RU2806021C2 - Compositions and methods for internalization of enzymes - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: composition for use in the treatment of lysosomal storage diseases, containing a polynucleotide encoding a multidomain therapeutic protein containing a delivery domain and an enzymatic domain, and a pharmaceutically acceptable carrier. In one embodiment, the delivery domain binds to an internalization effector, the internalization effector being CD63.

EFFECT: expanding the scope of drugs for the treatment of lysosomal storage diseases.

15 cl, 17 dwg, 18 tbl, 9 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[1] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(e) по предварительным заявкам на патент США № 62/673098, поданной 17 мая 2018 г.; № 62/574719, поданной 19 октября 2017 г.; и № 62/516656, поданной 7 июня 2017 г.; каждая из которых включена в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.[1] This application claims priority under 35 U.S.C. § 119(e) under U.S. Provisional Patent Applications No. 62/673,098, filed May 17, 2018; No. 62/574719, filed October 19, 2017; and No. 62/516656, filed June 7, 2017; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТНИЕTECHNICAL FIELD TO WHICH THE PRESENT INVENTION RELATES

[2] Настоящая заявка в целом относится к композициям и способам для лечения лизосомных болезней накопления. В частности, настоящая заявка относится к целевым белковым комплексам, которые содержат заместительные ферменты, и к их применению в лечении лизосомных болезней накопления.[2] This application generally relates to compositions and methods for treating lysosomal storage diseases. In particular, the present application relates to targeted protein complexes that contain replacement enzymes and their use in the treatment of lysosomal storage diseases.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

[3] Лизосомные болезни накопления составляют класс редких заболеваний, которые влияют на разрушение многочисленных субстратов в лизосоме. Такие субстраты включают в себя сфинголипиды, мукополисахариды, гликопротеины, гликоген и олигосахариды, которые могут накапливаться в клетках больных, что приводит к гибели клеток. Органы, поражаемые лизосомными болезнями накопления, включают в себя центральную нервную систему (CNS), периферическую нервную систему (PNS), легкие, печень, кость, скелетную и сердечную мускулатуру и высокоинтеллектуальную систему.[3] Lysosomal storage diseases constitute a class of rare diseases that affect the destruction of multiple substrates in the lysosome. Such substrates include sphingolipids, mucopolysaccharides, glycoproteins, glycogen, and oligosaccharides, which can accumulate in diseased cells, leading to cell death. Organs affected by lysosomal storage diseases include the central nervous system (CNS), peripheral nervous system (PNS), lungs, liver, bone, skeletal and cardiac muscles, and the highly intelligent system.

[4] Варианты лечения лизосомных болезней накопления включают заместительную ферментную терапию (ERT), субстрат-редуцирующую терапию, фармакологическую шаперон-опосредованную терапию, терапию с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток и генную терапию. Пример субстрат-редуцирующей терапии включает в себя применение миглустата или элиглустата для лечения болезнь Гоше 1 типа. Эти лекарственные средства действуют путем блокирования активности синтазы, что снижает последующее продуцирование субстрата. Терапию с использованием гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), например, используют для облегчения и замедления негативного фенотипа центральной нервной системы у пациентов с некоторыми формами MPS. См. R.M. Boustany, «Lysosomal storage diseases--the horizon expands», 9(10) Nat. Rev. Neurol. 583-98, Oct. 2013. В таблице 1 приводятся некоторые лизосомные болезни накопления и ассоциированные с ними ферменты или другие белки.[4] Treatment options for lysosomal storage diseases include enzyme replacement therapy (ERT), substrate-reducing therapy, pharmacological chaperone-mediated therapy, hematopoietic stem cell transplant therapy, and gene therapy. An example of substrate-reducing therapy includes the use of miglustat or eliglustat for the treatment of type 1 Gaucher disease. These drugs work by blocking synthase activity, which reduces subsequent substrate production. Hematopoietic stem cell therapy (HSCT), for example, is used to alleviate and slow the negative central nervous system phenotype in patients with some forms of MPS. See R.M. Boustany, “Lysosomal storage diseases—the horizon expands,” 9(10) Nat. Rev. Neurol. 583-98, Oct. 2013. Table 1 lists some lysosomal storage diseases and their associated enzymes or other proteins.

Таблица 1. Лизосомные болезни накопленияTable 1. Lysosomal storage diseases

КлассClass ЗаболеваниеDisease Вовлеченный фермент/белокEnzyme/protein involved СфинголипидозSphingolipidosis Болезнь ФабриFabry disease α-Галактозидаза Aα-Galactosidase A Липогранулематоз ФарбераFarber lipogranulomatosis ЦерамидазаCeramidase Болезнь Гоше I типаGaucher disease type I β-Глюкозидазаβ-Glucosidase Болезнь Гоше II и III типовGaucher disease types II and III Активатор сапозина-СSaposin-C activator Болезни Ниманна-Пика A и B типовNiemann-Pick diseases types A and B СфингомиелиназаSphingomyelinase GM1-ганглиозидозGM1 gangliosidosis β-Галактозидазаβ-Galactosidase GM2-ганглиозидоз (болезнь Сандхоффа)GM2 gangliosidosis (Sandhoff disease) β-Гексозаминидаза A и Bβ-Hexosaminidase A and B GM2-ганглиозидоз (болезнь Тея-Сакса)GM2 gangliosidosis (Tay-Sachs disease) β-Гексозаминидаза Aβ-Hexosaminidase A GM2-ганглиозидоз (дефицит GM2-активатора)GM2 gangliosidosis (GM2 activator deficiency) Белок GM2-активаторGM2 activator protein GM3-ганглиозидозGM3 gangliosidosis GM3-синтазаGM3 synthase Метахроматическая лейкодистрофияMetachromatic leukodystrophy Арилсульфатаза AArylsulfatase A Дефицит активатора сфинголипидаSphingolipid activator deficiency Активатор сфинголипидаSphingolipid activator Мукополи-сахаридозMucopolysaccharidosis MPS I (болезнь Шейе, Гурлера-Шейе и Гурлера)MPS I (Scheie, Hurler-Scheie and Hurler disease) α-Идуронидазаα-Iduronidase MPS II (болезнь Хантера)MPS II (Hunter disease) Идуронидаза-2-сульфатазаIduronidase-2-sulfatase MPS IIIA (болезнь Санфилиппо A типа)MPS IIIA (Sanfilippo disease type A) Гепаран-N-сульфатазаHeparan-N-sulfatase MPS IIIB (болезнь Санфилиппо B типа)MPS IIIB (Sanfilippo disease type B) N-ацетил-α-глюкозаминидазаN-acetyl-α-glucosaminidase MPS IIIC (болезнь Санфилиппо C типа)MPS IIIC (Sanfilippo disease type C) Ацетил-CoA; α-глюкозамид-N-ацетилтрансферазаAcetyl-CoA; α-glucosamide-N-acetyltransferase MPS IIID (болезнь Санфилиппо D)MPS IIID (Sanfilippo D disease) N-Ацетилглюкозамин-6-сульфатазаN-Acetylglucosamine-6-sulfatase MPS IVA (синдром Моркио А типа)MPS IVA (Morkio syndrome type A) N-Ацетилгалактозамин-6-сульфат-сульфатазаN-Acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase MPS IVB (синдром Моркио В типа)MPS IVB (Morkio syndrome type B) β-галактозидазаβ-galactosidase MPS VI (болезнь Марото-Лами)MPS VI (Maroteaux-Lamy disease) N-Ацетилгалактозамин-4-сульфатаза (арилсульфатаза B)N-Acetylgalactosamine-4-sulfatase (arylsulfatase B) MPS VII (болезнь Слая)MPS VII (Sly's disease) β-Глюкуронидазаβ-Glucuronidase MPS IXMPS IX ГиалуронидазаHyaluronidase Болезнь накопления гликогенаGlycogen storage disease Болезнь Помпе (болезнь накопления гликогена II типа)Pompe disease (type II glycogen storage disease) α-Глюкозидаза 2α-Glucosidase 2 Липидный метаболизмLipid metabolism Дефицит лизосомной кислой липазы (LAL-D; болезнь Вольмана) Lysosomal acid lipase deficiency (LAL-D; Wolman disease) Лизосомная кислая липазаLysosomal acid lipase

[5] Двумя наиболее распространенными LSD являются заболевание Помпе и заболевание Фабри. Болезнь Помпе, уровень заболеваемости которой, по оценкам, составляет 1 на 10000, вызывается дефектным лизосомным ферментом альфа-глюкозидазой (GAA), который приводит к недостаточному процессингу лизосомного гликогена. Накопление лизосомного гликогена происходит преимущественно в скелетной, сердечной и печеночной тканях. Ранняя манифестация болезнь Помпе вызывает кардиомегалию, гипотонию, гепатомегалию и смерть из-за кардиореспираторной недостаточности обычно в возрасте до 2 лет. Проявление болезни Помпе во взрослом возрасте наблюдается только от двадцати до шестидесяти лет и обычно затрагивает только скелетную мускулатуру. Доступные в настоящее время средства для лечения включают MYZZME®/LUMIZYME® (алглюкозидаза альфа) от Genzyme, который представляет собой рекомбинантную альфа-глюкозидазу человека, которую получают в клетках CHO, и которую вводят посредством внутривенной инфузии.[5] The two most common LSDs are Pompe disease and Fabry disease. Pompe disease, which has an estimated incidence of 1 in 10,000, is caused by a defective lysosomal enzyme alpha-glucosidase (GAA), which results in insufficient processing of lysosomal glycogen. The accumulation of lysosomal glycogen occurs predominantly in skeletal, cardiac and liver tissues. Early onset Pompe disease causes cardiomegaly, hypotension, hepatomegaly, and death due to cardiorespiratory failure, usually before age 2 years. The onset of Pompe disease in adulthood occurs only between the ages of twenty and sixty and usually affects only the skeletal muscles. Currently available treatments include MYZZME®/LUMIZYME® (alglucosidase alpha) from Genzyme, which is a recombinant human alpha-glucosidase produced in CHO cells and administered by intravenous infusion.

[6] Болезнь Фабри, общий уровень заболеваемости которой, включая легкие случаи с поздним началом, по оценкам, составляет 1 на 3000, вызывается дефектным лизосомным ферментом альфа-галактозидазой A (GLA), который приводит к накоплению глоботриаозилцерамида в кровеносных сосудах и других тканях и органах. Симптомы, ассоциированные с болезнью Фабри включают в себя боль из-за повреждения нерва и/или обструкции небольших сосудов, почечную недостаточность и полное разрушение, сердечные осложнения, такие как высокое кровяное давление и кардиомиопатия, дерматологические симптомы, такие как образование ангиокератомы, ангидроз или гипергидроз, а также глазные проблемы, такие как воронковидная кератопатия, клиновидная катаракта и сосудистые нарушения конъюктивы и сетчатки. Доступные в настоящее время средства для лечения включают FABRAZYME® (агалзидаза бета) от Genzyme, который представляет собой рекомбинантную альфа-галактозидазу А человека, которую получают в клетках СНО, и которую вводят посредством внутривенной инфузии; REPLAGAL™ (агалзидаза альфа) от Shire, который представляет собой рекомбинантную альфа-галактозидазу А человека, которую получают в клетках фибробластов человека, и которую вводят посредством внутривенной инфузии; и GALAFOLD™ (мигаластат или 1-дезоксигалактоноджиримицин) от Amicus, который представляет собой низкомолекулярный шаперон для перорального введения, который обеспечивает сдвиг фолдинга альфа-галактозидазы А от аномальной к функциональной конформации.[6] Fabry disease, whose overall incidence rate, including mild late-onset cases, is estimated to be 1 in 3000, is caused by a defective lysosomal enzyme alpha-galactosidase A (GLA), which leads to the accumulation of globotriaosylceramide in blood vessels and other tissues and organs Symptoms associated with Fabry disease include pain due to nerve damage and/or small vessel obstruction, kidney failure and complete destruction, cardiac complications such as high blood pressure and cardiomyopathy, dermatological symptoms such as angiokeratoma formation, anhidrosis or hyperhidrosis , as well as eye problems such as infundibular keratopathy, wedge-shaped cataracts and vascular disorders of the conjunctiva and retina. Currently available treatments include FABRAZYME® (agalsidase beta) from Genzyme, which is a recombinant human alpha-galactosidase A produced in CHO cells and administered by intravenous infusion; REPLAGAL™ (agalsidase alpha) from Shire, which is a recombinant human alpha-galactosidase A produced in human fibroblast cells and administered by intravenous infusion; and GALAFOLD™ (migalastat or 1-deoxygalactonojirimycin) from Amicus, which is an orally administered small molecule chaperone that promotes a fold shift of alpha-galactosidase A from an aberrant to a functional conformation.

[7] Текущие методы лечения лизосомных болезней накопления не особо оптимальны. Например, ERT, как правило, должна вводиться с высокой частотой и при высокой дозе, например, дважды в неделю и до 40 мг/кг. Также некоторые замещаемые ферменты могут быть иммунологически перекрестнореагирующими (CRIM), стимулирующими продуцирование IgG у субъекта и, таким образом, препятствующими доставке фермента в лизосому посредством манноза-6-фосфатного (M6P) рецептора. IgG может экранировать остатки M6P заместительный фермент, и комплекс антиген-IgG-антитело может попадать в клеточные лизосомы через Fc-рецептор с шунтированием тем самым заместительного фермента преимущественно в макрофаги.[7] Current treatments for lysosomal storage diseases are not particularly optimal. For example, ERT typically must be administered at a high frequency and at a high dose, such as twice weekly and up to 40 mg/kg. Also, some of the replaced enzymes may be cross-reacting immunologically (CRIM), stimulating the production of IgG in the subject and thus preventing the delivery of the enzyme to the lysosome through the mannose-6-phosphate (M6P) receptor. IgG can shield the residues of the M6P replacement enzyme, and the antigen-IgG-antibody complex can enter cellular lysosomes through the Fc receptor, thereby shunting the replacement enzyme predominantly into macrophages.

[8] Доставка заместительных ферментов в соответствующие пораженные ткани также неэффективна (см. таблицу 2 и Desnick & Schuchman, «Enzyme replacement therapy for lysosomal diseases: lessons from 20 years of experience and remaining challenges», 13 Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 307-35, 2012). Например, пациенты, подвергшиеся длительной заместительной ферментной терапии по поводу болезни Помпе во младенческом возрасте, все равно могут страдать гиперназальной речью, остаточной мышечной слабостью, птозом, остеопенией, потерей слуха, подвергаться риску аспирации, дисфагией, сердечной аритмией и затруднением при глотании. Дозы заместительного фермента часто должны увеличиваться со временем до 40 мг/кг раз в неделю или раз в две недели.[8] Delivery of replacement enzymes to the affected tissues is also ineffective (see Table 2 and Desnick & Schuchman, “Enzyme replacement therapy for lysosomal diseases: lessons from 20 years of experience and remaining challenges,” 13 Annu. Rev. Genomics Hum. Genet 307-35, 2012). For example, patients who undergo long-term enzyme replacement therapy for Pompe disease in infancy may still suffer from hypernasal speech, residual muscle weakness, ptosis, osteopenia, hearing loss, risk of aspiration, dysphagia, cardiac arrhythmia, and difficulty swallowing. Doses of enzyme replacement should often be increased over time to 40 mg/kg once a week or every two weeks.

Таблица 2. Неэффективное нацеливание ERT на ткани Table 2. Ineffective tissue targeting of ERT

ЗаболеваниеDisease Подтип(-ы)Subtype(s) Легко достигает тканиEasily reaches fabric С трудом достигает тканиDifficult to reach tissue Болезнь ГошеGaucher disease 1 типа1 type Селезенка, печень, костный мозгSpleen, liver, bone marrow КостьBone 2 и 3 типов2 and 3 types Селезенка, печень, костный мозгSpleen, liver, bone marrow Кость, головной мозгBone, brain Болезнь ФабриFabry disease Классическое и позднее проявлениеClassic and late presentation Сосудистый эндотелийVascular endothelium Почка, сердцеKidney, heart МукополисахаридозMucopolysaccharidosis ВсеAll Селезенка, печень, костный мозгSpleen, liver, bone marrow Кость, головной мозг, хрящBone, brain, cartilage α-Маннозидозα-Mannosidosis ------ Селезенка, печень, костный мозгSpleen, liver, bone marrow Кость, головной мозгBone, brain Болезнь Ниманна-ПикаNiemann-Pick disease B типаB type Селезенка, печень, костный мозгSpleen, liver, bone marrow Альвеолярные макрофагиAlveolar macrophages Болезнь ПомпеPompe disease Во младенческом возрастеIn infancy ------ Сердце, гладкая и скелетная мускулатураHeart, smooth and skeletal muscles Более позднее проявлениеLater manifestation ------ Гладкая мускулатура и респираторная скелетная мускулатураSmooth muscle and respiratory skeletal muscle

[9] Эндогенный манноза-6-фосфатный рецептор (MPR) опосредует транспорт большинства рекомбинантных ферментов в лизосому. Существуют две комплементарных формы MPR: катион-независимый (CI-MPR) и катион-зависимый (CD-MPR). У нокаутов по любой из форм не секретируются лизосомные ферменты. Лизосомные гидролазы синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме и перемещаются в сеть цис-стороны аппарата Гольджи, где они ковалентно модифицируются путем добавления манноза-6-фосфатных (M6P) групп. Образование данного маркера зависит от последовательного эффекта двух лизосомных ферментов: UDP-N-ацетилглюкозамин-l-фосфотрансферазы (G1cNac-фосфотрансфераза) и N-ацетилглюкозамин-l-фосфодиэстер-α-N-ацетил-глюкозаминидазы (экспонирующий фермент). GlcNac-фосфотрансфераза катализирует перенос G1cNAc-1-фосфатного остатка от UDP-G1cNAc в C6 положения выбранных манноз в высокоманнозных олигосахаридах гидролаз. Затем экспонирующий фермент удаляет концевой G1cNAc, экспонируя сигнал распознавания M6P. В сети транс-Гольджи сигнал M6P обеспечивает сегрегацию лизосомных гидролаз от всех других типов белков посредством селективного связывания с M6P-рецепторами. Покрытые клатрином везикулы давали отпочковывание от транс-сети Гольджи и сливались с поздними эндосомами. При низком pH в поздней эндосоме гидролазы диссоциируются от M6P-рецепторов, и пустые рецепторы возвращаются в аппарат Гольджи для следующих раундов транспорта. [9] The endogenous mannose-6-phosphate receptor (MPR) mediates the transport of most recombinant enzymes into the lysosome. There are two complementary forms of MPR: cation-independent (CI-MPR) and cation-dependent (CD-MPR). Knockouts of either form do not secrete lysosomal enzymes. Lysosomal hydrolases are synthesized in the endoplasmic reticulum and translocate to the cis-side network of the Golgi apparatus, where they are covalently modified by the addition of mannose-6-phosphate (M6P) groups. The formation of this marker depends on the sequential effect of two lysosomal enzymes: UDP-N-acetylglucosamine-l-phosphotransferase (G1cNac-phosphotransferase) and N-acetylglucosamine-l-phosphodiester-α-N-acetyl-glucosaminidase (exposing enzyme). GlcNac phosphotransferase catalyzes the transfer of a G1cNAc-1-phosphate residue from UDP-G1cNAc to the C6 position of selected mannoses in high-mannose oligosaccharide hydrolases. The exposing enzyme then removes the terminal G1cNAc, exposing the M6P recognition signal. In the trans-Golgi network, the M6P signal mediates the segregation of lysosomal hydrolases from all other types of proteins through selective binding to M6P receptors. Clathrin-coated vesicles bud from the trans-Golgi network and fuse with late endosomes. At low pH in the late endosome, hydrolases dissociate from M6P receptors and empty receptors are returned to the Golgi apparatus for further rounds of transport.

[10] За исключением β-глюкоцереброзидазы, которая доставляется посредством маннозного рецептора, рекомбинантные лизосомные ферменты имеют M6P-гликозилирование и доставляются в лизосому главным образом посредством CI-MPR/IGF2R. Опосредованная гликозилированием/CI-MPR доставка заместительного фермента, однако, не достигает всех клинически релевантных тканей (таблица 2). Улучшение заместительной ферментной терапии акцентировали на улучшении доставки CI-MPR с помощью (i) усиления экспрессии на поверхности CI-MPR с использованием β2-агониста кленбутерола (Koeberl et al., «Enhanced efficacy of enzyme replacement therapy in Pompe disease through mannose-6-phosphate receptor expression in skeletal muscle», 103(2) Mol. Genet. Metab. 107-12, 2011), (ii) повышения количества остатков M6P в ферменте (Zhu et al., «Conjugation of mannose-6-phosphate-containing oligosaccharides to acid alpha-glucosidase improves the clearance of glycogen in Pompe mice», 279(48) J. Biol. Chem. 50336-41, 2004) или (iii) слияния домена IGF-II с ферментом (Maga et al., «Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid alpha-glucosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice», 288(3) J. Biol. Chem. 1428-38, 2013).[10] With the exception of β-glucocerebrosidase, which is delivered via the mannose receptor, recombinant lysosomal enzymes are M6P-glycosylated and delivered to the lysosome primarily via CI-MPR/IGF2R. Glycosylation/CI-MPR-mediated delivery of the replacement enzyme, however, does not reach all clinically relevant tissues (Table 2). Improvements in enzyme replacement therapy have focused on improving the delivery of CI-MPR by (i) enhancing the surface expression of CI-MPR using the β2-agonist clenbuterol (Koeberl et al., “Enhanced efficacy of enzyme replacement therapy in Pompe disease through mannose-6- phosphate receptor expression in skeletal muscle", 103(2) Mol. Genet. Metab. 107-12, 2011), (ii) increasing the number of M6P residues in the enzyme (Zhu et al., "Conjugation of mannose-6-phosphate-containing oligosaccharides to acid alpha-glucosidase improves the clearance of glycogen in Pompe mice", 279(48) J. Biol. Chem. 50336-41, 2004) or (iii) fusion of the IGF-II domain with the enzyme (Maga et al., " Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid alpha-glucosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice", 288(3) J. Biol. Chem. 1428-38, 2013).

[11] При лечении большого количества лизосомных болезней накопления с помощью заместительной ферментной терапии или генной терапии получают неудовлетворительный результат в основном из-за недостаточно эффективного нацеливания заместительного фермента на соответствующие ткань или орган, отрицательных иммунологических реакций у хозяина-реципиента и низкого значения времени полужизни в сыворотке. Существует потребность в улучшенных методах заместительной ферментной терапии, которые усилят и обеспечат лучшее биораспределение в ткани и поглощение фермента в лизосоме. Заявитель разработал улучшенную заместительную ферментную терапию в которой применяется контролируемая антителом доставка ферментов в лизосому целевых пораженных тканей, которая происходит независимо от CI-MPR.[11] Treatment of a large number of lysosomal storage diseases with enzyme replacement therapy or gene therapy produces unsatisfactory results, mainly due to insufficient targeting of the replacement enzyme to the relevant tissue or organ, negative immunological reactions in the recipient host, and low half-life in serum. There is a need for improved enzyme replacement therapies that will enhance and provide better tissue biodistribution and lysosome uptake of the enzyme. The applicant has developed an improved enzyme replacement therapy that uses antibody-controlled delivery of enzymes to the lysosome of target diseased tissues, which occurs independently of CI-MPR.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕSHORT DESCRIPTION

[12] Заявители обнаружили, что заместительные ферменты могут эффективно доставляться в клетку-мишень при связывании с доменом доставки в составе мультидоменного терапевтического белка. Мультидоменный терапевтический белок может быть доставлен в клетку, которая может находиться в условиях ex vivo или in vivo, посредством вектора для генной терапии, например, вирусного вектора, полинуклеотида без дополнительных средств, полинуклеотидного комплекса и т. д., содержащего кодирующую последовательность мультидоменного терапевтического белка.[12] Applicants have discovered that replacement enzymes can be efficiently delivered to a target cell when bound to a delivery domain within a multidomain therapeutic protein. The multi-domain therapeutic protein can be delivered to a cell, which may be ex vivo or in vivo, via a gene therapy vector, e.g., a viral vector, a polynucleotide without additional means, a polynucleotide complex, etc., containing the coding sequence of the multi-domain therapeutic protein .

[13] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мультидоменный терапевтический белок. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит ферментативный домен и домен доставки. В одном варианте осуществления полинуклеотид также содержит последовательность нуклеиновой кислоты вирусного вектора. В конкретном варианте осуществления полинуклеотид также содержит последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV).[13] In one aspect, the present invention provides a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a multi-domain therapeutic protein. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises an enzymatic domain and a delivery domain. In one embodiment, the polynucleotide also contains a viral vector nucleic acid sequence. In a specific embodiment, the polynucleotide also contains an adeno-associated virus (AAV) nucleic acid sequence.

[14] В одном варианте осуществления ферментативный домен обладает активностью гидролазы, например гликозилазы, например гликозидазы, например альфа-глюкозидазы (GAA) или альфа-галактозидазы A (GLA). В некоторых вариантах осуществления ферментативный домен содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:1, или ее биологически активную часть. В некоторых вариантах осуществления ферментативный домен содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:78. В некоторых вариантах осуществления ферментативный домен состоит по существу из аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO:78. В некоторых вариантах осуществления ферментативный домен состоит из аминокислотной последовательности, представленной под SEQ ID NO:78. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая подвергается эндоцитозу и транспортируется в лизосому. В конкретном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу CD63. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу ITGA7. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), такой как scFv, который связывает CD63 или ITGA7 (например, фиг. 1A, панель G).[14] In one embodiment, the enzymatic domain has hydrolase activity, such as a glycosylase, such as a glycosidase, such as alpha-glucosidase (GAA) or alpha-galactosidase A (GLA). In some embodiments, the enzymatic domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:1, or a biologically active portion thereof. In some embodiments, the enzymatic domain comprises the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:78. In some embodiments, the enzymatic domain consists essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:78. In some embodiments, the enzymatic domain consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:78. In one embodiment, the delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector. In one embodiment, the internalization effector is a cell surface molecule that is endocytosed and transported to a lysosome. In a specific embodiment, the internalization effector is a CD63 molecule. In one embodiment, the internalization effector is an ITGA7 molecule. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, antibody fragment, or single chain variable fragment (scFv), such as a scFv that binds CD63 or ITGA7 (eg , Fig. 1A, panel G).

[15] В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит два домена доставки (например, фиг. 1А, панель H). В одном варианте осуществления первый домен доставки связывает эффектор интернализации с обеспечением доставки фермента к соответствующей клетке-мишени или целевому субклеточному компартменту; а второй домен доставки связывает эффектор трансцитоза с обеспечением транспорта мультидоменного терапевтического белка через физиологический барьер, такой как альвеолярная мембрана, эндотелий печени, гематоэнцефалический барьер или т. п. В конкретном варианте осуществления второй домен доставки представляет собой scFv-домен к рецептору трансферрина (TfR). В конкретном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит ферментативный домен, представляющий собой GAA, первый домен доставки, представляющий собой scFv к CD63, и второй домен доставки, представляющий собой scFv к TfR. В другом варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит ферментативный домен, представляющий собой GAA, первый домен доставки, представляющий собой scFv к ITGA7, и второй домен доставки, представляющий собой scFv к CD63.[15] In one embodiment, the multi-domain therapeutic protein contains two delivery domains (eg , Fig. 1A, panel H). In one embodiment, the first delivery domain binds an internalization effector to enable delivery of the enzyme to the appropriate target cell or target subcellular compartment; and the second delivery domain binds a transcytosis effector to allow transport of the multi-domain therapeutic protein across a physiological barrier, such as the alveolar membrane, liver endothelium, blood-brain barrier, or the like. In a specific embodiment, the second delivery domain is a scFv domain to the transferrin receptor (TfR) . In a specific embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises an enzymatic domain that is a GAA, a first delivery domain that is an anti-CD63 scFv, and a second delivery domain that is an anti-TfR scFv. In another embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises an enzymatic domain that is a GAA, a first delivery domain that is an anti-ITGA7 scFv, and a second delivery domain that is an anti-CD63 scFv.

[16] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает вектор для генной терапии, такой как вектор на основе AAV, полинуклеотид без дополнительных средств, полинуклеотидный комплекс и т. д., который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мультидоменный терапевтический белок, содержащий ферментативный домен и домен доставки.[16] In one aspect, the present invention provides a gene therapy vector, such as an AAV-based vector, a polynucleotide without additional means, a polynucleotide complex, etc., which contains a nucleic acid sequence encoding a multi-domain therapeutic protein containing an enzymatic domain and a domain delivery.

[17] В одном варианте осуществления ферментативный домен обладает активностью гидролазы, например гликозилазы, например гликозидазы, например альфа-глюкозидазы или альфа-галактозидазы A. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая подвергается эндоцитозу и транспортируется в лизосому. В конкретном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу CD63. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу ITGA7. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), такой как scFv, который связывает CD63 или ITGA7.[17] In one embodiment, the enzymatic domain has hydrolase activity, such as a glycosylase, such as a glycosidase, such as alpha-glucosidase or alpha-galactosidase A. In one embodiment, the delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector. In one embodiment, the internalization effector is a cell surface molecule that is endocytosed and transported to a lysosome. In a specific embodiment, the internalization effector is a CD63 molecule. In one embodiment, the internalization effector is an ITGA7 molecule. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, antibody fragment, or single chain variable fragment (scFv), such as a scFv that binds CD63 or ITGA7.

[18] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает мультидоменный терапевтический белой, содержащий ферментативный домен и домен доставки. В одном варианте осуществления ферментативный домен обладает активностью гидролазы, например гликозилазы, например гликозидазы, например альфа-глюкозидазы или альфа-галактозидазы A. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая подвергается эндоцитозу и транспортируется в лизосому. В конкретном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу CD63. В другом варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу ITGA7. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), такой как scFv, который связывает CD63 или ITGA7.[18] In one aspect, the present invention provides a multi-domain therapeutic white containing an enzymatic domain and a delivery domain. In one embodiment, the enzymatic domain has hydrolase activity, such as a glycosylase, such as a glycosidase, such as alpha-glucosidase or alpha-galactosidase A. In one embodiment, the delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector. In one embodiment, the internalization effector is a cell surface molecule that is endocytosed and transported to a lysosome. In a specific embodiment, the internalization effector is a CD63 molecule. In another embodiment, the internalization effector is an ITGA7 molecule. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, antibody fragment, or single chain variable fragment (scFv), such as a scFv that binds CD63 or ITGA7.

[19] В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок применяется для лечения пациента, нуждающегося в заместительной ферментной терапии.[19] In one embodiment, the multidomain therapeutic protein is used to treat a patient in need of enzyme replacement therapy.

[20] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ получения мультидоменного терапевтического белка, содержащего ферментативный домен и домен доставки, в клетке. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок получают посредством обеспечения контакта клетки с вектором для генной терапии, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мультидоменный терапевтический белок. Последовательность нуклеиновой кислоты впоследствии интегрируется в геномный локус клетки, из которого последовательность нуклеиновой кислоты транскрибируется и транслируется в случае, если последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК, или транслируется в случае, если нуклеиновая кислота представляет собой РНК, и происходит получение мультидоменного терапевтического белка. В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой вектор, который обычно применяют для трансфекции клеток, такой как вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой полинуклеотид без дополнительных средств. В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой полинуклеотидный комплекс, например липидную наночастицу. В одном варианте осуществления геномный локус представляет собой локус «безопасной гавани», который обеспечивает высокую экспрессию мультидоменного терапевтического белка, не мешая при этом экспрессии основных генов или не стимулируя экспрессию онкогенов или других вредных генов. В одном варианте осуществления геномный локус представляет собой сайт аденоассоциированного вируса.[20] In one aspect, the present invention provides a method for producing a multi-domain therapeutic protein containing an enzymatic domain and a delivery domain in a cell. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein is produced by contacting a cell with a gene therapy vector containing a nucleic acid sequence encoding the multidomain therapeutic protein. The nucleic acid sequence is subsequently integrated into the genomic locus of the cell, from which the nucleic acid sequence is transcribed and translated if the nucleic acid sequence is DNA, or translated if the nucleic acid is RNA, to produce a multi-domain therapeutic protein. In one embodiment, the gene therapy vector is a vector that is typically used for transfecting cells, such as an adeno-associated virus (AAV) vector. In one embodiment, the gene therapy vector is a polynucleotide without additional means. In one embodiment, the gene therapy vector is a polynucleotide complex, such as a lipid nanoparticle. In one embodiment, the genomic locus is a "safe harbor" locus that allows for high expression of a multi-domain therapeutic protein without interfering with the expression of essential genes or promoting the expression of oncogenes or other deleterious genes. In one embodiment, the genomic locus is an adeno-associated virus site.

[21] В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека или клетка мыши. В одном варианте осуществления клетка находится в условиях ex vivo, например клеточная линия HEK293. В другом варианте осуществления клетка находится в условиях in vivo, и вектор для генной терапии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мультидоменный терапевтический белок, вводят субъекту, представляющему собой человека, или отличному от человека.[21] In one embodiment, the cell is a mammalian cell, such as a human cell or a mouse cell. In one embodiment, the cell is in an ex vivo environment, such as the HEK293 cell line. In another embodiment, the cell is maintained in vivo and a gene therapy vector containing a nucleic acid sequence encoding a multi-domain therapeutic protein is administered to a human or non-human subject.

[22] В одном варианте осуществления ферментативный домен обладает активностью гидролазы, например гликозилазы, например гликозидазы, например альфа-глюкозидазы (GAA) или альфа-галактозидазы A (GLA). В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая подвергается эндоцитозу и транспортируется в лизосому. В конкретном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу CD63. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), такой как scFv, который связывает CD63 (например, SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления мультидоменный терапевтический полипептид содержит scFv, который связывает CD63 (например, scFv, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:2), функционально связанный с GAA (представленной под SEQ ID NO:1) или ее биологически активной частью (представленной под SEQ ID NO:78). В некоторых вариантах осуществления мультидоменный терапевтический полипептид содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79.[22] In one embodiment, the enzymatic domain has hydrolase activity, such as a glycosylase, such as a glycosidase, such as alpha-glucosidase (GAA) or alpha-galactosidase A (GLA). In one embodiment, the delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector. In one embodiment, the internalization effector is a cell surface molecule that is endocytosed and transported to a lysosome. In a specific embodiment, the internalization effector is a CD63 molecule. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, antibody fragment, or single chain variable fragment (scFv), such as a scFv that binds CD63 (eg , SEQ ID NO:2). In some embodiments, the multidomain therapeutic polypeptide comprises a scFv that binds CD63 (e.g., a scFv comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:2) operably linked to a GAA (represented in SEQ ID NO:1) or a biologically active portion thereof ( presented under SEQ ID NO:78). In some embodiments, the multidomain therapeutic polypeptide comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:10 or SEQ ID NO:79.

[23] В конкретном варианте осуществления вектор на основе AAV, содержащий полинуклеотид, кодирующий слитый белок scFv-гидролаза, вводят субъекту, представляющему собой человека, или отличному от человека. Впоследствии полинуклеотид интегрируется в геномный локус, и продуцируется кодированный слитый белок. В конкретном варианте осуществления слитый белок представляет собой слитый белок, состоящий из scFv к CD63 и GAA (например, представленный в под SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79), или слитый белок, состоящий из scFv к ITGA7 и GAA, субъект, представляющий собой человека, или отличный от человека характеризуется недостатком активности эндогенной GAA, и активность GAA у субъекта эффективно восстанавливается.[23] In a specific embodiment, an AAV-based vector containing a polynucleotide encoding a scFv-hydrolase fusion protein is administered to a human or non-human subject. Subsequently, the polynucleotide is integrated into the genomic locus and the encoded fusion protein is produced. In a specific embodiment, the fusion protein is a fusion protein consisting of a scFv to CD63 and GAA (for example, presented in SEQ ID NO:10 or SEQ ID NO:79), or a fusion protein consisting of an scFv to ITGA7 and GAA, subject a human or non-human is characterized by a deficiency of endogenous GAA activity, and the subject's GAA activity is effectively restored.

[24] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента (представляющего собой человека или отличного от человека) с дефицитом фермента путем введения пациенту вектора для генной терапии, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен. В одном варианте осуществления ферментативный домен предусматривает гликозидазу, такую как GAA (например, SEQ ID NO:1) или ее биологически активная часть (например, SEQ ID NO:78) или GLA (например, UniProtKB № P06280, aa32-429, SEQ ID NO:13), и у пациента имеется болезнь Помпе или болезнь Фабри. В одном варианте осуществления домен доставки мультидоменного терапевтического белка представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации, таким как CD63 или ITGA7. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает CD63. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает ITGA7. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии предусматривает вектор на основе AAV, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий CD63, и GAA (например, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79). В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой вектор на основе AAV, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий ITGA7, и GAA. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии предусматривает полинуклеотид без дополнительных средств, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий CD63, и GAA (например, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79). В другом варианте осуществления вектор для генной терапии предусматривает полинуклеотид без дополнительных средств, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий ITGA7, и GAA. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии содержит полинуклеотидный комплекс, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий CD63, и GAA (например, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:79). В другом варианте осуществления вектор для генной терапии содержит полинуклеотидный комплекс, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий ITGA7, и GAA.[24] In one aspect, the present invention provides a method of treating a patient (human or non-human) with an enzyme deficiency by administering to the patient a gene therapy vector containing a nucleic acid sequence encoding a multi-domain therapeutic protein comprising a delivery domain and an enzymatic domain. In one embodiment, the enzymatic domain comprises a glycosidase such as a GAA (e.g., SEQ ID NO:1) or a biologically active portion thereof (e.g., SEQ ID NO:78) or a GLA (e.g., UniProtKB No. P06280, aa32-429, SEQ ID NO:13), and the patient has Pompe disease or Fabry disease. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector such as CD63 or ITGA7. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds CD63. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds ITGA7. In another embodiment, the gene therapy vector provides an AAV-based vector containing a nucleic acid sequence that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion comprising a CD63 binding fragment and a GAA (eg, SEQ ID NO:10 or SEQ ID NO:79). In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a nucleic acid sequence that encodes a multi-domain therapeutic fusion protein containing an ITGA7 binding fragment and a GAA. In another embodiment, the gene therapy vector provides a polynucleotide without additional means comprising a nucleic acid sequence that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion comprising a CD63 binding fragment and a GAA (eg, SEQ ID NO:10 or SEQ ID NO:79). In another embodiment, the gene therapy vector provides a polynucleotide without additional means comprising a nucleic acid sequence that encodes a multi-domain therapeutic fusion protein containing an ITGA7 binding fragment and a GAA. In another embodiment, the gene therapy vector comprises a polynucleotide complex comprising a nucleic acid sequence that encodes a multi-domain therapeutic fusion protein comprising a CD63 binding moiety and a GAA (eg, SEQ ID NO:10 or SEQ ID NO:79). In another embodiment, the gene therapy vector comprises a polynucleotide complex comprising a nucleic acid sequence that encodes a multi-domain therapeutic fusion protein comprising an ITGA7 binding fragment and a GAA.

[25] В одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции в соответствии с настоящим изобретением для применения в медицине. В одном варианте осуществления композиция, например фармацевтическая композиция, может содержать вектор для генной терапии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен. В одном варианте осуществления домен доставки мультидоменного терапевтического белка представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации, таким как CD63 или ITGA7. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает CD63. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает ITGA7. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой вектор на основе AAV, содержащий полинуклеотид, который кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий CD63, и GAA. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой вектор на основе AAV, содержащий полинуклеотид, который кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий ITGA7, и GAA. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например вектор для генной терапии, содержит тканеспецифический регуляторный элемент. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический регуляторный элемент содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или обе. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например вектор для генной терапии, содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:11.[25] In one aspect, the present invention relates to a composition in accordance with the present invention for use in medicine. In one embodiment, the composition, such as a pharmaceutical composition, may comprise a gene therapy vector comprising a nucleic acid sequence encoding a multi-domain therapeutic protein comprising a delivery domain and an enzymatic domain. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector such as CD63 or ITGA7. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds CD63. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds ITGA7. In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion containing a CD63 binding moiety and a GAA. In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion containing an ITGA7 binding fragment and a GAA. In some embodiments, the polynucleotide, such as a gene therapy vector, comprises a tissue-specific regulatory element. In some embodiments, the tissue-specific regulatory element comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, or both. In some embodiments, the polynucleotide, such as a gene therapy vector, comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:11.

[26] В одном аспекте описана композиция, содержащая вектор для генной терапии, содержащий ген, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен, для применения в лечении пациента (представляющего собой человека или отличного от человека) с дефицитом фермента, и/или для применения с целью уменьшения накопления гликогена в ткани у субъекта, представляющего собой человека или отличного от человека. В одном варианте осуществления домен доставки мультидоменного терапевтического белка представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации, таким как CD63 или ITGA7. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает CD63. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает ITGA7. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой векторы на основе AAV, содержащие полинуклеотид, который кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий CD63, и GAA. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой векторы на основе AAV, содержащие полинуклеотид, который кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий ITGA7, и GAA. Болезнь Помпе или болезнь Фабри, например, могут являться без ограничения клиническими показаниями, влекущими за собой дефицит фермента. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например вектор для генной терапии, содержит тканеспецифический регуляторный элемент. В некоторых вариантах осуществления тканеспецифический регуляторный элемент содержит последовательность, представленную под SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, или обе. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например вектор для генной терапии, содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:11.[26] In one aspect, a composition is described comprising a gene therapy vector comprising a gene encoding a multi-domain therapeutic protein comprising a delivery domain and an enzymatic domain, for use in treating a patient (human or non-human) with enzyme deficiency, and/ or for use to reduce tissue glycogen accumulation in a human or non-human subject. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector such as CD63 or ITGA7. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds CD63. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds ITGA7. In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion containing a CD63 binding moiety and a GAA. In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion containing an ITGA7 binding fragment and a GAA. Pompe disease or Fabry disease, for example, may be, without limitation, clinical indications resulting in enzyme deficiency. In some embodiments, the polynucleotide, such as a gene therapy vector, comprises a tissue-specific regulatory element. In some embodiments, the tissue-specific regulatory element comprises the sequence set forth in SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, or both. In some embodiments, the polynucleotide, such as a gene therapy vector, comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:11.

[27] В одном аспекте описано применение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением для изготовления лекарственного средства для терапевтического применения, такого как, например, лечение пациента (представляющего собой человека или отличного от человека) с дефицитом фермента, и/или уменьшение накопления гликогена в ткани у субъекта, представляющего собой человека или отличного от человека. Композиция может содержать, например, вектор для генной терапии, содержащий ген, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен. В одном варианте осуществления домен доставки мультидоменного терапевтического белка представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации, таким как CD63 или ITGA7. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает CD63. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой молекулу scFv, которая связывает ITGA7. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой векторы на основе AAV, содержащие полинуклеотид, который кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий CD63, и GAA. В другом варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой векторы на основе AAV, содержащие полинуклеотид, который кодирует слитый мультидоменный терапевтический белок, содержащий фрагмент, связывающий ITGA7, и GAA. Болезнь Помпе или болезнь Фабри, например, могут являться без ограничения клиническими показаниями, влекущими за собой дефицит фермента.[27] In one aspect, the use of a pharmaceutical composition in accordance with the present invention is described for the manufacture of a medicament for a therapeutic use, such as, for example, treating a patient (human or non-human) with an enzyme deficiency, and/or reducing glycogen accumulation in the tissue from a human or non-human subject. The composition may contain, for example, a gene therapy vector containing a gene encoding a multi-domain therapeutic protein containing a delivery domain and an enzymatic domain. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector such as CD63 or ITGA7. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds CD63. In one embodiment, the delivery domain is a scFv molecule that binds ITGA7. In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion containing a CD63 binding moiety and a GAA. In another embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein fusion containing an ITGA7 binding fragment and a GAA. Pompe disease or Fabry disease, for example, may be, without limitation, clinical indications resulting in enzyme deficiency.

[28] В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит ферментативный домен, представляющий собой GAA, и высокие уровни содержания GAA в сыворотке крови поддерживаются в сыворотке крови пациента в течение по меньшей мере 12 недель после введения вектора для генной терапии. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит ферментативный домен, представляющий собой GAA, и уровни содержания гликогена в сердечной, скелетной мышце и ткани печени пациента поддерживаются на уровнях, характерных для дикого типа, спустя 3 месяца после введения вектора для генной терапии. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит ферментативный домен, представляющий собой GAA, и мышечная сила пациента после лечения восстанавливается до уровней, характерных для дикого типа.[28] In one embodiment, the multi-domain therapeutic protein contains an enzymatic domain that is a GAA, and high serum levels of GAA are maintained in the patient's serum for at least 12 weeks after administration of the gene therapy vector. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises a GAA enzymatic domain and glycogen levels in the patient's cardiac, skeletal muscle, and liver tissue are maintained at wild-type levels 3 months after administration of the gene therapy vector. In one embodiment, the multi-domain therapeutic protein contains a GAA enzymatic domain and the patient's muscle strength is restored to wild-type levels after treatment.

[29] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ уменьшения накопления гликогена в ткани у субъекта, представляющего собой человека или отличного от человека, путем введения вектора для генной терапии, содержащего полинуклеотид, который кодирует мультидоменный терапевтический белок. В одном варианте осуществления ткань представляет собой печень, сердце или скелетную мышцу. В одном варианте осуществления субъект, представляющий собой человека или отличный от человека, имеет болезнь Помпе. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит слитый белок, содержащий scFv к CD63 и GAA. В другом варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит слитый белок, содержащий scFv к ITGA7 и GAA.[29] In one aspect, the present invention provides a method of reducing tissue glycogen accumulation in a human or non-human subject by administering a gene therapy vector containing a polynucleotide that encodes a multi-domain therapeutic protein. In one embodiment, the tissue is liver, heart, or skeletal muscle. In one embodiment, the human or non-human subject has Pompe disease. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises a fusion protein comprising an anti-CD63 scFv and a GAA. In another embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises a fusion protein comprising scFv to ITGA7 and GAA.

[30] В одном аспекте в данном документе описан способ уменьшения уровня содержания перекрестнореагирующего иммунологического материала к ферменту у пациента (представляющего собой человека или отличного от человека) с дефицитом фермента, при этом способ включает введение пациенту вектора для генной терапии, содержащего ген, кодирующий только заместительный фермент, или мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии представляет собой вектор на основе AAV, который может представлять собой химерный вектор на основе AAV (например, AAV2/8). В некоторых вариантах осуществления ферментативный домен предусматривает гликозидазу, такую как GAA (например, под SEQ ID NO:1) или GLA (например, UniProtKB № P06280, aa32-429, под SEQ ID NO:13), и пациент имеет болезнь Помпе или болезнь Фабри, и домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии вводят в количествах, достаточных для повышения уровней содержания GAA в сыворотке крови настолько, чтобы количество перекрестнореагирующего иммунологического материала уменьшилось или перекрестнореагирующий иммунологический материал не образовывался в обнаруживаемых количествах. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии вводят в количествах, достаточных для повышения уровня содержания GAA в сыворотке крови в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах осуществления пациента инфицируют вирусом (например, AAV), содержащим вектор для генной терапии, где необязательно вирус подвергнут псевдотипированию с целью достижения специфической нацеленности на ткань или клетку, выбранные из группы, состоящей из GALT, печени, гемопоэтической стволовой клетки, эритроцита, или их комбинацию, и/или где вектор для генной терапии содержит клеточно- или тканеспецифический энхансер и/или промотор, например, специфический для печени энхансер (например, серпина 1) и/или специфический для печени промотор (например, TTR). В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая подвергается эндоцитозу и транспортируется в лизосому. В конкретном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу CD63. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), такой как scFv, который связывает CD63 (например, SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления способ включает введение пациенту вектора для генной терапии, описанного в данном документе, в комбинации по меньшей мере с одним иммуносупрессором, при этом вектор для генной терапии и иммуносупрессор вводят одновременно и/или последовательно. В некоторых вариантах у пациента поддерживают постоянный уровень иммуносупрессора.[30] In one aspect, this document describes a method of reducing the level of cross-reactive immunological material to an enzyme in a patient (human or non-human) with enzyme deficiency, the method comprising administering to the patient a gene therapy vector containing a gene encoding only a replacement enzyme, or a multi-domain therapeutic protein containing a delivery domain and an enzymatic domain. In some embodiments, the gene therapy vector is an AAV-based vector, which may be a chimeric AAV-based vector (eg, AAV2/8). In some embodiments, the enzymatic domain comprises a glycosidase, such as GAA (eg, SEQ ID NO:1) or GLA (eg, UniProtKB No. P06280, aa32-429, SEQ ID NO:13), and the patient has Pompe disease or Fabry, and the delivery domain is an antigen-binding protein that binds to the internalization effector. In some embodiments, the gene therapy vector is administered in amounts sufficient to increase serum GAA levels such that the amount of cross-reacting immunological material is reduced or the cross-reacting immunological material is not produced in detectable amounts. In some embodiments, the gene therapy vector is administered in amounts sufficient to increase serum GAA levels over a period of time. In some embodiments, a patient is infected with a virus (e.g., AAV) containing a gene therapy vector, wherein optionally the virus has been pseudotyped to specifically target a tissue or cell selected from the group consisting of GALT, liver, hematopoietic stem cell, red blood cell, or a combination thereof, and/or wherein the gene therapy vector contains a cell- or tissue-specific enhancer and/or promoter, for example, a liver-specific enhancer (eg, serpin 1) and/or a liver-specific promoter (eg, TTR). In one embodiment, the internalization effector is a cell surface molecule that is endocytosed and transported to a lysosome. In a specific embodiment, the internalization effector is a CD63 molecule. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, antibody fragment, or single chain variable fragment (scFv), such as a scFv that binds CD63 (eg , SEQ ID NO:2). In some embodiments, the method includes administering to a patient a gene therapy vector described herein in combination with at least one immunosuppressive agent, wherein the gene therapy vector and the immunosuppressive agent are administered simultaneously and/or sequentially. In some embodiments, the patient is maintained at a constant level of the immunosuppressant.

[31] В одном аспекте в данном документе описан способ индуцирования толерантности к ферменту у пациента (представляющего собой человека или отличного от человека) с дефицитом фермента (т. е. индуцирования толерантности пациента к ферменту), при этом способ включает уменьшение уровня содержания перекрестнореагирующего иммунологического материала у пациента, например, введение пациенту вектора для генной терапии, содержащего ген, кодирующий только заместительный фермент, или мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен. В некоторых вариантах осуществления описан способ индуцирования толерантности к ферменту у пациента с дефицитом фермента, при этом способ включает введение пациенту вектора для генной терапии, содержащего ген, кодирующий только заместительный фермент или мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен, в течение определенного периода времени таким образом, что у пациента не появлялось увеличения обнаруживаемого перекрестнореагирующего иммунологического материала. В некоторых вариантах осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит домен доставки и ферментативный домен. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии представляет собой вектор на основе AAV, который может представлять собой химерный вектор на основе AAV (например, AAV2/8) и/или сконструированный вектор на основе AAV (например, рекомбинантный вирусный вектор с модифицированным тропизмом, применимый для нацеливания, например, на рецептор или маркер, преимущественно или исключительно экспрессируемый клеткой или тканью, например гепатоцитом или печенью, тканью слизистой оболочки, эритроцитами, гемопоэтическими стволовыми клетками и т. д.), и где необязательно ген экспрессируется под контролем энхансера и/или промотора, специфического для клетки или ткани, например специфического для печени промотора и т. д. В некоторых вариантах осуществления ферментативный домен предусматривает гликозидазу, такую как GAA (например, под SEQ ID NO:1) или GLA (например, UniProtKB № P06280, aa32-429, под SEQ ID NO:13), и пациент имеет болезнь Помпе или болезнь Фабри, и домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с эффектором интернализации. В одном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу клеточной поверхности, которая подвергается эндоцитозу и транспортируется в лизосому. В конкретном варианте осуществления эффектор интернализации представляет собой молекулу CD63. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, фрагмент антитела или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), такой как scFv, который связывает CD63 (например, SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления способ лечения пациента с дефицитом фермента включает введение пациенту рекомбинантной формы и/или изозима фермента (например, GAA у пациента с болезнью Помпе, например scFv63::GAA, GAA, оптимизированная GAA или их комбинации), где пациент является толерантным к ферменту, например, где пациент был подвергнут индуцированию толерантности к ферменту в соответствии со способом, описанным в данном документе. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ введения фермента пациенту с дефицитом этого фермента включает индуцирование толерантности у пациента в отношении фермента, например, путем введения вектора для генной терапии, кодирующего фермент или мультидоменный терапевтический белок, содержащий фермент, предпочтительно в количествах, достаточных для увеличения уровня содержания фермента в сыворотке крови настолько, чтобы перекрестнореагирующий иммунологический материал находился на уровне, сопоставимом с уровнем, обнаруженным у пациента, не испытывающего дефицита фермента, при этом необязательно вектор для генной терапии специфически нацелен на печень и/или содержит специфический для печени энхансер и/или промотор. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает после введения вектора, нацеленного на ген, дополнительное введение фермента и/или его рекомбинантного варианта, включая мультидоменный терапевтический белок, содержащий фермент.[31] In one aspect, this document describes a method of inducing tolerance to an enzyme in a patient (human or non-human) with enzyme deficiency (i.e., inducing tolerance of the patient to the enzyme), the method including reducing the level of a cross-reacting immunological material in a patient, for example, administering to the patient a gene therapy vector containing a gene encoding only a replacement enzyme, or a multi-domain therapeutic protein containing a delivery domain and an enzymatic domain. In some embodiments, a method is described for inducing enzyme tolerance in a patient with enzyme deficiency, the method comprising administering to the patient a gene therapy vector containing a gene encoding only a replacement enzyme or a multi-domain therapeutic protein containing a delivery domain and an enzymatic domain over a period of time. time such that the patient does not experience an increase in detectable cross-reacting immunological material. In some embodiments, the multidomain therapeutic protein comprises a delivery domain and an enzymatic domain. In some embodiments, the gene therapy vector is an AAV-based vector, which may be a chimeric AAV-based vector (e.g., AAV2/8) and/or an engineered AAV-based vector (e.g., a tropism-modified recombinant viral vector applicable for targeting, for example, a receptor or marker predominantly or exclusively expressed by a cell or tissue, for example a hepatocyte or liver, mucosal tissue, red blood cells, hematopoietic stem cells, etc.), and where optionally the gene is expressed under the control of an enhancer and/or a cell- or tissue-specific promoter, e.g., a liver-specific promoter, etc. In some embodiments, the enzymatic domain comprises a glycosidase, such as a GAA (e.g. , SEQ ID NO:1) or GLA (e.g. , UniProtKB No. P06280, aa32 -429, SEQ ID NO:13), and the patient has Pompe disease or Fabry disease, and the delivery domain is an antigen binding protein that binds to an internalization effector. In one embodiment, the internalization effector is a cell surface molecule that is endocytosed and transported to a lysosome. In a specific embodiment, the internalization effector is a CD63 molecule. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, antibody fragment, or single chain variable fragment (scFv), such as a scFv that binds CD63 (eg , SEQ ID NO:2). In some embodiments, a method of treating a patient with enzyme deficiency includes administering to the patient a recombinant form and/or isozyme of the enzyme (e.g., GAA in a patient with Pompe disease, e.g., scFv63::GAA, GAA, optimized GAA, or combinations thereof) wherein the patient is tolerant to enzyme, for example, where the patient has been subjected to induction of tolerance to the enzyme in accordance with the method described herein. Accordingly, in some embodiments, a method of administering an enzyme to a patient with a deficiency of the enzyme includes inducing tolerance in the patient to the enzyme, for example, by administering a gene therapy vector encoding the enzyme or a multidomain therapeutic protein containing the enzyme, preferably in amounts sufficient to increase the level of serum enzyme levels such that the cross-reacting immunological material is at a level comparable to that found in a patient not deficient in the enzyme, wherein optionally the gene therapy vector specifically targets the liver and/or contains a liver-specific enhancer and/or promoter In some embodiments, the method further includes, after administration of the gene-targeting vector, additional administration of an enzyme and/or a recombinant variant thereof, including a multidomain therapeutic protein containing the enzyme.

[32] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с CD63 человека. Антитела в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения применимы, среди прочего, для специфического направления интернализации и/или лизосомного транспорта фермента, например GAA или GLA. Таким образом, этот аспект изобретения также предусматривает биспецифические антитела, их антигенсвязывающие фрагменты, которые связывают CD63 человека, и слитые конструкции антитело-белок (см., например, фиг. 1А).[32] In another aspect, the present invention provides antibodies and antigen binding fragments thereof that bind to human CD63. Antibodies in accordance with this aspect of the present invention are useful, among other things, to specifically target the internalization and/or lysosomal transport of an enzyme, such as GAA or GLA. Thus, this aspect of the invention also provides bispecific antibodies, antigen binding fragments thereof that bind human CD63, and antibody-protein fusion constructs (see, for example, FIG. 1A).

