RU2805648C2

RU2805648C2 - Bispecific binding molecules capable of binding cd137 and tumor antigens and variants of their application

Info

Publication number: RU2805648C2
Application number: RU2019128669A
Authority: RU
Inventors: Лицинь Лю; Чиа-Ин Као Лам; Гундо ДИДРИХ; Лесли С. Джонсон; Пол А. Мур; Эцио Бонвини
Original assignee: Макродженикс, Инк.
Priority date: 2017-02-24
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2023-10-23

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: novel HER2/neu-binding molecule has been proposed. A pharmaceutical composition containing said binding molecules and the use of said molecules for the treatment of diseases and conditions associated with HER2/Neu expression, such as cancer, are also proposed.

EFFECT: obtaining binding molecules with improved binding affinity for HER2 and improved stability.

12 cl, 81 dwg, 15 tbl, 11 ex

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИCROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявкам на патент США №62/463353 (подана 24 февраля 2017 г.; на рассмотрении) и 62/597594 (подана 12 декабря 2017 г.; на рассмотрении), которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.[0001] This application claims priority to U.S. Patent Applications 62/463353 (filed Feb. 24, 2017; pending) and 62/597594 (filed Dec. 12, 2017; pending), which are incorporated herein in their entirety by links.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLINK TO LIST OF SEQUENCES

[0002] Настоящая заявка включает один или более перечней последовательностей в соответствии с §1.821 раздела 37 Свода федеральных правил США и далее, которые раскрыты на машиночитаемом носителе (название файла: 1301_0149PCT_ST25.txt, создан 11 февраля 2018 г. и имеет размер 309094 байта), данный файл полностью включен в настоящий документ посредством ссылки.[0002] This application includes one or more sequence listings in accordance with 37 USC §1.821 et seq., which are disclosed on a machine-readable medium (file name: 1301_0149PCT_ST25.txt, created February 11, 2018 and size 309094 bytes) , this file is incorporated herein by reference in its entirety.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD

[0003] Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, которые имеют один или более эпитопсвязывающих сайтов, специфичных для эпитопа CD137, и один или более эпитопсвязывающих сайтов, специфичных для эпитопа опухолевого антигена («ТА») (например, «CD137×TA связывающая молекула»). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения такие CD137×TA связывающие молекулы будут представлять собой биспецифические молекулы, в частности, биспецифические четырехвалентные диатела, которые состоят из двух, трех, четырех или более четырех полипептидных цепей и имеют два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. Согласно другому варианту такие CD137×TA связывающие молекулы будут представлять собой биспецифические молекулы, в частности, биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, состоящие из трех или более полипептидных цепей и имеющие один или два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и один или два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с CD137 и ТА. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат любые такие CD137×TA связывающие молекулы. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких молекул в лечении рака и других заболеваний и состояний. Согласно настоящему изобретению также предложены новые CD137-связывающие молекулы и HER2/neu-связывающие молекулы, а также их производные и варианты их применения.[0003] The present invention provides binding molecules that have one or more epitope-binding sites specific for a CD137 epitope and one or more epitope-binding sites specific for a tumor antigen (“TA”) epitope (e.g., “CD137×TA binding molecule” ). According to one embodiment of the present invention, such CD137xTA binding molecules will be bispecific molecules, in particular, bispecific tetravalent diabodies that consist of two, three, four, or more than four polypeptide chains and have two epitope-binding sites, each of which is specific for an epitope CD137, and two epitope-binding sites, each of which is specific for the TA epitope. In another embodiment, such CD137xTA binding molecules will be bispecific molecules, in particular, bispecific trivalent binding molecules consisting of three or more polypeptide chains and having one or two epitope binding sites, each of which is specific for a CD137 epitope, and one or two epitope-binding sites, each of which is specific for the TA epitope. The CD137xTA binding molecules of the present invention are capable of simultaneously binding to CD137 and TA. The present invention relates to pharmaceutical compositions that contain any such CD137xTA binding molecules. The present invention further relates to methods of using such molecules in the treatment of cancer and other diseases and conditions. The present invention also provides novel CD137 binding molecules and HER2/neu binding molecules, as well as derivatives thereof and uses thereof.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART

[0004] CD137 (также известный как 4-1ВВ и «член 9 суперсемейства рецепторов TNF» («TNFRSF9»)) представляет собой костимулирующий рецептор, который является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей, опосредующий СD28-зависимую и независимую костимуляцию Т-клеток (Vinay, D.S. and Kwon, B.S. (1998) «Role of 4-1BB in immune responses», Semin Immunol. 10:481-489; Bartkowiak, T. et al. (2015) «4-1BB Agonists: Multi-Potent Potentiators Of Tumor Immunity», Frontiers Oncol. 5:117; pp. 1-16; So, Т., et al. (2008) «Immune Regulation And Control Of Regulatory T Cells By OX40 And 4-1BB», Cytokine & Growth Factor Rev. 19:253-262; Croft, M. (2009) «The Role Of TNF Superfamily Members In T-Cell Function And Diseases», Nat. Rev. Immunol. 9:271-285; Yonezawa, A. et al. (2015) «Boosting cancer immunotherapy with Anti-CD137 antibody therapy», Clin. Cancer Res. 21(14):3113-3120; Li, S.Y. et al. (2013) immunotherapy Of Melanoma With The Immunecostimulatory Monoclonal Antibodies Targeting CD137», Clin. Pharmacol. 5:47-53; Vinay, D.S. et al. (2012) «Immunotherapy Of Cancer With 4-1BB», Mol. Cancer Ther. 11:1062-1070; Houot, R. et al. (2012) «Boosting Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody», Oncoimmunology. 1:957-958; Kwon, B.S. et al. (1989) «cDNA Sequences Of Two Inducible T-Cell Genes», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1963-1967; Chen, L. et al. (2013) (Molecular Mechanisms Of T Cell Co-Stimulation And Coinhibition», Nat. Rev. Immunol. 13:227-242; Yao S. et al. «Advances In Targeting Cell Surface Signaling Molecules For Immune Modulation», Nat. Rev. Drug Discov. 12:130-146).[0004] CD137 (also known as 4-1BB and “TNF receptor superfamily member 9” (“TNFRSF9”)) is a costimulatory receptor that is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily that mediates CD28-dependent and -independent costimulation of T cells ( Vinay, D. S. and Kwon, B. S. (1998) "Role of 4-1BB in immune responses", Semin Immunol. 10:481-489; Bartkowiak, T. et al. (2015) "4-1BB Agonists: Multi-Potent Potentiators Of Tumor Immunity", Frontiers Oncol. 5:117; pp. 1-16; So, T., et al. (2008) "Immune Regulation And Control Of Regulatory T Cells By OX40 And 4-1BB", Cytokine & Growth Factor Rev. 19:253-262; Croft, M. (2009) "The Role Of TNF Superfamily Members In T-Cell Function And Diseases", Nat. Rev. Immunol. 9:271-285; Yonezawa, A. et al. (2015) "Boosting cancer immunotherapy with Anti-CD137 antibody therapy", Clin. Cancer Res. 21(14):3113-3120; Li, S.Y. et al. (2013) immunotherapy Of Melanoma With The Immunecostimulatory Monoclonal Antibodies Targeting CD137", Clin. Pharmacol. 5:47-53; Vinay, D.S. et al. (2012) “Immunotherapy Of Cancer With 4-1BB”, Mol. Cancer Ther. 11:1062-1070; Houot, R. et al. (2012) "Boosting Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulating Antibody", Oncoimmunology. 1:957-958; Kwon, B.S. et al. (1989) "cDNA Sequences Of Two Inducible T-Cell Genes", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1963-1967; Chen, L. et al. (2013) (Molecular Mechanisms Of T Cell Co-Stimulation And Coinhibition", Nat. Rev. Immunol. 13:227-242; Yao S. et al. "Advances In Targeting Cell Surface Signaling Molecules For Immune Modulation", Nat. Rev. Drug Discov 12:130-146).

[0005] CD137 индуцируемо экспрессируется T-клетками, природными клетками-киллерами (NK), дендритными клетками (ДК), В-клетками и другими клетками иммунной системы (Vinay, D.S. et al. (2015) «Therapeutic Potential Of Anti-CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibodies, Expert Opinion On Therapeutic Targets», DOI:10.1517/14728222.2016.1091448; pp. 1-14; Wang, C. et al. (2009) «Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges», Immunol. Rev. 229:192-215; Sallin, M.A. et al. (2014) «The Anti-Lymphoma Activities Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII^-/- Mice», Cancer Immunol, Immunother. 63:947-958; Melero, I. et al. (2008) «Multilayered Action Mechanisms Of CD137 (4-1BB)-Targeted Immunotherapies», Trends Pharmacol Sci. 29:383-390; Ramakrishna, V. et al. (2015) «Characterization Of The Human T Cell Response To In Vitro CD27 Costimulation With Varlilumab», J. Immunother. Canc. 2:37; pp. 1-13). Белок состоит из 255 аминокислотного белка, имеющего короткую N-концевую цитоплазматическую часть, транс мембранную область и внеклеточный домен, который имеет 3 богатых цистеином мотива (Schwarz, Н. et al. (1993) «А Receptor Induced By Lymphocyte Activation (ILA): A New Member Of The Human Nerve-Growth-Factor / Tumor-Necrosis-Factor Receptor Family», Gene 134:295-298).[0005] CD137 is inducibly expressed by T cells, natural killer (NK) cells, dendritic cells (DCs), B cells and other cells of the immune system (Vinay, DS et al. (2015) “Therapeutic Potential Of Anti-CD137 ( 4-1BB) Monoclonal Antibodies, Expert Opinion On Therapeutic Targets", DOI:10.1517/14728222.2016.1091448; pp. 1-14; Wang, C. et al. (2009) "Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges", Immunol. Rev. 229:192-215; Sallin, M.A. et al. (2014) "The Anti-Lymphoma Activities Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII ^-/- Mice", Cancer Immunol, Immunother 63:947-958;Melero, I. et al. (2008) "Multilayered Action Mechanisms of CD137 (4-1BB)-Targeted Immunotherapies", Trends Pharmacol Sci. 29:383-390; Ramakrishna, V. et al. (2015) "Characterization Of The Human T Cell Response To In Vitro CD27 Costimulation With Varlilumab", J. Immunother. Canc. 2:37; pp. 1-13). The protein consists of a 255 amino acid protein having a short N-terminal cytoplasmic part, a transmembrane region and an extracellular domain that has 3 cysteine-rich motifs (Schwarz, H. et al. (1993) “A Receptor Induced By Lymphocyte Activation (ILA): A New Member of the Human Nerve-Growth-Factor/Tumor-Necrosis-Factor Receptor Family", Gene 134:295-298).

[00061 Лигирование CD137 его лигандом CD137L (4-1BBL; TNFSF9), который в основном, хотя и не исключительно, экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках (АПК), вызывает различные ответы Т-клеток, такие как размножение клеток, повышенная секреция цитокинов и предотвращение гибели клеток, индуцированной активацией (Qian, Y. et al. (2015) «CD137 Ligand-Mediated Reverse Signaling Inhibits Proliferation And Induces Apoptosis In Non-Small Cell Lung Cancer», Med. Oncol. 32:44; pp. 1-10); Sallin, M.A. et al. (2014) «The Anti-Lymphoma Activities Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII^-/- Mice», Cancer Immunol. Immunother. 63:947-958; Lee, S.W. et al. (2009) «4-1BB As A Therapeutic Target For Human Diseases, Adv. Exp. Med. Biol. 647:120-129; Thum, E. et al. (2009) «CD137, Implications In Immunity And Potential For Therapy», Front. Biosci. (Landmark Ed). 14:4173-4188; Wang, C. et al. (2009) «Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges», Immunol. Rev. 229(1):192-215; Long, A.H. et al. (2015) «4-1ВВ Costimulation Ameliorates T Cell Exhaustion Induced By Tonic Signaling Of Chimeric Antigen Receptors», Nature Med. 21(6):581; pp. 1-13). Таким образом, такое лигирование служит для активации иммунной системы. Однако цис-взаимодействия между CD137 и CD137L также эффективно подавляют экспрессию CD137L (Kwon, В. (2015) «Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?», Immune Network. 15(3): 121-124). Соответственно, функция лиганда CD137 заключается в контроле степени и кинетики СВ137-опосредуемой активации иммунной системы (Kwon, В. (2015) «Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?», Immune Network. 15(3): 121-124; Shuford WW et al. (1997) «4-1BB Costimulatory Signals Preferentially Induce CD8+ T Cell Proliferation And Lead To The Amplification In Vivo Of Cytotoxic T Cell Responses», J. Exp. Med. 186:47-55).[00061 Ligation of CD137 by its ligand CD137L (4-1BBL; TNFSF9), which is primarily, although not exclusively, expressed on antigen presenting cells (APCs), induces various T cell responses such as cell proliferation, increased cytokine secretion, and prevention of death cell activation-induced (Qian, Y. et al. (2015) “CD137 Ligand-Mediated Reverse Signaling Inhibits Proliferation And Induces Apoptosis In Non-Small Cell Lung Cancer,” Med. Oncol. 32:44; pp. 1-10) ; Sallin, M.A. et al. (2014) "The Anti-Lymphoma Activities Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII ^-/- Mice", Cancer Immunol. Immunother. 63:947-958; Lee, S. W. et al. (2009) “4-1BB As A Therapeutic Target For Human Diseases,” Adv. Exp. Med. Biol. 647:120-129; Thum, E. et al. (2009) “CD137, Implications In Immunity And Potential For Therapy”, Front. Biosci. (Landmark Ed). 14:4173-4188; Wang, C. et al. (2009) “Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL: Complexities And Challenges”, Immunol. Rev. 229(1):192-215; Long, A.H. et al. (2015) "4-1BB Costimulation Ameliorates T Cell Exhaustion Induced By Tonic Signaling Of Chimeric Antigen Receptors", Nature Med. 21(6):581; pp. 1-13). Thus, such ligation serves to activate the immune system. However, cis-interactions between CD137 and CD137L also effectively suppress CD137L expression (Kwon, W. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?”, Immune Network. 15(3): 121-124) . Accordingly, the function of the CD137 ligand is to control the extent and kinetics of CD137-mediated activation of the immune system (Kwon, V. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses?”, Immune Network. 15(3): 121-124; Shuford WW et al. (1997) "4-1BB Costimulatory Signals Preferentially Induce CD8+ T Cell Proliferation And Lead To The Amplification In Vivo Of Cytotoxic T Cell Responses", J. Exp. Med. 186:47-55) .

[0007] Примечательно, что CD137, экспрессируемый на человеческих NK-клетках, становится активным после связывания с противоопухолевыми антителами (т.е. антителами, которые связывают опухолевый антиген («ТА»)), которые стали связанными с опухолевыми клетками (Houot, R. et al. (2012) «Boosting Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody», Oncoimmunology. 1:957-958; Kohrt, H.E. et al. (2014) «Targeting CD137 Enhances The Efficacy Of Cetuximab», J. Clin. Invest. 124(4):2668-2682; Lin, W. et al. (2008) «Fc-Dependent Expression Of CD137 On Human NK Cells: Insights Into «Agonistic» Effects Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies», Blood 112(3):699-707; Mittal, P. et al. (2015) «Tumor-Unrelated CD4 T Cell Help Augments CD134 Plus CD137 Dual Costimulation Tumor Therapy», J. Immunol. Nov 11. pii: 1502032; pp. 1-14; , A.R. et al. (2015) «Cancer Immunotherapy With Immunomodulatory Anti-CD137 And Anti-PD-1 Monoclonal Antibodies Requires Batf3-Dependent Dendritic Cells», Cancer Discov. Oct 22. pii: CD-15-0510; pp. 1-28; Wei, H. et al. (2014) «Dual Targeting Of CD137 Co-Stimulatory And PD-1 Co-Inhibitory Molecules For Ovarian Cancer Immunotherapy», OncoImmunology 3:e28248; pp. 1-3; Seo, S.K. et al. (2004) «4-1BB-Mediated Immunotherapy Of Rheumatoid Arthritis», Nat. Med. 10:1088-1094).[0007] Notably, CD137 expressed on human NK cells becomes active upon binding to antitumor antibodies (i.e., antibodies that bind tumor antigen (“TA”)) that have become associated with tumor cells (Houot, R et al (2012) "Boosting Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulating Antibody", Oncoimmunology 1:957-958; Kohrt, HE et al (2014) "Targeting CD137 Enhances The Efficacy Of Cetuximab" , J. Clin. Invest. 124(4):2668-2682; Lin, W. et al. (2008) "Fc-Dependent Expression Of CD137 On Human NK Cells: Insights Into "Agonistic" Effects Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies ", Blood 112(3):699-707; Mittal, P. et al. (2015) "Tumor-Unrelated CD4 T Cell Help Augments CD134 Plus CD137 Dual Costimulation Tumor Therapy", J. Immunol. Nov 11. pii: 1502032 ; pp. 1-14; , AR et al. (2015) “Cancer Immunotherapy With Immunomodulatory Anti-CD137 And Anti-PD-1 Monoclonal Antibodies Requires Batf3-Dependent Dendritic Cells”, Cancer Discov. Oct 22. pii: CD-15-0510; pp. 1-28; Wei, H. et al. (2014) “Dual Targeting Of CD137 Co-Stimulatory And PD-1 Co-Inhibitory Molecules For Ovarian Cancer Immunotherapy”, OncoImmunology 3:e28248; pp. 1-3; Seo, SK et al. (2004) "4-1BB-Mediated Immunotherapy Of Rheumatoid Arthritis", Nat. Med. 10:1088-1094).

