisher or similar). Place in Cryo 1°C freezer container (NALGENE), place in freezer at -80°C overnight (or longer, <2 weeks), transfer to liquid nitrogen tank.

4. Размораживание клеток: клетки извлекают из жидкого азота, оставляют в водяной бане при 37°C на 2-3 минуты, пока не исчезнут кристаллы, затем быстро переносят в одну холодную пробирку с коническим дном объемом 15 мл с помощью наконечника на 1 мл, промывают флакон холодной свежей средой 1-2 раза, медленно добавляют 9-12 мл холодной свежей среды в пробирку объемом 15 мл, центрифугируют при 1200 об/мин (300 g) в течение 5 минут. Удаляют супернатант, ресуспендируют осадок клеток в свежей среде, определяют число и жизнеспособность клеток, как описано выше. Сеют в новый флакон с покрытием и инкубируют при условиях, описанных выше.4. Thaw cells: cells are removed from liquid nitrogen, left in a water bath at 37°C for 2-3 minutes until the crystals disappear, then quickly transferred to one cold 15 ml conical bottom tube using a 1 ml tip, wash the bottle with cold fresh medium 1-2 times, slowly add 9-12 ml of cold fresh medium into a 15 ml test tube, centrifuge at 1200 rpm (300 g) for 5 minutes. The supernatant is removed, the cell pellet is resuspended in fresh medium, and the number and viability of cells are determined as described above. Sow into a new coated vial and incubate under the conditions described above.

5. Подготовка клеток к трансплантации: клетки собирают с использованием TrypLE Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, 2-кратное разведение (эквивалент 0,125%), 5-6 минут, инкубирование при 37°C. Диссоциацию останавливают путем добавления DMEM. Суспензию клеток центрифугируют, 300 g ×5 мин, затем клетки ресуспендируют в 0,5-3 мл холодной BSS Plus (или BSS/DPBS/HBSS). Жизнеспособность клеток и число клеток определяют с помощью трипанового синего (Invitrogen), подсчитывают с помощью Countess (Invitrogen) или вручную, или NC200. Центрифугируют, 300 g в течение 5 минут, ресуспендируют клетки в холодной BSS Plus (или BSS/DPBS/HBSS) с получением подходящей дозировки для трансплантации.5. Prepare Cells for Transplantation: Cells are harvested using TrypLE Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, 2-fold dilution (0.125% equivalent), 5-6 minutes, incubate at 37°C . Dissociation is stopped by adding DMEM. The cell suspension is centrifuged at 300 g x 5 min, then the cells are resuspended in 0.5-3 ml of cold BSS Plus (or BSS/DPBS/HBSS). Cell viability and cell number were determined using Trypan Blue (Invitrogen), counted using Countess (Invitrogen) or manually or NC200. Centrifuge, 300 g for 5 minutes, resuspend the cells in cold BSS Plus (or BSS/DPBS/HBSS) to obtain a suitable dosage for transplantation.

Пример 5: Приготовление реагентов и клеточного продуктаExample 5: Preparation of Reagents and Cell Product

Приготовление полной среды (бессывороточной)Preparation of complete medium (serum-free)

[00255] Среду для культуры человеческих ретинальных клеток-предшественников приготавливали с использованием следующих компонентов:[00255] Human retinal progenitor cell culture media was prepared using the following components:

• Улучшенная DMEM/F12 (Invitrogen),• Improved DMEM/F12 (Invitrogen),

o Необязательно DMEM/F12 (Invitrogen или другой бренд), или KnockOut DMEM/F12 (Invitrogen или другой бренд), или нейробазальная среда (Invitrogen), или UltraCULTURE (Lonza), или ReNcell (Chemicon), или другая эквивалентная среда.o Optional DMEM/F12 (Invitrogen or other brand), or KnockOut DMEM/F12 (Invitrogen or other brand), or Neurobasal Medium (Invitrogen), or UltraCULTURE (Lonza), or ReNcell (Chemicon), or other equivalent media.

• Добавка N-2 (Invitrogen),• Supplement N-2 (Invitrogen),

o Необязательно B27 (Invitrogen или другой бренд) xeno-free или B27, не xeno-free, или Stempro (Invitrogen) или другой эквивалент.o Optional B27 (Invitrogen or other brand) xeno-free or B27, non-xeno-free, or Stempro (Invitrogen) or other equivalent.