[33] Иллюстративные антитела к CD63 по настоящему изобретению перечислены в таблице 10. В таблице 10 представлены идентификаторы последовательностей аминокислот и нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой цепи (HCVR), вариабельных областей легкой цепи (LCVR), а также определяющих комплементарность областей тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) и определяющих комплементарность областей легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) иллюстративных антител к CD63.[33] Exemplary anti-CD63 antibodies of the present invention are listed in Table 10. Table 10 provides amino acid and nucleic acid sequence identifiers for heavy chain variable regions (HCVR), light chain variable regions (LCVR), and heavy chain complementarity determining regions (HCDR1 , HCDR2 and HCDR3) and light chain complementarity determining regions (LCDR1, LCDR2 and LCDR3) of exemplary CD63 antibodies.

[34] Настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат HCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[34] The present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise an HCVR comprising an amino acid sequence selected from any of the HCVR amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90% of at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[35] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат LCVR, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[35] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise an LCVR comprising an amino acid sequence selected from any of the LCVR amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90% at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[36] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCVR и LCVR (HCVR/LCVR), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 10, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 10. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, содержащуюся в иллюстративных антителах к CD63, перечисленных в таблице 10. В определенных вариантах осуществления пара аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 и SEQ ID NO: 62/70.[36] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising a pair of amino acid sequences HCVR and LCVR (HCVR/LCVR) comprising any of the HCVR amino acid sequences listed in Table 10 paired with any of the LCVR amino acid sequences listed in the Table 10. In certain embodiments, the present invention provides antibodies or antigen binding fragments thereof that comprise the HCVR/LCVR amino acid sequence pair contained in the exemplary anti-CD63 antibodies listed in Table 10. In certain embodiments, the HCVR/LCVR amino acid sequence pair is selected from group consisting of SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO: 46/54 and SEQ ID NO: 62/70.

[37] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[37] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise a heavy chain CDR1 (HCDR1) comprising an amino acid sequence selected from any of the HCDR1 amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereto that is characterized by at least at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[38] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[38] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise a heavy chain CDR2 (HCDR2) comprising an amino acid sequence selected from any of the HCDR2 amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereto that is characterized by at least at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[39] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 11, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[39] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise a heavy chain CDR3 (HCDR3) comprising an amino acid sequence selected from any of the HCDR3 amino acid sequences listed in Table 11, or a substantially similar sequence thereto that is characterized by at least at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[40] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие CDR1 легкой цепи (LCDR1), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[40] The present invention also provides antibodies or antigen binding fragments thereof comprising a light chain CDR1 (LCDR1) comprising an amino acid sequence selected from any of the LCDR1 amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, which is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[41] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие CDR2 легкой цепи (LCDR2), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[41] The present invention also provides antibodies or antigen binding fragments thereof comprising a light chain CDR2 (LCDR2) comprising an amino acid sequence selected from any of the LCDR2 amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, which is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[42] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR3 тяжелой цепи (LCDR3), содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[42] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that comprise a heavy chain CDR3 (LCDR3) comprising an amino acid sequence selected from any of the LCDR3 amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereto that is characterized by at least at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto.

[43] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие пару аминокислотных последовательностей HCDR3 и LCDR3 (HCDR3/LCDR3), содержащую любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 10, в паре с любой из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 10. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат пару аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3, содержащуюся в иллюстративных антителах к CD63, перечисленных в таблице 10. В определенных вариантах осуществления пара аминокислотных последовательностей HCDR3/LCDR3 выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 20/28, SEQ ID NO: 36/44, SEQ ID NO:52/60 и SEQ ID NO: 68/76.[43] The present invention also provides antibodies or antigen binding fragments thereof comprising a pair of amino acid sequences HCDR3 and LCDR3 (HCDR3/LCDR3) comprising any of the HCDR3 amino acid sequences listed in Table 10 paired with any of the LCDR3 amino acid sequences listed in the Table 10. In certain embodiments, the present invention provides antibodies or antigen binding fragments thereof that comprise the HCDR3/LCDR3 amino acid sequence pair contained in the exemplary anti-CD63 antibodies listed in Table 10. In certain embodiments, the HCDR3/LCDR3 amino acid sequence pair is selected from group consisting of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 20/28, SEQ ID NO: 36/44, SEQ ID NO:52/60 and SEQ ID NO: 68/76.

[44] Настоящее изобретение также предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат группу из шести CDR (т. е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в любом из иллюстративных антител к CD63, перечисленных в таблице 10. В определенных вариантах осуществления группа аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:16-18-20-24-26-28, SEQ ID NO: 32-34-36-40-42-44, SEQ ID NO:48-50-52-56-58-60 и SEQ ID NO: 64-66-68-72-74-76.[44] The present invention also provides antibodies or antigen-binding fragments thereof that contain a group of six CDRs ( i.e., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contained in any of the exemplary anti-CD63 antibodies listed in Table 10 In certain embodiments, the group of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 is selected from the group consisting of SEQ ID NO:16-18-20-24-26-28, SEQ ID NO:32-34-36 -40-42-44, SEQ ID NO:48-50-52-56-58-60 and SEQ ID NO: 64-66-68-72-74-76.

[45] В связанном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие группу из шести CDR (т. е. HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3), содержащихся в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, определенных для любого из иллюстративных антител к CD63, перечисленных в таблице 10. Например, настоящее изобретение включает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие группу аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, которая содержится в паре аминокислотных последовательностей HCVR/LCVR, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 и SEQ ID NO: 62/70. Способы и методики идентификации CDR в аминокислотных последовательностях HCVR и LCVR хорошо известны в данной области техники и могут быть использованы для идентификации CDR в указанных аминокислотных последовательностях HCVR и/или LCVR, раскрытых в данном документе. Иллюстративные подходы, которые могут быть использованы для идентификации границ CDR, включают, например, определение по Кабат, определение по Чотиа и определение согласно AbM. В целом, определение по Кабат основано на вариабельности последовательностей, определение по Чотиа основано на положении структурных петлевых областей, и определение согласно AbM является компромиссным решением между подходами по Кабат и Чотиа. Смотри, например, Kabat, «Sequences of Proteins of Immunological Interest», National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); and Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Доступны также общедоступные базы данных для идентификации последовательностей CDR в антителе.[45] In a related embodiment, the present invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising a group of six CDRs ( i.e., HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3) contained in the HCVR/LCVR amino acid sequence pair defined for any of the exemplary anti-CD63 antibodies listed in Table 10. For example, the present invention includes antibodies or antigen-binding fragments thereof comprising the amino acid sequence group HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, which is contained in the HCVR/LCVR amino acid sequence pair selected from the group consisting of SEQ ID NO:14/22, SEQ ID NO:30/38, SEQ ID NO:46/54 and SEQ ID NO:62/70. Methods and techniques for identifying CDRs in HCVR and LCVR amino acid sequences are well known in the art and can be used to identify CDRs in said HCVR and/or LCVR amino acid sequences disclosed herein. Exemplary approaches that can be used to identify CDR boundaries include, for example, the Kabat definition, the Chotia definition, and the AbM definition. In general, the Kabat definition is based on sequence variability, the Chotia definition is based on the position of structural loop regions, and the AbM definition is a compromise between the Kabat and Chotia approaches. See, for example, Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al. , J. Mol. Biol. 273 :927-948 (1997); and Martin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :9268-9272 (1989). Public databases are also available to identify CDR sequences in an antibody.

[46] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела к CD63 или их части. Например, настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[46] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding anti-CD63 antibodies or portions thereof. For example, the present invention provides nucleic acid molecules encoding any of the HCVR amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the HCVR nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[47] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[47] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCVR amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the LCVR amino acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% sequence identity thereto.

[48] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR1, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCDR1, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[48] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR1 amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the HCDR1 nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[49] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR2, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCDR2, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[49] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR2 amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the HCDR2 nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[50] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей HCDR3, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCDR3, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[50] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the HCDR3 amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the HCDR3 nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[51] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR1, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCDR1, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[51] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCDR1 amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR1 nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[52] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR2, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCDR2, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[52] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCDR2 amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR2 nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[53] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие любую из аминокислотных последовательностей LCDR3, перечисленных в таблице 10; в определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCDR3, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее.[53] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding any of the LCDR3 amino acid sequences listed in Table 10; in certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the LCDR3 nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98 % or at least 99% sequence identity with respect to it.

[54] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие HCVR, где HCVR содержит группу из трех CDR (т. е., HCDR1-HCDR2-HCDR3), при этом группа аминокислотных последовательностей HCDR1-HCDR2-HCDR3 является такой, как определено для любого из иллюстративных антител к CD63, перечисленных в таблице 10.[54] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding HCVR, wherein HCVR contains a group of three CDRs ( i.e., HCDR1-HCDR2-HCDR3), wherein the group of amino acid sequences HCDR1-HCDR2-HCDR3 is as defined for any of the exemplary anti-CD63 antibodies listed in Table 10.

[55] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие LCVR, где LCVR содержит группу из трех CDR (т. е., LCDR1-LCDR2-LCDR3), при этом группа аминокислотных последовательностей LCDR1-LCDR2-LCDR3 является такой, как определено для любого из иллюстративных антител к CD63, перечисленных в таблице 10.[55] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding LCVR, wherein LCVR contains a group of three CDRs ( i.e. , LCDR1-LCDR2-LCDR3), wherein the group of amino acid sequences LCDR1-LCDR2-LCDR3 is as defined for any of the exemplary anti-CD63 antibodies listed in Table 10.

[56] Настоящее изобретение также предусматривает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие как HCVR, так и LCVR, где HCVR содержит аминокислотную последовательность, представляющую собой любую из аминокислотных последовательностей HCVR, перечисленных в таблице 10, и где LCVR содержит аминокислотную последовательность, представляющую собой любую из аминокислотных последовательностей LCVR, перечисленных в таблице 10. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот HCVR, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности в отношении нее, и полинуклеотидную последовательность, выбранную из любой из последовательностей нуклеиновых кислот LCVR, перечисленных в таблице 10, или по сути аналогичную ей последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей в отношении нее. В определенных вариантах осуществления в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR и LCVR, где как HCVR, так и LCVR получены из одного и того же антитела к CD63, приведенного в таблице 10.[56] The present invention also provides nucleic acid molecules encoding both HCVR and LCVR, wherein HCVR contains an amino acid sequence that is any of the HCVR amino acid sequences listed in Table 10, and where LCVR contains an amino acid sequence that is any of LCVR sequences listed in Table 10. In certain embodiments, the nucleic acid molecule comprises a polynucleotide sequence selected from any of the HCVR nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereof, that is characterized by at least 90% of at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto, and a polynucleotide sequence selected from any of the LCVR nucleic acid sequences listed in Table 10, or a substantially similar sequence thereto, characterized by at least 90%, at least 95%, at least 98%, or at least 99% sequence identity thereto. In certain embodiments, in accordance with this aspect of the present invention, the nucleic acid molecule encodes HCVR and LCVR, where both HCVR and LCVR are derived from the same anti-CD63 antibody shown in Table 10.

[57] Настоящее изобретение также предусматривает рекомбинантные векторы экспрессии, способные экспрессировать полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела к CD63. Например, настоящее изобретение включает рекомбинантные векторы экспрессии, содержащие любую из упомянутых выше молекул нуклеиновых кислот, т. е, молекул нуклеиновых кислот, кодирующих любую из последовательностей HCVR, LCVR и/или CDR, представленных в таблице 10. Также в объем настоящего изобретения включены клетки-хозяева, в которые были введены векторы экспрессии, а также способы получения антител или их частей путем культивирования клеток-хозяев в условиях, обеспечивающих продуцирование антител или фрагментов антител, и выделение полученных таким образом антител и фрагментов антител.[57] The present invention also provides recombinant expression vectors capable of expressing a polypeptide comprising an anti-CD63 antibody heavy or light chain variable region. For example, the present invention includes recombinant expression vectors containing any of the nucleic acid molecules mentioned above, i.e. , nucleic acid molecules encoding any of the HCVR, LCVR and/or CDR sequences presented in Table 10. Cells are also included within the scope of the present invention - hosts into which expression vectors have been introduced, as well as methods for producing antibodies or parts thereof by culturing host cells under conditions that ensure the production of antibodies or antibody fragments, and isolating the antibodies and antibody fragments thus obtained.

[58] В некоторых аспектах настоящее изобретение включает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, такие как антитела к CD63, имеющие модифицированный профиль гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления могут быть применимыми модификация для удаления нежелательных сайтов гликозилирования, или антитело без фукозного фрагмента, который присутствует в олигосахаридной цепи, например, для усиления функции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (смотри Shields et al. (2002) JBC 277:26733), в случае, если цитотоксичность желательна. В других применениях модификацию галактозилирования можно осуществлять для модифицирования комплементзависимой цитотоксичности (CDC).[58] In some aspects, the present invention includes antibodies or antigen-binding fragments thereof, such as anti-CD63 antibodies, having a modified glycosylation profile. In some embodiments, modification to remove unwanted glycosylation sites, or an antibody without a fucose moiety that is present on the oligosaccharide chain, may be useful, for example, to enhance antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) function (see Shields et al. (2002) JBC 277:26733 ), in case cytotoxicity is desired. In other applications, modification of galactosylation can be carried out to modify complement dependent cytotoxicity (CDC).

[59] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантное антитело человека или его фрагмент, которые специфически связывают CD63, и фармацевтически приемлемый носитель. В связанном аспекте в настоящем изобретении представлена композиция, которая представляет собой комбинацию антитела к CD63 и второго терапевтического средства. В одном варианте осуществления второе терапевтическое средство представляет собой любое средство, при объединении которого с антителом к CD63 обеспечивается преимущество. Дополнительные комбинированные терапевтические препараты и комбинированные составы, включающие антитела к CD63 по настоящему изобретению, описаны в других частях данного документа.[59] In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising a recombinant human antibody or fragment thereof that specifically binds CD63, and a pharmaceutically acceptable carrier. In a related aspect, the present invention provides a composition that is a combination of an anti-CD63 antibody and a second therapeutic agent. In one embodiment, the second therapeutic agent is any agent that provides benefit when combined with an anti-CD63 antibody. Additional combination therapeutics and combination formulations comprising the anti-CD63 antibodies of the present invention are described elsewhere herein.

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫGRAPHIC MATERIALS

[60] На фигуре 1А схематически представлены мультидоменные терапевтические белки. На панели A изображен мультидоменный терапевтический белок, содержащий биспецифическое антитело (ii) и заместительный фермент (i). На панели B изображен слитый полипептид фермент-Fc (i), ассоциирующийся со специфическим в отношении эффектора интернализации полутелом (ii) с образованием мультидоменного терапевтического белка. На панели С изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с С-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели D изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с N-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели Е изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с С-концом легкой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели F изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с N-концом легкой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели G изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с С-концом одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), содержащего область VH (заштрихованный столбик) и область VL (незакрашенный столбик). На панели H изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с двумя доменами scFv, где первый scFv (i) служит в качестве первого домена доставки, и второй scFv (ii) служит в качестве второго домена доставки.[60] Figure 1A is a schematic representation of multidomain therapeutic proteins. Panel A depicts a multidomain therapeutic protein containing a bispecific antibody (ii) and a replacement enzyme (i). Panel B depicts an enzyme-Fc fusion polypeptide (i) associating with an internalization effector-specific hemibody (ii) to form a multidomain therapeutic protein. Panel C shows a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the C-terminus of the antibody heavy chain to the internalization effector. Panel D shows a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the N-terminus of the antibody heavy chain to the internalization effector. Panel E shows a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the C-terminus of the antibody light chain to the internalization effector. Panel F shows a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the N-terminus of the antibody light chain to the internalization effector. Panel G shows a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the C-terminus of a single chain variable fragment (scFv) containing a VH region (filled bar) and a VL region (open bar). Panel H depicts a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to two scFv domains, with the first scFv (i) serving as the first delivery domain and the second scFv (ii) serving as the second delivery domain.

[61] Фигура 1В представляет собой неограничивающую иллюстративную иллюстрацию вектора для генной терапии на основе AAV, который кодирует мультидоменный терапевтический белок, представленный на панели, где scFv представляет собой scFv к CD63 человека, а заместительный фермент представляет собой GAA (например, scFv к hCD63::hGAA; см., например, аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:10). Аминокислоты 1-119 под SEQ ID NO:10 обеспечивают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) антитела H5C6; аминокислоты 120-134 под SEQ ID NO:10 обеспечивают линкерную аминокислотную последовательность между вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей H5C6; аминокислоты 135-245 под SEQ ID NO:10 обеспечивают аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (V_L) антитела H5C6; аминокислоты 136-250 под SEQ ID NO:10 обеспечивают линкерную аминокислотную последовательность между scFv к hCD63 и GAA; и аминокислоты 251-1133 под SEQ ID NO:10 обеспечивают аминокислотную последовательность GAA. Иллюстративные последовательности 5'ITR и 3'ITR соответственно представлены под SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7. Иллюстративный специфический для печени энхансер (серпина 1) представлен под SEQ ID NO:9. Иллюстративный специфический для печени промотор (TTR) представлен под SEQ ID NO:8. Дополнительные иллюстративные аминокислотные последовательности V_H и V_L к CD63 (и кодирующие их нуклеотидные последовательности), которые можно использовать для конструирования мультидоменного терапевтического белка, содержащего антитело к CD63 или его антигенсвязывающую часть, представлены в таблице 10.[61] Figure 1B is a non-limiting exemplary illustration of an AAV-based gene therapy vector that encodes the multi-domain therapeutic protein shown in the panel, where the scFv is an anti-human CD63 scFv and the replacement enzyme is a GAA (e.g., an anti-hCD63 scFv: :hGAA; see, for example, the amino acid sequence shown under SEQ ID NO:10). Amino acids 1-119 of SEQ ID NO:10 provide the amino acid sequence of the heavy chain variable domain ( _VH ) of the H5C6 antibody; amino acids 120-134 of SEQ ID NO:10 provide the linker amino acid sequence between the H5C6 heavy and light chain variable domains; amino acids 135-245 of SEQ ID NO:10 provide the amino acid sequence of the light chain variable domain (V _L ) of the H5C6 antibody; amino acids 136-250 of SEQ ID NO:10 provide the linker amino acid sequence between the hCD63 scFv and GAA; and amino acids 251-1133 of SEQ ID NO:10 provide the amino acid sequence of GAA. Exemplary 5'ITR and 3'ITR sequences, respectively, are provided under SEQ ID NO:6 and SEQ ID NO:7. An exemplary liver-specific enhancer (serpin 1) is provided under SEQ ID NO:9. An exemplary liver-specific promoter (TTR) is provided under SEQ ID NO:8. Additional exemplary anti-CD63 V _H and V _L amino acid sequences (and nucleotide sequences encoding them) that can be used to design a multi-domain therapeutic protein containing an anti-CD63 antibody or an antigen-binding portion thereof are presented in Table 10.

[62] Фигура 2 представляет собой столбчатую диаграмму, изображающую количество накопленного гликогена в микрограммах на миллиграмм ткани в зависимости от доставленного фермента. На оси X изображены ткани от мыши CD63^hu/hu; GAA^-/- слева направо: сердце, четырехглавая мышца, икроножная мышца, диафрагма, камбаловидная мышца и длинная мышца-разгибатель пальцев (EDL). Черные ящики («1») отображают количество накопленного гликогена в мышиной модели болезни Помпе, не подвергнутой обработке. Оранжевые ящики («2») отображают количество накопленного гликогена в мышиной модели дикого типа, не подвергнутой обработке. Светло-зеленые ящики («3») отображают количество накопленного гликогена в мышиной модели болезни Помпе, которую подвергали обработке с помощью AAV-hGAA (вектор на основе аденоассоциированного вируса, содержащий ген, кодирующий GAA человека) в дозе 10¹⁰ vg. Темно-зеленые ящики («4») отображают количество накопленного гликогена в мышиной модели болезни Помпе, которую подвергали обработке с помощью AAV-hGAA в дозе 10¹¹ vg. Светло-зеленые ящики («5») отображают количество накопленного гликогена в мышиной модели болезни Помпе, которую подвергали обработке с помощью AAV с scFv к hCD63::hGAA (вектор на основе аденоассоциированного вируса, содержащий ген, кодирующий домен scFv к CD63 человека, связанный с GAA человека) в дозе 10¹⁰ vg. Темно-синие ящики («6») отображают количество накопленного гликогена в мышиной модели болезни Помпе, которую подвергали обработке с помощью AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹¹ vg.[62] Figure 2 is a bar graph depicting the amount of glycogen stored in micrograms per milligram of tissue as a function of enzyme delivered. The x-axis shows tissue from a CD63 ^hu/hu mouse; GAA ^-/- from left to right: heart, quadriceps, gastrocnemius, diaphragm, soleus, and extensor digitorum longus (EDL). Black boxes (“1”) represent the amount of glycogen stored in the untreated mouse model of Pompe disease. Orange boxes (“2”) represent the amount of glycogen stored in the untreated wild-type mouse model. Light green boxes (“3”) represent the amount of glycogen stored in a mouse model of Pompe disease that was treated with AAV-hGAA (an adeno-associated virus vector containing the gene encoding human GAA) at a dose of 10 ¹⁰ vg. Dark green boxes (“4”) represent the amount of glycogen stored in a mouse model of Pompe disease that was treated with 10 ¹¹ vg AAV-hGAA. Light green boxes (“5”) represent the amount of glycogen stored in a mouse model of Pompe disease that was treated with an AAV with an anti-hCD63::hGAA scFv (an adeno-associated virus vector containing a gene encoding the human CD63 scFv domain associated with human GAA) at a dose of 10 ¹⁰ vg. Dark blue boxes (“6”) represent the amount of glycogen stored in a mouse model of Pompe disease that was treated with AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg.

[63] Фигура 3 представляет собой столбчатую диаграмму, изображающую средний уровень содержания гликогена (мкг/мг), измеренный в скелетной мышечной ткани каждой мыши через 3 месяца после инъекции AAV. Каждое значение измерения нанесено на график в виде зависимости от уровня воздействия GAA (т. е. уровня содержания в сыворотке крови) на каждую мышь, которую подвергали обработке с помощью конкретной конструкции на основе фермента в конкретной дозировке. Закрашенные квадраты обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Закрашенные пирамиды обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹¹ vg. Закрашенные перевернутые пирамиды обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Закрашенные ромбы обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹¹ vg.[63] Figure 3 is a bar graph depicting the average glycogen level (μg/mg) measured in the skeletal muscle tissue of each mouse 3 months after AAV injection. Each measurement value is plotted against the level of GAA exposure ( i.e., serum level) for each mouse that was treated with a specific enzyme construct at a specific dosage. Filled squares indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Filled pyramids indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg. Filled inverted pyramids indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Filled diamonds indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg.

[64] Фигура 4 представляет собой точечный график, изображающий средний уровень содержания гликогена (мкг/мг) в сердечной мышце, измеренный в ткани сердца через 3 месяца после инъекции AAV, в зависимости от уровня воздействия GAA (т. е. уровней содержания в сыворотке крови) на каждую мышь, которую подвергали обработке с помощью конкретной конструкции на основе фермента при конкретной дозировке. Закрашенные квадраты обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Закрашенные пирамиды обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹¹ vg. Закрашенные перевернутые пирамиды обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Закрашенные ромбы обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹¹ vg.[64] Figure 4 is a scatter plot depicting mean cardiac glycogen levels (μg/mg) measured in cardiac tissue 3 months after AAV injection as a function of the level of GAA exposure ( i.e., serum levels blood) for each mouse that was treated with a specific enzyme construct at a specific dosage. Filled squares indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Filled pyramids indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg. Filled inverted pyramids indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Filled diamonds indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg.

[65] Фигура 5 представляет собой точечный график, изображающий титры антител к GAA через 3 месяца после инъекции AAV в зависимости от уровня воздействия GAA (т. е. уровней содержания в сыворотке крови) на каждую мышь, которую подвергали обработке с помощью конкретной конструкции на основе фермента при конкретной дозировке. Незакрашенные квадраты обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Незакрашенные круги обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹¹ vg. Незакрашенные ромбы обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Шестиугольники обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹¹ vg.[65] Figure 5 is a scatter plot depicting anti-GAA antibody titers 3 months after AAV injection as a function of the level of GAA exposure (i.e., serum levels) in each mouse that was treated with a particular construct at based on the enzyme at a specific dosage. Open squares indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Open circles indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg. Open diamonds indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Hexagons indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg.

[66] Фигура 6 представляет собой точечный график, изображающий титры антител к GAA через 3 месяца после инъекции AAV в зависимости от конструкции на основе фермента и дозы. Круги обозначают контрольных мышей, получающих пустой вектор на основе AAV. Квадраты обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Пирамиды обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹¹ vg. Перевернутые пирамиды обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Ромбы обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹¹ vg.[66] Figure 6 is a scatter plot depicting anti-GAA antibody titers 3 months after AAV injection as a function of enzyme construct and dose. Circles represent control mice receiving empty AAV vector. Squares indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Pyramids indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg. Inverted pyramids indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Diamonds indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg.

[67] Фигура 7А представляет собой линейный график, изображающий уровни содержания GAA в сыворотке крови (произвольные единицы «a.u.»; ось Y) в зависимости от времени в неделях после инъекции вектора для генной терапии. Квадраты обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Пирамиды обозначают AAV-hGAA в дозе 10¹¹ vg. Перевернутые пирамиды обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹⁰ vg. Ромбы обозначают AAV с scFv к hCD63::hGAA в дозе 10¹¹ vg.[67] Figure 7A is a line graph depicting serum GAA levels (arbitrary "au"units; Y-axis) versus time in weeks following gene therapy vector injection. Squares indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Pyramids indicate AAV-hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg. Inverted pyramids indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹⁰ vg. Diamonds indicate AAV with scFv to hCD63::hGAA at a dose of 10 ¹¹ vg.

[68] Фигура 7В представляет собой гистограмму, изображающую соотношения мРНК (мРНК hGAA относительно мРНК mGAPDH) после введения конструкций на основе AAV мышам CD63 HumIn с нокаутом GAA (мыши GAA-/-, CD63hu/hu) или мышам GAA+/+, CD63hu/hu таким образом: (1) необработанный контроль (2) AAV-специфический для печени промотор-hGAA (1e10vg), (3) AAV-специфический для печени промотор-hGAA (1e11vg), (4) AAV-специфический для печени промотор-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA (1e10vg), (5) AAV-специфический для печени промотор-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA (1e11vg) или (6) необработанный контроль (GAA+/+, CD63hu/hu). Экспрессия GAA в печени была обнаружена при всех инъекциях конструкции на основе AAV.[68] Figure 7B is a histogram depicting the mRNA ratios (hGAA mRNA relative to mGAPDH mRNA) following administration of AAV-based constructs to CD63 HumIn GAA knockout mice (GAA−/− mice, CD63hu/hu) or GAA+/+, CD63hu/ mice. hu thus: (1) untreated control (2) AAV liver-specific promoter-hGAA (1e10vg), (3) AAV liver-specific promoter-hGAA (1e11vg), (4) AAV liver-specific promoter fragment hCD63::hGAA binding (1e10vg), (5) AAV liver-specific promoter fragment hCD63::hGAA binding (1e11vg) or (6) untreated control (GAA+/+, CD63hu/hu). Hepatic GAA expression was detected in all injections of the AAV-based construct.

[69] Фигура 7С представляет собой график, на котором сравнивается уровень содержания GAA в сыворотке крови с уровнем экспрессии РНК GAA у мышей, получающих AAV, кодирующий слитый белок (квадраты), и мышей, получающих AAV, кодирующий GAA (обе конструкции обеспечивали специфический для печени промотор (LSP) для управления экспрессией).[69] Figure 7C is a graph comparing serum GAA levels with GAA RNA expression levels in mice receiving AAV encoding the fusion protein (squares) and mice receiving AAV encoding GAA (both constructs provided specific liver promoter (LSP) to drive expression).

[70] Фигура 7D представляет собой гистограмму, изображающую гепатоциты человека Huh-7, временно трансфицированные конструкциями, управляемыми специфическим для печени промотором, кодирующими hGAA, scFv к hCD63::GAA (слитая конструкция) или контрольную несвязывающую слитую конструкцию scFv::GAA. Для обеих слитых конструкций scFv::GAA было характерным более высокое соотношение белка в секретируемом супернатанте, чем hGAA отдельно через 3 дня после трансфекции. Добавление M6P в супернатант в течение экспериментального периода для уменьшения CI-MPR-опосредованного захвата не влияло на соотношение. (* = р <0,05, n=3).[70]Figure 7Dis a histogram depicting Huh-7 human hepatocytes transiently transfected with liver-specific promoter-driven constructs encoding hGAA, scFv to hCD63::GAA (fusion construct), or a control non-binding scFv::GAA fusion construct. Both scFv::GAA fusion constructs had a higher protein ratio in the secreted supernatant than hGAA alone 3 days after transfection. Addition of M6P to the supernatant during the experimental period to reduce CI-MPR-mediated uptake did not affect the ratio. (* = p <0.05, n=3).

[71] Фигура 8 представляет собой флуоресцентные микрофотографии, изображающие лизосомы, окрашенные по LAMP1 в мышечных волокнах мыши, контрастно окрашенных с помощью DAPI для выявления ядер. На панелях А и А1 изображены клетки четырехглавой мышцы, полученные от необработанной мыши дикого типа (GAA^+/+) и окрашенные по LAMP1 (панель А) и ядру (панель А1). На панелях B и B1 изображены клетки четырехглавой мышцы, полученные от необработанной мыши с нокаутом по GAA (GAA^-/-) и окрашенные по LAMP1 (панель B) и ядру (панель B1). На панелях C и C1 изображены клетки четырехглавой мышцы, полученные от мыши GAA-/-, которую подвергали обработке с помощью конструкции на основе AAV-hGAA, и окрашенные по LAMP1 (панель C) и ядру (панель C1). На панелях D и D1 изображены клетки четырехглавой мышцы, полученные от мыши GAA^-/-, которую подвергали обработке с помощью конструкции на основе AAV с scFv к hCD63::hGAA, и окрашенные по LAMP1 (панель D) и ядру (панель D1).[71] Figure 8 is fluorescence micrographs depicting lysosomes stained for LAMP1 in mouse muscle fibers counterstained with DAPI to reveal nuclei. Panels A and A1 depict quadriceps muscle cells obtained from an untreated wild-type mouse (GAA ^+/+ ) and stained for LAMP1 (panel A) and the nucleus (panel A1). Panels B and B1 depict quadriceps muscle cells obtained from an untreated GAA knockout mouse (GAA ^−/− ) and stained for LAMP1 (panel B) and the nucleus (panel B1). Panels C and C1 depict quadriceps muscle cells obtained from a GAA −/− mouse that was treated with an AAV-hGAA-based construct and stained for LAMP1 (panel C) and nucleus (panel C1). Panels D and D1 depict quadriceps muscle cells obtained from a GAA ^−/− mouse that was treated with an AAV-based construct with scFv to hCD63::hGAA and stained for LAMP1 (panel D) and nucleus (panel D1).

[72] На фигуре 9 изображены линейные графики, показывающие силу захвата и эффективность выполнения теста с вращающимся барабаном у мышей, обработанных с помощью либо AAV-LSP-hGAA, либо AAV-LSP-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA. Измерения при ускорении вращающегося барабана (A) и измерения силы захвата передних конечностей (B) у мышей с GAA дикого типа (перевернутый треугольник), необработанного контроля (квадрат), мышей, обработанных с помощью AAV-LSP-hGAA (1e11vg/мышь) (треугольник) или мышей, обработанных с помощью AAV-LSP-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA (1e11vg/мышь) (круг) проводились с месячными интервалами в течение 6 месяцев. Планки погрешностей представляют собой +/- SD. N=8-10 для всех групп.[72] Figure 9 depicts line graphs showing grip strength and spin-drum test performance in mice treated with either AAV-LSP-hGAA or AAV-LSP-hCD63::hGAA binding fragment. Rotating drum acceleration measurements ( A ) and forelimb grip strength measurements ( B ) in wild-type GAA mice (inverted triangle), untreated control (square), AAV-LSP-hGAA-treated mice (1e11vg/mouse) ( triangle) or mice treated with AAV-LSP-hCD63::hGAA binding fragment (1e11vg/mouse) (circle) were performed at monthly intervals for 6 months. Error bars represent +/- SD. N=8-10 for all groups.

[73] На фигуре 10А и фигуре 10В показано применение других мембранных белков в качестве направляющих, таких как слитые белки на основе scFv к ITGA7 (интегрин альфа-7), для направления GAA. На фигуре 10А показана активность GAA (ось у) миобластов мыши C2C12, проинкубированных в течение ночи с комплексом фрагмент, связывающий мышиный CD63-GAA, или комплексом фрагмент, связывающий мышиный ITGA7-GAA с или без 5 мМ M6P. На фигуре 10В показаны мыши с нокаутом GAA, гуманизированные по CD63 (GAA-/-; CD63hu/hu), которым вводили плазмиды, кодирующие формат scFv::GAA комплекса фрагмент, связывающий hCD63::GAA (2) или формат полноразмерный IgG4::GAA фрагмента, связывающего интегрин альфа-7 мыши (3) путем гидродинамической доставки (HDD), затем уровни содержания гликогена в ткани измеряли через 3 недели после HDD. Необработанные контрольные мыши GAA-/-; CD63hu/hu (1) и необработанные контрольные мыши дикого типа GAA+/+; CD63hu/hu (4) также тестировали на уровни содержания гликогена в тех же тканях.[73] Figure 10A and Figure 10B show the use of other membrane proteins as guides, such as scFv-based fusion proteins to ITGA7 (integrin alpha-7), to target GAA. Figure 10A shows the GAA activity (y axis) of mouse C2C12 myoblasts incubated overnight with the mouse CD63-GAA fragment-binding complex or the mouse ITGA7-GAA fragment-binding complex with or without 5 mM M6P. Figure 10B shows CD63 humanized GAA knockout mice (GAA-/-; CD63hu/hu) that were treated with plasmids encoding the scFv::GAA complex format hCD63::GAA binding fragment (2) or the full-length IgG4::format. GAA fragment binding murine alpha-7 integrin (3) by hydrodynamic delivery (HDD), then tissue glycogen levels were measured 3 weeks after HDD. Untreated control GAA-/- mice; CD63hu/hu (1) and untreated control wild-type GAA+/+ mice; CD63hu/hu (4) was also tested for glycogen levels in the same tissues.

[74] Фигура 11 представляет собой точечный график, изображающий уровни содержания GAA в сыворотке крови (произвольные единицы «a.u.»; ось y) спустя месяц после инъекции AAV в зависимости от в зависимости от конструкции фермента и дозы. Квадраты обозначают AAV-LSP-Δ8GAA. Пирамиды обозначают AAV-scFv к hCD63::GAA. Обе конструкции обеспечивали специфический для печени промотор (LSP) для стимуляции экспрессии. Доза представлена в виде количества вирусного генома (vg) на килограмм (кг) мыши.[74] Figure 11 is a scatter plot depicting serum GAA levels (arbitrary "au"units; y-axis) one month after AAV injection as a function of enzyme design and dose. Squares indicate AAV-LSP-Δ8GAA. Pyramids indicate AAV-scFv to hCD63::GAA. Both constructs provided a liver-specific promoter (LSP) to stimulate expression. The dose is presented as the amount of viral genome (vg) per kilogram (kg) of mouse.

[75] На фигуре 12 представлены дот-блот анализы, изображающие уровни содержания гликогена в микрограммах на миллиграмм ткани (сердце, квадрицепс, диафрагма или трицепс) в зависимости от уровня содержания GAA в сыворотке крови. Квадраты обозначают AAV-LSP-Δ8GAA. Пирамиды обозначают AAV-scFv к hCD63::GAA. Обе конструкции обеспечивали специфический для печени промотор (LSP) для стимуляции экспрессии.[75] Figure 12 shows dot blot assays depicting glycogen levels in micrograms per milligram of tissue (heart, quadriceps, diaphragm, or triceps) as a function of serum GAA levels. Squares indicate AAV-LSP-Δ8GAA. Pyramids indicate AAV-scFv to hCD63::GAA. Both constructs provided a liver-specific promoter (LSP) to stimulate expression.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION

[76] Настоящее изобретение не ограничено описанными конкретными вариантами осуществления, композициями, способами и условиями эксперимента, поскольку такие варианты осуществления, композиции, способы и условия могут варьировать. Терминология, используемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.[76] The present invention is not limited to the specific embodiments, compositions, methods and experimental conditions described, since such embodiments, compositions, methods and conditions may vary. The terminology used herein is for purposes of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting as the scope of the present invention will be limited only by the appended claims.

[77] Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, аналогичные описанным в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны лишь некоторые предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как это обычно понимает специалист в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.[77] Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein may be used in practicing or testing the present invention, only certain preferred methods and materials are described herein. All publications referred to herein are incorporated herein by reference in their entirety. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one skilled in the art to which the present invention belongs.

[78] «Заболевания, связанные с дефицитом ферментов» включают нелизосомные болезни накопления, такие как болезнь Краббе (галактозилцерамидаза), фенилкетонурия, галактоземия, болезнь кленового сиропа, митохондриальные нарушения, атаксия Фридрейха, синдром Зеллвегера, адренолейкодистрофия, болезнь Вильсона, гемохроматоз, дефицит орнитинтранскарбамилазы, метилмалоновая ацидемия, пропионовая ацидемия и лизосомные болезни накопления. Термин «лизосомные болезни накопления» включает любое нарушение, возникшее в результате дефекта функции лизосомы. На данный момент идентифицировали приблизительно 50 лизосомных болезней накопления, наиболее известные из которых включают болезнь Тея-Сакса, болезнь Гоше и болезнь Ниманна-Пика. Патогенез этих заболеваний объясняют накоплением продуктов неполного разрушения в лизосоме, обычно из-за утраты белковой функции. Лизосомные болезни накопления вызываются утратой функции или истощением вариантов в белках, чья нормальная функция заключается в разрушении или координации разрушения лизосомного содержимого. Белки, связанные с лизосомными болезнями накопления, предусматривают ферменты, рецепторы и другие трансмембранные белки (например, NPC1), посттрансляционные модифицирующие белки (например, сульфатазу), белки переноса через мембрану, а также неферментативные кофакторы и другие растворимые белки (например, GM2 ганглиозидный активатор). Таким образом, лизосомные болезни накопления охватывают больше расстройств кроме тех нарушений, которые вызваны дефективными ферментами per se, и включают в себя любое нарушение, вызванное любым молекулярным дефектом. Таким образом, используемый в данном документе термин «фермент» охватывает те другие белки, ассоциированные с лизосомными болезнями накопления.[78] "Diseases associated with enzyme deficiency" include non-lysosomal storage diseases such as Krabbe disease (galactosylceramidase), phenylketonuria, galactosemia, maple syrup disease, mitochondrial disorders, Friedreich's ataxia, Zellweger syndrome, adrenoleukodystrophy, Wilson's disease, hemochromatosis, ornithine transcarbamylase deficiency , methylmalonic acidemia, propionic acidemia and lysosomal storage diseases. The term "lysosomal storage diseases" includes any disorder resulting from a defect in lysosome function. To date, approximately 50 lysosomal storage diseases have been identified, the best known of which include Tay-Sachs disease, Gaucher disease, and Niemann-Pick disease. The pathogenesis of these diseases is explained by the accumulation of products of incomplete destruction in the lysosome, usually due to loss of protein function. Lysosomal storage diseases are caused by loss of function or depletion variants in proteins whose normal function is to destroy or coordinate the destruction of lysosomal contents. Proteins associated with lysosomal storage diseases include enzymes, receptors and other transmembrane proteins (eg, NPC1), post-translational modifying proteins (eg, sulfatase), membrane transport proteins, and nonenzymatic cofactors and other soluble proteins (eg, GM2 ganglioside activator ). Thus, lysosomal storage diseases cover more disorders than those caused by defective enzymes per se, and include any disorder caused by any molecular defect. Thus, as used herein, the term “enzyme” includes those other proteins associated with lysosomal storage diseases.

[79] Природа молекулярного повреждения влияет на тяжесть заболевания во многих случаях, т. e. полная утрата функции, как правило, ассоциирован с пренатальным или неонатальным проявлением и предусматривает тяжелые симптомы; частичная утрата функции ассоциирована со менее выраженным (относительно) и более поздним проявлением заболевания. Как правило, требуется восстановить только небольшое процентное отношение активности, чтобы исправить метаболические дефекты в дефицитных клетках. В таблице 1 перечисляются некоторые из более распространенных лизосомных болезней накопления и ассоциированные с утратой функции при них белки. Лизосомные болезни накопления, как правило, описаны у Desnick and Schuchman, 2012.[79] The nature of the molecular damage influences the severity of the disease in many cases, i.e. complete loss of function is usually associated with prenatal or neonatal presentation and involves severe symptoms; partial loss of function is associated with a less pronounced (relatively) and later manifestation of the disease. Typically, only a small percentage of activity needs to be restored to correct metabolic defects in deficient cells. Table 1 lists some of the more common lysosomal storage diseases and their associated loss of function proteins. Lysosomal storage diseases are generally described in Desnick and Schuchman, 2012.

[80] Лизосомные болезни накопления могут быть систематизированы по типу продукта, который накапливается в дефективной лизосоме. Сфинголипидоз представляет собой класс заболеваний, которые поражают метаболизм сфинголипидов, которые являются липидами, содержащими жирные кислоты, соединенные с алифатическими аминоспиртами (обзор в S. Hakomori, «Glycosphingolipids in Cellular Interaction, Differentiation, and Oncogenesis», 50 Annual Review of Biochemistry 733-764, July 1981). Накопленные продукты сфинголипидоза включают в себя ганглиозиды (например, заболевание Тея-Сакса), гликолипиды (например, заболевание Фабри) и глюкоцереброзиды (например, заболевание Гоше).[80] Lysosomal storage diseases can be classified according to the type of product that accumulates in the defective lysosome. Sphingolipidosis is a class of diseases that affect the metabolism of sphingolipids, which are lipids containing fatty acids coupled to aliphatic amino alcohols (reviewed in S. Hakomori, “Glycosphingolipids in Cellular Interaction, Differentiation, and Oncogenesis,” 50 Annual Review of Biochemistry 733-764 , July 1981). The accumulated products of sphingolipidosis include gangliosides (eg, Tay-Sachs disease), glycolipids (eg, Fabry disease), and glucocerebrosides (eg, Gaucher disease).

[81] Мукополисахаридоз представляет собой группу заболеваний, которые поражают метаболизм глюкозаминогликанов (GAGS или мукополисахаридов), которые представляют собой длинные неразветвленные цепи повторяющихся дисахаридов, которые помогают строить кость, хрящ, сухожилия, роговицу, кожу и соединительную ткань (обзор в Muenzer, «Early initiation of enzyme replacement therapy for the mucopolysaccharidoses», 111(2) Mol. Genet. Metab. 63-72 (Feb. 2014); Sasisekharan et al., «Glycomics approach to structure-function relationships of glycosaminoglycans», 8(1) Ann. Rev. Biomed. Eng. 181-231 (Dec. 2014)). Накопленные продукты мукополисахаридоза включают в себя гепарана сульфат, дерматана сульфат, кератина сульфат, различные формы хондроитина сульфата и гиалуроновую кислоту. Например, синдром Моркио А типа обуславливается дефектом в лизосомном ферменте галактоза-6-сульфат-сульфатаза, который приводит к накоплению кератина сульфата и хондроитин-6-сульфатав в лизосомах.[81] Mucopolysaccharidosis is a group of diseases that affect the metabolism of glycosaminoglycans (GAGS or mucopolysaccharides), which are long, unbranched chains of repeating disaccharides that help build bone, cartilage, tendon, cornea, skin and connective tissue (reviewed in Muenzer, “Early initiation of enzyme replacement therapy for the mucopolysaccharidoses", 111(2) Mol. Genet. Metab. 63-72 (Feb. 2014); Sasisekharan et al., "Glycomics approach to structure-function relationships of glycosaminoglycans", 8(1) Ann. Rev. Biomed. Eng. 181-231 (Dec. 2014)). Accumulated products of mucopolysaccharidosis include heparan sulfate, dermatan sulfate, keratin sulfate, various forms of chondroitin sulfate, and hyaluronic acid. For example, Morquio syndrome type A is caused by a defect in the lysosomal enzyme galactose-6-sulfate sulfatase, which leads to the accumulation of keratin sulfate and chondroitin-6-sulfate in lysosomes.

[82] Болезни накопления гликогена (также известные как гликогеноз) являются результатом неспособности клетки к метаболизму (к созданию или разрушению) гликогена. Метаболизм гликогена модерируется различными ферментами или другими белками, в том числе глюкоза-6-фосфатазой, кислой альфа-глюкозидазой, линеаризирующим гликоген ферментом, разветвляющим гликоген ферментом, мышечной гликогенфосфорилазой, печеночной гликогенфосфорилазой, мышечной фосфофруктокиназой, киназой фосфорилазы, переносчиком глюкозы, альдолазой A, бета-энолазой и гликогенсинтазой. Типичной болезнью лизосомного накопления/накопления гликогена является болезнь Помпе, при которой дефективная кислая альфа-глюкозидаза вызывает накопление гликогена в лизосомах. Симптомы включают в себя гепатомегалию, мышечную слабость, сердечную недостаточность, а в случае инфантильного варианта смерть в возрасте до 2 лет (см. DiMauro and Spiegel, «Progress and problems in muscle glycogenosis», 30(2) Acta Myol. 96-102 (Oct. 2011)).[82] Glycogen storage diseases (also known as glycogenosis) result from the cell's inability to metabolize (make or break down) glycogen. Glycogen metabolism is moderated by various enzymes or other proteins, including glucose-6-phosphatase, acid alpha-glucosidase, glycogen linearizing enzyme, glycogen branching enzyme, muscle glycogen phosphorylase, hepatic glycogen phosphorylase, muscle phosphofructokinase, phosphorylase kinase, glucose transporter, aldolase A, beta -enolase and glycogen synthase. A typical lysosomal/glycogen storage disease is Pompe disease, in which defective acid alpha-glucosidase causes glycogen to accumulate in lysosomes. Symptoms include hepatomegaly, muscle weakness, heart failure, and in the case of the infantile variant, death before the age of 2 years (see DiMauro and Spiegel, “Progress and problems in muscle glycogenosis,” 30(2) Acta Myol. 96-102 ( Oct. 2011)).

[83] «Мультидоменный терапевтический белок» предусматривает (i) один белок, который содержит более чем один функциональный домен, (ii) белок, который содержит более чем одну полипептидную цепь, и (iii) смесь из более чем одного белка или более чем одного полипептида. Термин «полипептид», как правило, означает отдельную цепь аминокислот, соединенных вместе пептидными связями. Термин «белок» охватывает термин «полипептид», но также включает в себя более сложные структуры. То есть отдельный полипептид является белком, и белок может содержать один или более полипептидов, ассоциированных в структуру более высокого порядка. Например, гемоглобин является белком, содержащим четыре полипептида: два альфа-глобиновых полипептида и два бета-глобиновых полипептида. Миоглобин также является белком, но он содержит только один миоглобиновый полипептид.[83] A "multi-domain therapeutic protein" refers to (i) a single protein that contains more than one functional domain, (ii) a protein that contains more than one polypeptide chain, and (iii) a mixture of more than one protein or more than one polypeptide. The term "polypeptide" generally refers to a single chain of amino acids linked together by peptide bonds. The term "protein" covers the term "polypeptide" but also includes more complex structures. That is, a single polypeptide is a protein, and a protein may contain one or more polypeptides associated in a higher order structure. For example, hemoglobin is a protein containing four polypeptides: two alpha-globin polypeptides and two beta-globin polypeptides. Myoglobin is also a protein, but it contains only one myoglobin polypeptide.

[84] Мультидоменный терапевтический белок содержит один или более полипептидов и по меньшей мере два домена, выполняющих две функции. Один из этих доменов представляет собой «ферментативный домен», который обеспечивает замещение активности дефектного белка, ассоциированного с заболеванием, связанным с дефицитом ферментов. Другой из этих доменов представляет собой «домен доставки», который обеспечивает связывание с эффектором интернализации. Таким образом, один полипептид, который обеспечивает замещение активности фермента и способность связываться с эффектором интернализации (также известный, как белок, связывающий эффектор интернализации (активность домена доставки)), представляет собой мультидоменный терапевтический белок. Также смесь белков, где один белок обеспечивает функцию фермента, а другой белок обеспечивает активность связывания с эффектором интернализации, представляет собой мультидоменный терапевтический белок. На фигуре 1А изображены различные примеры мультидоменных терапевтических белков. В одном примере (фигура 1A, панель A) мультидоменный терапевтический белок содержит фермент (представленный шестиугольником) и биспецифическое антитело (IE-BP), которое связывает фермент (пунктирные линии) и эффектор интернализации (сплошные линии). В данном случае одно плечо биспецифического антитела нековалентно связывается с ферментом, а другое плечо нековалентно связывается с эффектором интернализации, тем самым обеспечивая интернализацию заместительного фермента в клетку или субклеточный компартмент. В другом примере (панель B) мультидоменный терапевтический белок предусматривает один белок, содержащий два полипептида, при этом один полипептид обладает функцией фермента, а другой обладает функцией домена доставки. В данном случае фермент слит с Fc-доменом иммуноглобулина или константной областью тяжелой цепи, которая ассоциируется с Fc-доменом полуантитела к ферменту, с образованием бифункционального мультидоменного терапевтического белка. Вариант осуществления, изображенный на панели B, аналогичен таковому на панели A, за исключением того, что фермент ковалентно присоединен к одному из полуантител, а не посредством взаимодействия антиген-антитело по вариабельному домену иммуноглобулина полуантитела.[84] A multidomain therapeutic protein contains one or more polypeptides and at least two domains that have dual functions. One of these domains is an “enzyme domain” that provides replacement activity for a defective protein associated with enzyme deficiency disease. Another of these domains is the “delivery domain,” which mediates binding to the internalization effector. Thus, a single polypeptide that provides replacement enzyme activity and the ability to bind to an internalization effector (also known as internalization effector binding protein (delivery domain activity)) is a multidomain therapeutic protein. Also, a mixture of proteins, where one protein provides enzyme function and another protein provides internalization effector binding activity, is a multidomain therapeutic protein. Figure 1A depicts various examples of multidomain therapeutic proteins. In one example (Figure 1A, panel A), a multidomain therapeutic protein contains an enzyme (represented by a hexagon) and a bispecific antibody (IE-BP) that binds the enzyme (dashed lines) and the internalization effector (solid lines). Here, one arm of the bispecific antibody binds non-covalently to the enzyme and the other arm non-covalently binds to the internalization effector, thereby allowing the replacement enzyme to be internalized into the cell or subcellular compartment. In another example (Panel B), a multidomain therapeutic protein comprises a single protein comprising two polypeptides, wherein one polypeptide has enzyme function and the other has delivery domain function. Here, the enzyme is fused to the Fc domain of an immunoglobulin or a heavy chain constant region that associates with the Fc domain of a semi-antibody to the enzyme to form a bifunctional multidomain therapeutic protein. The embodiment depicted in panel B is similar to that in panel A, except that the enzyme is covalently attached to one of the half-antibodies rather than through an antigen-antibody interaction at the immunoglobulin variable domain of the half-antibody.

[85] В других примерах мультидоменный терапевтический белок состоит из фермента, ковалентно связанного (непосредственно или опосредованно с помощью линкера) с доменом доставки. В одном варианте осуществления фермент присоединен к С-концу молекулы иммуноглобулина (например, к тяжелой цепи или, в качестве альтернативы, к легкой цепи). В других вариантах осуществления фермент присоединен к N-концу молекулы иммуноглобулина (например, к тяжелой цепи или, в качестве альтернативы, к легкой цепи). В данных примерах молекула иммуноглобулина представляет собой домен доставки. В еще одном варианте осуществления фермент присоединен к С-концу молекулы scFv, которая связывает эффектор интернализации.[85] In other examples, a multidomain therapeutic protein consists of an enzyme covalently linked (directly or indirectly via a linker) to a delivery domain. In one embodiment, the enzyme is attached to the C-terminus of the immunoglobulin molecule (eg, to the heavy chain or, alternatively, to the light chain). In other embodiments, the enzyme is attached to the N-terminus of the immunoglobulin molecule (eg, to the heavy chain or, alternatively, to the light chain). In these examples, the immunoglobulin molecule is a delivery domain. In yet another embodiment, the enzyme is attached to the C-terminus of the scFv molecule, which binds the internalization effector.

[86] В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит два домена доставки. В одном варианте осуществления первый домен доставки связывается с молекулой- лизосомного транспорта или другим эффектором интернализации (например, CD63). В другом варианте осуществления второй домен доставки связывается с эффектором трансцитоза для обеспечения трансклеточного транспорта мультидоменного терапевтического белка. В одном варианте осуществления эффектор трансцитоза представляет собой, среди прочего, рецептор LDL, рецептор IgA, рецептор трансферрина или неонатальный Fc-рецептор (FcRn). В конкретном варианте осуществления домен доставки, обеспечивающий трансцитоз, предусматривает молекулу, которая связывается с рецептором трансферрина, такую как, например, антитело к рецептору трансферрина или молекула scFv к рецептору трансферрина. Публикация Tuma and Hubbard, «Transcytosis: Crossing Cellular Barriers», Physiological Reviews, 83(3): 871-935 (1 июля 2003 г.) включена в данный документ посредством ссылки в отношении рецепторов клеточной поверхности, которые опосредуют трансцитоз, которые применимы при практическом осуществлении настоящего изобретения.[86] In one embodiment, the multidomain therapeutic protein contains two delivery domains. In one embodiment, the first delivery domain binds to a lysosomal transport molecule or other internalization effector (eg, CD63). In another embodiment, the second delivery domain binds to a transcytosis effector to facilitate transcellular transport of a multidomain therapeutic protein. In one embodiment, the transcytosis effector is, among others, an LDL receptor, an IgA receptor, a transferrin receptor, or a neonatal Fc receptor (FcRn). In a specific embodiment, the transcytosis delivery domain comprises a molecule that binds to the transferrin receptor, such as, for example, an anti-transferrin receptor antibody or an anti-transferrin receptor scFv molecule. Tuma and Hubbard, “Transcytosis: Crossing Cellular Barriers,” Physiological Reviews, 83(3): 871–935 (July 1, 2003), is incorporated herein by reference with respect to cell surface receptors that mediate transcytosis that are useful in practical implementation of the present invention.

[87] «Ферментативный домен» или «фермент» означает любой белок, ассоциированный с этиологией или физиологическим эффектом заболевания, связанного с дефицитом ферментов. Фермент предусматривает собственно фермент, транспортный белок, рецептор или другой белок, который является дефективным и который рассматривается в роли молекулярного повреждения, вызывающего заболевание. Фермент также предусматривает любой белок, который может обеспечивать аналогичную или достаточную биохимическую или физиологическую активность, который обеспечивает замещение или обход молекулярного повреждения при заболевании. Например, «изозим» может использоваться в качестве фермента. Примеры белков, связанных с лизосомной болезнью накопления, включают белки, приведенные в таблице 1 как «вовлеченный фермент/белок», а также любой известный или открытый позже белок или другую молекулу, которые обеспечивают обход молекулярного дефекта при заболевании, связанном с дефицитом ферментов.[87] "Enzyme domain" or "enzyme" means any protein associated with the etiology or physiological effect of a disease associated with enzyme deficiency. The enzyme itself includes an enzyme, transport protein, receptor or other protein that is defective and that is considered to be the molecular lesion causing the disease. An enzyme also includes any protein that can provide similar or sufficient biochemical or physiological activity to replace or bypass molecular damage in a disease. For example, "isozyme" can be used as an enzyme. Examples of proteins associated with lysosomal storage disease include those listed in Table 1 as “enzyme/protein involved,” as well as any known or later discovered protein or other molecule that circumvents the molecular defect in an enzyme deficiency disease.