[0008] Такие утверждения легли в основу предположения, что антитела, которые являются иммуноспецифичными для CD137, можно применять для активации иммунной системы и обеспечения терапии рака (Melero I. et al. (1997) «Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors», Nat Med. 3:682-385; Sun, Y. et al. (2002) «Со stimulatory Molecule-Targeted Antibody Therapy Of A Spontaneous Autoimmune Disease», Nature Med. 8:1405-1413; Kammer, G.M. et al. (2002) «Immunotherapy Tackles Lupus», Nat. Med. 8(12): 1356-1358; Foell, J. et al. (2003) «CD137 Costimulatory T Cell Receptor Engagement Reverses Acute Disease In Lupus-Prone NZB x NZW F1 Mice», J. Clin. Invest. 111(10):1505-1518; Mittler, R.S. et al. (2004) «Anti-CD137 Antibodies In The Treatment Of Autoimmune Disease And Cancer», Immunol. Res. 29(1-3): 197-208; Foell, J.L. et al. (2004) «Engagement of The CD137 (4-1BB) Costimulatory Molecule Inhibits And Reverses The Autoimmune Process In Collagen-Induced Arthritis And Establishes Lasting Disease Resistance», Immunology 113(1):89-98; Sytwu, H.K. et al. (2003) «Anti-4-1BB-Based Immunotherapy For Autoimmune Diabetes: Lessons From A Transgenic Non-Obese Diabetic (NOD) Model», J. Autoimmun. 21(3):247-254; Hernandez-Chacon JA et al. (2011) «Costimulation Through The CD137/4-1BB Pathway Protects Human Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes From Activation Induced Cell Death And Enhances Antitumor Effector Function», J. Immunother. 34:236-250; Morales-Kastresana, A. et al. (2014) «Combinations Of Immunostimulatory Antibodies With Synergistic Effects Against Spontaneous Cancer», OncoImmunology 3:2, e27812, pp. 1-4; Sanmamed, M.F. et al. (2015) «Agonists of Co-stimulation in Cancer Immunotherapy Directed Against CD137, OX40, GITR, CD27, CD28, and ICOS», Seminars Oncol. 42(4):640-655; Tongu, M. et al. (2015) «Intermittent Chemotherapy Can Retain The Therapeutic Potential Of Anti-CD137 Antibody During The Late Tumor-Bearing State», Cancer Sci. 106(1):9-17; Takeda, K. et al. (2007) «Combination Antibody-Based Cancer Immunotherapy», Cancer Sci. 98(9): 1297-1302). Антитела к CD137 раскрыты в патентах США №№2014/0274909; 2013/0280265; 2013/0273078; 2013/0071403; 2012/0058047; 2011/0104049; 2011/0097313; 2008/0166336; 2008/0019905; 2006/0188439; 2006/0182744; 2006/0121030; и 2003/0223989.[0008] Such statements have led to the suggestion that antibodies that are immunospecific for CD137 could be used to activate the immune system and provide cancer therapy (Melero I. et al. (1997) "Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors", Nat Med. 3:682-385; Sun, Y. et al. (2002) "With stimulatory Molecule-Targeted Antibody Therapy Of A Spontaneous Autoimmune Disease", Nature Med. 8:1405-1413; Kammer, G. M. et al (2002) "Immunotherapy Tackles Lupus", Nat Med 8(12): 1356-1358; Foell, J. et al (2003) "CD137 Costimulatory T Cell Receptor Engagement Reverses Acute Disease In Lupus" -Prone NZB x NZW F1 Mice", J. Clin. Invest. 111(10):1505-1518; Mittler, R. S. et al. (2004) "Anti-CD137 Antibodies In The Treatment Of Autoimmune Disease And Cancer", Immunol. Res 29(1-3): 197-208 Foell, J.L. et al (2004) Engagement of The CD137 (4-1BB) Costimulatory Molecule Inhibits And Reverses The Autoimmune Process In Collagen-Induced Arthritis And Establishes Lasting Disease Resistance ", Immunology 113(1):89-98; Sytwu, H.K. et al. (2003) “Anti-4-1BB-Based Immunotherapy For Autoimmune Diabetes: Lessons From A Transgenic Non-Obese Diabetic (NOD) Model”, J. Autoimmune. 21(3):247-254; Hernandez-Chacon JA et al. (2011) “Costimulation Through The CD137/4-1BB Pathway Protects Human Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes From Activation Induced Cell Death And Enhances Antitumor Effector Function”, J. Immunother. 34:236-250; Morales-Kastresana, A. et al. (2014) "Combinations Of Immunostimulatory Antibodies With Synergistic Effects Against Spontaneous Cancer", OncoImmunology 3:2, e27812, pp. 1-4; Sanmamed, M.F. et al. (2015) “Agonists of Co-stimulation in Cancer Immunotherapy Directed Against CD137, OX40, GITR, CD27, CD28, and ICOS,” Seminars Oncol. 42(4):640-655; Tongu, M. et al. (2015) "Intermittent Chemotherapy Can Retain The Therapeutic Potential Of Anti-CD137 Antibody During The Late Tumor-Bearing State", Cancer Sci. 106(1):9-17; Takeda, K. et al. (2007) “Combination Antibody-Based Cancer Immunotherapy”, Cancer Sci. 98(9): 1297-1302). Antibodies to CD137 are disclosed in US patent Nos. 2014/0274909; 2013/0280265; 2013/0273078; 2013/0071403; 2012/0058047; 2011/0104049; 2011/0097313; 2008/0166336; 2008/0019905; 2006/0188439; 2006/0182744; 2006/0121030; and 2003/0223989.

[0009] Однако, несмотря на все такие достижения предшествующего уровня техники, остается потребность в улучшенных композициях, способных более активно направлять иммунную систему организма для атаки раковых клеток или клеток, инфицированных патогеном, в частности, при более низких терапевтических концентрациях. Несмотря на то, что адаптивная иммунная система может быть эффективным механизмом защиты против рака и заболевания, ее функционирование часто затрудняется механизмами подавления/уклонения от иммунитета в микросреде опухоли, опосредуемыми сниженной/отсутствующей костимулирующей активностью CD137. Кроме того, коингибирующие молекулы, экспрессируемые опухолевыми клетками, иммунными клетками и стромальными клетками в среде опухоли, могут доминантно ослаблять ответы Т-клеток против раковых клеток.[0009] However, despite all such advances in the prior art, there remains a need for improved compositions capable of more actively directing the body's immune system to attack cancer cells or cells infected by a pathogen, particularly at lower therapeutic concentrations. Although the adaptive immune system can be an effective mechanism of defense against cancer and disease, its functioning is often hampered by immune suppression/evasion mechanisms in the tumor microenvironment mediated by reduced/absent CD137 co-stimulatory activity. In addition, coinhibitory molecules expressed by tumor cells, immune cells, and stromal cells in the tumor environment can dominantly dampen T cell responses against cancer cells.

[00010] Как подробно описано ниже, настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность, обеспечивая CD137×TA связывающие молекулы. Такие биспецифические молекулы способны связываться с опухолевыми антигенами, которые экспрессируются на поверхностях опухолевых клеток, и колокализовать CD137-экспрессирующие NK-клетки с такими опухолевыми клетками. Такая колокализация активирует NK-клетки так, чтобы стимулировать активацию или постоянную активацию иммунной системы (например, стимулирование ответа цитотоксических Т-клеток против опухолевых клеток). Эти признаки позволяют применять такие биспецифические молекулы при стимуляции иммунной системы и, в частности, в лечении рака и ассоциированных с патогенами заболеваний и состояний. Настоящее изобретение относится к указанным и другим целям.[00010] As described in detail below, the present invention addresses this need by providing CD137xTA binding molecules. Such bispecific molecules are capable of binding to tumor antigens that are expressed on the surfaces of tumor cells and colocalizing CD137-expressing NK cells with such tumor cells. This colocalization activates NK cells so as to promote activation or sustained activation of the immune system (eg, promoting a cytotoxic T cell response against tumor cells). These features allow the use of such bispecific molecules in stimulating the immune system and, in particular, in the treatment of cancer and pathogen-associated diseases and conditions. The present invention relates to these and other purposes.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

[00011] Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, которые имеют один или более эпитопсвязывающих сайтов, специфичных для эпитопа CD137, и один или более эпитопсвязывающих сайтов, специфичных для эпитопа опухолевого антигена («ТА») (например, «CD137×TA связывающая молекула»). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения такие CD137×TA связывающие молекулы будут представлять собой биспецифические молекулы, в частности, биспецифические четырехвалентные диатела, которые состоят из двух, трех, четырех или более четырех полипептидных цепей и имеют два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. Согласно другому варианту такие CD137×TA связывающие молекулы будут представлять собой биспецифические молекулы, в частности, биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, состоящие из трех или более полипептидных цепей и имеющие один или два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и один или два эпитопсвязывающих сайта каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с CD137 и ТА. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат любые такие CD137×TA связывающие молекулы. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких молекул в лечении рака и других заболеваний и состояний. Настоящее изобретение также относится к новым CD137-связывающим молекулам и HER2/neu-связывающим молекулам, а также их производным и вариантам их применения.[00011] The present invention provides binding molecules that have one or more epitope-binding sites specific for a CD137 epitope and one or more epitope-binding sites specific for a tumor antigen (“TA”) epitope (e.g., “CD137×TA binding molecule” ). According to one embodiment of the present invention, such CD137xTA binding molecules will be bispecific molecules, in particular, bispecific tetravalent diabodies that consist of two, three, four, or more than four polypeptide chains and have two epitope-binding sites, each of which is specific for an epitope CD137, and two epitope-binding sites, each of which is specific for the TA epitope. In another embodiment, such CD137xTA binding molecules will be bispecific molecules, in particular, bispecific trivalent binding molecules consisting of three or more polypeptide chains and having one or two epitope binding sites, each of which is specific for a CD137 epitope, and one or two epitope-binding sites, each of which is specific for the TA epitope. The CD137xTA binding molecules of the present invention are capable of simultaneously binding to CD137 and TA. The present invention relates to pharmaceutical compositions that contain any such CD137xTA binding molecules. The present invention further relates to methods of using such molecules in the treatment of cancer and other diseases and conditions. The present invention also relates to novel CD137 binding molecules and HER2/neu binding molecules, as well as derivatives thereof and uses thereof.

[00012] Настоящее изобретение относится к CD137×TA связывающим молекулам, которые являются одновалентными в том отношении, что они способны связываться только с одной копией эпитопа CD137 и только с одной копией эпитопа ТА, но являются биспецифическими в том отношении, что одно такое диатело способно одновременно связываться с эпитопом CD137 и с эпитопом ТА. Однако настоящее изобретение, в частности, относится к CD137×TA связывающим молекулам, которые состоят из полипептидных цепей, которые гетеродимерно связаны друг с другом с образованием двух сайтов связывания, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и двух сайтов связывания, каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. Такие предпочтительные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению называют «биспецифическими четырехвалентными». Настоящее изобретение также относится, в частности, к CD137×TA связывающим молекулам, которые состоят из полипептидных цепей, которые гетеродимерно связаны друг с другом с образованием двух сайтов связывания, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и одного сайта связывания, который специфичен для эпитопа ТА. Такие предпочтительные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению называют «биспецифическими трехвалентными».[00012] The present invention provides CD137xTA binding molecules that are monovalent in that they are capable of binding to only one copy of the CD137 epitope and only one copy of the TA epitope, but are bispecific in that one such diabody is capable of simultaneously bind to the CD137 epitope and the TA epitope. However, the present invention particularly relates to CD137xTA binding molecules that consist of polypeptide chains that are heterodimerically linked to each other to form two binding sites, each specific for a CD137 epitope, and two binding sites, each specific for the TA epitope. Such preferred CD137xTA binding molecules of the present invention are referred to as "bispecific tetravalent". The present invention also relates, in particular, to CD137xTA binding molecules that consist of polypeptide chains that are heterodimerically linked to each other to form two binding sites, each of which is specific for a CD137 epitope, and one binding site that is specific for the CD137 epitope. TA. Such preferred CD137xTA binding molecules of the present invention are referred to as "bispecific trivalent".

[00013] Согласно настоящему изобретению предложены CD137×TA связывающие молекулы, которые содержат три полипептидные цепи («первую», «вторую» и «третью» полипептидные цепи), причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом. Предпочтительные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат четыре полипептидные цепи («первую», «вторую», «третью» и «четвертую» полипептидные цепи), причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, третья и четвертая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом. Предпочтительными также являются CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, содержащие пять полипептидных цепей («первую», «вторую», «третью», «четвертую» и «пятую» полипептидные цепи), причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, третья и четвертая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, третья и пятая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом.[00013] The present invention provides CD137xTA binding molecules that contain three polypeptide chains ("first", "second" and "third" polypeptide chains), wherein the first and second polypeptide chains are covalently linked to each other, and the first and third polypeptide chains are covalently linked to each other. Preferred CD137xTA binding molecules of the present invention comprise four polypeptide chains ("first", "second", "third" and "fourth" polypeptide chains), the first and second polypeptide chains being covalently linked to each other, the third and fourth polypeptide chains are covalently linked to each other, and the first and third polypeptide chains are covalently linked to each other. Also preferred are CD137xTA binding molecules of the present invention comprising five polypeptide chains ("first", "second", "third", "fourth" and "fifth" polypeptide chains), wherein the first and second polypeptide chains are covalently linked to each other. each other, the third and fourth polypeptide chains are covalently linked to each other, the third and fifth polypeptide chains are covalently linked to each other, and the first and third polypeptide chains are covalently linked to each other.

[00014] Более конкретно согласно настоящему изобретению предложена CD137×TA связывающая молекула, причем указанная связывающая молекула способна специфично связываться с эпитопом CD137 и эпитопом опухолевого антигена (ТА), и при этом указанная CD137×TA связывающая молекула содержит первый вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; и при этом:[00014] More specifically, the present invention provides a CD137xTA binding molecule, wherein said binding molecule is capable of specifically binding to a CD137 epitope and a tumor antigen (TA) epitope, and wherein said CD137xTA binding molecule comprises a first light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a first heavy chain variable domain, which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and wherein:

(A) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL15 МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 222); и(A) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the VL15 MAB-3 light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 222); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1B МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 84);(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-3 VH1B heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 84);

(B) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL14 МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 221); и(B) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the VL14 MAB-3 light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 221); And

(C) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL11 МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 218); и(C) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the VL11 MAB-3 light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 218); And

(D) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL10 МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 217); и(D) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the VL10 MAB-3 light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 217); And

(E) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL6 МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 213); и(E) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 light chain VL6 CDR to CD137 (SEQ ID NO: 213); And

(F) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL4 МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 211); и(F) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the VL4 MAB-3 light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 211); And

(G) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(G) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74);(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-3 VH heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 74);

(H) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 91); и(H) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-4 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 91); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 90);(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-4 VH heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 90);

(I) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-5 к CD137 (SEQ ID NO: 97); и(I) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-5 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 97); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-5 к CD137 (SEQ ID NO: 96);(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-5 VH heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 96);

(J) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(J) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1A МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 83);(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-3 VH1A heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 83);

(K) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(K) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(L) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(L) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1C МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 85); или(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-3 VH1C heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 85); or

(М) (1) указанные CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(M) (1) said CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) указанные CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1D МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 86).(2) said CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the VH1D MAB-3 heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 86).

[00015] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой первый вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00015] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the first heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 77); или(A) hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 77); or

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92);(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92);

и/или в которой первый вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:and/or wherein the first light chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(A) hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 82); или(A) hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 82); or

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 93).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 93).

[00016] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой первый вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00016] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the first heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) VH1E hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 208);(A) VH1E hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 208);

(B) VH1B hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 84);(B) VH1B hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 84);

(C) VH1A hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 83);(C) VH1A hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 83);

(D) VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76);(D) VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76);

(E) VH1C hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 85);(E) VH1C hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 85);

(F) VH1D hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 86);(F) VH1D hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 86);

(G) VH1F hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 209);(G) VH1F hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 209);

(H) VH1G hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 210); или(H) VH1G hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 210); or

(I) VH1 hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92)(I) VH1 hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92)

[00017] Настоящее изобретение также относится к таким CD137×TA связывающим молекулам, в которых первый вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00017] The present invention also provides such CD137xTA binding molecules wherein the first light chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(A) VL15 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 222);(A) VL15 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 222);

(B) VL14 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 221);(B) VL14 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 221);

(C) VL1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 87);(C) VL1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 87);

(D) VL2 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 88);(D) VL2 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 88);

(E) VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89);(E) VL3 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 89);

(F) VL4 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 211);(F) VL4 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 211);

(G) VL5 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 212);(G) VL5 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 212);

(H) VL6 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 213);(H) VL6 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 213);

(I) VL7 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 214);(I) VL7 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 214);

(J) VL8 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 215);(J) VL8 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 215);

(K) VL9 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 216);(K) VL9 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 216);

(L) VL10 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 217);(L) VL10 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 217);

(M) VL11 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 218);(M) VL11 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 218);

(N) VL12 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 219);(N) VL12 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 219);

(O) VL13 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 220);(O) VL13 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 220);

(P) VL1 hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 94); или(P) VL1 hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 94); or

(Q) VL2 hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 95).(Q) VL2 hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 95).

[00018] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой опухолевый антиген (ТА) выбран из группы опухолевых антигенов, состоящей из: 19.9; онкофетального белка 5Т4; антигена 4.2; А33; AFP; ALCAM; BAGE; бета-катенина; СА125; карбоксипептидазы М; B1; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; СЕА; СЕАСАМ5; СЕАСАМ6; СО-43; СО-514; CTLA-1; CTLA-4; цитокератина 8; ряда Е1; ЭФР-Р; рецептора эфрина; Erb; F3; FC10.2; GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19-9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; антигена CD20 В-лимфомы человека; антигена жировых глобул человеческого молока; Е6 папилломавируса человека/Е7 папилломавируса человека; HMW-MAA; антигена I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; общего антигена карциномы KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; М18; М39; MAGE; MART; Myl; MUC-1; MUM-1; N-ацетилглюкозаминилтрансферазы; неогликопротеина; NS-10; OFA-1; OFA-2; онкостатина M; p15; PSA; PSMA; РЕМА; PIPA; простатической кислой фосфатазы; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; пептида, происходящего из Т-клеточного рецептора; TAG-72; TL5; рецептора TNF-α; рецептора TNF-β; рецептора TNF-γ; TRA-1-85; рецептора трансферрина; TSTA; и VEGF-R.[00018] The present invention also provides such a CD137×TA binding molecule, wherein the tumor antigen (TA) is selected from the group of tumor antigens consisting of: 19.9; oncofetal protein 5T4; antigen 4.2; A33; AFP; ALCAM; BAGE; beta-catenin; CA125; carboxypeptidase M; B1; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; CEA; SEASAM5; SEACAM6; SO-43; SO-514; CTLA-1; CTLA-4; cytokeratin 8; row E1; EGF-R; ephrin receptor; Erb; F3; FC10.2; GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19-9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; human B lymphoma antigen CD20; human milk fat globule antigen; E6 human papillomavirus/E7 human papillomavirus; HMW-MAA; antigen I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; common carcinoma antigen KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; MAGE; MART; Myl; MUC-1; MUM-1; N-acetylglucosaminyltransferase; neoglycoprotein; NS-10; OFA-1; OFA-2; oncostatin M; p15; PSA; PSMA; REMA; PIPA; prostatic acid phosphatase; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; T-cell receptor-derived peptide; TAG-72; TL5; TNF-α receptor; TNF-β receptor; TNF-γ receptor; TRA-1-85; transferrin receptor; TSTA; and VEGF-R.