• EGF (рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста): Invitrogen, необязательно другой бренд• EGF (recombinant human epidermal growth factor): Invitrogen, optional other brand

• bFGF (основной фактор роста фибробластов): Invitrogen, необязательно другой бренд• bFGF (basic fibroblast growth factor): Invitrogen, optional other brand

• GlutaMAX I: Invitrogen, необязательно L-глутамин (Invitrogen или другой бренд)• GlutaMAX I: Invitrogen, optional L-glutamine (Invitrogen or other brand)

• Гентамицин (Invitrogen) для выделения и первого пассажа (~4-5 дней)• Gentamicin (Invitrogen) for isolation and first passage (~4-5 days)

[00256] Фермент для пассирования:[00256] Passaging enzyme:

• Раствор Версена: Thermo Fisher (Life tech), используют, как описано выше, при пассаже 1 и 2. Раствор Версена представляет собой раствор ЭДТА для использования в качестве мягкого неферментативного реагента для диссоциации клеток. Раствор Версена Gibco^® (0,48 мм) содержит 0,2 г ЭДТА (Na₄) на литр фосфатно-солевого буфера (PBS).• Versene Solution: Thermo Fisher (Life tech), use as described above for passages 1 and 2. Versene Solution is an EDTA solution for use as a mild, non-enzymatic cell dissociation reagent. Gibco ^® Versene solution (0.48 mm) contains 0.2 g EDTA (Na ₄ ) per liter of phosphate-buffered saline (PBS).

Приготовление среды для криоконсервацииPreparation of medium for cryopreservation

[00257] Приготавливали среду для криоконсервации культивированных человеческих ретинальных клеток-предшественников, содержащую:[00257] A medium for cryopreservation of cultured human retinal progenitor cells was prepared containing:

• 90% полной среды• 90% full environment

• 10% ДМСО• 10% DMSO

Покрытие флаконовBottle coating

Фибронектин человеческой плазмы (Invitrogen), необязательно орнитин, полилизин, ламинин или Матригель, разбавляют в DPBS, в концентрации: 1-5 мкг/см², оставляют на 1-3 часа для нанесения покрытия в вытяжном шкафу при комнатной температуре, хранят при 4C в течение ночи или до 2 недель. Промывают улучшенной DMEM/F12 перед применением.Human plasma fibronectin (Invitrogen), optionally ornithine, polylysine, laminin or Matrigel, diluted in DPBS, concentration: 1-5 µg/ ^cm2 , leave for 1-3 hours to coat in a fume hood at room temperature, store at 4C overnight or up to 2 weeks. Wash with enhanced DMEM/F12 before use.

Пример 6: Дополнительная версия протокола B культивирования клетокExample 6: Additional Version of Cell Culture Protocol B

[00258] Человеческие ретинальные клетки-предшественники культивировали из ретинальных клеток, выделенных согласно способу, описанному в Примере 2:[00258] Human retinal progenitor cells were cultured from retinal cells isolated according to the method described in Example 2:

1. Замена среды: меняют 100% среды, замену производят каждые 2 дня. Открытые системы, закрытые системы и полузакрытые можно использовать при замене среды и пассировании клеток. Среду необязательно можно менять ежедневно.1. Replacement of the medium : change 100% of the medium, replacement is made every 2 days. Open systems, closed systems, and semi-closed systems can be used when exchanging media and passaging cells. The medium does not necessarily need to be changed daily.

2. Пассирование: клетки пассируют каждые 4-5 дней при конфлюентности 15-95%, необязательно при конфлюентности 40-95%. Способ отличается числом пассажей. Клетки также могут пассировать каждые 3-4 дня или каждые 3-5 дней.2. Passaging : cells are passaged every 4-5 days at a confluency of 15-95%, optionally at a confluency of 40-95%. The method differs in the number of passages. Cells can also be passaged every 3-4 days or every 3-5 days.

Пассаж 1: TrypLE Select (Invitrogen) + ЭДТА (Invitrogen) в соотношении 1:4, инкубирование в течение 7-8 минут при 37°C. Passage 1 : TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) in a ratio of 1:4, incubate for 7-8 minutes at 37°C.

Пассаж 2: TrypLE Select (Invitrogen) + ЭДТА (Invitrogen) + DPBS (Invitrogen) в соотношении 1:1:3, инкубирование в течение 5-6 минут при 37°C. T Passage 2 : TrypLE Select (Invitrogen) + EDTA (Invitrogen) + DPBS (Invitrogen) in a ratio of 1:1:3, incubate for 5-6 minutes at 37°C. T

Пассаж 3 и последующие: TrypLE Select (Invitrogen) + DPBS в соотношении 1:1, инкубирование в течение 5-7 минут при 37°C.Passage 3 and subsequent: TrypLE Select (Invitrogen) + DPBS in a 1:1 ratio, incubate for 5-7 minutes at 37°C.

Необязательно могут использовать trypLE Express, трипсин или эквивалент, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалент, 2-кратное разведение (эквивалент 0,125%). Диссоциацию скоплений останавливают путем добавления DMEM или PBS (10 мл).Optionally, trypLE Express, trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, 2-fold dilution (0.125% equivalent) may be used. The dissociation of clusters is stopped by adding DMEM or PBS (10 ml).

