RU2409663C1 - Method for producing dedifferentiated cells of adult retinal pigment eye epithelium - Google Patents
Method for producing dedifferentiated cells of adult retinal pigment eye epithelium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2409663C1 RU2409663C1 RU2009137876/10A RU2009137876A RU2409663C1 RU 2409663 C1 RU2409663 C1 RU 2409663C1 RU 2009137876/10 A RU2009137876/10 A RU 2009137876/10A RU 2009137876 A RU2009137876 A RU 2009137876A RU 2409663 C1 RU2409663 C1 RU 2409663C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- solution
- retinal pigment
- eyeball
- rpe
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области нейробиологии и офтальмологии.The invention relates to the field of neurobiology and ophthalmology.
Ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) располагается в глазе между нейральной сетчаткой и сосудистой оболочкой глаза. Клетки РПЭ эволюционно адаптированы для защиты нервных клеток сетчатки от чрезвычайно травматичного повреждения светом и оксидативного стресса. А так как клетки РПЭ имеют общее нейроэпителиальное происхождение с клетками мозга, они являются иммунологически привилегированными при их трансплантации не только в глаз, но и в ЦНС. Разработка клеточных технологий для получения специализированных клеточных культур с заданными свойствами на основе РПЭ позволит иметь источник клеток для трансплантации с целью стимуляции регенераторных процессов при широком спектре нейродегенеративных заболеваний. Нативный РПЭ представляет собой монослой сильно пигментированных клеток, имеющих гексогональную форму, что является проявлением эпителиальной дифференцировки клеток. Выделенные из глаза клетки РПЭ в зависимости от подобранных условий культивирования могут обладать либо эпителиальным фенотипом, либо фенотипом фибробласто подобных клеток.Retinal pigment epithelium (RPE) is located in the eye between the neural retina and choroid. RPE cells are evolutionarily adapted to protect retinal nerve cells from extremely traumatic light damage and oxidative stress. And since RPE cells have a common neuroepithelial origin with brain cells, they are immunologically privileged during their transplantation not only in the eye, but also in the central nervous system. The development of cell technologies for producing specialized cell cultures with desired properties based on RPE will make it possible to have a source of cells for transplantation in order to stimulate regenerative processes in a wide range of neurodegenerative diseases. Native RPE is a monolayer of highly pigmented cells having a hexogonal shape, which is a manifestation of the epithelial differentiation of cells. RPE cells isolated from the eye, depending on the selected culturing conditions, may possess either an epithelial phenotype or a fibroblast-like phenotype.
В норме клетки РПЭ формируют неподвижный монослой, но при этом клетки сохраняют способность делиться, когда их помещают в культуру или когда они участвуют в раневом заживлении.Normally, RPE cells form a fixed monolayer, but the cells retain the ability to divide when they are placed in culture or when they participate in wound healing.
Известно, что в новых условиях микроокружения (in vivo при различных стимулах, таких как фотокоагуляция или криотерапия сетчатки, или in vitro) клетки РПЭ дедифференцируются и показывают псевдометапластическую трансформацию в фибробластоподобные, веретенообразной формы клетки, которые активно делятся и мигрируют, а также депигментируются.It is known that under new microenvironment conditions (in vivo with various stimuli, such as photocoagulation or cryotherapy of the retina, or in vitro), RPE cells are dedifferentiated and show a pseudo-metaplastic transformation into fibroblast-like, spindle-shaped cells that actively divide and migrate, as well as depigmented.
Клетки РПЭ взрослого человека в культуре быстро пролиферируют и дедифференцируются на молекулярном уровне, теряют маркеры дифференцировки РПЭ, такие как RPE65, RET-PE10, CRALBP, CRBP. Дедифференцированные клетки начинают экспрессировать маркеры плюрипотентных клеток (Рах6). Обнаружение в культуре маркеров нейральных стволовых клеток (нестина, β-тубулина-III и др.) свидетельствует уже о трансдифференцировке клеток в нейральном направлении.Adult RPE cells in culture rapidly proliferate and dedifferentiate at the molecular level, lose RPE differentiation markers, such as RPE65, RET-PE10, CRALBP, CRBP. De-differentiated cells begin to express markers of pluripotent cells (Pax6). The detection in the culture of markers of neural stem cells (nestin, β-tubulin-III, etc.) already indicates transdifferentiation of cells in the neural direction.
Дедифференцированные клетки РПЭ по сравнению с дифференцированными клетками обладают большими потенциями, а именно они активно пролиферируют и мигрируют, они пластичны, т.е. в зависимости от условий микроокружения эти клетки могут приобретать свойства других клеток, что очень важно учитывать при лечении нейродегенеративных заболеваний мозга.In contrast to differentiated cells, the differentiated RPE cells have higher potencies, namely, they actively proliferate and migrate, they are plastic, i.e. depending on the microenvironment conditions, these cells can acquire the properties of other cells, which is very important to consider when treating neurodegenerative diseases of the brain.
Клетки РПЭ имеют нейроэпителиальное происхождение. При помещении дедифференцированных клеток РПЭ в определенные условия они могут дифференцироваться в двух направлениях: эпителиальном или нейральном. Дифференцированные клетки этого сделать не могут. Поэтому культуры дедиффенцированных клеток РПЭ могут быть использованы в офтальмологической практике (при лечении возрастной макулярной дегенерации, пигментного ретинита и др.) с целью восстановления целостности сетчатки и в неврологической практике с целью стимуляции регенераторных процессов при широком спектре нейродегенеративных заболеваний мозга (болезни Паркинсона, Альцгеймера, Гентингтона и др.).RPE cells are of neuroepithelial origin. When dedifferentiated RPE cells are placed under certain conditions, they can differentiate in two directions: epithelial or neural. Differentiated cells cannot do this. Therefore, cultures of dedifferentiated RPE cells can be used in ophthalmic practice (in the treatment of age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, etc.) with the aim of restoring the integrity of the retina and in neurological practice with the goal of stimulating regenerative processes in a wide range of neurodegenerative brain diseases (Parkinson’s, Alzheimer's, Huntington and others.).
Кроме того, важно учитывать тот факт, что для трансплантации в головной мозг и субретинальное пространство для лечения нейродегенеративных заболеваний требуется не менее 3-5 млн клеток. Для получения достаточного количества клеток с заданными свойствами подходят только дедифференцированные клетки, поскольку только они обладают пролиферативным потенциалом и при этом сохраняют способность экспрессировать ряд специфических факторов, позволяющих клеткам осуществлять нейропротекторные действия.In addition, it is important to take into account the fact that transplantation into the brain and subretinal space for the treatment of neurodegenerative diseases requires at least 3-5 million cells. To obtain a sufficient number of cells with desired properties, only dedifferentiated cells are suitable, since only they have proliferative potential and at the same time retain the ability to express a number of specific factors that allow cells to carry out neuroprotective actions.