[00019] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой опухолевый антиген (ТА) выбран из опухолевых антигенов из таблицы 1 и, в частности, в которой опухолевый антиген (ТА) представляет собой: HER2/neu, EphA2 или 5Т4.[00019] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the tumor antigen (TA) is selected from the tumor antigens from Table 1 and, in particular, wherein the tumor antigen (TA) is: HER2/neu, EphA2 or 5T4.

[00020] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu, причем указанная CD137×TA связывающая молекула содержит второй вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; и при этом[00020] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the tumor antigen (TA) is HER2/neu, wherein the CD137xTA binding molecule contains a second light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and the first heavy chain variable domain, which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and wherein

(A) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-1 к HER2 (SEQ ID NO: 63); и(A) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the MAB-1 light chain VL CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 63); And

(B) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 второго вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-1 к HER2 (SEQ ID NO: 62).(B) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the second heavy chain variable domain are the MAB-1 VH heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 62).

[00021] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой:[00021] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule wherein:

(A) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 67);(A) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the hMAB-1 light chain VL1 CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 67);

(2) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68); или(2) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the hMAB-1 light chain VL2 CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 68); or

(3) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69); и(3) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the hMAB-1 light chain VL3 CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 69); And

(B) (1) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 второго вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64);(B) (1) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the second heavy chain variable domain are the hMAB-1 VH1 heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 64);

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 второго вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 65); или(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the second heavy chain variable domain are the hMAB-1 VH2 heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 65); or

(3) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 второго вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66).(3) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the second heavy chain variable domain are the hMAB-1 heavy chain VH3 CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 66).

[00022] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой второй вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00022] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the second heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(A) VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64);(A) VH1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 64);

(B) VH2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 65); или(B) VH2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 65); or

(C) VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66).(C) VH3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 66).

[00023] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой второй вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00023] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the second light chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(A) VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 67);(A) VL1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 67);

(B) VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68); или(B) VL2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 68); or

(C) VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69).(C) VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69).

[00024] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой опухолевый антиген (ТА) представляет собой 5Т4, причем указанная CD137×TA связывающая молекула содержит второй вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; и при этом:[00024] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the tumor antigen (TA) is 5T4, wherein the CD137xTA binding molecule contains a second light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a first heavy chain variable domain, which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and wherein:

(I) (A) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-1 к 5Т4 (SEQ ID NO: 135); и(I) (A) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the MAB-1 VL light chain CDR to 5T4 (SEQ ID NO: 135); And

(В) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 второго вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-1 к 5Т4 (SEQ ID NO: 134); или(B) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the second heavy chain variable domain are the MAB-1 VH heavy chain CDR to 5T4 (SEQ ID NO: 134); or

(II) (A) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-2 к 5Т4 (SEQ ID NO: 137); и(II) (A) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the MAB-2 VL light chain CDR to 5T4 (SEQ ID NO: 137); And

(В) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 второго вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-2 к 5Т4 (SEQ ID NO: 136).(B) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the second heavy chain variable domain are the MAB-2 VH heavy chain CDR to 5T4 (SEQ ID NO: 136).

[00025] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой второй вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность: VH1 МАВ-1 (SEQ ID NO: 135).[00025] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the second heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO: 135).

[00026] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой второй вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность: VH1 МАВ-1 (SEQ ID NO: 136).[00026] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the second light chain variable domain comprises the amino acid sequence: MAB-1 VH1 (SEQ ID NO: 136).

[00027] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, причем указанная молекула представляет собой биспецифическое четырехвалентное Fc-несущее диатело, содержащее первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи, при этом указанные полипептидные цепи образуют ковалентно связанный комплекс.[00027] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the molecule is a bispecific tetravalent Fc-bearing diabody containing first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein said polypeptide chains form a covalently linked complex.

[00028] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu и при этом:[00028] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein said tumor antigen (TA) is HER2/neu and wherein:

(I) (А) первая и третья полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100; и(I) (A) the first and third polypeptide chains have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 100; And

(В) вторая и четвертая полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101;(B) the second and fourth polypeptide chains have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101;

илиor

(II) (А) первая и третья полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 102; и(II) (A) the first and third polypeptide chains have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 102; And

(В) вторая и четвертая полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 103.(B) the second and fourth polypeptide chains have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 103.

[00029] Настоящее изобретение также относится к таким CD137×TA связывающим молекулам, причем указанная молекула является биспецифической и четырехвалентной и содержит первую, вторую, третью, четвертую и пятую полипептидные цепи, при этом указанные полипептидные цепи образуют ковалентно связанный комплекс.[00029] The present invention also provides such CD137xTA binding molecules, wherein the molecule is bispecific and tetravalent and contains first, second, third, fourth and fifth polypeptide chains, wherein said polypeptide chains form a covalently linked complex.

[00030] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu и при этом:[00030] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule wherein the tumor antigen (TA) is HER2/neu and wherein:

(I) (А) первая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104;(I) (A) the first polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104;

(B) вторая и пятая полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105;(B) the second and fifth polypeptide chains have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105;

(C) третья полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 106; и(C) the third polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 106; And

(D) четвертая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107;(D) the fourth polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 107;

илиor

(II) (А) первая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104;(II) (A) the first polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104;

(C) третья полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 или SEQ ID NO: 118; и(C) the third polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, or SEQ ID NO: 118; And

(D) четвертая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 или SEQ ID NO: 123.(D) the fourth polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, or SEQ ID NO: 123.

[00031] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, причем указанная молекула является биспецифической и трехвалентной и содержит первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи, при этом указанные полипептидные цепи образуют ковалентно связанный комплекс.[00031] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein the molecule is bispecific and trivalent and contains first, second, third and fourth polypeptide chains, wherein said polypeptide chains form a covalently linked complex.

[00032] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu, и при этом:[00032] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein said tumor antigen (TA) is HER2/neu, and wherein:

(А) указанная первая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195 или SEQ ID NO: 196.(A) said first polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, or SEQ ID NO: 196.

(B) указанная вторая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200 или SEQ ID NO: 201;(B) said second polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, or SEQ ID NO: 201;

(C) указанная третья полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104; и(C) said third polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104; And

(D) указанная четвертая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105.(D) said fourth polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 105.

[00033] Настоящее изобретение также относится к такой CD137×TA связывающей молекуле, в которой указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой 5Т4, и при этом:[00033] The present invention also provides such a CD137xTA binding molecule, wherein said tumor antigen (TA) is 5T4, and wherein:

(A) указанная первая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196 или SEQ ID NO: 229;(A) said first polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, or SEQ ID NO: 229;

(B) указанная вторая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201 или SEQ ID NO: 230;(B) said second polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, or SEQ ID NO: 230;

(C) указанная третья полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 231; и(C) said third polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 231; And

(D) указанная четвертая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 232.(D) said fourth polypeptide chain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 232.

[00034] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любую из описанных выше CD137×TA связывающих молекул и физиологически приемлемый носитель.[00034] The present invention also relates to a pharmaceutical composition containing any of the CD137xTA binding molecules described above and a physiologically acceptable carrier.

[00035] Настоящее изобретение также относится к применению любой из описанных выше CD137×TA связывающих молекул или такой фармацевтической композиции в лечении заболевания или состояния, ассоциированного или характеризующегося экспрессией опухолевого антигена (ТА), и при этом, в частности, заболевание или состояние, ассоциированное или характеризующееся экспрессией опухолевого антигена (ТА), представляет собой рак.[00035] The present invention also relates to the use of any of the above CD137xTA binding molecules or such pharmaceutical composition in the treatment of a disease or condition associated with or characterized by the expression of a tumor antigen (TA), and in particular, a disease or condition associated or characterized by the expression of tumor antigen (TA), is cancer.

[00036] Настоящее изобретение также относится к СВ137-связывающей молекуле, которая содержит вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; причем:[00036] The present invention also provides a CD137 binding molecule that contains a light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a heavy chain variable domain that contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and:

(G) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(G) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the MAB-3 VH heavy chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 74);

(H) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 91); и(H) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the MAB-4 VL light chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 91); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 90);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the MAB-4 VH heavy chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 90);

(I) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-5 к CD137 (SEQ ID NO: 97); и(I) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the MAB-5 VL light chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 97); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-5 к CD137 (SEQ ID NO: 96);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the heavy chain VH CDRs of MAB-5 to CD137 (SEQ ID NO: 96);

(J) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(J) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the MAB-3 VL light chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1A МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 83);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the VH1A heavy chain CDRs of MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 83);

(K) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(K) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 light chain VL CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1B МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 84);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the VH1B heavy chain CDRs of MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 84);

(L) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(L) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 light chain VL CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1C МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 85); или(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the VH1C heavy chain CDRs of MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 85); or

(М) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(M) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 light chain VL CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1D МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 86).(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the VH1D heavy chain CDRs of MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 86).

[00037] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации такой CD137-связывающей молекулы, в которой вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00037] The present invention also provides an embodiment of such a CD137 binding molecule, wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92).

[00038] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации такой CD137-связывающей молекулы, в которой вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00038] The present invention also provides an embodiment of such a CD137 binding molecule, wherein the light chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 93).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 93).

[00039] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких CD137-связывающих молекул, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00039] The present invention also provides an embodiment of such CD137-binding molecules in which the heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76);(A) VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76);

(B) VH1A hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 83);(B) VH1A hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 83);

(C) VH1B hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 84);(C) VH1B hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 84);

(D) VH1C hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 85);(D) VH1C hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 85);

(E) VH1D hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 86);(E) VH1D hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 86);

(F) VH1E hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 208);(F) VH1E hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 208);

(I) VH1 hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92).(I) VH1 hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92).

[00040] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких CD137-связывающих молекул, в которых вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00040] The present invention also provides an embodiment of such CD137-binding molecules wherein the light chain variable domain comprises the amino acid sequence:

[00041] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких CD137-связывающих молекул, в которых указанная молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.[00041] The present invention also provides an embodiment of such CD137-binding molecules, wherein the molecule is an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

[00042] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любую из описанных выше CD137-связывающих молекул и физиологически приемлемый носитель.[00042] The present invention also provides a pharmaceutical composition containing any of the CD137 binding molecules described above and a physiologically acceptable carrier.

[00043] Настоящее изобретение также относится к применению любой из описанных выше CD137-связывающих молекул или такой фармацевтической композиции в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с подавленной иммунной системой или характеризующегося экспрессией опухолевого антигена (ТА).[00043] The present invention also relates to the use of any of the CD137-binding molecules described above or such pharmaceutical composition in the treatment of a disease or condition associated with a suppressed immune system or characterized by tumor antigen (TA) expression.

[00044] Настоящее изобретение также относится к такому применению, при котором состояние, ассоциированное с подавленной иммунной системой или характеризующееся экспрессией опухолевого антигена (ТА), представляет собой рак.[00044] The present invention also relates to such applications in which the condition associated with a suppressed immune system or characterized by the expression of a tumor antigen (TA) is cancer.

[00045] Настоящее изобретение также относится к HER2/neu-связывающей молекуле, которая содержит вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; причем:[00045] The present invention also provides a HER2/neu binding molecule that contains a light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a heavy chain variable domain that contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and:

(A) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-1 к HER2 (SEQ ID NO: 63); и(A) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the MAB-1 VL light chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 63); And

(B) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-1 к HER2 (SEQ ID NO: 62).(B) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the MAB-1 VH heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 62).

[00046] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких HER2/neu-связывающих, молекул, причем:[00046] The present invention also provides an embodiment of such HER2/neu binding molecules, wherein:

(A) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 67);(A) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the hMAB-1 light chain CDRs to HER2 VL1 (SEQ ID NO: 67);

(2) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68); или(2) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the hMAB-1 VL2 light chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 68); or

(3) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69);(3) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the light chain variable domain are the hMAB-1 light chain VL3 CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 69);

иAnd

(B) (1) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64);(B) (1) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the hMAB-1 VH1 heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 64);

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 65); или(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the hMAB-1 VH2 heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 65); or

(3) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66).(3) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the heavy chain variable domain are the hMAB-1 VH3 heavy chain CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 66).

[00047] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких HER2/neu-связывающих молекул, в которых вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00047] The present invention also provides an embodiment of such HER2/neu binding molecules wherein the heavy chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(A) VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64);(A) VH1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 64);

(С) VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66)(C) VH3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 66)

[00048] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких HER2/neu-связывающих молекул, в которых вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:[00048] The present invention also provides an embodiment of such HER2/neu binding molecules wherein the light chain variable domain comprises the amino acid sequence:

(A) VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 67);(A) VL1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 67);

(C) VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69).(C) VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69).

[00049] Настоящее изобретение также относится к варианту реализации таких HER2/neu-связывающих молекул, в которых молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.[00049] The present invention also provides an embodiment of such HER2/neu binding molecules, wherein the molecule is an antibody or an antigen binding fragment thereof.

[00050] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей любую из описанных выше HER2/neu-связывающих молекул и физиологически приемлемый носитель.[00050] The present invention also provides a pharmaceutical composition containing any of the HER2/neu binding molecules described above and a physiologically acceptable carrier.

[00051] Настоящее изобретение также относится к применению любой из описанных выше HER2/neu-связывающих молекул или такой фармацевтической композиции в лечении заболевания или состояния, ассоциированного или характеризующегося экспрессией HER2/neu, и при этом, в частности, состояние, ассоциированное или характеризующееся экспрессией HER2/neu, представляет собой рак.[00051] The present invention also relates to the use of any of the above-described HER2/neu binding molecules or such pharmaceutical composition in the treatment of a disease or condition associated with or characterized by the expression of HER2/neu, and in particular, a condition associated with or characterized by the expression HER2/neu, is a cancer.

[00052] Настоящее изобретение также относится к способам повышения активности агента, нацеленного на опухоль, включающим введение такого агента, нацеленного на опухоль, в комбинации с любой из описанных выше CD137×TA связывающих молекул или фармацевтической композицией, содержащей их. Настоящее изобретение также относится к таким способам, дополнительно включающим введение ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, и при этом, в частности, такой ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1. Настоящее изобретение относится, в частности, к таким способам, в которых агент, нацеленный на опухоль, представляет собой антитело, эпитопсвязывающий фрагмент антитела или агент, который опосредует перенаправленное уничтожение клетки-мишени Т-клетками.[00052] The present invention also provides methods for enhancing the activity of a tumor-targeting agent, comprising administering such a tumor-targeting agent in combination with any of the CD137×TA binding molecules described above or a pharmaceutical composition containing them. The present invention also provides such methods further comprising administering a PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor, wherein, in particular, such immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody . The present invention particularly relates to methods in which the tumor-targeting agent is an antibody, an epitope-binding fragment of an antibody, or an agent that mediates redirected killing of a target cell by T cells.

[00053] Настоящее изобретение также относится к способам лечения заболевания или состояния, ассоциированного с подавленной иммунной системой или характеризующегося экспрессией опухолевого антигена (ТА), включающим введение субъекту, нуждающемуся в этом, любой из описанных выше CD137×TA связывающих молекул или фармацевтической композиции, содержащей их. В частности, настоящее изобретение относится к таким способам, в которых состояние, ассоциированное с подавленной иммунной системой или характеризующееся экспрессией опухолевого антигена (ТА), представляет собой рак. Настоящее изобретение также относится к таким способам, дополнительно включающим введение агента, нацеленного на опухоль, и при этом, в частности, агент, нацеленный на опухоль, представляет собой антитело, эпитопсвязывающий фрагмент антитела или агент, который опосредует перенаправленное уничтожение клетки-мишени Т-клетками. Настоящее изобретение также относится к таким способам, дополнительно включающим введение ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, и при этом, в частности, такой ингибитор контрольной точки иммунного ответа представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1.[00053] The present invention also provides methods for treating a disease or condition associated with a suppressed immune system or characterized by tumor antigen (TA) expression, comprising administering to a subject in need thereof any of the CD137xTA binding molecules described above or a pharmaceutical composition comprising their. In particular, the present invention relates to such methods in which the condition associated with a suppressed immune system or characterized by the expression of a tumor antigen (TA) is cancer. The present invention also provides such methods further comprising administering a tumor-targeting agent, wherein, in particular, the tumor-targeting agent is an antibody, an epitope-binding fragment of an antibody, or an agent that mediates redirected killing of a target cell by T cells . The present invention also provides such methods further comprising administering a PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor, wherein, in particular, such immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody .

[00054] Настоящее изобретение также относится к описанным выше вариантам применения и способам, в которых рак выбран из группы, состоящей из: острого миелолейкоза, опухоли надпочечников, рака, ассоциированного со СПИДом, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухолей сонных артерий, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной карциномы почек, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, экстраскелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии костей, рака желчного пузыря или желчных протоков, рака желудка, гестационной трофобластической болезни, герминогенной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, глиобластомы, опухоли из островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, злокачественной мезотелиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, не мелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли околощитовидной железы, педиатрического рака, опухоли оболочки периферических нервов, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, постериорной увеальной меланомы, редкого гематологического заболевания, карциномы почек, метастатического рака почек, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичек, рака тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы и рака матки.[00054] The present invention also relates to the above-described uses and methods in which the cancer is selected from the group consisting of: acute myeloid leukemia, adrenal tumor, AIDS-associated cancer, alveolar soft tissue sarcoma, astrocytic tumor, bladder cancer, cancer bone, brain and spinal cord cancer, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal carcinoma, clear cell carcinoma, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing tumor, extraskeletal myxoid chondrosarcoma, imperfect osseous fibrogenesis, fibrous dysplasia of bone, gallbladder or bile duct cancer, gastric cancer, gestational trophoblastic disease, germ cell tumor, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, islet cell tumor , Kaposi's sarcoma, kidney cancer, leukemia, lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/malignant lipomatous tumor, liver cancer, lymphoma, lung cancer, medulloblastoma, melanoma, meningioma, malignant mesothelioma, multiple endocrine neoplasia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblast ohms, neuroendocrine tumors, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, pharyngeal cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, pediatric cancer, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, posterior uveal melanoma, rare hematological diseases, renal carcinoma, metastatic renal cancer, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, gastric cancer, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic cancer, thymoma, metastatic thyroid cancer and uterine cancer.