[88] В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой гидролазу, включая эстеразы, гликозилазы, гидролазы, которые действуют на эфирные связи, пептидазы, линейные амидазы, дифосфатазы, кетонгидролазы, галогеназы, фосфоамидазы, сульфогидролазы, сульфиназы, десульфиназы и т. п. В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой гликозилазу, включая гликозидазы и N-гликозилазы. В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой гликозидазу, включая альфа-амилазу, бета-амилазу, глюкан-1,4-альфа-глюкозидазу, целлюлозу, эндо-1,3(4)-бета-глюканазу, инулиназу, эндо-1,4-бета-ксиланазу, эндо-1,4-b-ксиланазу, декстраназу, хитиназу, полигалактуронидазу, лизоцим, экзо-альфа-сиалидазу, альфа-глюкозидазу, бета-глюкозидазу, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, альфа-маннозидазу, бета-маннозидазу, бета-фруктофуранозидазу, альфа,альфа-трегалозу, бета-глюкуронидазу, ксилан-эндо-1,3-бета-ксилозидазу, амило-альфа-1,6-глюкозидазу, гиалуроноглюкозаминидазу, гиалуроноглюкуронидазу и т. п.[88] In some embodiments, the enzyme is a hydrolase, including esterases, glycosylases, hydrolases that act on ester bonds, peptidases, linear amidases, diphosphatases, ketone hydrolases, halogenases, phosphoamidase, sulfohydrolases, sulfinases, desulfinases, and the like. In some In embodiments, the enzyme is a glycosylase, including glycosidases and N -glycosylases. In some embodiments, the enzyme is a glycosidase, including alpha-amylase, beta-amylase, glucan-1,4-alpha-glucosidase, cellulose, endo-1,3(4)-beta-glucanase, inulinase, endo-1,4 -beta-xylanase, endo-1,4-b-xylanase, dextranase, chitinase, polygalacturonidase, lysozyme, exo-alpha-sialidase, alpha-glucosidase, beta-glucosidase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, alpha-mannosidase, beta -mannosidase, beta-fructofuranosidase, alpha, alpha-trehalose, beta-glucuronidase, xylan-endo-1,3-beta-xylosidase, amylo-alpha-1,6-glucosidase, hyaluronoglucosaminidase, hyaluronoglucuronidase, etc.

[89] В случае заболевания Помпе, при котором молекулярным дефектом является дефект активности α-глюкозидазы, ферменты включают альфа-глюкозидазу человека и «изозимы», такие как другие альфа-глюкозидазы, сконструированная рекомбинантная альфа-глюкозидаза, другие глюкозидазы, рекомбинантные глюкозидазы, любой белок, сконструированный с возможностью гидролиза концевого нередуцирующего 1-4-связанного остатка альфа-глюкозы с высвобождением одной молекулы альфа-глюкозы, любой фермент EC 3.2.1.20, природные или рекомбинантные углеводные гидролазы для гликогена или крахмалов при низком pH, а также гликозилгидролазы, такие как сахараза-изомальтаза, мальтаза-глюкоамилаза, глюкозидаза II и нейтральная альфа-глюкозидаза.[89] In Pompe disease, in which the molecular defect is a defect in α-glucosidase activity, the enzymes include human alpha-glucosidase and "isozymes" such as other alpha-glucosidases, engineered recombinant alpha-glucosidase, other glucosidases, recombinant glucosidases, any a protein designed to hydrolyze the terminal non-reducing 1-4-linked alpha-glucose residue to release one molecule of alpha-glucose, any EC 3.2.1.20 enzyme, natural or recombinant carbohydrate hydrolases for glycogen or starches at low pH, and glycosyl hydrolases such such as sucrase-isomaltase, maltase-glucoamylase, glucosidase II and neutral alpha-glucosidase.

[90] Термин «интернализующий эффектор» включает белок, который способен интернализоваться в клетку, или который в противном случае участвует в ретроградном мембранном транспорте или способствует ему. В некоторых случаях интернализующий эффектор представляет собой белок, который подвергается трансцитозу; т. е. белок интернализуется с одной стороны клетки и транспортируется на другую сторону клетки (например, от апикальной к базальной). Во многих вариантах осуществления интернализующий эффекторный белок представляет собой белок, экспрессируемый на клеточной поверхности, или растворимый внеклеточный белок. Однако в настоящем изобретении также рассматриваются варианты осуществления, в которых интернализующий эффекторный белок экспрессируется во внутриклеточном компартменте, таком как эндосома, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосома и т. д. Например, белки, участвующие в ретроградном мембранном транспорте (например, пути от ранних/рециркулирующих эндосом к транс-сети Гольджи), могут служить в качестве интернализующих эффекторных белков в различных вариантах осуществления настоящего изобретения. В любом случае связывание домена доставки с интернализующим эффекторным белком приводит к тому, что весь мультидоменный терапевтический белок и любые связанные с ним молекулы (например, фермент), также интернализуются в клетку. Как объясняется ниже, интернализующие эффекторные белки включают белки, которые непосредственно интернализуются в клетку, а также белки, которые опосредованно интернализуются в клетку.[90] The term “internalizing effector” includes a protein that is capable of being internalized into a cell, or that otherwise participates in or promotes retrograde membrane transport. In some cases, the internalizing effector is a protein that undergoes transcytosis; that is, the protein is internalized on one side of the cell and transported to the other side of the cell (e.g., from apical to basal). In many embodiments, the internalizing effector protein is a cell surface expressed protein or a soluble extracellular protein. However, the present invention also contemplates embodiments in which the internalizing effector protein is expressed in an intracellular compartment such as the endosome, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, lysosome, etc. For example, proteins involved in retrograde membrane transport (e.g., pathways from early /recycling endosomes to the trans-Golgi network) can serve as internalizing effector proteins in various embodiments of the present invention. In either case, binding of the delivery domain to the internalizing effector protein causes the entire multidomain therapeutic protein and any associated molecules (eg, enzyme) to also be internalized into the cell. As explained below, internalizing effector proteins include proteins that are directly internalized into the cell, as well as proteins that are indirectly internalized into the cell.

[91] Интернализующие эффекторные белки, которые непосредственно интернализуются в клетку, включают в себя связанные с мембраной молекулы по меньшей мере с одним внеклеточным доменом (например, трансмембранные белки, GPI-заякоренные белки и т. д.), которые подвергаются клеточной интернализации и предпочтительно обрабатываются посредством пути внутриклеточной деградации и/или рециркуляции. Конкретные неограничивающие примеры интернализующих эффекторных белков, которые непосредственно интернализуются в клетку, включают, например, CD63, MHC-I (например, HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептор трансферрина, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный как VIP17), IGF2R, H+ АТФазу вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовые рецепторы, лептиновые рецепторы, скавенджер-рецепторы (например, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36) и т. д.[91] Internalizing effector proteins that are directly internalized into the cell include membrane-associated molecules with at least one extracellular domain (eg, transmembrane proteins, GPI-anchored proteins, etc.) that undergo cellular internalization and preferably processed through intracellular degradation and/or recycling pathways. Specific non-limiting examples of internalizing effector proteins that are directly internalized into the cell include, for example, CD63, MHC-I (eg, HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor , LDL-related protein receptor 1, ASGR1, ASGR2, amyloid precursor protein-like protein-2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), MAL (myelin and lymphocyte protein, also known as VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase , diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptors, leptin receptors, scavenger receptors (e.g. SCARA1-5, SCARB1-3, CD36), etc.

[92] В определенных вариантах осуществления интернализующий эффектор представляет собой рецептор пролактина (PRLR). Было обнаружено, что PRLR представляет собой не только мишень для определенных терапевтических применений, но также является эффективным интернализующим эффекторным белком исходя из его высокой скорости интернализации и возобновления. Потенциал PRLR как интернализующего эффекторного белка, например, проиллюстрирован в WO 2015/026907, где показано, в том числе, что антитела к PRLR эффективно интернализуются PRLR-экспрессирующими клетками in vitro.[92] In certain embodiments, the internalizing effector is a prolactin receptor (PRLR). It has been found that PRLR is not only a target for certain therapeutic applications, but is also an effective internalizing effector protein based on its high rate of internalization and turnover. The potential of PRLR as an internalizing effector protein is, for example, illustrated in WO 2015/026907, which shows, among other things, that antibodies to PRLR are efficiently internalized by PRLR-expressing cells in vitro.

[93] В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфический для почки интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (клото), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство 22 транспортеров растворенных веществ, представитель 13), SLC5A2 (котранспортер 2 натрия/глюкозы) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфический для мышц интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор 1A костного морфогенетического белка), m-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфическая для мышц), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNAlS (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа рецептора ACh), CHRND (субъединица дельта рецептора ACh), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор), дистрогликан (DAG1) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых конкретных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, ASGR1, ASGR2 или PRLR.[93] In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 substances, representative 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In other specific embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor 1A), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (G-coupled receptor 48) -protein), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNAlS (L-type calcium channel alpha-15 subunit) type), CACNG6 (L-type calcium channel gamma-6 subunit), SCN1B (sodium channel beta-1 subunit), CHRNA1 (ACh receptor alpha subunit), CHRND (ACh receptor delta subunit), LRRC14B (leucine-rich protein 14B repeat), dystroglycan (DAG1) and POPDC3 (Popeye domain-containing protein 3). In some specific embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, ASGR1, ASGR2, or PRLR.

[94] В вариантах осуществления, в которых эффектор интернализации (IE) непосредственно интернализуется в клетку, домен доставки может представлять собой, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с IE, или лиганд или часть лиганда, которые специфически взаимодействуют с IE. Например, если IE представляет собой Kremen-1 или Kremen-2, то домен доставки может содержать лиганд Kremen (например, DKK1) или его Kremen-связывающую часть или состоять из таких. В качестве другого примера, если IE является рецепторной молекулой, такой как ASGR1, то домен доставки может содержать лиганд, специфический в отношении рецептора (например, асиалоорозомукоида [ASOR] или бета-Ga1NAc), или его рецептор-связывающую часть или состоять из них.[94] In embodiments in which the internalization effector (IE) is directly internalized into a cell, the delivery domain may be, for example, an antibody or antigen binding fragment of an antibody that specifically binds to the IE, or a ligand or portion of a ligand that specifically interacts with the IE . For example, if the IE is Kremen-1 or Kremen-2, then the delivery domain may contain or consist of a Kremen ligand (eg, DKK1) or a Kremen-binding portion thereof. As another example, if the IE is a receptor molecule such as ASGR1, then the delivery domain may contain or be composed of a receptor-specific ligand (eg, asialoorosomucoid [ASOR] or beta-Ga1NAc) or a receptor-binding portion thereof.

[95] Интернализующие эффекторные белки, которые опосредованно интернализуются в клетку, предусматривают белки и полипептиды, которые сами по себе не интернализуются, а интернализуются в клетку после связывания или иным образом ассоциации со вторым белком или полипептидом, который непосредственно интернализуется в клетку. Белки, которые опосредованно интернализуются в клетку, предусматривают, например, растворимые лиганды, которые способны связываться с интернализующей рецепторной молекулой, экспрессируемой на клеточной поверхности. Неограничивающим примером растворимого лиганда, который (опосредованно) интернализуется в клетку благодаря его взаимодействию с интернализующей рецепторной молекулой, экспрессируемой на клеточной поверхности, является трансферрин. В вариантах осуществления, где IE представляет собой трансферрин (или другой опосредованно интернализуемый белок), связывание домена доставки с IE и взаимодействие IE с рецептором трансферрина (или другой интернализующей рецепторной молекулой, экспрессируемой на клеточной поверхности) приводит к тому, что весь домен доставки и любые молекулы, связанные с ним (например, фермент), интернализуются в клетку одновременно с интернализацией IE и его партнера по связыванию.[95] Internalizing effector proteins that are indirectly internalized into a cell include proteins and polypeptides that are not themselves internalized, but are internalized into the cell after binding or otherwise associated with a second protein or polypeptide that is directly internalized into the cell. Proteins that are indirectly internalized into the cell include, for example, soluble ligands that are capable of binding to an internalizing receptor molecule expressed on the cell surface. A non-limiting example of a soluble ligand that is (indirectly) internalized into a cell through its interaction with an internalizing receptor molecule expressed on the cell surface is transferrin. In embodiments where the IE is transferrin (or other indirectly internalized protein), binding of the delivery domain to the IE and interaction of the IE with the transferrin receptor (or other internalizing receptor molecule expressed on the cell surface) results in the entire delivery domain and any molecules bound to it (e.g., an enzyme) are internalized into the cell simultaneously with the internalization of the IE and its binding partner.

[96] В вариантах осуществления, в которых IE интернализуется в клетку опосредованно, домен доставки может представлять собой, например, антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела, или scFv, которые специфически связываются с IE, или рецептор или часть рецептора, которые специфически взаимодействуют с растворимым эффекторным белком. Например, если IE представляет собой цитокин, то домен доставки может содержать соответствующий рецептор цитокина или его лиганд-связывающую часть или состоять из таких.[96] In embodiments in which the IE is internalized indirectly into the cell, the delivery domain may be, for example, an antibody, an antigen binding fragment of an antibody, or a scFv that specifically binds to the IE, or a receptor or portion of a receptor that specifically interacts with a soluble effector protein. For example, if the IE is a cytokine, then the delivery domain may contain or be composed of a corresponding cytokine receptor or ligand-binding portion thereof.

[97] Примером IE является CD63, который является представителем тетраспанинового суперсемейства белков клеточной поверхности, которые пересекают клеточную мембрану четыре раза. CD63 экспрессируется практически во всех тканях и, как полагают, вовлекается в формирование и стабилизацию комплексов передачи сигнала. CD63 локализуется в клеточной мембране, лизосомной мембране и поздней эндосомальной мембране. CD63, как известно, ассоциируется с интегринами и может быть вовлечен в эпителиальный-мезенхимальный переход. См. H. Maecker et al., «The tetraspanin superfamily: molecular facilitators», 11(6) FASEB J. 428-42, May 1997, и M. Metzelaar et al., «CD63 antigen. A novel lysosomal membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells,” 266 J. Biol. Chem. 3239-3245, 1991.[97] An example of an IE is CD63, which is a member of the tetraspanin superfamily of cell surface proteins that cross the cell membrane four times. CD63 is expressed in virtually all tissues and is believed to be involved in the formation and stabilization of signal transduction complexes. CD63 is localized to the cell membrane, lysosomal membrane, and late endosomal membrane. CD63 is known to associate with integrins and may be involved in epithelial-mesenchymal transition. See H. Maecker et al., “The tetraspanin superfamily: molecular facilitators,” 11(6) FASEB J. 428-42, May 1997, and M. Metzelaar et al., “CD63 antigen. A novel lysosomal membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells,” 266 J. Biol. Chem. 3239-3245, 1991.

[98] Другим примером IE является подобный предшественнику амилоида-бета (A4) белок 2 («APLP2»), повсеместно экспрессируемый представитель семейства APP (белка-предшественника амилоида). APLP2 представляет собой связанный с мембраной белок, который, как известно, взаимодействует с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I (например, Kd). Он связывается с Kd на клеточной поверхности и интернализуется клатрин-зависимым образом вместе с Kd. См. Tuli et al., «Mechanism for amyloid precursor-like protein 2 enhancement of major histocompatibility complex class I molecule degradation», 284 The Journal of Biological Chemistry 34296-34307 (2009).[98] Another example of IE is amyloid-beta precursor-like protein (A4) protein 2 (“APLP2”), a ubiquitously expressed member of the APP (amyloid precursor protein) family. APLP2 is a membrane-associated protein that is known to interact with major histocompatibility complex (MHC) class I molecules (e.g., Kd). It binds to Kd on the cell surface and is internalized in a clathrin - dependent manner along with Kd. See Tuli et al., “Mechanism for amyloid precursor-like protein 2 enhancement of major histocompatibility complex class I molecule degradation,” 284 The Journal of Biological Chemistry 34296-34307 (2009).

[99] Другим примером IE является рецептор пролактина (PRLR). Рецептор пролактина является представителем семейства цитокиновых рецепторов I типа и при связывании с лигандом и последующей димеризации активирует «тирозинкиназы Jak2, Fyn и Tec, фосфатазу SHP-2, фактор обмена гуаниновых нуклеотидов Vav и супрессор передачи сигнала SOCS», (см. Clevenger and Kline, «Prolactin receptor signal transduction», 10(10) Lupus 706-18 (2001), реферат). Рецептор пролактина подвергается эндоцитотическому рециклингу и может быть найден в лизосомных фракциях. См. Genty et al., «Endocytosis and degradation of prolactin and its receptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactin receptor cDNA», 99(2) Mol. Cell Endocrinol. 221-8 (1994); и Ferland et al., «The effect of chloroquine on lysosomal prolactin receptors in rat liver», 115(5) Endocrinology 1842-9 (1984).[99] Another example of an IE is the prolactin receptor (PRLR). The prolactin receptor is a member of the type I cytokine receptor family and, upon binding to a ligand and subsequent dimerization, activates “the tyrosine kinases Jak2, Fyn, and Tec, the phosphatase SHP-2, the guanine nucleotide exchange factor Vav, and the suppressor of SOCS signaling” (see Clevenger and Kline, "Prolactin receptor signal transduction", 10(10) Lupus 706-18 (2001), abstract). The prolactin receptor undergoes endocytotic recycling and can be found in lysosomal fractions. See Genty et al., “Endocytosis and degradation of prolactin and its receptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactin receptor cDNA,” 99(2) Mol. Cell Endocrinol. 221-8 (1994); and Ferland et al ., “The effect of chloroquine on lysosomal prolactin receptors in the rat liver,” 115(5) Endocrinology 1842-9 (1984).

[100] Как используется в данном документе, «иммунологическая реакция» как правило, означает иммунологический ответ пациента на посторонний или «чужой» белок. Этот иммунологический ответ включает аллергическую реакцию и развитие антител, которые влияют на эффективность заместительного фермента. Некоторые пациенты не могут продуцировать какой-либо нефункционирующий белок, что, таким образом, делает заместительный фермент «чужеродным» белком. Например, повторная инъекция рекомбинантной GLA (rGLA) тем страдающим болезнью Фабри пациентам, у которых отсутствует GLA, зачастую приводит к аллергической реакции. У других пациентов продуцирование антител против rGLA, как было показано, снижает эффективность заместительного фермента в лечении заболевания. См., например, Tajima et al. («Use of a Modified α-N-Acetylgalactosaminidase (NAGA) in the Development of Enzyme Replacement Therapy for Fabry Disease», 85(5) Am. J. Hum. Genet. 569-580 (2009)), в котором обсуждается применение модифицированной NAGA в качестве «изозима» для замещения GLA. Модифицированная NAGA не обладает иммунологической перекрестной реактивностью в отношении GLA и «не реагировала с сывороткой крови от пациента с заболеванием Фабри, регулярно получающего лечение в виде рекомбинантной GLA». Id, реферат.[100] As used herein, “immunological response” generally means a patient's immunological response to an extraneous or “foreign” protein. This immunological response includes an allergic reaction and the development of antibodies that affect the effectiveness of the replacement enzyme. Some patients are unable to produce any of the nonfunctioning protein, thus making the replacement enzyme a "foreign" protein. For example, repeated injection of recombinant GLA (rGLA) into Fabry disease patients who lack GLA often results in an allergic reaction. In other patients, the production of antibodies against rGLA has been shown to reduce the effectiveness of enzyme replacement in treating the disease. See, for example, Tajima et al. (“Use of a Modified α-N-Acetylgalactosaminidase (NAGA) in the Development of Enzyme Replacement Therapy for Fabry Disease,” 85(5) Am. J. Hum. Genet. 569-580 (2009)), which discusses the use modified NAGA as an "isozyme" to replace GLA. Modified NAGA does not have immunological cross-reactivity with GLA and "did not react with serum from a patient with Fabry disease routinely treated with recombinant GLA." Id, abstract.

[101] «Иммуносупрессор» включает лекарственные средства и/или белки, которые приводят к общей иммуносупрессии, и может использоваться для предотвращения возникновения перекрестнореагирующих иммунологических материалов (CRIM) к заместительным ферментам, например GAA или GLA, соответственно, у пациентов с болезнью Помпе или Фабри. Неограничивающие примеры иммуносупрессоров включают метотрексат, микофенолата мофетил, циклофосфамид, рапамицин, алкилирующие ДНК средства, антитело к CD20, антитело к BAFF, антитело к CD3, антитело к CD4 и любую их комбинацию.[101] "Immunosuppressive" includes drugs and/or proteins that lead to general immunosuppression and can be used to prevent the occurrence of cross-reactive immunological materials (CRIMs) to replacement enzymes, such as GAA or GLA, respectively, in patients with Pompe or Fabry disease . Non-limiting examples of immunosuppressants include methotrexate, mycophenolate mofetil, cyclophosphamide, rapamycin, DNA alkylating agents, anti-CD20 antibody, anti-BAFF antibody, anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, and any combination thereof.

[102] Регуляторные элементы, например промоторы, которые являются специфическими для определенной ткани, например печени, усиливают экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, например генов, находящихся под контролем такого регуляторного элемента, в ткани, для которой данный регуляторный элемент является специфическим. Неограничивающие примеры специфических для печени регуляторных элементов, например специфических для печени промоторов, можно найти в Chuah et al. (2014) Mol. Ther. 22:1605-13.[102] Regulatory elements, eg promoters, that are specific for a particular tissue, eg liver, enhance the expression of nucleic acid sequences, eg genes, under the control of such a regulatory element, in the tissue for which the regulatory element is specific. Non-limiting examples of liver-specific regulatory elements, such as liver-specific promoters, can be found in Chuah et al. (2014) Mol. Ther. 22:1605-13.

[103] Термин «белок» означает любой аминокислотный полимер, имеющий более чем приблизительно 20 аминокислот, ковалентно связанных посредством амидных связей. Белки содержат одну или более аминокислотных полимерных цепей, общеизвестных в уровне техники как «полипептиды». Таким образом, полипептид может быть белком, а белок может содержать несколько полипептидов с образованием одной функционирующей биомолекулы. В некоторых белках могут присутствовать дисульфидные мостики (т. e. между цистеиновыми остатками с образованием цистина). Такие ковалентные связи могут находиться в одной полипептидной цепи или между двумя отдельными полипептидными цепями. Например, дисульфидные мостики необходимы для надлежащей структуры и функции инсулина, иммуноглобулинов, протамина и т.п. Последний обзор по образованию дисульфидных связей см. в Oka and Bulleid, «Forming disulfides in the endoplasmic reticulum», 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9 (2013).[103] The term "protein" means any amino acid polymer having more than about 20 amino acids covalently linked through amide bonds. Proteins contain one or more amino acid polymer chains, commonly known in the art as "polypeptides". Thus, a polypeptide can be a protein, and a protein can contain multiple polypeptides to form a single functioning biomolecule. Some proteins may contain disulfide bridges (i.e. between cysteine residues to form cystine). Such covalent bonds may be within a single polypeptide chain or between two separate polypeptide chains. For example, disulfide bridges are required for the proper structure and function of insulin, immunoglobulins, protamine, etc. For a recent review on the formation of disulfide bonds, see Oka and Bulleid, “Forming disulfides in the endoplasmic reticulum,” 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9 (2013).

[104] Используемый в данном документе термин «белок» включает биотерапевтические белки, рекомбинантные белки, применяемые в исследовании или терапии, белки-ловушки и другие Fc-слитые белки, химерные белки, антитела, моноклональные антитела, антитела человека, биспецифические антитела, фрагменты антител, нанотела, химеры на основе рекомбинантных антител, слитые белки на основе scFv, цитокины, хемокины, пептидные гормоны и т. п. Белки могут быть получены с использованием рекомбинантных клеточных систем продуцирования, таких как система бакуловируса насекомых, дрожжевые системы (например, Pichia sp.), системы млекопитающих (например, клетки CHO и клетки CHO-K1, подобные производным CHO). Последний обзор обсуждения биотерапевтических белков и их продуцирования см. в Ghaderi et al., «Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation,” 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012).[104] As used herein, the term “protein” includes biotherapeutic proteins, recombinant proteins used in research or therapy, decoy proteins and other Fc fusion proteins, chimeric proteins, antibodies, monoclonal antibodies, human antibodies, bispecific antibodies, antibody fragments , nanobodies, recombinant antibody chimeras, scFv fusion proteins, cytokines, chemokines, peptide hormones, etc. Proteins can be produced using recombinant cell production systems such as the insect baculovirus system, yeast systems (e.g. Pichia sp. .), mammalian systems (eg CHO cells and CHO-K1 cells like CHO derivatives). For a recent review of the discussion of biotherapeutic proteins and their production, see Ghaderi et al., “Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation,” 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012).

[105] Используемый в данном документе термин «антитело» включает молекулы иммуноглобулинов, содержащие четыре полипептидные цепи, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен CL. VH- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR тяжелой цепи могут быть сокращены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR легкой цепи могут быть сокращены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Термин «высокоаффинное» антитело относится к тем антителам, которые характеризуются аффинностью связывания со своей мишенью, составляющей по меньшей мере 10-9 M, по меньшей мере 10-10 M; по меньшей мере 10-11 M или по меньшей мере 10-12 M, что измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORETM, или определения аффинности в растворе посредством ELISA. Термин «антитело» может охватывать антитела любого типа, такие как, например, моноклональные или поликлональные. Кроме того, антитело может быть любого происхождения, например, происходить от млекопитающего или не млекопитающего. В одном варианте осуществления антитело может происходить от млекопитающего или птицы. В дополнительном варианте осуществления антитело может быть человеческого происхождения и может дополнительно представлять собой человеческое моноклональное антитело.[105] As used herein, the term “antibody” includes immunoglobulin molecules containing four polypeptide chains, two heavy (H) chains and two light (L) chains linked together by disulfide bonds. Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated herein as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one CL domain. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs), interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (heavy chain CDRs can be abbreviated as HCDR1, HCDR2 and HCDR3;The light chain CDRs may be abbreviated as LCDR1, LCDR2 and LCDR3. The term “high affinity” antibody refers to those antibodies that have a binding affinity for its target of at least 10-9 M, at least 10-10 M; at least 10-11 M or at least 10-12 M, as measured by surface plasmon resonance, for example BIACORETM, or solution affinity determination by ELISA. The term "antibody" can cover antibodies of any type, such as, for example, monoclonal or polyclonal. In addition, the antibody may be of any origin, for example, derived from a mammal or non-mammalian. In one embodiment, the antibody may be derived from a mammal or an avian. In a further embodiment, the antibody may be of human origin and may further be a human monoclonal antibody.

[106] Фраза «биспецифическое антитело» включает в себя антитело, способное селективно связывать два или более эпитопов. Как правило, биспецифические антитела содержат две различные тяжелые цепи, при этом каждая тяжелая цепь специфически связывается с отдельным эпитопом - либо на двух разных молекулах (например, антигенах), либо на одной и той же молекуле (например, на одном и том же антигене). Если биспецифическое антитело способно селективно связываться с двумя разными эпитопами (первым эпитопом и вторым эпитопом), то аффинность первой тяжелой цепи по отношению к первому эпитопу, как правило, будет по меньшей мере на один, два, или три, или четыре порядка ниже аффинности первой тяжелой цепи по отношению ко второму эпитопу и наоборот. Эпитопы, распознаваемые биспецифическим антителом, могут находиться на одной и той же или на другой мишени (например, на одном и том же или на другом белке). Биспецифические антитела могут быть получены, например, путем объединения тяжелых цепей, которые распознают разные эпитопы одного и того же антигена. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные последовательности тяжелой цепи, которые распознают разные эпитопы одного и того же антигена, могут быть слиты с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими разные константные области тяжелой цепи, и такие последовательности могут быть экспрессированы в клетке, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина. Типичное биспецифическое антитело имеет две тяжелые цепи, каждая из которых содержит три CDR тяжелой цепи, за которыми следует (от N-конца к C-концу) CH1-домен, шарнир, CH2-домен и CH3-домен, и легкую цепь иммуноглобулина, которая либо не обеспечивает антигенсвязывающую специфичность, но которая при этом может ассоциироваться с каждой тяжелой цепью, либо которая может ассоциироваться с каждой тяжелой цепью и которая может связываться с одним или более эпитопами, связывающимися антигенсвязывающими областями тяжелой цепи, либо которая может ассоциироваться с каждой тяжелой цепью и обеспечивать связывание либо одной, либо обеих тяжелых цепей с одним или обоими эпитопами.[106] The phrase "bispecific antibody" includes an antibody capable of selectively binding two or more epitopes. Typically, bispecific antibodies contain two different heavy chains, with each heavy chain specifically binding to a different epitope - either on two different molecules (for example, antigens) or on the same molecule (for example, the same antigen) . If a bispecific antibody is capable of selectively binding to two different epitopes (a first epitope and a second epitope), then the affinity of the first heavy chain for the first epitope will generally be at least one, two, or three, or four orders of magnitude lower than the affinity of the first. heavy chain in relation to the second epitope and vice versa. The epitopes recognized by a bispecific antibody may be on the same or a different target (eg, the same or a different protein). Bispecific antibodies can be produced, for example, by combining heavy chains that recognize different epitopes of the same antigen. For example, nucleic acid sequences encoding heavy chain variable sequences that recognize different epitopes of the same antigen can be fused to nucleic acid sequences encoding different heavy chain constant regions, and such sequences can be expressed in a cell that expresses the light chain immunoglobulin. A typical bispecific antibody has two heavy chains, each containing three heavy chain CDRs followed (from N-terminus to C-terminus) by a CH1 domain, a hinge, a CH2 domain, and a CH3 domain, and an immunoglobulin light chain, which either does not provide antigen-binding specificity but which can still be associated with each heavy chain, or which can be associated with each heavy chain and which can bind to one or more epitopes binding to the antigen-binding regions of the heavy chain, or which can be associated with each heavy chain and provide binding of either one or both heavy chains to one or both epitopes.

[107] Фраза «тяжелая цепь» или «тяжелая цепь иммуноглобулина» включает последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает вариабельный домен тяжелой цепи. Вариабельные домены тяжелой цепи включают в себя три CDR тяжелой цепи и четыре области FR, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают в себя CDR, CDR и FR, а также их комбинации. Типичная тяжелая цепь после вариабельного домена (от N-конца к C-концу) содержит CH1-домен, шарнир, CH2-домен и CH3-домен. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает в себя фрагмент, который способен специфически распознавать антиген (например, распознавать антиген с KD в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазонах), который способен экспрессироваться и секретироваться клеткой и который содержит по меньшей мере одну CDR.[107] The phrase “heavy chain” or “immunoglobulin heavy chain” includes the immunoglobulin heavy chain constant region sequence from any organism and, unless otherwise indicated, includes the heavy chain variable domain. Heavy chain variable domains include three heavy chain CDRs and four FR regions unless otherwise noted. Heavy chain fragments include CDRs, CDRs and FRs, as well as combinations thereof. A typical heavy chain after the variable domain (from N-terminus to C-terminus) contains a CH1 domain, a hinge, a CH2 domain, and a CH3 domain. A functional heavy chain fragment includes a fragment that is capable of specifically recognizing an antigen (eg, recognizing an antigen with a KD in the micromolar, nanomolar, or picomolar ranges), that is capable of being expressed and secreted by a cell, and that contains at least one CDR.

[108] Фраза «легкая цепь» включает последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает каппа и лямбда легкие цепи человека. Вариабельные (VL) домены легкой цепи, как правило, включают в себя три CDR легкой цепи и четыре каркасных (FR) области, если не указано иное. Как правило, легкая цепь полной длины включает в себя, от амино-конца к карбоксильному концу, VL домен, который включает в себя FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и константный домен легкой цепи. Легкие цепи, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, предусматривают например, те, которые не связываются селективно либо с первым, либо со вторым антигеном, селективно связываемым антигенсвязывающим белком. Подходящие легкие цепи предусматривают цепи, которые могут быть идентифицированы путем скрининга по наиболее часто используемым легким цепям в имеющихся библиотеках антител (библиотеках WET или in silico), при этом легкие цепи существенно не влияют на аффинность и/или селективность антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающих белков. Подходящие легкие цепи включают в себя цепи, которые могут связываться с одним или обеими эпитопами, которые связываются антигенсвязывающими областями антигенсвязывающего белка.[108] The phrase “light chain” includes the immunoglobulin light chain constant region sequence from any organism and, unless otherwise specified, includes human kappa and lambda light chains. Light chain variable (VL) domains generally include three light chain CDRs and four framework (FR) regions, unless otherwise noted. Typically, the full length light chain includes, from the amino terminus to the carboxyl terminus, a VL domain, which includes FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, and a light chain constant domain. Light chains that can be used according to the present invention include, for example, those that do not bind selectively to either a first or a second antigen selectively bound by the antigen binding protein. Suitable light chains are those that can be identified by screening against the most commonly used light chains in available antibody libraries (WET or in silico libraries) and where the light chains do not significantly affect the affinity and/or selectivity of the antigen binding domains of the antigen binding proteins. Suitable light chains include chains that can bind to one or both epitopes that are bound by the antigen binding regions of the antigen binding protein.

[109] Фраза «вариабельный домен» включает аминокислотную последовательность легкой или тяжелой цепей иммуноглобулина (модифицированных, если требуется), которые содержат следующие аминокислотные области, в последовательности от N-конца к C-концу (если не указано иное): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. «Вариабельный домен» предусматривает аминокислотную последовательность, способную сворачиваться в канонический домен (VH или VL), имеющий структуру двойных бета-складок, где бета-складки соединяются дисульфидной связью между остатками первой бета-складки и второй бета-складки.[109] The phrase "variable domain" includes the amino acid sequence of immunoglobulin light or heavy chains (modified as appropriate) that contain the following amino acid regions, in sequence from N-terminus to C-terminus (unless otherwise noted): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A "variable domain" provides an amino acid sequence capable of folding into a canonical domain (VH or VL) having a double beta-sheet structure, where the beta-sheets are linked by a disulfide bond between residues of the first beta-sheet and the second beta-sheet.

[110] Фраза «определяющая комплементарность область» или термин «CDR» предусматривают аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты генов иммуноглобулина организма, которая в норме (т. e. у животного дикого типа) находится между двумя каркасными областями в вариабельной области легкой или тяжелой цепей молекулы иммуноглобулина (например, антитела или рецептора T-клетки). CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевой линии, или перегруппированной, или неперегруппированной последовательностью, и, например, наивной или зрелой B-клеткой или T-клеткой. В некоторых случая (например, для CDR3) CDR могут кодироваться двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевой линии), которые не являются смежными (например, в неперегруппированной последовательности нуклеиновой кислоты), но являются смежными в B-клеточной последовательности нуклеиновой кислоты, например, как результат сплайсинга или соединения последовательностей (например, рекомбинация V-D-J с образованием CDR3 тяжелой цепи).[110] The phrase "complementarity determining region" or the term "CDR" refers to the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence of the immunoglobulin genes of an organism that normally ( i.e., in a wild-type animal) is located between two framework regions in the mild or severe variable region chains of an immunoglobulin molecule (such as an antibody or T-cell receptor). The CDR may be encoded by, for example, a germline sequence, or a rearranged or non-rearranged sequence, and, for example, a naïve or mature B cell or T cell. In some cases (eg, for CDR3), CDRs may be encoded by two or more sequences (eg, germline sequences) that are not contiguous (eg, in a non-rearranged nucleic acid sequence) but are contiguous in a B cell nucleic acid sequence, e.g. , as a result of splicing or joining of sequences (for example, VDJ recombination to form the heavy chain CDR3).

[111] Термин «фрагмент антитела» относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфического связывания с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «фрагмент антитела», включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), который состоит из домена VH, (vi) выделенную CDR и (vii) scFv, который состоит из двух доменов Fv-фрагмента, VL и VH, связанных синтетическим линкером с образованием одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул. Другие формы одноцепочечных антител, таких как диатела, также охватываются термином «антитело» (см., например, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).[111] The term "antibody fragment" refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind an antigen. Examples of binding fragments encompassed by the term “antibody fragment” include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) F(ab')2 fragment, a divalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iv) Fv fragment, consisting of the VL and VH domains of one arm of the antibody, (v) dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), which consists of the VH domain, (vi) isolated CDR and (vii) scFv, which consists of two Fv fragment domains, VL and VH, linked by a synthetic linker to form a single protein chain in which the VL and VH regions are paired to form monovalent molecules. Other forms of single chain antibodies, such as diabodies, are also encompassed by the term "antibody" (see, for example, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123) .

[112] Фраза «Fc-содержащий белок» включает антитела, биспецифические антитела, иммуноадгезины и другие связывающие белки, которые содержат по меньшей мере функциональную часть областей CH2 и CH3 иммуноглобулина. «Функциональная часть» относится к CH2 и CH3 области, которая может связываться с Fc-рецептором (например, FcyR или FcRn, т. e. неонатальным Fc-рецептором) и/или которая может участвовать в активации комплемента. Если CH2 и CH3 область содержит делеции, замены и/или вставки или другие модификации, которые делают ее неспособной связываться с каким-либо Fc-рецепторам, а также неспособной активировать комплемент, то CH2 и CH3 область не является функциональной.[112] The phrase "Fc-containing protein" includes antibodies, bispecific antibodies, immunoadhesins and other binding proteins that contain at least a functional portion of the CH2 and CH3 regions of an immunoglobulin. "Functional part" refers to the CH2 and CH3 region that can bind to an Fc receptor (eg, FcyR or FcRn, ie, neonatal Fc receptor) and/or that can participate in complement activation. If the CH2 and CH3 region contains deletions, substitutions and/or insertions or other modifications that render it unable to bind to any Fc receptors and also unable to activate complement, then the CH2 and CH3 region is not functional.

[113] Fc-содержащий белок может содержать модификации в доменах иммуноглобулина, в том числе модификации, которые нарушают одну или более из эффекторных функций связывающего белка (например, модификации, которые влияют на связывание FcyR, связывание FcRn и, таким образом, время полужизни и/или активность CDC). Такие модификации включают без ограничения следующие модификации и их комбинации, обозначенные на основании нумерации константной области иммуноглобулина согласно EU: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 и 439.[113] An Fc-containing protein may contain modifications in immunoglobulin domains, including modifications that interfere with one or more of the effector functions of the binding protein (eg, modifications that affect FcyR binding, FcRn binding, and thus half-life and /or CDC activity). Such modifications include, without limitation, the following modifications and combinations thereof, designated based on EU immunoglobulin constant region numbering: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270 , 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315 , 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 and 439.

[114] Например, и без ограничения, связывающий белок представляет собой Fc-содержащий белок, демонстрирующий увеличенное время полужизни в сыворотке крови (по сравнению с таким же Fc-содержащим белком без указанной модификации(-й)) и имеющий модификацию в положении 250 (например, E или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или T), 254 (например, S или T) и 256 (например, S/R/Q/E/D или T); или модификацию в 428 и/или 433 (например, L/R/SI/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в 250 и/или 428; или модификацию в 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В другом примере модификация может предусматривать модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434S); модификацию 428L, 2591 (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254T и 256E); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308P).[114] For example, and without limitation, a binding protein is an Fc-containing protein exhibiting an increased half-life in serum (compared to the same Fc-containing protein without the specified modification(s)) and having a modification at position 250 ( for example E or Q); 250 and 428 (for example, L or F); 252 (eg L/Y/F/W or T), 254 (eg S or T) and 256 (eg S/R/Q/E/D or T); or modification to 428 and/or 433 (eg, L/R/SI/P/Q or K) and/or 434 (eg, H/F or Y); or modification to 250 and/or 428; or a modification to 307 or 308 (eg, 308F, V308F) and 434. In another example, the modification may include a modification to 428L (eg, M428L) and 434S (eg, N434S); modification 428L, 2591 (for example, V259I) and 308F (for example, V308F); modification 433K (for example, H433K) and 434 (for example, 434Y); modification of 252, 254 and 256 (for example, 252Y, 254T and 256E); modification 250Q and 428L (for example, T250Q and M428L); modification 307 and/or 308 (for example, 308F or 308P).

[115] Используемый в данном документе термин «антигенсвязывающий белок» относится к полипептиду или белку (один или более полипептидов, объединенных в функциональную единицу), который специфически распознает эпитоп на антигене, таком как специфический в отношении клетки антиген и/или целевой антиген в соответствии с настоящим изобретением. Антигенсвязывающий белок может быть полиспецифическим. Термин «полиспецифический» по отношению к антигенсвязывающему белку означает, что белок распознает разные эпитопы, либо на одном и том же антигене, либо на разных антигенах. В соответствии с настоящим изобретением полиспецифическая антигенсвязывающая молекула может представлять собой один многофункциональный полипептид или может представлять собой мультимерный комплекс из двух или более полипептидов, ковалентно или нековалентно связанных друг с другом. Термин «антигенсвязывающий белок» включает антитела или их фрагменты по настоящему изобретению, которые могут быть связаны или совместно экспрессированы с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического сочетания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или прочего) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как белок или его фрагмент, с получением биспецифической или полиспецифической антигенсвязывающей молекулы со второй специфичностью связывания.[115] As used herein, the term “antigen-binding protein” refers to a polypeptide or protein (one or more polypeptides combined into a functional unit) that specifically recognizes an epitope on an antigen, such as a cell-specific antigen and/or a target antigen according to with the present invention. The antigen binding protein can be multispecific. The term "multispecific" in relation to an antigen binding protein means that the protein recognizes different epitopes, either on the same antigen or on different antigens. In accordance with the present invention, the polyspecific antigen binding molecule may be a single multifunctional polypeptide or may be a multimeric complex of two or more polypeptides covalently or non-covalently linked to each other. The term "antigen binding protein" includes antibodies or fragments thereof of the present invention that may be associated with or co-expressed with another functional molecule, such as another peptide or protein. For example, an antibody or fragment thereof may be operably linked (e.g., by chemical combination, genetic fusion, non-covalent association, or the like) to one or more other molecular entities, such as a protein or fragment thereof, to produce a bispecific or multispecific antigen binding molecule with a second specificity binding.

[116] Используемый в данном документе термин «эпитоп» относится к части антигена, которая распознается полиспецифическим антигенсвязывающим полипептидом. Один антиген (такой как антигенный полипептид) может иметь более чем один эпитоп. Эпитопы можно определить как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, составляют подгруппу структуральных эпитопов и определяются как такие остатки, которые непосредственно обуславливают аффинность взаимодействия между the антигенсвязывающим полипептидом и антигеном. Также эпитопы могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные структуры молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и, в определенных вариантах осуществления могут иметь специфические характеристики трехмерных структур, и/или специфические характеристики заряда. Эпитопы, образованные непрерывными аминокислотами, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующими растворителями, в то время как эпитопы, образованные посредством укладки в третичную структуру, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями.[116] As used herein, the term “epitope” refers to the portion of an antigen that is recognized by a multispecific antigen-binding polypeptide. A single antigen (such as an antigenic polypeptide) may have more than one epitope. Epitopes can be defined as structural or functional. Functional epitopes generally form a subset of structural epitopes and are defined as those residues that directly mediate the affinity of interaction between the antigen-binding polypeptide and an antigen. Epitopes can also be conformational, that is, they consist of nonlinear amino acids. In certain embodiments, epitopes may include determinants that are reactive surface structures of molecules, such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl groups, or sulfonyl groups, and, in certain embodiments, may have specific three-dimensional structure characteristics, and/or specific characteristics charge. Epitopes formed by continuous amino acids are generally retained when exposed to denaturing solvents, while epitopes formed by folding into a tertiary structure are lost when exposed to denaturing solvents.

[117] Термин «домен» относится к любой части белка или полипептида, обладающего конкретной функцией или структурой. Предпочтительно домены в соответствии с настоящим изобретением связываются со специфическими по отношению к клетке или целевыми антигенами. Домены, связывающие антиген, специфический для клетки, или целевой антиген и т. п., как используется в данном документе, включают любой имеющийся в норме, получаемый ферментативным путем, синтетический или получаемый с помощью методик генной инженерии полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген.[117] The term "domain" refers to any part of a protein or polypeptide that has a specific function or structure. Preferably, the domains of the present invention bind to cell-specific or target antigens. Cell-specific antigen-binding or target antigen-binding domains, etc., as used herein, include any naturally occurring, enzymatically produced, synthetic, or genetically engineered polypeptide or glycoprotein that specifically binds an antigen .

[118] Термины «полутело» или «полуантитело», которые используются взаимозаменяемо, относятся к половине антитела, которая по существу содержит одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Тяжелые цепи антитела могут формировать димеры так, что тяжелая цепь одного полутела может ассоциироваться с тяжелой цепью, ассоциированной с другой молекулой (например, другим полутелом) или другим Fc-содержащим полипептидом. Два слегка отличающихся Fc-домена могут «гетеродимеризоваться», как при образовании биспецифических антител или других гетеродимеров, -тримеров, -тетрамеров и т. п. См. Vincent and Murini, «Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and pH-dependent antigen binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates», 7 Biotechnol. J. 1444-1450 (20912); и Shimamoto et al., «Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies,” 4(5) MAbs 586-91 (2012).[118] The terms "half-body" or "half-antibody", which are used interchangeably, refer to half of an antibody, which essentially contains one heavy chain and one light chain. Antibody heavy chains can form dimers such that a heavy chain of one hemibody can be associated with a heavy chain associated with another molecule (eg, another hemibody) or another Fc-containing polypeptide. Two slightly different Fc domains may “heterodimerize,” as in the formation of bispecific antibodies or other heterodimers, -trimers, -tetramers, etc. See Vincent and Murini, “Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and pH-dependent antigen.” binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates", 7 Biotechnol. J. 1444-1450 (20912); and Shimamoto et al., “Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies,” 4(5) MAbs 586-91 (2012).

[119] В одном варианте осуществления вариабельный домен полутела специфически распознает эффектор интернализации, и Fc-домен полутела димеризуется с Fc-слитым белком, который содержит заместительный фермент (например, пептитело) Id, 586.[119] In one embodiment, the hemibody variable domain specifically recognizes an internalization effector, and the hemibody Fc domain dimerizes with an Fc fusion protein that contains a replacement enzyme (eg, peptibody) Id, 586.

[120] Термин «одноцепочечный вариабельный фрагмент» или «scFv» включает одноцепочечный слитый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина (VH) и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина (VL). В некоторых вариантах осуществления VH и VL соединены линкерной последовательностью из 10-25 аминокислот. Полипептиды ScFv могут также содержать другие аминокислотные последовательности, такие как CL- или CH1-области. Молекулы ScFv могут быть получены с помощью фагового дисплея или изготовлены путем прямого субклонирования тяжелых и легких цепей из гибридомы или В-клетки. Публикация Ahmad et al., Clinical and Developmental Immunology, volume 2012, article ID 98025 включена в данный документ посредством ссылки в отношении способов получения фрагментов scFv посредством фагового дисплея и клонирования домена антитела.[120] The term “single chain variable fragment” or “scFv” includes a single chain fusion polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain variable region (VH) and an immunoglobulin light chain variable region (VL). In some embodiments, VH and VL are connected by a linker sequence of 10-25 amino acids. ScFv polypeptides may also contain other amino acid sequences, such as CL or CH1 regions. ScFv molecules can be produced by phage display or made by direct subcloning of heavy and light chains from a hybridoma or B cell. Ahmad et al., Clinical and Developmental Immunology, volume 2012, article ID 98025 is incorporated herein by reference with respect to methods for producing scFv fragments via phage display and antibody domain cloning.

[121] Термины «альфа-глюкозидаза» (или «α-глюкозидаза»), «α-глюкозидазная активность», «GAA» и «GAA-активность» используются взаимозаменяемо и относятся к любому белку, который облегчает гидролиз 1,4-альфа-связей гликогена и крахмала в глюкозе. GAA также известна, в том числе, как EC 3.2.1.20, мальтаза, глюкоинвертаза, глюкозидосахараза, мальтаза-глюкоамилаза, альфа-глюкопиранозидаза, глюкозидоинвертаза, альфа-D-глюкозидаза, альфа-глюкозидаза гидролаза, альфа-1,4-глюкозидаза и альфа-D-глюкозидаза глюкогидролаза. GAA может быть обнаружена в лизосоме и в щеточной кайме тонкого кишечника. У пациентов, страдающих заболеванием Помпе, отсутствует функционирующая лизосомная α-глюкозидаза. См. S. Chiba, «Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase», 61(8) Biosci. Biotechnol. Biochem. 1233-9 (1997); и Hesselink et al., «Lysosomal dysfunction in muscle with special reference to glycogen storage disease type II», 1637(2) Biochim. Biophys. Acta. 164-70 (2003).[121] The terms "alpha-glucosidase" (or "α-glucosidase"), "α-glucosidase activity", "GAA" and "GAA activity" are used interchangeably and refer to any protein that facilitates the hydrolysis of 1,4-alpha -links of glycogen and starch in glucose. GAA is also known as EC 3.2.1.20, maltase, glucoinvertase, glucoside sucrase, maltase glucoamylase, alpha-glucopyranosidase, glucoside invertase, alpha-D-glucosidase, alpha-glucosidase hydrolase, alpha-1,4-glucosidase and alpha -D-glucosidase glucohydrolase. GAA can be found in the lysosome and in the brush border of the small intestine. Patients suffering from Pompe disease lack a functioning lysosomal α-glucosidase. See S. Chiba, “Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase,” 61(8) Biosci. Biotechnol. Biochem. 1233-9 (1997); and Hesselink et al ., “Lysosomal dysfunction in muscle with special reference to glycogen storage disease type II,” 1637(2) Biochim. Biophys. Acta. 164-70 (2003).

[122] Термины «альфа-галактозидаза A» (или «α-галактозидаза A»), «активность α-галактозидазы A», «α-галактозидаза», «активность α-галактозидазы», «GLA» и «GLA-активность» используются взаимозаменяемо и относятся к любому белку, который облегчает гидролиз терминальных α-галактозильных фрагментов из гликолипидов и гликопротеинов, а также гидролизует α-D-фукозиды. GLA также известна, в том числе, как EC 3.2.1.22, мелибиаза, α-D-галактозидаза, α-галактозидаза A, α-галактозидгалактогидролаза, α-D-галактозидгалактогидролаза. GLA является лизосомным ферментом, кодируемым связанным с Х-хромосомой геном GLA. Дефекты в GLA могут приводить к заболеванию Фабри, при котором гликолипид, известный как глоботриаозилцерамид (также известный как Gb3, GL-3 или церамидтригексозид) накапливается внутри кровеносных сосудов (т. e. выраженная васкулопатия), что приводит к боли и ухудшению в функционировании почки, сердца, кожи и/или цереброваскулярных тканей, а также в других тканях и органах. См., например, Prabakaran et al. «Mannose 6-phosphate receptor and sortilin mediated endocytosis of α-galactosidase A in kidney endothelial cells», 7(6) PLoS One e39975 pp. 1-9 (2012).[122] The terms "alpha-galactosidase A" (or "α-galactosidase A"), "α-galactosidase A activity", "α-galactosidase", "α-galactosidase activity", "GLA" and "GLA activity" are used interchangeably and refer to any protein that facilitates the hydrolysis of terminal α-galactosyl moieties from glycolipids and glycoproteins and also hydrolyzes α-D-fucosides. GLA is also known as EC 3.2.1.22, melibiase, α-D-galactosidase, α-galactosidase A, α-galactoside galactohydrolase, α-D-galactoside galactohydrolase, among others. GLA is a lysosomal enzyme encoded by the X-linked GLA gene. Defects in the GLA can lead to Fabry disease, in which a glycolipid known as globotriaosylceramide (also known as Gb3, GL-3, or ceramide trihexoside) accumulates inside blood vessels (i.e., a significant vasculopathy), leading to pain and deterioration in kidney function , heart, skin and/or cerebrovascular tissues, as well as in other tissues and organs. See, for example, Prabakaran et al. "Mannose 6-phosphate receptor and sortilin mediated endocytosis of α-galactosidase A in kidney endothelial cells", 7(6) PLoS One e39975 pp. 1-9 (2012).

[123] В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента (или субъекта), страдающего лизосомной болезнью накопления, путем введения пациенту «мультидоменного терапевтического белка». Мультидоменный терапевтический белок попадает в клетки пациента и доставляет в лизосомы фермент или ферментативную активность (т. e. «заместительный фермент»), которые замещают фермент (т. e «эндогенный фермент») или ферментативную активность, которые ассоциированы с LSD. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок доставляется пациенту с помощью вектора для генной терапии, который содержит полинуклеотид, который кодирует мультидоменный терапевтический белок.[123] In one aspect, the present invention provides a method of treating a patient (or subject) suffering from a lysosomal storage disease by administering to the patient a "multi-domain therapeutic protein." The multidomain therapeutic protein enters the patient's cells and delivers to the lysosomes an enzyme or enzymatic activity ( i.e., "replacement enzyme") that replaces the enzyme (i.e., "endogenous enzyme") or enzymatic activity that is associated with LSD. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein is delivered to a patient using a gene therapy vector that contains a polynucleotide that encodes the multidomain therapeutic protein.

[124] Виды LSD включают сфинголипидоз, мукополисахаридоз и болезни накопления гликогена. В некоторых вариантах осуществления LSD представляет собой любую одну или более из болезни Фабри, болезни Гоше I типа, болезни Гоше II типа, болезни Гоше III типа, болезни Ниманна-Пика типа A, болезни Ниманна-Пика типа BGM1-ганглиозидоз, болезни Сандхоффа, болезни Тея-Сакса, дефицита активатора GM2, GM3-ганглиозидоза, метахроматической лейкодистрофии, дефицита активатора сфинголипида, болезни Шейе, болезни Гурлера-Шейе, болезни Гурлера, болезни Хантера, синдрома Санфилиппо A, синдрома Санфилиппо B, синдрома Санфилиппо C, синдрома Санфилиппо D, синдрома Моркио А, синдрома Моркио В, болезни Марото-Лами, болезни Слая, MPS IX и болезни Помпе. В соответствии с конкретным вариантом осуществления LSD представляет собой болезнь Фабри. В соответствии с другим вариантом осуществления LSD преставляет собой болезнь Помпе.[124] Types of LSD include sphingolipidosis, mucopolysaccharidosis, and glycogen storage diseases. In some embodiments, LSD is any one or more of Fabry disease, Gaucher disease type I, Gaucher disease type II, Gaucher disease type III, Niemann-Pick disease type A, Niemann-Pick disease type BGM1 gangliosidosis, Sandhoff disease, Tay-Sachs, GM2 activator deficiency, GM3 gangliosidosis, metachromatic leukodystrophy, sphingolipid activator deficiency, Scheie's disease, Hurler-Scheie's disease, Hurler's disease, Hunter's disease, Sanfilippo syndrome A, Sanfilippo syndrome B, Sanfilippo syndrome C, Sanfilippo syndrome D, syndrome Morquio A, Morquio B syndrome, Maroteaux-Lamy disease, Sly disease, MPS IX and Pompe disease. In accordance with a specific embodiment, LSD is Fabry disease. In another embodiment, LSD is Pompe disease.

[125] В некоторых вариантах осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит (a) заместительный фермент и (b) молекулярный объект, который связывается с эффектором интернализации (домен доставки). В некоторых случаях заместительный фермент представляет собой одно или более из α-галактозидазы, β-галактозидазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, активатора сапозина-С, церамидазы, сфингомиелиназы, β-гексозаминидазы, активатора GM2, GM3-синтазы, арилсульфатазы, активатора сфинголипида, α-идуронидазы, идуронидаза-2-сульфатазы, гепарин-N-сульфатазы, N-ацетил-α-глюкозаминидазы, α-глюкозамид-N-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-6-сульфат-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, β-глюкуронидазы и гиалуронидазы.[125] In some embodiments, the multidomain therapeutic protein comprises (a) a replacement enzyme and (b) a molecular entity that binds to an internalization effector (delivery domain). In some cases, the replacement enzyme is one or more of α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, saposin-C activator, ceramidase, sphingomyelinase, β-hexosaminidase, GM2 activator, GM3 synthase, arylsulfatase, activator sphingolipidase, α-iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparin-N-sulfatase, N-acetyl-α-glucosaminidase, α-glucosamide-N-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, N-acetylgalactosamine-6-sulfate- sulfatase, N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, β-glucuronidase and hyaluronidase.

[126] В некоторых случаях у пациента не может продуцироваться достаточно белка, так что заместительный фермент распознается организмом пациента как «чужой», и после введения заместительного фермента происходит иммунологическая реакция. Это не желательно. Поэтому, в некоторых вариантах осуществления заместительный фермент разрабатывают или продуцируют таким образом, чтобы избежать индуцирования иммунологической реакции у субъекта. Одним таким решением является применение «изозима» в качестве заместительного фермента. Изозим достаточно близок «своему» белку пациента, но обладает активностью заместительного фермента, достаточной для облегчения симптомов LSD.[126] In some cases, the patient cannot produce enough protein, so that the replacement enzyme is recognized by the patient's body as "foreign" and an immunological reaction occurs after the replacement enzyme is administered. This is not advisable. Therefore, in some embodiments, the replacement enzyme is designed or produced in such a way as to avoid inducing an immunological reaction in the subject. One such solution is the use of isozyme as a replacement enzyme. The isozyme is close enough to the patient's "self" protein, but has sufficient enzyme replacement activity to relieve LSD symptoms.

[127] В одном конкретном варианте осуществления, при котором LSD представляет собой заболевание Помпе, и эндогенный фермент представляет собой α-глюкозидазу (GAA), изозим может представлять собой любое из кислой α-глюкозидазы, сахаразы-изомальтазы (SI), мальтазы-глюкоамилазы (MGAM), глюкозидазы II (GANAB) и нейтральной α-глюкозидазы (C GNAC). В другом конкретном варианте осуществления, при котором LSD представляет собой заболевание Фабри, и эндогенный фермент представляет собой α-галактозидазу A (GLA), изозим может представлять собой α-N- ацетилгалактозаминидазу, сконструированную с возможностью получения GLA-активности.[127] In one particular embodiment, in which the LSD is Pompe disease and the endogenous enzyme is α-glucosidase (GAA), the isozyme may be any of acid α-glucosidase, sucrase-isomaltase (SI), maltase-glucoamylase (MGAM), glucosidase II (GANAB) and neutral α-glucosidase (C GNAC). In another specific embodiment, wherein the LSD is Fabry disease and the endogenous enzyme is α-galactosidase A (GLA), the isozyme may be an α-N-acetylgalactosaminidase engineered to have GLA activity.