Известно изобретение [патент US №6045791, МПК C12N 5/06], заключающееся в следующем. Проводят подготовку популяции зрелых (не плодовых) аутологичных или неаутологичных клеток РПЭ в виде монослойного пласта в поддерживающей конструкции («сендвидж» конструкции) для трансплантации в субретинальную область при реконструкции дистрофически измененного РПЭ. Подготовка клеток РПЭ заключается в сборе клеток из глаз при биопсии в виде интактного монослоя или в сборе клеток из глаз, энуклеированных для забора роговицы, с предварительным культивированием диссоциированных клеток до монослоя в поддерживающей конструкции, помещенной на агарозу или фибрин. Трансплантат толщиной 100-500 микрон с предпочтительной толщиной 150-250 микрон и площадью 1-4 мм и более состоит из слоя коллагена толщиной менее чем 100 микрон с предпочтительной толщиной 1-10 микрон, монослоя клеток РПЭ и слоя желатина толщиной 150-250 мкм. Данное изобретение подразумевает использование клеток РПЭ в виде интактных пластов, точнее слоев сильнопигментированных, гексагональных, поляризованных, непролиферирущих высокодифференцированных клеток. В тех случаях, когда прибегают к культивированию, клетки РПЭ выращивают в ограниченном количестве без пассирования, так как целью является нарастить трансплантат до определенной площади (1-4 мм2), и получают монослой пигментированных клеток. В этих случаях используют следующий метод изоляции клеток РПЭ: свежеэнуклеированные глаза транспортируют в ростовой среде с 5% сыворотки, после удаления переднего сегмента глаза со стекловидным телом надрезают задний сегмент глаза радиально по направлению к зрительному диску 4 длинными разрезами, придавая ему форму цветка с 4 лепестками, далее удаляют нейральную сетчатку, инкубируют задний сегмент в растворе 0,25% трипсина 30 минут при 37°С, клетки отделяют от мембраны Бруха пипетированием пастеровской пипеткой. Клетки культивируют на культуральных слайдах в ростовой среде DMEM/F12 (1:1) с 20% FBS.The invention is known [US patent No. 6045791, IPC
Недостатком данного изобретения является возможная контаминация культуры клеток РПЭ клетками нейральной сетчатки и элементами стекловидного тела, которое интимно связано с нейральной сетчаткой и не всегда при выделении отделяется полностью, а также форменными элементами крови в результате разрезания глазной чаши через все слои (конъюнктиву, сосудистую оболочку, РПЭ и нейральную сетчатку). При использовании трипсина возможно повреждение на клетках РПЭ поверхностных молекул, например таких, как рецепторы ростовых факторов, что приводит к замедлению роста клеток и пролиферации культуры из-за блокирования воздействия ростовых факторов среды на клетки. Кроме того, по этому методу получают дифференцированные клетки, и выход клеток небольшой.The disadvantage of this invention is the possible contamination of the RPE cell culture by the cells of the neural retina and the vitreous elements, which is intimately connected with the neural retina and is not always completely separated when excreted, as well as by the formed elements of the blood as a result of cutting the eye cup through all layers (conjunctiva, choroid, RPE and neural retina). When using trypsin, surface molecules, such as growth factor receptors, can be damaged on RPE cells, which leads to slower cell growth and proliferation of the culture due to blocking the effect of growth environmental factors on the cells. In addition, differentiated cells are obtained by this method, and the cell yield is small.
Известно изобретение [патент US №6183735, МПК А61К 35/00], заключающееся в следующем. Получали иммортализованные клеточные линии ретинального происхождения (IO/JG2/1 из ретинальных эндотелиальных и IO/LD7/4 из РПЭ клеток) млекопитающих, в частности крыс, путем трансфекции ретровирусного вектора, содержащего SV40 Т-ген, для транспортировки интересующих терапевтических субстанций в глаз и ЦНС при трансплантации. РПЭ клетки изолировали из 6-8 дневных крыс. Интактные глазные яблоки обрабатывали 2% диспазой 30 минут, роговицу и стекловидное тело удаляли, сетчатку изолировали и инкубировали 15 мин в культуральной среде. После инкубации слой клеток РПЭ отделяли от нейральной сетчатки и обрабатывали трипсином для получения клеточной суспензии. Клетки культивировали во флаконах до субконфлюэнта в среде, состоящей из F-10 с 20% FCS, 2 mM L-glutamine, пенициллином и стрептомицином. Культура росла в виде пигментированного монослоя и была положительна на цитокератины и эпитоп РПЭ, названный RET-PE-2.The invention is known [US patent No. 6183735, IPC A61K 35/00], which consists in the following. Immortalized cell lines of retinal origin (IO / JG2 / 1 from retinal endothelial and IO / LD7 / 4 from RPE cells) of mammals, in particular rats, were obtained by transfection of a retroviral vector containing the SV40 T gene to transport therapeutic substances of interest to the eye and CNS during transplantation. RPE cells were isolated from 6-8 day old rats. Intact eyeballs were treated with 2% dispase for 30 minutes, the cornea and vitreous body were removed, the retina was isolated and incubated for 15 minutes in culture medium. After incubation, the RPE cell layer was separated from the neural retina and treated with trypsin to obtain a cell suspension. Cells were cultured in vials prior to subconfluent in a medium consisting of F-10 with 20% FCS, 2 mM L-glutamine, penicillin and streptomycin. The culture grew as a pigmented monolayer and was positive for cytokeratins and an RPE epitope called RET-PE-2.
Однако данным методом получают культуры дифференцированных клеток. Кроме того, при данном методе выделения культура клеток РПЭ контаминируется другими типами клеток, а также повреждается действием трипсина на поверхностные молекулы клеток.However, this method produces cultures of differentiated cells. In addition, with this isolation method, RPE cell culture is contaminated with other types of cells, and is also damaged by the action of trypsin on the surface of the cell molecules.
Известно изобретение [патент US №6117675, МПК C12N 5/06], заключающееся в изоляции стволовых клеток из эмбриональной и взрослой сетчатки мышей и человека (из целого слоя РПЭ, включающего пигментированные клетки из цилиарной краевой области), получении суспензионной культуры (свободноплавающих клеточных агрегатов шарообразной формы, т.е. ретиносфер) и дифференцировке клеток в направлении ретинальных клеток. Диссекцию взрослых и эмбриональных слоев нейральной сетчатки и РПЭ выполняли в артифициальной цереброспиналыгой жидкости (aCSF) при комнатной температуре. При выделении слоя РПЭ из взрослых тканей в глазную чашу дополнительно заливали растворы ферментов и инкубировали по 10 минут в растворе диспазы при 30-32°С и в растворе ферментов (трипсина, гиалуронидазы и кинуреновой кислоты) при 37°С. После ферментативной обработки РПЭ разрезали на кусочки размером 1 мм, переносили в бессывороточную среду и механически ресуспендировали, затем диссоциированные клетки помещали на непокрытые культуральные чашки 35 мм в бессывороточной среде, состоящей из DMEM/F12 (1:1), 20 нг/мл EGF и/или 10 нг/мл FGF2 с 2 мкг/мл гепарина, инсулина, трансферрина, прогестерона, путресцина, селенита, глюкозы, 2 mM глютамина, и культивировали до получения в суспензионной культуре свободноплавающих ретиносфер, экспрессирующих Chx10 и не экспрессирующих GFAP, NSE и MBP.The invention is known [US patent No. 6117675, IPC C12N 5/06], which consists in the isolation of stem cells from the embryonic and adult retinas of mice and humans (from a whole layer of RPE, including pigmented cells from the ciliary edge region), obtaining a suspension culture (free-floating cell aggregates spherical shape, i.e. retinospheres) and differentiation of cells in the direction of retinal cells. Dissection of the adult and embryonic layers of the neural retina and RPE was performed in artifact cerebrospinal fluid (aCSF) at room temperature. When the RPE layer was isolated from adult tissues, enzyme solutions were additionally poured into the eye cup and incubated for 10 minutes in a dispase solution at 30-32 ° C and in a solution of enzymes (trypsin, hyaluronidase and kinurenoy acid) at 37 ° C. After enzymatic treatment, RPEs were cut into 1 mm pieces, transferred to serum-free medium and mechanically resuspended, then dissociated cells were placed on uncoated 35 mm culture plates in serum-free medium consisting of DMEM / F12 (1: 1), 20 ng / ml EGF and / or 10 ng / ml FGF2 with 2 μg / ml heparin, insulin, transferrin, progesterone, putrescine, selenite, glucose, 2 mM glutamine, and cultured to obtain free-floating retinospheres expressing Chx10 and not expressing GFAP, NSE and MBP in suspension culture .