[00055] В частности, настоящее изобретение относится к описанным выше вариантам применения и способам, в которых рак выбран из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака желудка, глиобластомы, рака почек, рака легких, меланомы, нейробластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, рака предстательной железы, карциномы почек, рабдомиосаркомы и плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN).[00055] In particular, the present invention relates to the above-described uses and methods in which the cancer is selected from the group consisting of: bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, gastric cancer, glioblastoma, kidney cancer, lung cancer, melanoma , neuroblastoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, pharyngeal cancer, prostate cancer, renal carcinoma, rhabdomyosarcoma and squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[00056] На Фигурах 1А-1В представлены схемы типичного ковалентно связанного диатела, имеющего два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет домен, способствующий образованию гетеродимера, содержащий Е-спираль или К-спираль (альтернативные домены, способствующие образованию гетеродимера, представлены ниже). Остаток цистеина может присутствовать в линкере (Фигура 1А) и/или в домене, способствующем образованию гетеродимера (Фигура 1В). Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одного и того же шаблона затенения или заливки. Волнистая линия на этой и на всех Фигурах, на которых представлены схематические изображения доменов связывающей молекулы, представляет один или более необязательных доменов, способствующих образованию гетеродимера, которые предпочтительно присутствуют.[00056] Figures 1A-1B are diagrams of a typical covalently bound diabody having two epitope-binding sites consisting of two polypeptide chains, each of which has a heterodimer-promoting domain containing an E-helix or a K-helix (alternative domains that promote the formation of heterodimer, presented below). A cysteine residue may be present in the linker (Figure 1A) and/or in the domain promoting heterodimer formation (Figure 1B). VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or shading pattern. Wavy line This and all Figures depicting schematic representations of binding molecule domains represents one or more optional heterodimer-forming domains that are preferably present.

[00057] На Фигуре 2 представлена схема типичной молекулы ковалентно связанного диатела, имеющей два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет домен СН2 и СН3, так, что объединившиеся цепи образуют полную область Fc или ее часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одного и того же шаблона затенения или заливки.[00057] Figure 2 is a diagram of a typical covalently linked diabody molecule having two epitope binding sites consisting of two polypeptide chains, each having a CH2 and a CH3 domain such that the combined chains form the entire Fc region or a portion thereof. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or shading pattern.

[00058] На Фигурах 3А-3Е представлены схемы, показывающие типичные ковалентно связанные четырехвалентные диатела, имеющие четыре эпитопсвязывающих сайта, состоящих из двух пар полипептидных цепей (т.е. в общей сложности из четырех полипептидных цепей). Одна полипептидная цепь каждой пары имеет домен СН2 и СН3, так, что объединившиеся цепи образуют полную область Fc или ее часть. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одного и того же шаблона затенения или заливки. Две пары полипептидных цепей могут быть одинаковыми. Согласно таким вариантам реализации, в которых две пары полипептидных цепей являются одинаковыми, и домены VL и VH распознают разные эпитопы (как показано на Фигурах 3А-3В), полученная молекула имеет четыре эпитопсвязывающих сайта и является биспецифической и двухвалентной по отношению к каждому связанному эпитопу. Согласно таким вариантам реализации, в которых домены VL и VH распознают один и тот же эпитоп (например, на обеих цепях применяются одни и те же CDR домена VL и одни и те же CDR домена VH), полученная молекула имеет четыре эпитопсвязывающих сайта и является моноспецифической и четырехвалентной в отношении одного эпитопа. Согласно другому варианту две пары полипептидов могут различаться. Согласно таким вариантам реализации, в которых две пары полипептидных цепей различаются, и домены VL и VH каждой пары полипептидов распознают разные эпитопы (как показано различными затенениями и шаблонами на Фигуре 3С), полученная молекула имеет четыре эпитопсвязывающих сайта и является тетраспецифической и одновалентной по отношению к каждому связанному эпитопу. На Фигуре 3А показано диатело, содержащее область Fc, которое содержит пептидный домен, способствующий образованию гетеродимера, содержащий остаток цистеина. На Фигуре 3В показано диатело, содержащее область Fc, которое содержит домены, способствующие образованию гетеродимера, содержащие Е-спираль и К-спираль, а также содержащие остаток цистеина и линкер (с необязательным остатком цистеина). На Фигуре 3С показано диатело, содержащее область Fc, которое содержит домены антитела СН1 и CL. На Фигурах 3D-3E проиллюстрировано, как отбор связывающих доменов, показанных на Фигуре 3В, может привести к получению CD137×TA связывающей молекулы, имеющей два сайта связывания, специфичных для эпитопа CD137, и два сайта связывания, специфичных для эпитопа ТА. На Фигурах 3D-3E проиллюстрировано, как можно отобрать домены для получения CD137×TA связывающих молекул, имеющих различающиеся ориентации (т.е. на Фигуре 3D домен VL CD137 применяется в качестве домена VL1 связывающей молекулы, домен VH CD137 применяется в качестве домена VH1 связывающей молекулы, домен VL ТА применяется в качестве домена VL2 связывающей молекулы и домен VH ТА применяется в качестве домена VH2 связывающей молекулы). Напротив, на Фигуре 3Е домен VL ТА применяется в качестве домена VL1 связывающей молекулы, домен VH ТА применяется в качестве домена VH1 связывающей молекулы, домен VL CD137 применяется в качестве домена VL2 связывающей молекулы и домен VH CD137 применяется в качестве домена VH2 связывающей молекулы. Как представлено ниже, сайты связывания VL/VH, образованные за счет объединения полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить четырехвалентное связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или тетраспецифическим.[00058] Figures 3A-3E are diagrams showing typical covalently linked tetravalent diabodies having four epitope-binding sites consisting of two pairs of polypeptide chains (ie, a total of four polypeptide chains). One polypeptide chain of each pair has a CH2 and CH3 domain, such that the combined chains form the entire Fc region or part of it. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or shading pattern. Two pairs of polypeptide chains can be identical. In such embodiments, in which the two pairs of polypeptide chains are the same and the VL and VH domains recognize different epitopes (as shown in Figures 3A-3B), the resulting molecule has four epitope-binding sites and is bispecific and bivalent with respect to each bound epitope. In such embodiments, in which the VL and VH domains recognize the same epitope (e.g., the same VL domain CDRs and the same VH domain CDRs are used on both strands), the resulting molecule has four epitope-binding sites and is monospecific and tetravalent for one epitope. In another embodiment, the two pairs of polypeptides may be different. In such embodiments, in which the two pairs of polypeptide chains are distinct and the VL and VH domains of each polypeptide pair recognize different epitopes (as indicated by the different shadings and patterns in Figure 3C), the resulting molecule has four epitope-binding sites and is tetraspecific and monovalent with respect to each associated epitope. Figure 3A shows an Fc region-containing diabody that contains a heterodimer-forming peptide domain containing a cysteine residue. Figure 3B shows an Fc region-containing diabody that contains heterodimer-forming domains containing an E-helix and a K-helix, and also containing a cysteine residue and a linker (with an optional cysteine residue). Figure 3C shows an Fc region-containing diabody that contains the CH1 and CL antibody domains. Figures 3D-3E illustrate how selection of the binding domains shown in Figure 3B can result in a CD137xTA binding molecule having two CD137 epitope-specific binding sites and two TA epitope-specific binding sites. Figures 3D-3E illustrate how domains can be selected to produce CD137xTA binding molecules having different orientations (i.e., in Figure 3D, the VL domain of CD137 is used as the VL1 domain of the binding molecule, the VH domain of CD137 is used as the VH1 domain of the binding molecule molecules, the VL domain of TA is used as the VL2 domain of the binding molecule and the VH domain of TA is used as the VH2 domain of the binding molecule). In contrast, in Figure 3E, the VL domain of TA is used as the VL1 domain of the binding molecule, the VH domain of TA is used as the VH1 domain of the binding molecule, the VL domain of CD137 is used as the VL2 domain of the binding molecule, and the VH domain of CD137 is used as the VH2 domain of the binding molecule. As presented below, the VL/VH binding sites formed by combining polypeptide chains can be the same or different to provide tetravalent binding that is monospecific, bispecific, trispecific or tetraspecific.

[00059] На Фигуре 4А и 4В представлены схемы типичной молекулы ковалентно связанного диатела, имеющей два эпитопсвязывающих сайта, состоящих из трех полипептидных цепей. Две из полипептидных цепей имеют домен СН2 и СН3 так, что объединившиеся цепи образуют полную область Fc или ее часть. Полипептидные цепи, содержащие домен VL и VH, дополнительно содержат домен, способствующий образованию гетеродимера. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одного и того же шаблона затенения или заливки.[00059] Figures 4A and 4B are diagrams of a typical covalently linked diabody molecule having two epitope-binding sites consisting of three polypeptide chains. Two of the polypeptide chains have a CH2 and CH3 domain such that the combined chains form the entire Fc region or part thereof. Polypeptide chains containing a VL and VH domain additionally contain a domain that promotes heterodimer formation. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or shading pattern.

[00060] На Фигуре 5A-5D представлены схемы типичной ковалентно связанной связывающей молекулы, имеющей четыре эпитопсвязывающих сайта, состоящих из пяти полипептидных цепей. На Фигуре 5А показана общая структура такой CD137×TA связывающей молекулы. Две из полипептидных цепей имеют домен СН2 и СН3 так, что объединившиеся цепи образуют область Fc, которая содержит полную область Fc или ее часть. Полипептидные цепи, содержащие соединенные домены VL и VH, дополнительно содержат домен, способствующий образованию гетеродимера. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одного и того же шаблона затенения или заливки. На Фигуре 5В показана структура альтернативной предпочтительной CD137×TA связывающей молекулы, в которой вариабельные домены, показанные на Фигуре 5А, отобраны для получения конечной CD137×TA связывающей молекулы, которая имеет два связывающих домена, не характерных для диатела, специфичных для иллюстративного ТА, HER2/neu, и два связывающих домена, характерных для диатела, специфичных для CD137. На Фигуре 5С показана структура альтернативной предпочтительной CD137×TA связывающей молекулы, в которой вариабельные домены, показанные на Фигуре 5А, были отобраны для получения конечной CD137×TA связывающей молекулы, которая имеет два связывающих домена, не характерных для диатела, специфичных для CD137, и два связывающих домена, характерных для диатела, специфичных для HER2/neu. На Фигуре 5D показана структура альтернативной предпочтительной CD137×TA связывающей молекулы, в которой вариабельные домены, показанные на Фигуре 5А, были отобраны для получения конечной CD137×TA связывающей молекулы, которая имеет два связывающих домена, не характерных для диатела, специфичных для эпитопа CD137, один связывающий домен, характерный для диатела, специфичный для эпитопа HER2/neu, и второй связывающий домен, характерный для диатела, специфичный для эпитопа CD137. Такие эпитопы CD137 могут быть одинаковыми или различными. Следует понимать, что при правильном отборе связывающих доменов, показанных на Фигуре 5А, любые три из связывающих доменов могли бы быть отобраны для связывания эпитопа CD137. Аналогичным образом, любые три из связывающих доменов могли бы быть отобраны для связывания эпитопа HER2/neu. Как представлено ниже, сайты связывания VL/VH, образованные за счет объединения полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить четырехвалентное связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или тетраспецифическим.[00060] Figures 5A-5D show diagrams of a typical covalently linked binding molecule having four epitope-binding sites consisting of five polypeptide chains. Figure 5A shows the general structure of such a CD137xTA binding molecule. Two of the polypeptide chains have a CH2 and a CH3 domain such that the combined chains form an Fc region that contains all or part of the Fc region. Polypeptide chains containing joined VL and VH domains additionally contain a domain that promotes heterodimer formation. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or shading pattern. Figure 5B shows the structure of an alternative preferred CD137xTA binding molecule in which the variable domains shown in Figure 5A are selected to produce a final CD137xTA binding molecule that has two non-diabody binding domains specific to an exemplary TA, HER2 /neu, and two diabody-specific binding domains specific to CD137. Figure 5C shows the structure of an alternative preferred CD137xTA binding molecule in which the variable domains shown in Figure 5A were selected to produce a final CD137xTA binding molecule that has two non-diabody-specific CD137-specific binding domains and two diabody binding domains specific to HER2/neu. Figure 5D shows the structure of an alternative preferred CD137xTA binding molecule in which the variable domains shown in Figure 5A were selected to produce a final CD137xTA binding molecule that has two non-diabody binding domains specific for the CD137 epitope. one diabody-specific binding domain specific for the HER2/neu epitope, and a second diabody-specific binding domain specific for the CD137 epitope. Such CD137 epitopes may be the same or different. It should be understood that with proper selection of the binding domains shown in Figure 5A, any three of the binding domains could be selected to bind the CD137 epitope. Likewise, any three of the binding domains could be selected to bind the HER2/neu epitope. As presented below, the VL/VH binding sites formed by combining polypeptide chains can be the same or different to provide tetravalent binding that is monospecific, bispecific, trispecific or tetraspecific.

[00061] На Фигуре 6A-6F представлены схемы типичных трехвалентных связывающих молекул, содержащих область Fc, имеющих три эпитопсвязывающих сайта. На Фигуре 6А схематично проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена, характерных для диатела, и связывающий домен Fab-типа, имеющих разные ориентации доменов, в которых связывающие домены, характерные для диатела, являются С-концевыми по отношению к области Fc. На Фигурах 6В-6С показана структура иллюстративной предпочтительной CD137×TA связывающей молекулы, в которой вариабельные домены, показанные на Фигурах 6А, были отобраны для получения конечной CD137×TA связывающей молекулы, которая имеет связывающие домены, не характерные для диатела, специфичные для CD137, связывающий домен, характерный для диатела, который специфичен для иллюстративного ТА, HER2/neu, и второй связывающий домен, характерный для диатела, который специфичен для CD137. На Фигуре 6D схематично проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена, характерных для диатела, и связывающий домен Fab-типа, имеющих разные ориентации доменов, в которых связывающие домены, характерные для диатела, являются С-концевыми по отношению к области Fc. Молекулы на Фигурах 6A-6D содержат четыре цепи. На Фигурах 6Е и 6F, соответственно, схематически проиллюстрированы домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена, характерных для диатела, которые являются N-концевыми по отношению к области Fc, и связывающий домен Fab-типа, в котором легкая цепь и тяжелая цепь соединены за счет полипептидного спейсера, или связывающий домен scFv-типа. Трехвалентные связывающие молекулы на Фигурах 6G и 6Н, соответственно, схематически иллюстрируют домены трехвалентных связывающих молекул, содержащих два связывающих домена, характерных для диатела, которые являются С-концевыми по отношению к области Fc, и связывающий домен Fab-типа, в котором легкая цепь и тяжелая цепь соединены за счет полипептидного спейсера, или связывающий домен scFv-типа. Трехвалентные связывающие молекулы на Фигурах 6Е-6Н содержат три цепи. Домены VL и VH, которые распознают один и тот же эпитоп, показаны с использованием одного и того же шаблона затенения или заливки.[00061] Figures 6A-6F are diagrams of typical trivalent Fc region binding molecules having three epitope binding sites. Figure 6A schematically illustrates the domains of trivalent binding molecules containing two diabody-specific binding domains and a Fab-type binding domain having different domain orientations in which the diabody-specific binding domains are C-terminal to the Fc region. Figures 6B-6C show the structure of an exemplary preferred CD137xTA binding molecule in which the variable domains shown in Figures 6A were selected to produce a final CD137xTA binding molecule that has non-diabody-specific CD137-specific binding domains. a diabody-specific binding domain that is specific for an exemplary TA, HER2/neu, and a second diabody-specific binding domain that is specific for CD137. Figure 6D schematically illustrates the domains of trivalent binding molecules containing two diabody-specific binding domains and a Fab-type binding domain having different domain orientations in which the diabody-specific binding domains are C-terminal to the Fc region. The molecules in Figures 6A-6D contain four chains. Figures 6E and 6F, respectively, schematically illustrate the domains of trivalent binding molecules containing two diabody-specific binding domains that are N-terminal to the Fc region and a Fab-type binding domain in which a light chain and a heavy chain are linked due to a polypeptide spacer, or scFv-type binding domain. The trivalent binding molecules in Figures 6G and 6H, respectively, schematically illustrate the domains of trivalent binding molecules containing two diabody-specific binding domains that are C-terminal to the Fc region and a Fab-type binding domain in which the light chain and the heavy chain is connected by a polypeptide spacer, or scFv-type binding domain. The trivalent linking molecules in Figures 6E-6H contain three chains. VL and VH domains that recognize the same epitope are shown using the same shading or shading pattern.

[00062] На Фигуре 7 показаны кривые связывания антител к CD137, урелумаба и утомилумаба (МАВ-1 к CD137 и МАВ-2 к CD137, соответственно), и нескольких новых химерных моноклональных антител (МАТ) к CD137 (chMAB-3 к CD137; chMAB-4 к CD137 и chMAB-5 к CD137) с активированными CD8⁺ Т-клетками.[00062] Figure 7 shows the binding curves of the anti-CD137 antibodies, urelumab and utomilumab (anti-CD137 MAB-1 and anti-CD137 MAB-2, respectively), and several novel chimeric anti-CD137 monoclonal antibodies (MAbs) (chMAB-3 anti-CD137; chMAB-4 anti-CD137 and chMAB-5 anti-CD137) with activated CD8 ⁺ T cells.

[00063] На Фигуре 8 показана индукция секреции ИЛ-2 общей популяцией Т-клеток через 72 часа после стимуляции с применением нанесенного на подложку и высушенного антитела к CD3 (3 мкг/мл-50 мкг/мл) в присутствии антител к CD137, урелумаба или утомилумаба (МАВ-1 к CD137 или МАВ-2 к CD137, соответственно), или новых химерных антител к CD137 (chMAB-3 к CD137, chMAB-4 к CD137 или chMAB-5 к CD137), которые были сшиты с 4× hFc F(ab)'₂. Сшитые антитела (Ab+αhFc) применяли в концентрации 0,1, 1,0 или 10 мкг/мл. На графике также представлены следующие контроли: стимулированная общая популяция Т-клеток, обработанных антителом для контроля изотипа, только hFc F(ab)'₂ или необработанные клетки.[00063] Figure 8 shows the induction of IL-2 secretion by a general population of T cells 72 hours after stimulation with coated and dried anti-CD3 antibody (3 μg/ml-50 μg/ml) in the presence of anti-CD137 antibody, urelumab. or utomilumab (MAB-1 to CD137 or MAB-2 to CD137, respectively), or new chimeric antibodies to CD137 (chMAB-3 to CD137, chMAB-4 to CD137, or chMAB-5 to CD137), which were cross-linked with 4× hFc F(ab)' ₂ . Cross-linked antibodies (Ab+αhFc) were used at concentrations of 0.1, 1.0, or 10 μg/ml. The graph also shows the following controls: stimulated total population of T cells treated with isotype control antibody, hFc F(ab)' ₂ alone, or untreated cells.

