EA041885B1 - COMPOSITIONS AND METHODS FOR INTERNALIZING ENZYMES - Google Patents

Description

Область изобретенияField of invention

Настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам для лечения лизосомных болезней накопления. В частности, настоящее изобретение относится к целевым белковым комплексам, которые содержат заместительные ферменты, и к их применению в лечении лизосомных болезней накопления.The present invention relates generally to compositions and methods for the treatment of lysosomal storage diseases. In particular, the present invention relates to target protein complexes that contain replacement enzymes and their use in the treatment of lysosomal storage diseases.

Предпосылки изобретенияBackground of the invention

Лизосомные болезни накопления составляют класс редких заболеваний, которые влияют на разрушение многочисленных субстратов в лизосоме. Такие субстраты включают в себя сфинголипиды, мукополисахариды, гликопротеины, гликоген и олигосахариды, которые могут накапливаться в клетках больных людей, что приводит к смерти клеток. Органы, поражаемые лизосомными болезнями накопления, охватывают центральную нервную систему (CNS), периферическую нервную систему (PNS), легкие, печень, кость, скелетную и сердечную мускулатуру и высокоинтеллектуальную систему.Lysosomal storage diseases constitute a class of rare diseases that affect the breakdown of numerous substrates in the lysosome. Such substrates include sphingolipids, mucopolysaccharides, glycoproteins, glycogen, and oligosaccharides, which can accumulate in the cells of sick people, leading to cell death. Organs affected by lysosomal storage diseases include the central nervous system (CNS), peripheral nervous system (PNS), lungs, liver, bone, skeletal and cardiac muscles, and the high intelligence system.

Варианты лечения лизосомных болезней накопления включают заместительную ферментную терапию (ERT), субстрат-редуцирующую терапию, фармакологическую шаперон-опосредованную терапию, терапию с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток и генную терапию. Пример субстратредуцирующей терапии включает применение миглустата или элиглустата для лечения заболевания Гоше 1 типа. Эти лекарственные средства действуют путем блокирования активности синтазы, что снижает последующее продуцирование субстрата. Терапию с использованием гемопоэтических стволовых клеток (HSCT), например, используют для облегчения и замедления отрицательного фенотипа центральной нервной системы у пациентов с некоторыми формами MPS. См. R.M. Boustany, Lysosomal storage diseases--the horizon expands, 9(10) Nat. Rev. Neurol. 583-98, Oct. 2013. В табл. 1 приводятся некоторые лизосомные болезни накопления и ассоциированные с ними ферменты или другие белки.Treatment options for lysosomal storage diseases include enzyme replacement therapy (ERT), substrate reduction therapy, pharmacological chaperone-mediated therapy, hematopoietic stem cell transplantation therapy, and gene therapy. An example of substrate reducing therapy includes the use of miglustat or eliglustat for the treatment of type 1 Gaucher disease. These drugs work by blocking synthase activity, which reduces subsequent substrate production. Hematopoietic stem cell therapy (HSCT), for example, is used to alleviate and slow down the negative central nervous system phenotype in patients with some forms of MPS. See R.M. Boustany, Lysosomal storage diseases--the horizon expands, 9(10) Nat. Rev. Neurol. 583-98, Oct. 2013. Table. 1 lists some lysosomal storage diseases and their associated enzymes or other proteins.

- 1 041885- 1 041885

Лизосомные болезни накопленияLysosomal storage diseases

Таблица 1Table 1

Класс Class Заболевание Disease Вовлеченный фермент/белок Involved enzyme/protein Сфинголипидо 3 sphingolipido 3 Заболевание Фабри Fabry disease α-галактозидаза А α-galactosidase A Липогранулематоз Фарбера Farber's lipogranulomatosis Церамидаза Ceramidase Заболевание Гоше I типа Gaucher disease type I β-глюкозидаза β-glucosidase Заболевание Гоше II и III типов Gaucher disease II and III types Активатор сапозина-С Activator saposina-S Заболевания Ниманна-Пика типов А и В Niemann-Pick disease types A and B Сфингомиелиназа Sphingomyelinase GM1-ганглиозидоз GM1 gangliosidosis β-галактозидаза β-galactosidase GM2-ганглиозидоз (заболевание Сандгоффа) GM2 gangliosidosis (Sandhoff disease) β-гексозаминидаза А и В β-hexosaminidase A and B GM2-ганглиозидоз (заболевание Тея-Сакса) GM2 gangliosidosis (Tay-Sachs disease) β-гексозаминидаза А β-hexosaminidase A GM2-ганглиозидоз (дефицит GM2-активатора) GM2 gangliosidosis (deficiency of GM2 activator) Белок GM2активатор Protein GM2activator GM3-ганглиозидоз GM3 gangliosidosis 6МЗ-синтаза 6M3-synthase Метахроматинеокая лейкодистрофия Metachromatic leukodystrophy Арилсульфатаза А Arylsulfatase A Дефицит активатора сфинголипида sphingolipid activator deficiency Активатор сфинголипида sphingolipid activator Мукополи- сахаридозы Mucopoli- saccharidoses MPS I (заболевание Шейе, Гурлера-Шейе и Гурлера) MPS I (Scheye, Gurler-Scheye and Gurler disease) а-идуронидаза a-iduronidase MPS II (заболевание Хантера) MPS II (disease Hunter) Идуронидаза-2сульфатаза Iduronidase-2sulfatase MPS IIIA (заболевание MPS IIIA (disease Γeπapaн-^- Γeparan-^-

- 2 041885- 2 041885

Санфилиппо А типа) Sanfilippo A type) сульфатаза sulfatase MPS IIIB (заболевание MPS IIIB (disease V-ацетил-а- V-acetyl-a- Санфилиппо В типа) Sanfilippo B type) глюкозаминидаза glucosaminidase MPS IIIC (заболевание Санфилиппо С типа) MPS IIIC (disease Sanfilippo C type) Ацетил-СоА; аглюкозамид-Vацетилтрансфераза Acetyl-CoA; aglucosamide-Vacetyltransferase MPS IIID (заболевание Санфилиппо D) MPS IIID (Sanfilippo D disease) N- ацетилглюкозамин- 6-сульфатаза N- N- acetylglucosamine- 6-sulfatase N- MPS IVA (синдром Моркио MPS IVA (Morquio syndrome ацетилгалактозамин acetylgalactosamine А типа) A type) -6-сульфат- -6-sulfate- сульфатаза sulfatase MPS IVB (синдром Моркио В типа) MPS IVB (Morquio B type syndrome) β-галактозидаза β-galactosidase — — Ν- N- MPS VI (заболевание MPS VI (disease ацетилгалактозамин acetylgalactosamine Марото-Лами) Maroto-Lami) -4-сульфатаза -4-sulfatase (арилсульфатаза В) (arylsulfatase B) MPS VII (заболевание Слая) MPS VII (disease Sly) β-глюкуронидаза β-glucuronidase MPS IX MPS IX Гиалуронидаза Hyaluronidase Болезнь Disease Заболевание Помпе Pompe disease накопления accumulation (болезнь накопления (storage disease) а-глюкозидаза 2 a-glucosidase 2 гликогена glycogen гликогена II типа) type II glycogen) Липидный lipid Дефицит лизосомальной Lysosomal deficiency Лизосомальная Lysosomal метаболизм metabolism кислой липазы (LAL-D; acid lipase (LAL-D; кислая липаза acid lipase заболевание Вольмана) Wolman disease)

Двумя наиболее распространенными LSD являются заболевание Помпе и заболевание Фабри. Заболевание Помпе вызвано дефективным лизосомальным ферментом альфа-глюкозидазы (GAA), что приводит к недостаточному процессированию псевдогемального гликогена. Накопление лизосомального гликогена происходит преимущественно в скелетной, сердечной и печеночной тканях. Раннее проявление заболевания Помпе вызывает кардиомегалию, гипотонию, гепатомегалию и смерть из-за кардиореспираторной недостаточности обычно в возрасте до 2 лет. Проявление заболевания Помпе во зрелом возрасте наблюдается только от двадцати до шестидесяти лет и обычно затрагивает только скелетную мускулатуру.The two most common LSDs are Pompe disease and Fabry disease. Pompe disease is caused by a defective lysosomal alpha-glucosidase enzyme (GAA), resulting in insufficient processing of pseudohemal glycogen. The accumulation of lysosomal glycogen occurs mainly in skeletal, cardiac and hepatic tissues. Early onset Pompe disease causes cardiomegaly, hypotension, hepatomegaly, and death due to cardiorespiratory failure, usually by age 2 years. The onset of Pompe disease in adulthood occurs only between the ages of 20 and 60 and usually affects only skeletal muscle.

Заболевание Фабри вызывается дефективным лизосомальными ферментом альфа-галактозидаза A (GLA), что проявляется в накоплении глоботриаозилцерамида в кровеносных сосудах и других тканях и органах. Симптомы, связанные с заболеванием Фабри, включают боль из-за повреждения нерва и/или обструкции небольших сосудов, почечную недостаточность и полное разрушение, сердечные осложнения, такие как высокое кровяное давление и кардиомиопатия, дерматологические симптомы, такие как образование ангиокератомы, ангидроз или гипергидроз, а также глазные проблемы, такие как воронковидная кератопатия, клиновидная катаракта и сосудистые нарушения конъюктивы и сетчатки.Fabry disease is caused by a defective lysosomal enzyme alpha-galactosidase A (GLA), which results in the accumulation of globotriaosylceramide in blood vessels and other tissues and organs. Symptoms associated with Fabry disease include pain due to nerve injury and/or obstruction of small vessels, renal failure and complete destruction, cardiac complications such as high blood pressure and cardiomyopathy, dermatological symptoms such as angiokeratoma formation, anhidrosis or hyperhidrosis, as well as eye problems such as funnel keratopathy, wedge cataracts, and vascular disorders of the conjunctiva and retina.

Текущие методы лечения лизосомных болезней накопления не особо оптимальны. Например, ERT, как правило, должна вводиться с высокой частотой и при высокой дозе, например дважды в неделю и не менее 40 мг/кг. Также некоторые замещаемые ферменты могут быть иммунологически перекрестнореагирующими (CRIM), стимулирующими продуцирование IgG у субъекта и, таким образом, препятствующими доставке фермента в лизосому посредством манноза-6-фосфатного (M6P) рецептора. IgG может экранировать остатки M6P заместительный фермент, и комплекс антиген-IgG-антитело может попадать в клеточные лизосомы посредством Fc-рецептора с шунтированием тем самым заместительного ферментаCurrent treatments for lysosomal storage diseases are not particularly optimal. For example, ERT will typically be administered at a high frequency and at a high dose, eg twice a week and at least 40 mg/kg. Also, some substituted enzymes may be immunologically cross-reactive (CRIM), stimulating IgG production in a subject and thus preventing delivery of the enzyme to the lysosome via the mannose-6-phosphate (M6P) receptor. IgG can shield residues of the M6P substitution enzyme, and the antigen-IgG-antibody complex can enter cell lysosomes via the Fc receptor, thereby shunting the substitution enzyme

- 3 041885 преимущественно в макрофаги.- 3 041885 predominantly in macrophages.

Доставка заместительных ферментов в соответствующие пораженные ткани также неэффективна (см. табл. 2 и Desnick & Schuchman, Enzyme replacement therapy for lysosomal diseases: lessons from 20 years of experience and remaining challenges, 13 Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 307-35, 2012). Например, пациенты, подвергшиеся длительной заместительной ферментной терапии по поводу заболевания Помпе в младенческом возрасте, все равно могут страдать гиперназальной речью, остаточной мышечной слабостью, птозом, остеопенией, потерей слуха, риском аспирации, дисфагией, сердечной аритмией и затруднением при глотании. Дозы заместительного фермента часто должны увеличиваться со временем до 40 мг/кг раз в неделю или раз в две недели.Delivery of replacement enzymes to the affected tissues is also ineffective (see Table 2 and Desnick & Schuchman, Enzyme replacement therapy for lysosomal diseases: lessons from 20 years of experience and remaining challenges, 13 Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 307-35 , 2012). For example, patients undergoing long-term enzyme replacement therapy for Pompe disease in infancy may still suffer from hypernasal speech, residual muscle weakness, ptosis, osteopenia, hearing loss, risk of aspiration, dysphagia, cardiac arrhythmias, and difficulty swallowing. Doses of replacement enzyme should often be increased over time to 40 mg/kg weekly or biweekly.

Таблица 2table 2

Неэффективное нацеливание ERT на тканиInefficient targeting of ERT to tissues

Заболевание Disease Подтип(—ы) Subtype(s) Легко достигает ткани Reaches tissue easily С трудом достигает ткани Difficulty reaching tissue Селезенка, Spleen, 1 типа 1 type печень, костный liver, bone Кость Bone Заболевание Disease мозг brain Гоше Gaucher 2 и 3 типов 2 and 3 types Селезенка, печень, костный мозг Spleen, liver, bone marrow Кость, головной мозг bone, brain Заболевание Фабри Disease Fabry Классическое и позднее проявления classic and later manifestations Сосудистый эндотелий Vascular endothelium Почка, сердце Kidney, heart Мукополисахар идозы Mucopolysaccharide idoses Все All Селезенка, печень, костный мозг Spleen, liver, bone marrow Кость, головной мозг, хрящ Bone, head brain, cartilage а-маннозидоз a-mannosidosis — — Селезенка, печень, костный мозг spleen, liver, bone brain Кость, головной мозг bone, brain Заболевание Ниманна-Пика Disease Niemann Pika типа В type B Селезенка, печень, костный мозг Spleen, liver, bone marrow Альвеолярные макрофаги Alveolar macrophages В IN Сердце, гладкая Heart, smooth младенческом infant — — и скелетная and skeletal возрасте age мускулатуры muscles Заболевание Disease — — Гладкая Smooth Помпе pompe Более позднее проявление later manifestation. — — мускулатура и респираторная скелетная мускулатура musculature and respiratory skeletal muscles

Эндогенный манноза-6-фосфатный рецептор (MPR) опосредует транспорт большинства рекомбинантных ферментов в лизосому. Существуют две комплементарных формы MPR: катион-независимый (CI-MPR) и катион-зависимый (CD-MPR). У любой из нокаутных форм лизосомальные ферменты не секретируются. Лизосомальные гидролазы синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме и перемещаются в цис-сеть Гольджи, где они ковалентно модифицируются путем добавления манноза-6фосфатных (M6P) групп. Образование этого маркера зависит от последовательного эффекта двух лизосомальных ферментов: UDP-N-ацетилглюкозамин-1-фосфотрансферазы (G1cNac-фосфотрансфераза) и N-ацетилглюкозамин-1-фосфодиэстер-α-N-ацетил-глюкозаминидазы (экспонирующий фермент). G1cNac-фосфотрансфераза катализирует перенос G1cNAc-1-фосфатного остатка от UDP-G1cNAc к C6положениям выбранных манноз в высокоманнозных олигосахаридах гидролаз. Затем экспонирующий фермент удаляет концевой G1cNAc, экспонируя сигнал распознавания M6P. В транс-сети Гольджи сиг- 4 041885 нал M6P обеспечивает сегрегацию лизосомальных гидролаз от всех других типов белков посредством селективного связывания с рецепторами M6P. Покрытые клатрином везикулы давали отпочковывание от транс-сети Гольджи и сливались с поздними эндосомами. При низком pH в поздней эндосоме гидролазы диссоциируются от рецепторов M6P, и пустые рецепторы возвращаются в аппарат Гольджи для следующих циклов транспорта.The endogenous mannose-6-phosphate receptor (MPR) mediates the transport of most recombinant enzymes into the lysosome. There are two complementary forms of MPR: cation-independent (CI-MPR) and cation-dependent (CD-MPR). In any of the knockout forms, lysosomal enzymes are not secreted. Lysosomal hydrolases are synthesized in the endoplasmic reticulum and translocated to the cis-Golgi network, where they are covalently modified by the addition of mannose-6-phosphate (M6P) groups. The formation of this marker depends on the sequential effect of two lysosomal enzymes: UDP-N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase (G1cNac-phosphotransferase) and N-acetylglucosamine-1-phosphodiester-α-N-acetylglucosaminidase (exhibiting enzyme). G1cNac phosphotransferase catalyzes the transfer of a G1cNAc-1-phosphate residue from UDP-G1cNAc to C6 positions of selected mannoses in high-mannose hydrolase oligosaccharides. The display enzyme then removes the terminal G1cNAc, exposing the M6P recognition signal. In the trans Golgi network, the M6P signal ensures the segregation of lysosomal hydrolases from all other types of proteins through selective binding to M6P receptors. Clathrin-coated vesicles budded from the trans-Golgi network and fused with late endosomes. At low pH in the late endosome, hydrolases dissociate from M6P receptors and empty receptors return to the Golgi apparatus for the next transport cycles.

За исключением β-глюкоцереброзидазы, которая доставляется посредством маннозного рецептора, рекомбинантные лизосомальные ферменты имеют M6P-гликозилирование и доставляются в лизосому главным образом посредством CI-MPR/IGF2R. Однако опосредованная гликозилированием/CI-MPR доставка заместительного фермента не достигает всех клинически релевантных тканей (табл. 2). Улучшение заместительной ферментной терапии акцентировали на улучшении доставки CI-MPR с помощью (i) усиления экспрессии на поверхности CI-MPR с использованием в2-агониста кленбутерола (Koeberl et al., Enhanced efficacy of enzyme replacement therapy in Pompe disease through mannose-6-phosphate receptor expression in skeletal muscle, 103(2) Mol. Genet. Metab. 107-12, 2011), (ii) повышения количества остатков M6P в ферменте (Zhu et al., Conjugation of mannose-6-phosphate-containing oligosaccharides to acid alphaglucosidase improves the clearance of glycogen in Pompe mice, 279(48) J. Biol. Chem. 50336-41, 2004) или (iii) слияния домена IGF-II с ферментом (Maga et al., Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid alpha-glucosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice, 288(3) J. Biol. Chem. 1428-38, 2013).With the exception of β-glucocerebrosidase, which is delivered via the mannose receptor, recombinant lysosomal enzymes have M6P glycosylation and are delivered to the lysosome primarily via CI-MPR/IGF2R. However, glycosylation/CI-MPR mediated replacement enzyme delivery does not reach all clinically relevant tissues (Table 2). Improved enzyme replacement therapy has focused on improving CI-MPR delivery by (i) enhancing CI-MPR surface expression using the β2-agonist clenbuterol (Koeberl et al., Enhanced efficacy of enzyme replacement therapy in Pompe disease through mannose-6-phosphate receptor expression in skeletal muscle, 103(2) Mol. Genet. Metab. 107-12, 2011), (ii) increasing the amount of M6P residues in the enzyme (Zhu et al., Conjugation of mannose-6-phosphate-containing oligosaccharides to acid alphaglucosidase improves the clearance of glycogen in Pompe mice, 279(48) J. Biol. Chem. 50336-41, 2004) or (iii) fusion of the IGF-II domain with the enzyme (Maga et al., Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid alpha-glucosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice, 288(3) J. Biol. Chem. 1428-38, 2013).

Большое число лизосомных болезней накопления неправильно лечат с помощью заместительной ферментной терапии или генной терапии в основном из-за плохого нацеливания заместительного фермента на соответствующие ткань или орган. Существует потребность в улучшенных методах заместительной ферментной терапии, которые усилят и обеспечат лучшее биораспределение в тканях и лизосомальное поглощение фермента. Заявители разработали улучшенную заместительную ферментную терапию с использованием контролируемой антителом CI-MPR-независимой доставки ферментов в лизосому целевых пораженных тканей.A large number of lysosomal storage diseases are not properly treated with enzyme replacement therapy or gene therapy, mainly due to poor targeting of the replacement enzyme to the appropriate tissue or organ. There is a need for improved methods of enzyme replacement therapy that will enhance and provide better tissue biodistribution and lysosomal uptake of the enzyme. Applicants have developed an improved enzyme replacement therapy using antibody-controlled CI-MPR-independent enzyme delivery to the lysosome of target diseased tissues.

Краткое описание изобретенияBrief description of the invention

Заявители выяснили, что заместительные ферменты могут быть эффективно доставлены в лизосому определенной целевой клетки в случае ассоциации с объектом, нацеленным на клеточную поверхность. Комбинацию этого фермента и нацеливающего объекта называют биотерапевтическим комплексом. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, т.е. биотерапевтическому комплексу, которая содержит фермент и антигенсвязывающий белок. Фермент ассоциируется с лизосомной болезнью накопления (LSD), и при этом антигенсвязывающий белок связывается с эффектором интернализации. Эффектор интернализации опосредует связывание с клеткой и поглощение в лизосомном компартменте.Applicants have found that replacement enzymes can be efficiently delivered to the lysosome of a particular target cell when associated with a cell surface target. The combination of this enzyme and the targeting entity is referred to as a biotherapeutic complex. Thus, in one aspect, the present invention relates to a composition, i. a biotherapeutic complex that contains an enzyme and an antigen-binding protein. The enzyme is associated with lysosomal storage disease (LSD) whereby the antigen-binding protein binds to an internalization effector. The internalization effector mediates cell binding and uptake into the lysosomal compartment.

В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой любой фермент из агалактозидазы, β-галактозидазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, активатора сапозина-C, церамидазы, сфингомиелиназы, β-гексозаминидазы, активатора GM2, GM3-синтазы, арилсульфатазы, активатора сфинголипида, α-идуронидазы, идуронидаза-2-сульфатазы, гепарин-К-сульфатазы, N-ацетил-аглюкозаминидазы, а-глюкозамид-К-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-б-сульфатазы, Nацетилгалактозамин-6-сульфат-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, β-глюкуронидазы и гиалуронидазы. В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой изозим, который обладает активностью, такой же или аналогичной активности любого одного или более из вышеперечисленных ферментов. В некоторых вариантах осуществления активность α-глюкозидазы может быть обеспечена изозимом, таким как сахараза-изомальтаза (SI), мальтаза-глюкоамилаза (MGAM), глюкозидаза II (GANAB) или нейтральная α-глюкозидаза (C GNAC). В других вариантах осуществления активность агалактозидазы A может быть обеспечена изозимом, таким как a-N-ацетилгалактозаминидаза, которая сконструирована с обеспечением GLA-активности.In some embodiments, the enzyme is any of agalactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, saposin-C activator, ceramidase, sphingomyelinase, β-hexosaminidase, GM2 activator, GM3 synthase, arylsulfatase, sphingolipid activator, α -iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparin-K-sulfatase, N-acetyl-aglucosaminidase, a-glucosamide-K-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-b-sulfatase, N-acetylgalactosamine-6-sulfate-sulfatase, N-acetylgalactosamine-4 -sulfatase, β-glucuronidase and hyaluronidase. In some embodiments, the enzyme is an isozyme that has the same or similar activity as any one or more of the above enzymes. In some embodiments, α-glucosidase activity can be provided by an isozyme such as sucrase-isomaltase (SI), maltase-glucoamylase (MGAM), glucosidase II (GANAB), or neutral α-glucosidase (C GNAC). In other embodiments, agalactosidase A activity can be provided by an isozyme, such as a-N-acetylgalactosaminidase, which is engineered to provide GLA activity.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой любой белок, который может связываться с одним или более эффекторами интернализации. В более конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой одну или более из слитой молекулы на основе рецептора, молекулы-ловушки, слитой молекулы на основе рецептора и Fc-фрагмента, антитела, Fab-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fd-фрагмента, Fv-фрагмента, одноцепочечной Fv (scFv) молекулы, dAb-фрагмента, выделенной области, определяющей комплементарность (CDR), пептида CDR3, конформационно затрудненного пептида FR3-CDR3-FR4, домен-специфичного антитела, однодоменного антитела, антитела с делецией домена, химерного антитела, антитела с привитой CDR, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела, моновалентного нанотела, бивалентного нанотела, иммунофармацевтического средства на основе модульного белка малого размера (SMIP), верблюжьего антитела (гомодимерное антитело с тяжелой цепью VHH), вариабельного домена IgNAR акулы и т.п. В одном конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с эффектором интернализации и ферментом.In some embodiments, an antigen binding protein is any protein that can bind to one or more internalization effectors. In more specific embodiments, the antigen binding protein is one or more of a receptor-based fusion molecule, a decoy molecule, a receptor-based fusion and an Fc fragment, an antibody, a Fab fragment, an F(ab')2 fragment, an Fd- fragment, Fv fragment, single chain Fv (scFv) molecule, dAb fragment, complementarity determining region (CDR), CDR3 peptide, conformationally constrained FR3-CDR3-FR4 peptide, domain-specific antibody, single-domain antibody, domain-deleted antibody , chimeric antibody, CDR-grafted antibody, diabody, triabody, tetrabody, minibody, nanobody, monovalent nanobody, bivalent nanobody, small modular protein (SMIP) immunopharmaceutical, camel antibody (VHH heavy chain homodimeric antibody), variable domain shark IgNAR, etc. In one specific embodiment, the antigen binding protein is a bispecific antibody that binds to an internalization effector and an enzyme.

В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой рецепторный белок или лиганд, который связывается с рецепторным белком, который расположен в, на или вблизиIn some embodiments, the internalization effector is a receptor protein or ligand that binds to a receptor protein that is located in, on, or near

- 5 041885 клеточной мембраны и может быть подвергнут эндоцитозу. В более конкретных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой один или более из CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, трансферринового рецептора, LDL-рецептора, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белка-2, подобного белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелинового рецептора (APLNR), PRLR (пролактиновый рецептор), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный как VIP17), IGF2R, H+ АТФазы вакуолярного типа, рецептора дифтерийного токсина, фолатного рецептора, глутаматных рецепторов, глутатионового рецептора, лептинового рецептора, скэвенджеррецептора, SCARA1-5, SCARB1-3 и CD36. В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к почке интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство транспортеров растворенных веществ 22 представитель 13), SLC5A2 (котранспортер натрия/глюкозы 2) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к мышцам интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор костного морфогенетического белка 1A), м-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфичная по отношению к мышцам), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNAlS (субъединица альфа-15 кальциевого канала Lтипа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа ACh-рецептора), CHRND (субъединица дельта AChрецептора), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, APLP2 или PRLR. В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой макрофаг-предпочтительный интернализатор, в том числе, например, VSIG4 (CRIG), MSR1 (CD204) и MMR1 (MCR1, CD206).- 5 041885 cell membrane and can be subjected to endocytosis. In more specific embodiments, the internalization effector is one or more of CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL-related protein 1 receptor, ASGR1, ASGR2 , amyloid precursor-like protein-2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), PRLR (prolactin receptor), MAL (myelin and lymphocytic protein, also known as VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase, diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptor, leptin receptor, scavenger receptor, SCARA1-5, SCARB1-3 and CD36. In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 representative 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In certain other embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein 1A receptor), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (48 receptor). , G-protein coupled), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNAlS (alpha-15 subunit calcium channel L-type), CACNG6 (gamma-6 subunit of the L-type calcium channel), SCN1B (beta-1 sodium channel subunit), CHRNA1 (alpha ACh receptor subunit), CHRND (delta ACh receptor subunit), LRRC14B (protein 14B containing leucine-rich repeat) and POPDC3 (Protein 3 containing the Popeye domain). In some embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, APLP2, or PRLR. In some embodiments, the internalization effector is a macrophage-preferred internalizer, including, for example, VSIG4 (CRIG), MSR1 (CD204) and MMR1 (MCR1, CD206).