Данный метод направлен на получение суспензионной культуры из пигментированных эпителиальных клеток цилиарной области, а также на получение дифференцированных клеток.This method aims to obtain a suspension culture from pigmented epithelial cells of the ciliary region, as well as to obtain differentiated cells.
Известно изобретение [патент TW №422881, МПК C12N 5/06], заключающееся в изоляции клеток нативного РПЭ взрослого человека из свежевыделенного глаза, обработке организованного монослоя 0,25%-ным раствором ЭДТА в течение 12 минут, покрытии его 12% желатином при +4°С и трансплантации.The invention is known [patent TW No. 422881, IPC
В данном методе дифференцированные клетки РПЭ выделяются слоем.In this method, differentiated RPE cells are secreted by a layer.
Обычно для выделения ретинального ПЭ из глаз взрослого человека на этапе отделения клеток от мембраны Бруха используют ферменты (трипсина, папаина). Однако при использовании ферментов происходит разрушение не только межклеточных и клеточно-матриксных контактов, но и самих клеток.Usually, enzymes (trypsin, papain) are used to isolate retinal PE from the eyes of an adult at the stage of separation of cells from Bruch’s membrane. However, when enzymes are used, not only the intercellular and cell-matrix contacts are destroyed, but also the cells themselves.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является получение большого количества жизнеспособных дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия, уменьшение длительности и упрощение процесса.The problem to which the invention is directed, is to obtain a large number of viable dedifferentiated cells of the retinal pigment epithelium, reducing the duration and simplifying the process.
Техническим результатом является исключение повреждающего действия ферментов, а также достижение прикрепления на культуральной поверхности популяции клеток с более низкими адгезивными свойствами.The technical result is the elimination of the damaging effect of enzymes, as well as the achievement of attachment to the cultural surface of a population of cells with lower adhesive properties.
Для решения поставленной задачи способ получения дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека характеризуется тем, что энуклиируют глазное яблоко при аутопсии, промывают его в спиртовом растворе последовательно при концентрациях 70°, 50°, 30° и в растворе Хенкса безTo solve this problem, the method of obtaining dedifferentiated cells of the retinal pigment epithelium of an adult eye is characterized by the fact that the eyeball is enucleated by autopsy, washed in an alcohol solution sequentially at concentrations of 70 °, 50 °, 30 ° and in Hanks solution without
Са2+, Mg2+ антибиотиком, удаляют по зубчатой линии передний сегмент глазного яблока, отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, наполняют глазную чашу раствором Хенкса без Са2+, Mg2+ с ЭДТА и инкубируют клетки ретинального пигментного эпителия в течение 15-30 мин, полученные клетки собирают пипеткой и переносят в стерильную среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12, 2 mМ L-глутамина, 50 мл 10% FBS, 5 мл раствора антибиотика, пипетируют, центрифугируют при в течение 5-7 мин при скорости 800 об/мин, выделенные клетки ресуспендируют на ростовую среду с высоким содержанием сыворотки, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 в соотношении 1:1, 2 mМ L-глутамина, 50 мл 20% FBS, добавки В27 (1:100), 20 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF, 2 мкг/мл гепарина, 5 мл раствора антибиотика, затем полученную суспензию клеток ретинального пигментного эпителия распределяют на культуральной поверхности и инкубируют до достижения прикрепления клетками 15-25% ее площади, суспензию с неприкрепившимися клетками аспирируют и распределяют на свежей культуральной поверхности и инкубируют, а к прикрепившимся клеткам добавляют ростовую среду с высоким содержанием сыворотки и инкубируют до достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта, причем распределение суспензии клеток на свежую культуральную поверхность и инкубирование проводят неоднократно до прекращения прикрепления клеток ретинального пигментного эпителия на культуральной поверхности.Ca 2+ , Mg 2+ with an antibiotic, the anterior segment of the eyeball is removed along the dentate line, the vitreous body and the neural retina are separated from the pigment epithelium, the eye cup is filled with Hanks solution without Ca 2+ , Mg 2+ with EDTA and the cells of the retinal pigment epithelium are incubated in for 15-30 minutes, the obtained cells are pipetted and transferred to a sterile medium for isolation, consisting of 500 ml of DMEM / F12 medium, 2 mM L-glutamine, 50 ml of 10% FBS, 5 ml of antibiotic solution, pipetted, centrifuged for 5-7 min at a speed of 800 rpm, the selected cells re suspended in a high serum growth medium consisting of 500 ml of DMEM / F12 medium in a ratio of 1: 1, 2 mM L-glutamine, 50 ml of 20% FBS, additives B27 (1: 100), 20 ng / ml FGF-2 , 20 ng / ml EGF, 2 μg / ml heparin, 5 ml antibiotic solution, then the resulting suspension of retinal pigment epithelial cells is distributed on the culture surface and incubated until 15-25% of its area is reached by cells, the suspension with non-adherent cells is aspirated and distributed into fresh culture surface and incubated, and to the attached cells add growth medium with a high serum content is incubated and incubated until the confluent monolayer of the target product is achieved, and the cell suspension is distributed on the fresh culture surface and incubated several times until the retinal pigment epithelial cells attach to the culture surface.
В частном варианте энуклиирование глазного яблока проводят до 24 часов после смерти донора.In a particular embodiment, enucleation of the eyeball is carried out up to 24 hours after the death of the donor.
В другом частном варианте глазное яблоко промывают в спиртовом растворе в течение 1-2 мин при каждой концентрации.In another particular embodiment, the eyeball is washed in an alcohol solution for 1-2 minutes at each concentration.
В другом частном варианте глазное яблоко промывают от спиртового раствора в растворе Хенкса без Са2+, Mg2+ с антибиотиком 2-3 раза.In another particular embodiment, the eyeball is washed from an alcoholic solution in a Hanks solution without Ca 2+ , Mg 2+ with an antibiotic 2-3 times.
В другом частном варианте в качестве антибиотика используют 100 U/ml пенициллина и 100 U/ml стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad).In another particular embodiment, 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad) are used as an antibiotic.
В другом частном варианте зубчатую линию определяют по границе между темным и светлым участком.In another particular embodiment, the toothed line is determined by the boundary between the dark and the light area.