[00064] На Фигуре 9 показана индукция секреции ИФН-γ общей популяцией Т-клеток через 72 часа после стимуляции гранулами, направленными против CD3, в присутствии сшитых химерных антител к CD137 (chMAB-3 к CD137 или chMAB-5 к CD137) (1 мкг/мл антитела к CD-137 + 4 мкг/мл hFc F(ab)'₂) ± клетки-мишени JIMT-1 (HER2/neu⁺⁺), в присутствии лиганда (1 мкг/мл CD-137L-His) или без него. На графике также представлены следующие контрольные образцы: стимулированная общая популяция Т-клеток ± клетки JIMT-1, ± hFc F(ab)'₂, а также необработанная/нестимулированная общая популяция Т-клеток и клеток JIMT-1.[00064] Figure 9 shows the induction of IFN-γ secretion by the general population of T cells 72 hours after stimulation with anti-CD3 beads in the presence of cross-linked chimeric anti-CD137 antibodies (chMAB-3 anti-CD137 or chMAB-5 anti-CD137) (1 μg/ml antibody to CD-137 + 4 μg/ml hFc F(ab)' ₂ ) ± target cells JIMT-1 (HER2/neu ⁺⁺ ), in the presence of ligand (1 μg/ml CD-137L-His) or without it. The graph also shows the following controls: stimulated total T cell population ± JIMT-1 cells, ± hFc F(ab)' ₂ , and untreated/unstimulated total T cell population and JIMT-1 cells.

[00065] На Фигурах 10A-10В показана способность CD137×TA связывающих молекул связываться с CD137 активированных CD8⁺ Т-клеток, согласно результатам измерения методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с использованием FITC-меченых CD8 и АФЦ-меченой αhFc. Фигура 10А: DART-B и DART-С (содержащие домены hMAB-3 к CD137 и hMAB-1 к HER2), DART-D и DART-Е (содержащие домены МАВ-3 к CD137 и hMAB-1 к HER2) и контрольные молекулы DART-3 (содержащая домены hMAB-1 к HER2 и варианты доменов паливизумаба) и DART-6 (содержащая варианты доменов паливизумаба и домены МАВ-3 к CD137). Фигура 10В: DART-D (содержащая домены МАВ-3 к CD137 и hMAB-1 к HER2), DART-F (содержащая домены МАВ-4 к CD137 и hMAB-1 к HER2), DART-1 и DART-4 (содержащие домены МАВ-1 к CD137 и hMAB-1 к HER2), DART-2 и DART-5 (содержащие домены МАВ-2 к CD137 и hMAB-1 к HER2) и контрольная связывающая молекула DART-6 (содержащая домены МАВ-3 к CD137 и варианты доменов паливизумаба).[00065] Figures 10A-10B show the ability of CD137xTA binding molecules to bind to CD137 activated CD8 ⁺ T cells as measured by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using FITC-labeled CD8 and AFC-labeled αhFc. Figure 10A: DART-B and DART-C (containing hMAB-3 domains to CD137 and hMAB-1 to HER2), DART-D and DART-E (containing domains MAB-3 to CD137 and hMAB-1 to HER2) and control molecules DART-3 (containing hMAB-1 domains to HER2 and variant domains of palivizumab) and DART-6 (containing variant domains of palivizumab and domains of MAB-3 to CD137). Figure 10B: DART-D (containing the MAB-3 domains to CD137 and hMAB-1 to HER2), DART-F (containing the domains MAB-4 to CD137 and hMAB-1 to HER2), DART-1 and DART-4 (containing domains MAB-1 to CD137 and hMAB-1 to HER2), DART-2 and DART-5 (containing domains of MAB-2 to CD137 and hMAB-1 to HER2) and the control binding molecule DART-6 (containing domains of MAB-3 to CD137 and variant domains of palivizumab).

[00066] На Фигурах 11А-11 В показана способность CD137×TA связывающих молекул связываться с иллюстративным ТА, HER2/neu, на поверхности клеток-мишеней рака желудка N87 (HER2⁺⁺⁺), согласно результатам измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI). Фигура 11А: DART-В, DART-С, DART-D, DART-E и контрольные связывающие молекулы DART-3 и DART-6. Фигура 11B: DART-D, DART-F, DART-1, DART-2, DART-4, DART-5 и DART-6.[00066] Figures 11A-11B show the ability of CD137xTA binding molecules to bind to an exemplary TA, HER2/neu, on the surface of N87 gastric cancer target cells (HER2 ⁺⁺⁺ ), as measured by mean fluorescence intensity (MFI). Figure 11A: DART-B, DART-C, DART-D, DART-E and control binding molecules DART-3 and DART-6. Figure 11B: DART-D, DART-F, DART-1, DART-2, DART-4, DART-5 and DART-6.

[00067] На Фигурах 12А-12В показана способность CD137×TA связывающих молекул DART-B, DART-D и DART-G, а также контрольных молекул DART-3 и DART-6 связываться с CD137, экспрессированным модифицированными клетками СНО (Фигура 12А), и CD137, экспрессированным активированными CD8⁺ Т-клетками (Фигура 12В).[00067] Figures 12A-12B show the ability of the CD137xTA binding molecules DART-B, DART-D and DART-G, as well as the control molecules DART-3 and DART-6, to bind to CD137 expressed by modified CHO cells (Figure 12A) , and CD137 expressed by activated CD8 ⁺ T cells (Figure 12B).

[00068] На Фигурах 13А-13В показана способность CD137×TA связывающих молекул DART-B, DART-D и DART-G, а также контрольных молекул DART-3 и DART-6 связываться с иллюстративным ТА, HER2/neu, экспрессированным клетками-мишенями рака желудка N87 (HER2⁺⁺⁺) (Фигура 13А) и клетками-мишенями JIMT-1 (HER2⁺⁺) (Фигура 13В).[00068] Figures 13A-13B show the ability of the CD137xTA binding molecules DART-B, DART-D and DART-G, as well as the control molecules DART-3 and DART-6, to bind to an exemplary TA, HER2/neu, expressed by cells. gastric cancer target N87 (HER2 ⁺⁺ ) (Figure 13A) and JIMT-1 target cells (HER2 ⁺⁺ ) (Figure 13B).

[00069] На Фигурах 14А-14В представлены результаты первого типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (на примере высвобождения ИФН-γ). На Фигурах показаны результаты для DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, DART-A, DART-D, DART-E и DART-F и контрольных молекул, DART-3 и DART-6, испытанных в присутствии HER2/neu-экспрессирующих K клеток-мишеней N87 (HER2⁺⁺⁺) (Фигура 14А) или JIMT-1 (HER2⁺⁺) (Фигура 14В), костимулирующая активность не была обнаружена при применении HER2/neu-отрицательных клеток-мишеней Hs700T или в отсутствие клеток-мишеней.[00069] Figures 14A-14B show the results of a first representative assay of the ability of CD137xTA binding molecules to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (as exemplified by IFN-γ release). The Figures show results for DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, DART-A, DART-D, DART-E and DART-F and control molecules, DART-3 and DART-6, tested in presence of HER2/neu-expressing K target cells N87 (HER2 ⁺⁺⁺ ) (Figure 14A) or JIMT-1 (HER2 ⁺⁺ ) (Figure 14B), costimulatory activity was not detected with HER2/neu-negative target cells Hs700T or in the absence of target cells.

[00070] На Фигурах 15А-15В представлены результаты второго типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (на примере высвобождения ИФН-γ). На Фигурах показаны результаты для DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, DART-B, DART-D и DART-G, а также контрольных молекул DART-3 и DART-6, испытанных в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (HER2⁺⁺⁺) (Фигура 15А) или JIMT-1 (HER2⁺⁺) (Фигура 15В), костимулирующая активность не была обнаружена при применении HER2/neu-отрицательных клеток-мишеней Hs700T или в отсутствие клеток-мишеней.[00070] Figures 15A-15B show the results of a second representative assay for the ability of CD137xTA binding molecules to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (exemplified by IFN-γ release). The Figures show results for DART-1, DART-2, DART-4, DART-5, DART-B, DART-D and DART-G, as well as control molecules DART-3 and DART-6, tested in the presence of HER2/ neu-expressing N87 (HER2 ⁺⁺⁺ ) (Figure 15A) or JIMT-1 (HER2 ⁺⁺ ) (Figure 15B) target cells, no co-stimulatory activity was detected with HER2/neu-negative Hs700T target cells or in the absence target cells.

[00071] На Фигурах 16А и 16В показана способность CD137×TA связывающих молекул опосредовать зависимую от дозы и мишени передачу сигналов с участием пути NF/kB в CD137-экспрессирующей линии репортерных клеток (Jurkat-NF-κB-Luc), о чем свидетельствует увеличение экспрессии люциферазы. На Фигурах показаны результаты для DART-G и контрольных связывающих молекул DART-3 и DART-6 на CD137-экспрессирующих клетках Jurkat-NF-κB-Luc, культивированных совместно с клетками JIMT-1, экспрессирующими HER2/neu (Фигура 16А), или HER2/neu-отрицательными клетками KG-1 (Фигура 16В).[00071] Figures 16A and 16B show the ability of CD137xTA binding molecules to mediate dose- and target-dependent signaling involving the NF/κB pathway in a CD137-expressing reporter cell line (Jurkat-NF-κB-Luc), as evidenced by an increase luciferase expression. The Figures show results for DART-G and the control binding molecules DART-3 and DART-6 on CD137-expressing Jurkat-NF-κB-Luc cells co-cultured with JIMT-1 cells expressing HER2/neu (Figure 16A), or HER2/neu negative KG-1 cells (Figure 16B).

[00072] На Фигуре 17, панели А-О, показана способность CD137×TA связывающих молекул повышать пролиферацию Т-клеток в совместной культуре с ТА-экспрессирующими клетками-мишенями. CFSE-меченые человеческие Т-клетки ± субоптимальная стимуляция αCD3/αCD28 культивировали совместно с клетками-мишенями HER2/neu-high N87 (Фигура 17, панели А-С и J-K), клетками-мишенями HER2/neu-low MCF-7 (Фигура 17, панели D-F и L-M) или в отсутствие клеток-мишеней (Фигура 17, панели G-I и N-O) в присутствии DART-А (Фигура 17, панели A, D и G), DART-3 (Фигура 17, панели В, Е и Н), DART-6 (Фигура 17, панели С, F и I) или без молекул (Фигура 17, панели J, L и N) и контролировали пролиферацию Т-клеток.[00072] Figure 17, panels A-O, shows the ability of CD137xTA binding molecules to enhance T cell proliferation in co-culture with TA-expressing target cells. CFSE-labeled human T cells ± suboptimal αCD3/αCD28 stimulation were cocultured with HER2/neu-high N87 target cells (Figure 17, panels A-C and J-K), HER2/neu-low MCF-7 target cells (Figure 17, panels A-C and J-K). 17, panels D-F and L-M) or in the absence of target cells (Figure 17, panels G-I and N-O) in the presence of DART-A (Figure 17, panels A, D and G), DART-3 (Figure 17, panels B, E and H), DART-6 (Figure 17, panels C, F and I) or without molecules (Figure 17, panels J, L and N) and monitored T cell proliferation.

[00073] На Фигурах 18А-18В показана способность CD137×TA-связывающей молекулы DART-1 усиливать уничтожение клеток-мишеней N87 за счет АЗКЦ, опосредуемой антителом к ТА, маргетуксимабом, согласно результатам измерения ассоциированной с клетками активности люциферазы (Фигура 18А), и усиливать опосредуемую маргитуксимабом активацию NK-клеток, измеренную на основании экспрессии CD69 (Фигура 18В).[00073] Figures 18A-18B show the ability of the CD137xTA-binding molecule DART-1 to enhance the killing of N87 target cells by ADCC mediated by the anti-TA antibody, margetuximab, as measured by cell-associated luciferase activity (Figure 18A), and enhance margituximab-mediated NK cell activation as measured by CD69 expression (Figure 18B).

[00074] На Фигурах 19А-19В показаны результаты типичного анализа способности CD137×TA связывающей молекулы DART-7 и контрольной молекулы DART-8 опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (на примере высвобождения ИФН-γ). Высвобождение цитокинов измеряли в присутствии EphA2-экспрессирующих клеток-мишеней Hs700T (Фигура 19А) или EphA2-отрицательных клеток-мишеней Hs700T (EphA2.KO) (Фигура 19В) или в отсутствие клеток-мишеней. На графике также представлены следующие контрольные образцы: стимулированная общая популяция Т-клеток + клетки-мишени и необработанная/нестимулированная общая популяция Т-клеток.[00074] Figures 19A-19B show the results of a typical assay for the ability of the CD137xTA binding molecule DART-7 and the control molecule DART-8 to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (exemplified by IFN-γ release). Cytokine release was measured in the presence of EphA2-expressing Hs700T target cells (Figure 19A) or EphA2-negative Hs700T target cells (EphA2.KO) (Figure 19B) or in the absence of target cells. The graph also shows the following controls: stimulated total T cell population + target cells and untreated/unstimulated total T cell population.

[00075] На Фигурах 20А-20В показана способность производных DART-G, имеющих оптимизированные CDR_H3, связываться с CD137, экспрессированным на поверхности модифицированных клеток СНО (Фигура 20А) или CD8⁺ Т-клеток (Фигура 20В).[00075] Figures 20A-20B show the ability of DART-G derivatives having optimized _H 3 CDRs to bind to CD137 expressed on the surface of modified CHO cells (Figure 20A) or CD8 ⁺ T cells (Figure 20B).

[00076] На Фигурах 21А-21С показаны результаты типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул DART-B, DART-D, DART-G, DART-G2, DART-G3 и DART-G4, а также контрольных молекул DART-3 и DART-6, опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (на примере высвобождения ИФН-γ). Высвобождение цитокинов измеряли в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (Фигура 21А), клеток-мишеней JIMT-1 (Фигура 21В) или клеток-мишеней MDA-231 (Фигура 21С) или без клеток-мишеней.[00076] Figures 21A-21C show the results of a typical assay for the CD137xTA binding molecules DART-B, DART-D, DART-G, DART-G2, DART-G3, and DART-G4, as well as the control molecules DART-3 and DART-6, mediate co-stimulatory activity in a T-cell cytokine release assay (as exemplified by IFN-γ release). Cytokine release was measured in the presence of HER2/neu-expressing N87 target cells (Figure 21A), JIMT-1 target cells (Figure 21B) or MDA-231 target cells (Figure 21C) or without target cells.

[00077] На Фигуре 22 показаны результаты типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул DART-B, DART-G, DART-G1, DART-G2, DART-G3 и DART-G4, а также контрольных молекул DART-3 и DART-6, опосредовать перенаправленное уничтожение клеток-мишеней N87 (HER2⁺⁺⁺), измеренное на основании ассоциированной с клетками активности люциферазы.[00077] Figure 22 shows the results of a typical assay for the CD137xTA binding molecules DART-B, DART-G, DART-G1, DART-G2, DART-G3, and DART-G4, as well as the control molecules DART-3 and DART-G4. 6, mediate redirected killing of N87 target cells (HER2 ⁺⁺⁺ ) as measured by cell-associated luciferase activity.

[00078] На Фигурах 23А-23С показана способность CD137×TA связывающих молекул связывать разные клетки, экспрессирующие иллюстративный ТА, HER2/neu, согласно результатам измерения средней интенсивности флуоресценции (MFI). Фигура 23А: связывание с клетками рака желудка N87 (HER2⁺⁺⁺). Фигура 23В: связывание с клетками карциномы молочной железы JIMT-1 (HER2⁺⁺). Фигура 23С: связывание с клетками рака молочной железы MCF-7 (HER2⁺). Связывание для TRIDENT-А, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4 и контрольных связывающих молекул TRIDENT-1 и TRIDENT-2 показано на обеих панелях.[00078] Figures 23A-23C show the ability of CD137xTA binding molecules to bind various cells expressing an exemplary TA, HER2/neu, as measured by mean fluorescence intensity (MFI). Figure 23A: Binding to N87 (HER2 ⁺⁺⁺ ) gastric cancer cells. Figure 23B: JIMT-1(HER2 ⁺⁺ ) binding to breast carcinoma cells. Figure 23C: Binding to MCF-7 (HER2 ⁺ ) breast cancer cells. Binding for TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4, and control binding molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2 are shown in both panels.

[00079] На Фигурах 24А-24В показана способность CD137×TA связывающих молекул связываться с CD137, экспрессированным активированными CD8⁺ Т-клетками. Фигура 24А: TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4 и контрольные связывающие молекулы TRIDENT-1 и TRIDENT-2. Фигура 24В: DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4 и контрольные связывающие молекулы TRIDENT-1 и TRIDENT-2.[00079] Figures 24A-24B show the ability of CD137xTA binding molecules to bind CD137 expressed by activated CD8 ⁺ T cells. Figure 24A: TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4 and control binding molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2. Figure 24B: DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4 and control binding molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2.

[00080] На Фигурах 25А-25С показана способность CD137×TA связывающих молекул опосредовать конъюгацию клетка-клетка между клетками СНО, экспрессирующими CD137, и клетками, экспрессирующими иллюстративный ТА, HER2/neu, FACS. Фигура 25А: конъюгация клетка-клетка с клетками рака желудка N87 (HER2⁺⁺⁺). Фигура 25В: конъюгация клетка-клетка с клетками карциномы молочной железы JIMT-1 (HER2⁺⁺). Фигура 25С: конъюгация клетка-клетка с клетками рака молочной железы MCF-7 (HER2⁺). Активность TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-АЗ, TRIDENT-A4, DART-G4 и контрольной связывающей молекулы TRIDENT-2 показана на обеих панелях.[00080] Figures 25A-25C show the ability of CD137xTA binding molecules to mediate cell-cell conjugation between CHO cells expressing CD137 and cells expressing an exemplary TA, HER2/neu, FACS. Figure 25A: Cell-cell conjugation with N87 (HER2 ⁺⁺⁺ ) gastric cancer cells. Figure 25B: Cell-cell conjugation with JIMT-1 (HER2 ⁺⁺ ) breast carcinoma cells. Figure 25C: Cell-cell conjugation with MCF-7 (HER2 ⁺ ) breast cancer cells. The activities of TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-AZ, TRIDENT-A4, DART-G4, and the control binding molecule TRIDENT-2 are shown in both panels.