[128] В данном документе предусмотрены способы, отличные от применения изозима, для снижения уровня содержания перекрестнореагирующих иммунологических материалов (CRIM) к заместительному ферменту. Как показано на фигурах 5 и 6, введение мультидоменного терапевтического белка (например, посредством вектора для генной терапии), содержащего домен, связывающий интернализующий эффектор, и ферментативный домен, снижает уровень содержания CRIM к заместительному ферменту, поступающему при введении контрольного терапевтического белка (где отсутствует интернализующий эффекторный домен и содержится ферментативный домен). Таким образом, в одном варианте осуществления снижения уровня CRIM к ферменту у пациента с дефицитом фермента включает введение пациенту мультидоменного терапевтического белка (или кодирующей его нуклеиновой кислоты, например вектора для генной терапии, содержащего ген, кодирующий мультидоменный терапевтический белок), где мультидоменный терапевтический белок содержит домен доставки (например, белок, связывающий эффектор интернализации) и ферментативный домен.[128] Methods other than the use of isozyme are provided herein to reduce the level of cross-reacting immunological materials (CRIM) to the replacement enzyme. As shown in Figures 5 and 6, administration of a multi-domain therapeutic protein (eg, via a gene therapy vector) containing an internalizing effector binding domain and an enzymatic domain reduces the level of CRIM to the replacement enzyme supplied by the control therapeutic protein (where there is no internalizing effector domain and contains an enzymatic domain). Thus, in one embodiment, reducing the level of CRIM to an enzyme in a patient with enzyme deficiency involves administering to the patient a multi-domain therapeutic protein (or a nucleic acid encoding the same, e.g., a gene therapy vector containing a gene encoding a multi-domain therapeutic protein), wherein the multi-domain therapeutic protein comprises a delivery domain (eg, an internalization effector binding protein) and an enzymatic domain.

[129] В мультидоменном терапевтическом белке содержится компонент, представляющий собой белок, связывающий эффектор интернализации, который обеспечивает поглощение заместительного фермента клеткой. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации может представлять собой CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептор трансферрина, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), PRLR (рецептор пролактина), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный, как VIP17), IGF2R, H+ АТФазу вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовый рецептор, лептиновый рецептор, скавенджер-рецептор, SCARA1-5, SCARB1-3 и CD36. В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфический для почки интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (клото), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство 22 транспортеров растворенных веществ, представитель 13), SLC5A2 (котранспортер 2 натрия/глюкозы) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфический для мышц интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор 1A костного морфогенетического белка), m-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфическая для мышц), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNAlS (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа рецептора ACh), CHRND (субъединица дельта рецептора ACh), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор), дистрогликан (DAG1) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2 или PRLR.[129] The multidomain therapeutic protein contains an internalization effector binding protein component that mediates uptake of the replacement enzyme into the cell. Thus, in some embodiments, the internalization effector may be CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL-related protein receptor 1, ASGR1, ASGR2, amyloid precursor protein-like protein-2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), PRLR (prolactin receptor), MAL (myelin and lymphocyte protein, also known as VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase, diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptor, leptin receptor, scavenger receptor, SCARA1-5, SCARB1-3 and CD36. In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 member 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In other specific embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor 1A), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (G-coupled receptor 48) -protein), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNAlS (L-type calcium channel alpha-15 subunit) type), CACNG6 (L-type calcium channel gamma-6 subunit), SCN1B (sodium channel beta-1 subunit), CHRNA1 (ACh receptor alpha subunit), CHRND (ACh receptor delta subunit), LRRC14B (leucine-rich protein 14B repeat), dystroglycan (DAG1) and POPDC3 (Popeye domain-containing protein 3). In some embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2, or PRLR.

[130] В некоторых вариантах осуществления белок, связывающий эффектор интернализации, предусматривает антигенсвязывающий белок, который включает, например, молекулу слияния с рецептором, молекулу-ловушку, молекулу слияния с рецептором Fc, антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, молекулу одноцепочечного Fv (scFv), dAb-фрагмент, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), пептид CDR3, конформационно затрудненный пептид FR3-CDR3-FR4, домен-специфическое антитело, однодоменное антитело, антитело с удаленным доменом, химерное антитело, антитело с привитой CDR, диатело, триатело, тетратело, минитело, нанотело, одновалентное нанотело, двухвалентное нанотело, иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (SMIP), верблюжье антитело (гомодимерное антитело на основе тяжелой цепи VHH), вариабельный домен IgNAR акулы.[130] In some embodiments, the internalization effector binding protein comprises an antigen binding protein that includes, for example, a receptor fusion molecule, a decoy molecule, an Fc receptor fusion molecule, an antibody, a Fab fragment, an F(ab')2- fragment, Fd fragment, Fv fragment, single chain Fv molecule (scFv), dAb fragment, isolated complementarity determining region (CDR), CDR3 peptide, conformationally constrained peptide FR3-CDR3-FR4, domain-specific antibody, single domain antibody, antibody domain deleted, chimeric antibody, CDR grafted antibody, diabody, tribody, tetrabody, minibody, nanobody, monovalent nanobody, divalent nanobody, small modular protein (SMIP) immunopharmaceutical, camel antibody (VHH heavy chain homodimeric antibody ), shark IgNAR variable domain.

[131] В одном варианте осуществления молекулярный объект, который связывается с эффектором интернализации, представляет собой антитело, фрагмент антитела или другой антигенсвязывающий белок. Например, молекулярный объект может представлять собой биспецифическое антитело, в котором одно плечо связывается с эффектором интернализации (например, ITGA7, CD9, CD63, PRLR, APLP2, ASGR1, ASGR2), а другое плечо связывается с заместительным ферментом. В данном документе мультидоменный терапевтический белок содержит биспецифическое антитело и заместительный фермент (фиг. 1A). В конкретном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Фабри, и мультидоменный терапевтический белок содержит GLA и биспецифическое антитело, которое связывает GLA и CD63. В конкретном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Фабри, и мультидоменный терапевтический белок содержит GLA и биспецифическое антитело, которое связывает GLA и ITGA7. В другом конкретном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Помпе, и мультидоменный терапевтический белок содержит GAA и биспецифическое антитело, которое связывает GAA и CD63. В другом конкретном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Помпе, и мультидоменный терапевтический белок содержит GAA и биспецифическое антитело, которое связывает GAA и ITGA7.[131] In one embodiment, the molecular entity that binds to the internalization effector is an antibody, antibody fragment, or other antigen-binding protein. For example, the molecular entity may be a bispecific antibody in which one arm binds to an internalization effector (eg, ITGA7, CD9, CD63, PRLR, APLP2, ASGR1, ASGR2) and the other arm binds to a replacement enzyme. Herein, the multidomain therapeutic protein contains a bispecific antibody and a replacement enzyme (Figure 1A). In a specific embodiment, the disease to be treated is Fabry disease, and the multi-domain therapeutic protein comprises GLA and a bispecific antibody that binds GLA and CD63. In a specific embodiment, the disease to be treated is Fabry disease, and the multi-domain therapeutic protein comprises GLA and a bispecific antibody that binds GLA and ITGA7. In another specific embodiment, the disease to be treated is Pompe disease, and the multi-domain therapeutic protein comprises GAA and a bispecific antibody that binds GAA and CD63. In another specific embodiment, the disease to be treated is Pompe disease, and the multi-domain therapeutic protein comprises GAA and a bispecific antibody that binds GAA and ITGA7.

[132] В других вариантах осуществления молекулярный объект, который связывается с эффектором интернализации, содержит полуантитело, и заместительный фермент содержит Fc-домен (слитый полипептид фермент-Fc). В одном варианте осуществления Fc-домен слитого полипептида фермент-Fc ассоциирует с Fc-доменом полутела, специфического в отношении эффектора интернализации, с образованием мультидоменного терапевтического белка (фиг. 1B).[132] In other embodiments, the molecular entity that binds to the internalization effector comprises a half-antibody and the replacement enzyme comprises an Fc domain (enzyme-Fc fusion polypeptide). In one embodiment, the Fc domain of an enzyme-Fc fusion polypeptide associates with the Fc domain of an internalization effector-specific hemibody to form a multidomain therapeutic protein (Figure 1B).

[133] В других вариантах осуществления заместительный фермент ковалентно связан с белком, связывающим эффектор интернализации. Вариант осуществления, представляющий собой слитый полипептид фермент-Fc:полутело, описанный в предыдущем параграфе (см. также фиг. 1B), попадает в этот класс, поскольку димер Fc может быть скреплен с помощью одного или более дисульфидных мостиков. Ковалентная связь между доменом активности фермента или полипептидом и доменом или полипептидом, связывающими эффектор интернализации, может представлять собой любой тип ковалентной связи, т. e. любую связь, которая предусматривает распределение электронов. В некоторых случаях ковалентная связь представляет собой пептидную связь между двумя аминокислотами, такую, что заместительный фермент и белок, связывающий эффектор интернализации, полностью или частично формируют непрерывную полипептидную цепь, как в белке слияния. В некоторых случаях часть заместительного фермента и белок, связывающий эффектор интернализации, связаны непосредственно. В других случаях используется линкер для прикрепления двух частей. См. Chen et al., «Fusion protein linkers: property, design and functionality», 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013).[133] In other embodiments, the replacement enzyme is covalently linked to an internalization effector binding protein. The enzyme-Fc:halfbody fusion polypeptide embodiment described in the previous paragraph (see also Fig. 1B) falls into this class because the Fc dimer can be linked by one or more disulfide bridges. The covalent bond between the enzyme activity domain or polypeptide and the internalization effector binding domain or polypeptide may be any type of covalent bond, i.e. any bond that involves sharing electrons. In some cases, the covalent bond is a peptide bond between two amino acids such that the replacement enzyme and the internalization effector binding protein form all or part of a continuous polypeptide chain, as in a fusion protein. In some cases, part of the replacement enzyme and the internalization effector binding protein are linked directly. In other cases, a linker is used to attach the two parts. See Chen et al., “Fusion protein linkers: property, design and functionality,” 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013).

[134] В конкретном варианте осуществления заместительный фермент ковалентно связан с C-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации (см. фиг. 1C) или с С-концом легкой цепи (фиг. 1E). В другом конкретном варианте осуществления заместительный фермент ковалентно связан с N-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации (см. фиг. 1D) или с N-концом легкой цепи (фиг. 1F). В другом конкретном варианте осуществления фермент соединен к С-концом домена, представляющего собой scFv к эффектору интернализации (фиг. 1G).[134] In a specific embodiment, the replacement enzyme is covalently linked to the C-terminus of the internalization effector antibody heavy chain (see Figure 1C) or to the C-terminus of the light chain (Figure 1E). In another specific embodiment, the replacement enzyme is covalently linked to the N-terminus of the internalization effector antibody heavy chain (see FIG. 1D) or to the N-terminus of the light chain (FIG. 1F). In another specific embodiment, the enzyme is coupled to the C-terminus of a domain representing a scFv to an internalization effector (Figure 1G).

[135] В некоторых случаях, особенно если заместительный фермент в норме не подвергается протеолитическому расщеплению в лизосоме, в такие варианты осуществления мультидоменного терапевтического белка, которые предусматривают слияние антитело-фермент, добавляют расщепляемый линкер. В некоторых вариантах осуществления между антителом и заместительным ферментом вставляют расщепляемый катепсином линкер для обеспечения удаления антитела в лизосоме с целью a) возможного способствования сохранению ферментативной активности с помощью удаления стерически крупного антитела и b) возможного увеличения времени полужизни фермента в лизосоме.[135] In some cases, especially if the replacement enzyme is not normally subject to proteolytic cleavage in the lysosome, a cleavable linker is added to such antibody-enzyme fusion embodiments of a multidomain therapeutic protein. In some embodiments, a cathepsin-cleavable linker is inserted between the antibody and the replacement enzyme to allow removal of the antibody in the lysosome to a) possibly promote retention of enzymatic activity by removing the sterically large antibody and b) possibly increasing the half-life of the enzyme in the lysosome.

[136] В одном конкретном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок доставляется пациенту или клетке в составе вектора для генной терапии, который содержит полинуклеотид, который кодирует мультидоменный терапевтический белок. В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок содержит домен доставки и ферментативный домен. В конкретном варианте осуществления домен доставки связывается с интернализующим эффектором, таким как CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептор трансферрина, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственный LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок (MAL)), IGF2R, H+ АТФаза вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовый рецептор, лептиновые рецепторы, скавенджер-рецептор A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 и CD36. В одном варианте осуществления домен доставки представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с CD63 (т. е. scFv к CD63). В другом варианте осуществления домен доставки представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывается с ITGA7 (т. е. scFv к ITGA7).[136] In one specific embodiment, the multidomain therapeutic protein is delivered to a patient or cell as part of a gene therapy vector that contains a polynucleotide that encodes the multidomain therapeutic protein. In one embodiment, the multidomain therapeutic protein comprises a delivery domain and an enzymatic domain. In a specific embodiment, the delivery domain binds to an internalizing effector such as CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL-related protein receptor 1, ASGR1, ASGR2 , amyloid precursor protein-like protein 2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), MAL (myelin and lymphocyte protein (MAL)), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase, diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptor , leptin receptors, scavenger receptor A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 and CD36. In one embodiment, the delivery domain is a single chain variable fragment (scFv) that binds to CD63 ( ie, an anti- CD63 scFv). In another embodiment, the delivery domain is a single chain variable fragment (scFv) that binds to ITGA7 ( ie, an ITGA7 scFv).

[137] В одном конкретном варианте осуществления ферментативный домен мультидоменного терапевтического белка предусматривает гидролазу. В конкретном варианте осуществления ферментативный домен предусматривает гидролазу, которая представляет собой гликозилазу. В более конкретном варианте осуществления ферментативный домен предусматривает гликозилазу, которая представляет собой гликозидазу. В более конкретном варианте осуществления ферментативный домен представляет собой гликозидазу, которая представляет собой альфа-глюкозидазу.[137] In one particular embodiment, the enzymatic domain of the multidomain therapeutic protein comprises a hydrolase. In a specific embodiment, the enzymatic domain comprises a hydrolase, which is a glycosylase. In a more specific embodiment, the enzymatic domain comprises a glycosylase, which is a glycosidase. In a more specific embodiment, the enzymatic domain is a glycosidase, which is an alpha-glucosidase.

[138] В целом, в данном документе раскрыты композиции, содержащие полинуклеотиды, и их применение, например (м)РНК, ДНК и их модифицированные формы, которые кодируют мультидоменный терапевтический белок, содержащий интернализующий эффекторный домен и ферментативный домен, для лечения лизосомных болезней накопления, например, для снижения уровня гликогена и/или усиления иммунной толерантности к GAA у пациента с болезнью Помпе.[138] In general, this document discloses compositions containing polynucleotides and their use, for example (m)RNA, DNA and modified forms thereof, that encode a multi-domain therapeutic protein containing an internalizing effector domain and an enzymatic domain, for the treatment of lysosomal storage diseases , for example, to reduce glycogen levels and/or enhance immune tolerance to GAA in a patient with Pompe disease.

[139] Термин «полинуклеотид» включает полимер из нуклеотидов (например, РНК или ДНК), который кодирует по меньшей мере один полипептид, включая слитые полипептиды, например мультидоменный терапевтический полипептид, содержащий интернализующий эффекторный домен и ферментативный домен. Используемый в данном документе термин полинуклеотид охватывает полимеры, содержащие как модифицированные, так и немодифицированные нуклеотиды. Полинуклеотид может содержать одну или более кодирующих и некодирующих областей. Полинуклеотид может быть очищен из природных источников, получен с применением рекомбинантных систем экспрессии и необязательно очищен, химически синтезирован и т. д. Где это уместно, например, в случае химически синтезированных молекул, полинуклеотид может содержать нуклеозидные аналоги, такие как аналоги, содержащие химически модифицированные основания или сахара, модификации основной цепи и т. д. Полинуклеотидная последовательность представлена в направлении от 5' до 3', если не указано иное. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой или содержит природные нуклеозиды (например, аденозин, гуанозин, цитидин, уридин); аналоги нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, C-5-пропинилцитидин, C-5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, C5-бромуридин, C5-фторуридин, C5-йодуридин, C5-пропинилуридин, C5-пропинилцитидин, C5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, O(6)-метилгуанин и 2-тиоцитидин); химически модифицированные основания; биологически модифицированные основания (например, метилированные основания); интеркалированные основания; модифицированные сахара (например, 2'-фторрибоза, рибоза, 2'-дезоксирибоза, арабиноза и гексоза); и/или модифицированные фосфатные группы (например, фосфоротиоатные и 5'-N-фосфорамидитные связи).[139] The term "polynucleotide" includes a polymer of nucleotides (eg, RNA or DNA) that encodes at least one polypeptide, including fusion polypeptides, such as a multidomain therapeutic polypeptide containing an internalizing effector domain and an enzymatic domain. As used herein, the term polynucleotide includes polymers containing both modified and unmodified nucleotides. A polynucleotide may contain one or more coding and non-coding regions. The polynucleotide may be purified from natural sources, produced using recombinant expression systems, and optionally purified, chemically synthesized, etc. Where appropriate, for example in the case of chemically synthesized molecules, the polynucleotide may contain nucleoside analogues, such as analogues containing chemically modified bases or sugars, backbone modifications, etc. The polynucleotide sequence is presented in the 5' to 3' direction unless otherwise indicated. In some embodiments, the polynucleotide is or contains naturally occurring nucleosides (eg, adenosine, guanosine, cytidine, uridine); nucleoside analogues (eg, 2-aminoadenosine, 2-thiotimidine, inosine, pyrrolopyrimidine, 3-methyladenosine, 5-methylcytidine, C-5-propynylcytidine, C-5-propynyluridine, 2-aminoadenosine, C5-bromuridine, C5-fluorouridine, C5 -ioduridine, C5-propynyluridine, C5-propynylcytidine, C5-methylcytidine, 2-aminoadenosine, 7-deazaadenosine, 7-deazaguanosine, 8-oxoadenosine, 8-oxoguanosine, O(6)-methylguanine and 2-thiocytidine); chemically modified bases; biologically modified bases (eg, methylated bases); intercalated bases; modified sugars (eg, 2'-fluororibose, ribose, 2'-deoxyribose, arabinose and hexose); and/or modified phosphate groups (eg, phosphorothioate and 5'-N-phosphoramidite linkages).

[140] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит один или более нестандартных нуклеотидных остатков. Нестандартные нуклеотидные остатки могут включать, например, 5-метилцитидин («5mC»), псевдоуридин («.psi.U»), и/или 2-тиоуридин («2sU»). См., например, патент США № 8278036 или WO2011012316, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте в связи с обсуждением таких остатков и их включения в полинуклеотид. Присутствие нестандартных нуклеотидных остатков может сделать полинуклеотид более стабильным и/или менее иммуногенным, чем контрольный полинуклеотид с той же последовательностью, но содержащий только стандартные остатки. В дополнительных вариантах осуществления полинуклеотид может содержать один или более нестандартных нуклеотидных остатков, выбранных из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-бромурацила, 5-пропинилурацила, 6-аминопурина, 2-аминопурина, инозина, диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина, цитозинов. а также комбинации этих модификаций и других модификаций нуклеиновых оснований. Определенные варианты осуществления могут, кроме того, включать дополнительные модификации фуранозного кольца или нуклеинового основания. Дополнительные модификации могут включать, например, модификации или замены сахара (например, одну или более из модификации 2'-O-алкила, блокированной нуклеиновой кислоты ( LNA )). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может образовывать комплекс или быть гибридизованным с дополнительными полинуклеотидами и/или пептидо-полинуклеотидами ( PNA ). В вариантах осуществления, где модификация сахара представляет собой 2'-O-алкил-модификацию, такая модификация может включать без ограничения 2'-дезокси-2'-фтор-модификацию, 2'-O-метил-модификацию, 2'-О-метоксиэтил-модификацию и 2'-дезокси-модификацию. В определенных вариантах осуществления любая из этих модификаций может присутствовать в 0-100% нуклеотидов, например, в более чем 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% или в 100% нуклеотидов, входящих в состав, по отдельности или в комбинации. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает молекулы информационной РНК (мРНК), которые могут быть или могут не быть модифицированными, например, которые могут содержать или могут не содержать модифицированы нуклеотид, с помощью хорошо известных способов с целью повышения их стабильности и/или снижения их иммуногенности. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает молекулы ДНК, которые могут, которые могут быть или могут не быть модифицированы, например, которые могут содержать или могут не содержать модифицированный нуклеотид, с помощью хорошо известных способов с целью повышения их стабильности и/или снижения их иммуногенности.[140] In some embodiments, the polynucleotide contains one or more non-standard nucleotide residues. Non-standard nucleotide residues may include, for example, 5-methylcytidine (“5mC”), pseudouridine (“.psi.U”), and/or 2-thiouridine (“2sU”). See, for example, US Pat. No. 8,278,036 or WO2011012316, each of which is incorporated herein by reference in its entirety for discussion of such residues and their incorporation into a polynucleotide. The presence of non-standard nucleotide residues may make the polynucleotide more stable and/or less immunogenic than a control polynucleotide with the same sequence but containing only the standard residues. In additional embodiments, the polynucleotide may contain one or more non-standard nucleotide residues selected from isocytosine, pseudoisocytosine, 5-bromouracil, 5-propynyluracil, 6-aminopurine, 2-aminopurine, inosine, diaminopurine and 2-chloro-6-aminopurine, cytosines. as well as combinations of these modifications and other modifications of nucleic bases. Certain embodiments may further include additional modifications to the furanose ring or nucleic base. Additional modifications may include, for example, sugar modifications or substitutions (eg, one or more of the 2'-O-alkyl, capped nucleic acid ( LNA ) modification). In some embodiments, the polynucleotide may form a complex or be hybridized with additional polynucleotides and/or peptide polynucleotides ( PNAs ). In embodiments where the sugar modification is a 2'-O-alkyl modification, such modification may include, but is not limited to, a 2'-deoxy-2'-fluoro modification, a 2'-O-methyl modification, a 2'-O- methoxyethyl modification and 2'-deoxy modification. In certain embodiments, any of these modifications may be present in 0-100% of the nucleotides, such as more than 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, or 100% of the nucleotides included in the composition, individually or in combination. In some embodiments, the polynucleotide includes messenger RNA (mRNA) molecules that may or may not be modified, for example, which may or may not contain a modified nucleotide, by well known methods to increase their stability and/or reduce their immunogenicity . In some embodiments, the polynucleotide includes DNA molecules that may or may not be modified, for example, which may or may not contain a modified nucleotide, by well known methods to increase their stability and/or reduce their immunogenicity.

[141] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид также включает «последовательность нуклеиновой кислоты, нацеливающуюся на локус». Последовательность, нацеливающаяся на локус, обеспечивает возможность интеграции полинуклеотида, кодирующего мультидоменный терапевтический белок, в геном клетки-хозяина реципиента. В некоторых вариантах осуществления последовательность, нацеливающаяся на локус, включает фланкирующие гомологичные плечи для обеспечения гомологичной рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления последовательность, нацеливающаяся на локус, включает последовательности направляющей РНК и фермент Cas типа II для обеспечения интеграции (т. е. способ на основе CRISPR-Cas9). В некоторых вариантах осуществления последовательность, нацеливающаяся на локус, включает направляющие последовательности распознавания нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN) для обеспечения интеграции. В некоторых вариантах осуществления последовательность, нацеливающаяся на локус, включает последовательности распознавания эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), для обеспечения интеграции. В других вариантах осуществления последовательность, нацеливающаяся на локус, включает код «один остаток-один нуклеотид», используемый нуклеазами, полученными на основе BuD, для обеспечения интеграции.[141] In some embodiments, the polynucleotide also includes a “locus-targeting nucleic acid sequence.” The targeting sequence allows the polynucleotide encoding the multidomain therapeutic protein to be integrated into the genome of the recipient host cell. In some embodiments, the locus-targeting sequence includes flanking homologous arms to promote homologous recombination. In some embodiments, the sequence targeting the locus includes guide RNA sequences and a Cas type II enzyme to promote integration ( ie, a CRISPR-Cas9-based method). In some embodiments, the locus targeting sequence includes zinc finger nuclease (ZFN) recognition guide sequences to promote integration. In some embodiments, the locus-targeting sequence includes transcription activator-like effector nuclease (TALEN) recognition sequences to promote integration. In other embodiments, the locus-targeting sequence includes a one-residue-one-nucleotide code used by BuD-derived nucleases to promote integration.

[142] В некоторых вариантах осуществления геномный локус, в который интегрируется полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, представляет собой локус «безопасной гавани». В одном варианте осуществления локус «безопасной гавани» обеспечивает высокую экспрессию мультидоменного терапевтического белка, не мешая при этом экспрессии основных генов или не стимулируя экспрессию онкогенов или других вредных генов. В одном варианте осуществления геномный локус находится внутри или поблизости локуса экспрессируемого в печени альбумина (Alb), локуса EESYR, локуса SARS, положения 188083272 на хромосоме 1 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, положения 3046320 на хромосоме 10 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, положения 67328980 на хромосоме 17 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, сайта аденоассоциированного вируса 1 (AAVS1) на хромосоме, в норме имеющегося сайта интеграции вируса AAV на хромосоме 19 человека или его ортолога у млекопитающего, отличного от человека, гена рецептора хемокина 5 (CCR5), гена рецептора хемокина, кодирующего корецептор HIV-1, или локуса Rosa26 у мыши или его ортолога у млекопитающего, отличного от мыши. В одном варианте осуществления геномный локус представляет собой сайт аденоассоциированного вируса. В одном варианте осуществления геномный локус для интеграции выбирают в соответствии со способом согласно публикации Papapetrou и Schambach, J. Molecular Therapy, vol. 24 (4):678-684, April 2016, которая включена в данный документ посредством ссылки в отношении поэтапного выбора геномного локуса «безопасной гавани» для интеграции вектора для генной терапии; см. также публикацию Barzel et al. Nature, vol. 517: 360-364, полностью включенную в данный документ посредством ссылки в отношении нацеливания гена без промотора в локус экспрессируемого в печени альбумина (Alb).[142] In some embodiments, the genomic locus into which the polynucleotide encoding a multidomain therapeutic protein is integrated is a safe harbor locus. In one embodiment, the safe harbor locus allows for high expression of a multi-domain therapeutic protein without interfering with the expression of essential genes or promoting the expression of oncogenes or other deleterious genes. In one embodiment, the genomic locus is within or adjacent to the liver expressed albumin (Alb) locus, the EESYR locus, the SARS locus, position 188083272 on human chromosome 1 or its ortholog in a non-human mammal, position 3046320 on human chromosome 10 or its ortholog in a non-human mammal, position 67328980 on human chromosome 17 or its ortholog in a non-human mammal, an adeno-associated virus 1 (AAVS1) site on the chromosome normally present with an AAV virus integration site on human chromosome 19 or its orthologue in a mammal, a non-human chemokine receptor 5 (CCR5) gene, a chemokine receptor gene encoding an HIV-1 co-receptor, or the Rosa26 locus in a mouse or its ortholog in a non-mouse mammal. In one embodiment, the genomic locus is an adeno-associated virus site. In one embodiment, the genomic locus for integration is selected in accordance with the method according to Papapetrou and Schambach, J. Molecular Therapy, vol. 24 (4):678-684, April 2016, which is incorporated herein by reference with respect to the stepwise selection of a genomic safe harbor locus for gene therapy vector integration; see also Barzel et al. Nature, vol. 517: 360-364, incorporated herein by reference in its entirety with respect to promoterless gene targeting of the liver expressed albumin ( Alb ) locus.

[143] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, например ДНК, также содержит промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей мультидоменный терапевтический белок. В конкретном варианте осуществления промотор представляет собой тканеспецифический промотор, который управляет экспрессией гена в конкретной ткани. В одном варианте осуществления тканеспецифический промотор представляет собой специфический для печени энхансер/промотор, полученный из serpina1 (например, SEQ ID NO:9), и/или представляет собой промотор TTR (SEQ ID NO:8). В других вариантах осуществления промотор представляет собой промотор CMV. В других вариантах осуществления промотор представляет собой промотор убиквитина С.[143] In some embodiments, the polynucleotide, such as DNA, also comprises a promoter operably linked to a nucleic acid sequence encoding a multi-domain therapeutic protein. In a specific embodiment, the promoter is a tissue-specific promoter that drives the expression of a gene in a specific tissue. In one embodiment, the tissue-specific promoter is a liver-specific enhancer/promoter derived from serpina1 (eg , SEQ ID NO:9) and/or is a TTR promoter (SEQ ID NO:8). In other embodiments, the promoter is a CMV promoter. In other embodiments, the promoter is a ubiquitin C promoter.

[144] В одном варианте осуществления «вектор для генной терапии», кодирующий мультидоменный терапевтический белок, представляет собой любой вектор, способный доставлять полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, хозяину, например, пациенту. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии нацелен на конкретную клетку-хозяина или орган, например, для локальной доставки, например тканеспецифической доставки. Как правило, в случае локальной доставки требуется, чтобы белок (например, мультидоменный терапевтический белок), кодируемый мРНК, транслировался и экспрессировался главным образом в органе и/или органом, например, в печени, где в результате этого образовывалось бы депо, например, депо в печени для продуцирования (и секреции) белка. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии доставляет полинуклеотид мультидоменного терапевтического белка в печень пациента с образованием депо в печени. См., например, публикацию DeRosa et al. Gene Therapy, vol. 10:699-707, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии доставляет полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, в мышечную ткань пациента. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии доставляет полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, в мозг пациента.[144] In one embodiment, a “gene therapy vector” encoding a multi-domain therapeutic protein is any vector capable of delivering a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic protein to a host, such as a patient. In some embodiments, the gene therapy vector is targeted to a specific host cell or organ, for example, for local delivery, such as tissue-specific delivery. Typically, local delivery requires that the protein (e.g., multi-domain therapeutic protein) encoded by the mRNA be translated and expressed primarily in and/or by an organ, e.g., the liver, where it would result in a depot, e.g. in the liver to produce (and secrete) protein. In some embodiments, the gene therapy vector delivers a multidomain therapeutic protein polynucleotide to the liver of a patient to form a liver depot. See, for example, DeRosa et al. Gene Therapy , vol. 10:699-707, which is incorporated herein by reference in its entirety. In some embodiments, the gene therapy vector delivers a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic protein to muscle tissue of a patient. In some embodiments, the gene therapy vector delivers a polynucleotide encoding a multidomain therapeutic protein to the brain of a patient.

[145] Любой природный или сконструированный вектор для генной терапии доставки, известный в настоящее время или который будет разработан в будущем, может быть использован в осуществлении настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии представляет собой вирусный вектор, например, содержит вирус, вирусный капсид, вирусный геном и т. д. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии представляет собой полинуклеотид без дополнительных средств, например эписому. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии включает полинуклеотидный комплекс. Иллюстративные неограничивающие полинуклеотидные комплексы для применения в качестве вектора для генной терапии включают липоплексы, полимерсомы, полипексы, дендримеры, неорганические наночастицы (например, покрытые полинуклеотидом золото, диоксид кремния, оксид железа, фосфат кальция и т. д.). В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии, описанный в данном документе, содержит комбинацию вирусного вектора, полинуклеотидов без дополнительных средств и полинуклеотидных комплексов.[145] Any natural or engineered gene therapy delivery vector now known or to be developed in the future can be used in the practice of the present invention. In some embodiments, the gene therapy vector is a viral vector, eg, contains a virus, a viral capsid, a viral genome, etc. In some embodiments, the gene therapy vector is a polynucleotide without additional means, such as an episome. In some embodiments, the gene therapy vector includes a polynucleotide complex. Exemplary non-limiting polynucleotide complexes for use as a gene therapy vector include lipoplexes, polymersomes, polypex, dendrimers, inorganic nanoparticles (eg, polynucleotide-coated gold, silica, iron oxide, calcium phosphate, etc.). In some embodiments, a gene therapy vector described herein comprises a combination of a viral vector, polynucleotides without additional agents, and polynucleotide complexes.

[146] В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой вирус, включая ретровирус, аденовирус, вирус простого герпеса, поксвирус, вирус осповакцины, лентивирус или аденоассоциированный вирус. В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой аденоассоциированный вирус (AAV), включая серотипы AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11 или их сконструированные варианты или варианты, возникшие в результате естественного отбора.[146] In one embodiment, the gene therapy vector is a virus, including a retrovirus, adenovirus, herpes simplex virus, poxvirus, vaccinia virus, lentivirus, or adeno-associated virus. In one embodiment, the gene therapy vector is an adeno-associated virus (AAV), including serotypes AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, and AAV11, or engineered or naturally occurring variants thereof. selection

[147] В одном варианте осуществления полинуклеотид также содержит последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV). В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой химерный аденоассоциированный вирус, содержащий генетические элементы из двух или более серотипов. Например, вектор на основе AAV с генами rep из AAV1 и генами cap из AAV2 (обозначенные как AAV1/2 или AAV RC1/2) можно использовать в качестве вектора для генной терапии для доставки полинуклеотида мультидоменного терапевтического белка в клетку или клетку нуждающегося пациента. В одном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой AAV1/2, AAV1/3, AAV1/4, AAV1/5, AAV1/6, AAV1/7, AAV1/8, AAV1/9, AAV1/10, AAV1/11, AAV2/1, AAV2/3, AAV2/4, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2/10, AAV2/11, AAV3/1, AAV3/2, AAV3/4, AAV3/5, AAV3/6, AAV3/7, AAV3/8, AAV3/9, AAV3/10, AAV3/10, AAV4/1, AAV4/2, AAV4/3, AAV4/5, AAV4/6, AAV4/7, AAV4/8, AAV4/9, AAV4/10, AAV4/11, AAV5/1, AAV5/2, AAV5/3, AAV5/4, AAV5/6, AAV5/7, AAV5/8, AAV5/9, AAV5/10, AAV5/11, AAV6/1, AAV6/2, AAV6/3, AAV6/4, AAV6/5, AAV6/7, AAV6/8, AAV6/9, AAV6/10, AAV6/10, AAV7/1, AAV7/2, AAV7/3, AAV7/4, AAV7/5, AAV7/6, AAV7/8, AAV7/9, AAV7/10, AAV7/11, AAV8/1, AAV8/2, AAV8/3, AAV8/4, AAV8/5, AAV8/6, AAV8/7, AAV8/9, AAV8/10, AAV8/11, AAV9/1, AAV9/2, AAV9/3, AAV9/4, AAV9/5, AAV9/6, AAV9/7, AAV9/8, AAV9/10, AAV9/11, AAV10/1, AAV10/2, AAV10/3, AAV10/4, AAV10/5, AAV10/6, AAV10/7, AAV10/8, AAV10/9, AAV10/11, AAV11/1, AAV11/2, AAV11/3, AAV11/4, AAV11/5, AAV11/6, AAV11/7, AAV11/8, AAV11/9, AAV11/10, химерный вирион или их производные. Публикация Gao et al., «Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy», PNAS 99(18): 11854-11859, Sep. 3, 2002, включена в данный документ посредством ссылки в отношении векторов на основе AAV и химерных вирионов, применимых в качестве векторов для генной терапии, а также их конструирования и применения.[147] In one embodiment, the polynucleotide also contains an adeno-associated virus (AAV) nucleic acid sequence. In one embodiment, the gene therapy vector is a chimeric adeno-associated virus containing genetic elements from two or more serotypes. For example, an AAV-based vector with rep genes from AAV1 and cap genes from AAV2 (designated AAV1/2 or AAV RC1/2) can be used as a gene therapy vector to deliver a multidomain therapeutic protein polynucleotide to a cell or cell of a patient in need. In one embodiment, the gene therapy vector is AAV1/2, AAV1/3, AAV1/4, AAV1/5, AAV1/6, AAV1/7, AAV1/8, AAV1/9, AAV1/10, AAV1/11, AAV2/1, AAV2/3, AAV2/4, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2/10, AAV2/11, AAV3/1, AAV3/2, AAV3/ 4, AAV3/5, AAV3/6, AAV3/7, AAV3/8, AAV3/9, AAV3/10, AAV3/10, AAV4/1, AAV4/2, AAV4/3, AAV4/5, AAV4/6, AAV4/7, AAV4/8, AAV4/9, AAV4/10, AAV4/11, AAV5/1, AAV5/2, AAV5/3, AAV5/4, AAV5/6, AAV5/7, AAV5/8, AAV5/ 9, AAV5/10, AAV5/11, AAV6/1, AAV6/2, AAV6/3, AAV6/4, AAV6/5, AAV6/7, AAV6/8, AAV6/9, AAV6/10, AAV6/10, AAV7/1, AAV7/2, AAV7/3, AAV7/4, AAV7/5, AAV7/6, AAV7/8, AAV7/9, AAV7/10, AAV7/11, AAV8/1, AAV8/2, AAV8/ 3, AAV8/4, AAV8/5, AAV8/6, AAV8/7, AAV8/9, AAV8/10, AAV8/11, AAV9/1, AAV9/2, AAV9/3, AAV9/4, AAV9/5, AAV9/6, AAV9/7, AAV9/8, AAV9/10, AAV9/11, AAV10/1, AAV10/2, AAV10/3, AAV10/4, AAV10/5, AAV10/6, AAV10/7, AAV10/ 8, AAV10/9, AAV10/11, AAV11/1, AAV11/2, AAV11/3, AAV11/4, AAV11/5, AAV11/6, AAV11/7, AAV11/8, AAV11/9, AAV11/10, chimeric virion or their derivatives. Gao et al., “Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy,” PNAS 99(18): 11854-11859, Sep. 3, 2002, is incorporated herein by reference with respect to AAV and chimeric virion vectors useful as gene therapy vectors, as well as their construction and use.

[148] В более конкретном варианте осуществления вектор для генной терапии представляет собой химерный вектор на основе AAV с последовательностью гена rep серотипа 2 и последовательностью cap серотипа 8 («AAV2/8» или «AAV RC2/8»).[148] In a more specific embodiment, the gene therapy vector is an AAV-based chimeric vector with a serotype 2 rep gene sequence and a serotype 8 cap sequence (“AAV2/8” or “AAV RC2/8”).

[149] В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии представляет собой вирусный вектор, который был подвергнут псевдотипированию (например, сконструирован) для нацеливания на конкретную клетку, например гепатоцит. Многие из достижений в направленной генной терапии с применением вирусных векторов можно кратко описать как нерекомбинаторную (отличную от генетической) или рекомбинаторную (генетическую) модификацию вирусного вектора, которая приводит к псевдотипированию, расширению тропизма и/или изменению мишени тропизма естественного вирусного вектора. (Обзор представлен в публикации Nicklin and Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji and Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15). В подходах, отличных от генетических, обычно используют адаптер, который распознает как поверхностный белок вируса дикого типа (немодифицированный), так и клетку-мишень. Растворимые псевдорецепторы (для вируса дикого типа), полимеры, такие как полиэтиленгликоль, и антитела или их части, применяли в качестве вирус-связывающего домена адаптеров, тогда как для связывающего клетку домена адаптеров, описанных выше, применяли природные лиганды, представляющие собой пептиды или витамины, а также антитела и их части. Например, замена мишени вирусного вектора на клетку-мишень может быть выполнена после связывания комплекса вектор:адаптер с белком, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, например белком клеточной поверхности. Такой подход применяли для AAV (Bartlett et al. (1999) Nat. Biotechnol. 74: 2777-2785), аденовирусов (Hemminki et al. (2001) Cancer Res. 61: 6377-81; van Beusechem et al. (2003) Gene Therapy 10:1982-1991; Einfeld, et al. (2001) J. Virol. 75:11284-91; Glasgow et al. (2009) PLOS One 4:e8355), герпесвирусов (Nakano et al. (2005) Mol. Ther. 11:617-24) и парамиксовирусов (Bian et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:295-303; Bian et al. (2005) Int. J. Oncol. 29:1359-69), коронавирусов (Haijema et al. (2003) J. Virol. 77:4528-4538; Wurdinger et al. (2005) Gene Therapy 12:1394-1404).[149] In some embodiments, the gene therapy vector is a viral vector that has been pseudotyped (eg, engineered) to target a specific cell, such as a hepatocyte. Many of the advances in targeted gene therapy using viral vectors can be briefly described as non-recombinatorial (other than genetic) or recombinatorial (genetic) modification of a viral vector that results in pseudotyping, expansion of tropism, and/or alteration of the target tropism of the natural viral vector. (Reviewed in Nicklin and Baker (2002) Curr. Gene Ther. 2:273-93; Verheiji and Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15 ) Non-genetic approaches typically use an adapter that recognizes both the surface protein of the wild-type virus (unmodified) and the target cell. Soluble pseudoreceptors (for wild-type virus), polymers such as polyethylene glycol, and antibodies or parts thereof have been used as the virus-binding domain of the adapters, while natural ligands such as peptides or vitamins have been used for the cell-binding domain of the adapters described above , as well as antibodies and their parts. For example, replacing the target of a viral vector with a target cell can be accomplished following binding of the vector:adapter complex to a protein expressed on the surface of the target cell, such as a cell surface protein. This approach has been used for AAV (Bartlett et al. (1999) Nat. Biotechnol . 74: 2777-2785), adenoviruses (Hemminki et al. (2001) Cancer Res . 61: 6377-81; van Beusechem et al. (2003) Gene Therapy 10:1982-1991; Einfeld, et al. (2001) J. Virol. 75:11284-91; Glasgow et al. (2009) PLOS One 4:e8355), herpesviruses (Nakano et al. (2005) Mol . Ther. 11:617-24) and paramyxoviruses (Bian et al. (2005) Cancer Gene Ther. 12:295-303; Bian et al. (2005) Int. J. Oncol. 29:1359-69), coronaviruses (Haijema et al. (2003) J. Virol. 77:4528-4538; Wurdinger et al. (2005) Gene Therapy 12:1394-1404).

[150] Более популярным подходом являлась рекомбинаторная генетическая модификация вирусных капсидных белков и, таким образом, поверхности вирусного капсида. При непрямых рекомбинаторных подходах вирусный капсид модифицируется с помощью гетерологичного «каркаса», который затем связывается с адаптером. Адаптер связывается с каркасом и клеткой-мишенью. (Arnold et al. (2006) Mol. Ther. 5:125-132; Ponnazhagen et al. (2002) J. Virol. 76:12900-907; см. также WO 97/05266). Каркасы, такие как (1) Fc-связывающие молекулы (например, Fc-рецепторы, белок A и т. д.), которые связываются с Fc антител-адаптеров, (2) (стрепт)авидин, который связывается с биотинилированными адаптерами, (3) биотин, который связывается с адаптерами, слитыми с (стрепт)авидином, и (4) пары связывания белок:белок, которые образуют изометрические пептидные связи, такие как SpyCatcher, который связывает адаптер SpyTagged, были включены в Ad (Pereboeva et al. (2007) Gene Therapy 14: 627-637; Park et al. (2008) Biochemical and Biophysical Research Communications 366: 769-774; Henning et al. (2002) Human Gene Therapy 13:1427-1439; Banerjee et al. (2011) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 21:4985-4988), AAV (Gigout et al. (2005) Molecular Therapy 11:856-865; Stachler et al. (2008) Molecular Therapy 16:1467-1473), и тогавирусы (Quetglas et al. (2010) Virus Research 153:179-196; Ohno et al. (1997) Nature Biotechnology 15:763-767; Klimstra et al. (2005) Virology 338:9-21).[150] A more popular approach has been the recombinatorial genetic modification of viral capsid proteins and thus the surface of the viral capsid. In indirect recombinatorial approaches, the viral capsid is modified with a heterologous scaffold, which then binds to an adapter. The adapter binds to the scaffold and the target cell. (Arnold et al. (2006)Mol. Ther. 5:125-132; Ponnazhagen et al. (2002)J.Virol. 76:12900-907; see also WO 97/05266). Scaffolds such as (1) Fc-binding molecules (e.g., Fc receptors, protein A, etc.) that bind to Fc adapter antibodies, (2) (strept)avidin, which binds to biotinylated adapters, ( 3) biotin, which binds to adapters fused to (strept)avidin, and (4) protein:protein binding pairs that form isometric peptide bonds, such as SpyCatcher, which binds the SpyTagged adapter, have been included in Ad (Pereboeva et al. (2007)Gene Therapy 14: 627-637; Park et al. (2008)Biochemical and Biophysical Research Communications 366: 769-774; Henning et al. (2002)Human Gene Therapy 13:1427-1439; Banerjee et al. (2011)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 21:4985-4988), AAV (Gigout et al. (2005)Molecular Therapy 11:856-865; Stachler et al. (2008)Molecular Therapy 16:1467-1473), and togaviruses (Quetglas et al. (2010)Virus Research 153:179-196; Ohno et al. (1997)Nature Biotechnology 15:763-767; Klimstra et al. (2005)Virology 338:9-21).

[151] При прямом рекомбинаторном подходе к нацеливанию нацеливающий лиганд непосредственно вставляется в вирусный капсид или соединяется с ним, то есть белковые вирусные капсиды модифицируются для экспрессии гетерологичного лиганда. Лиганд, кроме того, перенаправляет, например, связывает рецептор или маркер, преимущественно или исключительно экспрессируемый на клетке-мишени. (Stachler et al. (2006) Gene Ther. 13:926-931; White et al. (2004) Circulation 109:513-519.). Прямые рекомбинаторные подходы применяли для AAV (Park et al., (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653-59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052-56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3:964-75; Shi et al. (2001) Human Gene Therapy 12:1697-1711; Shi and Bartlett (2003) Molecular Therapy 7:515-525), ретровируса (Dalba et al. Current Gene Therapy 5:655-667; Tai and Kasahara (2008) Frontiers in Bioscience 13:3083-3095; Russell and Cosset (1999) Journal of Gene Medicine 1:300-311; Erlwein et al. (2002) Virology 302:333-341; Chadwick et al. (1999) Journal of Molecular Biology 285:485-494; Pizzato et al. (2001) Gene Therapy 8:1088-1096), поксвируса (Guse et al. (2011) Expert Opinion on Biological Therapy 11:595-608; Galmiche et al. (1997) Journal of General Virology 78:3019-3027; Paul et al. (2007) Viral Immunology 20:664-671), парамиксовируса (Nakamura and Russell (2004) Expert Opinion on Biological Therapy 4:1685-1692; Hammond et al. (2001) Journal of Virology 75:2087-2096; Galanis (2010) Clinical Pharmacology and Therapeutics 88:620-625; Blechacz and Russell (2008) Current Gene Therapy 8:162-175; Russell and Peng (2009) Current Topics in Microbiology and Immunology 330:213-241) и герпесвируса (Shah and Breakefield (2006) Current Gene Therapy 6:361-370; Campadelli-Fiume et al. (2011) Reviews in Medical Virology 21:213-226).[151] In the direct recombinatorial targeting approach, the targeting ligand is directly inserted into or coupled to the viral capsid, that is, viral capsid proteins are modified to express a heterologous ligand. The ligand further redirects, for example binds, a receptor or marker predominantly or exclusively expressed on the target cell. (Stachler et al. (2006) Gene Ther . 13:926-931; White et al. (2004) Circulation 109:513-519.). Direct recombinatorial approaches have been used for AAV (Park et al., (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653-59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052-56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3: 964-75; Shi et al. (2001) Human Gene Therapy 12:1697-1711; Shi and Bartlett (2003) Molecular Therapy 7:515-525), retrovirus (Dalba et al. Current Gene Therapy 5:655-667; Tai and Kasahara (2008) Frontiers in Bioscience 13:3083-3095 Russell and Cosset (1999) Journal of Gene Medicine 1:300-311 Erlwein et al (2002) Virology 302:333-341 Chadwick et al ( 1999) Journal of Molecular Biology 285:485-494; Pizzato et al. (2001) Gene Therapy 8:1088-1096), poxvirus (Guse et al. (2011) Expert Opinion on Biological Therapy 11:595-608; Galmiche et al. (1997) Journal of General Virology 78:3019-3027; Paul et al. (2007 ) Viral Immunology 20:664-671), paramyxovirus (Nakamura and Russell (2004) Expert Opinion on Biological Therapy 4:1685-1692; Hammond et al (2001) Journal of Virology 75:2087-2096;Galanis (2010) Clinical Pharmacology and Therapeutics 88:620-625; Blechacz and Russell (2008) Current Gene Therapy 8:162–175; Russell and Peng (2009) Current Topics in Microbiology and Immunology 330:213-241) and herpesvirus (Shah and Breakefield (2006) Current Gene Therapy 6:361-370; Campadelli-Fiume et al. (2011) Reviews in Medical Virology 21 :213-226).

[152] В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии, описанный в данном документе, подвергается псевдотипированию в отношении тех тканей, которые особенно подходят для генерации регуляторного ответа, например толерантности, например, к заместительному ферменту. Такие ткани включают без ограничения слизистую ткань, например кишечно-ассоциированную лимфоидную ткань (GALT), гемопоэтические стволовые клетки и печень. В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии или ген, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, описанный в данном документе, экспрессируются под контролем промоторов, специфических для этих тканей, например специфического для печени промотора.[152] In some embodiments, the gene therapy vector described herein is pseudotyped for those tissues that are particularly suited to generate a regulatory response, such as tolerance, for example, to a replacement enzyme. Such tissues include, but are not limited to, mucosal tissue such as gut-associated lymphoid tissue (GALT), hematopoietic stem cells, and liver. In some embodiments, a gene therapy vector or a gene encoding a multidomain therapeutic protein described herein is expressed under the control of tissue-specific promoters, such as a liver-specific promoter.

[153] В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии, описанный в данном документе, предусматривает полинуклеотид без дополнительных средств. Например, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический полипептид, можно вводить, например, внутримышечно, непосредственно в орган для образования депо, внутривенно и т. д. Дополнительные хорошо известные способы улучшенной доставки полинуклеотидов без дополнительных средств включают без ограничения электропорацию, сонопорацию, применение генной пушки для «стрельбы» частицами золота, покрытыми полинуклеотидами, магнитофекцию и гидродинамическую доставку.[153] In some embodiments, the gene therapy vector described herein provides a polynucleotide without additional means. For example, in some embodiments, a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic polypeptide can be administered, for example, intramuscularly, directly into a depot organ, intravenously, etc. Additional well-known methods for improved delivery of polynucleotides without additional means include, but are not limited to, electroporation, sonoporation, the use of a gene gun to “shoot” gold particles coated with polynucleotides, magnetofection and hydrodynamic delivery.

[154] В некоторых вариантах осуществления вектор для генной терапии, описанный в данном документе, содержит полинуклеотидные комплексы, такие как без ограничения наночастицы (например, самоорганизующиеся наночастицы полинуклеотидов, самоорганизующиеся наночастицы на основе полимеров, неорганические наночастицы, липидные наночастицы, полупроводниковые/металлические наночастицы), гели и гидрогели, полинуклеотидные комплексы с катионами и анионами, микрочастицы и любые их комбинации.[154] In some embodiments, the gene therapy vector described herein comprises polynucleotide complexes, such as, but not limited to, nanoparticles (e.g., polynucleotide self-assembled nanoparticles, polymer-based self-assembled nanoparticles, inorganic nanoparticles, lipid nanoparticles, semiconductor/metal nanoparticles) , gels and hydrogels, polynucleotide complexes with cations and anions, microparticles and any combinations thereof.

[155] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут быть составлены в виде самоорганизующихся наночастиц. В качестве неограничивающего примера, полинуклеотиды могут применяться для получения наночастиц, которые могут применяться в системе доставки для полинуклеотидов (см., например, международную публикацию № WO2012125987; которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидные самоорганизующиеся наночастицы могут содержать ядро из полинуклеотидов, раскрытых в данном документе, и полимерную оболочку. Полимерная оболочка может представлять собой любой из полимеров, описанных в данном документе, и они известны в данной области техники. В дополнительном варианте осуществления полимерная оболочка может применяться для защиты полинуклеотидов в ядре.[155] In some embodiments, the polynucleotides disclosed herein can be formulated as self-assembled nanoparticles. As a non-limiting example, polynucleotides can be used to prepare nanoparticles that can be used in a delivery system for polynucleotides (see, for example, International Publication No. WO2012125987; which is incorporated herein by reference in its entirety). In some embodiments, the polynucleotide self-assembled nanoparticles may comprise a core of polynucleotides disclosed herein and a polymer shell. The polymer shell may be any of the polymers described herein and are known in the art. In a further embodiment, the polymer shell can be used to protect the polynucleotides in the core.

[156] В некоторых вариантах осуществления эти самоорганизующиеся наночастицы могут представлять собой микрогубки, образованные из длинных полимеров, состоящих из полинуклеотидных «шпилек», которые формируются в кристаллические «плиссированные» листы перед самоорганизацией в микрогубки. Эти микрогубки представляют собой плотно упакованные губчатые микрочастицы, которые могут функционировать как эффективный носитель и могут доставлять груз в клетку. Диаметр микрогубок может составлять от 1 до 300 нм. Микрогубки можно объединять в комплексы с другими веществами, известными в данной области техники, для образования более крупных микрогубок. В качестве неограничивающего примера, микрогубку можно объединять в комплекс со средством для формирования наружного слоя, способствующего клеточному поглощению, таким как поликатион полиэтиленим (PEI). Этот комплекс может образовывать частицы диаметром 250 нм, которые могут оставаться стабильными при высоких температурах (150°C.) (публикация Grabow and Jaegar, Nature Materials 2012, 11: 269-269; которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Кроме того, эти микрогубки могут обладать способностью проявлять исключительную степень защиты от разложения рибонуклеазами. В другом варианте осуществления самоорганизующиеся наночастицы на основе полимера, такие как без ограничения микрогубки, могут быть полностью программируемыми наночастицами. Геометрию, размер и стехиометрию наночастиц можно точно контролировать для создания оптимальной наночастицы для доставки груза, такого как без ограничения полинуклеотиды.[156] In some embodiments, these self-assembled nanoparticles may be microsponges formed from long polymers consisting of polynucleotide “hairpins” that are formed into crystalline “pleated” sheets before self-assembling into microsponges. These microsponges are densely packed spongy microparticles that can function as an effective carrier and can deliver cargo into the cell. The diameter of microsponges can range from 1 to 300 nm. Microsponges can be complexed with other substances known in the art to form larger microsponges. As a non-limiting example, the microsponge can be complexed with an outer layer-forming agent that promotes cellular uptake, such as polyethylene im (PEI). This complex can form particles with a diameter of 250 nm, which can remain stable at high temperatures (150°C.) (Grabow and Jaegar, Nature Materials 2012, 11: 269-269; which is incorporated herein by reference in its entirety) . In addition, these microsponges may have the ability to exhibit an exceptional degree of protection against degradation by ribonucleases. In another embodiment, polymer-based self-assembled nanoparticles, such as but not limited to microsponges, can be fully programmable nanoparticles. The geometry, size and stoichiometry of nanoparticles can be precisely controlled to create the optimal nanoparticle for delivering cargo, such as, but not limited to, polynucleotides.

[157] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды могут быть составлены в виде неорганических наночастиц (патент США № 8257745, включенный в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Неорганические наночастицы могут включать без ограничения глинистые вещества, которые набухают в воде. В качестве неограничивающего примера, неорганическая наночастица может включать синтетические смектитовые глины, которые изготовлены из простых силикатов (см., например, патенты США № 5585108 и 8257745, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей их полноте).[157] In some embodiments, the polynucleotides may be formulated as inorganic nanoparticles (US Pat. No. 8,257,745, incorporated herein by reference in its entirety). Inorganic nanoparticles may include, but are not limited to, clay substances that swell in water. By way of non-limiting example, the inorganic nanoparticle may include synthetic smectite clays that are made from simple silicates (see, for example, US Pat. Nos. 5,585,108 and 8,257,745, each of which is incorporated herein by reference in its entirety).

[158] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может быть составлен в виде диспергируемой в воде наночастицы, содержащей полупроводниковый или металлический материал (публикация патента США № 20120228565; включенная в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте) или составлен в виде магнитной наночастицы (публикации патента США № 20120265001 и 20120283503; каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Диспергируемые в воде наночастицы могут представлять собой гидрофобные наночастицы или гидрофильные наночастицы.[158] In some embodiments, the polynucleotide may be formulated as a water-dispersible nanoparticle containing semiconductor or metallic material (U.S. Patent Publication No. 20120228565; incorporated herein by reference in its entirety) or formulated as a magnetic nanoparticle (Patent Publication US No. 20120265001 and 20120283503, each of which is incorporated herein by reference in its entirety). Water-dispersible nanoparticles can be hydrophobic nanoparticles or hydrophilic nanoparticles.