В другом частном варианте отделяют стекловидное тело и нейральную сетчатку от пигментного эпителия, подрезая нейральную сетчатку в области зрительного нерва.In another particular embodiment, the vitreous body and the neural retina are separated from the pigment epithelium, cutting the neural retina in the optic nerve.
В другом частном варианте раствор Хенкса без Са2+, Mg2+ содержит 3,76 г/л ЭДТА.In another particular embodiment, the Hanks solution without Ca 2+ , Mg 2+ contains 3.76 g / l EDTA.
В другом частном варианте полученные клетки ретинального пигментного эпителия собирают пипеткой с объемом наконечника 200µ1.In another particular embodiment, the obtained retinal pigment epithelial cells are collected with a pipette with a tip volume of 200 µ1.
В другом частном варианте выделение клеток ретинального пигментного эпителия проводят при пониженной температуре на льду.In another particular embodiment, the isolation of retinal pigment epithelial cells is carried out at a reduced temperature on ice.
В другом частном варианте процесс инкубирования проводят при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СО2.In another particular embodiment, the incubation process is carried out at 37 ° C, air humidity 95%, in an atmosphere of 5% CO 2 .
В другом частном варианте клетки ретинального пигментного эпителия подвергают иммуноцитохимической оценке.In another particular embodiment, retinal pigment epithelial cells are subjected to immunocytochemical evaluation.
Наиболее важным является время энуклеации глазных яблок до 24 часов после смерти донора. Чем дольше глазные яблоки находятся среди омертвевших тканей, тем дольше они подвергаются воздействию гидролитических ферментов погибших клеток и тканей, т.е. аутолизу. Раннее изъятие биоматериала благоприятно влияет на жизнеспособность клеток РПЭ, при условии, что глазные яблоки находятся в питательной среде при пониженной температуре. При данных условиях время обработки глаз может быть отсрочено до 24 часов.The most important is the time of enucleation of the eyeballs up to 24 hours after the death of the donor. The longer the eyeballs are among the dead tissue, the longer they are exposed to the hydrolytic enzymes of dead cells and tissues, i.e. autolysis. Early removal of biomaterial favorably affects the viability of RPE cells, provided that the eyeballs are in a nutrient medium at a low temperature. Under these conditions, eye treatment time can be delayed up to 24 hours.
Использование диссоциирующего раствора Хенкс-ЭДТА без этапа трипсинизации обеспечивает получение большего в 2-3 раза количества жизнеспособных клеток и упрощает процесс. ЭДТА, связывая ионы кальция, блокирует действие кадгеринов, опосредующих клеточную адгезию. Таким образом, ЭДТА, нарушая адгезивные контакты, способствует разрушению эпителиального монослоя, не влияя на жизнеспособность клеток. Больший выход клеток РПЭ связан с отсутствием необходимости отмывки от фермента, на котором происходит потеря клеток.The use of Hanks-EDTA dissociating solution without the trypsinization step provides a 2-3 times larger number of viable cells and simplifies the process. EDTA, binding calcium ions, blocks the action of cadherins that mediate cell adhesion. Thus, EDTA, disrupting adhesive contacts, contributes to the destruction of the epithelial monolayer, without affecting cell viability. A greater yield of RPE cells is associated with the absence of the need for washing from the enzyme at which cell loss occurs.
Инкубирование культуры более 2 дней после посадки на пластик способствует прикреплению популяции клеток с более низкими адгезивными свойствами. Это обеспечивает более быструю пролиферацию клеток, получение достаточного количества клеток на первичном этапе и получение популяции клеток с менее дифференцированными свойствами.Incubation of the culture for more than 2 days after planting on plastic promotes the attachment of a population of cells with lower adhesive properties. This provides faster cell proliferation, obtaining a sufficient number of cells at the initial stage and obtaining a population of cells with less differentiated properties.
Скорость пролиферации клеток РПЭ в культуре и время достижения конфлюэнтного монослоя целевого продукта (дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия глаза взрослого человека) зависит не только от возраста донора, причины смерти, времени после смерти, но и от обогащения ростовой среды сывороткой и добавления в нее нейральной добавки и ростовых факторов, стимулирующих пролиферацию и миграцию клеток.The rate of proliferation of RPE cells in culture and the time to reach the confluent monolayer of the target product (dedifferentiated cells of the retinal pigment epithelium of an adult eye) depends not only on the age of the donor, the cause of death, time after death, but also on the enrichment of the growth medium with serum and the addition of a neural supplement and growth factors stimulating cell proliferation and migration.
При инкубировании в обогащенной ростовой среде, содержащей высокий процент сыворотки, нейральную добавку и ростовые факторы, конфлюэнтный монослой можно ожидать на 2-3 недели раньше, чем при инкубировании в ростовой среде с низким содержанием 5-10% сыворотки без факторов.When incubated in an enriched growth medium containing a high percentage of serum, a neural supplement and growth factors, a confluent monolayer can be expected 2-3 weeks earlier than when incubated in a growth medium with a low content of 5-10% serum without factors.
Клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ) были выделены следующим образом.Retinal pigment epithelial cells (RPE) were isolated as follows.
Клетки РПЭ были выделены из аутопсийного материала (глазных яблок), полученных из судебного морга от доноров с неизвестным офтальмологическим анамнезом. Энуклеацию глаз производили в срок до 24 часов после смерти донора. Глазные яблоки транспортировали в научную лабораторию в стерильной ростовой среде с антибиотиком: 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 5 мл р-ра Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Cat. № P0781) в контейнере при +4°С. Обработку глазных яблок осуществляли в стерильных условиях под ламинарным шкафом через 24-48 часов после смерти донора. Процедуру выделения РПЭ выполняли на льду, используя холодные растворы. Глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком (на 500 мл раствора Хэнкса 5 мл антибиотика). Стерильными ножницами освобождали глазные яблоки от окружающих тканей. Затем глазные яблоки промывали в спиртовом растворе с нисходящей концентрацией 70°, 50°, 30° в течение 1-2 мин при каждой концентрации перенося каждый раз в новую 50 мл-центрифужную пробирку. Далее для отмывки от спиртового раствора глазные яблоки помещали в раствор Хэнкса с антибиотиком и промывали 2-3 раза. В качестве антибиотика используют 100 U/ml пенициллина и 100 U/ml стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl). После промывки глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком. Скальпелем протыкали склеру, отступив от радужки латеральнее на 0,5-0,7 см позади зубчатой линии, ориентиром которой при обычном освещении служит граница между темным и светлым участками. Склеру с подлежащими тканями разрезали офтальмологическими ножницами по окружности глазного яблока. Передний сегмент глаза удаляли. В заднем сегменте глаза пинцетом и препаровальной иглой отделяли нейральную сетчатку и стекловидное тело от РПЭ и удаляли, подрезая ножницами нейральную сетчатку в области зрительного нерва. Серологической пипеткой наполняли глазную чашу холодным раствором Хэнкса-ЭДТА и инкубировали 15-30 минут. В течение изоляционной процедуры глазные чаши находились на льду в растворе Хэнкса с антибиотиком. Клетки РПЭ собирали пипеткой с объемом наконечника 200µl. Контролируя процесс под бинокулярной лупой, наконечником проводили по слою и одновременно засасывали клетки, отделившиеся от мембраны Бруха. Способ забора ретинального ПЭ из глазной чаши взрослого человека с помощью 200µl наконечника облегчает процесс отделения клеток от мембраны Бруха и снижает процент потери клеток на этапе их выделения. Клетки вместе с раствором Хэнкса-ЭДТА (на 1 литр дистиллированной воды 9,5 г порошка Хэнкса, 3,75 г ЭДТА и 0,35 г. Бикарбоната натрия (4,7 мл 7,5% w/v) извлекали из глазной чаши, переносили в стерильную пробирку, содержащую ростовую среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Саl. № 06421, USA); 2 mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл FBS (10%) (Fetal Bovine Serum, HyClone, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Саt. № Р0781), пипетировали (механическая диссоциация клеток) и центрифугировали в течение 5-7 мин при 800 об/мин до осаждения клеток. Далее выделенные клетки РПЭ ресуспендировали в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, содержащей 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл 20% FBS (HyClone, USA); добавку В27 (1:100, Invitrogen, USA); 20 нг/мл FGF-2 (Sigma, USA); 20нг/мл EGF (Sigma, USA); 2 мкг/мл гепарина (Sigma, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Саt. № Р0781). В зависимости от образовавшегося осадка клетки РПЭ из первого глазного яблока равномерно распределяли в 1-2 стерильных пластиковых флаконах площадью 25 см2 и на поверхности 7 вкладышей в 24-луночных платах (Falcon, Greiner, Germany) для дальнейшей иммуноцитохимической (ИЦХ) оценки.RPE cells were isolated from autopsy material (eyeballs) obtained from a court mortuary from donors with an unknown ophthalmological history. Eye enucleation was performed up to 24 hours after the death of the donor. Eyeballs were transported to a science laboratory in a sterile growth medium with an antibiotic: 500 ml of DMEM / F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. No. D6421, USA); 5 ml of Penicillin-streptomycin solution (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Cat. No. P0781) in a container at + 4 ° C. Eyeballs were treated under sterile conditions under a laminar cabinet 24-48 hours after the donor's death. The RPE isolation procedure was performed on ice using cold solutions. Eyeballs were placed in a Petri dish with a diameter of 90-100 mm containing Hanks solution with antibiotic (500 ml of
Процесс инкубирования проводили при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СО2.The incubation process was carried out at 37 ° C, air humidity 95%, in an atmosphere of 5% CO 2 .
В таблице приведены различные условия выделения и инкубирования клеток РПЭ.The table shows the various conditions for the isolation and incubation of RPE cells.
Предложенный способ характеризуется следующими примерами и иллюстрируется на фиг.1, фиг.2, фиг.3 и фиг.4.The proposed method is characterized by the following examples and is illustrated in figure 1, figure 2, figure 3 and figure 4.
Пример 1.Example 1
Культура РПЭ донора №1.RPE culture of donor No. 1.
Мужчина, 50 лет. Диагноз: Отравление этиловым спиртом. Энуклеация глаз - время после смерти, часы: 24. Обработка глазных яблок - время после смерти, часы: 31.Male, 50 years old. Diagnosis: Ethanol poisoning. Eye enucleation - time after death, hours: 24. Eyeball processing - time after death, hours: 31.
Выделение клеток РПЭ из первого глазного яблока осуществляли следующим образом.The selection of RPE cells from the first eyeball was carried out as follows.
Клетки РПЭ были выделены из аутопсийного материала (глазных яблок), полученных из судебного морга от доноров с неизвестным офтальмологическим анамнезом. Энуклеацию глаз производили через 24 часа после смерти донора. Глазные яблоки доставляли в научную лабораторию в стерильной ростовой среде с антибиотиком для транспортировки глазных яблок, состоящей из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Саt. № 06421, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Cat. № P078 1) в контейнере (в 50 мл-центрифужной пробирке) при +4°С. Обработку глазных яблок осуществляли в стерильных условиях под ламинарным шкафом через 31 час после смерти доноров. Процедуру выделения РПЭ выполняли на льду, используя холодные растворы. Глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком. Стерильными ножницами освобождали глазные яблоки от окружающих тканей. Затем глазные яблоки промывали спиртовым раствором с нисходящей концентрацией 70°, 50°, 30° в течение 1 мин при каждой концентрации, перенося каждый раз в новую 50-мл центрифужную пробирку. Далее для отмывки от спирта глазные яблоки помещали в раствор Хэнкса с антибиотиком и промывали 2 раза. После промывки глазные яблоки помещали в чашку Петри диаметром 90-100 мм, содержащую раствор Хэнкса с антибиотиком. Скальпелем протыкали склеру, отступив от радужки латеральнее на 0,5-0,7 см позади зубчатой линии, ориентиром которой при обычном освещении служит граница между темным и светлым участками. Склеру с подлежащими тканями разрезали офтальмологическими ножницами по окружности глазного яблока. Передний сегмент глаза удаляли. В заднем сегменте глаза пинцетом и препаровальной иглой отделяли нейральную сетчатку и стекловидное тело от РПЭ и удаляли, подрезая ножницами нейральную сетчатку в области зрительного нерва. Серологической пипеткой наполняли глазную чашу холодным раствором Хэнкса-ЭДТА и инкубировали 20 мин. В течение изоляционной процедуры глазные чаши находились на льду в растворе Хэнкса с антибиотиком. Клетки РПЭ собирали пипеткой с объемом наконечника 200µl. Контролируя процесс под бинокулярной лупой, наконечником проводили по слою и одновременно засасывали клетки, отделившиеся от мембраны Бруха. Клетки вместе с раствором Хэнкса-ЭДТА извлекали из глазной чаши, переносили в стерильную пробирку, содержащую ростовую среду для выделения, состоящую из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл FBS (10%) (Fetal Bovine Serum, HyClone, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Саt. № Р0781), пипетировали (механическая диссоциация клеток) и центрифугировали в течение 5 мин при 800 об/мин, до осаждения клеток.RPE cells were isolated from autopsy material (eyeballs) obtained from a court mortuary from donors with an unknown ophthalmological history. Eye enucleation was performed 24 hours after the death of the donor. Eyeballs were delivered to a science lab in a sterile growth medium with an antibiotic for transporting eyeballs containing 500 ml of DMEM / F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. No. 06421, USA); 5 ml of Penicillin-streptomycin solution (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Cat. No. P078 1) in a container (in a 50 ml centrifuge tube) at + 4 ° С. Eyeballs were treated under sterile conditions under a laminar cabinet 31 hours after the death of donors. The RPE isolation procedure was performed on ice using cold solutions. Eyeballs were placed in a Petri dish with a diameter of 90-100 mm, containing a Hanks solution with an antibiotic. Sterile scissors freed the eyeballs from the surrounding tissue. Then, the eyeballs were washed with an alcohol solution with a descending concentration of 70 °, 50 °, 30 ° for 1 min at each concentration, each time transferring to a new 50-ml centrifuge tube. Further, for washing off alcohol, the eyeballs were placed in a Hanks solution with an antibiotic and washed 2 times. After washing, the eyeballs were placed in a Petri dish with a diameter of 90-100 mm containing a Hanks solution with an antibiotic. They pierced the sclera with a scalpel, departing from the iris laterally 0.5-0.7 cm behind the dentate line, which, under normal lighting, serves as the boundary between the dark and light areas. The sclera with the underlying tissues was cut with ophthalmic scissors around the circumference of the eyeball. The anterior segment of the eye was removed. In the posterior segment of the eye, the neural retina and vitreous were separated from the RPE with tweezers and a dissecting needle and removed by cutting with a pair of scissors the neural retina in the optic nerve. A serological pipette was used to fill the eye cup with a cold Hanks-EDTA solution and incubate for 20 minutes. During the isolation procedure, the eye cups were on ice in a Hanks antibiotic solution. RPE cells were harvested with a pipette with a tip volume of 200 µl. Controlling the process under a binocular magnifier, the tip was drawn through the layer and at the same time cells that separated from Bruch's membrane were aspirated. Cells along with Hanks-EDTA solution were removed from the eye cup and transferred to a sterile tube containing growth isolation medium consisting of 500 ml of DMEM / F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. No. D6421 , USA); 2mM L-Glutamine (Sigma, USA); 50 ml FBS (10%) (Fetal Bovine Serum, HyClone, USA); 5 ml of Penicillin-streptomycin solution (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% Nad, Sigma, Cat. No. P0781) were pipetted (mechanical dissociation of cells) and centrifuged for 5 min at 800 rpm until cell precipitation .