Биотерапевтический комплекс может иметь любой из нескольких форматов. В некоторых вариантах осуществления фермент ковалентно связан с антигенсвязывающим белком. В одном конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий белок содержит полуантитело (т.е. с одной тяжелой цепью и одной легкой цепью), фермент ковалентно связан с Fc-доменом иммуноглобулина, и Fc-домен, который ковалентно связан с ферментом, ассоциируется с Fc-доменом антигенсвязывающего белка. В другом конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, и фермент ковалентно связан с C-концом тяжелой цепи (или легкой цепи) этого антитела. В следующем варианте осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, и фермент ковалентно связан с N-концом тяжелой цепи (или легкой цепи) этого антитела.The biotherapeutic complex may have any of several formats. In some embodiments, the enzyme is covalently linked to an antigen-binding protein. In one specific embodiment, the antigen-binding protein comprises a semi-antibody (i.e., one heavy chain and one light chain), the enzyme is covalently linked to the Fc domain of the immunoglobulin, and the Fc domain, which is covalently linked to the enzyme, is associated with the Fc domain of the antigen-binding protein. squirrel. In another specific embodiment, the antigen binding protein is an antibody and the enzyme is covalently linked to the C-terminus of the heavy chain (or light chain) of the antibody. In a further embodiment, the antigen binding protein is an antibody and the enzyme is covalently linked to the N-terminus of the heavy chain (or light chain) of the antibody.

В других вариантах осуществления фермент не связан ковалентно с антигенсвязывающим белком. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий белок связывается и с эффектором интернализации, и с ферментом. В конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с эффектором интернализации и ферментом.In other embodiments, the enzyme is not covalently linked to the antigen-binding protein. In one embodiment, the antigen binding protein binds to both the internalization effector and the enzyme. In a specific embodiment, the antigen binding protein is a bispecific antibody that binds to an internalization effector and an enzyme.

В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой GAA или изозим, обладающий активностью GAA, и эффектор интернализации представляет собой CD9, ITGA7, CD63, APLP2 или PRLR. В других вариантах осуществления фермент представляет собой GLA или изозим, обладающий GLA-активностью, и эффектор интернализации представляет собой CD9, ITGA7, CD63, APLP2 или PRLR.In some embodiments, the enzyme is GAA or an isozyme having GAA activity and the internalization effector is CD9, ITGA7, CD63, APLP2, or PRLR. In other embodiments, the enzyme is GLA or an isozyme having GLA activity and the internalization effector is CD9, ITGA7, CD63, APLP2, or PRLR.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего лизосомной болезнью накопления (LSD), предусматривающему стадию введения субъекту биотерапевтического комплекса (описанного выше), при этом биотерапевтический комплекс попадает в лизосому клетки субъекта и обеспечивает ферментативную активность (заместительный фермент), которая замещает ферментативную активность, ассоциированную с LSD (эндогенный фермент). LSD включают в себя сфинголипидоз, мукополисахаридоз и болезни накопления гликогена. Более конкретно, LSD, подлежащее лечению, представляет собой любое одно или более из заболеваний, приведенных в табл. 1, и заместительный фермент обладает активностью соответствующего фермента, приведенного в табл. 1. В конкретном варианте осуществления LSD представляет собой заболевание Помпе, и ассоциированный фермент представляет собой α-глюкозидазу (GAA). В другом конкретном варианте осуществления LSD представляет собой заболевание Фабри, и ассоциированный фермент представляет собой αгалактозидазу A (GLA). В другом конкретном примере LSD представляет собой дефицит лизосомальной кислой липазы (LAL-D), и ассоциированный фермент представляет собой лизосомальную кислую липазу (LIPA).In another aspect, the present invention relates to a method of treating a subject suffering from lysosomal storage disease (LSD), comprising the step of administering to the subject a biotherapeutic complex (described above), wherein the biotherapeutic complex enters the lysosome of the subject's cell and provides an enzymatic activity (substitute enzyme) that replaces enzymatic activity associated with LSD (endogenous enzyme). LSD includes sphingolipidosis, mucopolysaccharidosis, and glycogen storage diseases. More specifically, the LSD to be treated is any one or more of the diseases listed in Table. 1, and replacement enzyme has the activity of the corresponding enzyme shown in table. 1. In a specific embodiment, LSD is Pompe disease and the associated enzyme is α-glucosidase (GAA). In another specific embodiment, the LSD is Fabry disease and the associated enzyme is α-galactosidase A (GLA). In another specific example, LSD is lysosomal acid lipase (LAL-D) deficient and the associated enzyme is lysosomal acid lipase (LIPA).

В одном варианте осуществления заместительный фермент не индуцирует иммунологическую реакцию у субъекта. В некоторых случаях заместительный фермент представляет собой изозим. Например, в случае если эндогенный фермент представляет собой α-глюкозидазу, то изозим представляет собой другой белок, который обеспечивает такую же или аналогичную ферментативную активность, как и αглюкозидаза, такую как у сахаразы-изомальтазы (SI), мальтазы-глюкоамилазы (MGAM), глюкозидазы IIIn one embodiment, the replacement enzyme does not induce an immunological response in the subject. In some cases, the replacement enzyme is an isozyme. For example, if the endogenous enzyme is α-glucosidase, then the isozyme is another protein that provides the same or similar enzymatic activity as α-glucosidase, such as sucrase-isomaltase (SI), maltase-glucoamylase (MGAM), glucosidase II

- 6 041885 (GANAB) и нейтральной α-глюкозидазы (C GNAC). В случае если эндогенный фермент представляет собой α-галактозидазу A (GLA), то изозим представляет собой другой белок, который обеспечивает такую же или аналогичную ферментативную активность, как и α-глюкозидаза A, такую как у α-Nацетилгалактозаминидазы, которая сконструирована с обеспечением GLA-активности.- 6 041885 (GANAB) and neutral α-glucosidase (C GNAC). If the endogenous enzyme is α-galactosidase A (GLA), then the isozyme is another protein that provides the same or similar enzymatic activity as α-glucosidase A, such as α-Nacetylgalactosaminidase, which is engineered to provide GLA -activities.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу отбора или скрининга биотерапевтического комплекса, содержащего фермент и антигенсвязывающий белок, который эффективно замещает фермент у пациента при необходимости этого. В одном варианте осуществления биотерапевтический комплекс вводят в модельную систему, и модельную систему оценивают на предмет активности замещенного фермента. В одном варианте осуществления модельной системой является животное, у которого отсутствует экспрессия фермента и которое экспрессирует антиген, родственный антигенсвязывающему белку. В одном варианте осуществления животной моделью является мышь, которая экспрессирует гуманизированного родственника антигенсвязывающего белка и содержит нокаутный ген, который кодирует фермент.In one aspect, the present invention relates to a method for selecting or screening for a biotherapeutic complex containing an enzyme and an antigen binding protein that effectively replaces the enzyme in a patient when needed. In one embodiment, the biotherapeutic complex is introduced into the model system and the model system is evaluated for the activity of the substituted enzyme. In one embodiment, the model system is an animal that lacks enzyme expression and expresses an antigen related to an antigen binding protein. In one embodiment, the animal model is a mouse that expresses a humanized relative of an antigen binding protein and contains a knockout gene that encodes for an enzyme.

Графические материалыGraphic materials

На фиг. 1 схематически представлены биотерапевтические комплексы. На панели A изображен биотерапевтический комплекс, содержащий биспецифическое антитело (ii) и заместительный фермент (i). На панели В изображен слитый полипептид фермент-Fc (i), ассоциирующийся со специфичным в отношении эффектора интернализации полутелом (ii) с образованием биотерапевтического комплекса. На панели C изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с C-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели D изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с N-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели E изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с C-концом легкой цепи антитела к эффектору интернализации. На панели F изображен заместительный фермент (шестиугольник), ковалентно связанный с N-концом легкой цепи антитела к эффектору интернализации. Кривые линии на панелях C, D, E и F представляют линкеры.In FIG. 1 schematically represents biotherapeutic complexes. Panel A depicts a biotherapeutic complex containing a bispecific antibody (ii) and a replacement enzyme (i). Panel B depicts an enzyme-Fc fusion polypeptide (i) associated with an internalization effector-specific hemibody (ii) to form a biotherapeutic complex. Panel C depicts a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the C-terminus of the heavy chain of an anti-internalization effector antibody. Panel D depicts a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the N-terminus of the heavy chain of an anti-internalization effector antibody. Panel E depicts a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the C-terminus of the light chain of an anti-internalization effector antibody. Panel F shows a replacement enzyme (hexagon) covalently linked to the N-terminus of the light chain of an anti-internalization effector antibody. The curved lines in panels C, D, E and F represent linkers.

На фиг. 2 представлен вестерн-блоттинг в невосстанавливающих условиях антитела к hFc в супернатантах экстракта клеток CHO, экспрессирующих белок, связывающий эффектор интернализации (IEBP), или заместительный белок лизосомной болезни накопления (LSD-RP). Дорожку 1 загружали антителом к CD63 IgG4, дорожку 2 - выступом GAA-Fc, дорожку 3 -антителом к CD63 IgG4 GAA, и дорожку 4 GAA - антителом к CD63 IgG4.In FIG. 2 shows non-reducing Western blotting of anti-hFc antibody in CHO cell extract supernatants expressing internalization effector binding protein (IEBP) or lysosomal storage disease replacement protein (LSD-RP). Lane 1 was loaded with anti-CD63 IgG4, lane 2 with GAA-Fc overhang, lane 3 with anti-CD63 IgG4 GAA, and lane 4 with GAA with anti-CD63 IgG4.

На фиг. 3 изображены столбиковые графики, представляющие приблизительную GAA-активность, определяемую с использованием 4-метилумбеллиферил-а-глюкозидазы к флуоресцентному субстрату. По осям Y панели A и панели B представлены моли субстрата, гидролизованного на моль белка в час. По осям X представлен каждый слитый белок GAA.In FIG. 3 is a bar graph representing the approximate GAA activity as determined using 4-methylumbelliferyl-a-glucosidase against a fluorescent substrate. The y-axes of panel A and panel B are moles of substrate hydrolyzed per mole of protein per hour. X-axes represent each GAA fusion protein.

На фиг. 4 изображены линейные графики, представляющие приблизительную GAA-активность конструкций GAA, интернализованных клетками HEK. По осям Y панелей A и B представлены наномоли субстрата, гидролизованного на мг клеточного лизата в час. На X-осях указана повышающаяся концентрация конструкции GAA. На панели A квадраты () представляют антитело к CD63-GAA, вводимое в клетки HEK в присутствии 5 мМ манноза-6-фосфата (M6P), конкурента MPR-опосредованного лизосомального нацеливания, и круги (D) представляют антитело к CD63-GAA, вводимое в клетки HEK отдельно. На панели B круги (D) представляют антитело к CD63-GAA, вводимое в клетки HEK, квадраты () представляют мутантное антитело к CD63-GAA, которое не связывается с CD63, вводимое в клетки HEK, и треугольники (▲) представляют антитело к CD63-GAA, вводимое в клетки A CD63 HEK, которые не экспрессируют CD63.In FIG. 4 are line graphs representing the approximate GAA activity of GAA constructs internalized by HEK cells. The y-axes of panels A and B are nanomoles of substrate hydrolyzed per mg of cell lysate per hour. The X-axes indicate increasing concentration of the GAA construct. In panel A, squares () represent anti-CD63-GAA antibody administered to HEK cells in the presence of 5 mM mannose-6-phosphate (M6P), a competitor of MPR-mediated lysosomal targeting, and circles (D) represent anti-CD63-GAA antibody administered into HEK cells separately. In panel B, circles (D) represent anti-CD63-GAA antibody introduced into HEK cells, squares () represent mutant anti-CD63-GAA antibody that does not bind to CD63 introduced into HEK cells, and triangles (▲) represent anti-CD63 antibody -GAA introduced into CD63 HEK A cells that do not express CD63.

На фиг. 5 изображены линейные графики, представляющие приблизительную GAA-активность конструкций GAA, которые были интернализованны миобластами человека (панель A) или мыши (панель B). По осям Y панелей A и B представлены наномоли субстрата, гидролизованного на мг клеточного лизата в час. На X-осях указана повышающаяся концентрация конструкции GAA, либо антитела к CD63-GAA, либо mycGAA в присутствии или отсутствии M6P.In FIG. 5 are line graphs representing the approximate GAA activity of GAA constructs that have been internalized by human (panel A) or mouse (panel B) myoblasts. The y-axes of panels A and B are nanomoles of substrate hydrolyzed per mg of cell lysate per hour. The x-axes indicate the increasing concentration of the GAA construct, either anti-CD63-GAA or mycGAA in the presence or absence of M6P.

На фиг. 6 представлены уровни GAA (панель A) и содержание гликогена (панель B) трех клеточных линий заболевания Помпе (GM20089, GM20090 и GM20091) по сравнению с GAA неонатальных человеческих кожных фибробластов дикого типа (NHDF). На панели A показан вестерн-блоттинг антитела к hGAA, изображающий остаточный белок GAA в клеточных линиях заболевания Помпе и уровни белка GAA в NHDF дикого типа. На панели B представлен столбчатый график, изображающий содержание гликогена в микрограммах на миллион клеток после глюкозного голодания со снижением содержания цитоплазматического гликогена.In FIG. 6 shows GAA levels (panel A) and glycogen content (panel B) of three Pompe disease cell lines (GM20089, GM20090, and GM20091) compared to wild-type neonatal human dermal fibroblast (NHDF) GAA. Panel A shows a Western blot of an anti-hGAA antibody depicting residual GAA protein in Pompe disease cell lines and GAA protein levels in wild-type NHDF. Panel B is a bar graph depicting glycogen content in micrograms per million cells after glucose starvation with decreased cytoplasmic glycogen.

На фиг. 7 представлен в форме столбчатого графика риск дефектов накопления гликогена для клеточных линий заболевания Помпе GM20089 (панель A), GM20090 (панель B) и GM20091 (панель C) при 200 нМ антитела к CD63-GAA или 200 нМ myc-GAA. На оси Y представлено содержание гликогена в микрограммах на миллиграмм клеточного лизата.In FIG. 7 is a bar graph representation of the risk of defects in glycogen storage for Pompe disease cell lines GM20089 (panel A), GM20090 (panel B) and GM20091 (panel C) at 200 nM anti-CD63-GAA or 200 nM myc-GAA. The Y-axis represents the glycogen content in micrograms per milligram of cell lysate.

На фиг. 8 представлен вестерн-блоттинг в невосстанавливающих условиях антитела к hFc в супер- 7 041885 натантах экстракта клеток CHO, содержащих антитело к CD63-GLA (дорожка 1), выступ GLA-Fc (дорожка 2), GLA-антитело к CD63 (дорожка 3), выступ антитела к myc (дорожка 4), впадину антитело кIn FIG. 8 shows non-reducing Western blotting of anti-hFc antibody in super natants of CHO cell extract containing anti-CD63-GLA antibody (lane 1), GLA-Fc overhang (lane 2), anti-CD63 GLA antibody (lane 3) , anti-myc antibody protrusion (lane 4), anti-myc trough (lane 4),

CD63 (дорожка 5) и смесь супернатантов, содержащих выступ антитела к myc и впадину антитела кCD63 (lane 5) and a mixture of supernatants containing an anti-myc antibody ridge and an anti-myc trough.

CD63 (дорожка 6).CD63 (track 6).

На фиг. 9 представлена в форме столбчатого графика ферментативная активность GLA (на оси Y в наномоле субстрата, гидролизуемого на наномоль слитого белка в час) слитого белка, содержащего GLA, в том числе слева направо на оси X антитело к CD63-GLA (C-концевая конструкция тяжелой цепи), GLA-Fc, GLA-антитело к CD63 (N-концевая конструкция тяжелой цепи), GLA-myc-FLAG и GLA 6-his.In FIG. 9 is a bar graph representation of the GLA enzymatic activity (on the y-axis in nanomoles of substrate hydrolyzed per nanomoles of fusion protein per hour) of a GLA-containing fusion protein, including from left to right on the x-axis the anti-CD63-GLA antibody (C-terminal construct of heavy chains), GLA-Fc, anti-CD63 GLA (N-terminal heavy chain construct), GLA-myc-FLAG and GLA 6-his.

На фиг. 10 изображен линейный график, представляющий приблизительную GLA-активность, обнаруженную в экстрактах клеток HEK, содержащих конструкции GLA, которые были интернализованны клетками HEK. На оси Y показана GLA-активность в наномолях субстрата, гидролизованного на миллиграмм клеточного лизата в час. На X-осях указана повышающаяся концентрация конструкции GAA. Верхняя линия представляет GLA-антитело к CD63, средняя линия представляет GLA-myc плюс биспецифическое антитело к myc/антитело к CD63, и нижняя линия представляет GLA-myc.In FIG. 10 is a line graph representing the approximate GLA activity found in HEK cell extracts containing GLA constructs that were internalized by HEK cells. The y-axis shows GLA activity in nanomoles of substrate hydrolyzed per milligram of cell lysate per hour. The X-axes indicate the increasing concentration of the GAA construct. The top line represents anti-CD63 GLA antibody, the middle line represents GLA-myc plus anti-myc/anti-CD63 bispecific antibody, and the bottom line represents GLA-myc.

На фиг. 11 изображен линейный график, представляющий поглощение pHrodo-меченых белков во фракции с низким pH (т.е. лизосомальной фракции) клеток HEK (панель A), клеток PC-3 (панель B) и клеток HepG2 (панель 3). Круги (D) представляют pHrodo-меченное антитело к CD63, квадраты () представляют pHrodo-меченое антитело к APLP2, и треугольники (▲) представляют pHrodo-меченую GLA.In FIG. 11 is a line graph representing the uptake of pHrodo-labeled proteins in the low pH fraction (ie lysosomal fraction) of HEK cells (panel A), PC-3 cells (panel B), and HepG2 cells (panel 3). Circles (D) represent pHrodo-labeled anti-CD63 antibody, squares () represent pHrodo-labeled anti-APLP2 antibody, and triangles (▲) represent pHrodo-labeled GLA.

На фиг. 12 представлены вестерн-блоттинги в восстанавливающих условиях для клеточных лизатов, содержащих интернализованное антитело к CD63-GAA. Каждая дорожка представляет клеточных экстракты, полученные в определенные дни после интернализации белка. На панели A представлен вестерн-блот, зондированный антителом к GAA. Антитело к CD63-GAA размером 150 кДа визуализировано с помощью маркера ^ a. Лизосомальная активная форма GAA размером 76 кДа визуализирована с помощью маркера ^ b. На панели B представлен вестерн-блот, зондированный антителом к hIgG. Антитело к CD63-GAA размером 150 кДа визуализировано с помощью маркера c ^. Тяжелая цепь антитела (50 кДа) визуализирована с помощью маркера d ^. Легкая цепь антитела (23 кДа) визуализирована с помощью маркера e ^.In FIG. 12 shows reducing western blots of cell lysates containing internalized anti-CD63-GAA antibody. Each lane represents cell extracts obtained on specific days after protein internalization. Panel A shows a Western blot probed with an anti-GAA antibody. The 150 kDa anti-CD63-GAA antibody is visualized with the ^a marker. The 76 kDa lysosomal active form of GAA is visualized with the ^b marker. Panel B shows a Western blot probed with an anti-hIgG antibody. The 150 kDa anti-CD63-GAA antibody is visualized with the c^ marker. The antibody heavy chain (50 kDa) is visualized with the d^ marker. The antibody light chain (23 kDa) is visualized with the e^ marker.

На фиг. 13 представлен вестерн-блоттинг антитела к hGAA. Полоса 76 кДа представляет зрелую GAA. Дорожка 1 содержит печеночные экстракты от гуманизированной CD63 мыши, которая получила антитело к CD63-GAA, дорожка 2 - почку, дорожка 3 сердце, дорожка 4 - икроножную мышцу, дорожка 5 - квадрицепс, и дорожка 6 - диафрагму.In FIG. 13 shows a Western blot of an anti-hGAA antibody. The 76 kDa band represents mature GAA. Lane 1 contains liver extracts from a humanized CD63 mouse that received anti-CD63-GAA antibody, lane 2 kidney, lane 3 heart, lane 4 gastrocnemius, lane 5 quadriceps, and lane 6 diaphragm.

На фиг. 14 представлен вестерн-блоттинг антитела к hGAA на экстрактах ткани от мыши дикого типа (+/+) и гуманизированной CD63 (hu/hu) мыши через 24 ч после получения антитела к hCD63-GAA при 50 мг/кг. Визуализирована лизосомальная активная форма GAA размером 76 кДа. Дорожки 1 и 2 представляют соответственно экстракты сердца от мышей дикого типа и гуманизированных. Дорожки 3 и 4 представляют экстракты икроножной мышцы от мышей дикого типа и гуманизированных. Дорожки 5 и 6 представляют экстракты диафрагмы от мышей дикого типа и гуманизированных.In FIG. 14 shows a Western blot of an anti-hGAA antibody on tissue extracts from a wild-type (+/+) mouse and a humanized CD63 (hu/hu) mouse 24 hours after production of an anti-hCD63-GAA antibody at 50 mg/kg. The 76 kDa lysosomal active form of GAA was visualized. Lanes 1 and 2 represent heart extracts from wild-type and humanized mice, respectively. Lanes 3 and 4 represent gastrocnemius muscle extracts from wild-type and humanized mice. Lanes 5 and 6 represent diaphragm extracts from wild-type and humanized mice.

На фиг. 15 представлена гистограмма, изображающая относительное количество антитела к интегрину альфа 7, антитела к CD9 и антитела к дистрогликану, найденных в икроножной мышце, четырехглавой мышце, диафрагме, сердце, печени, почке и селезенке, нормализованное к уровням, найденным в печени.In FIG. 15 is a bar graph depicting the relative amounts of anti-alpha 7 integrin antibody, anti-CD9 antibody, and anti-dystroglycan antibody found in gastrocnemius, quadriceps, diaphragm, heart, liver, kidney, and spleen normalized to levels found in the liver.

На фиг. 16 представлена гистограмма, изображающая лизосомальное нацеливание pHrodo-меченых антител. На оси Y представлена нормализованная везикулярная флуоресценция. На оси X представлено каждое антитело слева направо: антитело к myc, антитело к CD63, антитело к дистрогликану, антитело к м-кадгерину, антитело к CD9 и антитело к интегрину альфа 7.In FIG. 16 is a bar graph depicting lysosomal targeting of pHrodo-labeled antibodies. The Y-axis represents normalized vesicular fluorescence. The x-axis represents each antibody from left to right: anti-myc, anti-CD63, anti-dystroglycan, anti-m-cadherin, anti-CD9, and anti-alfa-7.

На фиг. 17 представлен точечный график, изображающий уровни содержания гликогена, выраженные в микрограммах гликогена на миллиграмм ткани. Ткань показана на оси X слева направо как сердце, квадрицепс, икроножная мышца, диафрагма и трицепс. Круги (•) представляют уровни содержания гликогена у необработанных GAA нокаутных (KO) мышей, квадраты () представляют уровни содержания гликогена у мышей GAA KO, обработанных антителом к mCD63-GAA, треугольники вершиной вверх (▲) представляют уровни содержания гликогена у мышей GAA KO, обработанных hGAA, и треугольники вершиной вниз (▼) представляют уровни содержания гликогена у необработанных мышей дикого типа. Обработки осуществляли с помощью гидродинамической доставки конструкций ДНК.In FIG. 17 is a scatter plot depicting glycogen levels expressed as micrograms of glycogen per milligram of tissue. Tissue is shown on the x-axis from left to right as the heart, quadriceps, calf, diaphragm, and triceps. Circles (•) represent glycogen levels in untreated GAA knockout (KO) mice, squares () represent glycogen levels in anti-mCD63-GAA treated GAA KO mice, point-up triangles (▲) represent glycogen levels in GAA KO mice , treated with hGAA, and downward triangles (▼) represent glycogen levels in untreated wild-type mice. Treatments were performed using hydrodynamic delivery of DNA constructs.

На фиг. 18 представлен точечный график, изображающий уровни содержания гликогена, выраженные в микрограммах гликогена на миллиграмм ткани. Ткань показана на оси X слева направо как сердце, квадрицепс, икроножная мышца, диафрагма и трицепс. Круги (•) представляют уровни содержания гликогена у необработанных GAA нокаутных (KO) мышей, квадраты () представляют уровни содержания гликогена у мышей GAA KO, обработанных антителом к mCD63-GAA, треугольники вершиной вверх (▲) представляют уровни содержания гликогена у мышей GAA KO, обработанных антителом к hCD63GAA, и треугольники вершиной вниз (▼) представляют уровни содержания гликогена у необработанных мышей дикого типа. Обработки осуществляли с помощью гидродинамической доставки конструкцийIn FIG. 18 is a scatter plot depicting glycogen levels expressed as micrograms of glycogen per milligram of tissue. Tissue is shown on the x-axis from left to right as the heart, quadriceps, calf, diaphragm, and triceps. Circles (•) represent glycogen levels in untreated GAA knockout (KO) mice, squares () represent glycogen levels in anti-mCD63-GAA treated GAA KO mice, point-up triangles (▲) represent glycogen levels in GAA KO mice , treated with hCD63GAA antibody, and point-down triangles (▼) represent glycogen levels in untreated wild-type mice. Processing was carried out using hydrodynamic delivery of structures

- 8 041885- 8 041885

ДНК.DNA.

На фиг. 19 представлена гистограмма, изображающая липазную активность, выраженную в наномолях субстрата (4-метилумбеллиферилолеата), гидролизованного в час (ось Y) с помощью антитела к myc, нативной лизосомальной кислой липазы (LIPA), слитого белка антитело к myc-LIPA (C-концевое слияние тяжелой цепи) и LIPA-антитело к myc (N-концевое слияние тяжелой цепи).In FIG. 19 is a bar graph depicting lipase activity expressed as nanomoles of substrate (4-methylumbelliferyl oleate) hydrolysed per hour (y-axis) with anti-myc antibody, native lysosomal acid lipase (LIPA), anti-myc-LIPA antibody fusion protein (C-terminal heavy chain fusion) and anti-myc LIPA antibody (N-terminal heavy chain fusion).