3. Диссоциация: диссоциация скоплений клеток останавливают путем добавления улучшенной DMEM или PBS (10 мл). Жизнеспособность клеток и число клеток определяют с помощью NC-200. Ожидаемая жизнеспособность клетки >70%. Клетки сеют в новые покрытые фибронектином флаконы или многоуровневые флаконы (CS) при плотности 1-200×10⁴/см² (ранний пассаж 2×10⁶/см², поздний пассаж: 1×10⁴/см²).3. Dissociation : Dissociation of cell clusters is stopped by adding enhanced DMEM or PBS (10 ml). Cell viability and cell number were determined using NC-200. Expected cell viability >70%. Cells are seeded into new fibronectin-coated flasks or tiered flasks (CS) at a density of 1-200×10 ⁴ /cm ² (early passage 2×10 ⁶ /cm ² , late passage: 1×10 ⁴ /cm ² ).

4. Криоконсервация: клетки собирают с использованием TrypLE Select/Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, в 2-кратном разведении (эквивалент 0,125%), в течение 5-7 минут, инкубирование при 37°C. Диссоциаци останавливают путем добавления DMEM или PBS, и затем клетки центрифугируют. Для пробирки объемом 50 мл: клетки центрифугируют при 490×g в течение 7 минут. Для флакона с коническим дном объемом 500 мл: клетки центрифугируют при 700×g в течение 8 минут. Клетки ресуспендируют в свежей среде. Жизнеспособность клеток и число клеток определяют с помощью NC200. Добавляют такое же количество 2× среды для криоконсервации (20% диметилсульфоксида (ДМСО)) с получением конечного содержания ДМСО 10% в суспензии клеток. Фасуют аликвотами по 0,5-10×10⁶ клеток в каждый криофлакон (Themofisher или подобный). Это соответствует от приблизительно 10×10⁶ до приблизительно 40×10⁶ клеток на мл культуральной среды +10% ДМСО. Клетки помещают в Cryo 1°C контейнер для замораживания (NALGENE) и помещают контейнер в замораживатель на -80°C в течение ночи (или дольше, <2 недель), затем переносят в резервуар с жидким азотом. В альтернативе программируемый замораживатель может использоваться для замораживания клеток перед переносом в жидкий азот.4. Cryopreservation : Cells are harvested using TrypLE Select/Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, 2-fold dilution (0.125% equivalent), for 5-7 minutes, incubate at 37 °C. Dissociation is stopped by adding DMEM or PBS and then the cells are centrifuged. For a 50 ml tube: centrifuge the cells at 490×g for 7 minutes. For a 500 ml conical bottom vial: centrifuge the cells at 700×g for 8 minutes. Cells are resuspended in fresh medium. Cell viability and cell number were determined using NC200. The same amount of 2× cryopreservation medium (20% dimethyl sulfoxide (DMSO)) is added to produce a final DMSO content of 10% in the cell suspension. Packed in aliquots of 0.5-10×10 ⁶ cells into each cryofilk (Themofisher or similar). This corresponds to approximately 10×10 ⁶ to approximately 40×10 ⁶ cells per ml of culture medium +10% DMSO. Cells are placed in a Cryo 1°C freezing container (NALGENE) and the container is placed in a -80°C freezer overnight (or longer, <2 weeks), then transferred to a liquid nitrogen reservoir. Alternatively, a programmable freezer can be used to freeze cells before transferring to liquid nitrogen.

5. Размораживание клеток: клетки извлекают из жидкого азота, оставляют в водяной бане при 37°C на 2-3 минуты, пока не исчезнут кристаллы, быстро переносят в одну холодную пробирку с коническим дном объемом 15 мл с помощью наконечника на 1 мл. Флакон промывают холодной свежей средой 1-2 раза, затем в пробирку на 15 мл добавляют 9-12 мл холодной свежей среды. Центрифугируют при 1200 об/мин (300 g) в течение 5 минут. Удаляют супернатант, ресуспендируют осадок клеток в свежей среде и определяют количество и жизнеспособность клеток, как описано выше в Примере 2. Клетки сеют в новые покрытые флаконы или многоуровневые флаконы и инкубируют при условиях, описанных выше.5. Thawing cells : cells are removed from liquid nitrogen, left in a water bath at 37°C for 2-3 minutes until the crystals disappear, quickly transferred to one cold 15 ml conical bottom tube using a 1 ml tip. The bottle is washed with cold fresh medium 1-2 times, then 9-12 ml of cold fresh medium is added to a 15 ml test tube. Centrifuge at 1200 rpm (300 g) for 5 minutes. The supernatant is removed, the cell pellet is resuspended in fresh medium, and cell number and viability are determined as described above in Example 2. Cells are seeded into new coated vials or tiered vials and incubated under the conditions described above.