Выделенные клетки РПЭ ресуспендировали в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки, состоящей из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Саt. № 6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 20% FBS (HyClone, USA); добавка В27 (1:100, Invitrogen, USA); 20 нг/мл FGF-2 (Sigma, USA); 20 нг/мл EGF (Sigma, USA); 2 мкг/мл гепарина (Sigma, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Саt. № Р0781). Культуры инкубировали при 37°С, влажности воздуха 95%, в атмосфере 5% СO2.The isolated RPE cells were resuspended in a high serum growth medium consisting of 500 ml of DMEM / F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. No. 6421, USA); 2mM L-Glutamine (Sigma, USA); 20% FBS (HyClone, USA); additive B27 (1: 100, Invitrogen, USA); 20 ng / ml FGF-2 (Sigma, USA); 20 ng / ml EGF (Sigma, USA); 2 μg / ml heparin (Sigma, USA); 5 ml Penicillin-streptomycin solution (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Cat. No. P0781). The cultures were incubated at 37 ° C, 95% humidity, in an atmosphere of 5% CO 2 .
Выделение клеток РПЭ из второго глазного яблока осуществляли так же, но с дополнением: на этапе инкубирования использовали трипсин 0,125% (Sigma, USA), инкубирование вели в течение 3 мин.The isolation of RPE cells from the second eyeball was carried out in the same way, but with the addition of 0.15% trypsin (Sigma, USA) was used at the incubation stage, incubation was carried out for 3 min.
Свежевыделенные эксплантаты РПЭ из обоих глазных яблок состояли из небольших кластеров и единичных полигональной формы, крупных, сильно пигментированных эпителиоидных клеток,The freshly isolated RPE explants from both eyeballs consisted of small clusters and single polygonal shapes, large, highly pigmented epithelioid cells,
Прикрепление кусочков и распластывание клеток РПЭ из первого глазного яблока наблюдалось уже на следующий день, тенденция клеток к образованию монослоя наблюдалось через 1 неделю от начала культивирования, а конфлюэнтный монослой был достигнут через 2 недели. Прикрепление и колониеобразование клеток РПЭ из второго глазного яблока отсрочивалось, по сравнению с первым глазным яблоком, на 3 дня, конфлюэнтная монослойная культура была образована через 1 месяц от начала инкубирования.The attachment of the pieces and the spreading of RPE cells from the first eyeball was observed the very next day, the tendency of the cells to form a monolayer was observed 1 week after the start of cultivation, and the confluent monolayer was achieved after 2 weeks. The attachment and colony formation of RPE cells from the second eyeball was delayed, compared with the first eyeball, by 3 days, a confluent monolayer culture was formed 1 month after the start of incubation.
Замедление пролиферации клеток РПЭ из второго глазного яблока было связано с повреждающим действием трипсина.Slowing of the proliferation of RPE cells from the second eyeball was associated with the damaging effect of trypsin.
Клетки РПЭ, полученные при выделении и ресуспендировании в ростовой среде с высоким содержание сыворотки из первого глазного яблока, были равномерно распределены на культуральной поверхности - в 2 стерильных пластиковых культуральных флаконах M1 и М2 площадью 25 см2 каждый.RPE cells obtained by isolation and resuspension in a growth medium with a high serum content from the first eyeball were evenly distributed on the culture surface in 2 sterile plastic culture bottles M1 and M2 with an area of 25 cm 2 each.
Клетки в M1 и М2 прикреплялись и начинали делиться и в течение 5 дней создавали сильно пигментированные первичные колонии. Распластанные крупные клетки делались плоскими и полигональными, с гранулами пигмента, собранными группками вокруг выступающего ядра, содержащего 1 или 2 ядрышка. Цитоплазма на периферии тонкая и относительно прозрачная с резко очерченными межклеточными границами. Делящиеся клетки становились мельче, депигментировались, некоторые из них приобретали веретенообразную форму.Cells in M1 and M2 adhered and began to divide, and within 5 days they created highly pigmented primary colonies. Flattened large cells were made flat and polygonal, with pigment granules collected in groups around a protruding nucleus containing 1 or 2 nucleoli. The cytoplasm at the periphery is thin and relatively transparent with sharply defined intercellular borders. The dividing cells became smaller, depigmented, some of them acquired a fusiform shape.
Образование конфлюэнтного монослоя было достигнуто через 16 дней от распределения на культуральной поверхности (посадки). Через 5 дней после посадки в M1 и М2 была произведена первая смена среды. Аспирированная ростовая среда с M1 и М2 со всей взвесью, состоящей из неприкрепившихся клеток, так называемый «детрит», была распределена на свежей культуральной поверхности - перенесена в стерильные культуральные пластиковые флаконы М3 и М4, в которых через 3 дня после переноса отмечалось прикрепление клеток и образование колоний, а через 2 недели - рост колоний и образование конфлюэнтного монослоя. Через 3 дня после переноса удаленной ростовой среды в М3 и М4 была проведена смена среды. Удаляемая ростовая среда из М3 и М4 со всей взвесью, состоящей из неприкрепившихся клеток, была объединена и перенесена на новую свежую культуральную поверхность - в стерильный культуральный пластиковый флакон М5, в котором через 4 дня была проведена смена среды. В М5 отмечались большие пролиферирующие эпителиоподобные колонии, а через 17 дней - конфлюэнтный монослой. Таким образом, клетки РПЭ от момента их выделения, перенесенные в М5, находились без смены ростовой среды 12 дней, при этом они не только сохраняли свою жизнеспособность, но и прикреплялись к пластику, распластывались и пролиферировали.The formation of a confluent monolayer was achieved after 16 days from distribution on the culture surface (planting). 5 days after landing in M1 and M2, the first medium change was made. The aspirated growth medium with M1 and M2, with the whole suspension consisting of non-adherent cells, the so-called “detritus”, was distributed on a fresh culture surface — transferred to sterile plastic culture bottles M3 and M4, in which 3 days after the transfer, cell attachment was noted and colony formation, and after 2 weeks - colony growth and the formation of a confluent monolayer. 3 days after the transfer of the removed growth medium to M3 and M4, the medium was changed. The removable growth medium from M3 and M4 with the whole suspension consisting of non-adherent cells was combined and transferred to a new fresh culture surface - into a sterile plastic culture bottle M5, in which after 4 days the medium was changed. In M5, large proliferating epithelial-like colonies were noted, and after 17 days - a confluent monolayer. Thus, from the moment of their isolation, RPE cells transferred to M5 were without changing the growth medium for 12 days, while they not only retained their viability, but also attached to the plastic, spread out and proliferated.