На фиг. 20 представлен точечный график, изображающий уровни содержания гликогена, выраженные в микрограммах гликогена на миллиграмм ткани. Ткань изображена на оси X слева направо как сердце, трицепс, квадрицепс, икроножная мышца и диафрагма. Круги (•) представляют уровни содержания гликогена у необработанных GAA нокаутных (KO) мышей, квадраты () представляют уровни содержания гликогена у мышей GAA KO, обработанных антителом к mCD63-GAA, треугольники вершиной вверх (▲) представляют уровни содержания гликогена у мышей GAA KO, обработанных антителом к hCD63-GAA, и треугольники вершиной вниз (▼) представляют уровни содержания гликогена у необработанных мышей дикого типа. Обработки осуществляли с помощью гидродинамической доставки (HDD) конструкций ДНК.In FIG. 20 is a scatter plot depicting glycogen levels expressed as micrograms of glycogen per milligram of tissue. Tissue is depicted on the x-axis from left to right as the heart, triceps, quadriceps, calf, and diaphragm. Circles (•) represent glycogen levels in untreated GAA knockout (KO) mice, squares () represent glycogen levels in anti-mCD63-GAA treated GAA KO mice, point-up triangles (▲) represent glycogen levels in GAA KO mice , treated with hCD63-GAA antibody, and point-down triangles (▼) represent glycogen levels in untreated wild-type mice. Treatments were performed using hydrodynamic delivery (HDD) of DNA constructs.

Описание изобретенияDescription of the invention

Настоящее изобретение не ограничено описанными конкретными вариантами осуществления, композициями, способами и условиями эксперимента, поскольку такие варианты осуществления, композиции, способы и условия могут варьировать. Терминология, используемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.The present invention is not limited to the specific embodiments, compositions, methods, and experimental conditions described, as such embodiments, compositions, methods, and conditions may vary. The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to be limiting, as the scope of the present invention will only be limited by the appended claims.

Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, аналогичные описанным в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны лишь некоторые предпочтительные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте. Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, как это обычно понимает специалист в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.While any methods and materials similar to or equivalent to those described herein may be used in the practice or testing of the present invention, only a few preferred methods and materials are described herein. All publications cited in this document are incorporated herein by reference in their entirety. Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this document have the same meaning as is usually understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs.

Термин лизосомные болезни накопления включает любое нарушение, возникшее в результате дефекта в лизосомальной функции. На данный момент идентифицировали приблизительно 50 нарушений, наиболее известные из которых включают заболевание Тея-Сакса, заболевание Гоше и заболевание Ниманна-Пика. Патогенез этих заболеваний объясняется накоплением продуктов неполного разрушения в лизосоме, обычно из-за утраты белковой функции. Лизосомные болезни накопления вызываются утратой функции или истощением вариантов в белках, чья нормальная функция заключается в разрушении или координации разрушения лизосомального содержимого. Белки, связанные с лизосомными болезнями накопления, предусматривают ферменты, рецепторы и другие трансмембранные белки (например, NPC1), посттрансляционные модифицирующие белки (например, сульфатазу), белки переноса через мембрану, а также неферментативные кофакторы и другие растворимые белки (например, GM2 ганглиозидный активатор). Таким образом, лизосомные болезни накопления охватывают больше расстройств кроме тех нарушений, которые вызваны дефективными ферментами per se, и включают в себя любое нарушение, вызванное любым молекулярным дефектом. Таким образом, используемый в данном документе термин фермент охватывает те из других белков, которые ассоциированы с лизосомными болезнями накопления.The term lysosomal storage diseases includes any disorder resulting from a defect in lysosomal function. Approximately 50 disorders have been identified to date, the most prominent of which include Tay-Sachs disease, Gaucher disease, and Niemann-Pick disease. The pathogenesis of these diseases is explained by the accumulation of products of incomplete destruction in the lysosome, usually due to the loss of protein function. Lysosomal storage diseases are caused by loss of function or depletion of variants in proteins whose normal function is to break down or coordinate the breakdown of lysosomal contents. Proteins associated with lysosomal storage diseases include enzymes, receptors and other transmembrane proteins (eg, NPC1), post-translational modifying proteins (eg, sulfatase), membrane transport proteins, and nonenzymatic cofactors and other soluble proteins (eg, GM2 ganglioside activator). ). Thus, lysosomal storage diseases encompass more disorders than those caused by defective enzymes per se, and include any disorder caused by any molecular defect. Thus, as used herein, the term enzyme encompasses those of other proteins that are associated with lysosomal storage diseases.

Природа молекулярного повреждения влияет на тяжесть заболевания во многих случаях, т.е. полная утрата функции, как правило, ассоциирован с пренатальным или неонатальным проявлением и предусматривает тяжелые симптомы; частичная утрата функции ассоциирована со менее выраженным (относительно) и более поздним проявлением заболевания. Как правило, чтобы исправить метаболические дефекты в дефицитных клетках, требуется восстановить лишь небольшое процентное отношение активности. В табл. 1 перечисляются некоторые из более распространенных лизосомных болезней накопления и белки, ассоциированные с утратой функции при них. Как правило, лизосомные болезни накопления описаны у Desnick and Schuchman, 2012.The nature of the molecular damage affects the severity of the disease in many cases, ie. complete loss of function is usually associated with prenatal or neonatal manifestation and involves severe symptoms; partial loss of function is associated with a less pronounced (relatively) and later manifestation of the disease. Typically, only a small percentage of activity needs to be restored to correct metabolic defects in deficient cells. In table. Table 1 lists some of the more common lysosomal storage diseases and the proteins associated with loss of function in them. Generally, lysosomal storage diseases are described in Desnick and Schuchman, 2012.

Лизосомные болезни накопления могут быть систематизированы по типу продукта, который накапливается в дефективной лизосоме. Сфинголипидоз представляет собой класс заболеваний, которые поражают метаболизм сфинголипидов, которые являются липидами, содержащими жирные кислоты, соединенные с алифатическими аминоспиртами (обзор в S. Hakomori, Glycosphingolipids in Cellular Interaction, Differentiation, and Oncogenesis, 50 Annual Review of Biochemistry 733-764, July 1981). Накопленные продукты сфинголипидоза включают в себя ганглиозиды (например, заболевание Тея-Сакса), гликолипиды (например, заболевание Фабри) и глюкоцереброзиды (например, заболевание Гоше).Lysosomal storage diseases can be classified according to the type of product that accumulates in the defective lysosome. Sphingolipidosis is a class of diseases that affect the metabolism of sphingolipids, which are lipids containing fatty acids linked to aliphatic amino alcohols (reviewed in S. Hakomori, Glycosphingolipids in Cellular Interaction, Differentiation, and Oncogenesis, 50 Annual Review of Biochemistry 733-764, July 1981). Accumulated products of sphingolipidosis include gangliosides (eg, Tay-Sachs disease), glycolipids (eg, Fabry disease), and glucocerebrosides (eg, Gaucher disease).

Мукополисахаридоз представляет собой группу заболеваний, которые поражают метаболизм глюкозаминогликанов (GAGS или мукополисахаридов), которые представляют собой длинные неразветвленные цепи повторяющихся дисахаридов, которые помогают строить кость, хрящ, сухожилия, роговицу, кожу и соединительную ткань (обзор в Muenzer, Early initiation of enzyme replacement therapy for theMucopolysaccharidosis is a group of diseases that affect the metabolism of glucosaminoglycans (GAGS or mucopolysaccharides), which are long, unbranched chains of repeating disaccharides that help build bone, cartilage, tendons, cornea, skin, and connective tissue (reviewed in Muenzer, Early initiation of enzyme replacement therapy for the

- 9 041885 mucopolysaccharidoses, 111(2) Mol. Genet. Metab. 63-72 (Feb. 2014); Sasisekharan et al., Glycomics approach to structure-function relationships of glycosaminoglycans, 8(1) Ann. Rev. Biomed. Eng. 181-231 (Dec. 2014)). Накопленные продукты мукополисахаридоза включают в себя гепарана сульфат, дерматана сульфат, кератина сульфат, различные формы хондроитина сульфата и гиалуроновую кислоту. Например, синдром Моркио A типа обуславливается дефектом в лизосомальном ферменте галактоза-6-сульфатсульфатаза, который приводит к лизосомальному накоплению кератина сульфата и хондроитин-6сульфата.- 9 041885 mucopolysaccharidoses, 111(2) Mol. Genet. Metab. 63-72 (Feb. 2014); Sasisekharan et al., Glycomics approach to structure-function relationships of glycosaminoglycans, 8(1) Ann. Rev. Biomed. Eng. 181-231 (Dec. 2014)). The accumulated products of mucopolysaccharidosis include heparan sulfate, dermatan sulfate, keratin sulfate, various forms of chondroitin sulfate, and hyaluronic acid. For example, Morquio A syndrome type is caused by a defect in the lysosomal enzyme galactose-6-sulfate sulfatase, which results in lysosomal accumulation of keratin sulfate and chondroitin-6 sulfate.

Болезни накопления гликогена (также известные как гликогеноз) являются результатом неспособности клетки к метаболизму (к созданию или разрушению) гликогена. Метаболизм гликогена модерируется различными ферментами или другими белками, в том числе глюкоза-6-фосфатазой, кислой альфаглюкозидазой, линеаризующим гликоген ферментом, разветвляющим гликоген ферментом, мышечной гликогенфосфорилазой, печеночной гликогенфосфорилазой, мышечной фосфофруктокиназой, киназой фосфорилазы, переносчиком глюкозы, альдолазой А, бета-энолазой и гликогенсинтазой. Типичная болезнь лизосомального накопления/накопления гликогена представляет собой заболевание Помпе, при котором дефективная кислая альфа-глюкозидаза вызывает накопление гликогена в лизосомах. Симптомы включают гепатомегалию, мышечную слабость, сердечную недостаточность, а в случае инфантильного варианта смерть в возрасте до 2 лет (см. DiMauro and Spiegel, Progress and problems in muscle glycogenosis, 30(2) Acta Myol. 96-102 (Oct. 2011)).Glycogen storage diseases (also known as glycogenosis) are the result of a cell's inability to metabolize (make or break down) glycogen. Glycogen metabolism is moderated by various enzymes or other proteins, including glucose-6-phosphatase, acid alpha-glucosidase, glycogen linearizing enzyme, glycogen branching enzyme, muscle glycogen phosphorylase, hepatic glycogen phosphorylase, muscle phosphofructokinase, phosphorylase kinase, glucose transporter, aldolase A, beta-enolase and glycogen synthase. A typical lysosomal/glycogen storage disease is Pompe's disease, in which a defective acid alpha-glucosidase causes glycogen to accumulate in lysosomes. Symptoms include hepatomegaly, muscle weakness, heart failure, and in the case of the infantile variant, death before the age of 2 years (see DiMauro and Spiegel, Progress and problems in muscle glycogenosis, 30(2) Acta Myol. 96-102 (Oct. 2011) ).

Биотерапевтический комплекс включает в себя (i) один белок, который содержит более чем один функциональный домен, (ii) белок, который содержит более чем одну полипептидную цепь, и (iii) смесь более чем одного белка или более чем одного полипептида. Как правило, термин полипептид означает отдельную цепь аминокислот, связанных вместе посредством пептидных связей. Термин белок охватывает термин полипептид, но также включает более сложные структуры. То есть отдельный полипептид является белком, и при этом белок может содержать один или более полипептидов, ассоциированных в структуру более высокого порядка. Например, гемоглобин является белком, содержащим четыре полипептида: два альфа-глобиновых полипептида и два бета-глобиновых полипептида. Миоглобин также является белком, однако он содержит только один миоглобиновый полипептид.The biotherapeutic complex includes (i) a single protein that contains more than one functional domain, (ii) a protein that contains more than one polypeptide chain, and (iii) a mixture of more than one protein or more than one polypeptide. Typically, the term polypeptide means a single chain of amino acids linked together via peptide bonds. The term protein encompasses the term polypeptide but also includes more complex structures. That is, a single polypeptide is a protein, and the protein may contain one or more polypeptides associated in a higher order structure. For example, hemoglobin is a protein containing four polypeptides: two alpha-globin polypeptides and two beta-globin polypeptides. Myoglobin is also a protein, however it contains only one myoglobin polypeptide.

Биотерапевтический комплекс содержит один или более полипептидов и имеет по меньшей мере две функции. Одна из этих функций заключается в замещении дефективной активности белка, ассоциированной с лизосомной болезнью накопления. Другой из этих функций является связывание с эффектором интернализации. Таким образом, один полипептид, который обеспечивает активность лизосомального белка (например, ферментативную активность или активность переносчика; также известную как активность белка, связанного с лизосомальным заболеванием (LSD-RP)) и способность связываться с эффектором интернализации (также известную как активность белка, связывающего эффектор интернализации (IE-BP), представляет собой биотерапевтический комплекс. Также смесь белков, где один белок обладает функцией лизосомального белка, а другой белок обладает активностью связывания с эффектором интернализации, представляет собой биотерапевтический комплекс. На фиг. 1 изображены различные примеры биотерапевтических комплексов. В одном примере (фиг. 1, панель A) биотерапевтический комплекс содержит лизосомальный замещающий белок (LSD-RP, представленный шестиугольником) и биспецифическое антитело (1E-BP), которое связывается с лизосомальным замещающим белком (пунктирные линии) и эффектором интернализации (жирные линии). В данном случае одно плечо биспецифического антитела нековалентно связывается с LSD-RP, а другое плечо нековалентно связывается с эффектором интернализации с обеспечением тем самым интернализации замещающего белка (LSD-RP) в лизосому. В другом примере (панель В) биотерапевтический комплекс содержит один белок, содержащий два полипептида, при этом один полипептид обладает функцией LSD-RP, а другой обладает функцией IE-BP. В данном случае LSD-RP слит с Fc-доменом иммуноглобулина или константной областью тяжелой цепи, которая ассоциируется с Fc-доменом полуантитела к LSD-RP, с образованием бифункционального биотерапевтического комплекса. Вариант осуществления, изображенный на панели В, аналогичен таковому на панели A, за исключением того, что LSD-RP ковалентно присоединен к одному из полуантител, а не посредством взаимодействия антиген-антитело по вариабельному домену иммуноглобулина полуантитела.The biotherapeutic complex contains one or more polypeptides and has at least two functions. One of these functions is to replace the defective protein activity associated with lysosomal storage disease. Another of these functions is binding to the internalization effector. Thus, one polypeptide that confers lysosomal protein activity (e.g., enzymatic or transporter activity; also known as lysosomal disease-associated protein (LSD-RP) activity) and the ability to bind to an internalization effector (also known as protein-binding protein activity) the internalization effector (IE-BP) is a biotherapeutic complex.Also, a mixture of proteins, where one protein has the function of a lysosomal protein and the other protein has the activity of binding to the internalization effector, is a biotherapeutic complex.Figure 1 shows various examples of biotherapeutic complexes. In one example (Figure 1, panel A), the biotherapeutic complex contains a lysosomal replacement protein (LSD-RP, represented by a hexagon) and a bispecific antibody (1E-BP) that binds to the lysosomal replacement protein (dashed lines) and an internalization effector (solid lines). ). In this In this case, one arm of the bispecific antibody binds non-covalently to LSD-RP and the other arm binds non-covalently to the internalization effector, thereby allowing the replacement protein (LSD-RP) to be internalized into the lysosome. In another example (panel B), the biotherapeutic complex contains one protein containing two polypeptides, with one polypeptide having LSD-RP function and the other having IE-BP function. In this case, LSD-RP is fused to an immunoglobulin Fc domain or a heavy chain constant region that associates with the Fc domain of an anti-LSD-RP semi-antibody to form a bifunctional biotherapeutic complex. The embodiment depicted in panel B is similar to that in panel A, except that the LSD-RP is covalently attached to one of the semi-antibodies rather than through an antigen-antibody interaction at the immunoglobulin variable domain of the semi-antibody.

В других примерах биотерапевтический комплекс состоит из LSD-RP, ковалентно связанного (непосредственно или опосредованно через линкер) с IE-BP. В одном варианте осуществления LSD-RP присоединяется к C-концу молекулы иммуноглобулина (например, к тяжелой цепи или, в качестве альтернативы, к легкой цепи). В других вариантах осуществления LSD-RP присоединяется к N-концу молекулы иммуноглобулина (например, к тяжелой цепи или, в качестве альтернативы, к легкой цепи). В данных примерах молекулой иммуноглобулина является IE-BP.In other examples, the biotherapeutic complex consists of LSD-RP covalently linked (directly or indirectly via a linker) to IE-BP. In one embodiment, the LSD-RP is attached to the C-terminus of the immunoglobulin molecule (eg, the heavy chain or, alternatively, the light chain). In other embodiments, LSD-RP is attached to the N-terminus of an immunoglobulin molecule (eg, heavy chain, or alternatively light chain). In these examples, the immunoglobulin molecule is IE-BP.

Термины белок, связанный с лизосомной болезнью накопления или LSD-RP означают любой белок, ассоциированный с этиологией или физиологическим эффектом лизосомной болезни накопления. LSD-RP предусматривает активный фермент, транспортный белок, рецептор или другой белок, который является дефективным и который характеризуется как молекулярное повреждение, вызывающее заболевание. LSD-RP также предусматривает любой белок, который может обеспечивать аналогичную или дос- 10 041885 таточную биохимическую или физиологическую активность, которая заменяет или обходит молекулярное повреждение при заболевании. Например, термин изозим может использоваться как LSD-RP. Примеры белков, связанных с лизосомной болезнью накопления, включают в себя белки, приведенные в табл. 1 как вовлеченный фермент/белок, а также любой известный или открытый позже белок или другую молекулу, которые обходят молекулярный дефект при лизосомной болезни накопления.The terms protein associated with lysosomal storage disease or LSD-RP means any protein associated with the etiology or physiological effect of lysosomal storage disease. LSD-RP provides for an active enzyme, transport protein, receptor, or other protein that is defective and that is characterized as a disease-causing molecular lesion. LSD-RP also contemplates any protein that can provide a similar or sufficient biochemical or physiological activity that replaces or bypasses molecular damage in disease. For example, the term isozyme can be used as LSD-RP. Examples of proteins associated with lysosomal storage disease include the proteins shown in Table. 1 as an enzyme/protein involved, as well as any known or later discovered protein or other molecule that bypasses the molecular defect in lysosomal storage disease.

В случае заболевания Помпе, при котором молекулярным дефектом является дефект в αглюкозидазной активности, LSD-RP предусматривает альфа-глюкозидазу человека и изозимы, такие как другие альфа-глюкозидазы, сконструированная рекомбинантная альфа-глюкозидаза, другие глюкозидазы, рекомбинантные глюкозидазы, любой белок, сконструированный с возможностью гидролиза концевого нередуцирующего 1-4-связанного остатка альфа-глюкозы с высвобождением одной молекулы альфа-глюкозы, любой фермент EC 3.2.1.20, природные или рекомбинантные при низком pH углеводные гидролазы для гликогена или крахмалов, а также гликозилгидролазы, такие как сахараза-изомальтаза, мальтаза-глюкоамилаза, глюкозидаза II и нейтральная альфа-глюкозидаза,In the case of Pompe disease, in which the molecular defect is a defect in α-glucosidase activity, LSD-RP provides for human alpha-glucosidase and isozymes such as other alpha-glucosidases, engineered recombinant alpha-glucosidase, other glucosidases, recombinant glucosidases, any protein engineered with the ability to hydrolyze a terminal non-reducing 1-4-linked alpha-glucose residue to release one molecule of alpha-glucose, any EC 3.2.1.20 enzyme, natural or low pH recombinant carbohydrate hydrolases for glycogen or starches, and glycosyl hydrolases such as sucrase-isomaltase , maltase-glucoamylase, glucosidase II and neutral alpha-glucosidase,

Термин интернализующий эффектор включает белок, который способен интернализоваться в клетку, или который в противном случае участвует в ретроградном мембранном транспорте или способствует ему. В некоторых случаях интернализующий эффектор представляет собой белок, который подвергается трансцитозу; т.е. белок интернализуется с одной стороны клетки и транспортируется на другую сторону клетки (например, от апикальной к базальной). Во многих вариантах осуществления интернализующий эффекторный белок представляет собой белок, экспрессируемый на клеточной поверхности, или растворимый внеклеточный белок. Однако в настоящем изобретении также рассматриваются варианты осуществления, в которых интернализующий эффекторный белок экспрессируется во внутриклеточном компартменте, таком как эндосома, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосома и т. д. Например, белки, участвующие в ретроградном мембранном транспорте (например, пути от ранних/рециркулирующих эндосом к транс-сети Гольджи), могут служить в качестве интернализующих эффекторных белков в различных вариантах осуществления настоящего изобретения. В любом случае связывание IE-BP с интернализующим эффекторным белком приводит к тому, что весь биотерапевтический комплекс и любые связанные с ним молекулы (например, LSD-RP), также интернализуются в клетку. Как объясняется ниже, интернализующие эффекторные белки включают белки, которые непосредственно интернализуются в клетку, а также белки, которые опосредованно интернализуются в клетку.The term internalizing effector includes a protein that is capable of internalizing into a cell, or that otherwise participates in or facilitates retrograde membrane transport. In some cases, the internalizing effector is a protein that undergoes transcytosis; those. the protein is internalized on one side of the cell and transported to the other side of the cell (eg, from apical to basal). In many embodiments, the internalizing effector protein is a cell surface expressed protein or a soluble extracellular protein. However, the present invention also contemplates embodiments in which the internalizing effector protein is expressed in an intracellular compartment such as endosome, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, lysosome, etc. For example, proteins involved in retrograde membrane transport (e.g., pathways from early /recycling endosomes to the trans-Golgi network) can serve as internalizing effector proteins in various embodiments of the present invention. In either case, binding of the IE-BP to the internalizing effector protein results in the entire biotherapeutic complex and any molecules associated with it (eg, LSD-RP) also being internalized into the cell. As explained below, internalizing effector proteins include proteins that are directly internalized into a cell as well as proteins that are indirectly internalized into a cell.

Интернализующие эффекторные белки, которые непосредственно интернализуются в клетку, включают в себя связанные с мембраной молекулы по меньшей мере с одним внеклеточным доменом (например, трансмембранные белки, GPI-заякоренные белки и т. д.), которые подвергаются клеточной интернализации и предпочтительно обрабатываются посредством пути внутриклеточной деградации и/или рециркуляции. Конкретные неограничивающие примеры интернализующих эффекторных белков, которые непосредственно интернализуются в клетку, включают, например, CD63, MHC-I (например, HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, рецептор трансферрина, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный как VIP17), IGF2R, H+ АТФазу вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовые рецепторы, лептиновые рецепторы, скавенджер-рецепторы (например, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36) и т.д.Internalizing effector proteins that are directly internalized into a cell include membrane-bound molecules with at least one extracellular domain (e.g., transmembrane proteins, GPI-anchored proteins, etc.) that undergo cellular internalization and are preferably processed via the pathway intracellular degradation and/or recycling. Specific non-limiting examples of internalizing effector proteins that are directly internalized into a cell include, for example, CD63, MHC-I (e.g., HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor , LDL-related protein 1 receptor, ASGR1, ASGR2, amyloid precursor protein-2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), MAL (myelin and lymphocytic protein, also known as VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase , diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptors, leptin receptors, scavenger receptors (eg SCARA1-5, SCARB1-3, CD36), etc.

В определенных вариантах осуществления интернализующий эффектор представляет собой рецептор пролактина (PRLR). Было обнаружено, что PRLR представляет собой не только мишень для определенных терапевтических применений, но также является эффективным интернализующим эффекторным белком на основании его высокой скорости интернализации и возобновления. Потенциал PRLR как интернализующего эффекторного белка, например, проиллюстрирован в WO 2015/026907, где показано, inter alia, что антитела к PRLR эффективно интернализуются PRLR-экспрессирующими клетками in vitro.In certain embodiments, the implementation of the internalizing effector is a prolactin receptor (PRLR). It has been found that PRLR is not only a target for certain therapeutic applications, but is also an effective internalizing effector protein based on its high rate of internalization and renewal. The potential of PRLR as an internalizing effector protein is, for example, illustrated in WO 2015/026907, which shows, inter alia, that anti-PRLR antibodies are efficiently internalized by PRLR-expressing cells in vitro.

В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к почке интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство транспортеров растворенных веществ 22 представитель 13), SLC5A2 (котранспортер натрия/глюкозы 2) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к мышцам интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор костного морфогенетического белка 1A), м-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфичная по отношению к мышцам), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNAlS (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-б кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа ACh-рецептора), CHRND (субъединица дельта ACh-рецептора), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, ALPL2 или PPRLR.In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 representative 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In certain other embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein 1A receptor), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (48 receptor). , G-protein coupled), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNAlS (alpha-15 subunit L-type calcium channel), CACNG6 (gamma-b subunit of L-type calcium channel), SCN1B (beta-1 sodium channel subunit), CHRNA1 (alpha ACh receptor subunit), CHRND (delta ACh receptor subunit), LRRC14B ( protein 14B containing a leucine-rich repeat) and POPDC3 (protein 3 containing a Popeye domain). In some embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, or PPRLR.

В вариантах осуществления, в которых эффектор интернализации (IE) непосредственно интернали- 11 041885 зуется в клетку, IE-BP может представлять собой, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с IE, или лиганд или часть лиганда, которые специфически взаимодействуют с IE. Например, если IE представляет собой Kremen-1 или Kremen-2, то E-BP может содержать лиганд Kremen (например, DKK1) или его Kremen-связывающую часть или состоять из них. В качестве другого примера, если IE является рецепторной молекулой, такой как ASGR1, то IE может содержать лиганд, специфичный по отношению к рецептору (например, асиалоорозомукоида [ASOR] или бета-GalNAc), или его рецептор-связывающую часть или состоять из них.In embodiments in which the internalization effector (IE) is directly internalized into the cell, the IE-BP can be, for example, an antibody or an antigen-binding fragment of an antibody that specifically binds to the IE, or a ligand or part of a ligand that interacts specifically. with IE. For example, if the IE is Kremen-1 or Kremen-2, then the E-BP may contain or consist of a Kremen ligand (eg, DKK1) or a Kremen-binding portion thereof. As another example, if the IE is a receptor molecule such as ASGR1, then the IE may contain or consist of a receptor-specific ligand (eg, asialorosomucoid [ASOR] or beta-GalNAc) or a receptor-binding portion thereof.