[159] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут быть инкапсулированы в любой гидрогель, известный в данной области техники, который может образовывать гель при инъекции субъекту. Гидрогели представляют собой сеть полимерных цепей, которые являются гидрофильными, и иногда находятся в виде коллоидного геля, в котором вода является дисперсионной средой. Гидрогели являются (они могут содержать более 99% воды) природными или синтетическими полимерами с высокой абсорбционной способностью. Гидрогели также обладают степенью гибкости, очень близкой к такой в живых тканях, благодаря значительному содержанию в них воды. Описанный в данном документе гидрогель может применяться для инкапсулирования липидных наночастиц, которые являются биосовместимыми, биоразлагаемыми и/или пористыми.[159] In some embodiments, the polynucleotides disclosed herein can be encapsulated in any hydrogel known in the art that can form a gel when injected into a subject. Hydrogels are a network of polymer chains that are hydrophilic, and are sometimes found in the form of a colloidal gel in which water is the dispersion medium. Hydrogels are (they can contain more than 99% water) natural or synthetic polymers with high absorption capacity. Hydrogels also have a degree of flexibility very similar to that found in living tissues due to their significant water content. The hydrogel described herein can be used to encapsulate lipid nanoparticles that are biocompatible, biodegradable and/or porous.

[160] В качестве неограничивающего примера гидрогель может представлять собой гидрогель, функционализированный с помощью аптамера. Гидрогель, функционализированный с помощью аптамера, может быть запрограммирован на высвобождение одного или более полинуклеотидов с применением гибридизации полинуклеотидов. (Публикация Battig et al., J. Am. Chem. Society. 2012 134:12410-12413; которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). В некотором варианте осуществления полинуклеотид может быть инкапсулирован в липидную наночастицу, и затем липидная наночастица может быть инкапсулирована в гидрогель.[160] As a non-limiting example, the hydrogel may be an aptamer functionalized hydrogel. An aptamer-functionalized hydrogel can be programmed to release one or more polynucleotides using polynucleotide hybridization. (Battig et al., J. Am. Chem. Society. 2012 134:12410-12413; which is incorporated herein by reference in its entirety). In some embodiment, the polynucleotide can be encapsulated in a lipid nanoparticle, and then the lipid nanoparticle can be encapsulated in a hydrogel.

[161] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут быть инкапсулированы в фибриновый гель, фибриновый гидрогель или фибриновый клей. В другом варианте осуществления полинуклеотиды могут быть составлены в виде липидной наночастицы или быстро удаляемой липидной наночастицы перед инкапсулированием в фибриновый гель, фибриновый гидрогель или фибриновый клей. В еще одном варианте осуществления полинуклеотиды могут быть составлены в виде липоплекса перед инкапсулированием в фибриновый гель, гидрогель или фибриновый клей. Фибриновые гели, гидрогели и клеи содержат два компонента: раствор фибриногена и раствор тромбина с высоким содержанием кальция (см., например, публикации Spicer and Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148: 49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Концентрация компонентов фибринового геля, гидрогеля и/или клея может быть изменена для изменения характеристик, размера ячеек сети и/или характеристик разложения геля, гидрогеля и/или клея, таких как без ограничения изменение характеристик высвобождения фибринового геля, гидрогеля и/или клея. (См., например, публикации Spicer and Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148: 49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128; каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Этот признак может быть полезным при использовании для доставки полинуклеотида, раскрытого в данном документе. (См., например, публикации Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128; каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).[161] In some embodiments, the polynucleotides disclosed herein may be encapsulated in fibrin gel, fibrin hydrogel, or fibrin glue. In another embodiment, the polynucleotides may be formulated as a lipid nanoparticle or a quick release lipid nanoparticle before being encapsulated in a fibrin gel, fibrin hydrogel, or fibrin glue. In yet another embodiment, the polynucleotides can be formulated as a lipoplex before being encapsulated in a fibrin gel, hydrogel, or fibrin glue. Fibrin gels, hydrogels and adhesives contain two components: a fibrinogen solution and a high-calcium thrombin solution (see, for example, Spicer and Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148: 49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; each of which is incorporated herein by reference in its entirety). The concentration of the components of the fibrin gel, hydrogel and/or glue can be changed to change the characteristics, mesh size and/or degradation characteristics of the gel, hydrogel and/or glue, such as, without limitation, changing the release characteristics of the fibrin gel, hydrogel and/or glue. (See, for example, Spicer and Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148: 49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157: 80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14: 119 -128; each of which is incorporated herein by reference in its entirety). This feature may be useful when used to deliver the polynucleotide disclosed herein. (See, for example, Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128; each of which is incorporated herein by reference in its entirety ).

[162] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, раскрытый в данном документе, может содержать катионы или анионы. В одном варианте осуществления составы содержат катионы металлов, такие как без ограничения Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ и их комбинации. В качестве неограничивающего примера, составы могут содержать полимеры и полинуклеотид, образующие комплекс с катионом металла (см., например, патенты США №№ 6265389 и 6555525, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).[162] In some embodiments, the polynucleotide disclosed herein may contain cations or anions. In one embodiment, the compositions contain metal cations such as, but not limited to, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+, and combinations thereof. By way of non-limiting example, the formulations may contain polymers and a polynucleotide complexed with a metal cation (see, for example, US Pat. Nos. 6,265,389 and 6,555,525, each of which is incorporated herein by reference in its entirety).

[163] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид может быть составлен в виде наночастиц и/или микрочастиц. Эти наночастицы и/или микрочастицы могут быть отлиты в форму любого размера и химического состава. В качестве примера, наночастицы и/или микрочастицы могут быть получены с применением технологии PRINT® от LIQUIDA TECHNOLOGIES.RTM. (Моррисвилль, Северная Каролина, США) (см., например, международную публикацию № WO2007024323; которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).[163] In some embodiments, the polynucleotide may be formulated as nanoparticles and/or microparticles. These nanoparticles and/or microparticles can be molded into any size and chemical composition. As an example, nanoparticles and/or microparticles can be produced using PRINT® technology from LIQUIDA TECHNOLOGIES.RTM. (Morrisville, North Carolina, USA) (See, for example, International Publication No. WO2007024323; which is incorporated herein by reference in its entirety).

[164] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, могут быть составлены в виде наночастиц NanoJacket и NanoLiposome от Keystone Nano (Стейт Колледж, Пенсильвания, США). Наночастицы NanoJacket изготовлены из соединений, которые в норме содержатся в организме, включая кальций, фосфат, и могут также включать небольшое количество силикатов. Размер наночастиц NanoJacket может составлять от 5 до 50 нм, и их можно применять для доставки гидрофильных и гидрофобных соединений, таких как без ограничения полинуклеотиды, первичные конструкции и/или полинуклеотид. Наночастицы NanoLiposome получают из липидов, таких как без ограничения липиды, которые в норме содержатся организме. Размер наночастиц NanoLiposome может составлять 60-80 нм и их можно применять для доставки гидрофильных и гидрофобных соединений, таких как без ограничения полинуклеотиды, первичные конструкции и/или полинуклеотиды. В одном аспекте полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, составлены в виде наночастицы NanoLiposome, такой как без ограничения Ceramide NanoLiposome.[164] In some embodiments, the polynucleotides disclosed herein can be formulated as NanoJacket and NanoLiposome nanoparticles from Keystone Nano (State College, PA, USA). NanoJacket nanoparticles are made from compounds normally found in the body, including calcium, phosphate, and may also include small amounts of silicates. NanoJacket nanoparticles can range in size from 5 to 50 nm and can be used to deliver hydrophilic and hydrophobic compounds such as, but not limited to, polynucleotides, primary constructs and/or polynucleotide. NanoLiposome nanoparticles are derived from lipids, such as, but not limited to, lipids that are normally found in the body. NanoLiposome nanoparticles can be 60-80 nm in size and can be used to deliver hydrophilic and hydrophobic compounds such as, but not limited to, polynucleotides, prime constructs and/or polynucleotides. In one aspect, the polynucleotides disclosed herein are formulated as a NanoLiposome nanoparticle, such as, but not limited to, a Ceramide NanoLiposome.

[165] В одном варианте осуществления мультидоменный терапевтический белок представляет собой слитый белок, содержащий scFv к CD63 и GAA, или слитый белок, содержащий scFv к ITGA7 и GAA. Введение слитого белка, содержащего scFv к CD63 и GAA, или слитого белка, содержащего scFv к ITGA7 и GAA, посредством AAV-доставки обеспечивает долгосрочное стабильное продуцирование GAA в сыворотке крови пациента после введения вектора для генной терапии, содержащего мультидоменный терапевтический белок. В одном варианте осуществления уровень содержания GAA в сыворотке крови пациента-реципиента в ≥ 1,5 раза-100 раз, в ≥ 1,5 раза-10 раз, в ≥ 2,5 раза, в 2,5 раза-3 раза, в 2,5 раза, в 2,6 раза, в 2,7 раза, в 2,8 раза, в 2,9 раза, в 3,0 раза, в 3,1 раза, в 3,2 раза, в 3,3 раза, в 3,4 раза, в 3,5 раза, в 3,6 раза, в 3,7 раза, в 3,8 раза, в 3,9 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз или в 10 раз выше, чем уровни содержания в сыворотке крови пациента, получающего GAA, не соединенный с доменом доставки, спустя 1 месяц, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев или 6 месяцев после введения вектора для генной терапии, содержащего мультидоменный терапевтический белок.[165] In one embodiment, the multidomain therapeutic protein is a fusion protein comprising an anti-CD63 scFv and a GAA, or a fusion protein comprising an anti-ITGA7 scFv and a GAA. Administration of a fusion protein containing scFv to CD63 and GAA, or a fusion protein containing scFv to ITGA7 and GAA, via AAV delivery provides long-term, stable production of GAA in the patient's serum after administration of a gene therapy vector containing a multi-domain therapeutic protein. In one embodiment, the recipient patient's serum GAA level is ≥1.5-fold to 100-fold, ≥1.5-fold to 10-fold, ≥2.5-fold, 2.5 to 3-fold, 2.5 times, 2.6 times, 2.7 times, 2.8 times, 2.9 times, 3.0 times, 3.1 times, 3.2 times, 3, 3 times, 3.4 times, 3.5 times, 3.6 times, 3.7 times, 3.8 times, 3.9 times, 4 times, 5 times, 6 times , 7-fold, 8-fold, 9-fold, or 10-fold higher than the serum levels of a patient receiving GAA not coupled to the delivery domain after 1 month, 3 months, 4 months, 5 months, or 6 months after administration of a gene therapy vector containing a multidomain therapeutic protein.

[166] В одном варианте осуществления введение слитого белка, содержащего scFv к CD63 и GAA, или слитого белка, содержащего scFv к ITGA7 и GAA, посредством AAV-доставки обеспечивает долговременное стабильное снижение уровней содержания накопленного гликогена у пациентов с болезнью Помпе. В одном варианте осуществления уровни содержания гликогена в сердечной, скелетной мышце и ткани печени у пациента снижаются до уровней, характерных для дикого типа (без заболевания). В одном варианте осуществления уровни содержания гликогена в сердечной, скелетной мышце и ткани печени у пациента поддерживаются на уровнях, характерных для дикого типа, спустя 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев или 6 месяцев после введения вектора для генной терапии, содержащего мультидоменный терапевтический белок.[166] In one embodiment, administration of an anti-CD63 and GAA scFv fusion protein or an anti-ITGA7 and GAA scFv fusion protein via AAV delivery provides a long-term, sustained reduction in stored glycogen levels in patients with Pompe disease. In one embodiment, glycogen levels in the patient's cardiac, skeletal muscle, and liver tissue are reduced to wild-type (no disease) levels. In one embodiment, glycogen levels in the patient's cardiac, skeletal muscle, and liver tissue are maintained at wild-type levels 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, or 6 months after administration of the gene therapy vector , containing a multidomain therapeutic protein.

[167] В одном варианте осуществления введение слитого белка, содержащего scFv к CD63 и GAA, или слитого белка, содержащего scFv к ITGA7 и GAA, посредством AAV-доставки обеспечивает долгосрочное восстановление мышечной силы у пациентов с болезнью Помпе. В одном варианте осуществления сила пациента, измеренная по силе захвата, восстанавливается до нормы (то есть нормального уровня, характерного для состояния без заболевания) через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев или 6 месяцев после введения вектора для генной терапии, содержащего мультидоменный терапевтический белок.[167] In one embodiment, administration of a fusion protein comprising scFv to CD63 and GAA, or a fusion protein containing scFv to ITGA7 and GAA, via AAV delivery provides long-term restoration of muscle strength in patients with Pompe disease. In one embodiment, the patient's strength, as measured by grip strength, returns to normal (i.e., normal levels characteristic of a disease-free state) 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, or 6 months after administration of the gene vector. therapy containing a multidomain therapeutic protein.

[168] В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает композицию, обладающую ферментативной активностью и содержащую антигенсвязывающий белок, при этом фермент ассоциирован с заболеванием, связанным с дефицитом ферментов (LSD), и белком, связывающим эффектор интернализации. Ферменты (включающие белки, которые не являются каталитическими per se), ассоциированные с лизосомными болезнями накопления, включают, например, любые возможные гидролазы, α-галактозидазу, β-галактозидазу, α-глюкозидазу, β-глюкозидазу, активатор сапозина-С, церамидазу, сфингомиелиназу, β-гексозаминидазу, активатор GM2, GM3-синтазу, арилсульфатазу, активатор сфинголипида, α-идуронидазу, идуронидаза-2-сульфатазу, гепарин-N-сульфатазу, N-ацетил-α-глюкозаминидазу, α-глюкозамид-N-ацетилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-6-сульфат-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазу, β-глюкуронидазу, гиалуронидазу и т. п.[168] In another aspect, the present invention provides a composition having enzymatic activity and containing an antigen binding protein, wherein the enzyme is associated with an enzyme deficiency disease (LSD) and an internalization effector binding protein. Enzymes (including proteins that are not catalytic per se ) associated with lysosomal storage diseases include, for example, any possible hydrolases, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, saposin-C activator, ceramidase, sphingomyelinase, β-hexosaminidase, GM2 activator, GM3 synthase, arylsulfatase, sphingolipid activator, α-iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparin- N -sulfatase, N -acetyl-α-glucosaminidase, α-glucosamide- N- acetyltransferase, N -acetylglucosamine-6-sulfatase, N -acetylgalactosamine-6-sulfate-sulfatase, N -acetylgalactosamine-4-sulfatase, β-glucuronidase, hyaluronidase, etc.

[169] Белки, связывающие эффектор интернализации, например, включают молекулу слияния с рецептором, молекулу-ловушку, молекулу слияния с рецептором Fc, антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, молекулу одноцепочечного Fv (scFv), dAb-фрагмент, выделенную определяющую комплементарность область (CDR), пептид CDR3, конформационно затрудненный пептид FR3-CDR3-FR4, домен-специфическое антитело, однодоменное антитело, антитело с удаленным доменом, химерное антитело, антитело с привитой CDR, диатело, триатело, тетратело, минитело, нанотело, одновалентное нанотело, двухвалентное нанотело, иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (SMIP), верблюжье антитело (гомодимерное антитело на основе тяжелой цепи VHH), вариабельный домен IgNAR акулы, другие антигенсвязывающие белки и т. п.[169] Internalization effector binding proteins, for example, include receptor fusion molecule, decoy molecule, Fc receptor fusion molecule, antibody, Fab fragment, F(ab')2 fragment, Fd fragment, Fv fragment, single chain Fv molecule (scFv), dAb fragment, dedicated complementarity determining region (CDR), CDR3 peptide, conformationally constrained peptide FR3-CDR3-FR4, domain-specific antibody, single-domain antibody, domain-deleted antibody, chimeric antibody, grafted antibody CDR, diabody, tribody, tetrabody, minibody, nanobody, monovalent nanobody, divalent nanobody, small modular protein (SMIP) immunopharmaceutical, camel antibody (VHH heavy chain homodimeric antibody), shark IgNAR variable domain, other antigen binding proteins and so on.

[170] Эффекторы интернализации включают, например, CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептор трансферрина, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), PRLR (рецептор пролактина), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный, как VIP17), IGF2R, H+ АТФазу вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовый рецептор, лептиновый рецептор, скавенджер-рецептор, SCARA1-5, SCARB1-3 и CD36. В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфический для почки интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (клото), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство 22 транспортеров растворенных веществ, представитель 13), SLC5A2 (котранспортер 2 натрия/глюкозы) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфический для мышц интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор 1A костного морфогенетического белка), m-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфическая для мышц), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNAlS (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа рецептора ACh), CHRND (субъединица дельта рецептора ACh), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор), дистрогликан (DAG1) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, ASGR1, ASGR2 или PRLR.[170] Internalization effectors include, for example, CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL-related protein receptor 1, ASGR1, ASGR2, protein-2 , amyloid precursor protein-like (APLP2), apelin receptor (APLNR), PRLR (prolactin receptor), MAL (myelin and lymphocyte protein, also known as VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase, diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptor, leptin receptor, scavenger receptor, SCARA1-5, SCARB1-3 and CD36. In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 member 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In other specific embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor 1A), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (G-coupled receptor 48) -protein), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNAlS (L-type calcium channel alpha-15 subunit) type), CACNG6 (L-type calcium channel gamma-6 subunit), SCN1B (sodium channel beta-1 subunit), CHRNA1 (ACh receptor alpha subunit), CHRND (ACh receptor delta subunit), LRRC14B (leucine-rich protein 14B repeat), dystroglycan (DAG1) and POPDC3 (Popeye domain-containing protein 3). In some embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, ASGR1, ASGR2, or PRLR.

[171] В некоторых вариантах осуществления фермент ковалентно связан (т. e. электроны распределяются между атомами) с антигенсвязывающим белком. В одном конкретном варианте осуществления белок, связывающий эффектор интернализации, состоит из полутела или содержит таковое; фермент слит с Fc-слитым доменом (например, на C-конце); и Fc-домен, который ковалентно связан с ферментом, ассоциируется с Fc-доменом антигенсвязывающего белка так, что ассоциация предусматривает один или более дисульфидных мостиков. Данный конкретный вариант осуществления схематически изображен на фиг. 1A, панель B.[171] In some embodiments, the enzyme is covalently linked (ie, electrons are shared between atoms) to the antigen binding protein. In one specific embodiment, the internalization effector binding protein consists of or contains a hemibody; the enzyme is fused to an Fc fusion domain (eg, at the C terminus); and the Fc domain, which is covalently linked to the enzyme, associates with the Fc domain of the antigen binding protein such that the association involves one or more disulfide bridges. This particular embodiment is shown schematically in FIG. 1A, panel B.

[172] В другом конкретном варианте осуществления белок, связывающий эффектор интернализации (домен доставки), состоит из антитела или фрагмента антитела или содержит таковые, и фермент ковалентно связан с антителом или фрагментом антитела. В конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, и фермент ковалентно связан (непосредственно с помощью пептидной связи или опосредованно с помощью линкера) с С-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела (фиг. 1А, панели С или Е соответственно). В другом конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой антитело, и фермент ковалентно связан (непосредственно с помощью пептидной связи или опосредованно с помощью линкера) с N-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела (фиг. 1А, панели D или F соответственно).[172] In another specific embodiment, the internalization effector (delivery domain) binding protein consists of or contains an antibody or antibody fragment, and the enzyme is covalently linked to the antibody or antibody fragment. In a specific embodiment, the delivery domain is an antibody, and the enzyme is covalently linked (directly via a peptide bond or indirectly via a linker) to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody (Figure 1A, panels C or E, respectively). In another specific embodiment, the delivery domain is an antibody and the enzyme is covalently linked (directly via a peptide bond or indirectly via a linker) to the N-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody (Figure 1A, panels D or F, respectively).

[173] В некоторых вариантах осуществления фермент и домен доставки не связаны ковалентно, а объединены в смесь. Домен доставки и фермент могут связываться посредством нековалентных сил с образованием комплекса. Например, в одном конкретном варианте осуществления домен доставки представляет собой биспецифическое антитело, в котором одно плечо антитела связывается с эффектором интернализации, а другое плечо связывается с ферментом. Данный вариант осуществления схематически изображен на фиг. 1A, панель A.[173] In some embodiments, the enzyme and delivery domain are not covalently linked, but are combined in a mixture. The delivery domain and the enzyme can bind through non-covalent forces to form a complex. For example, in one particular embodiment, the delivery domain is a bispecific antibody in which one arm of the antibody binds to an internalization effector and the other arm binds to an enzyme. This embodiment is shown schematically in FIG. 1A, panel A.

[174] В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой GAA или обладает активностью GAA (например, изозим с активностью GAA), и эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CDH15, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2 или PRLR. В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой GAA или обладает активностью GAA, домен интернализации представляет собой CD63, и домен доставки представляет собой биспецифическое антитело со специфичностью к CD63 и GAA. В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой GAA или обладает активностью GAA, домен интернализации представляет собой ITGA7, и домен доставки представляет собой биспецифическое антитело со специфичностью к ITGA7 и GAA.[174] In some embodiments, the enzyme is a GAA or has GAA activity (eg, an isozyme with GAA activity), and the internalization effector is ITGA7, CDH15, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2, or PRLR. In a specific embodiment, the enzyme is a GAA or has GAA activity, the internalization domain is CD63, and the delivery domain is a bispecific antibody with specificity for CD63 and GAA. In a specific embodiment, the enzyme is a GAA or has GAA activity, the internalization domain is ITGA7, and the delivery domain is a bispecific antibody with specificity for ITGA7 and GAA.

[175] В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой GLA или обладает активностью GLA (например, изозим с активностью GAA), и эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2 или PRLR. В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой GLA или обладает активностью GLA, домен интернализации представляет собой CD63, и домен доставки представляет собой биспецифическое антитело со специфичностью к CD63 и GLA. В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой GLA или обладает активностью GLA, домен интернализации представляет собой ITGA7, и домен доставки представляет собой биспецифическое антитело со специфичностью к ITGA7 и GLA.[175] In some embodiments, the enzyme is GLA or has GLA activity (eg, an isozyme with GAA activity), and the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2, or PRLR. In a specific embodiment, the enzyme is GLA or has GLA activity, the internalization domain is CD63, and the delivery domain is a bispecific antibody with specificity for CD63 and GLA. In a specific embodiment, the enzyme is GLA or has GLA activity, the internalization domain is ITGA7, and the delivery domain is a bispecific antibody with specificity for ITGA7 and GLA.

Фармацевтические композиции и их введениеPharmaceutical compositions and their administration

[176] Фармацевтические составы могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которой, как используется в данном документе, включает любые возможные растворители, дисперсионные среды, разбавители или другие жидкие среды-носители, средства для диспергирования или суспендирования, поверхностно-активные вещества, изотонические средства, загущающие или эмульгирующие средства, консерванты, твердые связующие вещества, смазывающие вещества и т. п., подходящие для конкретной необходимой лекарственной формы. В публикации Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21.sup.st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006; которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), раскрыты различные вспомогательные вещества, используемые при составлении фармацевтических композиций, и известные методики для их получения. За исключением случаев, когда какая-либо обычная среда на основе вспомогательного вещества несовместима с веществом или его производными, например, из-за какого-либо нежелательного биологического эффекта или из-за другого взаимодействия вредным образом с любым другим компонентом (компонентами) фармацевтической композиции, предполагается, что ее использование находится в пределах объема настоящего изобретения.[176] The pharmaceutical compositions may further contain a pharmaceutically acceptable excipient, which as used herein includes any possible solvents, dispersion media, diluents or other liquid carrier media, dispersing or suspending agents, surfactants, isotonic agents , thickening or emulsifying agents, preservatives, solid binders, lubricants, etc., suitable for the particular dosage form required. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21.sup.st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006; which is incorporated herein by reference in its entirety), discloses various excipients , used in the preparation of pharmaceutical compositions, and known methods for their preparation. Unless any conventional excipient vehicle is incompatible with the substance or its derivatives, for example due to any undesirable biological effect or other interaction in a harmful manner with any other component(s) of the pharmaceutical composition, its use is intended to be within the scope of the present invention.

[177] В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество является чистым, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 100%. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество одобрено для применения у людей и для ветеринарного применения. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество одобрено Управлением по контролю качества продуктов и лекарственных препаратов США. В некоторых вариантах вспомогательное вещество характеризуется фармацевтической степенью чистоты. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество соответствует стандартам Фармакопеи США (USP), Европейской Фармакопеи (EP), Британской Фармакопеи и/или Международной Фармакопеи.[177] In some embodiments, the pharmaceutically acceptable excipient is at least 95% pure, at least 96% pure, at least 97% pure, at least 98% pure, at least 99% pure, or at least 100%. In some embodiments, the excipient is approved for use in humans and for veterinary use. In some embodiments, the excipient is approved by the US Food and Drug Administration. In some embodiments, the excipient is of pharmaceutical grade purity. In some embodiments, the excipient conforms to United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), British Pharmacopoeia, and/or International Pharmacopoeia standards.

[178] Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, применяемые в производстве фармацевтических композиций, включают без ограничения инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие средства, поверхностно-активные вещества и/или эмульгаторы, дезинтегрирующие средства, связующие средства, консерванты, буферные средства, смазывающие средства и/или масла. Такие вспомогательные вещества могут быть необязательно включены в фармацевтические композиции.[178] Pharmaceutically acceptable excipients used in the manufacture of pharmaceutical compositions include, but are not limited to, inert diluents, dispersants and/or granulating agents, surfactants and/or emulsifiers, disintegrating agents, binders, preservatives, buffering agents, lubricants and /or oils. Such excipients may optionally be included in pharmaceutical compositions.

[179] Иллюстративные разбавители включают без ограничения карбонат кальция, карбонат натрия, фосфат кальция, дикальция фосфат, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, фосфат натрия, лактозу, сахарозу, целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, каолин, маннит, сорбит, инозит, хлорид натрия, сухой крахмал, кукурузный крахмал, сахарную пудру и т. д. и/или их комбинации.[179] Illustrative diluents include, without limitation, calcium carbonate, sodium carbonate, calcium phosphate, dicalcium phosphate, calcium sulfate, hydrogen calcium phosphate, sodium phosphate, lactose, sucrose, cellulose, microcrystalline cellulose, kaolin, mannitol, sorbitol, inositol, sodium chloride, dry starch, corn starch, powdered sugar, etc. and/or combinations thereof.

[180] Иллюстративные гранулирующие и/или диспергирующие средства включают без ограничения картофельный крахмал, кукурузный крахмал, крахмал тапиоки, натрия крахмала гликолят, глины, альгиновую кислоту, гуаровую камедь, мякоть цитрусовых, агар, бентонит, целлюлозу и продукты переработки древесины, натуральную губку, катионообменные смолы, карбонат кальция, силикаты, карбонат натрия, сшитый поли(винилпирролидон) (кросповидон), карбоксиметилкрахмал натрия (крахмалгликолят натрия), карбоксиметилцеллюлоза, сшитая карбоксиметилцеллюлоза натрия (кроскармеллоза), метилцеллюлоза, предварительно желатинизированный крахмал (крахмал 1500), микрокристаллический крахмал, нерастворимый в воде крахмал, карбоксиметилцеллюлоза кальция, алюмосиликат магния (VEEGUM®), лаурилсульфат натрия, соединения четвертичного аммония и т. д. и/или их комбинации.[180] Exemplary granulating and/or dispersing agents include, but are not limited to, potato starch, corn starch, tapioca starch, sodium starch glycolate, clays, alginic acid, guar gum, citrus pulp, agar, bentonite, cellulose and wood products, natural sponge, cation exchange resins, calcium carbonate, silicates, sodium carbonate, cross-linked poly(vinylpyrrolidone) (crospovidone), sodium carboxymethyl starch (sodium starch glycolate), carboxymethyl cellulose, cross-linked sodium carboxymethyl cellulose (croscarmellose), methyl cellulose, pre-gelatinized starch (starch 1500), microcrystalline starch, insoluble in water, starch, calcium carboxymethylcellulose, magnesium aluminum silicate (VEEGUM®), sodium lauryl sulfate, quaternary ammonium compounds, etc. and/or combinations thereof.

[181] Иллюстративные поверхностно-активные вещества и/или эмульгаторы включают без ограничения природные эмульгаторы (например, акацию, агар, альгиновую кислоту, альгинат натрия, трагакант, хондрукс, холестерин, ксантан, пектин, желатин, яичный желток, казеин, ланолин, холестерин, воск и лецитин), коллоидные глины (например, бентонит [силикат алюминия] и VEEGUM® [алюмосиликат магния]), производные аминокислот с длинной цепью, высокомолекулярные спирты (например, стеариловый спирт, цетиловый спирт, олеиловый спирт, моностеарат триацетина, дистеарат этиленгликоля, глицерилмоностеарат и моностеарат пропиленгликоля, поливиниловый спирт), карбомеры (например, карбоксиполиметилен, полиакриловая кислота, полимер акриловой кислоты и карбоксивиниловый полимер), каррагенан, производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлоза натрия, порошкообразная целлюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза), сложные эфиры сорбитана и жирных кислот (например, полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат [TWEEN® 20], полиоксиэтиленсорбитан [TWEEN® 60], полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат [TWEEN® 80], сорбитанмонопальмитат [SPAN® 40], сорбитанмоностеарат [SPAN® 60], сорбитантристеарат [SPAN® 65], глицерилмоноолеат, сорбитанмоноолеат [SPAN® 80]) сложные эфиры полиоксиэтилена (например, полиоксиэтиленмоностеарат [MYRJ® 45], полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло, полиэтоксилированное касторовое масло, полиоксиметиленстеарат и SOLUTOL®), сложные эфиры сахарозы и жирных кислот, сложные эфиры жирных кислот и полиэтиленгликоля (например, CREMOPHOR®), простые эфиры полиоксиэтилена (например, полиоксиэтиленовый эфир лаурилового спирта [BRIJ® 30]), поли(винилпирролидон), монолаурат диэтиленгликоля, олеат триэтаноламина, олеат натрия, олеат калия, этилолеат, олеиновая кислота, этиллаурат, лаурилсульфат натрия, PLUORINC® F 68, POLOXAMER® 188, бромид цетримония, хлорид цетилпиридиния, хлорид бензалкония, докузат натрия и т. д. и/или их комбинации.[181] Exemplary surfactants and/or emulsifiers include, but are not limited to, natural emulsifiers (e.g., acacia, agar, alginic acid, sodium alginate, tragacanth, chondrox, cholesterol, xanthan, pectin, gelatin, egg yolk, casein, lanolin, cholesterol , waxes and lecithin), colloidal clays (e.g. bentonite [aluminum silicate] and VEEGUM® [magnesium aluminum silicate]), long chain amino acid derivatives, high molecular weight alcohols (e.g. stearyl alcohol, cetyl alcohol, oleyl alcohol, triacetin monostearate, ethylene glycol distearate , glyceryl monostearate and propylene glycol monostearate, polyvinyl alcohol), carbomers (e.g. carboxypolymethylene, polyacrylic acid, acrylic acid polymer and carboxyvinyl polymer), carrageenan, cellulose derivatives (e.g. sodium carboxymethylcellulose, powdered cellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, methylcellulose), complex Sorbitan and fatty acid esters (e.g., polyoxyethylenezorbianmonolaurat [Tween® 20], polyoxyethyleneorbine [Tween® 60], polyoxyethylene -zone [Tween® 80], sorbitantanmone -pale Trastiarat [Span® 65], glyceryl monooleate, sorbitan monooleate [SPAN® 80]), polyoxyethylene esters (e.g. polyoxyethylene monostearate [MYRJ® 45], polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyethoxylated castor oil, polyoxymethylene stearate and SOLUTOL®), sucrose fatty acid esters, polyethylene glycol fatty acid esters (e.g. CREMOPHOR®), polyoxyethylene ethers (e.g. polyoxyethylene lauryl ether [BRIJ® 30]), poly(vinyl pyrrolidone), diethylene glycol monolaurate, triethanolamine oleate, sodium oleate, potassium oleate, ethyl oleate, oleic acid, ethyl laurate, sodium lauryl sulfate , PLUORINC® F 68, POLOXAMER® 188, cetrimonium bromide, cetylpyridinium chloride, benzalkonium chloride, sodium docusate, etc. and/or combinations thereof.

[182] Иллюстративные связывающие средства включают без ограничения крахмал (например, кукурузный крахмал и крахмальную пасту); желатин; сахара (например, сахарозу, глюкозу, декстрозу, декстрин, мелассу, лактозу, лактит, маннит); природные и синтетические камеди (например, гуммиарабик, альгинат натрия, экстракт ирландского мха, камедь «панвар», камедь гхатти, слизь из оболочек семян подорожника блошного, карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, ацетилцеллюлоза, поливинилпирролидон, алюмосиликат магния (Veegum®) и арабогалактан лиственницы); альгинаты; полиэтиленоксид; полиэтиленгликоль; неорганические соли кальция; кремниевая кислота; полиметакрилаты; воски; вода; спирт; и т. д.; и их комбинации.[182] Exemplary binding agents include, but are not limited to, starch (eg, corn starch and starch paste); gelatin; sugars (eg sucrose, glucose, dextrose, dextrin, molasses, lactose, lactitol, mannitol); natural and synthetic gums (e.g. gum arabic, sodium alginate, Irish moss extract, panwar gum, ghatti gum, psyllium mucilage, carboxymethylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, microcrystalline cellulose, cellulose acetate, polyvinylpyrroles don, magnesium aluminum silicate (Veegum®) and larch arabogalactan); alginates; polyethylene oxide; polyethylene glycol; inorganic calcium salts; silicic acid; polymethacrylates; waxes; water; alcohol; etc.; and their combinations.

[183] Иллюстративные консерванты могут включать без ограничения антиоксиданты, хелатирующие средства, антимикробные консерванты, противогрибковые консерванты, спиртовые консерванты, кислотные консерванты и/или другие консерванты. Иллюстративные антиоксиданты включают без ограничения альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, монотиоглицерин, метабисульфит калия, пропионовую кислоту, пропилгаллат, аскорбат натрия, бисульфат натрия, метабисульфит натрия и/или сульфит натрия. Иллюстративные хелатирующие средства включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), моногидрат лимонной кислоты, динатрия эдетат, дикалия эдетат, эдетовую кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, фосфорную кислоту, натрия эдетат, винную кислоту и/или тринатрия эдетат. Иллюстративные антимикробные консерванты включают без ограничения хлорид бензалкония, хлорид бензетония, бензиловый спирт, бронопол, цетримид, хлорид цетилпиридиния, хлоргексидин, хлорбутанол, хлоркрезол, хлороксиленол, крезол, этиловый спирт, глицерин, гексетидин, имидомочевину, фенол, феноксиэтанол, фенилэтиловый спирт, фенилмеркуриевый нитрат, пропиленгликоль и/или тимеросал. Иллюстративные противогрибковые консерванты включают без ограничения бутилпарабен, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бензойную кислоту, гидроксибензойную кислоту, бензоат калия, сорбат калия, бензоат натрия, пропионат натрия и/или сорбиновую кислоту. Иллюстративные спиртовые консерванты включают без ограничения этанол, полиэтиленгликоль, фенол, фенольные соединения, бисфенол, хлорбутанол, гидроксибензоат и/или фенилэтиловый спирт. Иллюстративные кислотные консерванты включают без ограничения витамин А, витамин С, витамин Е, бета-каротин, лимонную кислоту, уксусную кислоту, дегидроуксусную кислоту, аскорбиновую кислоту, сорбиновую кислоту и/или фитиновую кислоту. Другие консерванты включают без ограничения токоферол, токоферола ацетат, детероксим мезилат, цетримид, бутилированный гидроксианизол (BHA), бутилированный гидрокситолуол (BHT), этилендиамин, лаурилсульфат натрия (SLS), лауретсульфат натрия (SLES), бисульфит натрия, метабисульфит натрия, сульфит калия, метабисульфит калия, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, метилпарабен, GERMALL® 115, GERMABEN® II, NEOLONE.TM., KATHON.TM. и/или EUXYL®.[183] Illustrative preservatives may include, but are not limited to, antioxidants, chelating agents, antimicrobial preservatives, antifungal preservatives, alcohol preservatives, acid preservatives, and/or other preservatives. Exemplary antioxidants include, but are not limited to, alpha-tocopherol, ascorbic acid, ascorbyl palmitate, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, monothioglycerol, potassium metabisulfite, propionic acid, propyl gallate, sodium ascorbate, sodium bisulfate, sodium metabisulfite, and/or sodium sulfite. Exemplary chelating agents include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid monohydrate, disodium edetate, dipotassium edetate, edetic acid, fumaric acid, malic acid, phosphoric acid, sodium edetate, tartaric acid, and/or trisodium edetate. Exemplary antimicrobial preservatives include, but are not limited to, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, benzyl alcohol, bronopol, cetrimide, cetylpyridinium chloride, chlorhexidine, chlorobutanol, chlorocresol, chloroxylenol, cresol, ethyl alcohol, glycerin, hexetidine, imidourea, phenol, phenoxyethanol, phenylethyl alcohol , phenylmercuric nitrate , propylene glycol and/or thimerosal. Exemplary antifungal preservatives include, but are not limited to, butylparaben, methylparaben, ethylparaben, propylparaben, benzoic acid, hydroxybenzoic acid, potassium benzoate, potassium sorbate, sodium benzoate, sodium propionate and/or sorbic acid. Exemplary alcohol preservatives include, but are not limited to, ethanol, polyethylene glycol, phenol, phenolic compounds, bisphenol, chlorobutanol, hydroxybenzoate and/or phenylethyl alcohol. Exemplary acid preservatives include, but are not limited to, vitamin A, vitamin C, vitamin E, beta-carotene, citric acid, acetic acid, dehydroacetic acid, ascorbic acid, sorbic acid, and/or phytic acid. Other preservatives include, but are not limited to, tocopherol, tocopherol acetate, deteroxime mesylate, cetrimide, butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), ethylenediamine, sodium lauryl sulfate (SLS), sodium laureth sulfate (SLES), sodium bisulfite, sodium metabisulfite, potassium sulfite, potassium metabisulfite, GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, methylparaben, GERMALL® 115, GERMABEN® II, NEOLONE.TM., KATHON.TM. and/or EUXYL®.

[184] Иллюстративные буферные средства включают без ограничения цитратные буферные растворы, ацетатные буферные растворы, фосфатные буферные растворы, хлорид аммония, карбонат кальция, хлорид кальция, цитрат кальция, глубионат кальция, глюцептат кальция, глюконат кальция, D-глюконовая кислота, глицерофосфат кальция, лактат кальция, пропановая кислота, левулинат кальция, пентановая кислота, двухосновный фосфат кальция, фосфорная кислота, трехосновный фосфат кальция, гидроксид-фосфат кальция, ацетат калия, хлорид калия, глюконат калия, смеси на основе калия, двухосновный фосфат калия, одноосновный фосфат калия, смеси на основе фосфата калия, ацетат натрия, бикарбонат натрия, хлорид натрия, цитрат натрия, лактат натрия, двухосновный фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, смеси на основе фосфата натрия, трометамин, гидроксид магния, гидроксид алюминия, альгиновая кислота, апирогенная вода, изотонический солевой раствор, раствор Рингера, этиловый спирт и т. д. и/или их комбинации.[184] Exemplary buffer agents include, but are not limited to, citrate buffers, acetate buffers, phosphate buffers, ammonium chloride, calcium carbonate, calcium chloride, calcium citrate, calcium glubionate, calcium gluceptate, calcium gluconate, D-gluconic acid, calcium glycerophosphate, calcium lactate, propanoic acid, calcium levulinate, pentanoic acid, dibasic calcium phosphate, phosphoric acid, tribasic calcium phosphate, calcium hydroxide phosphate, potassium acetate, potassium chloride, potassium gluconate, potassium-based mixtures, dibasic potassium phosphate, monobasic potassium phosphate, potassium phosphate mixtures, sodium acetate, sodium bicarbonate, sodium chloride, sodium citrate, sodium lactate, dibasic sodium phosphate, monobasic sodium phosphate, sodium phosphate mixtures, tromethamine, magnesium hydroxide, aluminum hydroxide, alginic acid, pyrogen-free water, isotonic saline solution, Ringer's solution, ethyl alcohol, etc. and/or combinations thereof.

[185] Иллюстративные смазывающие средства включают без ограничения стеарат магния, стеарат кальция, стеариновую кислоту, диоксид кремния, тальк, солод, глицерилбегенат, гидрогенизированные растительные масла, полиэтиленгликоль, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия, лейцин, лаурилсульфат магния, лаурилсульфат натрия и т. д. и их комбинации.[185] Illustrative lubricants include, but are not limited to, magnesium stearate, calcium stearate, stearic acid, silicon dioxide, talc, malt, glyceryl behenate, hydrogenated vegetable oils, polyethylene glycol, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, leucine, magnesium lauryl sulfate, sodium lauryl sulfate and etc. and their combinations.

[186] Иллюстративные масла включают без ограничения масла/жиры миндаля, косточки абрикоса, авокадо, бабассу, бергамота, семян черной смородины, бурачника, можжевельника, ромашки, канола, тмина, карнаубы, касторовое, корицы, масло какао, кокосовое, печени трески, кофе, кукурузы, семян хлопчатника, эму, эвкалипта, примулы вечерней, рыбы, семян льна, гераниоловое, тыквы, виноградных косточек, фундука, иссопа, изопропилмиристат, жожобы, плодов лакового дерева, лавандиновое, лавандовое, лимона, лицеа кубебы, макадамского ореха, мальвы, семян манго, семян пенника лугового, норки, мускатного ореха, оливковое, апельсина, атлантического большеголова, пальмовое, пальмоядровое, косточки персика, арахисовое, маковое, семян тыквы, рапсовое, рисовых отрубей, розмарина, сафлоровое, сандаловое, камелии горной, пряное, облепиховое, кунжутное, масло ши, кремниевое, соевое, подсолнечное, чайного дерева, расторопши, камелии, ветиверовое, грецкого ореха и зародышей пшеницы. Иллюстративные масла включают без ограничения бутилстеарат, каприловый триглицерид, каприновый триглицерид, циклометикон, диэтилсебацинат, диметикон 360, изопропилмиристат, минеральное масло, октилдодеканол, олеиловый спирт, силиконовое масло и/или их комбинации.[186] Illustrative oils include, but are not limited to, the oils/fats of almond, apricot kernel, avocado, babassa, bergamot, blackcurrant seed, borage, juniper, chamomile, canola, cumin, carnauba, castor, cinnamon, cocoa, coconut, cod liver oil, coffee, corn, cottonseed, emu, eucalyptus, evening primrose, fish, flax seed, geraniol, pumpkin, grape seed, hazelnut, hyssop, isopropyl myristate, jojoba, lacquer, lavender, lavender, lemon, lycea cubeba, macadamia nut, mallow, mango seed, meadowfoam seed, mink, nutmeg, olive, orange, Atlantic bighead, palm, palm kernel, peach kernel, peanut, poppy, pumpkin seed, rapeseed, rice bran, rosemary, safflower, sandalwood, mountain camellia, spicy , sea buckthorn, sesame, shea butter, silicon, soybean, sunflower, tea tree, milk thistle, camellia, vetiver, walnut and wheat germ. Illustrative oils include, without limitation, butyl stearate, caprylic triglyceride, capric triglyceride, cyclomethicone, diethyl sebacate, dimethicone 360, isopropyl myristate, mineral oil, octyldodecanol, oleyl alcohol, silicone oil, and/or combinations thereof.

[187] Вспомогательные вещества, такие как масло какао и воски для суппозиториев, красящие средства, покрывающие средства, подсластители, вкусовые добавки и/или ароматизирующие добавки, могут присутствовать в композиции, по усмотрению составителя.[187] Excipients, such as cocoa butter and suppository waxes, coloring agents, coating agents, sweeteners, flavoring agents and/or flavoring agents, may be present in the composition at the discretion of the formulator.

[188] Доставка[188] Delivery

[189] Настоящее изобретение охватывает доставку вектора для генной терапии (например, полинуклеотидов) любым подходящим путем, принимая во внимание вероятные достижения в области доставки лекарственных средств. Доставка может быть без дополнительных средств или в составе.[189] The present invention embraces the delivery of a gene therapy vector (eg, polynucleotides) by any suitable route, taking into account likely advances in the field of drug delivery. Delivery can be without additional funds or as part of the package.

[190] Доставка без дополнительных средств[190] Delivery without additional funds

[191] Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть доставлены к клетке без применения дополнительных веществ. Используемый в данном документе термин «без дополнительных средств» относится к доставке полинуклеотидов без средств, которые способствуют трансфекции. Например, полинуклеотиды, доставленные в клетку, могут не содержать модификаций. Полинуклеотиды без дополнительных средств могут быть доставлены в клетку с применением способов введения, известных в данной области техники и описанных в данном документе.[191] The polynucleotides of the present invention can be delivered to a cell without the use of additional substances. As used herein, the term “without additional means” refers to the delivery of polynucleotides without means that facilitate transfection. For example, polynucleotides delivered into a cell may not contain modifications. Polynucleotides can be delivered into cells without additional means using methods of administration known in the art and described herein.

[192] Доставка в составе[192] Delivery as part of

[193] Полинуклеотиды могут быть составлены с применением способов, описанных в данном документе. Составы могут содержать полинуклеотиды и могут дополнительно содержать без ограничения средства для проникновения в клетку, фармацевтически приемлемый носитель, средство доставки, биоразрушаемый или биосовместимый полимер, растворитель и депо для доставки с замедленным высвобождением. мРНК в виде составленных полинуклеотидов может быть доставлена в клетку с применением способов введения, известных в данной области техники и описанных в данном документе.[193] Polynucleotides can be formulated using the methods described herein. The compositions may contain polynucleotides and may further contain, without limitation, a cell penetrating agent, a pharmaceutically acceptable carrier, a delivery vehicle, a biodegradable or biocompatible polymer, a solvent, and a sustained release delivery depot. The mRNA in the form of assembled polynucleotides can be delivered into the cell using methods of administration known in the art and described herein.

[194] Введение[194] Introduction

[195] Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно вводить с помощью любого пути, который обеспечивает терапевтически эффективный результат. К этим путям относятся без ограничения: энтеральное, гастроэнтеральное, эпидуральное, пероральное, трансдермальное, эпидуральное (перидуральное), интрацеребральное (в головной мозг), интрацеребровентрикулярное (в желудочки головного мозга), накожное (нанесение на кожу), внутрикожное (собственно в кожу), подкожное (под кожу), назальное введение (через нос), внутривенная (в вену), внутриартериальная (в артерию), внутримышечная (в мышцу), внутрисердечная (в сердце), внутрикостная инфузия (в костный мозг), интратекальная (в позвоночный канал), внутрибрюшинная (инфузия или инъекция в брюшину), внутрипузырная инфузия, интравитреальная (в глаз), интракавернозная инъекция (в основание полового члена), интравагинальное введение, внутриматочное, экстраамниотическое введение, трансдермальное (диффузия через неповрежденную кожу для системного распределения), трансмукозальное (диффузия через слизистую оболочку), инсуффляция (вдувание), сублингвальное, сублабиальное, клизма, глазные капли (на конъюнктиву) или ушные капли. В конкретных вариантах осуществления композиции можно вводить таким образом, чтобы они могли проникать через гематоэнцефалический барьер, сосудистый барьер или другой эпителиальный барьер. Неограничивающие пути введения полинуклеотидов, первичных конструкций или мРНК по настоящему изобретению описаны ниже.[195] The polynucleotides of the present invention can be administered via any route that provides a therapeutically effective result. These routes include, but are not limited to: enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdermal, epidural (epidural), intracerebral (into the brain), intracerebroventricular (into the ventricles of the brain), cutaneous (applied to the skin), intradermal (into the skin itself) , subcutaneous (under the skin), nasal (through the nose), intravenous (into a vein), intra-arterial (into an artery), intramuscular (into a muscle), intracardiac (into the heart), intraosseous infusion (into the bone marrow), intrathecal (into the vertebral canal), intraperitoneal (infusion or injection into the peritoneum), intravesical infusion, intravitreal (into the eye), intracavernous injection (into the base of the penis), intravaginal injection, intrauterine, extra-amniotic injection, transdermal (diffusion through intact skin for systemic distribution), transmucosal (diffusion through the mucous membrane), insufflation (insufflation), sublingual, sublabial, enema, eye drops (on the conjunctiva) or ear drops. In certain embodiments, the compositions can be administered in such a way that they can penetrate the blood-brain barrier, vascular barrier, or other epithelial barrier. Non-limiting routes for administering the polynucleotides, primary constructs or mRNA of the present invention are described below.

[196] Парентеральное и инъекционное введение[196] Parenteral and injection administration

[197] Жидкие лекарственные формы для парентерального введения включают без ограничения фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и/или настойки. В дополнение к действующим веществам жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно используемые в данной области техники, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральные композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, подсластители, вкусовые добавки и/или ароматизирующие средства. В определенных вариантах осуществления для парентерального введения композиции смешивают с солюбилизирующими средствами, такими как CREMOPHOR®, спирты, масла, модифицированные масла, гликоли, полисорбаты, циклодекстрины, полимеры и/или их комбинации.[197] Liquid dosage forms for parenteral administration include, but are not limited to, pharmaceutically acceptable emulsions, microemulsions, solutions, suspensions, syrups and/or tinctures. In addition to the active ingredients, liquid dosage forms may contain inert diluents commonly used in the art, such as, for example, water or other solvents, solubilizing agents and emulsifiers, such as ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils (especially cottonseed, peanut, corn, wheat germ, olive, castor and sesame oils), glycerin, tetrahydrofurfuryl alcohol, polyethylene glycols and sorbitan fatty acid esters and mixtures thereof . In addition to inert diluents, oral compositions may contain auxiliary agents such as wetting agents, emulsifying and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents and/or flavoring agents. In certain embodiments, for parenteral administration, the compositions are mixed with solubilizing agents such as CREMOPHOR®, alcohols, oils, modified oils, glycols, polysorbates, cyclodextrins, polymers, and/or combinations thereof.

[198] Инъекционные лекарственные препараты, например, стерильные инъекционные водные или масляные суспензии, могут быть составлены в соответствии с известным уровнем техники с применением подходящих диспергирующих средств, смачивающих средств и/или суспендирующих средств. Стерильные инъекционные препараты могут представлять собой стерильные инъекционные растворы, суспензии и/или эмульсии в нетоксичных приемлемых для парентерального введения разбавителях и/или растворителях, например, как раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых сред-носителей и растворителей, которые можно применять, представлены вода, раствор Рингера, U.S.P. и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильные нелетучие масла обычно используются в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое щадящее нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, могут применяться при получении инъекционных препаратов.[198] Injectable drugs, for example, sterile injectable aqueous or oleaginous suspensions, can be formulated in accordance with the prior art using suitable dispersing agents, wetting agents and/or suspending agents. Sterile injectable preparations may be sterile injectable solutions, suspensions and/or emulsions in non-toxic parenterally acceptable diluents and/or solvents, such as a solution in 1,3-butanediol. Acceptable carrier media and solvents that may be used include water, Ringer's solution, U.S.P. and isotonic sodium chloride solution. Sterile fixed oils are usually used as a solvent or suspending medium. For this purpose, any gentle fixed oil can be used, including synthetic mono- or diglycerides. Fatty acids such as oleic acid can be used in the preparation of injectable preparations.

[199] Инъекционные составы могут быть стерилизованы, например, путем фильтрования через задерживающий бактерии фильтр и/или путем включения стерилизующих средств в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или другой стерильной инъекционной среде перед применением.[199] Injectable formulations can be sterilized, for example, by filtration through a bacteria-retaining filter and/or by incorporating sterilants in the form of sterile solid compositions that can be dissolved or dispersed in sterile water or other sterile injection medium prior to use.

[200] Чтобы продлить эффект действующего вещества, часто желательно замедлить абсорбцию действующего вещества при подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть достигнуто путем применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с плохой растворимостью в воде. Скорость абсорбции лекарственного средства затем зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. В качестве альтернативы, отсроченная абсорбция парентерально вводимой лекарственной формы достигается путем растворения или суспендирования лекарственного средства в масляной среде-носителе. Инъекционные депо-формы получают путем формирования микроинкапсулированных матриц лекарственного средства в биоразлагаемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения лекарственного средства и полимера и природы конкретного применяемого полимера можно контролировать скорость высвобождения лекарственного средства. Примеры других биоразлагаемых полимеров включают сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Составы, представляющие собой инъекционные депо, получают путем захватывания лекарственного средства в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями организма.[200] To prolong the effect of the active substance, it is often desirable to slow down the absorption of the active substance by subcutaneous or intramuscular injection. This can be achieved by using a liquid suspension of crystalline or amorphous material with poor water solubility. The rate of absorption of a drug then depends on the rate of its dissolution, which in turn may depend on crystal size and crystalline form. Alternatively, delayed absorption of a parenterally administered dosage form is achieved by dissolving or suspending the drug in an oily carrier vehicle. Injectable depot forms are prepared by forming microencapsulated drug matrices in biodegradable polymers such as polylactide-polyglycolide. Depending on the drug to polymer ratio and the nature of the particular polymer used, the rate of drug release can be controlled. Examples of other biodegradable polymers include poly(orthoesters) and poly(anhydrides). Injectable depot formulations are prepared by entrapping the drug in liposomes or microemulsions that are compatible with body tissues.

[201] Введение депо[201] Introduction of depot

[202] Как описано в данном документе, в некоторых вариантах осуществления композиция составлена в виде депо для пролонгированного высвобождения. Как правило, мишенью для введения является конкретный орган или ткань («ткань-мишень»).[202] As described herein, in some embodiments, the composition is formulated as a sustained release depot. Typically, the target for administration is a specific organ or tissue (“target tissue”).

[203] В некоторых аспектах изобретения полинуклеотиды пространственно удерживаются внутри или вблизи ткани-мишени. Предложен способ обеспечения ткани-мишени субъекта-млекопитающего композицией путем приведения ткани-мишени (которая содержит одну или более клеток-мишеней) в контакт с композицией в условиях, при которых композиция, в частности компонент(ы) нуклеиновой кислоты композиции, по сути удерживается в ткани-мишени, что означает, что по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 или более чем 99,99% композиции удерживается в ткани-мишени. Преимущественно уровень удержания определяют путем измерения количества нуклеиновой кислоты, присутствующей в композиции, которая попадает в одну или более клеток-мишеней. Например, по меньшей мере 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 или более 99,99% нуклеиновых кислоты, вводимых субъекту, присутствуют в клетке в период времени после введения. Например, внутримышечную инъекцию субъекту-млекопитающему выполняют с применением водной композиции, содержащей полинуклеотид и реагент для трансфекции, и удержание композиции определяют путем измерения количества рибонуклеиновой кислоты, содержащейся в мышечных клетках.[203] In some aspects of the invention, the polynucleotides are spatially retained within or adjacent to the target tissue. A method of providing a target tissue of a mammalian subject with a composition is provided by bringing the target tissue (which contains one or more target cells) into contact with the composition under conditions under which the composition, in particular the nucleic acid component(s) of the composition, is substantially held in target tissue, meaning that at least 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 or more than 99.99% of the composition is retained in the target tissue. Advantageously, the retention level is determined by measuring the amount of nucleic acid present in the composition that reaches one or more target cells. For example, at least 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99, or more than 99, 99% of the nucleic acids administered to a subject are present in the cell during the time period following administration. For example, intramuscular injection into a mammalian subject is performed using an aqueous composition containing a polynucleotide and a transfection reagent, and retention of the composition is determined by measuring the amount of ribonucleic acid contained in the muscle cells.

[204] Аспекты настоящего изобретения направлены на способы обеспечения ткани-мишени субъекта-млекопитающего композицией путем приведения ткани-мишени (содержащей одну или более клеток-мишеней) в контакт с композицией в условиях, при которых композиция по сути удерживается в ткани-мишени. Композиция содержит эффективное количество полинуклеотида, такое что полипептид, представляющий интерес, продуцируется по меньшей мере в одной клетке-мишени. Композиции, как правило, содержат средство для проникновения в клетку, хотя также рассматривается нуклеиновая кислота без дополнительных средств (такая как нуклеиновые кислоты без средства для проникновения в клетку или другого средства), и фармацевтически приемлемый носитель.[204] Aspects of the present invention are directed to methods of providing a target tissue of a mammalian subject with a composition by bringing the target tissue (containing one or more target cells) into contact with the composition under conditions under which the composition is substantially retained in the target tissue. The composition contains an effective amount of a polynucleotide such that the polypeptide of interest is produced in at least one target cell. The compositions generally comprise a cell penetrating agent, although a nucleic acid without additional agents (such as nucleic acids without a cell penetrating agent or other agent) and a pharmaceutically acceptable carrier are also contemplated.

[205] В некоторых обстоятельствах необходимо увеличение количества белка, продуцируемого клетками в ткани. Предпочтительно, это увеличение продуцирования белка пространственно ограничено клетками в ткани-мишени. Таким образом, предоставлены способы увеличения продуцирования белка, представляющего интерес, в ткани субъекта-млекопитающего. Предусматривается композиция, которая содержит полинуклеотиды, отличающаяся тем, что для единицы количества композиции установлено, что она обеспечивает продуцирование полипептида, представляющего интерес, в значительном проценте клеток, содержащихся в предварительно определенном объеме ткани-мишени.[205] In some circumstances, it is necessary to increase the amount of protein produced by cells in a tissue. Preferably, this increase in protein production is spatially limited to cells in the target tissue. Thus, methods are provided to increase the production of a protein of interest in tissue of a mammalian subject. Provided is a composition that contains polynucleotides, wherein a unit amount of the composition is determined to produce the polypeptide of interest in a significant percentage of cells contained in a predetermined volume of the target tissue.