На фиг.1 и фиг.2 приведены общие схемы инкубирования клеток РПЭ до достижения конфлюэнтного монослоя.Figure 1 and figure 2 shows the General scheme of incubation of RPE cells to achieve a confluent monolayer.
При подсчете клеток в камере Горяева количество клеток в конфлюэнтной культуре первого глаза составило: M1 ≈ 4 млн кл., М2 ≈ 4,2 млн кл., М3 ≈ 3,5 млн кл, М4 ≈ 3,2 млн кл, М5 ≈ 3 млн кл.When counting cells in the Goryaev’s chamber, the number of cells in the confluent culture of the first eye was: M1 ≈ 4 million cells, M2 ≈ 4.2 million cells, M3 ≈ 3.5 million cells, M4 ≈ 3.2 million cells, M5 ≈ 3 million cells
Таким образом, из первого глаза приблизительно через один месяц от начала инкубирования было получено ≈ 17,9 млн клетокThus, approximately one month after the start of incubation, ≈ 17.9 million cells were obtained from the first eye
Пример 2.Example 2
Культура РПЭ донора №2.RPE culture of donor No. 2.
Мужчина, 51 год. Диагноз: Отравление алкоголем. Энуклеации глаз - время после смерти, часы: 21. Обработка глазных яблок - время после смерти, часы: 26.Man, 51 years old. Diagnosis: alcohol poisoning. Enucleation of the eyes - time after death, hours: 21. Processing of eyeballs - time after death, hours: 26.
Выделение и ресуспендирование клеток РПЭ из первого глазного яблока осуществляли по примеру 1 для первого глазного яблока. Выделении РПЭ из второго глазного яблока осуществляли по примеру 1 для первого глазного яблока с ресуспендированием клеточного осадка в ростовой среде состава с низким содержанием сыворотки, состоящей из 500 мл среды DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. № D6421, USA); 2mM L-глутамина (Sigma, USA); 50 мл 10% FBS (HyClone, USA); 5 мл раствора Пенициллина-стрептомицина (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Саt. № Р0781).The selection and resuspension of RPE cells from the first eyeball was carried out according to example 1 for the first eyeball. Isolation of RPE from the second eyeball was carried out according to Example 1 for the first eyeball with resuspension of the cell pellet in the growth medium of a low serum composition consisting of 500 ml of DMEM / F12 medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium / Nutrient Mixture F-12 Ham, Sigma, Cat. No. D6421, USA); 2mM L-Glutamine (Sigma, USA); 50 ml of 10% FBS (HyClone, USA); 5 ml Penicillin-streptomycin solution (10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL in 0.9% NaCl, Sigma, Cat. No. P0781).
Свежевыделенные эксплантаты РПЭ из обоих глазных яблок состояли из небольших кластеров и единичных полигональной формы, крупных сильно пигментированных эпителиоидных клеток. В результате выделения клеток РПЭ из первого глазного яблока прикрепление кусочков и распластывание клеток наблюдалась уже на следующий день, образование конфлюэнтного монослоя наблюдалось через 12 дней от начала инкубирования, а конфлюэнт был достигнут через 19 дней от посадки (фиг.3). В результате выделения клеток РПЭ из второго глазного яблока прикрепление и колониеобразование отсрочивалось, по сравнению с первым глазным яблоком, на 3 дня, конфлюэнтная монослойная культура была образована через 1,5 мес от начала инкубирования.The freshly isolated RPE explants from both eyeballs consisted of small clusters and single polygonal shapes, large heavily pigmented epithelioid cells. As a result of the isolation of RPE cells from the first eyeball, the attachment of the pieces and the spreading of the cells was observed the next day, the formation of a confluent monolayer was observed 12 days after the start of incubation, and the confluent was reached 19 days after planting (Fig. 3). As a result of the isolation of RPE cells from the second eyeball, attachment and colony formation was delayed, compared with the first eyeball, by 3 days, a confluent monolayer culture was formed 1.5 months after the start of incubation.
Пример 3.Example 3
Культура РПЭ донора №3.RPE culture of donor No. 3.
Мужчина, 32 года. Диагноз: Кардиомиопатия. ОСН. Энуклеации глаз - время после смерти, часы: 25. Обработка глазных яблок - время после смерти, часы; первый глаз - 28, второй глаз - 48.Man, 32 years old. Diagnosis: Cardiomyopathy. DOS. Enucleation of the eyes - time after death, hours: 25. Processing of eyeballs - time after death, hours; the first eye is 28, the second eye is 48.
Выделение РПЭ из первого и второго глазных яблок осуществляли способом, описанным в примере 1, с ресуспендированием клеточного осадка в ростовой среде с высоким содержанием сыворотки. Свежевыделенные эксплантаты РПЭ из обоих глазных яблок состояли из небольших кластеров и единичных полигональной формы, крупных сильно пигментированных эпителиоидных клеток. Прикрепление кусочков и распластывание клеток РПЭ из обоих глазных яблок наблюдалось уже на следующий день. Клетки РПЭ из обоих глазных яблок начинали делиться и создавали сильно пигментированные первичные колонии в течение 3-5 дней после прикрепления к пластику. Распластанные крупные клетки делались плоскими и полигональными, с гранулами пигмента, собранными группками вокруг выступающего ядра. Делящиеся клетки становились мельче, депигментировались.The separation of RPE from the first and second eyeballs was carried out by the method described in example 1, with the resuspension of cell sediment in a growth medium with a high serum content. The freshly isolated RPE explants from both eyeballs consisted of small clusters and single polygonal shapes, large heavily pigmented epithelioid cells. The attachment of pieces and the spreading of RPE cells from both eyeballs was observed the very next day. RPE cells from both eyeballs began to divide and created highly pigmented primary colonies within 3-5 days after attachment to the plastic. Spread out large cells were made flat and polygonal, with pigment granules collected in groups around the protruding nucleus. Dividing cells became smaller, depigmented.
Тенденция клеток к достижению конфлюэнтного монослоя из обоих глазных яблок наблюдалась через 1 неделю от начала посадки, а конфлюэнтный монослой был достигнут из первого глазного яблока - через 14 дней от посадки, из второго глазного яблока - через 10 дней от посадки.The tendency of cells to achieve a confluent monolayer from both eyeballs was observed 1 week after the start of planting, and the confluent monolayer was reached from the
Клетки РПЭ из второго глазного яблока были неравномерно распределены в двух стерильных культуральных пластиковых флаконах площадью 25 см2 каждый: в первый флакон было высажено основное количество клеток, во второй флакон - небольшое количество клеток, примерно составившее 1/10 часть от количества клеток, высаженных в первый флакон. В первом флаконе клеточная культура носила эпителиоподобный характер, эпителиальные клетки располагались по типу «булыжной мостовой». Во втором флаконе с изначально небольшим количеством клеток прикрепление и колониеобразование отсрочивалось, по сравнению с клетками в первом флаконе, на 6 дней, конфлюэнтная культура была образована через 20 дней от начала инкубирования. Причем в культуре преобладали клетки веретенообразной формы, образующие на поверхности сфероподобные структуры (фиг.4).RPE cells from the second eyeball were unevenly distributed in two sterile plastic culture bottles of 25 cm 2 each: the main number of cells was planted in the first bottle, a small number of cells in the second bottle, approximately 1/10 of the number of cells planted in first bottle. In the first vial, the cell culture was epithelial-like in nature, epithelial cells were located on the type of “cobblestone pavement”. In the second vial with an initially small number of cells, attachment and colony formation was delayed, compared with the cells in the first vial, for 6 days, a confluent culture was formed 20 days after the start of incubation. Moreover, the culture was dominated by spindle-shaped cells forming spherical structures on the surface (Fig. 4).