[00081] На Фигурах 26А-26С показаны результаты типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4 и контрольных связывающих молекул TRIDENT-1 и TRIDENT-2 опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (на примере высвобождения ИФН-γ). Высвобождение цитокинов измеряли в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (Фигура 26А), клеток-мишеней JIMT-1 (Фигура 26В) или без клеток-мишеней (Фигура 26С).[00081] Figures 26A-26C show the results of a typical assay for the CD137xTA binding molecule TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3, TRIDENT-A4, DART-G, DART-G2, DART-G3, DART-G4, and control binding molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2 mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (as exemplified by IFN-γ release). Cytokine release was measured in the presence of HER2/neu-expressing N87 target cells (Figure 26A), JIMT-1 target cells (Figure 26B), or without target cells (Figure 26C).

[00082] На Фигуре 27 показана способность примерной CD137×TA связывающей молекулы (TRIDENT-A2) усиливать опосредуемое TA×CD3 диателом перенаправленное уничтожение клеток-мишеней Colo205/Luc Т-клетками, измеренное с помощью ассоциированной с клетками люциферазы, в сравнении с контрольной молекулой (TRIDENT-1).[00082] Figure 27 shows the ability of an exemplary CD137xTA binding molecule (TRIDENT-A2) to enhance TAxCD3 diabody-mediated redirected killing of target cells by Colo205/Luc T cells, as measured by cell-associated luciferase, compared to a control molecule (TRIDENT-1).

[00083] На Фигурах 28А-28С показана экспрессия маркеров Т-клеток, присутствующих в 1 мг опухоли, отобранном после обработки контрольной средой ( •); TRIDENT-A2 TA×CD3 диателом комбинацией TRIDENT-A2 и диатела TA×CD3 МАТ к PD-1 или комбинацией TRIDENT-A2, диатела TA×CD3 и МАТ к PD-1. Фигура 28А: экспрессия CD4. Фигура 28В: экспрессия CD8. Фигура 28С: экспрессия CD69. Фигура 28D: экспрессия PD-1.[00083] Figures 28A-28C show the expression of T cell markers present in 1 mg of tumor sampled after treatment with control medium (•); TRIDENT-A2 TA×CD3 diabody combination of TRIDENT-A2 and diabody TA×CD3 MAT to PD-1 or a combination of TRIDENT-A2, TA×CD3 diabody and anti-PD-1 mAb. Figure 28A: CD4 expression. Figure 28B: CD8 expression. Figure 28C: CD69 expression. Figure 28D: PD-1 expression.

[00084] На Фигуре 29 показана способность контрольной среды (•); TRIDENT-А2 TA×CD3 диатела комбинации TRIDENT-A2 и TA×CD3 диатела МАТ к PD-1 и комбинации TRIDENT-А2, диатела и МАТ к PD-1 ингибировать рост опухоли или размножение клеток карциномы яичников в МКПК-восстановленной ксенотрансплантатной модели у мышей.[00084] Figure 29 shows the ability of the control environment (•); TRIDENT-A2 TA×CD3 diabodies combinations of TRIDENT-A2 and TA×CD3 diabody MAT to PD-1 and combinations of TRIDENT-A2, diabody, and anti-PD-1 mAb to inhibit tumor growth or proliferation of ovarian carcinoma cells in a PBMC-reconstituted xenograft mouse model.

[00085] На Фигуре 30 показана способность CD137×TA связывающих молекул TRIDENT-A2, TRIDENT-B2 и контрольных связывающих молекул TRIDENT-1 и TRIDENT-2 опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками яванской макаки (на примере высвобождения ИФН-γ). Высвобождение цитокинов измеряли в присутствии клеток-мишеней JIMT-1, экспрессирующих 5Т4 и HER2/neu.[00085] Figure 30 shows the ability of CD137xTA binding molecules TRIDENT-A2, TRIDENT-B2 and control binding molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2 to mediate co-stimulatory activity in a cytokine release assay from cynomolgus T cells (as exemplified by IFN-γ release ). Cytokine release was measured in the presence of JIMT-1 target cells expressing 5T4 and HER2/neu.

[00086] На Фигурах 31А-31В показаны аминокислотные последовательности VH1B hMAB-3 к CD137 (Фигура 30А, SEQ ID NO: 84) и VL3 hMAB-3 к CD137 (Фигура 30В, SEQ ID NO: 89). Остатки CDR подчеркнуты. Положения замен заключены в рамку и номера согласно Kabat указаны стрелками; последовательная нумерация аминокислотных остатков указана над последовательностями.[00086] Figures 31A-31B show the amino acid sequences of VH1B hMAB-3 anti-CD137 (Figure 30A, SEQ ID NO: 84) and VL3 hMAB-3 anti-CD137 (Figure 30B, SEQ ID NO: 89). The remainder of the CDR is underlined. Substitution positions are boxed and numbers according to Kabat are indicated by arrows; The sequential numbering of amino acid residues is indicated above the sequences.

[00087] На Фигурах 32А-32В показана способность антител к CD137, содержащих деиммунизированные домены VH и VL, связываться с CD137 активированных CD4⁺ Т-клеток или CD8⁺ Т-клеток, согласно результатам измерения методом FACS с использованием V510-меченых CD4⁺ и αhFc АФЦ (Фигура 32А) или FITC-меченых CD8 и αhFc АФЦ (Фигура 32В).[00087] Figures 32A-32B show the ability of anti-CD137 antibodies containing deimmunized VH and VL domains to bind to CD137 activated CD4 ⁺ T cells or CD8 ⁺ T cells, as measured by FACS using V510-labeled CD4 ⁺ and αhFc AFC (Figure 32A) or FITC-labeled CD8 and αhFc AFC (Figure 32B).

[00088] На Фигурах 33А-33В показана индукция ИФН-γ общей популяцией Т-клеток через 72 часа после стимуляции нанесенным на подложку и высушенным антителом к CD3 (3 мкг/мл-50 мкг/мл) в присутствии оптимизированных/деиммунизированных антител к CD137, МАВ-3 к CD137 (1b.3), МАВ-3 к CD137 (1Е.15) и МАВ-3 к CD137 (1G.15), в отсутствие сшивания (Фигура 33А) или сшитых с 4× hFc F(ab)'₂ (Фигура 33В).[00088] Figures 33A-33B show IFN-γ induction by a general population of T cells 72 hours after stimulation with coated and dried anti-CD3 antibody (3 μg/ml-50 μg/ml) in the presence of optimized/deimmunized anti-CD137 antibodies , MAB-3 anti-CD137 (1b.3), MAB-3 anti-CD137 (1E.15) and MAB-3 anti-CD137 (1G.15), in the absence of cross-linking (Figure 33A) or cross-linked with 4× hFc F(ab )' ₂ (Figure 33B).

[00089] На Фигурах 34А-34С показана способность CD137×TA связывающих молекул TRIDENT-В2, TRIDENT-B5 и контрольных молекул TRIDENT-1, TRIDENT-3 и TRIDENT-4 связываться с CD137 на поверхности активированных CD8⁺ Т-клеток, согласно результатам измерения методом FACS с использованием FITC-меченых CD8 и αhFc АФЦ (Фигура 34А), и с иллюстративным ТА, 5Т4, на поверхности клеток-мишеней JIMT-1 (5T4^hi) (Фигура 34В) или SKOV-3 (5Т4^lo) (Фигура 34С).[00089] Figures 34A-34C show the ability of the CD137×TA binding molecules TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 and the control molecules TRIDENT-1, TRIDENT-3 and TRIDENT-4 to bind to CD137 on the surface of activated CD8 ⁺ T cells, as determined by the results. FACS measurements using FITC-labeled CD8 and αhFc AFC (Figure 34A), and with an exemplary TA, 5T4, on the surface of target cells JIMT-1 (5T4 ^hi ) (Figure 34B) or SKOV-3 (5T4 ^lo ) (Figure 34C).

[00090] На Фигурах 35А-35С показана способность CD137×TA связывающих молекул опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (на примере высвобождения ИФН-γ). На Фигурах показаны результаты для TRIDENT-B2, TRIDENT-В5 и контрольных молекул TRIDENT-1, TRIDENT-3 и TRIDENT-4, испытанных в присутствии 5Т4-экспрессирующих клеток-мишеней JIMT-1 (5T4^hi) (Фигура 35А) или SKOV-3 (5T4^lo) (Фигура 35В), костимулирующая активность не была обнаружена в отсутствие клеток-мишеней (Фигура 35С).[00090] Figures 35A-35C show the ability of CD137xTA binding molecules to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (as exemplified by IFN-γ release). The Figures show the results for TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 and control molecules TRIDENT-1, TRIDENT-3 and TRIDENT-4 tested in the presence of 5T4-expressing target cells JIMT-1 (5T4 ^hi ) (Figure 35A) or SKOV- 3 (5T4 ^lo ) (Figure 35B), no costimulatory activity was detected in the absence of target cells (Figure 35C).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[00091] Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, которые имеют один или более эпитопсвязывающих сайтов, специфичных для эпитопа CD137, и один или более эпитопсвязывающих сайтов, специфичных для эпитопа опухолевого антигена («ТА») (например, «CD137×TA связывающая молекула»). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения такие CD137×TA связывающие молекулы будут представлять собой биспецифические молекулы, в частности, биспецифические четырехвалентные диатела, которые состоят из двух, трех, четырех или более четырех полипептидных цепей и имеют два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. Согласно другому варианту такие CD137×TA связывающие молекулы будут представлять собой биспецифические молекулы, в частности, биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, состоящие из трех или более полипептидных цепей и имеющие один или два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа CD137, и один или два эпитопсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для эпитопа ТА. CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с CD137 и ТА. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат любые такие CD137×TA связывающие молекулы. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких молекул в лечении рака и других заболеваний и состояний. Согласно настоящему изобретению также предложены новые CD137-связывающие молекулы и HER2/neu-связывающие молекулы, а также их производные и варианты их применения.[00091] The present invention provides binding molecules that have one or more epitope-binding sites specific for a CD137 epitope and one or more epitope-binding sites specific for a tumor antigen (“TA”) epitope (e.g., “CD137×TA binding molecule” ). According to one embodiment of the present invention, such CD137xTA binding molecules will be bispecific molecules, in particular, bispecific tetravalent diabodies that consist of two, three, four, or more than four polypeptide chains and have two epitope-binding sites, each of which is specific for an epitope CD137, and two epitope-binding sites, each of which is specific for the TA epitope. In another embodiment, such CD137xTA binding molecules will be bispecific molecules, in particular, bispecific trivalent binding molecules consisting of three or more polypeptide chains and having one or two epitope binding sites, each of which is specific for a CD137 epitope, and one or two epitope-binding sites, each of which is specific for the TA epitope. The CD137xTA binding molecules of the present invention are capable of simultaneously binding to CD137 and TA. The present invention relates to pharmaceutical compositions that contain any such CD137xTA binding molecules. The present invention further relates to methods of using such molecules in the treatment of cancer and other diseases and conditions. The present invention also provides novel CD137 binding molecules and HER2/neu binding molecules, as well as derivatives thereof and uses thereof.

I. Антитела и другие связывающие молекулыI. Antibodies and other binding molecules

[00092] Антитела представляют собой молекулы иммуноглобулинов, способные специфично связываться с областью-мишенью («эпитопом») молекулы, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д. («антиген»), за счет по меньшей мере одного «эпитопсвязывающего сайта», расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В настоящем документе термины «антитело» и «антитела» относятся к моноклональным антителам, полиспецифическим антителам, человеческим антителам, гуманизированным антителам, синтетическим антителам, химерным антителам, поликлональным антителам, верблюжьим антителам, одноцепочечным Fv (scFv), одноцепочечным антителам, фрагментам Fab, фрагментам F(ab'), дисульфидсвязанным биспецифическим Fv (sdFv), интрателам и эпитопсвязывающим фрагментам любого из указанных выше. В частности, термин «антитело» включает молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулы, которые содержат эпитопсвязывающий сайт. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂) или подкласса. Антитела способны «иммуноспецифично связываться» с полипептидом или белком или небелковой молекулой благодаря присутствию на такой молекуле определенного домена, фрагмента или конформации («эпитоп»). В настоящем документе термин «эпитопсвязывающий фрагмент антитела» предназначен для обозначения части антитела, способной иммуноспецифично связываться с эпитопом. В настоящем документе термин охватывает фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv) и одноцепочечный фрагмент (scFv), а также эпитопсвязывающий домен диатела. В настоящем документе антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, о которых говорят, что они «иммуноспецифично» связывают область другой молекулы (т.е. эпитоп), если они реагируют или ассоциируются чаще, быстрее, более длительно и/или с большей аффинностью или авидностью с этим эпитопом по сравнению с альтернативными эпитопами. Из этого определения также понятно, что, например, антитело или его эпитопсвязывающий фрагмент, который иммуноспецифично связывается с первой мишенью, может специфично или предпочтительно связываться со второй мишенью или может не связываться с ней. Эпитопсодержащая молекула может обладать иммуногенной активностью так, что она вызывает выработку антител у животного; такие молекулы называются «антигены». Природные антитела способны связываться только с одним типом эпитопов (т.е. они являются «моноспецифическими»), хотя они могут связывать несколько копий эпитопа этого типа (т.е. проявлять «двухвалентность» или «поливалентность»).[00092] Antibodies are immunoglobulin molecules capable of specifically binding to a target region (“epitope”) of a molecule, such as a carbohydrate, polynucleotide, lipid, polypeptide, etc. (“antigen”), due to at least one “epitope-binding site” located in the variable region of the immunoglobulin molecule. As used herein, the terms "antibody" and "antibodies" refer to monoclonal antibodies, polyspecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, synthetic antibodies, chimeric antibodies, polyclonal antibodies, camel antibodies, single chain Fv (scFv), single chain antibodies, Fab fragments, fragments F(ab'), disulfide-linked bispecific Fv (sdFv), intrabodies and epitope-binding fragments of any of the above. In particular, the term "antibody" includes immunoglobulin molecules and immunologically active fragments of immunoglobulin molecules, i.e. molecules that contain an epitope-binding site. Immunoglobulin molecules can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY), class (eg, IgG ₁ , IgG ₂ , IgG ₃ , IgG ₄ , IgA ₁ and IgA ₂ ) or subclass. Antibodies are able to “immunospecifically bind” to a polypeptide or protein or non-protein molecule due to the presence of a specific domain, fragment or conformation (“epitope”) on such molecule. As used herein, the term “epitope-binding antibody fragment” is intended to refer to the portion of an antibody capable of immunospecifically binding to an epitope. As used herein, the term covers fragments (such as Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fv) and single chain fragment (scFv), as well as the epitope binding domain of the diabody. As used herein, an antibody or epitope-binding fragment thereof that is said to “immunospecifically” bind a region of another molecule (i.e., an epitope) if it reacts or associates more frequently, more quickly, longer lastingly, and/or with greater affinity or avidity with this epitope compared to alternative epitopes. It is also clear from this definition that, for example, an antibody or epitope-binding fragment thereof that immunospecifically binds to a first target may or may not specifically or preferentially bind to a second target. The epitope-containing molecule may have immunogenic activity such that it induces the production of antibodies in the animal; such molecules are called "antigens". Natural antibodies are capable of binding to only one type of epitope (i.e., they are “monospecific”), although they can bind multiple copies of that type of epitope (i.e., exhibit “bivalency” or “multivalency”).