[206] В некоторых вариантах осуществления композиция содержит несколько различных полинуклеотидов, где один или более полинуклеотидов кодируют полипептид, представляющий интерес. Необязательно композиция также содержит средство для проникновения в клетку, чтобы способствовать внутриклеточной доставке композиции. Определяют дозу композиции, необходимую для обеспечения продуцирования полипептида, представляющего интерес, в значительном проценте клеток, содержащихся в предварительно определенном объеме ткани-мишени (как правило, без индуцирования значительного уровня продуцирования полипептида, представляющего интерес, в ткани, расположенной рядом с предварительно определенным объемом или дистально от ткани-мишени). После этого определения определенную дозу вводят непосредственно в ткань субъекта-млекопитающего.[206] In some embodiments, the composition contains several different polynucleotides, where one or more polynucleotides encode a polypeptide of interest. Optionally, the composition also contains a cell penetrating agent to facilitate intracellular delivery of the composition. Determine the dose of the composition required to cause production of the polypeptide of interest in a significant percentage of cells contained in a predetermined volume of target tissue (generally without inducing a significant level of production of the polypeptide of interest in tissue adjacent to the predetermined volume or distal to the target tissue). Following this determination, a specific dose is administered directly into the tissue of the mammalian subject.

[207] В одном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает доставку полинуклеотидов с помощью более чем одной инъекции или с помощью инъекций в соответствии с методом дробления дозы.[207] In one embodiment, the present invention provides for the delivery of polynucleotides through more than one injection or through injections in accordance with a split-dose method.

[208] В одном варианте осуществления настоящее изобретение может удерживаться вблизи ткани-мишени с применением небольшого одноразового резервуара с лекарственным средством, пластыря-насоса или осмотического насоса. Неограничивающие примеры пластырей-насосов включают насосы, производимые и/или распространяемые BD® (Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США), Insula Corporation (Бедфорд, Массачусетс, США), SteadyMed Therapeutics (Сан-Франциско, Калифорния, США), Medtronic (Миннеаполис, Миннесота, США) (например, MiniMed), UniLife (Йорк, Пенсильвания, США), Valeritas (Бриджуотер, Нью-Джерси, США) и SpringLeaf Therapeutics (Бостон, Массачусетс, США). Неограничивающий пример осмотического насоса включает насос, производимый DURECT® (Купертино, Калифорния, США) (например, DUROS® и ALZET®).[208] In one embodiment, the present invention can be maintained close to the target tissue using a small disposable drug reservoir, pump patch, or osmotic pump. Non-limiting examples of pump patches include those manufactured and/or distributed by BD® (Franklin Lakes, NJ, USA), Insula Corporation (Bedford, MA, USA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA, USA), Medtronic ( Minneapolis, MN, USA) (e.g., MiniMed), UniLife (York, PA, USA), Valeritas (Bridgewater, NJ, USA), and SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA, USA). A non-limiting example of an osmotic pump includes the pump manufactured by DURECT® (Cupertino, California, USA) (eg, DUROS® and ALZET®).

[209] Режим дозирования[209] Dosing regimen

[210] Настоящее изобретение предусматривает способы, включающие введение вектора для генной терапии, содержащего полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический полипептид, и необязательно введение впоследствии мультидоменного терапевтического полипептида субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах осуществления способ включает введение вектора для генной терапии, содержащего полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический полипептид, в терапевтически эффективном количестве пациенту, нуждающемуся в этом, при этом терапевтически эффективное количество является достаточным для устранить необходимость в последующем введении мультидоменного терапевтического полипептида. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ лечения пациента с дефицитом фермента, нуждающегося в этом, например снижение уровней содержания гликогена и/или снижение CRIM к GAA у пациента с болезнью Помпе, включает введение пациенту вектора для генной терапии, содержащего полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, содержащий заместительный фермент, например слитый белок, содержащий scFv к CD63::GAA, например, мультидоменный терапевтический белок, содержащий последовательность, представленную под SEQ ID NO:11, в терапевтически эффективном количестве, где терапевтически эффективное количество устраняет необходимость в последующем введении пациенту заместительного фермента, например GAA или его производных. В некоторых вариантах осуществления способ лечения пациента с дефицитом фермента и который нуждается в этом, например снижение уровня содержания гликогена и/или снижение CRIM к GAA у пациента с болезнью Помпе, включает введение пациенту вектора для генной терапии, содержащего полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, содержащий заместительный фермент, например слитый белок scFv к CD63::GAA, например мультидоменный терапевтический белок, содержащий последовательность, представленную под SEQ ID NO:11, в терапевтически эффективном количестве, и дополнительно включает введение пациенту терапевтически эффективного количества заместительного фермента. Нуклеиновые кислоты, белки или комплексы или фармацевтические композиции, композиции для визуализации, диагностические или профилактические композиции на их основе могут быть введены субъекту с применением любого количества и любого пути введения, эффективного для предотвращения, лечения, диагностики или визуализации заболевания, нарушения и/или состояния (например, заболевания, нарушения и/или состояния, связанного с дефицитом кратковременной памяти). Точное требуемое количество будет варьироваться от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, конкретной композиции, способа ее введения, способа ее действия и т. п. Композиции в соответствии с настоящим изобретением обычно составляют в виде дозированной лекарственной формы для простоты введения и однородности дозирования. Понятно, однако, что общее суточное применение композиций по настоящему изобретению может определяться лечащим врачом исходя из результатов медицинской оценки. Конкретный терапевтически эффективный, профилактически эффективный или подходящий для визуализации уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая нарушение, подлежащее лечению, и тяжесть нарушения; активность конкретного применяемого соединения; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания пациента; время введения, способ введения и скорость выведения конкретного применяемого соединения; продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или одновременно с конкретным применяемым соединением; и подобные факторы, хорошо известные в медицине.[210] The present invention provides methods including administering a gene therapy vector containing a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic polypeptide, and optionally subsequently administering the multi-domain therapeutic polypeptide to a subject in need thereof. In some embodiments, the method includes administering a gene therapy vector comprising a polynucleotide encoding a multidomain therapeutic polypeptide in a therapeutically effective amount to a patient in need thereof, wherein the therapeutically effective amount is sufficient to obviate the need for subsequent administration of the multidomain therapeutic polypeptide. Accordingly, in some embodiments, a method of treating a patient with an enzyme deficiency in need, such as reducing glycogen levels and/or reducing CRIM to GAA in a patient with Pompe disease, comprises administering to the patient a gene therapy vector comprising a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic protein containing a replacement enzyme, for example a fusion protein containing scFv to CD63::GAA, for example, a multi-domain therapeutic protein containing the sequence set forth in SEQ ID NO:11, in a therapeutically effective amount, wherein the therapeutically effective amount eliminates the need for subsequent administration of the replacement enzyme to the patient an enzyme such as GAA or its derivatives. In some embodiments, a method of treating a patient who has an enzyme deficiency and is in need thereof, such as reducing glycogen levels and/or reducing CRIM to GAA in a patient with Pompe disease, comprises administering to the patient a gene therapy vector comprising a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic protein, comprising a replacement enzyme, for example a scFv to CD63::GAA fusion protein, for example a multi-domain therapeutic protein comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:11 in a therapeutically effective amount, and further comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the replacement enzyme. Nucleic acids, proteins or complexes or pharmaceutical compositions, imaging compositions, diagnostic or prophylactic compositions thereof can be administered to a subject using any amount and any route of administration effective for preventing, treating, diagnosing or imaging a disease, disorder and/or condition (eg, diseases, disorders and/or conditions associated with short-term memory deficits). The exact amount required will vary from subject to subject, depending on the species, age and general condition of the subject, the severity of the disease, the specific composition, its route of administration, its mode of action, etc. The compositions in accordance with the present invention are generally formulated in dosage form dosage form for ease of administration and uniformity of dosage. It is understood, however, that the total daily use of the compositions of the present invention may be determined by the attending physician based on the results of a medical evaluation. The specific therapeutically effective, prophylactically effective, or imaging appropriate dose level for any particular patient will depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disorder; the activity of the particular compound used; the specific composition used; age, body weight, general health, gender and diet of the patient; timing of administration, route of administration, and rate of elimination of the particular compound used; duration of treatment; drugs used in combination or concurrently with the specific compound used; and similar factors well known in medicine.

[211] Следующие примеры представлены с целью дальнейшей иллюстрации способов согласно настоящему изобретению. Данные примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.[211] The following examples are presented to further illustrate the methods of the present invention. These examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1. Конструирование полинуклеотида ScFv к hCD63::GAA и вектора для генной терапииExample 1. Construction of the ScFv polynucleotide for hCD63::GAA and vector for gene therapy

[212] Вирусы AAV2/8, кодирующие экспрессию GAA человека (hGAA; SEQ ID NO:1; последовательность нуклеиновой кислоты, представленная под SEQ ID NO:12) или одноцепочечный вариабельный фрагмент к CD63 человека (ScFv), слитый на его С-конце с GAA человека (scFv к hCD63-hGAA; SEQ ID NO:10; нуклеиновая кислота, представленная под SEQ ID NO: 11), генерировали с применением стандартного протокола тройной трансфекции (Gray et al. 2011; см. также «Production of recombinant adeno-associated viral vectors and use in vitro and in vivo administration», Current Protocols in Neuroscience, John Wiley & Sons, New York (1999), pp. 4.17.1-4.17.25, Vol 1). Для продуцирования 1×10⁷ клеток HEK293 высевали на чашки диаметром 15 см. На следующий день клетки трансфицировали с помощью (А) либо 8 мкг контрольного вектора pAAV, содержащего специфический для печени энхансер серпина 1 (SEQ ID NO:9) и кодирующего TTR-управляемую GAA человека, либо тестируемого pAAV, содержащего специфический для печени энхансер серпина 1 (SEQ ID NO:9) и кодирующего TCD-управляемый scFv к hCD63-hGAA (см. фигуру 1B) и (B) вектора, полученного из pAAV RC2/8, (Gao, 2002) и 16 мкг pHelper (Agilent, № по кат. 240074), с применением PEIpro (Polyplus transfection, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США № по кат. 115-100)-опосредованной трансфекции, в соотношении 1:1 (1 мкл PEIpro: 1 мкг ДНК). Через семьдесят два часа после трансфекции клетки собирали и лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ MgCl2, 2,5 мМ KCl, 100 мМ NaCl, с применением стандартного метода замораживания-оттаивания. Затем к образцам добавляли бензоназу (Sigma, № по кат. E1014-25KU) в конечной концентрации 0,5 ед./мкл, и затем инкубировали при 37°С в течение 60 минут. Затем вирусы очищали с применением ультрацентрифугирования в градиенте йодиксанола, как описано в (Zolotukhin et al., 1999, Gene Ther 1999;6:973-985), и затем титровали с помощью qPCR.[212] AAV2/8 viruses encoding the expression of human GAA (hGAA; SEQ ID NO:1; the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO:12) or a single chain variable fragment to human CD63 (ScFv) fused at its C-terminus with human GAA (scFv to hCD63-hGAA; SEQ ID NO: 10; nucleic acid provided under SEQ ID NO: 11) was generated using a standard triple transfection protocol (Gray et al. 2011; see also “Production of recombinant adeno -associated viral vectors and use in vitro and in vivo administration", Current Protocols in Neuroscience, John Wiley & Sons, New York (1999), pp. 4.17.1-4.17.25, Vol 1). To produce 1×10 ⁷ HEK293 cells were plated on 15 cm diameter dishes. The next day, cells were transfected with (A) or 8 μg of the pAAV control vector containing the liver-specific serpin enhancer 1 (SEQ ID NO:9) and encoding TTR- driven by human GAA, or test pAAV containing the liver-specific serpin 1 enhancer (SEQ ID NO:9) and encoding a TCD-driven scFv to hCD63-hGAA (see Figure 1B ) and (B) a vector derived from pAAV RC2/8 , (Gao, 2002) and 16 μg pHelper (Agilent, cat. no. 240074), using PEIpro (Polyplus transfection, New York, NY, USA cat. no. 115-100)-mediated transfection, in the ratio 1:1 (1 µl PEIpro: 1 µg DNA). Seventy-two hours after transfection, cells were harvested and lysed in a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 2.5 mM KCl, 100 mM NaCl using a standard freeze-thaw method. Benzonase (Sigma, Cat. No. E1014-25KU) was then added to the samples at a final concentration of 0.5 U/μL and then incubated at 37°C for 60 minutes. The viruses were then purified using iodixanol gradient ultracentrifugation as described in (Zolotukhin et al., 1999, Gene Ther 1999;6:973-985) and then titrated by qPCR.

[213] Образцы AAV обрабатывали с помощью DNaseI (Thermofisher Scientific, № по кат. EN0525) при 37°C в течение одного часа и лизировали с применением экстракта ДНК All Reagents (Thermofisher Scientific № по кат. 4403319). Инкапсидированные вирусные геномы определяли количественно с применением системы ПЦР в режиме реального времени QuantStudio 3 (Thermofisher Scientific) с применением праймеров, направленных на ITR AAV2. Последовательности праймеров к ITR AAV2 представляют собой 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ (прямой праймер к ITR; SEQ ID NO:3) и 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′ (обратный праймер к ITR; SEQ ID NO:4) (Aurnhammer et al., 2012), с помощью которых получают последовательность левого внутреннего инвертированного повтора (ITR) AAV (SEQ ID NO:6) и правого внутреннего инвертированного повтора (ITR) AAV (SEQ ID NO:7), соответственно. Последовательность зонда ITR AAV2 представляет собой 5'-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3' (SEQ ID NO:5) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N., et al., 2012, Hum. Gene Ther. Methods 23, 18-28). После этапа активации при 95°С, длившегося 10 минут, проводили цикл двухстадийной ПЦР при 95°С в течение 15 секунд и при 60°С в течение 30 секунд, всего 40 циклов. Для qPCR применяли TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermofisher Scientific, № по кат. 4304437). ДНК-плазмиду (Agilent, № по кат. 240074) применяли в качестве стандарта для определения абсолютных титров.[213] AAV samples were digested with DNaseI (Thermofisher Scientific, cat. no. EN0525) at 37°C for one hour and lysed using All Reagents DNA extract (Thermofisher Scientific cat. no. 4403319). Encapsidated viral genomes were quantified using the QuantStudio 3 real-time PCR system (Thermofisher Scientific) using primers targeting the AAV2 ITR. The AAV2 ITR primer sequences are 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ (ITR forward primer; SEQ ID NO:3) and 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′ (ITR reverse primer; SEQ ID NO:4) (Aurnhammeret al., 2012), which are used to obtain the sequence of the left internal inverted repeat (ITR) of AAV (SEQ ID NO:6) and the right internal inverted repeat (ITR) of AAV (SEQ ID NO:7), respectively. The AAV2 ITR probe sequence is 5'-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3' (SEQ ID NO:5) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N., et al., 2012, Hum. Gene Ther. Methods 23, 18-28). After an activation step at 95°C for 10 minutes, a two-step PCR cycle was performed at 95°C for 15 seconds and at 60°C for 30 seconds, for a total of 40 cycles. TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermofisher Scientific, cat. no. 4304437) was used for qPCR. DNA plasmid (Agilent, cat. no. 240074) was used as a standard for determining absolute titers.

[214] Для антител к CD63 человека и слитых молекул на их основе применяли вариабельные домены мышиного H5C6 к CD63 человека (аминокислоты 1-119 из SEQ ID NO:10 обеспечивают аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) антитела H5C6, а аминокислоты 135-245 из SEQ ID NO:10 обеспечивают аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи (V_L) антитела H5C6). Используемый в данном документе scFv к hCD63 (SEQ ID NO:2) получали из клона H5C6, который представляет собой легкую цепь антитела каппа из моноклонального мышиного IgG1 к hCD63, (H5C6 внесли в Банк гибридом для исследований развития (Developmental Studies Hybridoma Bank) Университета Айовы к августу, J.T. / Hildreth, J.E.K. (DSHB Hybridoma Product H5C6; DSHB № по кат. h5c6, RRID:AB_528158). ScFv-версии антител клонировали с вариабельными доменами в порядке тяжелая цепь-легкая цепь с глицин-сериновым линкером между ними (5'-VH-Gly-Ser-VL-3').[214] For antibodies to human CD63 and fusion molecules based thereon, the variable domains of mouse H5C6 to human CD63 were used (amino acids 1-119 of SEQ ID NO:10 provide the amino acid sequence of the heavy chain variable domain ( _VH ) of the antibody H5C6, and amino acids 135 -245 of SEQ ID NO:10 provides the amino acid sequence of the light chain variable domain (V _L ) of the H5C6 antibody). The anti-hCD63 scFv used herein (SEQ ID NO:2) was derived from clone H5C6, which is a kappa light chain from monoclonal mouse IgG1 anti-hCD63, (H5C6 was deposited into the Developmental Studies Hybridoma Bank of the University of Iowa by August, JT/Hildreth, JEK (DSHB Hybridoma Product H5C6; DSHB Cat# h5c6, RRID:AB_528158) ScFv versions of the antibodies were cloned with variable domains in the heavy chain-light chain order with a glycine-serine linker in between (5 '-VH-Gly-Ser-VL-3').

Пример 2. Содержание гликогена в мышиной модели болезни Помпе после введения AAVExample 2 Glycogen content in a mouse model of Pompe disease after AAV administration

[215] Чтобы определить эффект доставленного с помощью AAV слитого белка, содержащего scFv к hCD63 и GAA, по сравнению с доставленной с помощью AAV GAA в соответствующей модели накопления гликогена in vivo, оба средства терапии доставляли в мышиную модель болезни Помпе, где мыши были гомозиготными по делеции гена GAA мыши и были гомозиготными по экспрессии CD63 человека вместо CD63 мыши с фоновым генотипом штамма, составляющим 75% C57BL/6; 25% 129SvJ. Эти мыши в данном документе упоминаются как мыши CD63 HumIn с нокаутом GAA или, в качестве альтернативы, CD63hu/hu; мыши GAA^-/-.[215] To determine the effect of an AAV-delivered fusion protein containing scFv to hCD63 and GAA compared with AAV-delivered GAA in a corresponding in vivo model of glycogen storage, both therapies were delivered to a mouse model of Pompe disease where the mice were homozygous by deletion of the mouse GAA gene and were homozygous for the expression of human CD63 instead of mouse CD63 with a background strain genotype of 75% C57BL/6; 25% 129SvJ. These mice are referred to herein as CD63 HumIn GAA knockout mice or alternatively CD63hu/hu; GAA ^-/- mice.

[216] Для эксперимента 2-месячным мышам CD63 HumIn с нокаутом GAA вводили посредством инъекции в хвостовую вену либо вирус AAV2/8, содержащий геном либо со специфическим для печени TTR-промотором, управляющим GAA человека (AAV-hGAA; описанный в примере 1), либо со специфическим для печени TTR-промотором, управляющим scFv к CD63 человека, слитым на своем С-конце с GAA человека (AAV-scFv к hCD63-hGAA; описанный в примере 1). Оба вируса AAV2/8 доставляли в одной из двух доз, 1e10 vg/мышь или 1e11 vg/мышь. В качестве контроля в анализ были включены необработанные мыши CD63 HumIn с нокаутом GAA и необработанные мыши CD63 HumIn с интактным геном GAA. Мышей содержали в течение 3 месяцев после обработки и периодически (ежемесячно) брали у них кровь в течение этого периода для измерений уровней содержания GAA и антител к GAA в сыворотке крови. Через 3 месяца всех мышей умерщвляли и собирали отдельные ткани для измерений уровней гликогена, окрашивания с помощью PAS-H, количественного определения центрально расположенных ядер, измерения уровня пролиферации лизосом и измерения уровня экспрессии LC3b. Протокол дозирования и обработки для групп мышей в ходе эксперимента показан в таблице 3.[216] For the experiment, 2-month-old CD63 HumIn GAA knockout mice were treated by tail vein injection with either an AAV2/8 virus containing the genome or with the liver-specific TTR promoter driving human GAA (AAV-hGAA; described in Example 1). , or with a liver-specific TTR promoter driving scFv to human CD63 fused at its C-terminus to human GAA (AAV-scFv to hCD63-hGAA; described in Example 1). Both AAV2/8 viruses were delivered at one of two doses, 1e10 vg/mouse or 1e11 vg/mouse. As controls, untreated CD63 HumIn GAA knockout mice and untreated CD63 HumIn mice with an intact GAA gene were included in the analysis. Mice were maintained for 3 months after treatment and bled periodically (monthly) during this period to measure serum GAA and anti-GAA antibody levels. After 3 months, all mice were sacrificed and individual tissues were collected for measurements of glycogen levels, PAS-H staining, quantification of centrally located nuclei, measurement of lysosome proliferation levels, and measurements of LC3b expression levels. The dosing and treatment protocol for groups of mice during the experiment is shown in Table 3.

Таблица 3. Протокол дозирования и обработки для групп мышей в ходе экспериментаTable 3. Dosing and treatment protocol for groups of mice during the experiment

ГруппаGroup МышиMice Количество мышейNumber of mice ОбработкаTreatment ДозировкаDosage 11 CD63 HumIn с нокаутом GAACD63 HumIn with GAA Knockout 44 ОтсутствуетAbsent н/дn/a 22 CD63 HumIn с нокаутом GAACD63 HumIn with GAA Knockout 44 AAV-hGAAAAV-hGAA 1e10 vg/мышь1e10vg/mouse 33 CD63 HumIn с нокаутом GAACD63 HumIn with GAA Knockout 44 AAV-hGAAAAV-hGAA 1e11 vg/мышь1e11 vg/mouse 44 CD63 HumIn с нокаутом GAACD63 HumIn with GAA Knockout 55 AAV-scFv к hCD63-hGAAAAV-scFv to hCD63-hGAA 1e10 vg/мышь1e10vg/mouse 55 CD63 HumIn с нокаутом GAACD63 HumIn with GAA Knockout 44 AAV-scFv к hCD63-hGAAAAV-scFv to hCD63-hGAA 1e11 vg/мышь1e11 vg/mouse 66 CD63 HumIn с GAA WTCD63 HumIn with GAA WT 22 ОтсутствуетAbsent н/дn/a

[217] Результаты также представлены на фигуре 2, из которой видно, что scFv к hCD63::GAA понижает уровень содержания гликогена в скелетной мышце до уровней, характерных для дикого типа, в отличие от GAA отдельно. Обработка с помощью мультидоменного терапевтического белка, представляющего собой двухдоменный scFv к hCD63::GAA, привела к гораздо большему снижению содержания накопленного гликогена по сравнению с обработкой с помощью однодоменного заместительного фермента GAA. Из графика зависимости уровней содержания гликогена в квадрицепсе (фигура 3) или уровней содержания гликогена в сердце (фигура 4) от общей экспрессии GAA или scFv-GAA в сыворотке крови в течение трех месяцев для отдельных мышей видно, что слитый белок scFv к hCD63::GAA удаляет больше гликогена, чем фермент GAA отдельно, даже при аналогичных уровнях содержания в сыворотке крови (фигуры 3 и 4).[217] The results are also shown in Figure 2, which shows that scFv to hCD63::GAA reduces skeletal muscle glycogen levels to wild-type levels, as opposed to GAA alone. Treatment with the multidomain therapeutic protein, a dual-domain scFv to hCD63::GAA, resulted in a much greater reduction in stored glycogen compared to treatment with the single-domain GAA replacement enzyme. Plotting quadriceps glycogen levels (Figure 3) or cardiac glycogen levels (Figure 4) against total serum GAA or scFv-GAA expression over three months for individual mice, the scFv to hCD63 fusion protein: GAA removes more glycogen than GAA enzyme alone, even at similar serum levels (Figures 3 and 4).

Пример 3. Иммунный ответ на GAAExample 3: Immune response to GAA

[218] Для измерения уровней содержания антител к GAA человека в сыворотке крови во всех группах обработки отделение сыворотки от крови, собранной во время терминального кровотечения, осуществляли с применением пробирок для отделения сыворотки (BD Biosciences, № по кат. 365967) в соответствии с инструкциями производителя. Отдельно 96-луночные планшеты с высокой эффективностью связывания белков (ThermoFisher, № по кат. 15041) покрывали с помощью 20 мкг hGAA (R&D Systems, № по кат. 8329-GH-025), разведенного в PBS в течение ночи. Планшеты промывали с помощью PBS + 0,05% Tween (PBS-T) 3 раза. Планшеты блокировали с помощью 0,5% BSA в PBS-T, и серийные разведения мышиной сыворотки в диапазоне от 1:300 до 1:5,1e7 добавляли в планшет на ночь. Общее количество антител к IgG мыши (подклассы 1 + 2a + 2b + 3) измеряли с применением конъюгированного с HRP козьего антитела к IgG мыши (Jackson Immuno Research, № по кат. 115-035-164) и набора субстратов BD Opt EIA. Колориметрические реакции останавливали с применением 1 н. фосфорной кислоты. Затем измеряли поглощение при 450 нм на планшет-ридере Spectramax i3 (Molecular Devices). Кривые разведений аппроксимировали по сигмоидальным кривым, и из кривых рассчитывали титры. Титры, выраженные в виде среднего общего титра IgG +/- SD, показаны в таблице 4.[218] To measure serum levels of anti-human GAA antibodies in all treatment groups, separation of serum from blood collected at the time of terminal bleeding was performed using serum separation tubes (BD Biosciences, cat. no. 365967) according to the instructions manufacturer. Separately, 96-well high efficiency protein binding plates (ThermoFisher, cat. no. 15041) were coated with 20 μg of hGAA (R&D Systems, cat. no. 8329-GH-025) diluted in PBS overnight. The plates were washed with PBS + 0.05% Tween (PBS-T) 3 times. The plates were blocked with 0.5% BSA in PBS-T and serial dilutions of mouse serum ranging from 1:300 to 1:5.1e7 were added to the plate overnight. Total anti-mouse IgG antibodies (subclasses 1 + 2a + 2b + 3) were measured using HRP-conjugated goat anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research, cat. no. 115-035-164) and the BD Opt EIA Substrate Kit. Colorimetric reactions were stopped using 1 N. phosphoric acid. Absorbance was then measured at 450 nm using a Spectramax i3 plate reader (Molecular Devices). Dilution curves were fitted to sigmoidal curves, and titers were calculated from the curves. Titers expressed as mean total IgG titer +/- SD are shown in Table 4.

[219] Как показано в таблице 4, мыши, которые не подвергались обработке, показывали средний фоновый титр со средними уровнями 1,1E+03. Мыши, которых обрабатывали с помощью низкой дозы вируса (1e10 vg/мышь), либо AAV-scFv к hCD63-hGAA, либо AAV-hGAA, демонстрировали высокие титры, тогда как у мышей, обработанных высокой дозой (1e11 vg/мышь), титры были ниже. Мыши, обработанные с помощью 1e11vg AAV-scFv к hCD63-hGAA, которые показывали наиболее высокие уровни GAA в сыворотке крови, имели титры, находящиеся в диапазоне таковых у необработанных мышей.[219] As shown in Table 4, mice that were not treated showed an average background titer with average levels of 1.1E+03. Mice treated with a low dose of virus (1e10 vg/mouse), either AAV-scFv to hCD63-hGAA or AAV-hGAA, showed high titers, whereas mice treated with a high dose (1e11 vg/mouse) showed high titers. were lower. Mice treated with 1e11vg AAV-scFv to hCD63-hGAA, which exhibited the highest serum GAA levels, had titers in the range of those of untreated mice.

Таблица 4. Уровни содержания антител к GAA в сыворотке кровиTable 4. Serum levels of anti-GAA antibodies

Общий титр IgG к GAATotal IgG titer to GAA CD63 HumIn с нокаутом GAA без обработкиCD63 HumIn GAA Knockout Without Treatment CD63 HumIn с нокаутом GAA + AAV-hGAACD63 HumIn GAA+AAV-hGAA Knockout
(1e10 vg)(1e10vg) CD63 HumIn с нокаутом GAA + AAV-hGAACD63 HumIn GAA+AAV-hGAA Knockout
(1e11 vg)(1e11vg) CD63 HumIn с нокаутом GAA + AAV-scFv к hCD63-hGAACD63 HumIn with GAA + AAV-scFv knockout to hCD63-hGAA
(1e10 vg)(1e10vg) CD63 HumIn с нокаутом GAA + AAV-scFv к hCD63-hGAACD63 HumIn with GAA + AAV-scFv knockout to hCD63-hGAA
(1e11 vg)(1e11vg) СреднееAverage 1,1E+031.1E+03 7,6E+067.6E+06 2,4E+042.4E+04 5,5E+045.5E+04 4,0E+034.0E+03 SDSD 1,3E+031.3E+03 1,0E+071.0E+07 2,5E+042.5E+04 1,9E+041.9E+04 4,9E+034.9E+03

[220] Более высокие уровни содержания GAA или scFv к hCD63::GAA после введения AAV соответствуют более низким титрам антител к GAA. Сыворотку мышей с нокаутом по GAA, обработанных высокими или низкими титрами AAV-scFv к hCD63::GAA или AAV-GAA, оценивали в отношении содержания антител к GAA в течение трех месяцев после инъекции. На фигуре 5 изображена зависимость сывороточных титров антител к GAA от уровня воздействия GAA (т. е. общая экспрессия GAA или scFv-GAA в сыворотке в течение 3 месяцев) для отдельных мышей, что демонстрирует отрицательную корреляцию между титром антител и уровнем воздействия GAA на сыворотку, демонстрируя, что мыши с высоким уровнем воздействия GAA были подвергнуты индуцированию толерантности к GAA. Аналогично, фигура 6, на которой представлены титры антител к GAA для различных групп, инфицированных AAV, кодирующим GAA или белок scFv к hCD63::GAA, демонстрирует, что более высокие дозы конструкции приводили к более низким титрам антител к GAA.[220] Higher levels of GAA or anti-hCD63::GAA scFv following AAV administration correspond to lower titers of anti-GAA antibodies. Sera from GAA knockout mice treated with high or low titers of AAV-scFv to hCD63::GAA or AAV-GAA were assessed for anti-GAA antibodies for three months post-injection. Figure 5 plots serum anti-GAA antibody titers as a function of GAA exposure level ( i.e., total serum GAA or scFv-GAA expression over 3 months) for individual mice, demonstrating a negative correlation between antibody titers and serum GAA exposure level. , demonstrating that mice with high levels of GAA exposure were subject to induction of GAA tolerance. Likewise, Figure 6 , which plots anti-GAA antibody titers for different groups infected with AAV encoding GAA or the anti-hCD63::GAA scFv protein, demonstrates that higher doses of the construct resulted in lower anti-GAA antibody titers.

Пример 4. Содержание GAA в сывороткеExample 4 Serum GAA Content

[221] Чтобы измерить уровни содержания GAA человека в сыворотке крови в течение эксперимента, образцы отбирали в определенные моменты каждый месяц, вызывая хвостовое кровотечение. Сыворотку отделяли от крови, используя пробирки для отделения сыворотки (BD Biosciences, № по кат. 365967) в соответствии с инструкциями производителя. Затем 1 мкл выделенной сыворотки загружали в 4-20% предварительно залитый гель Novex wedgewell, прогоняли при 220 В в течение 45 минут и переносили на нитроцеллюлозную мембрану при 200 мА в течение 1 часа, применяя стандартные процедуры. Затем нитроцеллюлозную мембрану изучали с помощью первичного антитела к GAA (Abcam, № ab137068), используемого в разведении 1:2000, и антитела к GAPDH (Abcam, № AB9484), используемого в разведении 1:1000, в 12 мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. После первичной инкубации с антителами мембрану трижды промывали с помощью 1 × TBST, по 5 минут на каждую промывку. Затем к мембране добавляли вторичные антитела к IgG кролика (LiCor, 926-32211) и к IgG мыши (LiCor, 925-68070) (LiCor, Линкольн, Небраска) в разведении 1:15000 в 12 мл и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации с вторичными антителами мембрану дважды промывали с помощью 1 х TBST, по 5 минут на каждую промывку, и один раз с помощью 1 х TBS в течение 5 минут. Затем мембрану визуализировали и осуществляли количественное определение с применением прибора LiCor Odyssey (LI-COR Biotechnology). Уровни содержания GAA в сыворотке крови, выраженные как среднее +/- стандартное отклонение (SD) в произвольных единицах, показаны в таблице 5.[221] To measure human serum GAA levels over the course of the experiment, samples were taken at specific points each month by inducing a tail bleed. Serum was separated from blood using serum separation tubes (BD Biosciences, cat. no. 365967) according to the manufacturer's instructions. 1 μl of isolated serum was then loaded onto a 4-20% pre-loaded Novex wedgewell gel, run at 220 V for 45 minutes, and transferred to a nitrocellulose membrane at 200 mA for 1 hour using standard procedures. The nitrocellulose membrane was then probed with anti-GAA primary antibody (Abcam, no. ab137068) used at a dilution of 1:2000 and anti-GAPDH antibody (Abcam, no. AB9484) used at a dilution of 1:1000 in 12 ml and incubated overnight at 4°C. After the initial incubation with antibodies, the membrane was washed three times with 1× TBST, 5 minutes per wash. Secondary antibodies against rabbit IgG (LiCor, 926-32211) and anti-mouse IgG (LiCor, 925-68070) (LiCor, Lincoln, NE) were then added to the membrane at a dilution of 1:15,000 in 12 ml and incubated for 1 hour at room temperature. temperature. After incubation with secondary antibodies, the membrane was washed twice with 1x TBST for 5 minutes per wash, and once with 1x TBS for 5 minutes. The membrane was then visualized and quantified using a LiCor Odyssey instrument (LI-COR Biotechnology). Serum GAA levels, expressed as mean +/- standard deviation (SD) in arbitrary units, are shown in Table 5.

[222] Как показано в таблице 5, мыши CD63 HumIn с нокаутом GAA, обработанные высокой дозой (10¹¹ vg/мышь) исследуемых AAV-scFv к hCD63-hGAA или AAV-hGAA, продемонстрировали устойчивые уровни содержания GAA в сыворотке крови в течение эксперимента, причем уровни содержания GAA в сыворотке крови были несколько выше у мышей, обработанных с помощью AAV-scFv к hCD63-hGAA, чем у мышей, обработанных с помощью AAV-hGAA. У мышей, обработанных низкой дозой (10¹⁰ vg/мышь) либо AAV-scFv к hCD63-hGAA, либо AAV-hGAA, уровни GAA снижались в течение эксперимента, приближаясь к пренебрежительно малым уровням у некоторых мышей к моменту времени на 12 неделе.[222] As shown in Table 5, CD63 HumIn GAA knockout mice treated with a high dose (10 ¹¹ vg/mouse) of the study AAV-scFv to hCD63-hGAA or AAV-hGAA demonstrated sustained serum GAA levels throughout the experiment. , with serum GAA levels being slightly higher in mice treated with AAV-scFv to hCD63-hGAA than in mice treated with AAV-hGAA. In mice treated with a low dose (10 ¹⁰ vg/mouse) of either AAV-scFv to hCD63-hGAA or AAV-hGAA, GAA levels decreased over the course of the experiment, approaching negligible levels in some mice at the 12 week time point.

Таблица 5. Уровни содержания GAA в сывороткеTable 5. Serum GAA levels

AAV-scFv к hCD63-hGAA (10AAV-scFv to hCD63-hGAA (10 ¹⁰¹⁰ vg)vg) AAV-hGAA (10AAV-hGAA (10 ¹⁰¹⁰ vg)vg) AAV-scFv к hCD63-hGAA (10AAV-scFv to hCD63-hGAA (10 ^11eleven vg)vg) AAV-hGAA (10AAV-hGAA (10 ^11eleven vg)vg) НеделяA week СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD 11 0,210.21 0,170.17 0,040.04 0,030.03 2,362.36 1,781.78 0,770.77 0,530.53 22 0,190.19 0,160.16 0,070.07 0,070.07 2,022.02 1,181.18 1,151.15 0,560.56 44 0,170.17 0,150.15 0,010.01 0,020.02 2,802.80 1,161.16 1,221.22 0,750.75 88 0,290.29 0,330.33 0,030.03 0,050.05 2,582.58 1,181.18 0,620.62 0,600.60 1212 0,120.12 0,190.19 0,000.00 0,010.01 2,612.61 1,531.53 0,770.77 0,860.86 Площадь под кривойArea under the curve 2,272.27 2,232.23 0,270.27 0,360.36 28,1328.13 13,7313.73 9,809.80 7,227.22

[223] Экспрессия GAA или scFv к hCD63::GAA сохранялась в течение времени у мышей, получавших высокую дозу AAV (10¹¹ vg/мышь), но снижалась у мышей, получавших более низкую дозу (10¹⁰ vg/мышь). На фигуре 7А представлен график изменения уровней содержания GAA в сыворотке крови, измеренных с помощью вестерн-блоттинга, с течением времени для различных групп, инфицированных AAV, кодирующим GAA или scFv к hCD63, слитый с GAA. В случае слитого белка (scFv::GAA) демонстрировали неизменно более высокие уровни (например, в 2,5-3 раза) содержания GAA в сыворотке, чем в случае фермента GAA без домена доставки (фигура 7A).[223] Expression of GAA or scFv to hCD63::GAA was maintained over time in mice treated with a high dose of AAV (10 ¹¹ vg/mouse) but decreased in mice treated with a lower dose (10 ¹⁰ vg/mouse). Figure 7A shows a graph of serum GAA levels measured by Western blotting over time for different groups infected with AAV encoding GAA or scFv to hCD63 fused to GAA. The fusion protein (scFv::GAA) exhibited consistently higher levels ( eg 2.5-3-fold) of serum GAA content than the GAA enzyme without the delivery domain (Figure 7A).

[224] Количественная оценка экспрессии с помощью ПЦР в режиме реального времени в лизатах печени, сердца и квадрицепса спустя 3 месяца после инъекции показана на фиг. 7В. Экспрессия в печени была обнаружена при всех инъекциях конструкции на основе AAV, причем наивысшие уровни были обнаружены при инъекциях 1e11vg/мышь как для AAV-hGAA, так и для AAV-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA (оба управляются специфическим для печени промотором, LSP). Провели также сравнение уровня содержания GAA в сыворотке крови с уровнем экспрессии РНК GAA (фиг. 7C), и результаты показывают, что мыши, получающие AAV, кодирующий слитый белок, демонстрировали более низкую экспрессию РНК GAA, локализующейся в печени, через 3 месяца, однако уровни содержания GAA в сыворотке крови были высокими у этой конкретной мыши. В случае инъекций AAV-LSP-hGAA не показали высокого уровня содержания GAA в сыворотке крови при низких уровнях содержания РНК в печени. См. фиг. 7C. Эти данные свидетельствуют о том, что AAV, кодирующий белок слияния (экспрессия управляется специфическим для печени промотором), обеспечивает улучшенный профиль секреции GAA.[224] Quantification of expression by real-time PCR in liver, heart and quadriceps lysates 3 months post-injection is shown in FIG. 7B. Hepatic expression was detected in all injections of the AAV-based construct, with the highest levels detected in 1e11vg/mouse injections for both AAV-hGAA and AAV-hCD63::hGAA-binding fragment (both driven by the liver-specific promoter, LSP ). Serum GAA levels were also compared with GAA RNA expression levels (Figure 7C), and the results show that mice receiving the AAV fusion protein had lower liver-localized GAA RNA expression at 3 months, however Serum GAA levels were high in this particular mouse. Injected AAV-LSP-hGAA did not show high serum GAA levels with low liver RNA levels. See fig. 7C. These data suggest that AAV encoding a fusion protein (expression driven by a liver-specific promoter) provides an improved GAA secretion profile.

[225] Также в гепатоцитах Huh-7 наблюдали более высокое отношение секретируемого к внутриклеточному антителу:hGAA по сравнению с введением hGAA отдельно. В одном эксперименте гепатоциты Huh-7 человека были временно трансфицированы конструкциями, управляемыми специфическим для печени промотором, которые кодировали hGAA, слитый белок scFv к hCD63::GAA или контрольный слитый белок, содержащий несвязывающий scFv и GAA. Обе слитые конструкции scFv::GAA характеризовались более высоким соотношением белка в секретируемом супернатанте, чем в случае hGAA отдельно, через 3 дня после трансфекции (статистически значимо для p <0,05, n=3). Добавление M6P в супернатант в течение экспериментального периода для уменьшения CI-MPR-опосредованного захвата не влияло на соотношение.[225] Also, a higher ratio of secreted to intracellular antibody:hGAA was observed in Huh-7 hepatocytes compared to administration of hGAA alone. In one experiment, human Huh-7 hepatocytes were transiently transfected with liver-specific promoter-driven constructs that encoded hGAA, a scFv to hCD63::GAA fusion protein, or a control fusion protein containing a non-binding scFv and GAA. Both scFv::GAA fusion constructs had a higher protein ratio in the secreted supernatant than hGAA alone 3 days after transfection (statistically significant at p < 0.05, n = 3). Addition of M6P to the supernatant during the experimental period to reduce CI-MPR-mediated uptake did not affect the ratio.

Пример 5. Измерение уровня содержания гликогена в ткани и гистологическая характеристика мышечной тканиExample 5: Measurement of tissue glycogen levels and histological characterization of muscle tissue

[226] Измерение уровня содержания гликогена в ткани. Для измерения содержания гликогена в отдельных тканях - ткани сердца, квадрицепса, икроножной мышцы, диафрагмы, камбаловидной мышцы и EDL, - ткани вырезали у мышей из всех групп сразу же после асфиксии при помощи CO₂, а затем мгновенно замораживали в жидком азоте и хранились при -80°C. ~50 мг каждой ткани лизировали на настольном гомогенизаторе с шариками из нержавеющей стали в дистиллированной воде в соотношении от 1 мг до 25 мкл воды для измерений уровня содержания гликогена. Лизаты гликогена для анализа нагревали при 105°С в течение 15 минут и центрифугировали при 21000 x g для удаления дебриса. Измерения уровня гликогена проводили с применением набора для анализа гликогена (Sigma-Aldrich, № MAK016) в соответствии с инструкциями производителя для флуорометрических анализов. Флуоресценцию каждого образца измеряли при длине волны возбуждения 535 нм и длине волны излучения 587 нм на флуоресцентном планшет-ридере (Molecular Devices, Spectramax i3). Рассчитанное количество гликогена рассчитывали с применением следующей формулы, предоставленной производителем. Рассчитанное количество гликогена из каждой ткани в каждой группе обработки затем усредняли и полученные значения выражены в виде среднего +/- стандартное отклонение (SD) в таблице 6.[226] Measuring tissue glycogen levels . To measure glycogen content in individual tissues—heart, quadriceps, gastrocnemius, diaphragm, soleus, and EDL—tissues were excised from mice from all groups immediately after CO ₂ asphyxia and then snap frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C. ~50 mg of each tissue was lysed on a benchtop stainless steel bead homogenizer in distilled water at a ratio of 1 mg to 25 μl of water for glycogen measurements. Glycogen lysates for analysis were heated at 105°C for 15 minutes and centrifuged at 21,000 x g to remove debris. Glycogen measurements were performed using a glycogen assay kit (Sigma-Aldrich, #MAK016) according to the manufacturer's instructions for fluorometric assays. The fluorescence of each sample was measured at an excitation wavelength of 535 nm and an emission wavelength of 587 nm on a fluorescence plate reader (Molecular Devices, Spectramax i3). The calculated amount of glycogen was calculated using the following formula provided by the manufacturer. The calculated amount of glycogen from each tissue in each treatment group was then averaged and the resulting values are expressed as mean +/- standard deviation (SD) in Table 6.

[227] Как показано в таблице 6, потеря Gaa вызывает значительное повышение средних уровней содержания гликогена во всех тканях, в отношении которых осуществляли измерения, по сравнению с мышами с GAA WT. Обработка с помощью AAV-scFv к hCD63-hGAA при 10¹¹ vg/мышь снижала уровень содержания гликогена до уровней, характерных для WT, или почти до уровней, характерных для WT, во всех протестированных тканях, в отличие от обработки с помощью AAV-GAA, которая обеспечивала лишь частичное снижение содержания накопленного гликогена. Низкие дозы любого вируса также снижают уровень содержания гликогена, но в меньшей степени, чем высокие дозы. Доза 10¹⁰ vg/мышь AAV-scFv к hCD63-hGAA снижала уровни содержания гликогена аналогично дозе 10¹¹ vg/мышь AAV-GAA.[227] As shown in Table 6, loss of Gaa caused a significant increase in mean glycogen levels in all tissues measured compared to GAA WT mice. Treatment with AAV-scFv to hCD63-hGAA at 10 ¹¹ vg/mouse reduced glycogen levels to or near WT levels in all tissues tested, unlike treatment with AAV-GAA , which provided only a partial reduction in the content of accumulated glycogen. Low doses of either virus also reduce glycogen levels, but to a lesser extent than high doses. A dose of 10 ¹⁰ vg/mouse AAV-scFv to hCD63-hGAA reduced glycogen levels similar to a dose of 10 ¹¹ vg/mouse AAV-GAA.

Таблица 6. Средний уровень содержания гликогена +/- SD, измеренный в сердце, квадрицепсе, икроножной мышце, диафрагме, камбаловидной мышце и EDLTable 6. Mean Glycogen Levels +/- SD Measured in Heart, Quadriceps, Gastrocnemius, Diaphragm, Soleus, and EDL

Без обработкиNo processing AAV-hGAAAAV-hGAA
(10(10 ¹⁰¹⁰ vg) vg) AAV-hGAAAAV-hGAA
(10(10 ^11eleven vg) vg) СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СердцеHeart 27,79827,798 3,0133,013 17,24617,246 4,3754.375 1,7701,770 2,2792,279 КвадрицепсQuadriceps 14,65014,650 1,7831,783 11,01211,012 0,5280.528 5,8785,878 3,5043,504 Икроножная мышцаCalf muscle 14,29514,295 0,4800.480 10,99010,990 0,8680.868 6,0736,073 3,0803,080 ДиафрагмаDiaphragm 15,46315,463 1,1731.173 11,44611,446 1,2371.237 3,9953.995 3,3953.395 Камбаловидная мышцаSoleus muscle 17,26017,260 2,2622,262 13,68413,684 2,5062,506 6,5336,533 5,2015.201 EDLEDL 13,58813,588 0,4980.498 11,17811,178 1,7601,760 6,2756.275 3,1593.159 AAV-scFv к hCD63-hGAAAAV-scFv to hCD63-hGAA
(10(10 ¹⁰¹⁰ vg) vg) AAV-scFv к hCD63-hGAAAAV-scFv to hCD63-hGAA
(10(10 ^11eleven vg) vg) Мыши CD63 HumIn с GAA WT (контроль)CD63 HumIn mice with GAA WT (control) СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СердцеHeart 2,1902,190 2,6782,678 0,0580.058 0,0100.010 0,0850.085 0,0070.007 КвадрицепсQuadriceps 4,4854.485 3,1473.147 0,7980.798 0,2510.251 0,4400.440 0,0420.042 Икроножная мышцаCalf muscle 5,1985,198 2,5162,516 0,8250.825 0,4610.461 0,7900.790 0,0140.014 ДиафрагмаDiaphragm 3,0833,083 2,9682,968 0,3880.388 0,1210.121 0,3850.385 0,0070.007 Камбаловидная мышцаSoleus muscle 5,2685,268 2,7862,786 1,0401,040 0,8960.896 0,5450.545 0,0490.049 EDLEDL 2,4952,495 1,7501,750 0,3130.313 0,0990.099 0,2600.260 0,1410.141

[228] Сбор квадрицепса для гистопатологического исследования и количественного определения. Образцы ткани квадрицепса от мышей из каждой группы, кроме группы, которую обрабатывали с помощью низкой дозы (1e10 vg/мышь), либо мгновенно замораживали в жидком азоте сразу после вырезания и хранили при -80°C для количественного определения экспрессии LC3b, либо помещали в блоки, содержащие среду O.C.T (Tissue-Tek, №4583).[228] Collection of quadriceps for histopathological examination and quantification . Quadriceps tissue samples from mice from each group, except the low dose treatment group (1e10 vg/mouse), were either flash frozen in liquid nitrogen immediately after excision and stored at -80°C for quantification of LC3b expression, or placed in blocks containing OCT medium (Tissue-Tek, #4583).

[229] Образцы тканей в среде O.C.T отправляли в Histoserv, Inc (Джермантуан, Мэриленд, США) для приготовления срезов и окрашивания с помощью реактива Шиффа (PAS) для обнаружения полисахаридов. Дополнительные срезы были получены и возвращены для окрашивания с целью определения центрально расположенных ядер и уровня пролиферации лизосом.[229] Tissue samples in O.C.T medium were sent to Histoserv, Inc (Germantoine, MD, USA) for sectioning and staining with PAS for detection of polysaccharides. Additional sections were obtained and returned for staining to determine centrally located nuclei and levels of lysosome proliferation.

[230] Окрашивание с помощью PAS. Окрашенные с помощью PAS срезы визуализировали с применением сканера для препаратов Leica при увеличении 20x. Полученные изображения от мышей, являющихся репрезентативными для каждой группы обработки, показаны на фиг. 8.[230] Staining with PAS . PAS-stained sections were imaged using a Leica slide scanner at 20x magnification. Acquired images from mice representative of each treatment group are shown in FIG. 8.

[231] Как показано на фиг. 8, CD63 HumIn с нокаутом GAA, которых обработали с помощью AAV-scFv к hCD63-hGAA, через 3 месяца демонстрировали заметное снижение окрашивания по сравнению как с мышами CD63 HumIn с нокаутом GAA без обработки, так и с мышами CD63 HumIn GAA, обработанными с помощью AAV-hGAA, которые показали высокий уровень окрашивания с помощью PAS. Это дополнительно указывает на то, что обработка с помощью AAV-scFv к hCD63-hGAA может снизить уровень аккумуляции полисахаридов у мышей CD63 HumIn с нокаутом GAA и может действовать таким образом одинаково на все мышечные волокна.[231] As shown in FIG. 8, CD63 HumIn GAA KO mice that were treated with AAV-scFv to hCD63-hGAA showed a marked reduction in staining after 3 months compared to both CD63 HumIn GAA KO mice without treatment and CD63 HumIn GAA mice treated with using AAV-hGAA, which showed high levels of PAS staining. This further indicates that treatment with AAV-scFv to hCD63-hGAA can reduce the level of polysaccharide accumulation in CD63 HumIn GAA knockout mice and may thus act equally on all muscle fibers.

[232] Количественное определение центральных ядер и пролиферации лизосом. Неокрашенные срезы от Histoserv извлекали из морозильной камеры и затем фиксировали с помощью 4% параформальдегида в PBS в течение 15 минут в камере для окрашивания. Фиксированные препараты затем дважды промывали по 5 минут в PBS и затем инкубировали с блокирующим буфером (eBiosciences, 00-4953-54) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем препараты либо окрашивали с помощью крысиного антитела к Lamp-1(Abcam, №AB25245) в разведении 1:50 в блокирующем буфере, с помощью кроличьего антитела к ламинину (Sigma, №L9393) в разведении 1:1000 в блокирующем буфере или с помощью блокирующего буфера без добавления антител в камере для окрашивания с высокой влажностью, а затем переносили в 4°C для инкубации в течение ночи. На следующий день препараты затем дважды промывали по 5 минут в PBS и затем окрашивали либо козьим суперклональным вторичным антителом к IgG кролика (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 647 (Life Tech Thermo, №A27040), либо козьим перекрестно-адсорбированным вторичным антитело к IgG крысы (H+L), конъюгированным с Alexa Fluor 555 (Life Tech Thermo, №A21434) в камере для окрашивания, затем оставляли для инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем окрашенные препараты дважды промывали по 5 минут в PBS, после чего их заливали средой Fluoromount-G с DAPI (Life Tech Thermo, №00-4959-52) и визуализировали с помощью прибора Zeiss LSM710 (Carl Zeiss Microscopy GmbH). Количество ядер, расположенных по центру, количественно определяли с применением программного обеспечения Halo (Indica Labs, Нью-Мексико, США), и это количество выражено в виде процента волокон, для которых показано центральное расположение ядра, +/- стандартное отклонение и показано в таблице 7. Пролиферация лизосом изображена на фигуре 8.[232] Quantification of central nuclei and lysosome proliferation . Unstained sections from Histoserv were removed from the freezer and then fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 15 minutes in the staining chamber. Fixed slides were then washed twice for 5 minutes in PBS and then incubated with blocking buffer (eBiosciences, 00-4953-54) for 1 hour at room temperature. The slides were then either stained with rat anti-Lamp-1 antibody (Abcam, #AB25245) at a 1:50 dilution in blocking buffer, with rabbit anti-laminin antibody (Sigma, #L9393) at a 1:1000 dilution in blocking buffer, or with blocking buffer without added antibody in a high-humidity staining chamber and then transferred to 4°C for overnight incubation. The next day, slides were then washed twice for 5 minutes each in PBS and then stained with either goat superclonal anti-rabbit IgG secondary antibody (H+L) conjugated to Alexa Fluor 647 (Life Tech Thermo, #A27040) or goat cross-adsorbed secondary antibody to rat IgG (H+L) conjugated to Alexa Fluor 555 (Life Tech Thermo, #A21434) in a staining chamber, then allowed to incubate for 1 hour at room temperature. Stained slides were then washed twice for 5 min each in PBS, after which they were mounted in Fluoromount-G with DAPI (Life Tech Thermo, #00-4959-52) and visualized using a Zeiss LSM710 instrument (Carl Zeiss Microscopy GmbH). The number of centrally located nuclei was quantified using Halo software (Indica Labs, New Mexico, USA), and this number is expressed as the percentage of fibers showing central nuclear location +/- standard deviation and is shown in the table 7. Lysosome proliferation is depicted in Figure 8.

Таблица 7. Количественное определение центрально расположенных ядерTable 7. Quantification of centrally located nuclei

Без обработкиNo processing AAV-hGAA (1e11vg)AAV-hGAA (1e11vg) AAV-scFv к hCD63-hGAA (1e11vg)AAV-scFv to hCD63-hGAA (1e11vg) Мыши CD63 HumIn с GAA WT (контроль)CD63 HumIn mice with GAA WT (control) СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD СреднееAverage SDSD % Волокон с центрально расположенными ядрами% Fibers with centrally located nuclei 22,0022.00 10,1010.10 33,0033.00 4,364.36 12,7512.75 6,296.29 8,508.50 7,787.78

[233] Количественное определение уровня экспрессии LC3b. Для количественного определения уровня экспрессии LC3b образцы, подвергнутые мгновенному замораживанию, размораживали, гомогенизировали и затем лизировали в буфере RIPA при соотношении 1 мг ткани к 25 мкл буфера RIPA (150 мМ NaCl, 1,0% IGEPAL® CA-630, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Tris, рН 8,0, Sigma Aldrich, R0278) с помощью соударения с шариками в течение 45 секунд (MP Biomedical). Лизаты очищали от нерастворимого материала путем центрифугирования при 21000 x g, а затем 300 мкг лизата в буфере RIPA загружали в 4-20% предварительно залитый гель Novex wedgewell, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и анализировали с помощью вестерн-блоттинга, используя протокол, аналогичный ранее описанному, для анализа уровней содержания GAA в сыворотке крови, заменяя первичное антитело к GAA на использование первичного антитела, которое распознает мышиные LC3b-I и LC3b-II (Sigma, №L7543). Затем мембрану визуализировали и осуществляли количественное определение с применением прибора LiCor Odyssey (LI-COR Biotechnology). Уровни LC3b-I и LC3b-II, выраженные в виде (среднее +/- стандартное отклонение) в произвольных единицах, показаны в таблице 8.[233] Quantification of LC3b expression levels . To quantify LC3b expression levels, snap-frozen samples were thawed, homogenized and then lysed in RIPA buffer at a ratio of 1 mg tissue to 25 μl RIPA buffer (150 mM NaCl, 1.0% IGEPAL® CA-630, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0, Sigma Aldrich, R0278) by bead impact for 45 seconds (MP Biomedical). Lysates were cleared of insoluble material by centrifugation at 21,000 x g, and then 300 μg of lysate in RIPA buffer was loaded onto a 4-20% Novex wedgewell preloaded gel, transferred to a nitrocellulose membrane, and analyzed by Western blotting using a protocol similar to that previously described. to analyze serum GAA levels by replacing the primary anti-GAA antibody by using a primary antibody that recognizes mouse LC3b-I and LC3b-II (Sigma, #L7543). The membrane was then visualized and quantified using a LiCor Odyssey instrument (LI-COR Biotechnology). Levels of LC3b-I and LC3b-II, expressed as (mean +/- standard deviation) in arbitrary units, are shown in Table 8.