Интернализующие эффекторные белки, которые опосредованно интернализуются в клетку, предусматривают белки и полипептиды, которые сами по себе не интернализуются, а интернализуются в клетку после связывания или иным образом ассоциации со вторым белком или полипептидом, который непосредственно интернализуется в клетку. Белки, которые опосредованно интернализуются в клетку, предусматривают, например, растворимые лиганды, которые способны связываться с интернализующей рецепторной молекулой, экспрессируемой на клеточной поверхности. Неограничивающим примером растворимого лиганда, который (опосредованно) интернализуется в клетку посредством его взаимодействия с интернализующей рецепторной молекулой, экспрессируемой на клеточной поверхности, является трансферрин. В вариантах осуществления, где IE представляет собой трансферрин (или другой опосредованно интернализуемый белок), связывание IE-BP с IE и взаимодействие IE с рецептором трансферрина (или другой интернализующей рецепторной молекулой, экспрессируемой на клеточной поверхности) приводит к тому, что весь IE-BP и любые молекулы, связанные с ним (например, LSD-RP), интернализуются в клетку одновременно с интернализацией IE и его партнера по связыванию.Internalizing effector proteins that are indirectly internalized into a cell include proteins and polypeptides that are not themselves internalized, but are internalized into the cell after binding to or otherwise associated with a second protein or polypeptide that is directly internalized into the cell. Proteins that are indirectly internalized into a cell include, for example, soluble ligands that are capable of binding to an internalizing receptor molecule expressed on the cell surface. A non-limiting example of a soluble ligand that is (indirectly) internalized into a cell through its interaction with an internalizing receptor molecule expressed on the cell surface is transferrin. In embodiments where the IE is a transferrin (or other indirectly internalized protein), binding of the IE-BP to the IE and interaction of the IE with the transferrin receptor (or other internalizing receptor molecule expressed on the cell surface) results in the entire IE-BP and any molecules associated with it (eg, LSD-RP) are internalized into the cell simultaneously with the internalization of IE and its binding partner.

В вариантах осуществления, в которых IE опосредованно интернализуется в клетку, IE-BP может представлять собой, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с IE, или рецептор или часть рецептора, которые специфически взаимодействуют с растворимым эффекторным белком. Например, если IE представляет собой цитокин, то IE-BP может содержать соответствующий рецептор цитокина или его лиганд-связывающую часть или состоять из них.In embodiments in which IE is indirectly internalized into a cell, the IE-BP can be, for example, an antibody or antigen-binding antibody fragment that specifically binds to IE, or a receptor or receptor portion that specifically interacts with a soluble effector protein. For example, if the IE is a cytokine, then the IE-BP may comprise or consist of the corresponding cytokine receptor or ligand-binding portion thereof.

Примером IE является CD63, который является представителем тетраспанинового суперсемейства белков клеточной поверхности, которые пересекают клеточную мембрану четыре раза. CD63 экспрессируется практически во всех тканях и, как полагают, вовлекается в формирование и стабилизацию комплексов передачи сигнала. CD63 локализуется в клеточной мембране, лизосомальной мембране и поздней эндосомальной мембране. Как известно, CD63 ассоциирует с интегринами и может быть вовлечен в эпителиальный-мезенхимальный переход. См. H. Maecker et al., The tetraspanin superfamily: molecular facilitators, 11(6) FASEB J. 428-42, May 1997, и M. Metzelaar et al., CD63 antigen. A novel lysosomal membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells, 266 J. Biol. Chem. 3239-3245, 1991.An example of IE is CD63, which is a member of the tetraspanin superfamily of cell surface proteins that cross the cell membrane four times. CD63 is expressed in almost all tissues and is believed to be involved in the formation and stabilization of signal transduction complexes. CD63 is localized to the cell membrane, lysosomal membrane, and late endosomal membrane. CD63 is known to associate with integrins and may be involved in the epithelial-mesenchymal transition. See H. Maecker et al., The tetraspanin superfamily: molecular facilitators, 11(6) FASEB J. 428-42, May 1997, and M. Metzelaar et al., CD63 antigen. A novel lysosomal membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells, 266 J. Biol. Chem. 3239-3245, 1991.

Другим примером IE является подобный предшественнику амилоида-бета (A4) белок 2 (APLP2), повсеместно экспрессируемый представитель семейства APP (белка-предшественника амилоида). APLP2 представляет собой связанный с мембраной белок, который, как известно, взаимодействует с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I (например, Kd). Он связывается с Kd на клеточной поверхности и интернализуется клатрин-зависимым образом вместе с Kd. См. Tuli et al., Mechanism for amyloid precursor-like protein 2 enhancement of major histocompatibility complex class I molecule degradation, 284 The Journal of Biological Chemistry 34296-34307 (2009).Another example of IE is the amyloid beta (A4) precursor-like protein 2 (APLP2), a ubiquitously expressed member of the APP (amyloid precursor protein) family. APLP2 is a membrane-associated protein known to interact with major histocompatibility complex (MHC) class I molecules (eg, Kd). It binds to Kd on the cell surface and is internalized in a clathrin-dependent manner along with Kd. See Tuli et al., Mechanism for amyloid precursor-like protein 2 enhancement of major histocompatibility complex class I molecule degradation, 284 The Journal of Biological Chemistry 34296-34307 (2009).

Другим примером IE является пролактиновый рецептор (PRLR). Пролактиновый рецептор является представителем семейства цитокиновых рецепторов I типа и при связывании с лигандом и последующей димеризации активирует тирозинкиназы Jak2, Fyn и Tec, фосфатазу SHP-2, фактор обмена гуаниновых нуклеотидов Vav и супрессор передачи сигнала SOCS, (см. Clevenger and Kline, Prolactin receptor signal transduction, 10(10) Lupus 706-18 (2001), реферат). Пролактиновый рецептор подвергается эндоцитотическому рециклингу и может быть найден в лизосомальных фракциях. См. Genty et al., Endocytosis and degradation of prolactin and its receptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactin receptor cDNA, 99(2) Mol. Cell Endocrinol. 221-8 (1994); и Ferland et al., The effect of chloroquine on lysosomal prolactin receptors in rat liver, 115(5) Endocrinology 1842-9 (1984).Another example of IE is the prolactin receptor (PRLR). The prolactin receptor is a member of the type I cytokine receptor family and, when bound to a ligand and subsequently dimerized, activates the tyrosine kinases Jak2, Fyn, and Tec, SHP-2 phosphatase, guanine nucleotide exchange factor Vav, and the signal transduction suppressor SOCS, (see Clevenger and Kline, Prolactin receptor signal transduction, 10(10) Lupus 706-18 (2001), abstract). The prolactin receptor undergoes endocytic recycling and can be found in lysosomal fractions. See Genty et al., Endocytosis and degradation of prolactin and its receptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactin receptor cDNA, 99(2) Mol. Cell Endocrinol. 221-8 (1994); and Ferland et al., The effect of chloroquine on lysosomal prolactin receptors in rat liver, 115(5) Endocrinology 1842-9 (1984).

Как используется в данном документе, иммунологическая реакция как правило, означает иммунологический ответ пациента на посторонний или чужой белок. Этот иммунологический ответ включает аллергическую реакцию и развитие антител, которые влияют на эффективность заместительного фермента. Некоторые пациенты не могут продуцировать какой-либо нефункционирующий белок, что делает таким образом заместительный фермент чужеродным белком. Например, повторная инъекция рекомбинантной GLA (rGLA) тем страдающим заболеванием Фабри пациентам, у которых отсутствует GLA, зачастую приводит к аллергической реакции. У других пациентов, как было показано, продуцирование антител к rGLA снижает эффективность заместительного фермента в лечении заболевания. См., например, Tajima et al. (Use of a Modified α-N-Acetylgalactosaminidase (NAGA) in the Development of Enzyme Replacement Therapy for Fabry Disease, 85(5) Am. J. Hum. Genet. 569-580 (2009)), в котором обсуждается применение модифицированной NAGA в качестве изозима для замещения GLA. Модифицированная NAGA не обладает иммунологической перекрестной реакционной активностью с GLA и не реагирует сAs used herein, an immunological response generally refers to a patient's immunological response to a foreign or foreign protein. This immunological response includes an allergic reaction and the development of antibodies that interfere with the effectiveness of the replacement enzyme. Some patients are unable to produce any non-functioning protein, thus making the replacement enzyme a foreign protein. For example, repeated injection of recombinant GLA (rGLA) into Fabry disease patients lacking GLA often results in an allergic reaction. In other patients, the production of anti-rGLA antibodies has been shown to reduce the effectiveness of the replacement enzyme in treating the disease. See, for example, Tajima et al. (Use of a Modified α-N-Acetylgalactosaminidase (NAGA) in the Development of Enzyme Replacement Therapy for Fabry Disease, 85(5) Am. J. Hum. Genet. 569-580 (2009)), which discusses the use of modified NAGA as an isozyme for GLA replacement. Modified NAGA does not have immunological cross-reactivity with GLA and does not react with

- 12 041885 сывороткой крови от пациента с заболеванием Фабри, регулярно получающего лечение рекомбинантной- 12 041885 serum from a patient with Fabry disease regularly receiving treatment with recombinant

GLA. Id, реферат.G.L.A. ID, abstract.

Термин белок означает любой аминокислотный полимер, имеющий более чем приблизительно 20 аминокислот, ковалентно связанных посредством амидных связей. Белки содержат одну или более аминокислотных полимерных цепей, как правило известных из уровня техники как полипептиды. Таким образом, полипептид может представлять собой белок, а белок может содержать несколько полипептидов с образованием одной функционирующей биомолекулы. В некоторых белках могут присутствовать дисульфидные мостики (т.е. между цистеиновыми остатками с образованием цистина). Такие ковалентные связи могут находиться в одной полипептидной цепи или между двумя отдельными полипептидными цепями. Например, дисульфидные мостики необходимы для надлежащей структуры и функции инсулина, иммуноглобулинов, протамина и т.п. Последний обзор по образованию дисульфидных связей см. в Oka and Bulleid, Forming disulfides in the endoplasmic reticulum, 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9 (2013).The term protein means any amino acid polymer having more than about 20 amino acids covalently linked through amide bonds. Proteins contain one or more amino acid polymer chains, generally known in the art as polypeptides. Thus, a polypeptide may be a protein, and a protein may contain several polypeptides to form one functioning biomolecule. Some proteins may have disulfide bridges (i.e. between cysteine residues to form cystine). Such covalent bonds may be within one polypeptide chain or between two separate polypeptide chains. For example, disulfide bridges are required for the proper structure and function of insulin, immunoglobulins, protamine, and the like. For a recent review on disulfide bond formation, see Oka and Bulleid, Forming disulfides in the endoplasmic reticulum, 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9 (2013).

Кроме образования дисульфидных связей белки могут подвергаться другим посттрансляционным модификациям. Такие модификации включают в себя липидизацию (например, миристоилирование, пальмитоилирование, фарнезоилирование, геранилгеранилирование и образование гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) якоря), алкилирование (например, метилирование), ацилирование, амидирование, гликозилирование (например, добавление гликозильных групп по аргинину, аспарагинину, цистеину, гидроксилизину, серину, треонину, тирозину и/или триптофану) и фосфорилирование (т.е. добавление фосфатной группы к серину, треонину, тирозину и/или гистидину). Для последнего обзора по посттрансляционной модификации белков, продуцируемых эукариотами, см. Mowen and David, Unconventional post-translational modifications in immunological signaling, 15(6) Nat Immunol 512-20 (2014); and Blixt and Westerlind, Arraying the post-translational glycoproteome (PTG), 18 Curr Opin Chem Biol. 62-9 (2014).In addition to the formation of disulfide bonds, proteins can undergo other post-translational modifications. Such modifications include lipidation (e.g., myristoylation, palmitoylation, farnesoylation, geranylgeranylation, and formation of a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor), alkylation (e.g., methylation), acylation, amidation, glycosylation (e.g., addition of glycosyl groups at arginine, asparagine, cysteine, hydroxylysine, serine, threonine, tyrosine and/or tryptophan) and phosphorylation (i.e. adding a phosphate group to serine, threonine, tyrosine and/or histidine). For a recent review on post-translational modification of proteins produced by eukaryotes, see Mowen and David, Unconventional post-translational modifications in immunological signaling, 15(6) Nat Immunol 512-20 (2014); and Blixt and Westerlind, Arraying the post-translational glycoproteome (PTG), 18 Curr Opin Chem Biol. 62-9 (2014).

Иммуноглобулины представляют собой белки с несколькими полипептидными цепями и экстенсивными посттрансляционными модификациями. Канонический иммуноглобулиновый белок (например, IgG) содержит четыре полипептидных цепи - две легких цепи и две тяжелых цепи. Каждая легкая цепь соединяется с одной тяжелой цепью посредством цистиновой дисульфидной связи, а две тяжелых цепи связываются друг с другом посредством двух цистиновых дисульфидных связей. Иммуноглобулины, продуцируемые в системах млекопитающих, также гликозилируются по различным остаткам (например, по аспарагиновым остаткам) с различными полисахаридами и могут отличаться у видов, что может влиять на антигенность терапевтических антител (см. Butler and Spearman, The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering, 30 Curr Opin Biotech 107-112 (2014)).Immunoglobulins are proteins with multiple polypeptide chains and extensive post-translational modifications. The canonical immunoglobulin protein (eg IgG) contains four polypeptide chains - two light chains and two heavy chains. Each light chain is linked to one heavy chain via a cystine disulfide bond, and the two heavy chains are linked to each other via two cystine disulfide bonds. Immunoglobulins produced in mammalian systems are also glycosylated at various residues (eg, aspartic residues) with different polysaccharides and may differ between species, which may affect the antigenicity of therapeutic antibodies (see Butler and Spearman, The choice of mammalian cell host and possibilities). for glycosylation engineering, 30 Curr Opin Biotech 107-112 (2014)).

Используемый в данном документе термин белок включает биотерапевтические белки, рекомбинантные белки, используемые в исследовании или терапии, белки-ловушки и другие Fc-слитые белки, химерные белки, антитела, моноклональные антитела, антитела человека, биспецифические антитела, фрагменты антител, нанотела, химеры рекомбинантных антител, цитокины, хемокины, пептидные гормоны и т.п. Белки могут быть получены с использованием рекомбинантных клеточных систем продуцирования, таких как система бакуловируса насекомых, дрожжевые системы (например, Pichia sp. ), системы млекопитающих (например, клетки CHO и клетки CHO-K1, подобные производным CHO). Последний обзор обсуждения биотерапевтических белков и их продуцирования см. в Ghaderi et al., Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012).As used herein, the term protein includes biotherapeutic proteins, recombinant proteins used in research or therapy, decoys and other Fc fusion proteins, chimeric proteins, antibodies, monoclonal antibodies, human antibodies, bispecific antibodies, antibody fragments, nanobodies, recombinant chimeras. antibodies, cytokines, chemokines, peptide hormones, and the like. Proteins can be produced using recombinant cellular production systems such as the insect baculovirus system, yeast systems (eg Pichia sp.), mammalian systems (eg CHO cells and CHO-K1 cells like CHO derivatives). For a recent review of the discussion of biotherapeutic proteins and their production, see Ghaderi et al., Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012).

Используемый в данном документе термин антитело включает молекулы иммуноглобулинов, содержащие четыре полипептидные цепи, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена - CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в данном документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен CL. VH- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDR тяжелой цепи могут быть сокращены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR легкой цепи могут быть сокращены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Термин высокоаффинное антитело относится к тем антителам, которые характеризуются аффинностью связывания со своей целью, составляющей по меньшей мере 10^-9 М, по меньшей мере 10^-10 М; по меньшей мере 10^-11 М или по меньшей мере 10^-12 М, что измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™, или определения аффинности в растворе посредством ELISA.As used herein, the term antibody includes immunoglobulin molecules containing four polypeptide chains, two heavy (H) chains, and two light (L) chains linked together by disulfide bonds. Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated herein as HCVR or VH) and a heavy chain constant region. The heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3. Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated herein as LCVR or VL) and a light chain constant region. The light chain constant region contains one CL domain. The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDRs) interspersed with more conserved regions called framework regions (FRs). Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs arranged from amino to carboxy in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (heavy chain CDRs can be abbreviated as HCDR1, HCDR2 and HCDR3 Light chain CDRs can be abbreviated as LCDR1, LCDR2 and LCDR3 The term high affinity antibody refers to those antibodies that have a binding affinity for their target of at least 10 ^-9 M, at least 10 ^-10 M; at least 10 ^-11 M or at least 10 ^-12 M as measured by surface plasmon resonance, for example BIACORE™, or determination of affinity in solution by ELISA.

Фраза биспецифическое антитело включает в себя антитело, способное селективно связывать два или более эпитопов. Как правило, биспецифические антитела содержат две различные тяжелые цепи, при этом каждая тяжелая цепь специфически связывается с отдельным эпитопом - либо на двух разных моле- 13 041885 кулах (например, антигенах), либо на одной и той же молекуле (например, на одном и том же антигене). Если биспецифическое антитело способно селективно связываться с двумя разными эпитопами (первым эпитопом и вторым эпитопом), то аффинность первой тяжелой цепи по отношению к первому эпитопу, как правило, будет по меньшей мере на один, два, или три, или четыре порядка ниже аффинности первой тяжелой цепи по отношению ко второму эпитопу, и наоборот. Эпитопы, распознаваемые биспецифическим антителом, могут находиться на одной и той же или на другой цели (например, на одном и том же или на другом белке). Биспецифические антитела могут быть получены, например, путем объединения тяжелых цепей, которые распознают разные эпитопы одного и того же антигена. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие те вариабельные последовательности тяжелой цепи, которые распознают разные эпитопы одного и того же антигена, могут быть слиты с последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующими разные константные области тяжелой цепи, и такие последовательности могут быть экспрессированы в клетке, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина. Типичное биспецифическое антитело имеет две тяжелых цепи, каждая из которых содержит три CDR тяжелой цепи, а затем (от N-конца к C-концу) домен CH1, шарнир, домен CH2 и домен CH3, и легкая цепь иммуноглобулина, либо та, которая не обеспечивает антигенсвязывающую специфичность, однако может ассоциироваться с каждой тяжелой цепью, либо та, которая может ассоциироваться с каждой тяжелой цепью и может связываться с одним или более эпитопами, связанными с антигенсвязывающими областями тяжелой цепи, либо та, которая может ассоциироваться с каждой тяжелой цепью и обеспечивать связывание или одной, или обеих тяжелых цепей с одним или обоими эпитопами.The phrase bispecific antibody includes an antibody capable of selectively binding two or more epitopes. Typically, bispecific antibodies contain two different heavy chains, with each heavy chain specifically binding to a different epitope, either on two different molecules (eg, antigens) or on the same molecule (eg, on the same and the same antigen). If a bispecific antibody is capable of selectively binding to two different epitopes (a first epitope and a second epitope), then the affinity of the first heavy chain for the first epitope will typically be at least one, two, or three, or four orders of magnitude lower than the affinity of the first heavy chain in relation to the second epitope, and vice versa. Epitopes recognized by a bispecific antibody may be on the same or different target (eg, on the same or different protein). Bispecific antibodies can be obtained, for example, by combining heavy chains that recognize different epitopes of the same antigen. For example, nucleic acid sequences encoding those heavy chain variable sequences that recognize different epitopes of the same antigen can be fused to nucleic acid sequences encoding different heavy chain constant regions, and such sequences can be expressed in a cell that expresses light immunoglobulin chain. A typical bispecific antibody has two heavy chains, each containing three heavy chain CDRs, followed (from N-terminus to C-terminus) by a CH1 domain, a hinge, a CH2 domain, and a CH3 domain, and an immunoglobulin light chain, or one that does not provides antigen-binding specificity, but may be associated with each heavy chain, either one that may be associated with each heavy chain and may bind to one or more epitopes associated with antigen-binding regions of the heavy chain, or one that may be associated with each heavy chain and provide linking either one or both heavy chains to one or both epitopes.

Фраза тяжелая цепь или тяжелая цепь иммуноглобулина включает последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает вариабельный домен тяжелой цепи. Вариабельные домены тяжелой цепи включают в себя три CDR тяжелой цепи и четыре области FR, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают в себя CDR, CDR и FR, а также их комбинации. Типичная тяжелая цепь после вариабельного домена (от Nконца к C-концу) имеет домен CH1, шарнир, домен CH2 и домен CH3. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает в себя фрагмент, который способен специфически распознавать антиген (например, распознавать антиген с KD в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазонах), который способен экспрессироваться и секретироваться клеткой и который содержит по меньшей мере одну CDR.The phrase "heavy chain" or "immunoglobulin heavy chain" includes the sequence of an immunoglobulin heavy chain constant region from any organism and, unless otherwise indicated, includes a heavy chain variable domain. Heavy chain variable domains include three heavy chain CDRs and four FR regions, unless otherwise noted. Heavy chain fragments include CDR, CDR and FR, as well as combinations thereof. A typical heavy chain after the variable domain (N-terminal to C-terminal) has a CH1 domain, a hinge, a CH2 domain, and a CH3 domain. A functional heavy chain fragment includes a fragment that is capable of specifically recognizing an antigen (eg, recognizing an antigen with a KD in the micromolar, nanomolar, or picomolar ranges), that is capable of being expressed and secreted by the cell, and that contains at least one CDR.

Фраза легкая цепь включает последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина из любого организма и, если не указано иное, включает каппа и лямбда легкие цепи человека. Вариабельные (VL) домены легкой цепи, как правило, включают в себя три CDR легкой цепи и четыре каркасных (FR) области, если не указано иное. Как правило, легкая цепь полной длины включает в себя, от амино-конца к карбоксильному концу, домен VL, который включает в себя FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3CDR3-FR4 и константный домен легкой цепи. Легкие цепи, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, предусматривают например, те, которые не связываются селективно либо с первым, либо со вторым антигеном, селективно связываемым антигенсвязывающим белком. Подходящие легкие цепи предусматривают цепи, которые могут быть идентифицированы путем скрининга по наиболее часто используемым легким цепям в имеющихся библиотеках антител (библиотеках WET или in silico), при этом легкие цепи существенно не влияют на аффинность и/или селективность антигенсвязывающих доменов антигенсвязывающих белков. Подходящие легкие цепи предусматривают цепи, которые могут связываться с одним или обоими эпитопами, которые связываются антигенсвязывающими областями антигенсвязывающего белка.The phrase light chain includes the immunoglobulin light chain constant region sequence from any organism and, unless otherwise indicated, includes human kappa and lambda light chains. Light chain variable (VL) domains typically include three light chain CDRs and four framework (FR) regions, unless otherwise noted. Typically, a full length light chain includes, from the amino end to the carboxyl end, a VL domain that includes FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3CDR3-FR4 and a light chain constant domain. The light chains that can be used according to the present invention include, for example, those that do not selectively bind to either the first or second antigen selectively bound by the antigen binding protein. Suitable light chains include chains that can be identified by screening against the most commonly used light chains in available antibody libraries (WET or in silico libraries) where the light chains do not significantly affect the affinity and/or selectivity of the antigen-binding domains of the antigen-binding proteins. Suitable light chains include chains that can bind to one or both of the epitopes that are bound by the antigen-binding regions of the antigen-binding protein.

Фраза вариабельный домен включает аминокислотную последовательность легкой или тяжелой цепей иммуноглобулина (модифицированных, если требуется), которые содержат следующие аминокислотные области, в последовательности от N-конца к C-концу (если не указано иное): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термин вариабельный домен включает аминокислотную последовательность, способную сворачиваться в канонический домен (VH или VL), имеющий структуру двойных бетаскладок, при этом бета-складки соединяются дисульфидной связью между остатками первой бетаскладки и второй бета-складки.The phrase variable domain includes the amino acid sequence of immunoglobulin light or heavy chains (modified if required) that contain the following amino acid regions, in sequence from N-terminus to C-terminus (unless otherwise indicated): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3 , CDR3, FR4. The term variable domain includes an amino acid sequence capable of folding into a canonical domain (VH or VL) having a double beta-fold structure, with the beta-folds being connected by a disulfide bond between the residues of the first beta-fold and the second beta-fold.

Фраза область, определяющая комплементарность или термин CDR включают аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты генов иммуноглобулина организма, которая в норме (т.е. у животного дикого типа) находится между двух каркасных областей в вариабельной области легкой или тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина (например, антитела или Tклеточного рецептора). CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевой линии, или перегруппированной, или неперегруппированной последовательностью, и, например, наивной или зрелой B-клеткой или T-клеткой. В некоторых случая (например, для CDR3) CDR могут кодироваться двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевой линии), которые не являются смежными (например, в неперегруппированной последовательности нуклеиновой кислоты), но являются смежными в В-клеточной последовательности нуклеиновой кислоты, например, как результат сплайсинга или соединения последовательностей (например, рекомбинация V-D-J с образованием CDR3 тяжелой цепи).The phrase complementarity determining region or the term CDR includes the amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence of the immunoglobulin genes of an organism that normally (i.e., in a wild-type animal) is located between two framework regions in the variable region of the light or heavy chain of an immunoglobulin molecule (e.g., antibody or T cell receptor). The CDR may be encoded by, for example, a germline sequence, or a rearranged or non-rearranged sequence, and, for example, a naive or mature B cell or T cell. In some cases (eg, for CDR3), CDRs may be encoded by two or more sequences (eg, germline sequences) that are not contiguous (eg, in a non-rearranged nucleic acid sequence) but are contiguous in a B-cell nucleic acid sequence, for example , as a result of splicing or joining sequences (eg, V-D-J recombination to form heavy chain CDR3).

Термин фрагмент антитела относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которыеThe term antibody fragment refers to one or more antibody fragments that

- 14 041885 сохраняют способность специфичного связывания с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином фрагмент антитела, включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) dAbфрагмент (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), который состоит из домена VH, (vi) выделенную CDR и (vii) scFv, который состоит из двух доменов Fv-фрагмента, VL и VH, связанных синтетическим линкером с образованием одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул. Другие формы одноцепочечных антител, таких как диатела, также охватываются термином антитело (см., например, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).- 14 041885 retain the ability to specific binding to the antigen. Examples of binding fragments encompassed by the term antibody fragment include (i) Fab fragment, a monovalent fragment consisting of VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) an F(ab')2 fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) Fd fragment consisting of VH and CH1 domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one antibody arm, (v) a dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546) which consists of a VH domain, (vi) an isolated CDR and ( vii) scFv, which consists of two Fv fragment domains, VL and VH, linked by a synthetic linker to form a single protein chain, in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules. Other forms of single chain antibodies, such as diabodies, are also covered by the term antibody (see, for example, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Фраза Fc-содержащий белок включает антитела, биспецифические антитела, иммуноадгезины и другие связывающие белки, которые содержат по меньшей мере функциональную часть областей CH2 и CH3 иммуноглобулина. Функциональная часть относится к CH2 и CH3 области, которая может связываться с Fc-рецептором (например, FcyR или FcRn, т.е. неонатальным Fc-рецептором) и/или которая может участвовать в активации комплемента. Если области CH2 и CH3 содержат делеции, замены, и/или вставки, или другие модификации, которые делают ее неспособной связываться с каким-либо Fcрецепторам, а также неспособной активировать комплемент, то области CH2 и CH3 не являются функциональными.The phrase Fc-containing protein includes antibodies, bispecific antibodies, immunoadhesins, and other binding proteins that contain at least a functional portion of the CH2 and CH3 regions of an immunoglobulin. The functional part refers to the CH2 and CH3 region that can bind to an Fc receptor (eg FcyR or FcRn, ie neonatal Fc receptor) and/or that can be involved in complement activation. If the CH2 and CH3 regions contain deletions, substitutions, and/or insertions, or other modifications that make it unable to bind to any Fc receptors, and also unable to activate complement, then the CH2 and CH3 regions are not functional.