[00093] Термин «моноклональное антитело» относится к гомогенной популяции антител, в которой моноклональное антитело состоит из аминокислот (природных или неприродных), которые участвуют в селективном связывании антигена. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного эпитопа (или антигенного сайта). Термин «моноклональное антитело» охватывает не только интактные моноклональные антитела и полноразмерные моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные фрагменты (scFv), их мутантов, гибридные белки, содержащие часть антитела, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена с требуемой специфичностью и способностью связываться с антигеном. Этот термин не является ограничивающим в отношении источника антитела или способа его получения (например, с помощью гибридомы, отбора фагов, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает полные иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением «антитело». Способы получения моноклональных антител известны в данной области техники. Одним из способов, которые можно применять, является способ Kohler, G. et al. (1975) «Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity», Nature 256:495-497 или его модификация. Как правило, моноклональные антитела вырабатываются у мышей, крыс или кроликов. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат желательный эпитоп. Иммуноген может представлять собой, но не ограничивается указанными, первичные клетки, культивируемые клеточные линии, раковые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткани. Клетки, применяемые для иммунизации, можно культивировать в течение некоторого периода времени (например, по меньшей мере 24 часа) перед их применением в качестве иммуногена. Клетки можно применять в качестве иммуногенов сами по себе или в комбинации с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, V.M. (1995) «Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Productions, ILAR J. 37(3): 119-125). В целом клетки необходимо поддерживать в интактном и предпочтительно жизнеспособном состоянии при применении в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут обеспечить лучшее детектирование антигенов иммунизированным животным, чем разрушенные клетки. Применение денатурирующих или агрессивных адъювантов, например, адъюванта Фрейнда, может привести к разрыву клеток и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить несколько раз с периодическими интервалами, такими как два раза в неделю или один раз в неделю, или можно вводить так, чтобы поддерживать жизнеспособность у животного (например, в тканевом рекомбинанте). Согласно другому варианту существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются иммуноспецифичными для желательного патогенного эпитопа, могут быть секвенированы и получены рекомбинантно с помощью любого способа, известного в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения такое антитело секвенируют, и полинуклеотидную последовательность затем клонируют в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую антитело, представляющее интерес, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и клетка-хозяин затем может быть размножена и заморожена для будущего применения. Полинуклеотидную последовательность таких антител можно применять для генетической манипуляции, чтобы получить моноспецифические или полиспецифические (например, биспецифические, триспецифические и тетраспецифические) молекулы согласно настоящему изобретению, а также оптимизированные по аффинности антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и/или канинизированные антитела, чтобы улучшить аффинность или другие характеристики антитела. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности эпитопсвязывающей части антитела и замену оставшейся части антитела из вида, отличного от человека, последовательностями человеческих антител. Существует четыре основных этапа гуманизации моноклонального антитела. Они включают: (1) определение нуклеотидной и/или предсказанной аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей исходного антитела; (2) конструирование гуманизированного антитела или канинизированного антитела, т.е. принятие решения о том, какой(ие) каркасный(ые) участок (участки) антитела применять в процессе гуманизации или канинизации; (3) применение современных методологий/методик гуманизации или канинизации; и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного или канинизированного антитела (см., например, патенты США №4816567; 5807715; 5866692; и 6331415).[00093] The term "monoclonal antibody" refers to a homogeneous population of antibodies in which the monoclonal antibody is composed of amino acids (natural or non-natural) that are involved in selective antigen binding. Monoclonal antibodies are highly specific and directed against a single epitope (or antigenic site). The term "monoclonal antibody" covers not only intact monoclonal antibodies and full-length monoclonal antibodies, but also their fragments (such as Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fv), single chain fragments (scFv), their mutants, fusion proteins, containing part of an antibody, humanized monoclonal antibodies, chimeric monoclonal antibodies and any other modified configuration of an immunoglobulin molecule that contains an antigen recognition site with the required specificity and ability to bind to the antigen. The term is not limiting as to the source of the antibody or the method of its production (eg, hybridoma, phage selection, recombinant expression, transgenic animals, etc.). The term includes complete immunoglobulins, as well as fragments, etc., described above under the definition of "antibody". Methods for producing monoclonal antibodies are known in the art. One method that can be used is the method of Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity", Nature 256:495-497 or modification thereof. Typically, monoclonal antibodies are produced in mice, rats or rabbits. Antibodies are produced by immunizing an animal with an immunogenic number of cells, cell extracts, or protein preparations that contain the desired epitope. The immunogen may be, but is not limited to, primary cells, cultured cell lines, cancer cells, proteins, peptides, nucleic acids or tissues. Cells used for immunization may be cultured for a period of time (eg, at least 24 hours) before being used as an immunogen. Cells can be used as immunogens by themselves or in combination with a non-denaturing adjuvant such as Ribi (see, for example, Jennings, VM (1995) Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Productions, ILAR J. 37(3): 119 -125). In general, cells must be maintained in an intact and preferably viable state when used as immunogens. Intact cells may provide better detection of antigens in immunized animals than destroyed cells. The use of denaturing or aggressive adjuvants, such as Freund's adjuvant, may result in cell rupture and is therefore not recommended. The immunogen can be administered multiple times at periodic intervals, such as twice a week or once a week, or can be administered so as to maintain viability in the animal (eg, in a tissue recombinant). In another embodiment, existing monoclonal antibodies and any other equivalent antibodies that are immunospecific for the desired pathogenic epitope can be sequenced and recombinantly produced using any method known in the art. In one embodiment of the present invention, such an antibody is sequenced and the polynucleotide sequence is then cloned into an expression or propagation vector. The sequence encoding the antibody of interest can be maintained in a vector in a host cell, and the host cell can then be expanded and frozen for future use. The polynucleotide sequence of such antibodies can be used for genetic manipulation to produce monospecific or polyspecific (e.g., bispecific, trispecific and tetraspecific) molecules of the present invention, as well as affinity optimized antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and/or caninized antibodies to improve affinity or other characteristics of the antibody. The general principle of humanizing an antibody involves retaining the core sequence of the epitope-binding portion of the antibody and replacing the remaining portion of the antibody from a non-human species with human antibody sequences. There are four main steps in the humanization of a monoclonal antibody. These include: (1) determination of the nucleotide and/or predicted amino acid sequence of the variable domains of the light and heavy chains of the parent antibody; (2) construction of a humanized antibody or a caninized antibody, i.e. deciding which antibody framework(s) to use in the humanization or caninization process; (3) application of modern methodologies/techniques of humanization or caninization; and (4) transfection and expression of a humanized or canized antibody (see, for example, US Pat. Nos. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; and 6,331,415).

[00094] В последние несколько десятилетий наблюдается возобновление интереса к терапевтическому потенциалу антител, и антитела стали одним из ведущих классов биотехнологических лекарственных препаратов (Chan, С.Е. et at. (2009) «The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases», Singapore Med. J. 50(7):663-666). Более 200 препаратов на основе антител были одобрены для применения или находятся на этапе разработки.[00094] The past few decades have seen renewed interest in the therapeutic potential of antibodies, and antibodies have become one of the leading classes of biotechnology drugs (Chan, S. E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases" Singapore Med J 50(7):663-666). More than 200 antibody-based drugs have been approved for use or are in development.

А. Общие структурные признаки антителA. General structural characteristics of antibodies

[00095] Основная структурная единица природных иммуноглобулинов (например, IgG) представляет собой тетрамер, состоящий из двух более коротких «легких цепей», образующих комплекс с двумя более длинными «тяжелыми цепями», и обычно экспрессируется в виде гликопротеина массой приблизительно 150000 Да. Каждая цепь состоит из амино-концевой («N-концевой») части, которая содержит «вариабельный домен», и карбокси-концевой («С-концевой») части, которая содержит по меньшей мере один «константный домен». Легкая цепь IgG состоит из одного «вариабельного домена легкой цепи» («VL») и одного «константного домена легкой цепи» («CL»). Таким образом, структура легких цепей молекулы IgG представляет собой n-VL-CL-c (где n и с представляют, соответственно, N-конец и С-конец полипептида). Тяжелая цепь IgG состоит из одного «вариабельного домена тяжелой цепи» («VH»), трех «константных доменов тяжелой цепи» («СН1», «СН2» и «СН3») и «шарнирной» области («Н»), расположенной между доменами СН1 и СН2. Таким образом, структура тяжелой цепи IgG представляет собой n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (где n и с представляют, соответственно, N-конец и С-конец полипептида). Способность интактного немодифицированного антитела (например, антитела IgG) связывать эпитоп антигена зависит от присутствия и последовательностей вариабельных доменов.[00095] The basic structural unit of natural immunoglobulins (eg, IgG) is a tetramer consisting of two shorter "light chains" complexed with two longer "heavy chains" and is typically expressed as a glycoprotein of approximately 150,000 Daltons. Each chain consists of an amino-terminal (“N-terminal”) portion, which contains a “variable domain,” and a carboxy-terminal (“C-terminal”) portion, which contains at least one “constant domain.” The IgG light chain consists of one “light chain variable domain” (“VL”) and one “light chain constant domain” (“CL”). Thus, the light chain structure of an IgG molecule is n-VL-CL-c (where n and c represent the N-terminus and C-terminus of the polypeptide, respectively). The IgG heavy chain consists of one "heavy chain variable domain" ("VH"), three "heavy chain constant domains" ("CH1", "CH2" and "CH3") and a "hinge" region ("H") located between domains CH1 and CH2. Thus, the structure of the IgG heavy chain is n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (where n and c represent the N-terminus and C-terminus of the polypeptide, respectively). The ability of an intact, unmodified antibody (eg, an IgG antibody) to bind an antigen epitope depends on the presence and sequence of variable domains.

1. Константные домены1. Constant domains

(a) Константный домен легкой цепи(a) Light chain constant domain

[00096] Предпочтительный домен CL представляет собой каппа-домен CL человеческого IgG. Аминокислотная последовательность примерного человеческого каппа-домена CL представляет собой (SEQ ID NO: 1):[00096] A preferred CL domain is the kappa CL domain of human IgG. The amino acid sequence of the exemplary human kappa CL domain is (SEQ ID NO: 1):

[00097] Согласно другому варианту примерный домен CL представляет собой лямбда-домен человеческого IgG. Аминокислотная последовательность примерного человеческого лямбда-домена CL представляет собой (SEQ ID NO: 2):[00097] In another embodiment, an exemplary CL domain is a human IgG lambda domain. The amino acid sequence of the exemplary human lambda CL domain is (SEQ ID NO: 2):

(b) Домены CH1 тяжелой цепи(b) Heavy chain CH1 domains

[00098] Примерный домен CH1 представляет собой домен СН1 человеческого IgG1. Аминокислотная последовательность примерного домена СН1 человеческого IgG1 представляет собой (SEQ ID NO: 3):[00098] An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG1. The amino acid sequence of the exemplary CH1 domain of human IgG1 is (SEQ ID NO: 3):

[00099] Примерный домен CH1 представляет собой домен CH1 человеческого IgG2. Аминокислотная последовательность примерного домена СН1 человеческого IgG2 представляет собой (SEQ ID NO: 4):[00099] An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG2. The amino acid sequence of the exemplary human IgG2 CH1 domain is (SEQ ID NO: 4):

[000100] Примерный домен CH1 представляет собой домен CH1 человеческого IgG3. Аминокислотная последовательность примерного домена СН1 человеческого IgG3 [000100] An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG3. Amino acid sequence of the approximate CH1 domain of human IgG3

представляет собой (SEQ ID NO: 5):is (SEQ ID NO: 5):

[000101] Примерный домен CH1 представляет собой домен СН1 человеческого IgG4. Аминокислотная последовательность примерного домена СН1 человеческого IgG4 представляет собой (SEQ ID NO: 6):[000101] An exemplary CH1 domain is the CH1 domain of human IgG4. The amino acid sequence of the exemplary human IgG4 CH1 domain is (SEQ ID NO: 6):

(c) Шарнирные области тяжелой цепи(c) Heavy chain hinge regions

[000102] Примерная шарнирная область представляет собой шарнирную область человеческого IgG1. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области человеческого IgG1 представляет собой (SEQ ID NO: 7):[000102] An exemplary hinge region is a human IgG1 hinge region. The amino acid sequence of the exemplary hinge region of human IgG1 is (SEQ ID NO: 7):

[000103] Другой пример шарнирной области представляет собой шарнирную область человеческого IgG2. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области человеческого IgG2 представляет собой (SEQ ID NO: 8):[000103] Another example of a hinge region is the human IgG2 hinge region. The amino acid sequence of the exemplary hinge region of human IgG2 is (SEQ ID NO: 8):

[000104] Другая примерная шарнирная область представляет собой шарнирную область человеческого IgG3. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области человеческого IgG3 представляет собой (SEQ ID NO: 9):[000104] Another exemplary hinge region is the human IgG3 hinge region. The amino acid sequence of the exemplary hinge region of human IgG3 is (SEQ ID NO: 9):

[000105] Другая примерная шарнирная область представляет собой шарнирную область человеческого IgG4. Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области человеческого IgG4 представляет собой (SEQ ID NO: 10):[000105] Another exemplary hinge region is the human IgG4 hinge region. The amino acid sequence of the exemplary hinge region of human IgG4 is (SEQ ID NO: 10):

[000106] Как описано в настоящем документе, шарнирная область IgG4 может содержать стабилизирующую мутацию, такую как замена S228P (пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat). Аминокислотная последовательность примерной стабилизированной шарнирной области IgG4 представляет собой (SEQ ID NO: 11):[000106] As described herein, the IgG4 hinge region may contain a stabilizing mutation, such as the S228P substitution (numbered using the EC suffix as set forth in Kabat). The amino acid sequence of an exemplary IgG4 stabilized hinge region is (SEQ ID NO: 11):

(d) Домены СН2 и СН3 тяжелой цепи(d) Heavy chain CH2 and CH3 domains

[000107] Домены СН2 и СН3 двух тяжелых цепей взаимодействуют с образованием «области Fc» антител IgG, которая распознается клеточными рецепторами Fc, включая, но не ограничиваясь указанными, рецепторы Fc-гамма (FcγR). В настоящем документе термин «область Fc» используется для определения С-концевой области тяжелой цепи IgG. Часть области Fc (включая часть, которая охватывает всю область Fc) называется в настоящем документе «домен Fc». Область Fc, о которой говорят, что она относится к определенному изотипу, классу или подклассу IgG, если ее аминокислотная последовательность наиболее гомологична этому изотипу по сравнению с другими изотипами IgG. Было показано, что в дополнение к известным вариантам применения антител в диагностике их можно применять в качестве терапевтических агентов.[000107] The CH2 and CH3 domains of the two heavy chains interact to form the “Fc region” of IgG antibodies, which is recognized by cellular Fc receptors, including, but not limited to, Fc gamma receptors (FcγR). As used herein, the term “Fc region” is used to define the C-terminal region of the IgG heavy chain. A portion of the Fc region (including the portion that encompasses the entire Fc region) is referred to herein as the “Fc domain.” An Fc region that is said to belong to a particular IgG isotype, class, or subclass if its amino acid sequence is most homologous to that isotype compared to other IgG isotypes. In addition to the known diagnostic uses of antibodies, they have been shown to be useful as therapeutic agents.

[000108] Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 примерного человеческого IgG1 представляет собой (SEQ ID NO: 12):[000108] The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of exemplary human IgG1 is (SEQ ID NO: 12):

пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.numbered using the EC suffix as set out in Kabat, where X represents lysine (K) or is absent.

[000109] Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 примерного человеческого IgG2 представляет собой (SEQ ID NO: 13):[000109] The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of an exemplary human IgG2 is (SEQ ID NO: 13):

[000110] Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 примерного человеческого IgG3 представляет собой (SEQ ID NO: 14):[000110] The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of an exemplary human IgG3 is (SEQ ID NO: 14):

[000111] Аминокислотная последовательность домена СН2-СН3 примерного человеческого IgG4 представляет собой (SEQ ID NO: 15):[000111] The amino acid sequence of the CH2-CH3 domain of exemplary human IgG4 is (SEQ ID NO: 15):

[000112] На всем протяжении настоящего описания нумерация остатков в константной области тяжелой цепи IgG соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5^th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) («Kabat»), в явной форме включенной в настоящий документ посредством ссылки. Термин «индекс ЕС, как изложено в Kabat» относится к нумерации константных доменов человеческого антитела IgG1 ЕС.[000112] Throughout this specification, the numbering of residues in the constant region of the IgG heavy chain corresponds to the numbering using the EC suffix as set forth in Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, ^5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) (“Kabat”), which is expressly incorporated herein by reference. The term "EC index as set out in Kabat" refers to the numbering of the constant domains of the human IgG1 EC antibody.

[000113] Полиморфизмы наблюдали в ряде различных положений в константных областях антитела (например, в положениях Fc, включая, но не ограничиваясь указанными, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358, в соответствии с системой нумерации с использованием индекса ЕС, изложенной в Кабат), и, соответственно, могут существовать небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями, известными из предшествующего уровня техники. Хорошо известны полиморфные формы иммуноглобулинов человека. В настоящее время известно 18 GM-аллотипов: G1m (1, 2, 3, 17) или G1m (а, х, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (b1, с3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., «The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation)). Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Конкретно предусмотрено, что антитела согласно настоящему изобретению могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей, обеспеченных в настоящем документе. Помимо этого в некоторых системах экспрессии С-концевой остаток аминокислоты (выделенный жирным шрифтом) домена СН3 может быть удален после трансляции. Соответственно, С-концевой остаток домена СН3 представляет собой необязательный остаток аминокислоты в CD137×TA связывающих молекулах согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение конкретно охватывает CD137×TA связывающие молекулы, лишенные С-концевого остатка домена СН3. Настоящее изобретение также конкретно охватывает такие конструкции, содержащие С-концевой остаток лизина домена СН3.[000113] Polymorphisms have been observed at a number of different positions in the antibody constant regions (e.g., Fc positions, including, but not limited to, positions 270, 272, 312, 315, 356 and 358, according to the EC numbering system, set forth in Kabat), and accordingly there may be slight differences between the presented sequence and the sequences known from the prior art. Polymorphic forms of human immunoglobulins are well known. Currently, 18 GM allotypes are known: G1m (1, 2, 3, 17) or G1m (a, x, f, z), G2m (23) or G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11 , 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) or G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc , et al., “The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation)). Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). It is specifically contemplated that the antibodies of the present invention may include any allotype, isoallotype or haplotype of any immunoglobulin gene and are not limited to the allotype, isoallotype or haplotype of the sequences provided herein. Additionally, in some expression systems, the C-terminal amino acid residue (in bold) of the CH3 domain may be removed after translation. Accordingly, the C-terminal residue of the CH3 domain is an optional amino acid residue in the CD137xTA binding molecules of the present invention. The present invention specifically covers CD137xTA binding molecules lacking the C-terminal residue of the CH3 domain. The present invention also specifically covers such constructs containing the C-terminal lysine residue of the CH3 domain.

2. Вариабельные домены2. Variable domains

[000114] Вариабельные домены молекулы IgG состоят из трех «гипервариабельных участков» («CDR»), которые содержат аминокислотные остатки антитела, которые будут вступать в контакт с эпитопом, а также промежуточные сегменты, отличные от CDR, называемые «каркасные участки» («FR»), которые в целом поддерживают структуру и определяют расположение петель CDR, чтобы обеспечить такое контактирование (несмотря на то, что некоторые каркасные остатки также могут связываться с эпитопом). Таким образом, домены VL и VH имеют структуру n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c. Аминокислотные последовательности CDR определяют, сможет ли антитело связываться с конкретным эпитопом. Взаимодействие легкой цепи антитела с тяжелой цепью антитела и, в частности, взаимодействие их доменов VL и VH, образует эпитопсвязывающий сайт антитела.[000114] The variable domains of an IgG molecule consist of three “hypervariable regions” (“CDRs”) that contain the amino acid residues of the antibody that will contact the epitope, as well as intervening segments other than the CDRs called “framework regions” (“framework regions”). FR"), which generally support the structure and determine the location of the CDR loops to allow such contact (although some framework residues may also bind the epitope). Thus, the VL and VH domains have the structure n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c. The amino acid sequences of the CDR determine whether an antibody can bind to a specific epitope. The interaction of the antibody light chain with the antibody heavy chain, and in particular the interaction of their VL and VH domains, forms the epitope-binding site of the antibody.

[000115] Аминокислоты из вариабельных доменов зрелых тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов обозначены положением аминокислоты в цепи. Kabat (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5^th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)) описал многочисленные аминокислотные последовательности для антител, идентифицировал консенсусную аминокислотную последовательность для каждой подгруппы и присвоил номер остатка для каждой аминокислоты, и CDR и FR идентифицированы, как определено Kabat (следует понимать, что CDR_H1, как определено Chothia, С.& Lesk, А.М. ((1987) «Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins», J. Mol. Biol. 196:901-917), начинается на пять остатков ранее). Схема нумерации Kabat может быть расширена на антитела, не включенные в его сборник, путем сопоставления рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей в Kabat по отношению к консервативным аминокислотам. Этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в данной области техники и позволяет легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях в разных антителах, включая химерные или гуманизированные варианты. Например, аминокислота в положении 50 легкой цепи антитела человека занимает положение, эквивалентное таковому для аминокислоты в положении 50 легкой цепи мышиного антитела.[000115] Amino acids from the variable domains of mature immunoglobulin heavy and light chains are designated by the position of the amino acid in the chain. Kabat (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, ^5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991)) described numerous amino acid sequences for antibodies, identified a consensus amino acid sequence for each subgroup and assigned a residue number for each amino acid, and CDR and FR identified as defined by Kabat (it should be understood that CDR _H 1, as defined by Chothia, S. & Lesk, A. M. ((1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins", J. Mol. Biol. 196: 901-917), begins five residues earlier). Kabat's numbering scheme can be extended to antibodies not included in its collection by matching the antibody in question to one of the consensus sequences in Kabat with respect to conserved amino acids. This method of assigning residue numbers has become standard in the art and allows for easy identification of amino acids at equivalent positions in different antibodies, including chimeric or humanized variants. For example, the amino acid at position 50 of the light chain of a human antibody occupies a position equivalent to that of the amino acid at position 50 of the light chain of a murine antibody.