[234] Как показано в таблице 8, наблюдалось значительное увеличение как средних уровней LC3b-I, так и LC3b-II у мышей с дефицитом GAA, по сравнению с мышами CD63 HumIn с GAA WT. Обработка с помощью AAV-scFv к hCD63-hGAA снизила средние уровни LC3b-I и LC3b-II в CD63 HumIn с нокаутом GAA до уровней, характерных для WT, или почти до уровней, характерных для WT. CD63 HumIn с нокаутом GAA, обработанные с помощью AAV-hGAA, демонстрировали слегка пониженные средние уровни LC3b-I и LC3b-II по сравнению с мышами CD63 HumIn с нокаутом GAA, но это снижение было не таким выраженным, как при обработке с помощью AAV-scFv к hCD63-hGAA.[234] As shown in Table 8, there was a significant increase in both mean LC3b-I and LC3b-II levels in GAA-deficient mice compared to CD63 HumIn GAA WT mice. Treatment with AAV-scFv to hCD63-hGAA reduced the average levels of LC3b-I and LC3b-II in CD63 GAA knockout HumIn to or near WT levels. CD63 HumIn GAA knockout mice treated with AAV-hGAA exhibited slightly reduced mean levels of LC3b-I and LC3b-II compared to CD63 HumIn GAA knockout mice, but this reduction was not as pronounced as that observed with AAV-hGAA treatment. scFv to hCD63-hGAA.

Таблица 8. Уровни LC3b-I и LC3b-II в квадрицепсах мышейTable 8. Levels of LC3b-I and LC3b-II in mouse quadriceps

Уровни LC3b-I (произвольные единицы)LC3b-I levels (arbitrary units) ОбработкаTreatment НеобработанныеRaw AAV-hGAAAAV-hGAA AAV-scFv к hCD63-hGAAAAV-scFv to hCD63-hGAA CD63 HumIn с GAA WT (контроль)CD63 HumIn with GAA WT (control) СреднееAverage 833833 628628 403403 282282 SDSD 109109 139139 3333 4949 Уровни LC3b-II (произвольные единицы)LC3b-II levels (arbitrary units) ОбработкаTreatment НеобработанныеRaw AAV-hGAAAAV-hGAA AAV-scFv к hCD63-hGAAAAV-scFv to hCD63-hGAA CD63 HumIn с GAA WT (контроль)CD63 HumIn with GAA WT (control) СреднееAverage 33083308 28882888 445445 369369 SDSD 582582 12821282 398398 3333

Пример 6. Обработка с помощью AAV, содержащего фрагмент, связывающий hCD63::GAA, приводит к значительным улучшениям в тестах мышечной силы и координацииExample 6 Treatment with AAV Containing the hCD63::GAA Binding Moiety Leads to Significant Improvements in Tests of Muscle Strength and Coordination

[235] Сила захвата и эффективность выполнения теста с вращающимся барабаном у мышей, обработанных (см. выше) с помощью либо AAV-LSP-hGAA, либо AAV-LSP-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA. Измерения при ускорении вращающегося барабана (фиг. 9A) и измерения силы захвата передних конечностей (фиг. 9B) у мышей с GAA дикого типа, необработанного контроля, при обработке с помощью AAV-LSP-hGAA (1e11vg/мышь) или AAV-LSP-фрагмент, связывающий hCD63::hGAA (1e11vg/мышь) проводились с месячными интервалами в течение 6 месяцев. Планки погрешностей представляют собой +/- SD. N=8-10 для всех групп.[235] Grip strength and rotating drum test performance in mice treated (above) with either AAV-LSP-hGAA or AAV-LSP hCD63::hGAA binding fragment. Rotating drum acceleration measurements (Figure 9A) and forelimb grip strength measurements (Figure 9B) in wild-type GAA mice, untreated control, when treated with AAV-LSP-hGAA (1e11vg/mouse) or AAV-LSP- hCD63::hGAA binding fragment (1e11vg/mouse) were performed at monthly intervals for 6 months. Error bars represent +/- SD. N=8-10 for all groups.

Пример 7. Другие мембранные белки в качестве «направляющих», которые направляют GAA в тканиExample 7: Other Membrane Proteins as "Guides" That Direct GAA into Tissues

[236] Протестировали другие мембранные белки, такие как слитые белки на основе фрагмента, связывающего ITGA7 (интегрин альфа-7) в отношении направления GAA в ткани для замещения GAA у мышей с дефицитом ферментов. Мышиные миобласты C2C12 инкубировали в течение ночи с комплексом фрагмента, связывающего mCD63, и GAA, или комплексом фрагмента, связывающего ITGA7, и GAA, с или без 5 мМ M6P. Динамику содержания активного фермента GAA в лизатах миобластов выявляли в случае обоих слитых белков (фиг. 10А). В дальнейших экспериментах мышам с нокаутом GAA, гуманизированным по CD63 (GAA-/-; CD63hu/hu), вводили плазмиды, кодирующие фрагмент, связывающий hCD63::GAA в формате scFv::GAA или фрагмент, связывающий интегрин альфа-7, в формате полноразмерный IgG4::GAA путем гидродинамической доставки (HDD), и мышей умерщвляли через 3 недели после HDD. Уровни содержания гликогена в тканях измеряли в сердце, квадрицепсе, икроножной мышце и диафрагме. Необработанных контрольных мышей GAA^-/- xCD63hu/hu и необработанных контрольных мышей дикого типа GAA+/+; CD63hu/hu (4) также тестировали в тех же условиях. Уровни содержания гликогена были на очень низком уровне как у мышей, обработанных с помощью комплекса фрагмент, связывающий hCD63::GAA, так и у мышей, обработанных с помощью комплекса фрагмент, связывающий ITGA7::GAA, как у мышей дикого типа. См. фигуру 10B. [236] Other membrane proteins, such as ITGA7 (integrin alpha-7) binding fragment fusion proteins, have been tested to target GAA to tissues to replace GAA in enzyme-deficient mice. Murine C2C12 myoblasts were incubated overnight with mCD63-binding fragment complex and GAA, or ITGA7-binding fragment complex and GAA, with or without 5 mM M6P. The dynamics of the content of active GAA enzyme in myoblast lysates was detected in the case of both fusion proteins (Fig. 10A). In further experiments, CD63 humanized GAA knockout mice (GAA-/-; CD63hu/hu) were injected with plasmids encoding the hCD63::GAA binding fragment in the scFv::GAA format or the alpha-7 integrin binding fragment in the full-length IgG4::GAA by hydrodynamic delivery (HDD), and mice were sacrificed 3 weeks after HDD. Tissue glycogen levels were measured in the heart, quadriceps, gastrocnemius, and diaphragm. Untreated control GAA ^−/− xCD63hu/hu mice and untreated wild-type control GAA +/+ mice; CD63hu/hu (4) was also tested under the same conditions. Glycogen levels were very low in both mice treated with the hCD63::GAA fragment-binding complex and in mice treated with the ITGA7::GAA fragment-binding complex, similar to wild-type mice. See Figure 10B.

Пример 8. При сопоставимых уровнях содержания в сыворотке крови обработка с помощью AAV-фрагмент, связывающий CD63::GAA является более эффективной, чем конструкция AAV с оптимизированным GAAExample 8: At comparable serum levels, treatment with the CD63::GAA-binding AAV fragment is more effective than the GAA-optimized AAV construct

[237] Мыши CD63 HumIn с нокаутом GAA (GAA^-/- x CD63^hu/hu), инфицированные с помощью AAV, содержащих специфический для печени энхансер (серпина 1; SEQ ID NO:9) и специфический для печени промотор (LSP; TTR; SEQ ID NO:8), управляющие экспрессией мультидоменного терапевтического средства на основе комплекса фрагмент, связывающий hCD63::GAA (SEQ ID NO:10), в котором используется сигнальный пептид химотрипсиноген B2 (SP7) и содержатся аминокислоты 36-952 GAA человека (Δ8GAA; SEQ ID NO:78), показали значительный прирост в тестах мышечной силы и координации. Вводили три разные дозы каждого вируса: 5e11vg/кг, 2e12vg/кг и 4e12vg/кг. Сыворотку собирали путем вызывания подчелюстного кровотечения на регулярной основе. Через месяц после инфицирования с помощью AAV мышей умерщвляли. Образцы ткани сердечной и скелетной мышцы собирали и мгновенно замораживали в жидком азоте и поддерживали при -80°C для хранения. Уровень содержания гликогена в тканях измеряли путем гомогенизации тканей с помощью соударения с шариками в дистиллированной воде. Образцы кипятили и центрифугировали, а супернатанты использовали в коммерческом наборе для анализа гликогена. В случае сыворотки количественное определение осуществляли с применением вестерн-блоттинга с антителом к GAA человека, как описано в предыдущих примерах. Для каждой мыши строили график зависимости уровня содержания гликогена в каждой ткани и уровня содержания конструкции в сыворотке крови через 1 месяц. Для определения EC50 для двух средств обработки в каждой ткани применяли аппроксимацию кривой по 4 параметрам.[237] CD63 HumIn GAA knockout mice (GAA ^-/- x CD63 ^hu/hu ) infected with AAV containing a liver-specific enhancer (serpin 1; SEQ ID NO:9) and a liver-specific promoter (LSP; TTR ; SEQ ID NO:8), driving the expression of a multidomain therapeutic based on the hCD63::GAA binding fragment complex (SEQ ID NO:10), which uses the chymotrypsinogen B2 (SP7) signal peptide and contains amino acids 36-952 of human GAA ( Δ8GAA; SEQ ID NO:78) showed significant gains in tests of muscle strength and coordination. Three different doses of each virus were administered: 5e11vg/kg, 2e12vg/kg and 4e12vg/kg. Serum was collected by inducing submandibular bleeding on a regular basis. One month after infection with AAV, mice were sacrificed. Cardiac and skeletal muscle tissue samples were collected and flash frozen in liquid nitrogen and maintained at -80°C for storage. Tissue glycogen levels were measured by homogenizing the tissues using bead impingement in distilled water. Samples were boiled and centrifuged, and the supernatants were used in a commercial glycogen assay kit. For serum, quantification was performed using Western blotting with anti-human GAA antibody as described in the previous examples. For each mouse, a graph was plotted between the level of glycogen content in each tissue and the level of the construct in the blood serum after 1 month. 4-parameter curve fitting was used to determine the EC50 for the two treatments in each tissue.

[238] Инфицирование с помощью AAV, содержащих специфический для печени промотор (LSP), кодирующий либо комплекс фрагмент, связывающий hCD63::GAA, либо sp7-Δ8GAA, обеспечивало сопоставимые уровни содержания GAA в сыворотке крови при каждой инфицирующей дозе. Фигура 11. Тем не менее, в каждой анализируемой мышечной ткани при применении комплекса фрагмент, связывающий hCD63::GAA, в отличии от sp7-Δ8GAA, наблюдалось снижение EC50 в ~2,2 раза, демонстрируя, что при эквивалентных уровнях содержания в сыворотке крови комплекс фрагмент, связывающий CD63::GAA более эффективно удаляет гликоген, чем модифицированная конструкция для экспрессии GAA, которая не слита с антителом. См. фигуру 12 и таблицу 9. [238] Infection with AAVs containing a liver-specific promoter (LSP) encoding either the hCD63::GAA binding fragment complex or sp7-Δ8GAA produced comparable serum GAA levels at each infectious dose. Figure 11 . However, in every muscle tissue analyzed, the hCD63::GAA binding fragment complex, as opposed to sp7-Δ8GAA, exhibited a ~2.2-fold reduction in EC50, demonstrating that at equivalent serum levels, the fragment complex binding CD63::GAA is more efficient at removing glycogen than a modified GAA expression construct that is not fused to the antibody. See figure 12 and table 9.

Таблица 9. ECTable 9.EC ₅₀₅₀ (95% доверительный интервал) для AAV-фрагмент, связывающий hCD63::GAA и AAV-sp7-Δ8GAA (95% confidence interval) for AAV fragment binding hCD63::GAA and AAV-sp7-Δ8GAA в сердце, диафрагме, квадрицепсе и трицепсеin the heart, diaphragm, quadriceps and triceps

ТканьTextile КонструкцияDesign ЕС ₅₀ для клиренса гликогена (произвольные единицы) EC ₅₀ for glycogen clearance (arbitrary units) 95% доверительный интервал для EC95% confidence interval for EC ₅₀₅₀ СердцеHeart sp7-Δ8GAA sp7-Δ8GAA 0,038 0.038 0,00036-0,0640.00036-0.064 Фрагмент, связывающий hCD63::GAAhCD63::GAA binding fragment 0,017 0.017 0,0061-0,0290.0061-0.029 ДиафрагмаDiaphragm sp7-Δ8GAA sp7-Δ8GAA 0,1350.135 широкийwide Фрагмент, связывающий hCD63::GAAhCD63::GAA binding fragment 0,057 0.057 0,034-0,0800.034-0.080 КвадрицепсQuadriceps sp7-Δ8GAA sp7-Δ8GAA 0,187 0.187 0,14-0,310.14-0.31 Фрагмент, связывающий hCD63::GAAhCD63::GAA binding fragment 0,0800.080 широкийwide ТрицепсTriceps sp7-Δ8GAA sp7-Δ8GAA 0,19 0.19 0,13-0,410.13-0.41 Фрагмент, связывающий hCD63::GAAhCD63::GAA binding fragment 0,083 0.083 0,069-0,110.069-0.11

Пример 9. Иллюстративные антитела к CD63Example 9 Exemplary Anti-CD63 Antibodies

[239] Получение антител к CD63 человека [239] Production of antibodies to human CD63

[240] Антитела к CD63 человека были получены путем иммунизации мыши (например, сконструированной мыши, содержащей ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека) с помощью CD63 человека.[240] Antibodies to human CD63 were generated by immunizing a mouse (eg, an engineered mouse containing DNA encoding the variable regions of human immunoglobulin heavy chain and kappa light chain) with human CD63.

[241] После иммунизации спленоциты собирали у каждой мыши и (1) проводили слияние с клетками миеломы мыши для сохранения их жизнеспособности и формирования клеток гибридомы и проводили скрининг на специфичность к CD63 человека или (2) отсортировали В-клетки (как описано в US 2007/0280945A1) с помощью фрагмента CD63 человека в качестве сортирующего реагента, который связывает реактивные антитела и обеспечивает их идентификацию (антиген-позитивные В-клетки).[241] Following immunization, splenocytes were collected from each mouse and (1) fused with mouse myeloma cells to maintain viability and form hybridoma cells and screened for specificity to human CD63 or (2) B cells sorted (as described in US 2007 /0280945A1) using a fragment of human CD63 as a sorting reagent that binds reactive antibodies and ensures their identification (antigen-positive B cells).

[242] Химерные антитела к CD63 человека были первоначально выделены с вариабельной областью человека и константной областью мыши с применением, например, технологии VELOCIMMUNE, как описано в патенте США № 7105348; патенте США № 8642835; и патенте США 9622459, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки.[242] Chimeric antibodies to human CD63 were initially isolated with a human variable region and a mouse constant region using, for example, VELOCIMMUNE technology, as described in US patent No. 7105348; US Patent No. 8642835; and US Pat. No. 9,622,459, each of which is incorporated herein by reference.

[243] В некоторых антителах в целях тестирования константные области мыши заменяли необходимой константной областью человека, например СН человека дикого типа или модифицированным СН человека (например, изотипов IgG1, IgG2 или IgG4), и константной областью легкой цепи (CL) для получения полностью человеческого фрагмента, связывающего hCD63, включая полностью человеческое биспецифическое антитело, предусматривающее антитело к hCD63 или его антигенсвязывающую часть. Хотя выбранная константная область может варьировать в зависимости от конкретного применения, свойства, представляющие собой высокую аффинность связывания с антигеном или специфичность к мишеням, характерны для вариабельной области.[243] In some antibodies, mouse constant regions have been replaced for testing purposes with the desired human constant region, such as wild-type human CH or modified human CH (e.g. , IgG1, IgG2, or IgG4 isotypes), and a light chain constant region (CL) to produce a fully human an hCD63 binding fragment, including a fully human bispecific antibody comprising an anti-hCD63 antibody or an antigen-binding portion thereof. Although the selected constant region may vary depending on the particular application, properties such as high antigen binding affinity or target specificity are characteristic of the variable region.

[244] Некоторые биологические свойства иллюстративных биспецифических антител, содержащих связывающее плечо антитела к CD63 человека, полученных в соответствии со способами из данного примера, подробно описаны в представленных ниже примерах.[244] Certain biological properties of exemplary bispecific antibodies containing the binding arm of an anti-human CD63 antibody produced in accordance with the methods of this example are described in detail in the examples below.

[245] Последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антител к CD63 [245] Amino acid and nucleic acid sequences of the variable regions of the heavy and light chains of antibodies to CD63

[246] В таблице 10 приведены идентификаторы кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты (NA), а в скобках представлена сама аминокислотная (AA) последовательность вариабельной области тяжелой или легкой цепи (HCVR или LCVR соответственно) или CDR тяжелой или легкой цепи (HCDR и LCDR соответственно) выбранных антител к CD63, которые применяли для получения мультидоменных терапевтических белков, содержащих фрагмент, связывающий CD63::GAA, описанных в данном документе.[246] Table 10 shows the nucleic acid (NA) coding sequence identifiers, and in parentheses the amino acid (AA) sequence of the heavy or light chain variable region (HCVR or LCVR, respectively) or the heavy or light chain CDR (HCDR and LCDR, respectively) is presented. selected anti-CD63 antibodies that were used to produce the multidomain therapeutic proteins containing the CD63::GAA binding moiety described herein.

Таблица 10. Идентификаторы последовательности фрагмента, связывающего CD63Table 10. CD63 binding fragment sequence identifiers

SEQ ID NO:SEQ ID NO: Обозначение антителаAntibody designation HCVR
NA
(AA)HCVR
N.A.
(AA) HCDR1
NA
(AA)HCDR1
N.A.
(AA) HCDR2
NA
(AA)HCDR2
N.A.
(AA) HCDR3
NA
(AA)HCDR3
N.A.
(AA) LCVR
NA
(AA)LCVR
N.A.
(AA) LCDR1
NA
(AA)LCDR1
N.A.
(AA) LCDR2
NA
(AA)LCDR2
N.A.
(AA) LCDR3
NA
(AA)LCDR3
N.A.
(AA) H1M12451NH1M12451N 13
(14)13
(14) 15
(16)15
(16) 17
(18)17
(18) 19
(20)19
(20) 21
(22)21
(22) 23
(24)23
(24) 25
(26)25
(26) 27
(28)27
(28) H2M12395NH2M12395N 29
(30)29
(thirty) 31
(32)31
(32) 33
(34)33
(34) 35
(36)35
(36) 37
(38)37
(38) 39
(40)39
(40) 41
(42)41
(42) 43
(44)43
(44) H4H12450NH4H12450N 45
(46)45
(46) 47
(48)47
(48) 49
(50)49
(50) 51
(52)51
(52) 53
(54)53
(54) 55
(56)55
(56) 57
(58)57
(58) 59
(60)59
(60) H2M12450NH2M12450N 61
(62)61
(62) 63
(64)63
(64) 65
(66)65
(66) 67
(68)67
(68) 69
(70)69
(70) 71
(72)71
(72) 73
(74)73
(74) 74
(76)74
(76)

[247] Связывание с помощью родительских антител к CD63 человека [247] Binding by parental anti-human CD63 antibodies

[248] Относительный уровень связывания с клеточной поверхностью в случае связывания антител к CD63 с клетками, экспрессирующими CD63 человека, оценивали с помощью проточной цитометрии с применением CD63-положительных клеток HEK293 (ATCC, № по кат. CRL-1573), которые эндогенно экспрессируют CD63 человека, и CD63-отрицательных клеток с нокаутом HEK293/CD63. Для анализа клетки высевали в PBS без кальция и магния (VWR, № по кат. 45000-446), содержащий 2% FBS (Saradigm № по кат. 1500-500) (окрашивающий буфер) в 96-луночные планшеты с V-образным дном (Axygen Scientific, № по кат. P-96-450-VCS). Затем клетки инкубировали с антителами к CD63 или антителами изотипического контроля в концентрациях от 100 нМ до 1,7 пМ в течение 30 минут на льду. Лунки, не содержащие антител, применяли в качестве контроля. Клетки HEK293/клетки с нокаутом CD63 окрашивались только с помощью наиболее высокой концентрации (100 нМ) антител. Затем клетки один раз промывали с помощью окрашивающего буфера и инкубировали с вторичным антителом к Fc мыши, конъюгированным с PE (Jackson ImmunoResearch, № по кат. 115-115-164) при 100 нМ в течение 30 минут при 4°C. Затем клетки промывали и фиксировали с применением 50% раствора Cytofix (BD Biosciences, № по кат. 554655), разведенного в PBS. Образцы загружали в проточный цитометр Intellicyte Hypercyt, и результаты анализировали в программном обеспечении ForeCyt (Intellicyte) для расчета средней интенсивности флуоресценции (MFI). Измеренные значения анализировали с применением четырех-параметрического логистического уравнения по 12-точечной кривой ответа с применением GraphPad Prism, и были получены результирующие значения EC₅₀ (таблица 11). Отношение сигнал/шум (S/N) определяли путем расчета отношения MFI антител к CD63 или контрольных антител к MFI лунок, не содержащих антител (таблица 11).[248] The relative level of cell surface binding of anti-CD63 antibodies to human CD63-expressing cells was assessed by flow cytometry using CD63-positive HEK293 cells (ATCC, cat. no. CRL-1573), which endogenously express CD63 human and CD63-negative HEK293/CD63 knockout cells. For analysis, cells were seeded in PBS without calcium and magnesium (VWR, cat. no. 45000-446) containing 2% FBS (Saradigm cat. no. 1500-500) (staining buffer) in 96-well V-bottom plates (Axygen Scientific, Cat. No. P-96-450-VCS). Cells were then incubated with anti-CD63 antibodies or isotype control antibodies at concentrations ranging from 100 nM to 1.7 pM for 30 minutes on ice. Wells containing no antibodies were used as controls. HEK293/CD63 knockout cells were stained only with the highest concentration (100 nM) of antibody. Cells were then washed once with staining buffer and incubated with PE-conjugated anti-mouse Fc secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, cat. no. 115-115-164) at 100 nM for 30 minutes at 4°C. Cells were then washed and fixed using 50% Cytofix (BD Biosciences, cat. no. 554655) diluted in PBS. Samples were loaded into an Intellicyte Hypercyt flow cytometer and the results were analyzed in ForeCyt software (Intellicyte) to calculate mean fluorescence intensity (MFI). The measured values were analyzed using a four-parameter logistic equation with a 12-point response curve using GraphPad Prism, and the resulting EC ₅₀ values were obtained (Table 11). The signal-to-noise ratio (S/N) was determined by calculating the ratio of the MFI of anti-CD63 antibodies or control antibodies to the MFI of wells containing no antibodies (Table 11).

[249] Как показано в таблице 11, три антитела из антител к CD63 по настоящему изобретению продемонстрировали связывание с клетками HEK293 со значениями S/N в диапазоне от 21,0 до 31,6 и значениями EC₅₀ в диапазоне от 0,5 нМ до 1,9 нМ. Несвязывающиеся контроли не демонстрировали связывания с клетками HEK293 (S/N ≤ 1,5). Как антитела к CD63, так и антитела изотипического контроля, демонстрировали слабое или незначительное связывание с клетками HEK293/клетками с нокаутом CD63 (S/N ≤ 4,4).[249] As shown in Table 11, three antibodies of the anti-CD63 antibodies of the present invention demonstrated binding to HEK293 cells with S/N values ranging from 21.0 to 31.6 and EC ₅₀ values ranging from 0.5 nM to 1.9 nM. Non-binding controls showed no binding to HEK293 cells (S/N ≤ 1.5). Both anti-CD63 and isotype control antibodies showed weak or negligible binding to HEK293/CD63 knockout cells (S/N ≤ 4.4).

Таблица 11. Связывание антител к CD63 с клетками HEK293 и с клетками HEK293 с нокаутом CD63 по данным проточной цитометрииTable 11. Binding of anti-CD63 antibodies to HEK293 cells and to HEK293 CD63 knockout cells by flow cytometry

АнтителоAntibody ECE.C. ₅₀₅₀ HEK293 HEK293
(нМ)(nM) HEK293HEK293
(S/N)(S/N) HEK293 с нокаутом CD63 (S/N)HEK293 CD63 knockout (S/N) H2M12450NH2M12450N 0,50.5 26,726.7 2,92.9 H1M12451NH1M12451N 1,81.8 31,631.6 4,14.1 H2M12395NH2M12395N 1,91.9 21,021.0 2,92.9 Изотипический контроль 1Isotype control 1 NDND 1,41.4 4,44.4 Изотипический контроль 2Isotype control 2 NDND 1,51.5 1,61.6

ND = не определеноND = not defined

[250] Способность моноклональных антител к CD63 по настоящему изобретению связываться с клетками, экспрессирующими CD63 человека, также определяли с применением анализа с обнаружением на основе электрохемилюминесценции (ECL).[250] The ability of the anti-CD63 monoclonal antibodies of the present invention to bind to cells expressing human CD63 was also determined using an electrochemiluminescence (ECL) detection assay.

[251] Для получения сверхэкспрессирующих клеток мышиные эмбриональные фибробластные клетки NIH3T3 (ATCC, № по кат. CRL-1658) трансфицировали с образованием линии клеток «NIH3T3/hCD63», которая стабильно экспрессирует CD63 человека (hCD63; аминокислоты M1-M238 с учетным номером NP_001771; SEQ ID №:77). Были проанализированы уровни экспрессии CD63 человека в эндогенно экспрессирующих клетках, человеческой линии клеток аденокарциномы простаты, чувствительной к андрогенам, LNCAP (ATCC, № по кат. CRL-1740), и линии клеток первичной глиобластомы человека, U87MG (ATCC, № по кат. HTB-14), с помощью Quantum™ Alexa Fluor® 647 MESF (Bangs Laboratories, № по кат. 647B) и антитела к IgG мыши Simply Cellular® (Bangs Laboratories Inc, № по кат. 815) в соответствии с инструкциями производителя. Было установлено, что клетки LNCAP содержат меньшее количество копий CD63 человека, чем клетки U87MG. Нетрансфицированные клетки NIH3T3, у которых нет детектируемой путем сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) экспрессии CD63 человека, были включены в качестве отрицательного контроля.[251] To generate overexpressing cells, NIH3T3 mouse embryonic fibroblast cells (ATCC, cat. no. CRL-1658) were transfected to generate the “NIH3T3/hCD63” cell line, which stably expresses human CD63 (hCD63; amino acids M1-M238 with accession no. NP_001771 ;SEQ ID NO:77). Expression levels of human CD63 were analyzed in endogenously expressing cells, the human androgen-sensitive prostate adenocarcinoma cell line, LNCAP (ATCC, cat. no. CRL-1740), and the primary human glioblastoma cell line, U87MG (ATCC, cat. no. HTB -14), using Quantum™ Alexa Fluor® 647 MESF (Bangs Laboratories, cat. no. 647B) and Simply Cellular® anti-mouse IgG antibody (Bangs Laboratories Inc, cat. no. 815) according to the manufacturer's instructions. LNCAP cells were found to contain fewer copies of human CD63 than U87MG cells. Untransfected NIH3T3 cells, which lack detectable fluorescence-activated cell sorting (FACS) expression of human CD63, were included as a negative control.

[252] Вкратце, клеточные линии промывали один раз в буфере PBS без Ca²⁺/Mg²⁺ и инкубировали в течение 10 минут при 37°C с раствором для диссоциации клеток, не содержащим ферментов (Millipore, № по кат. S-004-C), чтобы отделить клетки. Затем клетки один раз промывали с помощью PBS с Ca ²⁺/Mg²⁺ и подсчитывали с помощью счетчика клеток Cellometer^™ Auto T4 (Nexcelom Bioscience, LLC). Приблизительно 2,0×10⁴ клеток NIH3T3/hCD63, LNCAP, U87MG или NIH3T3 высевали отдельно на 96-луночные планшеты с угольными электродами (Meso Scale Discovery, № по кат. L15XB-6) и затем инкубировали в течение одного часа при 37^°C. Сайты неспецифического связывания блокировали с помощью 2% BSA (вес/объем) в PBS с Ca²⁺/Mg²⁺ в течение одного часа при комнатной температуре (к. т.). Растворы, содержащие антитела к CD63 или антитела изотипического контроля в диапазоне концентраций (от 1,7 пМ до 100 нМ) в 0,5% BSA (вес/объем) в PBS с Ca²⁺/Mg²⁺, а также отдельно контрольный буфер добавляли затем в двух повторностях к связанным с планшетами клеткам NIH3T3/hCD63, LNCAP, U87MG или NIH3T3 и инкубировали в течение одного часа при к. т. Затем планшеты промывали для удаления несвязанных антител с применением устройства для промывания планшетов AquaMax2000 с головкой для отмывания клеток (MDS Analytical Technologies). Связанные с планшетами антитела определяли с применением 1 μг/мл либо козьего поликлонального антитела к IgG человека, специфического к фрагменту Fcγ, конъюгированного с SULFO-TAG^™(Jackson Immunoresearch, № по кат. 109-005-098), либо козьего поликлонального антитела к IgG мыши, специфического к фрагменту Fcγ (Jackson Immunoresearch, № по кат. 115-005-164), конъюгированного с SULFO-TAG^™, в течение одного часа при к. т. Планшеты промывали и затем инкубировали с буфером для считывания (MSD, № по кат. R92TD-2) в соответствии с инструкциями производителя. Люминесцентные сигналы измеряли с применением устройства для визуализации SECTOR (MSD). Интенсивность люминесценции, измеренную в относительных световых единицах (RLU), регистрировали, чтобы установить интенсивность связывания каждого антитела в диапазоне тестируемых концентраций. Соотношение сигнала, обнаруженного при связывании 3,7 нМ антитела с клетками, экспрессирующими CD63 человека, и такового для той же концентрации антитела, связывающегося с отрицательными клетками, было принято в качестве показателя специфичности связывания с CD63. Антитела с соотношением значений связывания более 3 классифицировали как специфические связывающие средства, а антитела с соотношением значений связывания, меньшим или равным 3, классифицировали как несвязывающие и отмечали как NB в таблице 12. Кроме того, сигналы прямого связывания (в RLU) анализировали в зависимости от концентрации антитела, и данные аппроксимировали по сигмоидальной (четырех-параметрической логистической) модели доза-ответ с применением программного обеспечения GraphPad Prism™. Значение ЕС₅₀ для связывания с клетками, экспрессирующими CD63 человека, определенное как концентрация антитела, при которой обнаруживается 50% максимального сигнала связывания, было определено для установления активности каждого антитела и представлено в таблице 12 только для конкретных связывающих средств.[252] Briefly, cell lines were washed once in PBS buffer without Ca ²⁺ /Mg ²⁺ and incubated for 10 minutes at 37°C with enzyme-free cell dissociation solution (Millipore, cat. no. S-004 -C) to separate the cells. Cells were then washed once with PBS with Ca ²⁺ /Mg ²⁺ and counted using a Cellometer ^™ Auto T4 cell counter (Nexcelom Bioscience, LLC). Approximately 2.0 x 10 ⁴ NIH3T3/hCD63, LNCAP, U87MG, or NIH3T3 cells were individually seeded onto 96-well carbon electrode plates (Meso Scale Discovery, cat. no. L15XB-6) and then incubated for one hour at 37 ^° C. Nonspecific binding sites were blocked with 2% BSA (w/v) in PBS with Ca ²⁺ /Mg ²⁺ for one hour at room temperature (RT). Solutions containing anti-CD63 antibodies or isotype control antibodies in a concentration range (1.7 pM to 100 nM) in 0.5% BSA (w/v) in PBS with Ca ²⁺ /Mg ²⁺ , as well as a separate control buffer were then added in duplicate to plate-bound NIH3T3/hCD63, LNCAP, U87MG, or NIH3T3 cells and incubated for one hour at RT. The plates were then washed to remove unbound antibodies using an AquaMax2000 plate washer with a cell wash head ( MDS Analytical Technologies). Plate-bound antibodies were detected using 1 μg/ml of either a goat polyclonal anti-human IgG antibody specific for the Fcγ fragment conjugated to SULFO-TAG ^™ (Jackson Immunoresearch, cat. no. 109-005-098) or a goat polyclonal antibody against Fcγ fragment-specific mouse IgG (Jackson Immunoresearch, cat. no. 115-005-164) conjugated to SULFO-TAG ^™ for one hour at RT. Plates were washed and then incubated with reading buffer (MSD, Cat. No. R92TD-2) in accordance with the manufacturer's instructions. Luminescent signals were measured using a SECTOR Imaging Device (MSD). Luminescence intensity, measured in relative light units (RLU), was recorded to establish the binding intensity of each antibody over the range of concentrations tested. The ratio of the signal detected when 3.7 nM antibody binds to cells expressing human CD63 and that for the same concentration of antibody binding to negative cells was taken as an indicator of the specificity of CD63 binding. Antibodies with a binding value ratio greater than 3 were classified as specific binders, and antibodies with a binding value ratio less than or equal to 3 were classified as non-binding and noted as NB in Table 12. In addition, direct binding signals (in RLU) were analyzed depending on antibody concentrations, and data were fitted to a sigmoidal (four-parameter logistic) dose-response model using GraphPad Prism™ software. The EC ₅₀ value for binding to cells expressing human CD63, defined as the concentration of antibody at which 50% of the maximum binding signal is detected, was determined to establish the activity of each antibody and is presented in Table 12 for specific binders only.

[253] Как показано в таблице 12, четыре антитела к CD63, полученные, как описано в примере 9, и Ab-компаратор (компаратор 1), специфически связывались с CD63 человека, экспрессируемым на сконструированных клетках NIH3T3/hCD63, а также эндогенно экспрессируемым на линиях клеток LNCAP и U87MG. Четыре антитела к CD63, описанные в примере 9, связывались с клетками NIH3T3/hCD63 со значениями EC₅₀ в диапазоне от 280 пМ до 970 пМ и соотношением значений связывания относительно отрицательной линии клеток в диапазоне от 91 до 281 раз. Четыре антитела к CD63 по настоящему изобретению связывались с клетками U87MG со значениями ЕС₅₀ в диапазоне от 500 пМ до 1,4 нМ и соотношением значений связывания относительно отрицательной линии клеток в диапазоне от 52 до 272 раз. Четыре антитела к CD63, полученные, как описано в примере 9, связывались с клетками LNCAP со значениями EC₅₀ в диапазоне от 210 пМ до 1,7 нМ и соотношением значений связывания относительно отрицательной линии клеток в диапазоне от 7 до 20 раз. Более низкие отношения значений связывания для клеток LNCAP согласуются с более низким числом копий CD63 на этих клетках по сравнению с клетками U87MG. Как и ожидалось, антитела изотипического контроля являлись несвязывающими и для них соотношение значений связывания с клетками составляло 3 или меньше.[253] As shown in Table 12, four anti-CD63 antibodies prepared as described in Example 9 and an Ab comparator (comparator 1) specifically bound to human CD63 expressed on engineered NIH3T3/hCD63 cells as well as endogenously expressed on LNCAP and U87MG cell lines. The four anti-CD63 antibodies described in Example 9 bound to NIH3T3/hCD63 cells with EC ₅₀ values ranging from 280 pM to 970 pM and binding ratios relative to the negative cell line ranging from 91 to 281 times. The four anti-CD63 antibodies of the present invention bound to U87MG cells with EC ₅₀ values ranging from 500 pM to 1.4 nM and ratios of binding values relative to the negative cell line ranging from 52 to 272 times. Four anti-CD63 antibodies prepared as described in Example 9 bound to LNCAP cells with EC ₅₀ values ranging from 210 pM to 1.7 nM and binding ratios relative to the negative cell line ranging from 7 to 20 times. The lower binding value ratios for LNCAP cells are consistent with the lower CD63 copy number on these cells compared to U87MG cells. As expected, the isotype control antibodies were non-binding and had a cell binding ratio of 3 or less.

Таблица 12. Связывание антител к CD63 с клетками, экспрессирующими CD63 человека, измеренное с помощью электрохемилюминесцентного обнаруженияTable 12. Binding of anti-CD63 antibodies to cells expressing human CD63 measured by electrochemiluminescence detection

АнтителоAntibody Эффективность связывания с клеткой, ECCell binding efficiency, EC ₅₀₅₀ (M) (M) Соотношение сигнала связывания клеток (RLU) для клеток с CD63 человека относительно отрицательных клеток NIH3T3. при концентрации Ab 3,7 нМRatio of cell binding signal (RLU) for human CD63 cells relative to NIH3T3 negative cells. at Ab concentration 3.7 nM NIH3T3/hCD63NIH3T3/hCD63 U87MGU87MG LNCAPLNCAP NIH3T3/hCD63NIH3T3/hCD63 U87MGU87MG LNCAPLNCAP H1M12451NH1M12451N 5,7E-105.7E-10 9,5E-109.5E-10 1,7E-091.7E-09 9191 5252 77 H2M12395NH2M12395N 2,9E-102.9E-10 7,9E-107.9E-10 3,5E-103.5E-10 256256 171171 1818 H4H12450NH4H12450N 9,7E-109.7E-10 1,4E-091.4E-09 1,4E-091.4E-09 281281 272272 2020 H2M12450NH2M12450N 2,8E-102.8E-10 5,0E-105.0E-10 2,1E-102.1E-10 230230 175175 2020 КОНТРОЛИCONTROLS Ab-компаратор 1Ab comparator 1 5,7E-105.7E-10 6,7E-106.7E-10 2,0E-092.0E-09 253253 271271 1616 Изотипический контроль IgG4 человекаHuman IgG4 isotype control NBN.B. NBN.B. NBN.B. 11 11 11 Изотипический контроль IgG2 мышиMouse IgG2 isotype control NBN.B. NBN.B. NBN.B. 33 22 22

NB - несвязывающий; антитела с соотношением значений связывания меньшим или равным 3 были классифицированы как несвязывающие.NB - non-binding; antibodies with binding ratios less than or equal to 3 were classified as nonbinding.

[254] Цитотоксичность, опосредованная родительскими антителами к CD63 человека [254] Cytotoxicity mediated by parental anti-human CD63 antibodies

[255] Чтобы оценить способность антитела к CD63, описанного в данном документе, интернализоваться в экспрессирующих CD63 клетках, был проведен непрямой анализ цитотоксичности in vitro. Человеческие CD63-позитивные клетки T47D (ATCC, № по кат. HTB-133) и человеческие CD63-отрицательные клетки NIH3T3 (ATCC, № по кат. CRL-1658) соответственно высевали в покрытые с помощью PDL 96-луночные планшеты (BD Biocoat, № по кат. 356461) при либо 6000 клеток на лунку в RPMI (Irvine Scientific, № по кат. 9160), содержащем 10% FBS (ATCC, № по кат. 30-2020), пенициллин/стрептомицин/L-глутамин (Gibco, № по кат. 10378-016), 50 мкМ бета-меркаптоэтанола ( Sigma, № по кат. M7522) (питательная среда), пируват натрия 100 мМ (Millipore, № по кат. TMS-005-C), HEPES 1M (Irvine Scientific, № по кат. 9319) и бычий инсулин 10 мкг/мл (Gemini BioProducts, № по кат. 700-912P), либо 2000 клеток на лунку в DME с высоким содержанием глюкозы (Irvine Scientific, № по кат. 9033), 10% телячьей сыворотки (Hyclone, № по кат. SH30072.03), а также пенициллин/стрептомицин/L-глутамин (Gibco, № по кат. 10378-016), и выращивали в течение ночи при 37°С в 5% СО₂. Для получения кривых жизнеспособности клеток клетки инкубировали в течение 5 минут при 37°С с серийно разведенным антителом к CD63 (H2M12450N) или несвязывающим антителом изотипического контроля в концентрациях от 3,0 пМ до 2,2 нМ. Вторичное антитело, представляющее собой Fab к mFc, конъюгированное с цитотоксической нагрузкой MMAF (Moradec, № по кат. AM-201AF-50), затем добавляли при 20 нМ в каждую лунку. Отдельно среда служила отрицательным контролем, и 33 мкМ дигитонина (Promega, № по кат. G9441) применяли для определения максимальной цитотоксичности. После 72-часовой инкубации жизнеспособность клеток измеряли с применением набора Cell Counting Kit-8 (Dojindo, № по кат. CK04) в соответствии с протоколами производителя с продолжительностью инкубации в диапазоне 1-3 часа. Поглощение при 450 нм (OD₄₅₀) измеряли на ридере Envision (PerkinElmer). Для всех лунок с обработанными дигитонином клетками вычитали значения фоновых уровней OD₄₅₀, и жизнеспособность выражали в виде процента от необработанных контролей (% жизнеспособности). Значения IC₅₀ определяли из четырех-параметрического логистического уравнения по 8-точечной кривой ответа (GraphPad Prism). Все значения IC₅₀ выражены в концентрации в нМ, и представлены значения минимального % жизнеспособных клеток, остающихся после обработки.[255] To evaluate the ability of the anti-CD63 antibody described herein to be internalized into CD63-expressing cells, an indirect in vitro cytotoxicity assay was performed. Human CD63-positive T47D cells (ATCC, cat. no. HTB-133) and human CD63-negative NIH3T3 cells (ATCC, cat. no. CRL-1658) were respectively seeded in PDL-coated 96-well plates (BD Biocoat, Cat. No. 356461) at either 6,000 cells per well in RPMI (Irvine Scientific, Cat. No. 9160) containing 10% FBS (ATCC, Cat. No. 30-2020), penicillin/streptomycin/L-glutamine (Gibco , cat. no. 10378-016), 50 µM beta-mercaptoethanol (Sigma, cat. no. M7522) (culture medium), sodium pyruvate 100 mM (Millipore, cat. no. TMS-005-C), HEPES 1M ( Irvine Scientific, Cat. No. 9319) and bovine insulin 10 µg/ml (Gemini BioProducts, Cat. No. 700-912P), or 2000 cells per well in high glucose DME (Irvine Scientific, Cat. No. 9033) , 10% bovine serum (Hyclone, cat. no. SH30072.03), and penicillin/streptomycin/L-glutamine (Gibco, cat. no. 10378-016), and grown overnight at 37°C in 5% CO ₂ . To obtain cell viability curves, cells were incubated for 5 minutes at 37°C with serially diluted anti-CD63 antibody (H2M12450N) or a nonbinding isotype control antibody at concentrations ranging from 3.0 pM to 2.2 nM. A secondary antibody, an anti-mFc Fab conjugated to a cytotoxic load of MMAF (Moradec, Cat# AM-201AF-50), was then added at 20 nM to each well. Separately, the medium served as a negative control, and 33 μM digitonin (Promega, cat. no. G9441) was used to determine maximum cytotoxicity. After 72-hour incubation, cell viability was measured using Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Cat. No. CK04) according to the manufacturer's protocols with incubation times ranging from 1-3 hours. Absorbance at 450 nm (OD ₄₅₀ ) was measured on an Envision reader (PerkinElmer). For all wells containing digitonin-treated cells, background OD ₄₅₀ values were subtracted and viability was expressed as a percentage of untreated controls (% viability). IC ₅₀ values were determined from a four-parameter logistic equation using an 8-point response curve (GraphPad Prism). All IC ₅₀ values are expressed as concentrations in nM and the minimum % viable cells remaining after treatment are presented.

[256] Как показано в таблице 13, антитело к CD63, H2M12450N, снижало жизнеспособность T47D до 21% со значением IC₅₀, составляющим 0,24 нМ, тогда как изотипический контроль снижал жизнеспособность только до 64%. Антитела практически не влияли на жизнеспособность линии клеток NIH3T3.[256] As shown in Table 13, the anti-CD63 antibody, H2M12450N, reduced viability of T47D to 21% with an IC ₅₀ value of 0.24 nM, while the isotype control reduced viability to only 64%. Antibodies had virtually no effect on the viability of the NIH3T3 cell line.

Таблица 13. Уровень интернализации антител к CD63, измеренный с помощью непрямого анализа цитотоксичности в клетках T47D и NIH3T3Table 13. Level of internalization of anti-CD63 antibodies measured by indirect cytotoxicity assay in T47D and NIH3T3 cells

АнтителоAntibody T47DT47D
(нМ)(nM)
ICIC ₅₀₅₀ % Жизнеспособности T47D% Viability T47D NIH3T3NIH3T3
(нМ)(nM)
ICIC ₅₀₅₀ % Жизнеспособности NIH3T3% Viability NIH3T3 H2M12450NH2M12450N 0,240.24 2121 NDND 8383 Изотипический контрольIsotype control NDND 6464 NDND 9191

ND = не определеноND = not defined

[257] Кинетика связывания Biacore моноклональных антител к CD63, связывающихся с реагентами петли CD63 (EC2), измеренная при 25°C и 37°C [257] Binding kinetics of Biacore anti-CD63 monoclonal antibodies binding to CD63 loop (EC2) reagents measured at 25°C and 37°C

[258] Константы равновесной диссоциации (K_D) для различных реагентов петли CD63, связывающихся с очищенными моноклональными антителами к CD63, определяли с применением биосенсора Biacore T200 или биосенсора Biacore 2000 на основе поверхностного плазмонного резонанса в реальном времени. Все исследования связывания проводили в подвижном буфере, состоящем из 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,05% об./об. поверхностно-активного вещества Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET), при 25°C и 37°C. Поверхность сенсорного чипа Biacore CM5 была сначала дериватизировали путем иммобилизации по амино-группе либо с кроличьим специфическим поликлональным антителом к Fc мыши (GE Healthcare, № по кат. BR100838), либо с набором антител к Fab человека (GE Healthcare, № по кат. 28958325) для захвата моноклональных антител к CD63. Исследования связывания проводили либо на рекомбинантной внеклеточной петле 2 CD63 человека, экспрессированной с С-концевым Myc-Myc-гексагистидином (EC-петля 2 hCD63-MMH; SEQ ID NO:80), либо на рекомбинантной внеклеточной петле 2 CD63 человека, экспрессированной с С-концевой меткой, представляющей собой Fc человека (EC-петля 2 hCD63-hFc; SEQ ID NO:81). Различные концентрации EC-петли 2 hCD63-MMH или EC-петли 2 hCD63-hFc (обе тестировали при концентрации 50нM-12,5 нМ в 4-кратном разведении, либо при концентрации 90 нМ-0,37 нМ в 3-кратных серийных разведениях) сначала получили в подвижном буфере HBS-ET и наносили на поверхность с моноклональным антителом к CD63, захваченным антителом к Fc мыши, на 4 минуты при скорости потока 35 мкл/минуту или 50 мкл/минуту, в то время как мониторинг диссоциации реагента CD63, связанного с моноклональным антителом, осуществляли в течение 8 или 10 минут в подвижном буфере HBS-ET. Скорость ассоциации (k _a ) и скорость диссоциации (k _d ) определяли путем аппроксимации сенсограмм связывания в режиме реального времени по модели связывания 1:1 с ограничением массопереноса с применением программного обеспечения для подбора кривой Scrubber 2.0c. Равновесную константу диссоциации связывания (_KD) и значения периодов полудиссоциации (t) рассчитывали исходя из кинетических скоростей следующим образом:[258] Equilibrium dissociation constants (K _D ) for various CD63 loop reagents binding to purified anti-CD63 monoclonal antibodies were determined using the Biacore T200 biosensor or the Biacore 2000 real-time surface plasmon resonance biosensor. All binding assays were performed in running buffer consisting of 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, and 0.05% v/v. surfactant Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET), at 25°C and 37°C. The surface of the Biacore CM5 sensor chip was first derivatized by amino immobilization with either a rabbit specific polyclonal anti-mouse Fc antibody (GE Healthcare, cat. no. BR100838) or an anti-human Fab antibody kit (GE Healthcare, cat. no. 28958325 ) to capture anti-CD63 monoclonal antibodies. Binding studies were performed on either recombinant human CD63 extracellular loop 2 expressed with C-terminal Myc-Myc-hexahistidine (EC-loop 2 hCD63-MMH; SEQ ID NO:80) or recombinant human CD63 extracellular loop 2 expressed with C -end tag representing human Fc (EC-loop 2 hCD63-hFc; SEQ ID NO:81). Various concentrations of hCD63-MMH EC loop 2 or hCD63-hFc EC loop 2 (both tested at 50 nM-12.5 nM in 4-fold dilutions, or at 90 nM-0.37 nM in 3-fold serial dilutions ) were first prepared in HBS-ET running buffer and applied to the surface with anti-CD63 monoclonal antibody captured by anti-mouse Fc antibody for 4 minutes at a flow rate of 35 μl/minute or 50 μl/minute while monitoring the dissociation of the CD63 reagent. bound to the monoclonal antibody was carried out for 8 or 10 minutes in HBS-ET running buffer. The association rate ( k _a ) and dissociation rate ( k _d ) were determined by fitting real-time binding sensorgrams to a mass transfer-limited 1:1 binding model using Scrubber 2.0c curve fitting software. The equilibrium binding dissociation constant ( _K D) and the half-dissociation periods (t ) were calculated based on kinetic velocities as follows:

K_D (M) = , и t½ (мин.) = K _D (M) = , and t½ (min.) =

[259] Кинетические параметры связывания для связывания белка, представляющего собой EC-петлю 2 CD63 человека, с различными моноклональными антителами к CD63 по настоящему изобретению при 25°C и 37°C показаны в таблицах 14-17.[259] Binding kinetic parameters for binding of human CD63 EC loop 2 protein to various anti-CD63 monoclonal antibodies of the present invention at 25°C and 37°C are shown in Tables 14-17.

[260] При 25°С все моноклональные антитела к CD63 по настоящему изобретению связывались с EC-петлей 2 hCD63-MMH со значениями K_D в диапазоне от 530 пМ до 11,0 нМ, как показано в таблице 14. При 37°С все моноклональные антитела к CD63 по настоящему изобретению связывались с EC-петлей 2 hCD63-MMH со значениями K_D в диапазоне от 1,15 нМ до 56,4 нМ, как показано в таблице 15.[260] At 25°C, all anti-CD63 monoclonal antibodies of the present invention bound to EC loop 2 of hCD63-MMH with K _D values ranging from 530 pM to 11.0 nM, as shown in Table 14. At 37°C, all The anti-CD63 monoclonal antibodies of the present invention bound to EC loop 2 of hCD63-MMH with K _D values ranging from 1.15 nM to 56.4 nM, as shown in Table 15.

[261] При 25°С все моноклональные антитела к CD63 по настоящему изобретению связывались с EC-петлей 2 hCD63-hFc со значениями K_D в диапазоне от 150 пМ до 753 пМ, как показано в таблице 16. При 37°С все моноклональные антитела к CD63 по настоящему изобретению связывались с EC-петлей 2 hCD63-hFc со значениями K_D в диапазоне от 119 пМ до 3,38 нМ, как показано в таблице 17.[261] At 25°C, all anti-CD63 monoclonal antibodies of the present invention bound to EC loop 2 of hCD63-hFc with K _D values ranging from 150 pM to 753 pM, as shown in Table 16. At 37°C, all monoclonal antibodies The CD63 of the present invention bound to EC loop 2 of hCD63-hFc with K _D values ranging from 119 pM to 3.38 nM, as shown in Table 17.

Таблица 14. Кинетические параметры связывания для связывания EC-петли 2 hCD63-MMH человека с моноклональными антителами к CD63 при 25°C Table 14. Binding kinetic parameters for human hCD63-MMH EC loop 2 binding to anti-CD63 monoclonal antibodies at 25 ° C

АнтителоAntibody Уровень захвата mAb (RU)mAb Capture Level (RU) Связано 50 нM или 90 нM Ag (RU)Bound 50 nM or 90 nM Ag (RU) k _a
(M^-1с^-1 ) k _a
(M^-1With^-1 ) kk _dd
(1/с)(1/s) KK _DD
(M)(M) t
(мин.) t
(min.) H2M12450NH2M12450N 592592 6565 2,27E+052.27E+05 2,79E-042.79E-04 1,23E-091.23E-09 4141 H2M12395NH2M12395N 472472 4242 1,66E+051.66E+05 1,82E-031.82E-03 1,10E-081.10E-08 66 H1M12451NH1M12451N 525525 5252 8,59E+048.59E+04 4,30E-044.30E-04 5,00E-095.00E-09 2727 H4H12450NH4H12450N 296296 2424 1,39E+051.39E+05 7,37E-057.37E-05 5,30E-105.30E-10 156,7156.7

Таблица 15. Кинетические параметры связывания для связывания EC-петли 2 hCD63-MMH человека с моноклональными антителами к CD63 при 37°C Table 15. Binding kinetic parameters for human hCD63-MMH EC loop 2 binding to anti-CD63 monoclonal antibodies at 37 ° C

АнтителоAntibody Уровень захвата mAb (RU)mAb Capture Level (RU) Связано 50 нM Ag (RU)Bound 50 nM Ag (RU) kk _aa
(M(M ^-1-1 сWith ^-1-1 )) kk _dd
(1/с)(1/s) KK _DD
(M)(M) t
(мин.) t
(min.) H2M12450NH2M12450N 617617 5858 1,75E+051.75E+05 2,01E-042.01E-04 1,15E-091.15E-09 5757 H2M12395NH2M12395N 535535 3131 1,65E+051.65E+05 9,32E-039.32E-03 5,64E-085.64E-08 11 H1M12451NH1M12451N 597597 4444 8,89E+048.89E+04 1,90E-031.90E-03 2,14E-082.14E-08 66

Таблица 16. Кинетические параметры связывания для связывания EC-петли 2 hCD63-hFC человека с моноклональными антителами к CD63 при 25°C Table 16. Binding kinetic parameters for human hCD63-hFC EC loop 2 binding to anti-CD63 monoclonal antibodies at 25 ° C

АнтителоAntibody Уровень захвата mAb (RU)mAb Capture Level (RU) Связано 50 нM Ag (RU)Bound 50 nM Ag (RU) kk _aa
(M(M ^-1-1 сWith ^-1-1 )) kk _dd
(1/с)(1/s) KK _DD
(M)(M) t
(мин.) t
(min.) H2M12450NH2M12450N 592592 134134 3,20E+053.20E+05 4,66E-054.66E-05 1,50E-101.50E-10 248248 H2M12395NH2M12395N 472472 117117 6,77E+056.77E+05 5,10E-045.10E-04 7,53E-107.53E-10 2323 H1M12451NH1M12451N 525525 107107 1,19E+051.19E+05 8,40E-058.40E-05 7,04E-107.04E-10 138138

Таблица 17. Кинетические параметры связывания для связывания EC-петли 2 hCD63-hFC человека с моноклональными антителами к CD63 при 37°C Table 17. Binding kinetic parameters for human hCD63-hFC EC loop 2 binding to anti-CD63 monoclonal antibodies at 37 ° C

АнтителоAntibody Уровень захвата mAb (RU)mAb Capture Level (RU) Связано 50 нM Ag (RU)Bound 50 nM Ag (RU) k _a
(M^-1с^-1 ) k _a
(M^-1With^-1 ) kk _dd
(1/с)(1/s) KK _DD
(M)(M) t
(мин.) t
(min.) H2M12450NH2M12450N 617617 138138 4,11E+054.11E+05 4,89E-054.89E-05 1,19E-101.19E-10 236236 H2M12395NH2M12395N 535535 123123 5,29E+055.29E+05 1,79E-031.79E-03 3,38E-093.38E-09 66 H1M12451NH1M12451N 597597 118118 6,51E+056.51E+05 3,31E-043.31E-04 5,09E-105.09E-10 3535

[262] Получение биспецифических антител для определения уровня интернализации биспецифического комплекса, содержащего связывающее плечо к CD63 [262] Preparation of bispecific antibodies to determine the level of internalization of the bispecific complex containing the CD63 binding arm

[263] Чтобы оценить способность антител к CD63, получаемых, как описано в этом примере, интернализоваться в виде части биспецифической антигенсвязывающей молекулы, антитела реконструировали в виде биспецифических форматов, где одно связывающее плечо было представлено парой VH/VL антитела к CD63 (см. таблица 10 родительские антитела), а другое было представлено посторонним связывающим плечом. Использовали стандартные способы получения биспецифических антител, и иллюстративные способы описаны, например, в публикации заявки США № 2010/0331527 и патенте США № US5731168, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки. Биспецифические антитела тестировали на их способность к интернализации с применением клеток, экспрессирующих CD63 человека. Для анализа клетки HEK293, которые эндогенно экспрессируют CD63 человека, высевали с плотностью 10000 клеток/лунка в DMEM, содержащем 10% FBS и пенициллин-стрептомицин/L-глутамин (Gibco, № по кат. 10378016), в черные 96-луночные планшеты с прозрачным дном, покрытые поли-D-лизином (Greiner, № по кат. 655946). Два дня спустя среду заменяли свежей средой, содержащей биспецифические антитела к CD63 и антитело отрицательного контроля в серии 2-кратных разведений, начинающихся с 10 мкг/мл до 0,157 мкг/мл, вместе с контролем, представляющим собой отдельно среду. Затем клетки инкубировали при 37°С в течение 3 часов, чтобы обеспечить интернализацию антител. После инкубации клетки промывали с помощью PBS, фиксировали в 4% параформальдегиде (Thermo Scientific, № по кат. 28908) в течение 20 минут при комнатной температуре и затем пермеабилизировали с помощью 0,2% Triton X-100 (Spectrum Chemical, № по кат. TR135) в 5% нормальной козьей сыворотке (NGS) (Gibco, № по кат. PCN5000) в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали либо с 2 мкг/мл Fab осла к IgG мыши с Alexa Fluor-647 (производство, № по кат. 115-606-006), либо с 2 мкг/мл Fab козы к IgG человека с Alexa Fluor-647 (Jackson ImmunoResearch, № по кат. 115-606-006) в 5% NGS в течение 1 часа при комнатной температуре. Раствор вторичного антитела удаляли, затем клетки промывали с помощью PBS и затем добавляли свежий PBS, содержащий 2 капли/мл NucBlue (Invitrogen, № по кат. R37605), для окрашивания ядер живых клеток. Интернализацию антител и ядра визуализировали при увеличении 40x с помощью системы для одновременной многопараметрической визуализации ImageXpress (Molecular Devices), а количественное определение интернализации антител осуществляли с применением программного модуля MetaXpress Transfluor Application Module (Molecular Devices). Уровень интернализации антитела представлен в виде точечно интегрированной интенсивности на клетку ± стандартное отклонение (SD).[263] To evaluate the ability of the anti-CD63 antibodies produced as described in this example to be internalized as part of a bispecific antigen-binding molecule, the antibodies were reconstituted in bispecific formats where one binding arm was represented by the VH/VL pair of the anti-CD63 antibody (see table 10 parental antibodies), and the other was represented by an extraneous binding arm. Standard methods for producing bispecific antibodies have been used, and exemplary methods are described, for example , in US Application Publication No. 2010/0331527 and US Patent No. US5731168, each of which is incorporated herein by reference. Bispecific antibodies were tested for their ability to be internalized using cells expressing human CD63. For the assay, HEK293 cells, which endogenously express human CD63, were seeded at a density of 10,000 cells/well in DMEM containing 10% FBS and penicillin-streptomycin/L-glutamine (Gibco, cat. no. 10378016) in black 96-well plates with transparent bottom, coated with poly-D-lysine (Greiner, cat. no. 655946). Two days later, the medium was replaced with fresh medium containing CD63 bispecific antibodies and negative control antibody in a series of 2-fold dilutions starting from 10 μg/ml to 0.157 μg/ml, along with a control of medium alone. Cells were then incubated at 37°C for 3 hours to allow antibody internalization. After incubation, cells were washed with PBS, fixed in 4% paraformaldehyde (Thermo Scientific, cat. no. 28908) for 20 minutes at room temperature, and then permeabilized with 0.2% Triton X-100 (Spectrum Chemical, cat. no. TR135) in 5% normal goat serum (NGS) (Gibco, Cat. No. PCN5000) for 20 minutes at room temperature. The cells were then incubated with either 2 μg/ml Donkey anti-mouse IgG Fab with Alexa Fluor-647 (manufacturer, cat. no. 115-606-006) or 2 μg/ml Goat anti-human IgG Fab with Alexa Fluor-647 ( Jackson ImmunoResearch, Cat# 115-606-006) in 5% NGS for 1 hour at room temperature. The secondary antibody solution was removed, then the cells were washed with PBS, and then fresh PBS containing 2 drops/ml NucBlue (Invitrogen, cat. no. R37605) was added to stain live cell nuclei. Antibody internalization and nuclei were visualized at 40x magnification using the ImageXpress Simultaneous Multiparametric Imaging System (Molecular Devices), and antibody internalization was quantified using the MetaXpress Transfluor Application Module (Molecular Devices). The level of antibody internalization is presented as point integrated intensity per cell ± standard deviation (SD).