6. Подготовка клеток к трансплантации: клетки собирают с использованием TrypLE Express (Invitrogen), необязательно трипсина или эквивалента, или TRYP-LE EXPRESS или эквивалента, 2-кратное разведение (эквивалент 0,125%), 5-6 минут, инкубирование при 37°C. Диссоциацию останавливают путем добавления полной среды, DMEM или PBS. Суспензию клеток центрифугируют при 300 g в течение 5 минут, и затем клетки ресуспендируют в 0,5-3 мл холодной BSS Plus (или BSS/DPBS/HBSS). Жизнеспособность клеток и число клеток определяют с помощью трипанового синего (Invitrogen), подсчитывают с помощью Countess (Invitrogen), вручную или с помощью NC200. Клетки центрифугируют при 300 g в течение 5 минут и ресуспендируют клетки в холодной BSS Plus (или BSS/DPBS/HBSS) с получением подходящей дозировки для трансплантации.6. Cell Preparation for Transplantation : Cells are harvested using TrypLE Express (Invitrogen), optional trypsin or equivalent, or TRYP-LE EXPRESS or equivalent, 2-fold dilution (0.125% equivalent), 5-6 minutes, incubate at 37°C . Dissociation is stopped by adding complete medium, DMEM or PBS. The cell suspension is centrifuged at 300 g for 5 minutes, and then the cells are resuspended in 0.5-3 ml of cold BSS Plus (or BSS/DPBS/HBSS). Cell viability and cell number were determined using Trypan Blue (Invitrogen), counted using Countess (Invitrogen), manually, or using an NC200. The cells are centrifuged at 300 g for 5 minutes and the cells are resuspended in cold BSS Plus (or BSS/DPBS/HBSS) to obtain the appropriate dosage for transplantation.

[00259] Приготовление реагентов/клеточного продукта:[00259] Preparation of reagents/cell product :

[00260] Приготовление полной среды (бессывороточной):[00260] Preparation of complete medium (serum free):

• В этом протоколе использовали улучшенную DMEM/F12 (Invitrogen). Необязательно может использоваться DMEM/F12 (Invitrogen или другой бренд), KnockOut DEMEM/F12 (Invitrogen или другой бренд), или нейробазальная среда (Invitrogen), UltraCULTURE (Lonza), ReNcell (Chemicon) или другая эквивалентная среда.• Improved DMEM/F12 (Invitrogen) was used in this protocol. Optionally, DMEM/F12 (Invitrogen or other brand), KnockOut DEMEM/F12 (Invitrogen or other brand), or Neurobasal Medium (Invitrogen), UltraCULTURE (Lonza), ReNcell (Chemicon), or other equivalent media may be used.

• Добавка N-2 (Invitrogen), необязательно B27 (Invitrogen или другой бренд) xeno-free, B27, не xeno-free, или Stempro (Invitrogen) или другой эквивалент.• Supplement N-2 (Invitrogen), optional B27 (Invitrogen or other brand) xeno-free, B27, non-xeno-free, or Stempro (Invitrogen) or other equivalent.

• EGF (рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста): Invitrogen, необязательно другого бренда.• EGF (recombinant human epidermal growth factor): Invitrogen, not necessarily a different brand.

• bFGF (основной фактор роста фибробластов): Invitrogen, необязательно другой бренд.• bFGF (basic fibroblast growth factor): Invitrogen, not necessarily another brand.

• GlutaMAX I: Invitrogen, необязательно L-глутамин (Invitrogen или другой бренд)• GlutaMAX I: Invitrogen, optional L-glutamine (Invitrogen or other brand)

• Гентамицин (Invitrogen) для выделения и первого пассажа (приблизительно 4 дня, хотя гентамицин можно использовать дольше).• Gentamicin (Invitrogen) for isolation and first passage (approximately 4 days, although gentamicin can be used longer).

[00261] Фермент для пассирования:[00261] Passaging enzyme :

• Раствор Версена: Thermo Fisher (Life tech), используемый, как описано выше, при пассажах 1 и 2. Раствор Версена представляет собой раствор ЭДТА для использования в качестве мягкого неферментативного реагента для диссоциации клетки. Раствор Версена Gibco^® (0,48 мм) содержит 0,2 г ЭДТА (Na₄) на литр фосфатно-солевого буфера (PBS).• Versene Solution: Thermo Fisher (Life tech), used as described above for passages 1 and 2. Versene Solution is an EDTA solution for use as a mild, non-enzymatic cell dissociation reagent. Gibco ^® Versene solution (0.48 mm) contains 0.2 g EDTA (Na ₄ ) per liter of phosphate-buffered saline (PBS).

[00262] Приготовление среды для криоконсервации:[00262] Preparation of cryopreservation medium :

• 90% полной среды.• 90% full environment.

• 10% ДМСО (диметилсульфоксида) (Sigma, необязательно другой бренд).• 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma, optional other brand).