Fc-содержащий белок может содержать модификации в доменах иммуноглобулина, в том числе если модификации нарушают одну или более из эффекторных функций связывающего белка (например, модификации, которые нарушают связывание FcyR, связывание FcRn и, таким образом, время полужизни и/или активность CDC). Такие модификации предусматривают без ограничения следующие модификации и их комбинации, согласно нумерации EU константной области иммуноглобулина: 238, 239, 248,An Fc-containing protein may contain modifications in immunoglobulin domains, including if the modifications disrupt one or more of the effector functions of the binding protein (e.g., modifications that disrupt FcyR binding, FcRn binding and thus half-life and/or CDC activity) . Such modifications include, without limitation, the following modifications and combinations thereof, according to the EU numbering of the immunoglobulin constant region: 238, 239, 248,

249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292,249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292,

293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328,293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328,

329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376,329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376,

378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 и 439.378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 and 439.

Например, и без ограничения, связывающий белок представляет собой Fc-содержащий белок, демонстрирующий увеличенное время полужизни в сыворотке крови (по сравнению с таким же Fcсодержащим белком без указанной модификации(-й)) и имеющий модификацию в положении 250 (например, E или Q); 250 и 428 (например, L или F); 252 (например, L/Y/F/W или T), 254 (например, S или T) и 256 (например, S/R/Q/E/D или T); или модификацию в 428 и/или 433 (например, L/R/SI/P/Q или K) и/или 434 (например, H/F или Y); или модификацию в 250 и/или 428; или модификацию в 307 или 308 (например, 308F, V308F) и 434. В другом примере модификация может предусматривать модификацию 428L (например, M428L) и 434S (например, N434s); модификацию 428L, 2591 (например, V259I) и 308F (например, V308F); модификацию 433K (например, H433K) и 434 (например, 434Y); модификацию 252, 254 и 256 (например, 252Y, 254T и 256E); модификацию 250Q и 428L (например, T250Q и M428L); модификацию 307 и/или 308 (например, 308F или 308P).For example, and without limitation, a binding protein is an Fc-containing protein that exhibits an increased serum half-life (compared to the same Fc-containing protein without the specified modification(s)) and has a modification at position 250 (e.g., E or Q ); 250 and 428 (for example, L or F); 252 (eg L/Y/F/W or T), 254 (eg S or T) and 256 (eg S/R/Q/E/D or T); or a modification at 428 and/or 433 (eg L/R/SI/P/Q or K) and/or 434 (eg H/F or Y); or modification at 250 and/or 428; or a modification to 307 or 308 (eg, 308F, V308F) and 434. In another example, the modification may include modification to 428L (eg, M428L) and 434S (eg, N434s); modification 428L, 2591 (for example, V259I) and 308F (for example, V308F); modification 433K (for example, H433K) and 434 (for example, 434Y); modification 252, 254 and 256 (for example, 252Y, 254T and 256E); modification 250Q and 428L (for example, T250Q and M428L); modification 307 and/or 308 (for example, 308F or 308P).

Используемый в данном документе термин антигенсвязывающий белок относится к полипептиду или белку (один или более полипептидов, объединенных в функциональную единицу), который специфически распознает эпитоп на антигене, таком как специфичный по отношению к клетке антиген и/или целевой антиген в соответствии с настоящим изобретением. Антигенсвязывающий белок может быть полиспецифичным. Термин полиспецифичный в отношении антигенсвязывающего белка означает, что белок распознает разные эпитопы, либо на одном и том же антигене, либо на разных антигенах. Полиспецифичная антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению может представлять собой один многофункциональный полипептид или может представлять собой мультимерный комплекс из двух или более полипептидов, ковалентно или нековалентно связанных друг с другом. Термин антигенсвязывающий белок включает антитела или их фрагменты по настоящему изобретению, которые могут быть связаны или совместно экспрессированы с другой функциональной молекулой, например другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического сочетания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или прочего) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как белок или его фрагмент, с получением биспецифической или полиспецифической антигенсвязывающей молекулы со второй специфичностью связывания.As used herein, the term antigen-binding protein refers to a polypeptide or protein (one or more polypeptides combined into a functional unit) that specifically recognizes an epitope on an antigen, such as a cell-specific antigen and/or target antigen in accordance with the present invention. The antigen binding protein may be polyspecific. The term polyspecific for an antigen-binding protein means that the protein recognizes different epitopes, either on the same antigen or on different antigens. The multispecific antigen-binding molecule of the present invention may be a single multifunctional polypeptide or may be a multimeric complex of two or more polypeptides covalently or non-covalently linked to each other. The term antigen-binding protein includes antibodies or fragments thereof of the present invention, which can be linked or co-expressed with another functional molecule, such as another peptide or protein. For example, an antibody or fragment thereof may be operably linked (eg, by chemical coupling, genetic fusion, non-covalent association, or the like) to one or more other molecular entities, such as a protein or fragment thereof, to produce a bispecific or polyspecific antigen-binding molecule with a second specificity. binding.

Используемый в данном документе термин эпитоп относится к части антигена, которая распознается полиспецифичным антигенсвязывающим полипептидом. Один антиген (такой как антигенный полипептид) может иметь более чем один эпитоп. Эпитопы можно определить как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы, как правило, составляют подгруппу структуральных эпитопов и определяются как такие остатки, которые непосредственно обусловливают аффинность взаимодействия между антигенсвязывающим полипептидом и антигеном. Также эпитопы могут быть конформационными, т.е. состоять из нелинейных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могутAs used herein, the term epitope refers to the portion of an antigen that is recognized by a multispecific antigen-binding polypeptide. One antigen (such as an antigenic polypeptide) may have more than one epitope. Epitopes can be defined as structural or functional. Functional epitopes generally constitute a subgroup of structural epitopes and are defined as those residues that directly confer affinity for an interaction between an antigen-binding polypeptide and an antigen. Epitopes can also be conformational, i.e. consist of non-linear amino acids. In certain embodiments, epitopes may

- 15 041885 включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные структуры молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи сахаров, фосфорильные группы или сульфонильные группы, и в определенных вариантах осуществления могут иметь специфические характеристики трехмерных структур и/или специфические характеристики заряда. Эпитопы, образованные непрерывными аминокислотами, как правило, сохраняются при воздействии денатурирующими растворителями, в то время как эпитопы, образованные с помощью укладки в третичную структуру, утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями.- 15 041885 include determinants that are reactive surface structures of molecules such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl groups, or sulfonyl groups, and in certain embodiments, may have specific three-dimensional structure characteristics and/or specific charge characteristics. Epitopes formed by continuous amino acids are generally retained upon exposure to denaturing solvents, while epitopes formed by folding into a tertiary structure are lost upon treatment with denaturing solvents.

Термин домен относится к любой части белка или полипептида, обладающего конкретной функцией или структурой. Предпочтительно домены по настоящему изобретению связываются со специфичными по отношению к клетке или целевыми антигенами. Как используется в данном документе, специфичный по отношению к клетке антиген или целевые антигенсвязывающие домены и т.п. предусматривают какой-либо полипептид или гликопротеин, встречающиеся в природе, полученные ферментативным путем, синтетические или полученные с помощью методик генной инженерии, которые специфически связывают антиген.The term domain refers to any portion of a protein or polypeptide that has a specific function or structure. Preferably, the domains of the present invention bind to cell-specific or target antigens. As used herein, a cell-specific antigen or target antigen-binding domains, and the like. provide for any polypeptide or glycoprotein, naturally occurring, enzymatically produced, synthetically or obtained by genetic engineering techniques, that specifically binds an antigen.

Термины полутело или полуантитело, которые используются взаимозаменяемо, относятся к половине антитела, которая фактически содержит одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Тяжелые цепи антитела могут формировать димеры так, что тяжелая цепь одного полутела может ассоциироваться с тяжелой цепью, ассоциированной с другой молекулой (например, другим полутелом) или другим Fcсодержащим полипептидом. Два слегка отличающихся Fc-домена могут гетеродимеризоваться как при образовании биспецифических антител или других гетеродимеров, тримеров, -тетрамеров и т.п. См. Vincent and Murini, Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and pH-dependent antigen binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates, 7 Biotechnol. J. 1444-1450 (20912); и Shimamoto et al., Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies, 4(5) MAbs 586-91 (2012).The terms half-body or half-body, which are used interchangeably, refer to the half of an antibody that actually contains one heavy chain and one light chain. The heavy chains of an antibody can form dimers such that the heavy chain of one hemibody can be associated with a heavy chain associated with another molecule (eg, another hemibody) or another Fc-containing polypeptide. The two slightly different Fc domains can heterodimerize as in the formation of bispecific antibodies or other heterodimers, trimers, β-tetramers, and the like. See Vincent and Murini, Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and pH-dependent antigen binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates, 7 Biotechnol. J. 1444-1450 (20912); and Shimamoto et al., Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies, 4(5) MAbs 586-91 (2012).

В одном варианте осуществления вариабельный домен полутела специфически распознает эффектор интернализации, и Fc-домен полутела димеризуется с Fc-слитым белком, который содержит заместительный фермент (например, пептитело) Id, 586.In one embodiment, the hemibody variable domain specifically recognizes an internalization effector and the hemibody Fc domain dimerizes with an Fc fusion protein that contains a replacement enzyme (e.g., peptibody) Id, 586.

Термины альфа-глюкозидаза (или α-глюкозидаза), α-глюкозидазная активность, GAA и GAA-активность используются взаимозаменяемо и относятся к любому белку, который облегчает гидролиз 1,4-альфа-связей гликогена и крахмала в глюкозе. GAA также известна inter alia как EC 3.2.1.20, мальтаза, глюкоинвертаза, глюкозидосахараза, мальтаза-глюкоамилаза, альфа-глюкопиранозидаза, глюкозидоинвертаза, альфа-О-глюкозидаза, альфа-глюкозидаза гидролаза, альфа-1,4-глюкозидаза и альфа-Dглюкозидаза глюкогидролаза. GAA может быть обнаружена в лизосоме и в щеточной кайме тонкого кишечника. У пациентов, страдающих заболеванием Помпе, отсутствует функционирующая лизосомальная α-глюкозидаза. См. S. Chiba, Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase, 61(8) Biosci. Biotechnol. Biochem. 1233-9 (1997); и Hesselink et al., Lysosomal dysfunction in muscle with special reference to glycogen storage disease type II, 1637(2) Biochim. Biophys. Acta. 164-70 (2003).The terms alpha-glucosidase (or α-glucosidase), α-glucosidase activity, GAA, and GAA activity are used interchangeably and refer to any protein that facilitates the hydrolysis of the 1,4-alpha bonds of glycogen and starch in glucose. GAA is also known inter alia as EC 3.2.1.20, maltase, glucoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, alpha-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, alpha-O-glucosidase, alpha-glucosidase hydrolase, alpha-1,4-glucosidase and alpha-D-glucosidase glucohydrolase . GAA can be found in the lysosome and in the brush border of the small intestine. Patients with Pompe disease lack functioning lysosomal α-glucosidase. See S. Chiba, Molecular mechanism in alpha-glucosidase and glucoamylase, 61(8) Biosci. Biotechnol. Biochem. 1233-9 (1997); and Hesselink et al., Lysosomal dysfunction in muscle with special reference to glycogen storage disease type II, 1637(2) Biochim. Biophys. acta. 164-70 (2003).

Термины альфа-галактозидаза A (или α-галактозидаза A), активность α-галактозидазы A, αгалактозидаза, активность α-галактозидазы, GLA и GLA-активность используются взаимозаменяемо и относятся к любому белку, который облегчает гидролиз терминальных α-галактозильных фрагментов из гликолипидов и гликопротеинов, а также гидролизует a-D-фукозиды. GLA также известна inter alia как EC 3.2.1.22, мелибиаза, a-D-галактозидаза, α-галактозидаза A, αгалактозидгалактогидролаза, α-D-галактозидгалактогидролаза. GLA представляет собой лизосомальный фермент, кодируемый геном GLA, связанным с X-хромосомой. Дефекты в GLA могут приводить к заболеванию Фабри, при котором гликолипид, известный как глоботриаозилцерамид (также известный как Gb3, GL-3 или церамидтригексозид) накапливается внутри кровеносных сосудов (т.е. выраженная васкулопатия), что приводит к боли и ухудшению в функционировании почки, сердца, кожи и/или цереброваскулярных тканей, а также в других тканях и органах. См., например, Prabakaran et al. Mannose 6phosphate receptor and sortilin mediated endocytosis of α-galactosidase A in kidney endothelial cells, 7(6) PLoS One e39975 pp. 1-9 (2012).The terms alpha-galactosidase A (or α-galactosidase A), α-galactosidase A activity, α-galactosidase, α-galactosidase activity, GLA, and GLA activity are used interchangeably and refer to any protein that facilitates the hydrolysis of terminal α-galactosyl moieties from glycolipids and glycoproteins, and also hydrolyzes a-D-fucosides. GLA is also known inter alia as EC 3.2.1.22, melibiase, α-D-galactosidase, α-galactosidase A, α-galactoside galactohydrolase, α-D-galactoside galactohydrolase. GLA is a lysosomal enzyme encoded by the GLA gene associated with the X chromosome. Defects in GLA can lead to Fabry disease, in which a glycolipid known as globotriaosylceramide (also known as Gb3, GL-3, or ceramidetrihexoside) accumulates inside blood vessels (i.e., severe vasculopathy), leading to pain and deterioration in kidney function , heart, skin and / or cerebrovascular tissues, as well as in other tissues and organs. See, for example, Prabakaran et al. Mannose 6phosphate receptor and sortilin mediated endocytosis of α-galactosidase A in kidney endothelial cells, 7(6) PLoS One e39975 pp. 1-9 (2012).

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения пациента (или субъекта), страдающего лизосомной болезнью накопления (LSD), путем введения пациенту биотерапевтического комплекса. Биотерапевтический комплекс попадает в клетки пациента и доставляет в лизосомы фермент или ферментативную активность (т.е. заместительный фермент), которые замещают фермент или ферментативную активность, ассоциированные с LSD (т.е. эндогенный фермент).In one aspect, the present invention relates to a method of treating a patient (or subject) suffering from lysosomal storage disease (LSD) by administering a biotherapeutic complex to the patient. The biotherapeutic complex enters the patient's cells and delivers to the lysosomes an enzyme or enzymatic activity (ie replacement enzyme) that replaces the enzyme or enzymatic activity associated with LSD (ie endogenous enzyme).

LSD включают в себя сфинголипидоз, мукополисахаридоз и болезни накопления гликогена. В некоторых вариантах осуществления LSD представляет собой любое одно или более из заболевания Фабри, заболевания Гоше I типа, заболевания Гоше II типа, заболевания Гоше III типа, заболевания НиманнаПика типа A, заболевания Ниманна-Пика типа BGM1-ганглиозидоза, заболевания Сандгоффа, заболевания Тея-Сакса, дефицита активатора GM2, GM3-ганглиозидоза, метахроматической лейкодистрофии, дефицита активатора сфинголипида, заболевания Шейе, заболевания Гурлера-Шейе, заболевания Гурлера, заболевания Хантера, Санфилиппо A, Санфилиппо B, Санфилиппо C, Санфилиппо D, синдрома Мор- 16 041885 кио типа A, синдрома Моркио B типа, заболевания Марото-Лами, заболевания Слая, MPS IX и заболевания Помпе. В конкретном варианте осуществления LSD представляет собой заболевание Фабри. В других вариантах осуществления LSD представляет собой заболевание Помпе.LSD includes sphingolipidosis, mucopolysaccharidosis, and glycogen storage diseases. In some embodiments, the LSD is any one or more of Fabry disease, Gaucher disease type I, Gaucher disease type II, Gaucher disease type III, Niemann-Pick disease type A, Niemann-Pick disease type BGM1 gangliosidosis, Sandhoff disease, Tay- Sachs disease, GM2 activator deficiency, GM3 gangliosidosis, metachromatic leukodystrophy, sphingolipid activator deficiency, Schieye disease, Hurler-Scheie disease, Hurler disease, Hunter disease, Sanfilippo A, Sanfilippo B, Sanfilippo C, Sanfilippo D, Mor-16 041885 Kyo type syndrome A, Morquio syndrome type B, Maroteau-Lami disease, Sly disease, MPS IX, and Pompe disease. In a specific embodiment, the LSD is Fabry disease. In other embodiments, the LSD is Pompe disease.

В некоторых вариантах осуществления биотерапевтический комплекс содержит (a) заместительный фермент и (b) молекулярный объект, который связывается с эффектором интернализации. В некоторых случаях заместительный фермент представляет собой одно или более из α-галактозидазы, βгалактозидазы, α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, активатора сапозина-С, церамидазы, сфингомиелиназы, Р-гексозаминидазы, активатора GM2, GM3-синтазы, арилсульфатазы, активатора сфинголипида, αидуронидазы, идуронидаза-2-сульфатазы, гепарин-И-сульфатазы, N-ацетил-а-глюкозаминидазы, αглюкозамид-М-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-б-сульфатазы, N-ацетил галактозамин-6сульфат-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, β-глюкуронидазы и гиалуронидазы.In some embodiments, the biotherapeutic complex comprises (a) a replacement enzyme and (b) a molecular entity that binds to an internalization effector. In some cases, the replacement enzyme is one or more of α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, saposin-C activator, ceramidase, sphingomyelinase, P-hexosaminidase, GM2 activator, GM3 synthase, arylsulfatase, sphingolipid activator, α-iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparin-I-sulfatase, N-acetyl-a-glucosaminidase, α-glucosamide-M-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, N-acetylgalactosamine-6sulfate-sulfatase, N-acetylgalactosamine-4 -sulfatase, β-glucuronidase and hyaluronidase.

В некоторых случаях у пациента не может продуцироваться достаточно белка, так что заместительный фермент распознается пациентом как чужой, и после введения заместительного фермента происходит иммунологическая реакция. Это является нежелательным. Поэтому, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, заместительный фермент разрабатывают или продуцируют таким образом, чтобы избежать индуцирования иммунологической реакции у субъекта. Одним таким решением является применение изозима в качестве заместительного фермента. Изозим достаточно близок собственному белку пациента, однако обладает активностью заместительного фермента, достаточной для облегчения симптомов LSD.In some cases, the patient cannot produce enough protein so that the replacement enzyme is recognized as foreign by the patient and an immunological reaction occurs after administration of the replacement enzyme. This is undesirable. Therefore, in accordance with some embodiments, the replacement enzyme is designed or produced in such a way as to avoid inducing an immunological response in the subject. One such solution is the use of an isozyme as a replacement enzyme. The isozyme is closely related to the patient's own protein, yet has sufficient substitution enzyme activity to alleviate the symptoms of LSD.

В одном конкретном варианте осуществления, при котором LSD представляет собой заболевание Помпе, и эндогенный фермент представляет собой α-глюкозидазу (GAA), изозим может представлять собой любое из кислой α-глюкозидазы, сахаразы-изомальтазы (SI), мальтазы-глюкоамилазы (MGAM), глюкозидазы II (GANAB) и нейтральной α-глюкозидазы (C GNAC). В другом конкретном варианте осуществления, при котором LSD представляет собой заболевание Фабри, и эндогенный фермент представляет собой α-галактозидазу A (GLA), изозим может представлять собой α-N-ацетилгалактозаминидазу, сконструированную с возможностью получения GLA-активности.In one particular embodiment, wherein the LSD is Pompe disease and the endogenous enzyme is α-glucosidase (GAA), the isozyme can be any of acid α-glucosidase, sucrase-isomaltase (SI), maltase-glucoamylase (MGAM) , glucosidase II (GANAB), and neutral α-glucosidase (C GNAC). In another specific embodiment, wherein the LSD is Fabry disease and the endogenous enzyme is α-galactosidase A (GLA), the isozyme may be an α-N-acetylgalactosaminidase engineered to produce GLA activity.

В биотерапевтическом комплексе имеется компонент белка, связывающего эффектор интернализации, который обеспечивает поглощение заместительного фермента клеткой. Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления эффектор интернализации может представлять собой CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, трансферриновый рецептор, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), PRLR (пролактиновый рецептор), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный как VIP17), IGF2R, H+ АТФаза вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовый рецептор, лептиновый рецептор, скэвенджер-рецептор, SCARA1-5, SCARB1-3 и CD36. В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к почке интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство транспортеров растворенных веществ 22 представитель 13), SLC5A2 (котранспортер натрия/глюкозы 2) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к мышцам интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор костного морфогенетического белка 1A), м-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфичная по отношению к мышцам), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNA1S (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа ACh-рецептора), CHRND (субъединица дельта ACh-рецептора), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, APLP2 или PRLR.The biotherapeutic complex contains a protein component that binds the internalization effector, which ensures the absorption of the replacement enzyme by the cell. Thus, in some embodiments, the internalization effector may be CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL related protein 1 receptor, ASGR1, ASGR2, amyloid precursor protein-2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), PRLR (prolactin receptor), MAL (myelin and lymphocytic protein, also known as VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase, diphtheria toxin receptor , folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptor, leptin receptor, scavenger receptor, SCARA1-5, SCARB1-3 and CD36. In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 representative 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In certain other embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein 1A receptor), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (48 receptor). , G-protein coupled), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNA1S (alpha-15 subunit L-type calcium channel), CACNG6 (L-type calcium channel gamma-6 subunit), SCN1B (sodium channel beta-1 subunit), CHRNA1 (ACh receptor alpha subunit), CHRND (ACh receptor delta subunit), LRRC14B ( protein 14B containing a leucine-rich repeat) and POPDC3 (protein 3 containing a Popeye domain). In some embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, APLP2, or PRLR.

В некоторых вариантах осуществления белок, связывающий эффектор интернализации, содержит антигенсвязывающий белок, который включает в себя, например, слитую молекулу на основе рецептора, молекулу-ловушку, слитую молекулу на основе рецептора и Fc-фрагмента, антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, одноцепочечную Fv (scFv) молекулу, dAb-фрагмент, выделенную область, определяющую комплементарность (CDR), пептид CDR3, конформационно затрудненный пептид FR3-CDR3-FR4, домен-специфичное антитело, однодоменное антитело, антитело с делецией домена, химерное антитело, антитело с привитой CDR, диатело, триатело, тетратело, минитело, нанотело, моновалентное нанотело, бивалентное нанотело, иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (SMIP), верблюжье антитело (гомодимерное антитело с тяжелой цепью VHH), вариабельный домен IgNAR акулы.In some embodiments, the internalization effector binding protein comprises an antigen binding protein that includes, for example, a receptor-based fusion molecule, a decoy molecule, a receptor-Fc fusion, an antibody, a Fab, F(ab ')2-fragment, Fd-fragment, Fv-fragment, single-chain Fv (scFv) molecule, dAb-fragment, complementarity determining region (CDR), CDR3 peptide, conformationally constrained FR3-CDR3-FR4 peptide, domain-specific antibody , single-domain antibody, domain-deleted antibody, chimeric antibody, CDR-grafted antibody, diabody, triatebody, tetrabody, minibody, nanobody, monovalent nanobody, bivalent nanobody, Small Modular Protein (SMIP) immunopharmaceutical, camel antibody (homodimeric antibody heavy chain VHH), shark IgNAR variable domain.

В одном варианте осуществления молекулярный объект, который связывается с эффектором интернализации, представляет собой антитело, фрагмент антитела или другой антигенсвязывающий белок.In one embodiment, the molecular entity that binds to the internalization effector is an antibody, antibody fragment, or other antigen-binding protein.

- 17 041885- 17 041885

Например, молекулярный объект может представлять собой биспецифическое антитело, в котором одно плечо связывается с эффектором интернализации (например, ITGA7, CD9, CD63, PRLR, APLP2), а другое плечо связывается с заместительным ферментом. В данном случае биотерапевтический комплекс содержит биспецифическое антитело и заместительный фермент (фиг. 1A). В конкретном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой заболевание Фабри, и биотерапевтический комплекс содержит GLA и биспецифическое антитело, которое связывается с GLA и CD63. В другом конкретном варианте осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой заболевание Помпе, и биотерапевтический комплекс содержит GAA и биспецифическое антитело, которое связывается с GAA и CD63.For example, the molecular entity may be a bispecific antibody in which one arm binds to an internalization effector (eg, ITGA7, CD9, CD63, PRLR, APLP2) and the other arm binds to a replacement enzyme. In this case, the biotherapeutic complex contains a bispecific antibody and a replacement enzyme (FIG. 1A). In a specific embodiment, the disease being treated is Fabry disease and the biotherapeutic complex contains GLA and a bispecific antibody that binds to GLA and CD63. In another specific embodiment, the disease being treated is Pompe disease and the biotherapeutic complex contains GAA and a bispecific antibody that binds to GAA and CD63.

В других вариантах осуществления молекулярный объект, который связывается с эффектором интернализации, содержит полуантитело, и заместительный фермент содержит Fc-домен (слитый полипептид фермент-Fc). В одном варианте осуществления Fc-домен слитого полипептида фермент-Fc ассоциирует с Fc-доменом специфичного по отношению к эффектору интернализации полутела с образованием биотерапевтического комплекса (фиг. 1B).In other embodiments, the molecular entity that binds to the internalization effector contains a semi-antibody and the replacement enzyme contains an Fc domain (enzyme-Fc fusion polypeptide). In one embodiment, the Fc domain of the enzyme-Fc fusion polypeptide associates with the Fc domain of an internalization effector-specific hemibody to form a biotherapeutic complex (FIG. 1B).

В других вариантах осуществления заместительный фермент ковалентно связан с белком, связывающим эффектор интернализации. Вариант осуществления слияния фермент-Fc: полутело, описанный в предыдущем параграфе (см. также фиг. 1B), попадает в этот класс, поскольку димер Fc может быть соединен посредством одного или более дисульфидных мостиков. Ковалентная связь между доменом активности фермента или полипептидом и доменом или полипептидом, связывающими эффектор интернализации, может представлять собой любой тип ковалентной связи, т.е. любую связь, которая предусматривает распределение электронов. В некоторых случаях ковалентная связь представляет собой пептидную связь между двумя аминокислотами, такую, что заместительный фермент и белок, связывающий эффектор интернализации, полностью или частично формируют непрерывную полипептидную цепь как в слитом белке. В некоторых случаях часть заместительного фермента и белок, связывающий эффектор интернализации, связываются непосредственно. В других случаях используется линкер для прикрепления двух частей. См. Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013).In other embodiments, the replacement enzyme is covalently linked to an internalization effector binding protein. The enzyme-Fc:hemibody fusion embodiment described in the previous paragraph (see also FIG. 1B) falls into this class because the Fc dimer can be connected via one or more disulfide bridges. The covalent bond between the enzyme activity domain or polypeptide and the internalization effector binding domain or polypeptide can be any type of covalent bond, i.e. any bond that involves the distribution of electrons. In some cases, a covalent bond is a peptide bond between two amino acids such that the substitutional enzyme and the internalization effector binding protein form wholly or partly a continuous polypeptide chain as in a fusion protein. In some cases, part of the replacement enzyme and the protein that binds the internalization effector bind directly. In other cases, a linker is used to attach the two pieces. See Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality, 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013).