Таким образом, выход клеток в монослойную культуру зависит также от плотности посадки во флаконы.Thus, the release of cells into a monolayer culture also depends on the density of planting in vials.
Известно, что плотность колоний достигает до 25-50% культуральной поверхности в течение 14-28 дней.It is known that the density of the colonies reaches up to 25-50% of the culture surface within 14-28 days.
По предлагаемому изобретению плотность колоний достигает 75-90% культуральной поверхности в течение 14-20 дней.According to the invention, the density of the colonies reaches 75-90% of the culture surface within 14-20 days.
Способ позволяет достичь прикрепления популяции клеток с низкими адгезивными свойствами, это обеспечивает более быструю пролиферацию клеток, получение достаточного количества клеток на первичном этапе и получение популяции клеток с менее дифференцированными свойствами. Таким образом, предложенный способ позволяет получить большое количество жизнеспособных дедифференцированных клеток ретинального пигментного эпителия.The method allows to achieve the attachment of a population of cells with low adhesive properties, this provides faster cell proliferation, obtaining a sufficient number of cells at the initial stage and obtaining a population of cells with less differentiated properties. Thus, the proposed method allows to obtain a large number of viable dedifferentiated cells of the retinal pigment epithelium.
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009137876/10A RU2409663C1 (en) | 2009-10-14 | 2009-10-14 | Method for producing dedifferentiated cells of adult retinal pigment eye epithelium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009137876/10A RU2409663C1 (en) | 2009-10-14 | 2009-10-14 | Method for producing dedifferentiated cells of adult retinal pigment eye epithelium |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2409663C1 true RU2409663C1 (en) | 2011-01-20 |
Family
ID=46307671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009137876/10A RU2409663C1 (en) | 2009-10-14 | 2009-10-14 | Method for producing dedifferentiated cells of adult retinal pigment eye epithelium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2409663C1 (en) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2464783C1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-10-27 | Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method of isolation and fixation of cells of retinal pigment epithelium of numan corpse eyes |
| RU2486603C1 (en) * | 2012-04-11 | 2013-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Method for simulating tissue structure of human retina |
| RU2569481C1 (en) * | 2014-12-25 | 2015-11-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for producing cell culture of retinal pigment epithelium from adult cadaver donor's eye |
| RU2578526C1 (en) * | 2014-12-25 | 2016-03-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of producing organ culture choroidal-pigment complex from adult cadaver donor's eye |
| RU2729937C1 (en) * | 2019-11-15 | 2020-08-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) | Method of subretinal transplantation of retinal pigment epithelium (rpe) cells differentiated from human induced pluripotent stem cells, with atrophy of retinal pigment epithelium in experiment |
| RU2809003C2 (en) * | 2018-09-27 | 2023-12-05 | Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния | Methods of isolating and cultivating human retinal progenitor cells |
-
2009
- 2009-10-14 RU RU2009137876/10A patent/RU2409663C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SONODA S. Et al., «A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells», Nature Protocols, 2009, v.4, p.662-673. * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2464783C1 (en) * | 2011-06-17 | 2012-10-27 | Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" | Method of isolation and fixation of cells of retinal pigment epithelium of numan corpse eyes |
| RU2486603C1 (en) * | 2012-04-11 | 2013-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) | Method for simulating tissue structure of human retina |
| RU2569481C1 (en) * | 2014-12-25 | 2015-11-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method for producing cell culture of retinal pigment epithelium from adult cadaver donor's eye |
| RU2578526C1 (en) * | 2014-12-25 | 2016-03-27 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of producing organ culture choroidal-pigment complex from adult cadaver donor's eye |
| RU2809003C2 (en) * | 2018-09-27 | 2023-12-05 | Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния | Methods of isolating and cultivating human retinal progenitor cells |
| RU2729937C1 (en) * | 2019-11-15 | 2020-08-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) | Method of subretinal transplantation of retinal pigment epithelium (rpe) cells differentiated from human induced pluripotent stem cells, with atrophy of retinal pigment epithelium in experiment |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1261357B1 (en) | Isolation and transplantation of retinal stem cells | |
| JP5409359B2 (en) | Cell isolation method, cell-free serum-free culture medium, and cell culture method | |
| US8338175B2 (en) | Conjunctival tissue system | |
| CN106167790B (en) | The method that human embryo stem cell for directional is induced to differentiate into endothelial cell | |
| AU2001234998A1 (en) | Isolation and transplantation of retinal stem cells | |
| US20200239842A1 (en) | Preparation and Expansion Methods for Human Pluripotent Stem Cell-Derived Human Retinal Pigment Epithelial Cells | |
| RU2409663C1 (en) | Method for producing dedifferentiated cells of adult retinal pigment eye epithelium | |
| Insler et al. | Heterologous transplantation versus enhancement of human corneal endothelium | |
| CN102899285A (en) | Method for differentiation of embryonic stem cells into nerve cells through in vitro induction | |
| EP1812560A1 (en) | Retina-specific cells differentiated in vitro from bone marrow stem cells, the production thereof and their use | |
| CN111088229B (en) | Preparation method of retina precursor cells derived from human pluripotent stem cells | |
| US20090047738A1 (en) | Feeder cell derived from tissue stem cell | |
| JP2022502047A (en) | Methods of isolation and culture of human retinal progenitor cells | |
| RU2809003C2 (en) | Methods of isolating and cultivating human retinal progenitor cells | |
| US11981919B2 (en) | Methods for forming three-dimensional human retinal tissue in vitro | |
| CN111164205B (en) | Cell aggregate comprising retinal tissue and method for producing same | |
| AU2018102120A4 (en) | Preparation and expansion methods for human pluripotent stem cell-derived human retinal pigment epithelial cells | |
| Fang et al. | Application of adipose-derived stem cells to observe the morphological changes by induction with decellularized corneal extracellular matrix and specified medium | |
| Fronk | Methods for Growing Retinal Pigment Epithelial Cells: Current Protocols and Future Recommendations | |
| Zhang et al. | Differentiation of human epidermis-derived mesenchymal stem cell-like pluripotent cells into neural-like cells in culture and after transplantation | |
| K Srivastava et al. | Basement Membrane Promotes Ciliary Body Derived Cell Spheres Formation | |
| Кавеліна | Creation of cornea biograft | |
| Stewart | Identification of progenitor cell-rich sites of the conjunctiva | |
| Giasson et al. | Optimization of culture conditions for porcine corneal endothelial cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20170614 |