[00263] Покрытие флаконов:[00263] Bottle coating :

• Использовали фибронектин человеческой плазмы (Invitrogen). В качестве альтернативы необязательно могут использовать орнитин, полилизин, ламинин или Матригель.• Human plasma fibronectin (Invitrogen) was used. Alternatively, ornithine, polylysine, laminin or Matrigel may optionally be used.

• Фибронектин разводят в DPBS.• Fibronectin is diluted in DPBS.

o Концентрация: 1-5 мкг/см², оставляют для нанесения покрытия на ночь, до 2 недель, при 4°C или на 1-3 часа в вытяжном шкафу при комнатной температуре, хранят при 4°C в течение ночи или до 2 недель.o Concentration: 1-5 µg/ ^cm2 , leave to coat overnight, up to 2 weeks, at 4°C or 1-3 hours in a fume hood at room temperature, store at 4°C overnight or up to 2 weeks

o Промывают улучшенной DMEM/F12 перед применением.o Wash with enhanced DMEM/F12 before use.

o Флаконы также могут использоваться без промывки улучшенной DMEM/F12.o Vials can also be used without rinsing with enhanced DMEM/F12.

ЭКВИВАЛЕНТЫEQUIVALENTS

[00264] Подробности одного или нескольких вариантов осуществления изобретения изложены в прилагаемом описании выше. Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут использоваться при практическом применении или тестировании настоящего изобретения, далее описаны примерные методы и материалы.[00264] Details of one or more embodiments of the invention are set forth in the accompanying description above. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, exemplary methods and materials are described below.

[00265] Представленное выше описание было представлено исключительно в целях иллюстрации и предназначено для ограничения изобретения не точной раскрытой формой, а только прилагаемой формулой изобретения.[00265] The above description has been presented for purposes of illustration only and is intended to limit the invention not to the exact form disclosed, but only to the appended claims.

[00266] В изложенное выше могут быть внесены модификации без отступления от основных аспектов изобретения. Хотя изобретение было подробно описано со ссылкой на один или несколько конкретных вариантов осуществления, специалисты в данной области техники поймут, что изменения могут быть внесены в варианты осуществления, конкретно раскрытые в данной заявке, и при этом такие модификации и улучшения будут входить в объем и сущность изобретения. Изобретение, иллюстративно описанное в настоящем документе, может быть подходящим образом осуществлено на практике в отсутствие какого-либо элемента(ов), конкретно не раскрытого в данном документе. Таким образом, например, в каждом случае в настоящем документе любой из терминов "включающий", "состоящий по существу из" и "состоящий из" может быть заменен любым из двух других терминов. Таким образом, использованные термины и выражения используются как описательные, а не ограничивающие термины, эквиваленты показанных и описанных признаков или их части не исключаются, и следует понимать, что в рамках изобретения допускаются различные модификации. Варианты осуществления изобретения представлены в следующей формуле изобретения.[00266] Modifications may be made to the above without departing from the essential aspects of the invention. Although the invention has been described in detail with reference to one or more specific embodiments, those skilled in the art will understand that changes may be made to the embodiments specifically disclosed herein, and such modifications and improvements will be within the scope and spirit of inventions. The invention illustrated herein may be suitably practiced in the absence of any element(s) not specifically disclosed herein. Thus, for example, in each instance herein, any of the terms “including,” “consisting essentially of,” and “consisting of” may be replaced by either of the other two terms. Thus, the terms and expressions used are used as descriptive and not limiting terms, equivalents of the features shown and described or parts thereof are not excluded, and it is understood that various modifications are permitted within the scope of the invention. Embodiments of the invention are presented in the following claims.

Claims (54)