В конкретном варианте осуществления заместительный фермент ковалентно связан с C-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации (см. фиг. 1C) или с C-концом легкой цепи (фиг. 1E). В другом конкретном варианте осуществления заместительный фермент ковалентно связан с N-концом тяжелой цепи антитела к эффектору интернализации (см. фиг. 1D) или с N-концом легкой цепи (фиг. 1F).In a specific embodiment, the substitution enzyme is covalently linked to the C-terminus of the heavy chain of an anti-internalization effector antibody (see FIG. 1C) or to the C-terminus of the light chain (FIG. 1E). In another specific embodiment, the substitution enzyme is covalently linked to the N-terminus of the heavy chain of an anti-internalization effector antibody (see FIG. 1D) or to the N-terminus of the light chain (FIG. 1F).

В некоторых случаях, особенно если заместительный фермент нормально протеолитически не процессирован в лизосоме, добавляют расщепляемый линкер в такие варианты осуществления биотерапевтического комплекса, которые предусматривают слияние антитело-фермент. В некоторых вариантах осуществления расщепляемый катепсином линкер вставляют между антителом и заместительным ферментом для облегчения удаления антитела в лизосоме для a) возможной помощи в сохранении ферментативной активности путем удаления стерически крупного антитела и b) возможного увеличения лизосомального времени полужизни фермента.In some cases, especially if the replacement enzyme is not normally proteolytically processed in the lysosome, a cleavable linker is added to such embodiments of the biotherapeutic complex that involve antibody-enzyme fusion. In some embodiments, a cathepsin-cleavable linker is inserted between the antibody and the replacement enzyme to facilitate removal of the antibody in the lysosome to a) possibly help maintain enzyme activity by removing the sterically large antibody, and b) possibly increase the lysosomal half-life of the enzyme.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, обладающей ферментативной активностью и содержащей антигенсвязывающий белок, при этом фермент ассоциирован с лизосомной болезнью накопления (LSD) и белком, связывающим эффектор интернализации. Ферменты (включающие в себя белки, которые не являются per se каталитическими), ассоциированные с лизосомными болезнями накопления, включают в себя, например, α-галактозидазу, β-галактозидазу, α-глюкозидазу, βглюкозидазу, активатор сапозина-C, церамидазу, сфингомиелиназу, β-гексозаминидазу, активатор GM2, GM3-синтазу, арилсульфатазу, активатор сфинголипида, а-идуронидазу, идуронидаза-2-сульфатазу, гепарин-N-сульфатазу, N-ацетил-а-глюкозаминидазу, а-глюкозамид-И-ацетилтрансферазу, Nацетилглюкозамин-6-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-б-сульфат-сульфатазу, N-ацетилгалактозамин-4сульфатазу, β-глюкуронидазу, гиалуронидазу и т.п.In another aspect, the present invention provides a composition having enzymatic activity and comprising an antigen binding protein, wherein the enzyme is associated with lysosomal storage disease (LSD) and an internalization effector binding protein. Enzymes (including proteins that are not per se catalytic) associated with lysosomal storage diseases include, for example, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glucosidase, β-glucosidase, saposin-C activator, ceramidase, sphingomyelinase, β-hexosaminidase, GM2 activator, GM3 synthase, arylsulfatase, sphingolipid activator, a-iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparin-N-sulfatase, N-acetyl-a-glucosaminidase, a-glucosamide-I-acetyltransferase, Nacetylglucosamine- 6-sulfatase, N-acetylgalactosamine-b-sulfate-sulfatase, N-acetylgalactosamine-4sulfatase, β-glucuronidase, hyaluronidase, and the like.

Белки, связывающие эффектор интернализации, например, включают в себя слитую молекулу на основе рецептора, молекулу-ловушку, слитую молекулу на основе рецептора и Fc-фрагмента, антитело, Fab-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fd-фрагмент, Fv-фрагмент, одноцепочечную Fv (scFv) молекулу, dAbфрагмент, выделенную область, определяющую комплементарность (CDR), пептид CDR3, конформационно затрудненный пептид FR3-CDR3-FR4, домен-специфичное антитело, однодоменное антитело, антитело с делецией домена, химерное антитело, антитело с привитой CDR, диатело, триатело, тетратело, минитело, нанотело, моновалентное нанотело, бивалентное нанотело, иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (SMIP), верблюжье антитело (гомодимерное антитело с тяжелой цепью VHH), вариабельный домен IgNAR акулы, другие антигенсвязывающие белки и т.п.Internalization effector binding proteins, for example, include receptor-based fusion, decoy, receptor-Fc fusion, antibody, Fab, F(ab')2, Fd, Fv fragment, single chain Fv (scFv) molecule, dAb fragment, complementarity determining region (CDR), CDR3 peptide, conformationally constrained FR3-CDR3-FR4 peptide, domain-specific antibody, single-domain antibody, domain-deleted antibody, chimeric antibody, CDR-grafted antibody, diabody, triatelo, tetrabody, minibody, nanobody, monovalent nanobody, bivalent nanobody, small size modular protein (SMIP) immunopharmaceutical, camel antibody (VHH heavy chain homodimeric antibody), shark IgNAR variable domain, others antigen-binding proteins; and the like.

Эффекторы интернализации включают в себя, например, CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, трансферриновый рецептор, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок, подобный белку-предшественнику амилоида-2 (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), PRLR (пролактиновый рецептор), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный какInternalization effectors include, for example, CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL related protein 1 receptor, ASGR1, ASGR2, protein like protein -amyloid precursor-2 (APLP2), apelin receptor (APLNR), PRLR (prolactin receptor), MAL (myelin and lymphocytic protein, also known as

- 18 041885- 18 041885

VIP17), IGF2R, H+ АТФазу вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовый рецептор, лептиновый рецептор, скэвенджер-рецептор, SCARA1-5, SCARB1-3 и CD36. В определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к почке интернализатор, такой как CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство транспортеров растворенных веществ 22 представитель 13), SLC5A2 (котранспортер натрия/глюкозы 2) и UMOD (уромодулин). В других определенных вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой специфичный по отношению к мышцам интернализатор, такой как BMPR1A (рецептор костного морфогенетического белка 1A), м-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфичная по отношению к мышцам), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNAlS (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа ACh-рецептора), CHRND (субъединица дельта ACh-рецептора), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye). В некоторых вариантах осуществления эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, ALPL2 или PPRLR.VIP17), IGF2R, vacuolar-type H+ ATPase, diphtheria toxin receptor, folate receptor, glutamate receptors, glutathione receptor, leptin receptor, scavenger receptor, SCARA1-5, SCARB1-3 and CD36. In certain embodiments, the internalization effector is a kidney-specific internalizer such as CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 representative 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2) and UMOD (uromodulin). In certain other embodiments, the internalization effector is a muscle-specific internalizer such as BMPR1A (bone morphogenetic protein 1A receptor), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (48 receptor). , G-protein coupled), cholinergic receptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNAlS (alpha-15 subunit L-type calcium channel), CACNG6 (L-type calcium channel gamma-6 subunit), SCN1B (sodium channel beta-1 subunit), CHRNA1 (ACh receptor alpha subunit), CHRND (ACh receptor delta subunit), LRRC14B ( protein 14B containing a leucine-rich repeat) and POPDC3 (protein 3 containing a Popeye domain). In some embodiments, the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, or PPRLR.

В некоторых вариантах осуществления фермент ковалентно связан (т.е. электроны распределяются между атомами) с антигенсвязывающим белком. В одном конкретном варианте осуществления белок, связывающий эффектор интернализации, состоит из полутела или содержит таковое; фермент слит с Fcслитым доменом (например, на C-конце); и Fc-домен, который ковалентно связан с ферментом, ассоциируется с Fc-доменом антигенсвязывающего белка так, что ассоциация предусматривает один или более дисульфидных мостиков. Данный конкретный вариант осуществления схематически изображен на фиг. 1B.In some embodiments, the enzyme is covalently linked (ie, electrons are shared between atoms) to an antigen-binding protein. In one particular embodiment, the internalization effector binding protein consists of or contains a hemibody; the enzyme is fused to an Fc fusion domain (eg, at the C-terminus); and the Fc domain that is covalently linked to the enzyme is associated with the Fc domain of the antigen-binding protein such that the association includes one or more disulfide bridges. This particular embodiment is schematically depicted in FIG. 1b.

В другом конкретном варианте осуществления белок, связывающий эффектор интернализации (IEBP), состоит из антитела или фрагмента антитела или содержит таковые, и фермент ковалентно связан с антителом или фрагментом антитела. В конкретном варианте осуществления IEBP представляет собой антитело, и фермент ковалентно связан (непосредственно пептидной связью или опосредованно через линкер) с C-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела (соответственно фиг. 1C или 1E). В другом конкретном варианте осуществления IEBP представляет собой антитело, и фермент ковалентно связан (непосредственно пептидной связью или опосредованно через линкер) с N-концом тяжелой цепи или легкой цепи антитела (соответственно фиг. 1D или 1F).In another specific embodiment, the internalization effector binding protein (IEBP) consists of or contains an antibody or antibody fragment, and the enzyme is covalently linked to the antibody or antibody fragment. In a specific embodiment, the IEBP is an antibody and the enzyme is covalently linked (directly by a peptide bond or indirectly through a linker) to the C-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody (Fig. 1C or 1E, respectively). In another specific embodiment, the IEBP is an antibody and the enzyme is covalently linked (directly by a peptide bond or indirectly through a linker) to the N-terminus of the heavy chain or light chain of the antibody (FIG. 1D or 1F, respectively).

В некоторых вариантах осуществления фермент и IEBP не связываются ковалентно, а объединяются в смесь. IEBP и фермент могут ассоциироваться посредством нековалентных сил с образованием комплекса. Например, в соответствии с одним конкретным вариантом осуществления IEBP представляет собой биспецифическое антитело, в котором одно плечо антитела связывается с эффектором интернализации, а другое плечо связывается с ферментом. Данный вариант осуществления схематически изображен на фиг. 1A.In some embodiments, the implementation of the enzyme and IEBP are not covalently linked, but are combined into a mixture. The IEBP and the enzyme can associate through non-covalent forces to form a complex. For example, in accordance with one specific embodiment, the IEBP is a bispecific antibody in which one arm of the antibody binds to an internalization effector and the other arm binds to an enzyme. This embodiment is shown schematically in FIG. 1A.

В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой GAA или обладает GAAактивностью (например, изозим с активностью GAA), и эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CDH15, CD9, CD63, APLP2 или PRLR. В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой GAA или обладает GAA-активностью, домен интернализации представляет собой CD63, и IEBP представляет собой биспецифическое антитело со специфичностью по отношению к CD63 и GAA.In some embodiments, the enzyme is GAA or has GAA activity (eg, an isozyme with GAA activity), and the internalization effector is ITGA7, CDH15, CD9, CD63, APLP2, or PRLR. In a specific embodiment, the enzyme is GAA or has GAA activity, the internalization domain is CD63, and IEBP is a bispecific antibody with specificity for CD63 and GAA.

В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой GLA или обладает GLAактивностью (например, изозим с активностью GAA), и эффектор интернализации представляет собой ITGA7, CD9, CD63, APLP2 или PRLR. В конкретном варианте осуществления фермент представляет собой GLA или обладает GLA-активностью, домен интернализации представляет собой CD63, и IEBP представляет собой биспецифическое антитело со специфичностью по отношению к CD63 и GLA.In some embodiments, the enzyme is GLA or has GLA activity (eg, an isozyme with GAA activity), and the internalization effector is ITGA7, CD9, CD63, APLP2, or PRLR. In a specific embodiment, the enzyme is GLA or has GLA activity, the internalization domain is CD63, and IEBP is a bispecific antibody with specificity for CD63 and GLA.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу отбора или скрининга биотерапевтического комплекса, содержащего фермент и антигенсвязывающий белок, который эффективно замещает фермент у пациента при необходимости этого. В одном варианте осуществления биотерапевтический комплекс вводят в модельную систему, и модельную систему оценивают на предмет активности замещенного фермента. В одном варианте осуществления модельной системой является животное, у которого отсутствует экспрессия фермента и которое экспрессирует антиген, родственный антигенсвязывающему белку. В одном варианте осуществления животной моделью является мышь, которая экспрессирует гуманизированного родственника антигенсвязывающего белка и содержит нокаутный ген, который кодирует фермент.In another aspect, the present invention relates to a method for selecting or screening a biotherapeutic complex containing an enzyme and an antigen binding protein that effectively replaces the enzyme in a patient when needed. In one embodiment, the biotherapeutic complex is introduced into the model system and the model system is evaluated for the activity of the substituted enzyme. In one embodiment, the model system is an animal that lacks enzyme expression and expresses an antigen related to an antigen binding protein. In one embodiment, the animal model is a mouse that expresses a humanized relative of an antigen binding protein and contains a knockout gene that encodes for an enzyme.

В одном варианте осуществления мышь характеризуется нокаутом лизосомального фермента, такого как α-галактозидаза A, церамидаза, β-глюкозидаза, активатор сапозина-C, сфингомиелиназа, βгалактозидаза, β-гексозаминидаза A и B, β-гексозаминидаза A, белок GM2-активатор, GM3-синтаза, арилсульфатаза A, активатор сфинголипида, α-идуронидаза, идуронидаза-2-сульфатаза, гепаран-NIn one embodiment, the mouse is characterized by knockout of a lysosomal enzyme such as α-galactosidase A, ceramidase, β-glucosidase, saposin-C activator, sphingomyelinase, β-galactosidase, β-hexosaminidase A and B, β-hexosaminidase A, GM2 activator protein, GM3 -synthase, arylsulfatase A, sphingolipid activator, α-iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparan-N

- 19 041885 сульфатаза, N-ацетил-а-глюкозаминидаза, ацетил-CoA; а-глюкозамид-И-ацетилтрансфераза, Nацетилглюкозамин-6-сульфатаза, N-ацетилгалактозамин-б-сульфат-сульфатаза, β-галактозидаза, Nацетилгалактозамин-4-сульфатаза (арилсульфатаза B), β-глюкуронидаза, гиалуронидаза, а-глюкозидаза 2 или лизосомальная кислая липаза. В одном варианте осуществления нокаутная мышь также экспрессирует человеческую или гуманизированную версию эффектора интернализации (т.е. когнатного антигенсвязывающего белка). Эффекторы интернализации человека включают в себя CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, трансферриновый рецептор, LDL-рецептор, рецептор белка 1, родственного LDL, ASGR1, ASGR2, белок-2, подобный белку-предшественнику амилоида (APLP2), апелиновый рецептор (APLNR), PRLR (пролактиновый рецептор), MAL (миелиновый и лимфоцитарный белок, также известный как VIP17), IGF2R, H+ АТФазу вакуолярного типа, рецептор дифтерийного токсина, фолатный рецептор, глутаматные рецепторы, глутатионовый рецептор, лептиновый рецептор, скэвенджеррецептор, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36, CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (рецептор паратиреоидного гормона), SLC22A13 (семейство транспортеров растворенных веществ 22 представитель 13), SLC5A2 (котранспортер натрия/глюкозы 2), UMOD (уромодулин), BMPR1A (рецептор костного морфогенетического белка 1A), м-кадгерин, CD9, MuSK (киназа, специфичная по отношению к мышцам), LGR4/GPR48 (рецептор 48, сопряженный с G-белком), холинергический рецептор (никотиновый) альфа 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (интегрин альфа-7), CACNG1 (субъединица гамма-1 кальциевого канала L-типа), CACNA1S (субъединица альфа-15 кальциевого канала L-типа), CACNG6 (субъединица гамма-6 кальциевого канала L-типа), SCN1B (субъединица бета-1 натриевого канала), CHRNA1 (субъединица альфа ACh-рецептора), CHRND (субъединица дельта ACh-рецептора), LRRC14B (белок 14B, содержащий богатый лейцином повтор) и POPDC3 (белок 3, содержащий домен Popeye).- 19 041885 sulfatase, N-acetyl-a-glucosaminidase, acetyl-CoA; α-glucosamide-I-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, N-acetylgalactosamine-β-sulphate-sulfatase, β-galactosidase, Nacetylgalactosamine-4-sulfatase (arylsulfatase B), β-glucuronidase, hyaluronidase, α-glucosidase 2 or lysosomal acid lipase. In one embodiment, the knockout mouse also expresses a human or humanized version of the internalization effector (ie, a cognate antigen-binding protein). Human internalization effectors include CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, transferrin receptor, LDL receptor, LDL-related protein 1 receptor, ASGR1, ASGR2, protein-2 like protein amyloid precursor (APLP2) receptor, leptin receptor, scavenger receptor, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36, CDH16 (Cadheri-16), CLDN16 (Claudn-16), KL (Klotho), PTH1R (parathyroid hormone receptor), SLC22A13 (solute transporter family 22 representative 13), SLC5A2 (sodium/glucose cotransporter 2), UMOD (uromodulin), BMPR1A (bone morphogenetic protein receptor 1A), m-cadherin, CD9, MuSK (muscle-specific kinase), LGR4/GPR48 (receptor 48 , G-protein coupled), cholinergic rec eptor (nicotinic) alpha 1, CDH15 (Cadheri-15), ITGA7 (alpha-7 integrin), CACNG1 (L-type calcium channel gamma-1 subunit), CACNA1S (L-type calcium channel alpha-15 subunit), CACNG6 ( L-type calcium channel gamma-6 subunit), SCN1B (sodium channel beta-1 subunit), CHRNA1 (ACh receptor alpha subunit), CHRND (ACh receptor delta subunit), LRRC14B (leucine-rich repeat containing protein 14B), and POPDC3 (protein 3 containing the Popeye domain).

Из уровня техники известны способы создания мышей, которые экспрессируют рецепторы человека. См, например, Ma et al., Drug Metab. Dispos. 2008 Dec; 36(12):2506-12; и патент США № 8878001 B2, которые включены в данный документ в отношении трансгенных мышей, экспрессирующих рецепторы человека. Также из уровня техники известны способы получения нокаутных по ферменту мышей. См., например, Kuemmel et al., Pathol. Res. Pract. 1997; 193(10):663-71, которая включена в данный документ в отношении нокаута по ферменту лизосомального накопления мыши.Methods for creating mice that express human receptors are known in the art. See, for example, Ma et al., Drug Metab. Dispos. Dec 2008; 36(12):2506-12; and US Pat. No. 8,878,001 B2, which are incorporated herein in relation to transgenic mice expressing human receptors. Also known in the art are methods for producing enzyme knockout mice. See, for example, Kuemmel et al., Pathol. Res. Pract. 1997; 193(10):663-71, which is incorporated herein with respect to mouse lysosomal storage enzyme knockout.

Следующие примеры представлены с целью дальнейшей иллюстрации способов согласно настоящему изобретению. Эти примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.The following examples are presented to further illustrate the methods of the present invention. These examples are purely illustrative and are not intended to limit the scope of the present invention in any way.

ПримерыExamples

Пример 1. Лизосомальный α-глюкозидазный слитый белок.Example 1 Lysosomal α-glucosidase fusion protein.

Для доставки ферментов в лизосому разрабатывали контролируемые антителом CI-MPRнезависимые системы доставки. В таблице 3 приведены молекулярные конструкции вместе с их уровнями экспрессии в клетках CHO (см. фиг. 2), приблизительной активностью GAA, определяемой с использованием 4-метилумбеллиферил-а-глюкозидазы к флуоресцентному субстрату (см. фиг. 3), и статусом лизосомального нацеливания, интернализации и активности (см. фиг. 4 и 5).To deliver enzymes to the lysosome, antibody-controlled CI-MPR independent delivery systems have been developed. Table 3 lists the molecular constructs along with their expression levels in CHO cells (see Fig. 2), approximate GAA activity as determined using 4-methylumbelliferyl-a-glucosidase against a fluorescent substrate (see Fig. 3), and lysosomal status. targeting, internalization and activity (see Fig. 4 and 5).

Пример 2. Интернализация конструкции GAA.Example 2. Internalization of the GAA construct.

Интернализацию конструкций GAA определяли путем измерения ферментативной активности в клеточных лизатах. Различные конструкции рекомбинантной GAA (SEQ ID NO: 1) добавляли в HEK293, скелетные миобласты человека (Lonza, Walkersville, MD) или миобласты мыши C2C12. Клетки высевали в 24-луночные планшеты за 24 ч до добавления ферментативных конструкций. Ферментативные конструкции добавляли в среду клеток на 18 ч. Затем клетки тщательно промывали PBS, охлажденным льдом, и лизировали в 0,5% NP-40, охлажденным льдом, в аналитическом буфере (0,2 М натрия ацетата, 0,4 М калия хлорида, pH 4,3). Лизаты центрифугировали при 15000xg в течение 15 мин при 4°C, и супернатанты инкубировали с 4-метилумбеллиферил-альфа-О-глюкозидазой, субстратом GAA, в аналитическом буфере в течение 1 ч в 96-луночных планшетах. Реакции останавливали с использованием глицинкарбонатного буфера при pH 10,7. Флуоресценцию считывали на устройстве для считывания планшетов при 360 нм возбуждении и 450 нм испускании. Концентрацию белка в лизате оценивали с использованием набора для анализа с использованием бицинхониновой кислоты. В качестве стандартов использовали 4метилумбеллиферон. GAA-активность представляли в нмоль 4-метилумбеллиферона, высвобожденного в час на мг очищенного белка. См. Fuller et al., Isolation and characterisation of a recombinant, precursor form of lysosomal acid alpha-glucosidase, 234(3) European Journal of Biochemistry 903-909 (1995).The internalization of the GAA constructs was determined by measuring enzymatic activity in cell lysates. Various recombinant GAA constructs (SEQ ID NO: 1) were added to HEK293, human skeletal myoblasts (Lonza, Walkersville, MD) or C2C12 mouse myoblasts. Cells were seeded in 24-well plates 24 hours before the addition of enzyme constructs. The enzyme constructs were added to the cell medium for 18 h. Cells were then thoroughly washed with ice-cold PBS and lysed in 0.5% ice-cold NP-40 in assay buffer (0.2 M sodium acetate, 0.4 M potassium chloride , pH 4.3). Lysates were centrifuged at 15,000xg for 15 min at 4° C. and supernatants were incubated with 4-methylumbelliferyl-alpha-O-glucosidase, a GAA substrate, in assay buffer for 1 h in 96-well plates. Reactions were stopped using glycine carbonate buffer at pH 10.7. Fluorescence was read on a plate reader at 360 nm excitation and 450 nm emission. Protein concentration in the lysate was assessed using a bicinchoninic acid assay kit. 4-methylumbelliferone was used as standards. GAA activity was expressed as nmol 4-methylumbelliferone released per hour per mg of purified protein. See Fuller et al., Isolation and characterization of a recombinant, precursor form of lysosomal acid alpha-glucosidase, 234(3) European Journal of Biochemistry 903-909 (1995).

Интернализацию активности GAA оценивали в присутствии или отсутствии манноза-6-фосфата (M6P) (фиг. 4A), а также в присутствии или отсутствии CD63. Некоторые лизосомальные ферменты нацеливались на лизосому посредством присоединенного фрагмента M6P, связывающегося с рецептором манноза-6-фосфата (MPR). Таким образом, вовлечение CI-MPR в интернализацию антитела к CD63-GAA оценивали с помощью включения 5 мМ M6P, который конкурирует за связывание с MPR, в культуральной среде HEK в ходе поглощения антитела к CD63-GAA. Включение M6P не оказывало эффекта на поглощение антитела к CD63-GAA, как определяли путем выявления 4-метилумбеллиферона в клеточных лизатах (фиг. 4A). Однако поглощение антитела к CD63-GAA было зависимым от присутствия CD63Internalization of GAA activity was assessed in the presence or absence of mannose-6-phosphate (M6P) (FIG. 4A) and in the presence or absence of CD63. Several lysosomal enzymes have been targeted to the lysosome via an attached M6P fragment that binds to the mannose-6-phosphate receptor (MPR). Thus, the involvement of CI-MPR in the internalization of anti-CD63-GAA antibody was assessed by incorporating 5 mM M6P, which competes for binding to MPR, in HEK culture medium during uptake of anti-CD63-GAA antibody. M6P incorporation had no effect on anti-CD63-GAA antibody uptake, as determined by detection of 4-methylumbelliferone in cell lysates (FIG. 4A). However, anti-CD63-GAA antibody uptake was dependent on the presence of CD63.

- 20 041885 (фиг. 4B). Антитело к CD63-GAA поглощалось клетками HEK, которые экспрессируют CD63, но не поглощалось клетками HEK, несущими нокаут по гену CD63 (фиг. 4B).- 20 041885 (Fig. 4B). The anti-CD63-GAA antibody was taken up by HEK cells that express CD63, but was not taken up by HEK cells carrying the CD63 gene knockout (FIG. 4B).

Таблица 3Table 3

Конструкция Design Экспрессия СНО CHO expression GAAактивность (in vitro) GAA activity (in vitro) Нацеливание Targeting GAAактивность GAA activity MPR- Зависимое MPR- dependent CD 63- Зависимое CD63- dependent Лизосомал ьная совместная локализация Lysosomal co-localization Антитело к Antibody to — — CD63 IgG4 CD63 IgG4 ++ ++ ΝΑ ΝΑ Нет No Нет No Да Yes Да Yes Слияние GAA-Fc Fusion GAA-Fc (см. фиг. IB(i)) GAA- Ес*антитело к (see fig. IB(i)) GAA- EU*antibody to + + + + NA NA NA NA NA NA NA NA CD63 (см. фиг. 1В) CD63 (see Fig. 1B) NA NA + + Да Yes Нет No Да Yes NT NT Антитело к Antibody to — — CD63-GAA (см. фиг. 1С) CD63-GAA (see fig. 1C) ++ ++ + + Да Yes Нет No Да Yes Да Yes GAA-антитело к GAA antibody to — — CD63 (см. фиг. 1D) CD63 (see Fig. 1D) + + + + Да Yes Нет No Да Yes NT NT GAA GAA NT NT + + Да Yes Да Yes Нет No NT NT GLA GLA ΝΑ ΝΑ - - NA NA Да Yes Нет No NT NT •GLA· антитело •GLA antibody к CD63 to CD63 ΝΑ ΝΑ NA NA Нет No Да Yes NT NT

NA=не применимо; NT=не тестировалиNA=not applicable; NT=not tested

Пример 3. Поглощение конструкции GAA миобластами.Example 3 Uptake of a GAA Construct by Myoblasts.