[264] Как показано в таблице 18, все биспецифические антитела, содержащее одно плечо, связывающееся с CD63 человека (полученное из H1M12451, H2M12450 или H2M12395), и постороннее несвязывающее плечо, продемонстрировали эффективную интернализацию в клетки HEK293. Биспецифическое антитело, содержащее одно связывающее плечо mAb12450, продемонстрировало более высокую степень интернализации, чем другие протестированные биспецифические антитела.[264] As shown in Table 18, all bispecific antibodies containing one arm that binds to human CD63 (derived from H1M12451, H2M12450, or H2M12395) and an unrelated nonbinding arm demonstrated efficient internalization into HEK293 cells. A bispecific antibody containing one binding arm of mAb12450 demonstrated a higher degree of internalization than other bispecific antibodies tested.

Таблица 18. Уровень интернализации биспецифических антител к CD63 клетками HEK293Table 18. Level of internalization of bispecific antibodies to CD63 by HEK293 cells

Уровень интернализации антител (точечная интегральная интенсивность) ± SDLevel of antibody internalization (point integrated intensity) ± SD Концентрация антитела (мкг/мл)Antibody concentration (µg/ml) H2M12395NH2M12395N
би-специфическоеbi-specific H2M12450NH2M12450N
би-специфическоеbi-specific H1M12451NH1M12451N
би-bi-
специфическоеspecific Отрицательный контроль AbNegative Control Ab 1010 1,05E+06 ± 4,56E+051.05E+06 ± 4.56E+05 4,34E+06 ± 8,77E+054.34E+06 ± 8.77E+05 8,26E+05 ± 2,67E+058.26E+05 ± 2.67E+05 4,58E+03 ± 6,50E+034.58E+03 ± 6.50E+03 55 1,07E+06 ± 4,06E+05 1.07E+06 ± 4.06E+05 4,31E+06 ± 5,48E+054.31E+06 ± 5.48E+05 5,45E+05 ± 5,20E+045.45E+05 ± 5.20E+04 1,23E+03 ± 8,85E+021.23E+03 ± 8.85E+02 2,52.5 2,73E+05 ± 6,01E+042.73E+05 ± 6.01E+04 3,92E+06 ± 5,80E+053.92E+06 ± 5.80E+05 3,27E+05 ± 1,06E+053.27E+05 ± 1.06E+05 7,70E+02 ± 6,09E+027.70E+02 ± 6.09E+02 1,251.25 1,89E+05 ± 6,61E+041.89E+05 ± 6.61E+04 2,72E+06 ± 2,63E+052.72E+06 ± 2.63E+05 1,20E+05 ± 3,91E+041.20E+05 ± 3.91E+04 1,43E+03 ± 1,19E+031.43E+03 ± 1.19E+03 0,6250.625 2,03E+05 ± 9,37E+042.03E+05 ± 9.37E+04 1,75E+06 ± 1,39E+051.75E+06 ± 1.39E+05 7,87E+04 ± 1,07E+047.87E+04 ± 1.07E+04 3,37E+03 ± 5,22E+033.37E+03 ± 5.22E+03 0,31250.3125 3,95E+04 ± 8,23E+033.95E+04 ± 8.23E+03 8,57E+05 ± 1,60E+058.57E+05 ± 1.60E+05 3,77E+04 ± 1,22E+043.77E+04 ± 1.22E+04 1,99E+03 ± 2,19E+031.99E+03 ± 2.19E+03 0,156250.15625 2,81E+04 ± 1,30E+042.81E+04 ± 1.30E+04 2,42E+05 ± 2,54E+042.42E+05 ± 2.54E+04 7,23E+03 ± 6,09E+03 7.23E+03 ± 6.09E+03 1,87E+03 ± 1,16E+031.87E+03 ± 1.16E+03 00 3,72E+03 ± 1,66E+033.72E+03 ± 1.66E+03 8,21E+03 ± 3,47E+038.21E+03 ± 3.47E+03 1,66E+04 ± 1,80E+041.66E+04 ± 1.80E+04 1,10E+03 ± 1,56E+031.10E+03 ± 1.56E+03

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> Регенерон Фармасьютикалс, Инк.<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Байк, Эндрю Bike, Andrew

Сигнэр, Кэтрин Signare, Catherine

Шенхерр, Кристофер Schoenherr, Christopher

Кирацус, Христос Kyratsos, Christ

Ванг, Ченг Wang, Cheng

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНТЕРНАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INTERNALIZATION OF ENZYMES

<130> 009108.361WO1/10361WO01<130> 009108.361WO1/10361WO01

<150> 62/673,098<150> 62/673,098

<151> 2018-05-17<151> 2018-05-17

<150> 62/574,719<150> 62/574,719

<151> 2017-10-19<151> 2017-10-19

<150> 62/516,656<150> 62/516,656

<151> 2017-06-07<151> 2017-06-07

<160> 81<160> 81

<170> PatentIn версия 3.5<170> PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 952<211> 952

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 1<400> 1

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val CysMet Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 151 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu LeuAla Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30 20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro ValHis Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45 35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro GlyLeu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60 50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro ThrPro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 8065 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp LysGln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95 85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile ProAla Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110 100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys PheAla Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125 115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser SerPhe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140 130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe PheGlu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr GluPro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175 165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr GluAsn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190 180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro LeuVal Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205 195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg ArgTyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg

210 215 220 210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu PheGln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln TyrPhe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255 245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr SerIle Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270 260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro GlyTrp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285 275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp GlyAla Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300 290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp ValGly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly IleVal Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335 325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val GlnLeu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350 340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp GlyGln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365 355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile ThrLeu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380 370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp ValArg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr PheGln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415 405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu HisAsn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430 420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser SerGln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445 435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg ArgSer Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460 450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys ValGly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala LeuTrp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495 485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro PheAla Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510 500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg GlyAsp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525 515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr ValSer Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540 530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala SerPro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr GlySer His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575 565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg GlyLeu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590 580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly ArgThr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605 595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln LeuTyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620 610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val ProAla Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu GluLeu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655 645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met ArgLeu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670 660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe SerAsn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685 675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr AlaGlu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700 690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala GlyLeu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser SerGlu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735 725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu IleThr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750 740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe ProThr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765 755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu GlyLeu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly

770 775 780 770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His SerSer Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn ValGlu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815 805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu ThrHis Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830 820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu ThrThr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845 835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu SerLys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860 850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu AlaLeu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu GlyArg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895 885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr AlaAla Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910 900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr TyrPro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925 915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met GlySer Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940 930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp CysGlu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950945 950

<210> 2<210> 2

<211> 245<211> 245

<212> Белок<212> Protein

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 2<400> 2

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp TyrSer Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp ValTyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr ValAla Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr CysLeu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Arg Leu Thr Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Arg Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyThr Leu Val Thr Ile Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala SerGly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

130 135 140 130 135 140

Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala SerLeu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln GlnLys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

165 170 175 165 170 175

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys LeuLys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu

180 185 190 180 185 190

Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspGlu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205 195 200 205

Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr TyrPhe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

210 215 220 210 215 220

Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly ThrTyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Leu Glu Ile LysLys Leu Glu Ile Lys

245 245

<210> 3<210> 3

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 3<400> 3

ggaaccccta gtgatggagt t ggaaccccta gtgatggagt t

21 21

<210> 4<210> 4

<211> 16<211> 16

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 4<400> 4

cggcctcagt gagcga cggcctcagt gagcga

16 16

<210> 5<210> 5

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 5<400> 5

cactccctct ctgcgcgctc g cactccctct ctgcgcgctc g

21 21

<210> 6<210> 6

<211> 141<211> 141

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 6<400> 6

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc

60 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca

120 120

actccatcac taggggttcc t actccatcac taggggttcc t

141 141

<210> 7<210> 7

<211> 141<211> 141

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 7<400> 7

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg

60 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc

120 120

gagcgcgcag ctgcctgcag g gagcgcgcag ctgcctgcag g

141 141

<210> 8<210> 8

<211> 224<211> 224

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 8<400> 8

gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt

60 60

catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca

120 120

ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc

180 180

cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctga cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctga

224 224

<210> 9<210> 9

<211> 72<211> 72

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 9<400> 9

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg

60 60

ggctaagtcc ac ggctaagtcc ac

72 72

<210> 10<210> 10

<211> 1133<211> 1133

<212> Белок<212> Protein

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 10<400> 10

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly GlyGlu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 151 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp TyrSer Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp ValTyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr ValAla Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu TyrLys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr CysLeu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Arg Leu Thr Tyr Trp Gly Gln GlyAla Arg Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Arg Leu Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Val Thr Ile Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser GlyThr Leu Val Thr Ile Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala SerGly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser

130 135 140 130 135 140

Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala SerLeu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln GlnLys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln

165 170 175 165 170 175

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys LeuLys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Lys Leu

180 185 190 180 185 190

Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspGlu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

195 200 205 195 200 205

Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr TyrPhe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr

210 215 220 210 215 220

Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly ThrTyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

225 230 235 240225 230 235 240

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala His Pro Gly Arg ProLys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala His Pro Gly Arg Pro

245 250 255 245 250 255

Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe AspArg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp

260 265 270 260 265 270

Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg GlyCys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly

275 280 285 275 280 285

Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met GlyCys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly

290 295 300 290 295 300

Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu GluGln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu

305 310 315 320305 310 315 320

Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg ThrAsn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr

325 330 335 325 330 335

Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp ValThr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val

340 345 350 340 345 350

Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro AlaMet Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala

355 360 365 355 360 365

Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser ArgAsn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg

370 375 380 370 375 380

Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe GlyAla Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly

385 390 395 400385 390 395 400

Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr ThrVal Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr

405 410 415 405 410 415

Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr SerVal Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser

420 425 430 420 425 430

Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro LeuLeu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu

435 440 445 435 440 445

Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp LeuMet Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu

450 455 460 450 455 460

Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr LeuAla Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu

465 470 475 480465 470 475 480

Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn SerAla Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser

485 490 495 485 490 495

Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp ArgAsn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg

500 505 510 500 505 510

Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu ProSer Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro

515 520 525 515 520 525

Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe MetLys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met

530 535 540 530 535 540

Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr SerPro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser

545 550 555 560545 550 555 560

Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala HisSer Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His

565 570 575 565 570 575

Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser ArgPhe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg

580 585 590 580 585 590

Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala MetArg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met

595 600 605 595 600 605

Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val AspVal Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp

610 615 620 610 615 620

Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr AspPro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp

625 630 635 640625 630 635 640

Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln ProGlu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro

645 650 655 645 650 655

Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe ThrLeu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr

660 665 670 660 665 670

Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe HisAsn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His

675 680 685 675 680 685

Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro SerAsp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser

690 695 700 690 695 700

Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu GluAsn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu

705 710 715 720705 710 715 720

Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala AlaAsn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala

725 730 735 725 730 735

Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn LeuThr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu

740 745 750 740 745 750

His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala LeuHis Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu

755 760 765 755 760 765

Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr PheVal Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe

770 775 780 770 775 780

Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp SerAla Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser

785 790 795 800785 790 795 800

Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe AsnSer Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn

805 810 815 805 810 815

Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu GlyLeu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly

820 825 830 820 825 830

Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala PheAsn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe

835 840 845 835 840 845

Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln GluTyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu

850 855 860 850 855 860

Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala LeuPro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu

865 870 875 880865 870 875 880

Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His GlnThr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln

885 890 895 885 890 895

Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu PheAla His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe

900 905 910 900 905 910

Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp GlyPro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly

915 920 925 915 920 925

Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu ValGlu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val

930 935 940 930 935 940

Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val ProThr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro

945 950 955 960945 950 955 960

Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg GluVal Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu

965 970 975 965 970 975

Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro LeuPro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu

980 985 990 980 985 990

Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu GlnAsp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln

995 1000 1005 995 1000 1005

Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met AlaGly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala

1010 1015 1020 1010 1015 1020

Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu LeuLeu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu

1025 1030 1035 1025 1030 1035

Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly AlaPhe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala

1040 1045 1050 1040 1045 1050

Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val AsnTyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn

1055 1060 1065 1055 1060 1065

Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu GlnGlu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln

1070 1075 1080 1070 1075 1080

Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val LeuLys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu

1085 1090 1095 1085 1090 1095

Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp ThrSer Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr

1100 1105 1110 1100 1105 1110

Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln PheLys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe

1115 1120 1125 1115 1120 1125

Leu Val Ser Trp CysLeu Val Ser Trp Cys

1130 1130

<210> 11<210> 11

<211> 3489<211> 3489

<212> ДНК<212> DNA

<213> Искуственная<213> Artificial

<220><220>

<223> синтетическая<223> synthetic

<400> 11<400> 11

atgcacagac ctagacgtcg tggaactcgt ccacctccac tggcactgct cgctgctctc atgcacagac ctagacgtcg tggaactcgt ccacctccac tggcactgct cgctgctctc

60 60

ctcctggctg cacgtggtgc tgatgcagaa gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta ctcctggctg cacgtggtgc tgatgcagaa gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta

120 120

gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcaacct ctggattcac tttcagtgac gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcaacct ctggattcac tttcagtgac

180 180

tattacatgt cttgggttcg ccagactcca gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt tattacatgt cttgggttcg ccagactcca gagaagaggc tggagtgggt cgcatatatt

240 240

agtagtagtg gtggtagcac ctattattca gacactgtaa agggccaatt caccatctcc agtagtagtg gtggtagcac ctattattca gacactgtaa agggccaatt caccatctcc

300 300

agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg caaatgagcc gtctgaagtc tgaggacaca

360 360

gccatgtatt actgtgcaag acgagaagat tacgacggaa gacttactta ctggggccaa gccatgtatt actgtgcaag acgagaagat tacgacggaa gacttactta ctggggccaa

420 420

gggactctgg tcaccatctc tgcaggagga agtggtggag gcgggtcagg aggtggcggg gggactctgg tcaccatctc tgcaggagga agtggtggag gcgggtcagg aggtggcggg

480 480

agcggcggtg acattgtgct gacacagtct cctgcttcct tagctgtatc tctggggcag agcggcggtg acattgtgct gacacagtct cctgcttcct tagctgtatc tctggggcag

540 540

agggccacca tctcctgcag ggccagcaaa agtgtcagta catctggtta tagttatatg agggccacca tctcctgcag ggccagcaaa agtgtcagta catctggtta tagttatatg

600 600

aactggtacc aacagaaacc aggacagcca cccaaagtcc tcatctatct tgcatccaaa aactggtacc aacagaaacc aggacagcca cccaaagtcc tcatctatct tgcatccaaa

660 660

ctagaatctg gggtccctgc caggttcagt ggcagtgggt cagggacaga cttcaccctc ctagaatctg gggtccctgc caggttcagt ggcagtgggt cagggacaga cttcaccctc

720 720

aacatccatc ctgtggagga ggaggatgct gcaacctatt actgtcagca cagtagggag aacatccatc ctgtggagga ggaggatgct gcaacctatt actgtcagca cagtagggag

780 780

cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaaa ctggaaataa aaggtggtgg cggttcagca cttccgtaca cgttcggagg ggggaccaaa ctggaaataa aaggtggtgg cggttcagca

840 840

caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc

900 900

gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac gattgcgccc ctgacaaggc catcaccag gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac

960 960

atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc cagatggggc agccctggtg cttcttccca atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc cagatggggc agccctggtg cttcttccca

10201020

cccagctacc ccagctacaa gctggagaac ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc cccagctacc ccagctacaa gctggagaac ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc

10801080

accctgaccc gtaccacccc caccttcttc cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac accctgaccc gtaccacccc caccttcttc cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac

11401140

gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc

12001200

tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc cacagccggg caccgtcccc actctacagc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc cacagccggg caccgtcccc actctacagc

12601260

gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg

13201320

ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc tttgcggacc agttccttca gctgtccacc ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc tttgcggacc agttccttca gctgtccacc

13801380

tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc

14401440

accagctgga ccaggatcac cctgtggaac cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac accagctgga ccaggatcac cctgtggaac cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac

15001500

ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg ctggagaggacg gcgggtcggc acacggggtg

15601560

ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg

16201620

aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac atcttcctgg gccgagcc caagagcgtg

16801680

gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc

17401740

ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc accgctatca cccgccaggt ggtggagaac ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc accgctatca cccgccaggt ggtggagaac

18001800

atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc cagtggaacg acctggacta catggactcc atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc cagtggaacg acctggacta catggactcc

18601860

cggagggact tcacgttcaa caaggatggc ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag cggagggact tcacgttcaa caaggatggc ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag

19201920

ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc

19801980

cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac

20402040

gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta tggcccggggt ccactgcctt ccccgacttc

21002100

accaacccca cagccctggc ctggtgggag gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg accaacccca cagccctggc ctggtgggag gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg

21602160

cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac gagccttcca acttcatcag gggctctgag cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac gagccttcca acttcatcag gggctctgag

22202220

gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg

22802280

accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc agccaccagt ttctctccac acactacaac accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc agccaccagt ttctctccac acactacaac

23402340

ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc atcgcctccc acaggcgct ggtgaaggct

24002400

cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc

24602460

ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa

25202520

atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg

25802580

ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc tggacccagc tggggggcctt ctaccccttc

26402640

atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg

27002700

gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac

27602760

acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag

28202820

ttccccaagg actctagcac ctggactgtg gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ttccccaagg actctagcac ctggactgtg gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg

28802880

ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc

29402940

acatggtacg acctgcagac ggtgccagta gaggcccttg gcagcctccc acccccacct acatggtacg acctgcagac ggtgccagta gaggcccttg gcagcctccc acccccacct

30003000

gcagctcccc gtgagccagc catccacagc gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc gcagctcccc gtgagccagc catccacagc gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc

30603060

ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct gggtacatca tccccctgca gggccctggc

31203120

ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt

31803180

ggggaggccc gaggggagct gttctgggac gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggaggccc gaggggagct gttctgggac gatggagaga gcctggaagt gctggagcga

32403240

ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta

33003300

cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc

33603360

acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc

34203420

gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc

34803480

tggtgttag tggtgttag

34893489

<210> 12<210> 12

<211> 2859<211> 2859

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 12<400> 12

atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc

60 60

ttggcaaccg ctgcactcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga ttggcaaccg ctgcactcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga

120 120

gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc

180 180

agcagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca agcagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccggcc gtcccagagc agtgcccaca

240 240

cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag

300 300

gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc

360 360

cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac

420 420

ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc

480 480

cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac

540 540

ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc

600 600

cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg

660 660

atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc

720 720

tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc

780 780

gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac

840 840

cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg

900 900

ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg ctggagaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg

960 960

gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac

10201020

atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac atcttcctgg gccgagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac

10801080

ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc

11401140

accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc

12001200

cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc

12601260

ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg

13201320

atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag

13801380

ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta

14401440

tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag

15001500

gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac

15601560

gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac

16201620

ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc

16801680

agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc

17401740

atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc

18001800

tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc

18601860

tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct

19201920

ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc

19801980

tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg tggacccagc tggggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg

20402040

ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc

21002100

ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg

21602160

gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg

22202220

gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag

22802280

gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccagta gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccagta

23402340

gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc

24002400

gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct

24602460

gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc

25202520

atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct gttctgggac atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct gttctgggac

25802580

gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc

26402640

aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag

27002700

ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt

27602760

gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg

28202820

ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag

28592859

<210> 13<210> 13

<211> 354<211> 354

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 13<400> 13

caggtgcagc tgcaggagtc gggccccgga ctgatgaagc cttcggagac cctgtccctc caggtgcagc tgcaggagtc gggccccgga ctgatgaagc cttcggagac cctgtccctc

60 60

acctgcactg tctctggtgg ctccttcagc agttactatt ggaactggat ccggcagtcc acctgcactg tctctggtgg ctccttcagc agttactatt ggaactggat ccggcagtcc

120 120

ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atccgttata gtggggacac caactacaag ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atccgttata gtggggacac caactacaag

180 180

ccctccctca agagtcgatt caccatatca attgacacgt ccaagaacct tttctccctg ccctccctca agagtcgatt caccatatca attgacacgt ccaagaacct tttctccctg

240 240

aggctgaaat ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gatgggactg aggctgaaat ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag gatgggactg

300 300

gggagtgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttca gggagtgatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttca

354 354

<210> 14<210> 14

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 14<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Met Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu LysGly Tyr Ile Arg Tyr Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe Ser LeuSer Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe Ser Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Arg Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys AlaArg Leu Lys Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Arg Met Gly Leu Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly ThrArg Met Gly Leu Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Met Val Thr Val Ser SerMet Val Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 15<210> 15

<211> 24<211> 24

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 15<400> 15

ggtggctcct tcagcagtta ctat ggtggctcct tcagcagtta ctat

24 24

<210> 16<210> 16

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 16<400> 16

Gly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr TyrGly Gly Ser Phe Ser Ser Tyr Tyr

1 515

<210> 17<210> 17

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 17<400> 17

atccgttata gtggggacac c atccgttata gtggggacac c

21 21

<210> 18<210> 18

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 18<400> 18

Ile Arg Tyr Ser Gly Asp ThrIle Arg Tyr Ser Gly Asp Thr

1 515

<210> 19<210> 19

<211> 36<211> 36

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 19<400> 19

gcgaggatgg gactggggag tgatgctttt gatatc gcgaggatgg gactggggag tgatgctttt gatatc

36 36

<210> 20<210> 20

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 20<400> 20

Ala Arg Met Gly Leu Gly Ser Asp Ala Phe Asp IleAla Arg Met Gly Leu Gly Ser Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 101 5 10

<210> 21<210> 21

<211> 324<211> 324

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 21<400> 21

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc

60 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttaac aacaattatt tagcctggta ccagcagaaa ctctcctgca gggccagtca gagtgttaac aacaattatt tagcctggta ccagcagaaa

120 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgtattca acagggccac taacatccca cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgtattca acagggccac taacatccca

180 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagactggag gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagactggag

240 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccttg gacgttcggc cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gttcaccttg gacgttcggc

300 300

caagggacca aggtggaaat caaa caagggacca aggtggaaat caaa

324 324

<210> 22<210> 22

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 22<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn AsnGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Asn

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Gly Val Phe Asn Arg Ala Thr Asn Ile Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Gly Val Phe Asn Arg Ala Thr Asn Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser ProPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysTrp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 23<210> 23

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 23<400> 23

cagagtgtta acaacaatta t cagagtgtta acaacaatta t

21 21

<210> 24<210> 24

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 24<400> 24

Gln Ser Val Asn Asn Asn TyrGln Ser Val Asn Asn Asn Tyr

1 515

<210> 25<210> 25

<211> 9<211> 9

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 25<400> 25

ggtgtattc ggtgtattc

9 9

<210> 26<210> 26

<211> 3<211> 3

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 26<400> 26

Gly Val PheGly Val Phe

11

<210> 27<210> 27

<211> 27<211> 27

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 27<400> 27

cagcagtatg gtagttcacc ttggacg cagcagtatg gtagttcacc ttggacg

27 27

<210> 28<210> 28

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 28<400> 28

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp ThrGln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 515

<210> 29<210> 29

<211> 354<211> 354

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 29<400> 29

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccaaga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc caggtgcagc tgcaggagtc gggcccaaga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc

60 60

acctgcattg tctctggtgg ctccatcagt aatttctact ggaactggat ccggcagtcc acctgcattg tctctggtgg ctccatcagt aatttctact ggaactggat ccggcagtcc

120 120

ccagggaagg gactggaatg gattggatat ttcttttaca ctgggactat cgactacaac ccagggaagg gactggaatg gattggatat ttcttttaca ctgggactat cgactacaac

180 180

ccctccctca agagtcgagt caccatatca ctggacacgt ccaagaacca gttctccctg ccctccctca agagtcgagt caccatatca ctggacacgt ccaagaacca gttctccctg

240 240

aacctgcgtc ttctgaccgc cgcagacgcg gccgtttatt attgtgcgag gatggggctg aacctgcgtc ttctgaccgc cgcagacgcg gccgtttatt attgtgcgag gatggggctg

300 300

ggggctaatg cttttgacat ctggggccac gggacaatgg tcaccgtctc ttca ggggctaatg cttttgacat ctggggccac gggacaatgg tcaccgtctc ttca

354 354

<210> 30<210> 30

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 30<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn PheThr Leu Ser Leu Thr Cys Ile Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Phe

20 25 30 20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Tyr Phe Phe Tyr Thr Gly Thr Ile Asp Tyr Asn Pro Ser Leu LysGly Tyr Phe Phe Tyr Thr Gly Thr Ile Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuSer Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 8065 70 75 80

Asn Leu Arg Leu Leu Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys AlaAsn Leu Arg Leu Leu Thr Ala Ala Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Arg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly His Gly ThrArg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly His Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Met Val Thr Val Ser SerMet Val Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 31<210> 31

<211> 24<211> 24

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 31<400> 31

ggtggctcca tcagtaattt ctac ggtggctcca tcagtaattt ctac

24 24

<210> 32<210> 32

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 32<400> 32

Gly Gly Ser Ile Ser Asn Phe TyrGly Gly Ser Ile Ser Asn Phe Tyr

1 515

<210> 33<210> 33

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 33<400> 33

ttcttttaca ctgggactat c ttcttttaca ctgggactat c

21 21

<210> 34<210> 34

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 34<400> 34

Phe Phe Tyr Thr Gly Thr IlePhe Phe Tyr Thr Gly Thr Ile

1 515

<210> 35<210> 35

<211> 36<211> 36

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 35<400> 35

gcgaggatgg ggctgggggc taatgctttt gacatc gcgaggatgg ggctgggggc taatgctttt gacatc

36 36

<210> 36<210> 36

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 36<400> 36

Ala Arg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp IleAla Arg Met Gly Leu Gly Ala Asn Ala Phe Asp Ile

1 5 101 5 10

<210> 37<210> 37

<211> 324<211> 324

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 37<400> 37

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctcctggaga aagagccacc gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctcctggaga aagagccacc

60 60

ctctcctgca gggccagtca gcatgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa ctctcctgca gggccagtca gcatgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa

120 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtggatcca gcagggccac tggcatccca cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtggatcca gcaggggccac tggcatccca

180 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag

240 240

cctgcagatt ttgcagtgtt ttactgtcag cagtatggta actcaccttg gacgttcggc cctgcagatt ttgcagtgtt ttactgtcag cagtatggta actcaccttg gacgttcggc

300 300

caagggacca aggtggaaat gaaa caagggacca aggtggaaat gaaa

324 324

<210> 38<210> 38

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 38<400> 38

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Ser AsnGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ser Ser Asn

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Gly Gly Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Ala Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser ProPro Ala Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro

85 90 95 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Met LysTrp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Met Lys

100 105 100 105

<210> 39<210> 39

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 39<400> 39

cagcatgtta gcagcaacta c cagcatgtta gcagcaacta c

21 21

<210> 40<210> 40

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 40<400> 40

Gln His Val Ser Ser Asn TyrGln His Val Ser Ser Asn Tyr

1 515

<210> 41<210> 41

<211> 9<211> 9

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 41<400> 41

ggtggatcc ggtggatcc

9 9

<210> 42<210> 42

<211> 3<211> 3

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 42<400> 42

Gly Gly SerGly Gly Ser

11

<210> 43<210> 43

<211> 27<211> 27

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 43<400> 43

cagcagtatg gtaactcacc ttggacg cagcagtatg gtaactcacc ttggacg

27 27

<210> 44<210> 44

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 44<400> 44

Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp ThrGln Gln Tyr Gly Asn Ser Pro Trp Thr

1 515

<210> 45<210> 45

<211> 351<211> 351

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 45<400> 45

caggtgcaac tacaggagtc gggcccaaag gtggtgaagc cttcggagac cctgtccctc caggtgcaac tacaggagtc gggcccaaag gtggtgaagc cttcggagac cctgtccctc

60 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggaattggat ccgccagtcc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggaattggat ccgccagtcc

120 120

ccagggaagg gactggagtg gattggatat accaaaagag ggtataccga ctacaacccc ccagggaagg gactggagtg gattggatat accaaaagag ggtataccga ctacaacccc

180 180

tccctcagga gtcgcgtcac tatatcagaa gacacgtcca agaaccagtt ctccctgagg tccctcagga gtcgcgtcac tatatcagaa gacacgtcca agaaccagtt ctccctgagg

240 240

atcagctctg tgaccgccgc agacacggcc gtatattact gtgcacaaat ggggtgggga atcagctctg tgaccgccgc agacacggcc gtatattact gtgcacaaat ggggtgggga

300 300

tcccatgctt ttgacatgtg gggccaaggg acaatggtcg ccgtctcttc a tcccatgctt ttgacatgtg gggccaaggg acaatggtcg ccgtctcttc a

351 351

<210> 46<210> 46

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 46<400> 46

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg SerGly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu ArgArg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala GlnIle Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln

85 90 95 85 90 95

Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr MetMet Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110 100 105 110

Val Ala Val Ser SerVal Ala Val Ser Ser

115 115

<210> 47<210> 47

<211> 24<211> 24

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 47<400> 47

ggtggctcca tcagtagtta ctac ggtggctcca tcagtagtta ctac

24 24

<210> 48<210> 48

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 48<400> 48

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr TyrGly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr

1 515

<210> 49<210> 49

<211> 18<211> 18

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 49<400> 49

accaaaagag ggtatacc accaaaagag ggtatacc

18 18

<210> 50<210> 50

<211> 6<211> 6

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 50<400> 50

Thr Lys Arg Gly Tyr ThrThr Lys Arg Gly Tyr Thr

1 515

<210> 51<210> 51

<211> 36<211> 36

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 51<400> 51

gcacaaatgg ggtggggatc ccatgctttt gacatg gcacaaatgg ggtggggatc ccatgctttt gacatg

36 36

<210> 52<210> 52

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 52<400> 52

Ala Gln Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp MetAla Gln Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met

1 5 101 5 10

<210> 53<210> 53

<211> 324<211> 324

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 53<400> 53

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc

60 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa

120 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcaggggccac tggcatccca

180 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag

240 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc

300 300

caagggacca aggtggaaat caaa caagggacca aggtggaaat caaa

324 324

<210> 54<210> 54

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 54<400> 54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser SerGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe SerIle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser ProPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysTrp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 55<210> 55

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 55<400> 55

cagagtgtta gcagcagcta c cagagtgtta gcagcagcta c

21 21

<210> 56<210> 56

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 56<400> 56

Gln Ser Val Ser Ser Ser TyrGln Ser Val Ser Ser Ser Tyr

1 515

<210> 57<210> 57

<211> 9<211> 9

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 57<400> 57

ggtgcatcc ggtgcatcc

9 9

<210> 58<210> 58

<211> 3<211> 3

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 58<400> 58

Gly Ala SerGly Ala Ser

11

<210> 59<210> 59

<211> 27<211> 27

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 59<400> 59

cagcagtatg gtagctcacc ttggacg cagcagtatg gtagctcacc ttggacg

27 27

<210> 60<210> 60

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 60<400> 60

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp ThrGln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 515

<210> 61<210> 61

<211> 351<211> 351

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 61<400> 61

caggtgcaac tacaggagtc gggcccaaag gtggtgaagc cttcggagac cctgtccctc caggtgcaac tacaggagtc gggcccaaag gtggtgaagc cttcggagac cctgtccctc

60 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggaattggat ccgccagtcc acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggaattggat ccgccagtcc

120 120

ccagggaagg gactggagtg gattggatat accaaaagag ggtataccga ctacaacccc ccagggaagg gactggagtg gattggatat accaaaagag ggtataccga ctacaacccc

180 180

tccctcagga gtcgcgtcac tatatcagaa gacacgtcca agaaccagtt ctccctgagg tccctcagga gtcgcgtcac tatatcagaa gacacgtcca agaaccagtt ctccctgagg

240 240

atcagctctg tgaccgccgc agacacggcc gtatattact gtgcacaaat ggggtgggga atcagctctg tgaccgccgc agacacggcc gtatattact gtgcacaaat ggggtgggga

300 300

tcccatgctt ttgacatgtg gggccaaggg acaatggtcg ccgtctcttc a tcccatgctt ttgacatgtg gggccaaggg acaatggtcg ccgtctcttc a

351 351

<210> 62<210> 62

<211> 117<211> 117

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 62<400> 62

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg SerGly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu ArgArg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala GlnIle Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln

85 90 95 85 90 95

Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr MetMet Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110 100 105 110

Val Ala Val Ser SerVal Ala Val Ser Ser

115 115

<210> 63<210> 63

<211> 24<211> 24

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 63<400> 63

ggtggctcca tcagtagtta ctac ggtggctcca tcagtagtta ctac

24 24

<210> 64<210> 64

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 64<400> 64

Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr TyrGly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr

1 515

<210> 65<210> 65

<211> 18<211> 18

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 65<400> 65

accaaaagag ggtatacc accaaaagag ggtatacc

18 18

<210> 66<210> 66

<211> 6<211> 6

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 66<400> 66

Thr Lys Arg Gly Tyr ThrThr Lys Arg Gly Tyr Thr

1 515

<210> 67<210> 67

<211> 36<211> 36

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 67<400> 67

gcacaaatgg ggtggggatc ccatgctttt gacatg gcacaaatgg ggtggggatc ccatgctttt gacatg

36 36

<210> 68<210> 68

<211> 12<211> 12

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 68<400> 68

Ala Gln Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp MetAla Gln Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met

1 5 101 5 10

<210> 69<210> 69

<211> 324<211> 324

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 69<400> 69

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc

60 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttaat agtaggtact tagcctggta ccagcagaaa ctctcctgca gggccagtca gagtgttaat agtaggtact tagcctggta ccagcagaaa

120 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcaggggccac tggcatccca

180 180

gacaggtgca gtggcagtgg gtccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag gacaggtgca gtggcagtgg gtccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag

240 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc

300 300

caggggacca aggtggaaat caaa caggggacca aggtggaaat caaa

324 324

<210> 70<210> 70

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 70<400> 70

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 151 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser ArgGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Arg

20 25 30 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuTyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Cys SerIle Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Cys Ser

50 55 60 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu GluGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 8065 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser ProPro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

85 90 95 85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysTrp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 71<210> 71

<211> 21<211> 21

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 71<400> 71

cagagtgtta atagtaggta c cagagtgtta atagtaggta c

21 21

<210> 72<210> 72

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 72<400> 72

Gln Ser Val Asn Ser Arg TyrGln Ser Val Asn Ser Arg Tyr

1 515

<210> 73<210> 73

<211> 9<211> 9

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 73<400> 73

ggtgcatcc ggtgcatcc

9 9

<210> 74<210> 74

<211> 3<211> 3

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 74<400> 74

Gly Ala SerGly Ala Ser

11

<210> 75<210> 75

<211> 27<211> 27

<212> ДНК<212> DNA

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 75<400> 75

cagcagtatg gtagctcacc ttggacg cagcagtatg gtagctcacc ttggacg

27 27

<210> 76<210> 76

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 76<400> 76

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp ThrGln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 515

<210> 77<210> 77

<211> 238<211> 238

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 77<400> 77

Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr ValMet Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr Val

1 5 10 151 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val GlyLeu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Val Gly

20 25 30 20 25 30

Val Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala ThrVal Gly Ala Gln Leu Val Leu Ser Gln Thr Ile Ile Gln Gly Ala Thr

35 40 45 35 40 45

Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe LeuPro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Val Phe Leu

50 55 60 50 55 60

Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn TyrPhe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr

65 70 75 8065 70 75 80

Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu ValCys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu Val

85 90 95 85 90 95

Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Val MetGlu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Lys Val Met

100 105 110 100 105 110

Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met Glu Asn Tyr Pro LysSer Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met Glu Asn Tyr Pro Lys

115 120 125 115 120 125

Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met Gln Ala Asp Phe LysAsn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met Gln Ala Asp Phe Lys

130 135 140 130 135 140

Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys Ile Pro Ser MetCys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys Ile Pro Ser Met

145 150 155 160145 150 155 160

Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asn Val Thr Val GlySer Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asn Val Thr Val Gly

165 170 175 165 170 175

Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His Lys Glu Gly Cys ValCys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His Lys Glu Gly Cys Val

180 185 190 180 185 190

Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala AlaGlu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala

195 200 205 195 200 205

Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe AlaAla Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Val Phe Ala

210 215 220 210 215 220

Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val MetCys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met

225 230 235225 230 235

<210> 78<210> 78

<211> 917<211> 917

<212> Белок<212> Protein

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 78<400> 78

Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu GluLeu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg AspThr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp

20 25 30 20 25 30

Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys AspAla Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp

35 40 45 35 40 45

Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile ThrVal Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr

50 55 60 50 55 60

Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys GlnGln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln

65 70 75 8065 70 75 80

Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro ProGly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro

85 90 95 85 90 95

Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met GlySer Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly

100 105 110 100 105 110

Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys AspTyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp

115 120 125 115 120 125

Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg LeuIle Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu

130 135 140 130 135 140

His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro LeuHis Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu

145 150 155 160145 150 155 160

Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser ValGlu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val

165 170 175 165 170 175

Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu AspGlu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp

180 185 190 180 185 190

Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala AspGly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp

195 200 205 195 200 205

Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr GlyGln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly

210 215 220 210 215 220

Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr ArgLeu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg

225 230 235 240225 230 235 240

Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn LeuIle Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu

245 250 255 245 250 255

Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser AlaTyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala

260 265 270 260 265 270

His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu GlnHis Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln

275 280 285 275 280 285

Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp ValPro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val

290 295 300 290 295 300

Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr LeuTyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu

305 310 315 320305 310 315 320

Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly PheAsp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe

325 330 335 325 330 335

His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln ValHis Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val

340 345 350 340 345 350

Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp AsnVal Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn

355 360 365 355 360 365

Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys AspAsp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp

370 375 380 370 375 380

Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly GlyGly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly

385 390 395 400385 390 395 400

Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly ProArg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro

405 410 415 405 410 415

Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val PheAla Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe

420 425 430 420 425 430

Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro GlyIle Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly

435 440 445 435 440 445

Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp TrpSer Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp

450 455 460 450 455 460

Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly MetGlu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met

465 470 475 480465 470 475 480

Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu AspTrp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp

485 490 495 485 490 495

Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly ValGly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val

500 505 510 500 505 510

Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His GlnVal Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln

515 520 525 515 520 525

Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr GluPhe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu

530 535 540 530 535 540

Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg ProAla Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro

545 550 555 560545 550 555 560

Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala GlyPhe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly

565 570 575 565 570 575

His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser SerHis Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser

580 585 590 580 585 590

Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val GlyVal Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly

595 600 605 595 600 605

Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys ValAla Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val

610 615 620 610 615 620

Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His AsnArg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn

625 630 635 640625 630 635 640

Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro AlaSer Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala

645 650 655 645 650 655

Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu ProGln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro

660 665 670 660 665 670

His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr ValHis Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val

675 680 685 675 680 685

Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp ThrAla Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr

690 695 700 690 695 700

Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro ValVal Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val

705 710 715 720705 710 715 720

Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly ThrLeu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr

725 730 735 725 730 735

Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu ProTrp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro

740 745 750 740 745 750

Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly GlnPro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln

755 760 765 755 760 765

Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu ArgTrp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg

770 775 780 770 775 780

Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr GluAla Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu

785 790 795 800785 790 795 800

Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly GlySer Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly

805 810 815 805 810 815

Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu ValGlu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val

820 825 830 820 825 830

Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn AsnLeu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn

835 840 845 835 840 845

Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly LeuThr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu

850 855 860 850 855 860

Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln GlnGln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln

865 870 875 880865 870 875 880

Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro AspVal Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp

885 890 895 885 890 895

Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln PheThr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe

900 905 910 900 905 910

Leu Val Ser Trp CysLeu Val Ser Trp Cys

915 915

<210> 79<210> 79

<211> 1128<211> 1128

<212> Белок<212> Protein

<213> Искуственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> scFv_H4H123450(VH-linker-VL)_linker_GAA<223> scFv_H4H123450(VH-linker-VL)_linker_GAA

<400> 79<400> 79

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser GluGln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Lys Val Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 151 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser TyrThr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp IleTyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg SerGly Tyr Thr Lys Arg Gly Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu ArgArg Val Thr Ile Ser Glu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Arg

65 70 75 8065 70 75 80

Ile Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala GlnIle Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln

85 90 95 85 90 95

Met Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr MetMet Gly Trp Gly Ser His Ala Phe Asp Met Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110 100 105 110

Val Ala Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyVal Ala Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125 115 120 125

Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu SerGly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

130 135 140 130 135 140

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln SerLeu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160145 150 155 160

Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln AlaVal Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

165 170 175 165 170 175

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile ProPro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro

180 185 190 180 185 190

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr IleAsp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205 195 200 205

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln TyrSer Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

210 215 220 210 215 220

Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile LysGly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro ThrGly Gly Gly Gly Ser Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

245 250 255 245 250 255

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp LysGln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

260 265 270 260 265 270

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile ProAla Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

275 280 285 275 280 285

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys PheAla Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

290 295 300 290 295 300

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser SerPhe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

305 310 315 320305 310 315 320

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe PheGlu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

325 330 335 325 330 335

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr GluPro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

340 345 350 340 345 350

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr GluAsn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

355 360 365 355 360 365

Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro LeuVal Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

370 375 380 370 375 380

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg ArgTyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg

385 390 395 400385 390 395 400

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu PheGln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

405 410 415 405 410 415

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln TyrPhe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

420 425 430 420 425 430

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr SerIle Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

435 440 445 435 440 445

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro GlyTrp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

450 455 460 450 455 460

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp GlyAla Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

465 470 475 480465 470 475 480

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp ValGly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

485 490 495 485 490 495

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly IleVal Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

500 505 510 500 505 510

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val GlnLeu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

515 520 525 515 520 525

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp GlyGln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

530 535 540 530 535 540

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile ThrLeu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

545 550 555 560545 550 555 560

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp ValArg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

565 570 575 565 570 575

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr PheGln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

580 585 590 580 585 590

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu HisAsn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

595 600 605 595 600 605

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser SerGln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

610 615 620 610 615 620

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg ArgSer Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

625 630 635 640625 630 635 640

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys ValGly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

645 650 655 645 650 655

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala LeuTrp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

660 665 670 660 665 670

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro PheAla Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

675 680 685 675 680 685

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg GlyAsp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

690 695 700 690 695 700

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr ValSer Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

705 710 715 720705 710 715 720

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala SerPro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

725 730 735 725 730 735

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr GlySer His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

740 745 750 740 745 750

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg GlyLeu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

755 760 765 755 760 765

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly ArgThr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

770 775 780 770 775 780

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln LeuTyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

785 790 795 800785 790 795 800

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val ProAla Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

805 810 815 805 810 815

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu GluLeu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

820 825 830 820 825 830

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met ArgLeu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

835 840 845 835 840 845

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe SerAsn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

850 855 860 850 855 860

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr AlaGlu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

865 870 875 880865 870 875 880

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala GlyLeu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

885 890 895 885 890 895

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser SerGlu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

900 905 910 900 905 910

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu IleThr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

915 920 925 915 920 925

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe ProThr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

930 935 940 930 935 940

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu GlyLeu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly

945 950 955 960945 950 955 960

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His SerSer Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

965 970 975 965 970 975

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn ValGlu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

980 985 990 980 985 990

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu ThrHis Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

995 1000 1005 995 1000 1005

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala LeuThr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu

1010 1015 1020 1010 1015 1020

Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp GlyThr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly

1025 1030 1035 1025 1030 1035

Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val IleGlu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile

1040 1045 1050 1040 1045 1050

Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg ValPhe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val

1055 1060 1065 1055 1060 1065

Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val LeuThr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu

1070 1075 1080 1070 1075 1080

Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val ProGly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro

1085 1090 1095 1085 1090 1095

Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp IleVal Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile

1100 1105 1110 1100 1105 1110

Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp CysCys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

1115 1120 1125 1115 1120 1125

<210> 80<210> 80

<211> 125<211> 125

<212> Белок<212> Protein

<213> Искуственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> EC-петля 2 CD63 MMH<223> EC loop 2 CD63 MMH

<400> 80<400> 80

Arg Asp Lys Val Met Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln MetArg Asp Lys Val Met Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met

1 5 10 151 5 10 15

Glu Asn Tyr Pro Lys Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg MetGlu Asn Tyr Pro Lys Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met

20 25 30 20 25 30

Gln Ala Asp Phe Lys Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp GluGln Ala Asp Phe Lys Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu

35 40 45 35 40 45

Lys Ile Pro Ser Met Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys IleLys Ile Pro Ser Met Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile

50 55 60 50 55 60

Asn Val Thr Val Gly Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile HisAsn Val Thr Val Gly Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His

65 70 75 8065 70 75 80

Lys Glu Gly Cys Val Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn ValLys Glu Gly Cys Val Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val

85 90 95 85 90 95

Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln LysLeu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys

100 105 110 100 105 110

Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His HisLeu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His

115 120 125 115 120 125

<210> 81<210> 81

<211> 324<211> 324

<212> Белок<212> Protein

<213> Искуственная последовательность<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> EC-петля 2 CD63 hFC<223> EC loop 2 CD63 hFC

<400> 81<400> 81

Arg Asp Lys Val Met Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln MetArg Asp Lys Val Met Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gln Gln Met

1 5 10 151 5 10 15

Glu Asn Tyr Pro Lys Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg MetGlu Asn Tyr Pro Lys Asn Asn His Thr Ala Ser Ile Leu Asp Arg Met

20 25 30 20 25 30

Gln Ala Asp Phe Lys Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp GluGln Ala Asp Phe Lys Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu

35 40 45 35 40 45

Lys Ile Pro Ser Met Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys IleLys Ile Pro Ser Met Ser Lys Asn Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile

50 55 60 50 55 60

Asn Val Thr Val Gly Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile HisAsn Val Thr Val Gly Cys Gly Ile Asn Phe Asn Glu Lys Ala Ile His

65 70 75 8065 70 75 80

Lys Glu Gly Cys Val Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn ValLys Glu Gly Cys Val Glu Lys Ile Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val

85 90 95 85 90 95

Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu LeuLeu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

100 105 110 100 105 110

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr LeuGly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

115 120 125 115 120 125

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val SerMet Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

130 135 140 130 135 140

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val GluHis Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

145 150 155 160145 150 155 160

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser ThrVal His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

165 170 175 165 170 175

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu AsnTyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190 180 185 190

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala ProGly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

195 200 205 195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro GlnIle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

210 215 220 210 215 220

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln ValVal Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

225 230 235 240225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala ValSer Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

245 250 255 245 250 255

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr ProGlu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

260 265 270 260 265 270

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu ThrPro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

275 280 285 275 280 285

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser ValVal Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

290 295 300 290 295 300

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser LeuMet His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

305 310 315 320305 310 315 320

Ser Pro Gly LysSer Pro Gly Lys

<---<---

Claims (22)

1. Композиция для применения в лечении лизосомных болезней накопления, содержащая полинуклеотид, кодирующий мультидоменный терапевтический белок, содержащий домен доставки и ферментативный домен, и фармацевтически приемлемый носитель,1. A composition for use in the treatment of lysosomal storage diseases, containing a polynucleotide encoding a multi-domain therapeutic protein containing a delivery domain and an enzymatic domain, and a pharmaceutically acceptable carrier, где домен доставки связывается с эффектором интернализации;where the delivery domain binds to the internalization effector; где эффектор интернализации представляет собой CD63; иwherein the internalization effector is CD63; And где домен доставки содержит:where the delivery domain contains: аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 илиamino acid sequence of SEQ ID NO:2 or аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей изamino acid sequence selected from the group consisting of аминокислотной последовательности HCVR, выбранной из SEQ ID NOs:14, 30, 46 и 62, аминокислотной последовательности LCVR, выбранной из SEQ ID NOs:22, 38, 54 и 70, аминокислотной последовательности HCDR1, выбранной из SEQ ID NOs:16, 32, 48 и 64, аминокислотной последовательности HCDR2, выбранной из SEQ ID NOs:18, 34, 50 и 66, аминокислотной последовательности HCDR3, выбранной из SEQ ID NOs:20, 36, 52 и 68, аминокислотной последовательности LCDR1, выбранной из SEQ ID NOs:24, 40, 56 и 72, аминокислотной последовательности LCDR2, выбранной из SEQ ID NOs:26, 42, 58 и 74, аминокислотной последовательности LCDR3, выбранной из SEQ ID NOs:28, 44, 60 и 76, пары из аминокислот HCVR/LCVR, представленной под SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38,HCVR amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 14, 30, 46 and 62, LCVR amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 22, 38, 54 and 70, HCDR1 amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 16, 32, 48 and 64, the amino acid sequence of HCDR2 selected from SEQ ID NOs: 18, 34, 50 and 66, the amino acid sequence of HCDR3 selected from SEQ ID NOs: 20, 36, 52 and 68, the amino acid sequence of LCDR1 selected from SEQ ID NOs: 24, 40, 56 and 72, LCDR2 amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 26, 42, 58 and 74, LCDR3 amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 28, 44, 60 and 76, HCVR/LCVR amino acid pairs , presented under SEQ ID NO: 14/22, SEQ ID NO: 30/38, SEQ ID NO:46/54 или SEQ ID NO:62/70, где необязательно пара из аминокислот HCVR/LCVR содержит от N-конца до C-конца: HCVR, необязательный линкер и LCVR, и/или где необязательно ферментативный домен присоединен к С-концу LCVR, и любую их комбинацию.SEQ ID NO:46/54 or SEQ ID NO:62/70, wherein optionally the amino acid pair HCVR/LCVR comprises from N-terminus to C-terminus: HCVR, an optional linker and LCVR, and/or wherein optionally an enzymatic domain is attached to C-end LCVR, and any combination thereof. 2. Композиция по п. 1, где ферментативный домен присоединен к С-концу LCVR посредством линкера.2. The composition according to claim 1, wherein the enzymatic domain is attached to the C-terminus of the LCVR via a linker. 3. Композиция по п. 1 или 2, где домен доставки представляет собой антигенсвязывающий белок.3. The composition according to claim 1 or 2, wherein the delivery domain is an antigen-binding protein. 4. Композиция по пп. 1-3, где домен доставки представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).4. Composition according to claims. 1-3, where the delivery domain is a single chain variable fragment (scFv). 5. Композиция по любому из пп. 1-4, где ферментативный домен предусматривает гидролазу.5. Composition according to any one of paragraphs. 1-4, wherein the enzymatic domain comprises a hydrolase. 6. Композиция по любому из пп. 1-5, где ферментативный домен предусматривает гликозилазу.6. Composition according to any one of paragraphs. 1-5, wherein the enzymatic domain comprises a glycosylase. 7. Композиция по любому из пп. 1-6, где ферментативный домен предусматривает гликозидазу.7. Composition according to any one of paragraphs. 1-6, where the enzymatic domain comprises a glycosidase. 8. Композиция по любому из пп. 1-7, где ферментативный домен предусматривает альфа-глюкозидазу.8. Composition according to any one of paragraphs. 1-7, wherein the enzymatic domain comprises alpha-glucosidase. 9. Композиция по любому из пп. 1-8, где ферментативный домен содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:78 или ее фрагмент.9. Composition according to any one of paragraphs. 1-8, where the enzymatic domain contains the amino acid sequence of SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:78 or a fragment thereof. 10. Композиция по любому из пп. 1-9, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса.10. Composition according to any one of paragraphs. 1-9, wherein the polynucleotide further comprises a viral nucleic acid sequence. 11. Композиция по любому из пп. 1-10, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса, где последовательность нуклеиновой кислоты вируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV).11. Composition according to any one of paragraphs. 1-10, wherein the polynucleotide further comprises a viral nucleic acid sequence, wherein the viral nucleic acid sequence is an adeno-associated virus (AAV) nucleic acid sequence. 12. Композиция по любому из пп. 1-11, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, нацеливающуюся на локус, при этом последовательность нуклеиновой кислоты вируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV), и где последовательность нуклеиновой кислоты AAV содержит последовательность внутреннего концевого повтора и необязательно тканеспецифический регуляторный элемент, такой как специфический для печени промотор.12. Composition according to any one of paragraphs. 1-11, wherein the polynucleotide further comprises a viral nucleic acid sequence and optionally a nucleic acid sequence targeting a locus, wherein the viral nucleic acid sequence is an adeno-associated virus (AAV) nucleic acid sequence, and wherein the AAV nucleic acid sequence comprises an internal terminal repeat sequence and optionally a tissue-specific regulatory element, such as a liver-specific promoter. 13. Композиция по любому из пп. 1-12, где полинуклеотид дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты вируса и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, нацеливающуюся на локус, где последовательность нуклеиновой кислоты вируса представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты аденоассоциированного вируса (AAV), содержащую последовательность внутреннего концевого повтора, которая содержит SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или обе, и необязательно тканеспецифический регуляторный элемент, такой как специфический для печени промотор.13. Composition according to any one of paragraphs. 1-12, wherein the polynucleotide further comprises a viral nucleic acid sequence and optionally a nucleic acid sequence targeting a locus, wherein the viral nucleic acid sequence is an adeno-associated virus (AAV) nucleic acid sequence containing an internal terminal repeat sequence that contains SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7 or both, and optionally a tissue-specific regulatory element, such as a liver-specific promoter. 14. Композиция по любому из пп. 1-13, где полинуклеотид дополнительно содержит тканеспецифический регуляторный элемент, содержащий последовательность, представленную под SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или обе.14. Composition according to any one of paragraphs. 1-13, wherein the polynucleotide further comprises a tissue-specific regulatory element comprising the sequence set forth in SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, or both. 15. Композиция по любому из пп. 1-14, где полинуклеотид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:11 и/или кодирует аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:78.15. Composition according to any one of paragraphs. 1-14, wherein the polynucleotide contains the nucleic acid sequence of SEQ ID NO:11 and/or encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO:10 or SEQ ID NO:78.