1. Способ выделения первичных ретинальных клеток из человеческого образца, одного или пары человеческих глазных яблок, полученных от человека-донора, где указанные одно или пара человеческих глазных яблок обладают нормальной морфологией, включающей интактное глазное яблоко(и), прозрачную роговицу, нормальную форму или любую их комбинацию, включающий:1. A method of isolating primary retinal cells from a human sample, one or a pair of human eyeballs obtained from a human donor, wherein said one or pair of human eyeballs have normal morphology, including intact eyeball(s), clear cornea, normal shape or any combination thereof, including: (a) выделение образца сетчатки, включающего множество первичных ретинальных клеток, из человеческого образца в течение 8 часов после сбора одного или пары глазных яблок от человека-донора, где человек-донор представляет собой плод с гестационным возрастом от 12 недель до 28 недель,(a) isolating a retinal sample including a plurality of primary retinal cells from a human sample within 8 hours of collecting one or a pair of eyeballs from a human donor, wherein the human donor is a fetus with a gestational age of between 12 weeks and 28 weeks, (b) механическую диссоциацию множества первичных ретинальных клеток в образце сетчатки, выделенном на этапе (a), без обработки множества первичных ретинальных клеток протеазой, с получением в результате разделенной суспензии клеток и скоплений клеток и(b) mechanically dissociating the plurality of primary retinal cells in the retinal sample isolated in step (a), without treating the plurality of primary retinal cells with a protease, resulting in a separated cell suspension and cell aggregates, and (c) определение жизнеспособности, количества и морфологии первичных ретинальных клеток, полученных из образца сетчатки, где получают по меньшей мере 30×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток.(c) determining the viability, number and morphology of primary retinal cells obtained from the retinal sample, wherein at least 30×10 ⁶ viable primary retinal cells are obtained. 2. Способ по п.1, где перед этапом (a) человеческий образец помещают в среду для транспортировки культуры клеток, предпочтительно включающей RPMI-1640 с L-глутамином или улучшенную DMEM/F12, необязательно, где среда для транспортировки культуры клеток включает гентамицин в концентрации 0,5-50 микрограммов на миллилитр, где, необязательно, среда для транспортировки культуры клеток включает 50 микрограммов гентамицина на миллилитр.2. The method of claim 1, wherein before step (a) the human sample is placed in a cell culture transport medium, preferably comprising RPMI-1640 with L-glutamine or enhanced DMEM/F12, optionally wherein the cell culture transport medium includes gentamicin in concentrations of 0.5-50 micrograms per milliliter, where optionally the cell culture transport medium includes 50 micrograms of gentamicin per milliliter. 3. Способ по любому из пп.1, 2, где этап (b) включает:3. Method according to any one of claims 1, 2, where step (b) includes: (i) перенос образца сетчатки в пробирку,(i) transferring the retinal sample into a test tube, (ii) механическую диссоциацию образца сетчатки с получением множества разделенных первичных ретинальных клеток, предпочтительно путем суспендирования стерильной пипеткой, более предпочтительно путем суспендирования стерильной пипеткой от 2 до 50 раз, от 2 до 10 раз или от 4 до 8 раз,(ii) mechanically dissociating the retinal sample to produce a plurality of separated primary retinal cells, preferably by suspending with a sterile pipette, more preferably by suspending with a sterile pipette 2 to 50 times, 2 to 10 times, or 4 to 8 times, (iii) осаждение множества разделенных первичных ретинальных клеток с помощью центрифугирования и(iii) sedimentation of multiple separated primary retinal cells by centrifugation and (iv) удаление супернатанта.(iv) removal of the supernatant. 4. Способ по любому из пп.1-3, где этап (c) включает:4. Method according to any one of claims 1 to 3, where step (c) includes: (i) ресуспендирование осажденных первичных ретинальных клеток из этапа (b) в культуральной среде с температурой 1-8°C и добавкой антибиотика,(i) resuspending the pelleted primary retinal cells from step (b) in a culture medium with a temperature of 1-8°C and the addition of an antibiotic, (ii) посев множества разделенных ретинальных клеток в один или более флаконов или планшетов для культур клеток с покрытием, содержащих культуральную среду, где, необязательно, культуральная среда содержит добавку антибиотика,(ii) seeding a plurality of separated retinal cells into one or more coated cell culture flasks or plates containing a culture medium, where optionally the culture medium contains an antibiotic additive, (iii) инкубирование множества разделенных ретинальных клеток при 10-50°C, где, необязательно, инкубирование проходит при 37°C, и(iii) incubating the plurality of separated retinal cells at 10-50°C, where optionally the incubation is at 37°C, and (iv) определение количества и жизнеспособности первичных ретинальных клеток и скоплений ретинальных клеток.(iv) determination of the number and viability of primary retinal cells and retinal cell aggregates. 