Тестировали способность скелетных миобластов, которые являются представляющим интерес типом ткани при заболевания Помпе, поглощать разные конструкции GAA. Скелетные миобласты человека культивировали в присутствии различных концентраций (т.е. 25 нМ, 50 нМ и 200 нМ) (1) антитела к CD63-GAA, (2) антитела к CD63-GAA плюс 5 мМ M6P, (3) myc-GAA и (4) myc-GAA плюс 5 мМ M6P. Оценивали интернализацию конструкций GAA, которую определяли по уровню активности GAA, выявляемому в клеточных лизатах, на что указывало накопление 4-метилумбеллиферона. Поглощение 200 нМ антитела к CD63-GAA, которое было MPR-независимым, было не более чем в пять раз выше поглощения myc-GAA, которое было зависимым от MPR (фиг. 5A).The ability of skeletal myoblasts, which is a tissue type of interest in Pompe disease, to take up different GAA constructs was tested. Human skeletal myoblasts were cultured in the presence of various concentrations (i.e. 25 nM, 50 nM and 200 nM) of (1) anti-CD63-GAA, (2) anti-CD63-GAA plus 5 mM M6P, (3) myc-GAA and (4) myc-GAA plus 5 mM M6P. The internalization of the GAA constructs was assessed, which was determined by the level of GAA activity detected in cell lysates, as indicated by the accumulation of 4-methylumbelliferone. The uptake of 200 nM anti-CD63-GAA, which was MPR-independent, was no more than five times that of myc-GAA, which was MPR-dependent (FIG. 5A).

Для определения субклеточной локализации конструкции антитело к CD63-GAA, скелетные миобласты человека окрашивали антителами к IgG человека (для выявления фрагмента антитела к CD63 в конструкции антитело к CD63-GAA) и антителами к LAMP (для мечения лизосом). LAMP или мембранный гликопротеин, ассоциированный с лизосомой, включает в себя интегральные мембранные белки, которые являются специфичными по отношению к лизосомам. Эксперимент совместного мечения продемонстрировал, что антитело к CD63-GAA совместно локализуется с антителом к LAMP, что указывает на то, что антитело к CD63-GAA локализуется в лизосомах.To determine the subcellular localization of the anti-CD63-GAA antibody construct, human skeletal myoblasts were stained with anti-human IgG antibodies (to detect the anti-CD63 antibody fragment in the anti-CD63-GAA antibody construct) and anti-LAMP antibodies (for labeling lysosomes). LAMP, or lysosome-associated membrane glycoprotein, includes integral membrane proteins that are lysosome-specific. The co-labeling experiment demonstrated that the anti-CD63-GAA antibody colocalized with the anti-LAMP antibody, indicating that the anti-CD63-GAA antibody localized to lysosomes.

Аналогичным образом миобласты C2C12 мыши приводили в контакт с различными концентрациями, т.е. 25 нМ, 50 нМ и 200 нМ (1) антитела к CD63-GAA, (2) антитела к CD63-GAA плюс 5 мМ M6P, (3) myc-GAA и (4) myc-GAA плюс 5 мМ M6P. Оценивали интернализацию конструкций GAA, которую определяли по уровню активности GAA, выявляемому в клеточных лизатах, на что указывало накопление 4-метилумбеллиферона. Поглощение 200 нМ антитела к CD63-GAA, которое не подвергалось вредному воздействию M6P, было более чем в приблизительно шесть приблизительно девять раз больше поглоще- 21 041885 ния myc-GAA (фиг. 5B).Similarly, mouse C2C12 myoblasts were contacted with various concentrations, ie. 25 nM, 50 nM and 200 nM (1) anti-CD63-GAA, (2) anti-CD63-GAA plus 5 mM M6P, (3) myc-GAA and (4) myc-GAA plus 5 mM M6P. The internalization of the GAA constructs was assessed, which was determined by the level of GAA activity detected in cell lysates, as indicated by the accumulation of 4-methylumbelliferone. The uptake of 200 nM anti-CD63-GAA that was not adversely affected by M6P was more than about six to about nine times that of myc-GAA (FIG. 5B).

Пример 4. Эффект антитела к CD63-GAA в отношении накопления гликогена.Example 4 Effect of Anti-CD63-GAA Antibody on Glycogen Storage.

Оценивали эффект антитела к CD63-GAA в отношении накопления гликогена в лизосомах трех разных клеточных линий заболевания Помпе. Клеточные линии заболевания Помпе получали из фибробластов, полученных от тяжелобольных инфантильным заболеванием Помпе и содержащих нокаутные или нокдаунные мутации в гене GAA. Используемыми клеточными линиями были GM20089 (делеция экзона 18), GM20090 (сложная гетерозигота в экзоне 14 и 16) и GM20090 (сложная гетерозигота в экзоне 2). Эти линии получали из Coriell Institute, Camden, NJ. См. Huie et al., Increased occurrence of cleft lip in glycogen storage disease type II (GSDII): exclusion of a contiguous gene syndrome in two patients by presence of intragenic mutations including a novel nonsense mutation Gln58Stop, 85(1) Am. J. Med. Genet. 5-8 (1999); Huie et al., Glycogen storage disease type II: identification of four novel missense mutations (D645N, G648S, R672W, R672Q) and two insertions/deletions in the acid alpha-glucosidase locus of patients of differing phenotype, 244(3) Biochem. Biophys. Res. Commun. 921-7 (1998); и Nishiyama et al., Akt inactivation induces endoplasmic reticulum stress-independent autophagy in fibroblasts from patients with Pompe disease, 107 Molecular genetics and metabolism 490-5 (2012). Неонатальные кожные фибробласты человека (NHDF, Lonza) использовали в качестве контроля. Все клеточные линии заболевания Помпе демонстрировали лизосомальное накопление гликогена (после 72 часов глюкозного голодания для снижения цитоплазматического гликогена), хотя присутствовала остаточная (<0,1%) GAA-активность (фиг. 6, панели A и B, соответственно). Гликоген измеряли с использованием набора для анализа гликогена (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).The effect of an anti-CD63-GAA antibody on glycogen accumulation in lysosomes of three different Pompe disease cell lines was evaluated. Pompe disease cell lines were derived from fibroblasts derived from severely ill infantile Pompe disease and containing knockout or knockdown mutations in the GAA gene. The cell lines used were GM20089 (exon 18 deletion), GM20090 (exon 14 and 16 compound heterozygote), and GM20090 (exon 2 compound heterozygote). These lines were obtained from the Coriell Institute, Camden, NJ. See Huie et al., Increased occurrence of cleft lip in glycogen storage disease type II (GSDII): exclusion of a contiguous gene syndrome in two patients by presence of intragenic mutations including a novel nonsense mutation Gln58Stop, 85(1) Am. J. Med. Genet. 5-8 (1999); Huie et al., Glycogen storage disease type II: identification of four novel missense mutations (D645N, G648S, R672W, R672Q) and two insertions/deletions in the acid alpha-glucosidase locus of patients of differing phenotype, 244(3) Biochem. Biophys. Res. commun. 921-7 (1998); and Nishiyama et al., Akt inactivation induces endoplasmic reticulum stress-independent autophagy in fibroblasts from patients with Pompe disease, 107 Molecular genetics and metabolism 490-5 (2012). Neonatal human dermal fibroblasts (NHDF, Lonza) were used as controls. All Pompe disease cell lines showed lysosomal glycogen storage (after 72 hours of glucose starvation to reduce cytoplasmic glycogen), although residual (<0.1%) GAA activity was present (Fig. 6, panels A and B, respectively). Glycogen was measured using a glycogen assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Клетки истощали по глюкозе в течение приблизительно 96 часов перед лизисом для удаления цитоплазматического гликогена (см. Umapathysivam et al., Correlation of acid alpha-glucosidase and glycogen content in skin fibroblasts with age of onset in Pompe disease, 361(1-2) Clin Chim Acta. 191-8 (2005)). Клетки обрабатывали антителом к CD63-GAA (200 нМ) или myc-GAA (200 нМ) в течение 72 часов перед лизисом. Для всех трех клеточных линий заболевания Помпе обработка антителом к CD63-GAA приводила в результате к значительному снижению лизосомального накопления гликогена (фиг. 7), что указывало на то, что экзогенно дозированное антитело к CD63-GAA достигало лизосомы и было ферментативно активным.Cells were depleted of glucose for approximately 96 hours prior to lysis to remove cytoplasmic glycogen (see Umapathysivam et al., Correlation of acid alpha-glucosidase and glycogen content in skin fibroblasts with age of onset in Pompe disease, 361(1-2) Clin Chim Acta 191-8 (2005)). Cells were treated with anti-CD63-GAA (200 nM) or myc-GAA (200 nM) for 72 hours before lysis. For all three Pompe disease cell lines, anti-CD63-GAA antibody treatment resulted in a significant reduction in lysosomal glycogen storage (Figure 7), indicating that the exogenously dosed anti-CD63-GAA antibody reached the lysosome and was enzymatically active.

Пример 5. Изозимы к GAA.Example 5 Isozymes to GAA.

Во избежание возможных иммунных ответов у пациентов с заболеванием Помпе на GAA (т.е. перекрестнореагирующий иммунологический материал или CRIM) исследовали доставку других глюкозидаз человека для сохранения активности GAA. Исследованию подлежали нелизосомальные ферменты с аналогичной активностью гидролиза гликогена по отношению к GAA (также известной как кислая αглюкозидаза). Такие ферменты включают в себя сахаразу-изомальтазу (SI), мальтазу-глюкоамилазу (MGAM), глюкозидазу II (GANAB) и нейтральную α-глюкозидазу (C GNAC). Эти ферменты и различные рекомбинантные варианты осуществления описаны в Dhital et al., Mammalian mucosal α-glucosidases coordinate with α-amylase in the initial starch hydrolysis stage to have a role in starch digestion beyond glucogenesis, 8(4) PLoS One e625462013 Apr 25 (2013); Sim et al., Human intestinal maltase-glucoamylase: crystal structure of the N-terminal catalytic subunit and basis of inhibition and substrate specificity, 375(3) J. Mol. Biol. 782-92 (2008); и Quezada-Calvillo et al., Luminal starch substrate brake on maltase-glucoamylase activity is located within the glucoamylase subunit, 138(4) J. Nutr. 685-92 (2008).To avoid possible immune responses in patients with Pompe disease to GAA (ie, cross-reactive immunological material or CRIM), the delivery of other human glucosidases was investigated to maintain GAA activity. Non-lysosomal enzymes with similar glycogen hydrolysis activity to GAA (also known as acid α-glucosidase) were subject to study. Such enzymes include sucrase-isomaltase (SI), maltase-glucoamylase (MGAM), glucosidase II (GANAB), and neutral α-glucosidase (C GNAC). These enzymes and various recombinant embodiments are described in Dhital et al., Mammalian mucosal α-glucosidases coordinate with α-amylase in the initial starch hydrolysis stage to have a role in starch digestion beyond glucogenesis, 8(4) PLoS One e625462013 Apr 25 ( 2013); Sim et al., Human intestinal maltase-glucoamylase: crystal structure of the N-terminal catalytic subunit and basis of inhibition and substrate specificity, 375(3) J. Mol. Biol. 782-92 (2008); and Quezada-Calvillo et al., Luminal starch substrate brake on maltase-glucoamylase activity is located within the glucoamylase subunit, 138(4) J. Nutr. 685-92 (2008).

В клетках CHO получали и экспрессировали следующие изозимные конструкции: (1) антитело к CD63, (2) антитело к CD63-NtMGAM (т.е. N-концевая субъединица мальтазы-глюкоамилазы, связанной с C-концом тяжелой цепи антитела к CD63), и (3) антитело к CD63-CtMGAM. См. Dhital, 2013. Также конструировали другую конструкцию, экспрессирующую тяжелую цепь антитела к CD63 мыши, слитую с C-концевой субъединицей мальтазы-глюкоамилазы мыши (антитело к mCD63-mctMGAM) для применения в мышиных моделях (см. пример 11).The following isozyme constructs were generated and expressed in CHO cells: (1) anti-CD63 antibody, (2) anti-CD63-NtMGAM antibody (i.e. N-terminal subunit of maltase-glucoamylase linked to the C-terminus of the anti-CD63 antibody heavy chain), and (3) an anti-CD63-CtMGAM antibody. See Dhital, 2013. Another construct expressing an anti-mouse CD63 heavy chain fused to the C-terminal subunit of mouse maltase-glucoamylase (anti-mCD63-mctMGAM antibody) was also constructed for use in mouse models (see Example 11).

Пример 6. Лизосомальный слитый белок α-галактозидазы A (GLA).Example 6 Lysosomal α-galactosidase A (GLA) fusion protein.

Различные слитые белки, содержащие GLA человека (SEQ ID NO:2), конструировали и экспрессировали в клетках CHO. Такие конструкции включали в себя (i) GLA, слитую с C-концом тяжелых цепей антитела к CD63 (антитела к CD63-GLA), (ii) GLA, слитую с Fc иммуноглобулина (например, выступом Fc), (iii) GLA-антитело к CD63 (т.е. GLA, слитую с N-концом тяжелых цепей антитела к CD63), и (iv) слияние GLA-myc (фиг. 8). Также конструировали и экспрессировали белки, связывающие эффектор интернализации (IEBP), без фрагмента GLA. В одном случае IEBP представлял собой биспецифическое антитело с одной половиной, обладающей специфичностью связывания по отношению к CD63, и другой половиной, обладающей специфичностью связывания по отношению к myc. Оценивали ферментативную активность GLA (т.е. гидролиз 4-метилумбеллиферил-в-галактопиранозида) для каждого слитого белка GLA, результаты чего представлены на фиг. 9. За исключением C-концевого слияния антитела к CD63GLA все конструкции демонстрировали α-галактозидазную активность (фиг. 9). Fc-выступы описаны в Ridgway et al., 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization, 9(7) Protein Eng. 617-621 (1996).Various fusion proteins containing human GLA (SEQ ID NO:2) were constructed and expressed in CHO cells. Such constructs included (i) GLA fused to the C-terminus of anti-CD63 antibody heavy chains (anti-CD63-GLA antibodies), (ii) GLA fused to an immunoglobulin Fc (e.g. Fc overhang), (iii) GLA antibody to CD63 (ie, GLA fused to the N-terminus of the anti-CD63 antibody heavy chains), and (iv) GLA-myc fusion (FIG. 8). Internalization effector binding proteins (IEBPs) were also constructed and expressed without the GLA fragment. In one case, IEBP was a bispecific antibody with one half having binding specificity for CD63 and the other half having binding specificity for myc. GLA enzymatic activity (ie, hydrolysis of 4-methylumbelliferyl-β-galactopyranoside) was assessed for each GLA fusion protein, the results of which are shown in FIG. 9. With the exception of the C-terminal fusion of the anti-CD63GLA antibody, all constructs showed α-galactosidase activity (FIG. 9). Fc overhangs are described in Ridgway et al., 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization, 9(7) Protein Eng. 617-621 (1996).

Интернализацию каждой конструкции (или рекомбинации IEBP и GLA-myc) в клетки HEK опредеInternalization of each construct (or recombination of IEBP and GLA-myc) into HEK cells is determined

- 22 041885 ляли путем измерения образования метилумбеллиферона из катализируемого ферментом гидролиза 4метилумбеллиферил—в—галактопиранозида. Различные конструкции добавляли в клетки HEK293, которые затем инкубировали для обеспечения эндоцитоза, затем промывали и лизировали при pH 4. Субстрат GLA добавляли в каждый клеточный лизат, и обеспечивали протекание α-галактозидазной реакции. Результаты представлены на фиг. 9, которая показывает, что слитый белок GLA-антитело к CD63 был интернализован в клетки HEK. GLA-myc отдельно, т.е. при отсутствии элемента IEBP, не поглощался клетками HEK. Однако он поглощался в присутствии биспецифического антитела, которое связывало CD63 и связывало эпитоп myc (фиг. 10).- 22 041885 were measured by measuring the formation of methylumbelliferone from the enzyme-catalyzed hydrolysis of 4methylumbelliferyl-β-galactopyranoside. Various constructs were added to HEK293 cells which were then incubated to allow endocytosis, then washed and lysed at pH 4. GLA substrate was added to each cell lysate and the α-galactosidase reaction was allowed to proceed. The results are shown in FIG. 9 which shows that the anti-CD63 GLA fusion protein was internalized into HEK cells. GLA-myc alone, i.e. in the absence of the IEBP element, was not taken up by HEK cells. However, it was taken up in the presence of a bispecific antibody that bound CD63 and bound the myc epitope (FIG. 10).

Пример 7. Поглощение белков, связывающих эффектор интернализации.Example 7 Uptake of Internalization Effector Binding Proteins.

Интернализацию антитела к CD63 или антител к APLP2 в клеточных фракциях с низким pH сравнивали с интернализацией рекомбинантной GLA человека (rhGLA), которая имела высокое содержание M6P, во фракции с низким pH. Каждые из GLA, антитела к CD63 и антитела к APLP2 метили чувствительным к низкому pH красителем pHrodo® (Invitrogen, Calsbad, CA). Обеспечивали контакт клеток HEK, клеток HepG2 (карциномы печени) и клеток PC-3 (рака предстательной железы) с меченными pHrodo® белками и инкубировали на протяжении ночи или в течение приблизительно 16 часов. Затем клетки визуализировали и подсчитывали флуоресцентные везикулы. Результат флуоресценции нормализовали в соответствии со степенью мечения для каждого белка. Клетки HEK, PC-3 и HepG2 демонстрировали более высокое поглощение антитела к CD63 и антитела к APLP2 по сравнению с rhGLA (фиг. 11).Internalization of anti-CD63 antibody or anti-APLP2 antibodies in the low pH cell fractions was compared to internalization of recombinant human GLA (rhGLA), which had a high M6P content, in the low pH fraction. GLA, anti-CD63, and anti-APLP2 antibodies were each labeled with low pH sensitive pHrodo® dye (Invitrogen, Calsbad, Calif.). HEK cells, HepG2 cells (liver carcinoma) and PC-3 cells (prostate cancer) were contacted with pHrodo® labeled proteins and incubated overnight or for approximately 16 hours. Cells were then visualized and fluorescent vesicles were counted. The fluorescence result was normalized according to the degree of labeling for each protein. HEK, PC-3 and HepG2 cells showed higher uptake of anti-CD63 antibody and anti-APLP2 antibody compared to rhGLA (FIG. 11).

Пример 8. Процессирование слитого белка в лизосоме.Example 8 Processing of the fusion protein in the lysosome.

Независимо от того, процессируется ли протеолитически конструкция антитело к CD63-GAA в лизосоме, лизаты клеток заболевания Помпе тестировали с помощью анализа вестерн-блоттинга. Клетки GM20089 заболевания Помпе культивировали в присутствии антитела к CD63-GAA, а затем клеточные лизаты подвергали анализу вестерн-блоттинга в восстанавливающих условиях с использованием антител к GAA (фиг. 12, панель A) или антител к hIgG (фиг. 12, панель B).Whether or not the anti-CD63-GAA antibody construct is processed proteolytically in the lysosome, Pompe disease cell lysates were tested by Western blot analysis. Pompe disease GM20089 cells were cultured in the presence of anti-CD63-GAA antibody, and then cell lysates were subjected to Western blot analysis under reducing conditions using anti-GAA antibodies (Fig. 12, panel A) or anti-hIgG antibodies (Fig. 12, panel B) .

Линию фибробластов GM20089 заболевания Помпе от Coriell высевали в 6-луночные планшеты и инкубировали с антителом к CD63-GAA в течение 18 ч, а затем тщательно промывали средой. Содержимое лунок лизировали в буфере RIPA в различные моменты времени, т.е. через 0, 24, 48, 72 часа после удаления антитела к CD63-GAA. Лизаты анализировали на предмет GAA с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела к GAA человека (ab113021, Abcam LTD, Кембридж, Великобритания; фиг. 12). Полное антитело к CD63-GAA и более мелкие промежуточные соединения выявляли в ранние моменты времени, а зрелую лизосомальную форму GAA размером 76 кДа выявляли во все моменты времени после введения дозы антитела к CD63-GAA. Это продемонстрировало то, что антитело к CD63-GAA интернализуется в клетки пациента и корректно процессируется до зрелой лизосомальной формы GAA. Более того, время полужизни формы размером 76 кДа в клетках соответствовало другим исследованиям интернализации GAA (Maga, J. A. et al. Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid α-glucosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice. Journal of Biological Chemistry 288, 1428-1438 (2013).)Coriell's Pompe disease fibroblast line GM20089 was plated in 6-well plates and incubated with anti-CD63-GAA antibody for 18 hours and then washed thoroughly with medium. The contents of the wells were lysed in RIPA buffer at different time points, i.e. 0, 24, 48, 72 hours after anti-CD63-GAA antibody removal. Lysates were analyzed for GAA by Western blotting using an anti-human GAA antibody (ab113021, Abcam LTD, Cambridge, UK; FIG. 12). Full anti-CD63-GAA antibody and smaller intermediates were detected at early time points, and mature 76 kDa lysosomal GAA was detected at all time points after dosing with anti-CD63-GAA antibody. This demonstrated that the anti-CD63-GAA antibody is internalized into the patient's cells and correctly processed to the mature lysosomal form of GAA. Moreover, the half-life of the 76 kD form in cells was consistent with other GAA internalization studies (Maga, J. A. et al. Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid α-glucosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice. Journal of Biological Chemistry 288, 1428-1438 (2013).)

Пример 9. Тканевое распределение и процессирование антитела к CD63-GAA.Example 9 Tissue Distribution and Processing of an Anti-CD63-GAA Antibody.

Мышам, гуманизированным по локусу CD63 (см. Valenzuela et al., High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, 21 Nature Biotechnology 652-659 (2003)) вводили антитело к CD63-GAA. Отбирали образцы ткани, и оценивали GAA посредством анализа вестерн-блоттинга. GAA выявляли в печени, диафрагме, почке, сердце, а также в квадрицепсе и икроножной мышце (фиг. 13).Mice humanized at the CD63 locus (see Valenzuela et al., High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, 21 Nature Biotechnology 652-659 (2003)) were injected with an anti-CD63-GAA antibody. Tissue samples were taken and GAA was assessed by Western blot analysis. GAA was detected in the liver, diaphragm, kidney, heart, as well as in the quadriceps and gastrocnemius muscle (Fig. 13).

Вкратце, гуманизированных по CD63 мышей создавали методом нокина локуса CD63 человека в локус CD63 мыши. Антитело к CD63-GAA или антитело к CD63 вводили с помощью инъекции в хвостовую вену при 50 мг/кг гуманизированным по CD63 мышам или мышам дикого типа возрастом 2 месяца без CD63 человека. Осуществляли хвостовой забор крови в различные моменты времени, например, через 0, 6, 24 ч после инъекции. Выполняли ELISA с использованием антитела к Fc для определения концентрации антитела к CD63-GAA в сыворотке крови. Антитело к CD63-GAA быстро удалялось из сыворотки крови, при этом быстрее чем исходное антитело к CD63. Мышей после инъекции также умерщвляли в различные моменты времени, из тканей готовили срезы и фиксировали замораживанием в жидком азоте. Ткани лизировали в буфере RIPA и анализировали на предмет GAA с помощью вестерн-блоттинга. Зрелая лизосомальная форма размером 76 кДа присутствовала в большинстве анализируемых тканей, что указывает на интернализацию антитела к CD63-GAA в клетки ткани (фиг. 13). У гуманизированных по CD63 мышей антитело к CD63-GAA интернализовалось в скелетную мускулатуру (сердце, икроножную мышцу, квадрицепс), однако мыши дикого типа не демонстрировали никакого поглощения. Это указывало на то, что антитело к CD63-GAA интернализовалось в клетки скелетной мускулатуры при опосредовании CD63.Briefly, CD63 humanized mice were generated by knocking the human CD63 locus into the mouse CD63 locus. Anti-CD63-GAA or anti-CD63 was administered by tail vein injection at 50 mg/kg to CD63 humanized or 2 month old wild-type mice without human CD63. Carried out tail blood sampling at different time points, for example, 0, 6, 24 h after injection. An ELISA was performed using an anti-Fc antibody to determine the concentration of anti-CD63-GAA antibody in serum. The anti-CD63-GAA antibody was rapidly cleared from serum, faster than the original anti-CD63 antibody. After injection, mice were also sacrificed at different time points, tissue sections were prepared and fixed by freezing in liquid nitrogen. Tissues were lysed in RIPA buffer and analyzed for GAA by Western blotting. The mature 76 kDa lysosomal form was present in most tissues analyzed, indicating internalization of the anti-CD63-GAA antibody into tissue cells (FIG. 13). In CD63 humanized mice, anti-CD63-GAA antibody was internalized into skeletal muscle (heart, calf, quadriceps), however wild-type mice did not show any uptake. This indicated that the anti-CD63-GAA antibody was internalized into skeletal muscle cells by CD63 mediation.

Гуманизированным по CD63 мышам (CD63^hu/hu) и контрольным мышам (CD63+/+) вводили антитело к CD63-GAA при 50 мг/кг посредством инъекции в хвостовую вену. Во момент времени 24 ч ткани экстрагировали, и на дорожку наносили 200 мкг лизата. Рассматривали вестерн-блоттинг с антителом к hGAA и антителом к GAPDH в качестве контрольного нанесения. На фиг. 14 изображен вестерн- 23 041885 блоттинг и показано, что CD63-onocpegoeaHHoe поглощение антитела к hCD63-GAA в мышечную ткань происходит у мышей CD63^hu/hu, однако отсутствует у мышей CD63^+/+ WT. Антитело к hCD63-GAA процессировалось в зрелую hGAA размером 76 кДа.CD63 humanized mice (CD63 ^hu/hu ) and control mice (CD63+/+) were treated with anti-CD63-GAA antibody at 50 mg/kg via tail vein injection. At time 24 h, tissues were extracted and 200 μg of lysate was applied to the lane. A Western blot with an anti-hGAA antibody and an anti-GAPDH antibody was considered as a control application. In FIG. 14 depicts a Western blot and shows that CD63-onocpegoeaHHoe uptake of anti-hCD63-GAA antibody into muscle tissue occurs in CD63 ^hu/hu mice, but is absent in CD63 ^+/+ WT mice. The anti-hCD63-GAA antibody was processed into mature 76 kDa hGAA.

Пример 10. Специфичные по отношению к мышце эффекторы интернализации.Example 10 Muscle-Specific Internalization Effectors.