5. Способ по п.4, где количество жизнеспособных первичных ретинальных клеток составляет от 30×10⁶ до 1×10⁹ жизнеспособных первичных ретинальных клеток или в пределах 73-147×10⁶ жизнеспособных первичных ретинальных клеток.5. The method according to claim 4, where the number of viable primary retinal cells is from 30×10 ⁶ to 1×10 ⁹ viable primary retinal cells or in the range of 73-147×10 ⁶ viable primary retinal cells. 6. Способ по любому из пп.4 или 5, где процент жизнеспособных подсчитанных клеток составляет от 10 до 100% или от 68 до 85%.6. Method according to any one of claims 4 or 5, wherein the percentage of viable cells counted is from 10 to 100% or from 68 to 85%. 7. Способ культивирования выделенных первичных человеческих ретинальных клеток для получения популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников, где способ включает:7. A method of culturing isolated primary human retinal cells to obtain a population of non-immortalized human retinal progenitor cells, where the method includes: (a) посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральную среду, в первом пассаже множества первичных ретинальных клеток, полученных способом по любому из пп.1-6, с получением множества культивированных ретинальных клеток;(a) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture medium in a first passage of a plurality of primary retinal cells obtained by the method according to any one of claims 1 to 6, to obtain a plurality of cultured retinal cells; (b) посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральные среды, во втором пассаже множества культивированных ретинальных клеток, полученных в первом пассаже;(b) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture media in a second passage of a plurality of cultured retinal cells obtained in the first passage; (c) посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих культуральную среду, в третьем пассаже множества культивированных ретинальных клеток, полученных во втором пассаже; и(c) seeding one or more culture flasks or coated plates containing culture medium in the third passage of a plurality of cultured retinal cells obtained in the second passage; And (d) криоконсервацию множества культивированных ретинальных клеток;(d) cryopreserving multiple cultured retinal cells; где один или более культуральных флаконов с покрытием засевают при плотности от 0,5×10⁴ клеток на квадратный сантиметр (см²) до 5×10⁶ клеток на см²,wherein one or more coated culture flasks are seeded at a density of between 0.5 x 10 ⁴ cells per square centimeter (cm ² ) and 5 x 10 ⁶ cells per cm ² , плотность посева в первом пассаже больше, чем плотность посева во втором пассаже, иthe seeding density in the first passage is greater than the seeding density in the second passage, and плотность посева во втором пассаже больше, чем плотность посева в третьем пассаже,the sowing density in the second passage is greater than the sowing density in the third passage, с получением в результате популяции неиммортализованных человеческих ретинальных клеток-предшественников,resulting in a population of non-immortalized human retinal progenitor cells, где культуральная среда включает улучшенную DMEM/F12, KnockOut DEMEM/F12, UltraCULTURE, ReNcell или нейробазальную среду, и при этом культуральная среда дополнительно дополнена по меньшей мере одним из N-2, B27, Stempro, EGF, bFGF, GlutaMAX I, L-глутамином или гентамицином.wherein the culture medium includes enhanced DMEM/F12, KnockOut DEMEM/F12, UltraCULTURE, ReNcell or neurobasal medium, and wherein the culture medium is further supplemented with at least one of N-2, B27, Stempro, EGF, bFGF, GlutaMAX I, L- glutamine or gentamicin. 8. Способ по п.7, дополнительно включающий посев в один или более культуральных флаконов или планшетов с покрытием, содержащих питательную среду, в одном или более дополнительных пассажах множества культивированных ретинальных клеток, полученных в непосредственно предшествующем пассаже.8. The method of claim 7, further comprising seeding one or more culture flasks or coated plates containing the culture medium in one or more additional passages of a plurality of cultured retinal cells obtained in the immediately preceding passage. 9. Способ по любому из пп.7 или 8, в котором культуральные флаконы или планшеты покрыты не содержащим ксеногенных компонентов фибронектином, орнитином, полилизином, ламинином или их комбинацией.9. The method according to any one of claims 7 or 8, in which the culture flasks or plates are coated with xenogeneic-free fibronectin, ornithine, polylysine, laminin or a combination thereof. 10. Способ по любому из пп.7-9, где множество первичных или культивированных ретинальных клеток культивируют при:10. The method according to any one of claims 7 to 9, wherein a plurality of primary or cultured retinal cells are cultured by: (1) 37°C в атмосфере с 0-30% CO₂ и 0-50% O₂,(1) 37°C in an atmosphere of 0-30% CO ₂ and 0-50% O ₂ , (2) 37°C с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 20% или(2) 37°C with CO ₂ less than or equal to 5% and O ₂ less than or equal to 20% or (3) 37°C с содержанием CO₂ меньше или равным 5% и O₂ меньше или равным 3%.(3) 37°C with CO ₂ less than or equal to 5% and O ₂ less than or equal to 3%. 