Нокаутным по GAA мышам вводили биотинилированные антитела к специфичным по отношению к мышце антигенам, которые предусматривали антитело к интегрину альфа 7, антитело к CD9 и антитело к дистрогликану. Тканевое распределение этих антител определяли с помощью анализа вестернблоттинга. На фиг. 15 изображена гистограмма уровня антитела, найденного в скелетной мускулатуре (икроножной мышце, квадрицепсе и диафрагме), сердечной мышце, печени (что служило исходным уровнем для нормализации), почке и селезенке. Антитела к интегрину альфа 7 находили (на уровнях, превышающих уровни, обнаруженные в печени) в скелетной мускулатуре и сердце. Антитела к CD9 находили (на уровнях, превышающих уровни, обнаруженные в печени) в скелетной мускулатуре и сердце, а также в почке и селезенке (фиг. 15).GAA knockout mice were injected with biotinylated antibodies to muscle-specific antigens, which included anti-integrin alpha 7 antibody, anti-CD9 antibody, and anti-dystroglycan antibody. The tissue distribution of these antibodies was determined by Western blot analysis. In FIG. 15 is a histogram of antibody levels found in skeletal muscle (calf, quadriceps, and diaphragm), cardiac muscle, liver (which served as the baseline for normalization), kidney, and spleen. Anti-integrin alpha 7 antibodies have been found (at levels above those found in the liver) in skeletal muscle and heart. Anti-CD9 antibodies were found (at levels higher than those found in the liver) in skeletal muscle and heart, as well as in kidney and spleen (FIG. 15).

Чтобы определить, могут ли эти выбранные специфичные по отношению к мышцам антитела нацеливаться на лизосомы, антитела метили pHrodo-red, а затем инкубировали на протяжении ночи при 10 мкг/мл с мышиными миобластами C2C12. Везикулярную флуоресценцию определяли количественно и нормализовали к степени мечения флуорофора на антителе. Результаты, представленные на фиг. 16, показывают, что антитело к CD63, антитело к дистрогликану, антитело к м-кадгерину, антитело к CD9 и антитело к интегрину альфа 7 нацеливались на лизосомальную фракцию при низком pH миобластов C2C12.To determine if these selected muscle-specific antibodies could target lysosomes, the antibodies were labeled with pHrodo-red and then incubated overnight at 10 μg/ml with C2C12 mouse myoblasts. Vesicular fluorescence was quantified and normalized to the degree of fluorophore labeling on the antibody. The results shown in FIG. 16 show that anti-CD63 antibody, anti-dystroglycan antibody, anti-m-cadherin antibody, anti-CD9 antibody and anti-integrin alpha 7 antibody targeted the lysosomal fraction at low pH of C2C12 myoblasts.

Пример 11. Восстановление уровней содержания гликогена в мышце.Example 11 Recovery of muscle glycogen levels.

Нокаутных по GAA мышей (KO) возрастом 2-3 месяца с экспрессией нативного CD63 мыши подвергали гидродинамической доставке (HDD) плазмидных конструкций, кодирующих человеческую αглюкозидазу полной длины (hGAA), антитело к mCD63-GAA (антитело к CD63 мыши) и ассоциированную с ним легкую цепь или антитело к hCD63-GAA (антитело к CD63 человека) и ассоциированную с ним легкую цепь. Во всех конструкциях использовали идентичные плазмидные скелеты, состоящие из убиквитинового промотора и polyA-хвостов SV40. Вкратце, 40 мкг каждой плазмиды (т.е. 40 мкг тяжелой и легкой цепей или только hGAA) разбавляли 2-3 мл стерильного солевого раствора и быстро вводили в хвостовую вену мышам GAA KO. Забор крови из хвостовой вены каждые 3 дня демонстрировал уровни содержания hGAA или конструкций антитело-GAA в сыворотке крови в течение ~10 дней. Мышей умерщвляли через 3 недели после HDD, и ткани фиксировали замораживанием в жидком азоте. Ткани гомогенизировали в дистиллированной воде, кипятили и центрифугировали. Супернатанты анализировали на предмет гликогена с использованием набора для флуоресцентного анализа гликогена (MAK016, Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури).GAA knockout (KO) mice aged 2-3 months expressing native mouse CD63 were subjected to hydrodynamic delivery (HDD) of plasmid constructs encoding full-length human α-glucosidase (hGAA), anti-mCD63-GAA antibody (anti-mouse CD63 antibody) and its associated a light chain or an anti-hCD63-GAA antibody (anti-human CD63 antibody) and its associated light chain. All constructs used identical plasmid backbones consisting of the ubiquitin promoter and SV40 polyA tails. Briefly, 40 μg of each plasmid (ie 40 μg of heavy and light chains or hGAA alone) was diluted with 2-3 ml of sterile saline and rapidly injected into the tail vein of GAA KO mice. Tail vein sampling every 3 days demonstrated serum levels of hGAA or antibody-GAA constructs for ~10 days. Mice were sacrificed 3 weeks after HDD and tissues were fixed by freezing in liquid nitrogen. The tissues were homogenized in distilled water, boiled and centrifuged. Supernatants were analyzed for glycogen using a fluorescent glycogen assay kit (MAK016, Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Определяли уровни содержания гликогена в сердце, диафрагме и скелетной мускулатуре, в том числе в трицепсе, икроножной мышце и квадрицепсе, у мышей дикого типа, мышей GAA KO и мышей GAA KO, обработанных гидродинамически доставленными и экспрессированными hGAA или антителом к mCD63-GAA. Результаты, представленные на фиг. 17, показывают, что восстановление гликогена почти до уровней дикого типа у мышей, обработанных антителом к mCD63-GAA. Эффект восстановления гликогена был более выражен с антителом к mCD63-GAA, которое демонстрировало почти 100% восстановление от уровней содержания гликогена в мышцах дикого типа, чем с hGAA отдельно, которая демонстрировала лишь приблизительно 10-35% снижение уровней содержания гликогена в скелетной мускулатуре или диафрагме мышей KO (см. фиг. 17).Glycogen levels were determined in the heart, diaphragm, and skeletal muscles, including triceps, gastrocnemius, and quadriceps, in wild-type mice, GAA KO mice, and GAA KO mice treated with hydrodynamically delivered and expressed hGAA or anti-mCD63-GAA antibody. The results shown in FIG. 17 show that recovery of glycogen to nearly wild-type levels in anti-mCD63-GAA treated mice. The effect of glycogen recovery was more pronounced with the mCD63-GAA antibody, which showed nearly 100% recovery from wild-type muscle glycogen levels, than with hGAA alone, which showed only approximately 10-35% reduction in skeletal muscle or diaphragm glycogen levels. mice KO (see Fig. 17).

Определяли уровни содержания гликогена в сердце, диафрагме и скелетной мускулатуре, в том числе в трицепсе, икроножной мышце и квадрицепсе, у мышей дикого типа, мышей GAA KO и мышей GAA KO, обработанных гидродинамически доставленными (HDD) и экспрессированными антителом к hCD63-GAA, антителом к mCD63-GAA или антителом mCD63-mctMGAM. Результаты, представленные на фиг. 18, показывают, что восстановление гликогена почти до уровней дикого типа у мышей, обработанных антителом к mCD63-GAA. Эффект восстановления гликогена был более выражен с антителом к mCD63-GAA, которое демонстрировало восстановление уровней содержания гликогена в мышцах до 20% от уровней дикого типа, чем с антителом к hCD63-GAA отдельно, которое демонстрировало лишь приблизительно 20% снижение уровней содержания гликогена в скелетной мускулатуре или диафрагме мышей KO (см. фиг. 18). Этот результат дополнительно подтверждает усиленный эффект GAA, доставленной в лизосому посредством видоспецифической интернализации CD63. Обработку антителом к mCD63-mctMGAM посредством HDD у мышей GAA KO по сравнению с контрольными (необработанными) мышами GAA KO исследовали через 7 или 12 дней после HDD (см. фиг. 20). Сниженное содержание гликогена наблюдали in vivo у мышей GAA KO, обработанных специфичной по отношению к мыши HDD конструкцией антитело к mCD63-mctMGAM в оба момента времени, тогда как необработанные мыши дикого типа при прочих равных условиях не демонстрировали изменения в накоплении гликогена (фиг. 20).Glycogen levels were determined in the heart, diaphragm, and skeletal muscles, including triceps, gastrocnemius, and quadriceps, in wild-type mice, GAA KO mice, and GAA KO mice treated with hydrodynamically delivered (HDD) and expressed anti-hCD63-GAA antibody, an anti-mCD63-GAA antibody or an mCD63-mctMGAM antibody. The results shown in FIG. 18 show that recovery of glycogen to nearly wild-type levels in anti-mCD63-GAA treated mice. The glycogen recovery effect was more pronounced with anti-mCD63-GAA antibody, which showed restoration of muscle glycogen levels up to 20% of wild-type levels, than with anti-hCD63-GAA antibody alone, which showed only approximately 20% reduction in skeletal glycogen levels. musculature or diaphragm of KO mice (see Fig. 18). This result further confirms the enhanced effect of GAA delivered to the lysosome via species-specific internalization of CD63. Anti-mCD63-mctMGAM antibody treatment by HDD in GAA KO mice compared to control (untreated) GAA KO mice was examined 7 or 12 days after HDD (see FIG. 20). Decreased glycogen content was observed in vivo in GAA KO mice treated with the mouse-specific HDD antibody construct, anti-mCD63-mctMGAM antibody at both time points, while untreated wild-type mice ceteris paribus showed no change in glycogen storage (Fig. 20) .

Пример 12. Лизосомальная кислая липаза.Example 12 Lysosomal acid lipase.

Лизосомальная кислая липаза (LAL или LIPA) представляет собой фермент, который разрушаетLysosomal acid lipase (LAL or LIPA) is an enzyme that breaks down

--

Claims (30)

сложные холестериловые эфиры и триглицериды в лизосоме. Дефицит LIPA (например, LAL-D или заболевание Вольмана) приводит к накоплению жирового материала в печени, селезенке и других органах. Распространенность LAL-D составляет от 1 из 40000 до 1 из 300000 человек во всем мире. Младенцы с дефицитом LIPA, если их не лечить, умирают в течение 6-12 месяцев из-за полиорганной недостаточности. Дети более старшего возраста могут оставаться без диагноза до тех пор, пока они не умирают от сердечного приступа, инсульта или печеночной недостаточности.cholesteryl esters and triglycerides in the lysosome. LIPA deficiency (eg, LAL-D or Wolmann's disease) leads to accumulation of fatty material in the liver, spleen, and other organs. The prevalence of LAL-D is between 1 in 40,000 and 1 in 300,000 people worldwide. Infants with LIPA deficiency, if left untreated, die within 6-12 months due to multiple organ failure. Older children may go undiagnosed until they die of a heart attack, stroke, or liver failure. Для тестирования эффекта антитела, связанного с LIPA, в отношении активности эндогенной липазы, получали две конструкции LIPA-антитело: C-концевое слияние тяжелой цепи (антитело к myc-LIPA) и N-концевое слияние тяжелой цепи (LIPA-антитело к myc). cDNA аминокислот 24-399 из фермента лизосомальной кислой липазы человека (SEQ ID NO: 3) клонировали в N-конец или C-конец плазмиды тяжелой цепи антитела. Расщепляемую катепсином последовательность использовали в качестве линкера между тяжелой цепью и ферментом. Конструкции вместе с соответствующей легкой цепью трансфицировали в клетки CHO-K1. Супернатанты клеток CHO собирали через 5 дней после трансфекции и фильтровали в стерильных условиях. Супернатанты подвергали анализу вестерн-блоттинга и испытывали с антителом к LIPA и антителом к hIgG. Подтверждали экспрессию LIPA, антитела к myc-LIPA и LIPAантитело к myc в клетках CHO.To test the effect of a LIPA-bound antibody on endogenous lipase activity, two LIPA-antibody constructs were generated: a heavy chain C-terminal fusion (anti-myc-LIPA antibody) and an N-terminal heavy chain fusion (anti-myc LIPA antibody). Amino acid 24-399 cDNA from human lysosomal acid lipase enzyme (SEQ ID NO: 3) was cloned into the N-terminus or C-terminus of the antibody heavy chain plasmid. A cathepsin cleavable sequence was used as a linker between the heavy chain and the enzyme. The constructs, along with the appropriate light chain, were transfected into CHO-K1 cells. CHO cell supernatants were collected 5 days after transfection and filtered under sterile conditions. Supernatants were subjected to Western blot analysis and tested with anti-LIPA antibody and anti-hIgG antibody. The expression of LIPA, anti-myc-LIPA antibody and LIPA-anti-myc antibody in CHO cells was confirmed. Разбавления супернатантов в аналитическом буфере (0,2 М натрия ацетата, 0,4 М калия хлорида, pH 4,3) инкубировали с 4-метилумбеллиферилолеатом, субстратом LIPA, в течение 1 ч. Реакции останавливали с использованием глицинкарбонатного буфера при pH 10,7. Флуоресценцию считывали на устройстве для считывания планшетов при 360 нм возбуждении и 450 нм испускании. Как и антитело к mycLIPA, так и конструкции LIPA-антитело к myc проявляли значительную липазную активность в отношении контроля нативной LIPA (фиг. 19).Dilutions of supernatants in assay buffer (0.2 M sodium acetate, 0.4 M potassium chloride, pH 4.3) were incubated with 4-methylumbelliferyl oleate, a LIPA substrate, for 1 h. Reactions were stopped using glycine carbonate buffer at pH 10.7 . Fluorescence was read on a plate reader at 360 nm excitation and 450 nm emission. Both the anti-mycLIPA antibody and the LIPA-anti-myc antibody constructs exhibited significant lipase activity against native LIPA control (FIG. 19). Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к описанным в данном документе будут очевидны специалистам в данной области техники из вышеизложенного описания. Такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.The scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention in addition to those described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description. Such modifications are within the scope of the appended claims. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Композиция для лечения лизосомной болезни накопления (LSD), содержащая лизосомальный фермент, связанный с антигенсвязывающим белком, где антигенсвязывающий белок связывается с клеточным мембранным белком - эффектором интернализации, подвергающимся эндоцитозу, где клеточный мембранный белок - эффектор интернализации представляет собой CD63; и где лизосомальный фермент выбран из группы, состоящей из α-галактозидазы (GLA), βгалактозидазы (GLB), α-глюкозидазы (GAA), β-глюкозидазы, активатора сапозина-C, церамидазы, сфингомиелиназы, β-гексозаминидазы, активатора GM2, GM3-синтазы, арилсульфатазы, активатора сфинголипида, а-идуронидазы, идуронидаза-2-сульфатазы, гепарин-N-сульфатазы, N-ацетил-аглюкозаминидазы, а-глюкозамид-И-ацетилтрансферазы, N-ацетилглюкозамин-6-сульфатазы, Nацетилгалактозамин-6-сульфат-сульфатазы, N-ацетилгалактозамин-4-сульфатазы, β-глюкуронидазы, гиалуронидазы и их изозимов.1. Composition for the treatment of lysosomal storage disease (LSD), containing a lysosomal enzyme associated with an antigen-binding protein, where the antigen-binding protein binds to a cellular membrane protein - an internalization effector undergoing endocytosis, where the cellular membrane protein - an internalization effector is CD63; and wherein the lysosomal enzyme is selected from the group consisting of α-galactosidase (GLA), β-galactosidase (GLB), α-glucosidase (GAA), β-glucosidase, saposin-C activator, ceramidase, sphingomyelinase, β-hexosaminidase, GM2 activator, GM3 -synthase, arylsulfatase, sphingolipid activator, a-iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparin-N-sulfatase, N-acetyl-aglucosaminidase, a-glucosamide-I-acetyltransferase, N-acetylglucosamine-6-sulfatase, Nacetylgalactosamine-6- sulfate-sulfatase, N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, β-glucuronidase, hyaluronidase and their isozymes. 2. Композиция по п.1, где клеточный мембранный белок - эффектор интернализации локализуется на лизосомальной мембране.2. The composition according to claim 1, where the cell membrane protein - internalization effector is localized on the lysosomal membrane. 3. Композиция по п.1 или 2, где лизосомальный фермент выбран из группы, состоящей из агалактозидазы (GLA), β-галактозидазы (GLB) и α-глюкозидазы (GAA).3. The composition according to claim 1 or 2, wherein the lysosomal enzyme is selected from the group consisting of agalactosidase (GLA), β-galactosidase (GLB) and α-glucosidase (GAA). 4. Композиция по любому из пп.1-3, где антигенсвязывающий белок выбран из группы, состоящей из слитой молекулы на основе рецептора, молекулы-ловушки, слитой молекулы на основе рецептора и Fc-фрагмента, антитела, Fab-фрагмента, F(ab')2-фрагмента, Fd-фрагмента, Fv-фрагмента, одноцепочечной молекулы Fv (scFv), dAb-фрагмента, выделенной области, определяющей комплементарность (CDR), пептида CDR3, конформационно затрудненного пептида FR3-CDR3-FR4, домен-специфичного антитела, однодоменного антитела, антитела с делецией домена, химерного антитела, антитела с привитой CDR, диатела, триатела, тетратела, минитела, нанотела, моновалентного нанотела, бивалентного нанотела, иммунофармацевтического средства на основе модульного белка малого размера (SMIP), верблюжьего антитела (гомодимерное антитело с тяжелой цепью VHH) и вариабельного домена IgNAR акулы.4. The composition according to any one of claims 1 to 3, wherein the antigen binding protein is selected from the group consisting of a receptor-based fusion molecule, a decoy molecule, a receptor-based fusion molecule and an Fc fragment, an antibody, a Fab fragment, F(ab ')2-fragment, Fd-fragment, Fv-fragment, single-chain Fv molecule (scFv), dAb-fragment, complementarity determining region (CDR), CDR3 peptide, conformationally constrained FR3-CDR3-FR4 peptide, domain-specific antibody , single-domain antibody, domain-deleted antibody, chimeric antibody, CDR-grafted antibody, diabody, triabody, tetrabody, minibody, nanobody, monovalent nanobody, bivalent nanobody, small modular protein (SMIP) immunopharmaceutical, camel antibody (homodimeric antibody heavy chain VHH) and shark IgNAR variable domain. 5. Композиция по любому из пп.1-4, где лизосомальный фермент ковалентно связан с антигенсвязывающим белком.5. A composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the lysosomal enzyme is covalently linked to the antigen binding protein. 6. Композиция по п.5, где антигенсвязывающий белок содержит антитело, и при этом лизосомальный фермент ковалентно связан с C-концом тяжелой цепи антитела.6. The composition of claim 5, wherein the antigen binding protein comprises an antibody, and wherein the lysosomal enzyme is covalently linked to the C-terminus of the heavy chain of the antibody. 7. Композиция по любому из пп.1-4, где лизосомальный фермент связан с помощью белкового линкера с антигенсвязывающим белком.7. A composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the lysosomal enzyme is linked via a protein linker to an antigen binding protein. 8. Композиция по п.7, где антигенсвязывающий белок содержит полуантитело, при этом лизосомальный фермент ковалентно связан с Fc-доменом иммуноглобулина, и Fc-домен, который ковалентно8. The composition according to claim 7, where the antigen-binding protein contains a semi-antibody, while the lysosomal enzyme is covalently associated with the Fc domain of the immunoglobulin, and the Fc domain, which is covalently - 25 041885 связан с ферментом, ассоциирует с Fc-доменом антигенсвязывающего белка.- 25 041885 associated with the enzyme, associates with the Fc domain of the antigen-binding protein. 9. Композиция по п.7, где линкер представляет собой расщепляемый линкер.9. The composition of claim 7 wherein the linker is a cleavable linker. 10. Композиция по любому из пп.1-9, где лизосомальный фермент представляет собой αглюкозидазу (GAA) или обладает α-глюкозидазной (GAA) активностью.10. The composition according to any one of claims 1 to 9, wherein the lysosomal enzyme is α-glucosidase (GAA) or has α-glucosidase (GAA) activity. 11. Композиция по любому из пп.1-10, где лизосомальный фермент содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1.11. A composition according to any one of claims 1 to 10, wherein the lysosomal enzyme contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. 12. Композиция по любому из пп.1-9, где лизосомальный фермент представляет собой αгалактозидазу (GLA) или обладает α-галактозидазной (GLA) активностью.12. The composition according to any one of claims 1 to 9, wherein the lysosomal enzyme is α-galactosidase (GLA) or has α-galactosidase (GLA) activity. 13. Композиция по любому из пп.1-9 и 12, где лизосомальный фермент содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2.13. A composition according to any one of claims 1-9 and 12, wherein the lysosomal enzyme contains the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. 14. Композиция по любому из пп.1-4, где лизосомальный фермент не связан ковалентно с антигенсвязывающим белком.14. A composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the lysosomal enzyme is not covalently bound to the antigen binding protein. 15. Способ лечения субъекта, страдающего лизосомной болезнью накопления (LSD), предусматривающий введение субъекту композиции по п.1.15. A method of treating a subject suffering from lysosomal storage disease (LSD), comprising administering to the subject a composition according to claim 1. 16. Способ по п.15, где LSD выбран из группы, состоящей из сфинголипидоза, мукополисахаридоза и болезни накопления гликогена.16. The method of claim 15, wherein the LSD is selected from the group consisting of sphingolipidosis, mucopolysaccharidosis, and glycogen storage disease. 17. Способ по п.15 или 16, где LSD выбрана из группы, состоящей из заболевания Фабри, заболевания Гоше I типа, заболевания Гоше II типа, заболевания Гоше III типа, заболевания Ниманна-Пика типа A, заболевания Ниманна-Пика типа BGM1-ганглиозидоза, заболевания Сандгоффа, заболевания ТеяСакса, дефицита активатора GM2, GM3-ганглиозидоза, метахроматической лейкодистрофии, дефицита активатора сфинголипида, заболевания Шейе, заболевания Гурлера-Шейе, заболевания Гурлера, заболевания Хантера, заболевания Санфилиппо A, Санфилиппо B, Санфилиппо C, Санфилиппо D, синдрома Моркио типа A, синдрома Моркио типа B, заболевания Марото-Лами, заболевания Слая, MPS IX и заболевания Помпе.17. The method of claim 15 or 16, wherein the LSD is selected from the group consisting of Fabry disease, Gaucher disease type I, Gaucher disease type II, Gaucher disease type III, Niemann-Pick disease type A, Niemann-Pick disease type BGM1- gangliosidosis, Sandhoff's disease, Tay-Sachs' disease, GM2 activator deficiency, GM3 gangliosidosis, metachromatic leukodystrophy, sphingolipid activator deficiency, Schie's disease, Hurler-Scheie's disease, Hurler's disease, Hunter's disease, Sanfilippo A disease, Sanfilippo B, Sanfilippo C, Sanfilippo D, Morquio syndrome type A, Morquio syndrome type B, Maroteau-Lami disease, Sly disease, MPS IX and Pompe disease. 18. Способ по любому из пп.15-17, где LSD представляет собой заболевание Фабри или заболевание Помпе.18. The method of any one of claims 15-17 wherein the LSD is Fabry disease or Pompe disease. 19. Способ по любому из пп.15-18, где лизосомальный фермент выбран из группы, состоящей из αгалактозидазы (GLA), β-галактозидазы (GLB) и α-глюкозидазы (GAA).19. The method according to any one of claims 15-18, wherein the lysosomal enzyme is selected from the group consisting of α-galactosidase (GLA), β-galactosidase (GLB), and α-glucosidase (GAA). 20. Способ по любому из пп.15-19, где лизосомальный фермент не индуцирует иммунологическую реакцию у субъекта.20. The method according to any one of claims 15-19, wherein the lysosomal enzyme does not induce an immunological response in the subject. 21. Способ по любому из пп.15-20, где лизосомальный фермент представляет собой изозим.21. The method according to any one of claims 15-20, wherein the lysosomal enzyme is an isozyme. 22. Способ по п.21, где LSD представляет собой заболевание Помпе, эндогенный фермент представляет собой α-глюкозидазу (GAA) и изозим выбран из группы, состоящей из кислой α-глюкозидазы, сахаразы-изомальтазы (SI), мальтазы-глюкоамилазы (MGAM), глюкозидазы II (GANAB) и нейтральной α-глюкозидазы (C GNAC).22. The method of claim 21 wherein the LSD is Pompe disease, the endogenous enzyme is α-glucosidase (GAA) and the isozyme is selected from the group consisting of acid α-glucosidase, sucrase-isomaltase (SI), maltase-glucoamylase (MGAM ), glucosidase II (GANAB), and neutral α-glucosidase (C GNAC). 23. Способ по п.21, где LSD представляет собой заболевание Фабри, эндогенный фермент представляет собой α-галактозидазу A (GLA), а изозим представляет собой α-N-ацетилгалактозаминидазу, сконструированную с обеспечением GLA-активности.23. The method of claim 21, wherein the LSD is Fabry disease, the endogenous enzyme is α-galactosidase A (GLA), and the isozyme is α-N-acetylgalactosaminidase engineered to provide GLA activity. 24. Способ по любому из пп.15-23, где антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, фрагмент антитела или иной антигенсвязывающий белок.24. The method of any one of claims 15-23, wherein the antigen-binding protein is an antibody, antibody fragment, or other antigen-binding protein. 25. Способ по п.24, где антигенсвязывающий белок представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с лизосомальным ферментом и клеточным мембранным белком.25. The method of claim 24 wherein the antigen binding protein is a bispecific antibody that binds to a lysosomal enzyme and a cell membrane protein. 26. Способ по любому из пп.15-24, где лизосомальный фермент связан с Fc-доменом иммуноглобулина и антигенсвязывающий белок содержит полуантитело.26. The method of any one of claims 15-24, wherein the lysosomal enzyme is linked to the Fc domain of an immunoglobulin and the antigen-binding protein comprises a semi-antibody. 27. Способ по любому из пп.15-24, где лизосомальный фермент ковалентно связан с C-концом тяжелой цепи антитела к клеточному мембранному белку.27. The method of any one of claims 15-24, wherein the lysosomal enzyme is covalently linked to the C-terminus of the anti-cell membrane protein antibody heavy chain. 28. Способ по любому из пп.15-24, где лизосомальный фермент ковалентно связан с N-концом тяжелой цепи антитела к клеточному мембранному белку.28. The method of any one of claims 15-24, wherein the lysosomal enzyme is covalently linked to the N-terminus of the anti-cell membrane protein antibody heavy chain. 29. Способ по п.25, где лизосомальный фермент представляет собой α-галактозидазу (GLA) и LSD представляет собой заболевание Фабри.29. The method of claim 25 wherein the lysosomal enzyme is α-galactosidase (GLA) and the LSD is Fabry disease. 30. Способ по п.25, где лизосомальный фермент представляет собой α-глюкозидазу (GAA) и LSD представляет собой заболевание Помпе.30. The method of claim 25 wherein the lysosomal enzyme is α-glucosidase (GAA) and the LSD is Pompe disease. --