11. Способ по любому из пп.7-10, в котором период времени между пассажами составляет от 2 до 8 дней, от 3 до 6 дней, от 4 до 5 дней или от 3 до 4 дней.11. The method according to any one of claims 7 to 10, in which the period of time between passages is from 2 to 8 days, from 3 to 6 days, from 4 to 5 days or from 3 to 4 days. 12. Способ по любому из пп.7-11, где множество первичных ретинальных клеток разделяют в первом пассаже с использованием первого ферментативного раствора, включающего:12. The method according to any one of claims 7 to 11, wherein the plurality of primary retinal cells are separated in a first passage using a first enzymatic solution comprising: (1) трипсин или эквивалент и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), необязательно, где TrypLE и ЭДТА присутствуют в соотношении 1:4, или(1) trypsin or equivalent and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), optional, where TrypLE and EDTA are present in a ratio of 1:4, or (2) трипсин или эквивалент, ЭДТА, предпочтительно, TrypLE, ЭДТА и DPBS, необязательно, где TrypLE, ЭДТА и DPBS присутствуют в соотношении 1:1:3.(2) trypsin or equivalent, EDTA, preferably TrypLE, EDTA and DPBS, optionally, where TrypLE, EDTA and DPBS are present in a ratio of 1:1:3. 13. Способ по любому из пп. 7-12, в котором множество культивированных ретинальных клеток диссоциируют при втором пассаже вторым ферментативным раствором, содержащим:13. Method according to any one of paragraphs. 7-12, in which a plurality of cultured retinal cells are dissociated in a second passage with a second enzymatic solution containing: (1) трипсин или его эквивалент, предпочтительно TrypLE, ЭДТА и DPBS, необязательно, где TrypLE, EDTA и DPBS присутствуют в соотношении 1:1:3, или(1) trypsin or its equivalent, preferably TrypLE, EDTA and DPBS, optionally, where TrypLE, EDTA and DPBS are present in a ratio of 1:1:3, or (2) эквивалент трипсина, предпочтительно TrypLE и DPBS, где необязательно TrypLE и DPBS присутствуют в соотношении 1:1.(2) a trypsin equivalent, preferably TrypLE and DPBS, where optionally TrypLE and DPBS are present in a 1:1 ratio. 14. Способ по п.13, где множество первичных ретинальных клеток разделяют в течение 5-20 минут, 6-10 минут или 7-8 минут при 37°C.14. The method of claim 13, wherein the plurality of primary retinal cells are separated for 5-20 minutes, 6-10 minutes or 7-8 minutes at 37°C. 15. Способ по любому из пп.8-14, где множество культивированных ретинальных клеток разделяют в третьем или последующем пассаже с использованием третьего ферментативного раствора, включающего трипсин или эквивалент, предпочтительно TrypLE и DPBS, необязательно, где TrypLE и DPBS присутствуют в соотношении 1:1 в третьем ферментативном растворе.15. The method according to any one of claims 8 to 14, wherein the plurality of cultured retinal cells are separated in a third or subsequent passage using a third enzymatic solution comprising trypsin or equivalent, preferably TrypLE and DPBS, optionally, wherein TrypLE and DPBS are present in a ratio of 1: 1 in the third enzymatic solution. 16. Способ по п. 15, в котором множество культивированных ретинальных клеток разделяют в течение 5-10 минут или 5-7 минут при 37°С по меньшей мере при третьем или последующем пассаже.16. The method of claim 15, wherein the plurality of cultured retinal cells are separated for 5-10 minutes or 5-7 minutes at 37°C at at least the third or subsequent passage. 17. Способ по любому из пп.7-16, где клетки сеют в культуральные флаконы или планшеты при плотности от 0,5×10⁶ до 3,0×10⁶ клеток/см² в первом пассаже, от 0,1×10⁶ до 0,5×10⁶ клеток/см² во втором пассаже, от 0,03×10⁶ до 0,2×10⁶ клеток/см² в третьем пассаже и от 10000 до 60000 клеток/см² в четвертом и последующих пассажах.17. Method according to any one of claims 7-16, where cells are seeded into culture flasks or plates at a density of 0.5×10 ⁶ to 3.0×10 ⁶ cells/cm ² in the first passage, from 0.1×10 ⁶ to 0.5 × 10 ⁶ cells/cm ² in the second passage, from 0.03 × 10 ⁶ to 0.2 × 10 ⁶ cells/cm ² in the third passage and from 10,000 to 60,000 cells/cm ² in the fourth and subsequent ones passages. 18. Способ по любому из пп.7-17, где криоконсервация в этапе (d) включает:18. The method according to any one of claims 7-17, where cryopreservation in step (d) includes: (i) ферментативную диссоциацию клеток с использованием трипсина или эквивалента,(i) enzymatic dissociation of cells using trypsin or equivalent, (ii) остановку диссоциации избытком культуральной среды или улучшенной DMEM/F12,(ii) stopping dissociation with excess culture medium or improved DMEM/F12, (iii) центрифунгирование клеток при 10-10000×g в течение 1-30 минут,(iii) centrifuging cells at 10-10000×g for 1-30 minutes, (iv) ресуспендирование клеток в культуральной среде и определение общего количества и жизнеспособности клеток,(iv) resuspension of cells in culture medium and determination of total cell number and viability, (v) добавление среды для криоконсервации с получением конечной концентрации диметилсульфоксида (ДМСО) 5-30%,(v) adding cryopreservation medium to obtain a final concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) of 5-30%, (vi) аликвотирование множества клеток в каждый криофлакон,(vi) aliquoting multiple cells into each cryofial, (vii) замораживание каждого флакона при использовании программируемого криозамораживателя и(vii) freezing each vial using a programmable cryofreezer and (viii) помещение каждого флакона с клетками в жидкий N₂.(viii) placing each cell vial in liquid N ₂ . 19. Способ по любому из пп.3-18, где культуральная среда является бессывороточной.19. Method according to any one of claims 3 to 18, where the culture medium is serum-free.

Images