[000116] Полипептиды, которые представляют собой (или могут служить в качестве них) первый, второй и третий CDR легкой цепи антитела обозначены в настоящем документе, соответственно, как: домен CDR_L1, домен CDR_L2 и домен CDR_L3. Аналогичным образом, полипептиды, которые представляют собой (или могут служить в качестве них) первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела обозначены в настоящем документе, соответственно, как: домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3. Таким образом, термины домен CDR_L1, домен CDR_L2, домен CDR_L3, домен CDR_H1, домен CDR_H2 и домен CDR_H3 относятся к полипептидам, которые при включении в белок придают этому белку способность связываться со специфическим эпитопом, независимо от того, является ли такой белок антителом, имеющим легкие и тяжелые цепи, или диателом или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и т.д.), или представляет собой белок другого типа. Соответственно, в настоящем документе термин «эпитопсвязывающий фрагмент» обозначает фрагмент молекулы, способный иммуноспецифично связываться с эпитопом. Эпитопсвязывающий фрагмент может содержать любые 1, 2, 3, 4 или 5 доменов CDR антитела или может содержать все 6 из доменов CDR антитела и, несмотря на то, что он способен иммуноспецифично связываться с таким эпитопом, может проявлять иммуноспецифичность, аффинность или селективность в отношении такого эпитопа, которые отличаются от аналогичных показателей такого антитела. Однако предпочтительно эпитопсвязывающий фрагмент будет содержать все 6 из доменов CDR такого антитела. Эпитопсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой одну полипептидную цепь (например, scFv) или может содержать две или более полипептидных цепей, каждая из которых имеет амино- конец и карбокси-конец (например, диатело, фрагмент Fab, фрагмент Fab₂ и т.д.). Если специально не указано иное, порядок доменов белковых молекул, описанных в настоящем документе, имеет направление «от N-конца к С-концу».[000116] Polypeptides that are (or may serve as) the first, second, and third CDRs of an antibody light chain are referred to herein, respectively, as: CDR _L 1 domain, CDR _L 2 domain, and CDR _L 3 domain. Likewise Thus, polypeptides that are (or may serve as) the first, second, and third CDRs of an antibody heavy chain are referred to herein, respectively, as: CDR _H 1 domain, CDR _H 2 domain, and CDR _H 3 domain. Thus The terms CDR _L 1 domain, CDR _L 2 domain, CDR _L 3 domain, CDR _H 1 domain, CDR _H 2 domain, and CDR _H 3 domain refer to polypeptides that, when incorporated into a protein, confer on that protein the ability to bind to a specific epitope, independently whether such a protein is an antibody having light and heavy chains, or a diabody or single chain binding molecule (eg, scFv, BiTe, etc.), or is another type of protein. Accordingly, as used herein, the term “epitope-binding fragment” refers to a fragment of a molecule capable of immunospecifically binding to an epitope. An epitope-binding fragment may contain any 1, 2, 3, 4, or 5 antibody CDR domains or may contain all 6 of the antibody CDR domains and, while capable of immunospecifically binding to such an epitope, may exhibit immunospecificity, affinity, or selectivity for such an epitope, which differ from those of such an antibody. However, preferably the epitope binding fragment will contain all 6 of the CDR domains of such an antibody. The epitope-binding antibody fragment may be a single polypeptide chain (e.g., scFv) or may contain two or more polypeptide chains, each having an amino terminus and a carboxy terminus (e.g., diabody, Fab fragment, Fab ₂ fragment, etc. ). Unless specifically stated otherwise, the order of the domains of the protein molecules described herein is from N-terminus to C-terminus.

[000117] Эпитопсвязывающий сайт может содержать либо полный вариабельный домен, гибридизованный с константными доменами, либо только гипервариабельные участки (CDR) такого вариабельного домена, привитые на соответствующие каркасные участки. Эпитопсвязывающие сайты могут быть дикого типа или могут быть модифицированы одной или более заменами аминокислот. Это исключает константную область в качестве иммуногена у человека, однако сохраняется возможность иммунного ответа на чужеродный вариабельный домен (LoBuglio, A.F. et al. (1989) «Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Responses, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Другой подход сосредоточен не только на обеспечении константных областей человеческого происхождения, но и на модификации вариабельных доменов, чтобы как можно более точно изменить их на человеческую форму. Известно, что вариабельные домены тяжелых и легких цепей содержат три гипервариабельных участка (CDR), которые изменяются в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют способность к связыванию, фланкированных четырьмя каркасными участками (FR), которые являются относительно консервативными у данного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении антител из вида, отличного от человека, по отношению к определенному антигену, вариабельные домены могут быть «преобразованы» или «гуманизированы» путем прививки CDR, полученных из антител из видов, отличных от человека, на FR, присутствующие в человеческом антителе, подлежащем модификации. Применение упомянутого подхода к различным антителам было описано Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies for Therapy», Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity», Science 239:1534-1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) «Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformations», Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) «Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity», Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S.D. et al. (1991) «Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) «Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo», Bio/Technology 9:266-271; Co, M.S. et al. (1991) «Humanized Antibodies For Antiviral Therapy», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) «Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. et al. (1992) «Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen», J. Immunol. 148:1149-1154. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированные антитела содержат один или более CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), последовательности которых отличаются в сравнении с исходным антителом.[000117] The epitope-binding site may contain either the entire variable domain hybridized to the constant domains, or only the hypervariable regions (CDRs) of such a variable domain grafted onto appropriate framework regions. Epitope binding sites may be wild type or may be modified by one or more amino acid substitutions. This excludes the constant region as an immunogen in humans, but the possibility of an immune response to a foreign variable domain remains possible (LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Responses,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220–4224). Another approach focuses not only on providing constant regions of human origin, but also on modifying variable domains to change them as closely as possible to the human form. The variable domains of the heavy and light chains are known to contain three hypervariable regions (CDRs), which vary depending on the antigens in question and determine binding ability, flanked by four framework regions (FRs), which are relatively conserved in a given species and which presumably provide the framework for CDR. When producing antibodies from a non-human species against a particular antigen, the variable domains can be "transformed" or "humanized" by grafting CDRs derived from antibodies from the non-human species onto FRs present in the human antibody to be modifications. The application of this approach to various antibodies has been described by Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851–856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323–327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534–1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformations", Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124–134; Gorman, S.D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in Vivo,” Bio/Technology 9:266–271; Co, M.S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co., M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen", J. Immunol. 148:1149–1154. In some embodiments, humanized antibodies retain all CDR sequences (eg, a humanized mouse antibody that contains all six CDRs from the mouse antibodies). In other embodiments of the present invention, humanized antibodies contain one or more CDRs (one, two, three, four, five, or six) that differ in sequence from the parent antibody.

В. Гуманизация антителB. Humanization of antibodies

[000118] В частности, настоящее изобретение охватывает связывающие молекулы (включая антитела и диатела), которые содержат домен VL и/или VH гуманизированного антитела. Термин «гуманизированное» антитело относится к химерной молекуле, обычно полученной с использованием рекомбинантных методик, содержащей эпитопсвязывающий сайт иммуноглобулина из вида, отличного от человека, и остальную иммуноглобулиновую структуру молекулы, которая основана на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Полинуклеотидная последовательность вариабельных доменов указанных антител может быть использована для генетической манипуляции, чтобы получить указанные производные и улучшить аффинность или другие характеристики указанных антител. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности эпитопсвязывающей части антитела с заменой оставшейся части антитела из вида, отличного от человека, последовательностями человеческих антител. Существуют четыре общих этапа гуманизации моноклонального антитела. Указанные этапы включают: (1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности исходных вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела или канинизированного антитела, т.е. принимается решение о том, какой каркасный участок антитела будет применяться в процессе гуманизации или канинизации, (3) современные методологии/методики гуманизации или канинизации, и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№4816567; 5807715; 5866692; и 6331415.[000118] In particular, the present invention covers binding molecules (including antibodies and diabodies) that contain the VL and/or VH domain of a humanized antibody. The term “humanized” antibody refers to a chimeric molecule, typically produced using recombinant techniques, containing an epitope-binding site for an immunoglobulin from a non-human species and the remaining immunoglobulin structure of the molecule that is based on the structure and/or sequence of a human immunoglobulin. The polynucleotide sequence of the variable domains of said antibodies can be used for genetic manipulation to obtain said derivatives and improve the affinity or other characteristics of said antibodies. The general principle of humanizing an antibody involves maintaining the core sequence of the epitope-binding portion of the antibody while replacing the remaining portion of the non-human antibody with human antibody sequences. There are four general steps in the humanization of a monoclonal antibody. These steps include: (1) determination of the nucleotide and predicted amino acid sequence of the original variable domains of the light and heavy chains of the antibody, (2) construction of a humanized antibody or caninized antibody, i.e. deciding which antibody framework will be used in the humanization or caninization process, (3) current methodologies/techniques for humanization or caninization, and (4) transfection and expression of the humanized antibody. See, for example, US Pat. Nos. 4,816,567; 5807715; 5866692; and 6331415.

[000119] Был описан ряд молекул гуманизированных антител, содержащих эпитопсвязывающий сайт, происходящий из иммуноглобулина из вида, отличного от человека, включая химерные антитела, содержащие вариабельный домен грызуна или модифицированный вариабельный домен грызуна, и связанные с ними гипервариабельные участки (CDR), гибридизованные с человеческими константными доменами (см. например, Winter et al. (1991) «Man-made Antibodies», Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) «Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Responses», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) «Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen», J. Immunol. 138:4534-4538, и Brown et al. (1987) «Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody», Cancer Res. 47:3577-3583). В других ссылках описаны CDR грызунов, привитые в поддерживающий каркасный участок человека (FR), перед гибридизацией с соответствующим константным доменом человека (см. например, Riechmann, L. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies for Therapy», Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity», Science 239:1534- 1536; и Jones et al. (1986) «Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse», Nature 321:522-525). В другой ссылке описаны CDR грызунов, поддерживаемые каркасными участками грызунов после рекомбинации поверхностных остатков. См., например, публикацию европейского патента №519596. Эти «гуманизированные» молекулы предназначены для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы антител грызунов к белкам человека, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтического применения указанных фрагментов у реципиентов-людей. Другие способы гуманизации антител, которые также можно применять, раскрыты Daugherty et al. (1991) «Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins», Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, и в патентах США №№6180377; 6054297; 5997867; и 5866692.[000119] A number of humanized antibody molecules containing an epitope-binding site derived from an immunoglobulin from a non-human species have been described, including chimeric antibodies containing a rodent variable domain or a modified rodent variable domain, and associated hypervariable regions (CDRs) hybridized with human constant domains (see, for example, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies", Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Responses ", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor- Associated Antigen,” J. Immunol. Other references describe rodent CDRs grafted into a human supporting framework region (FR), prior to hybridization with the corresponding human constant domain (see, for example, Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332: 323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity", Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature 321:522-525). Another reference describes rodent CDRs maintained by rodent scaffold regions following recombination of surface residues. See, for example, European Patent Publication No. 519596. These "humanized" molecules are designed to minimize the unwanted immunological response to rodent antibody molecules to human proteins, which limits the duration and effectiveness of therapeutic use of these fragments in human recipients. Other methods for humanizing antibodies that can also be used are disclosed by Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins", Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, and US Pat. Nos. 6,180,377; 6054297; 5997867; and 5866692.

[000120] Несмотря на такие успехи, получение стабильных, функциональных гетер од имерных немоноспецифических диател, оптимизированных для терапевтического применения, может быть дополнительно улучшено с помощью тщательного рассмотрения и размещения доменов, применяемых в полипептидных цепях. Соответственно, настоящее изобретение относится к обеспечению специфических полипептидов, которые специально разработаны для образования, за счет ковалентных связей, стабильных и терапевтически пригодных гетеродимерных диател и гетеродимерных Fc-диател, которые способны одновременно связывать CD137 и ТА.[000120] Despite such advances, the production of stable, functional heterodymeric non-monospecific diabodies optimized for therapeutic use can be further improved by careful consideration and placement of the domains used in the polypeptide chains. Accordingly, the present invention relates to the provision of specific polypeptides that are specifically designed to form, through covalent linkages, stable and therapeutically useful heterodimeric diabodies and heterodimeric Fc diabodies that are capable of simultaneously binding CD137 and TA.

С. Биспецифические антитела, полиспецифические диатела и диатела DART^® C. Bispecific antibodies, polyspecific diabodies and DART ^® diabodies

[000121] Как указано выше, природные антитела способны связываться только с одним типом эпитопов, хотя они могут связывать несколько копий этого типа. В данной области техники существует потребность в получении биспецифических антител, и был разработан широкий спектр форматов рекомбинантных биспецифических антител для получения таких биспецифических антител (см., например, РСТ публикации №№ WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565). В большинстве таких подходов применяют линкерные пептиды, чтобы гибридизовать дополнительный связывающий фрагмент (например, scFv, VL, VH и т.д.) с центральной частью антитела или в ее пределах (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) или гибридизовать несколько связывающих частей антител друг с другом (например, два фрагмента Fab или scFv). В других форматах применяют линкерные пептиды, чтобы гибридизовать связывающий белок (например, scFv, VL, VH и т.д.) с доменом димеризации, таким как домен СН2-СН3 или альтернативными полипептидами (WO 2005/070966, WO 2006/107786А, WO 2006/107617А, WO 2007/046893). Как правило, такие подходы включают компромиссные варианты и приемлемые варианты. Например, в РСТ публикациях WO 2013/174873, WO 2011/133886 и WO 2010/136172 раскрыто, что применение линкеров может вызвать проблемы в терапевтических условиях, и описано триспецифическое антитело, в котором домены CL и СН1 передвинуты с их соответствующих природных положений, и домены VL и VH были диверсифицированы (WO 2008/027236, WO 2010/108127), чтобы придать им способность связываться более чем с одним антигеном. Соответственно, в молекулах, раскрытых в указанных документах, специфичность связывания изменена в пользу способности связываться с дополнительными видами антигенов. В РСТ публикациях WO 2013/163427 и WO 2013/119903 раскрыта модификация домена СН2 для включения аддукта гибридного белка, содержащего связывающий домен. В документе отмечено, что домен СН2, вероятно, играет лишь минимальную роль в качестве посредника эффекторной функции. В РСТ публикациях WO 2010/028797, WO2010028796 и WO 2010/028795 раскрыты рекомбинантные антитела, области Fc которых были заменены дополнительными доменами VL и VH так, чтобы получить трехвалентные связывающие молекулы. В РСТ публикациях WO 2003/025018 и WO2003012069 раскрыты рекомбинантные диатела, отдельные цепи которых содержат домены scFv. В РСТ публикации WO 2013/006544 раскрыты поливалентные молекулы Fab, которые синтезируют как одну полипептидную цепь и затем подвергают протеолизу с получением гетеродимерных структур. Соответственно, в молекулах, раскрытых в указанных документах, все или некоторые функциональные возможности выступать посредниками эффекторной функции изменены в пользу способности связываться с дополнительными типами антигенов. В РСТ публикациях WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 и WO 1991/003493 раскрыты способы добавления дополнительных связывающих доменов или функциональных групп к антителу или части антитела (например, добавление диатела к легкой цепи антитела или добавление дополнительных доменов VL и VH к легким и тяжелым цепям антитела, или добавление гетерологичного гибридного белка, или связывание нескольких доменов Fab друг с другом). Соответственно, в молекулах, раскрытых в указанных документах, нативная структура антител изменена в пользу способности связываться с дополнительными типами антигенов.[000121] As stated above, natural antibodies are capable of binding to only one type of epitope, although they can bind multiple copies of that type. There is a need in the art for the production of bispecific antibodies, and a wide range of recombinant bispecific antibody formats have been developed for the production of such bispecific antibodies (see, for example, PCT Publication Nos. WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565). Most of these approaches use linker peptides to hybridize an additional binding moiety (e.g., scFv, VL, VH, etc.) to or within the central portion of the antibody (IgA, IgD, IgE, IgG, or IgM) or to hybridize multiple binders parts of antibodies with each other (for example, two Fab or scFv fragments). Other formats use linker peptides to hybridize a binding protein (eg scFv, VL, VH, etc.) to a dimerization domain such as a CH2-CH3 domain or alternative polypeptides (WO 2005/070966, WO 2006/107786A, WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Typically, such approaches include compromises and acceptable options. For example, PCT publications WO 2013/174873, WO 2011/133886 and WO 2010/136172 disclose that the use of linkers can cause problems in therapeutic settings, and describe a trispecific antibody in which the CL and CH1 domains are moved from their respective natural positions, and the VL and VH domains have been diversified (WO 2008/027236, WO 2010/108127) to give them the ability to bind to more than one antigen. Accordingly, in the molecules disclosed in these documents, the binding specificity is changed in favor of the ability to bind to additional types of antigens. PCT publications WO 2013/163427 and WO 2013/119903 disclose modification of the CH2 domain to include a fusion protein adduct containing a binding domain. The paper noted that the CH2 domain likely plays only a minimal role as a mediator of effector function. PCT publications WO 2010/028797, WO2010028796 and WO 2010/028795 disclose recombinant antibodies whose Fc regions have been replaced by additional VL and VH domains so as to produce trivalent binding molecules. PCT publications WO2003/025018 and WO2003012069 disclose recombinant diabodies whose individual chains contain scFv domains. PCT publication WO 2013/006544 discloses multivalent Fab molecules that are synthesized as a single polypeptide chain and then proteolyzed to produce heterodimeric structures. Accordingly, in the molecules disclosed in these documents, some or all of the functionality to mediate effector function is altered in favor of the ability to bind additional types of antigens. In PCT publications WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/0752 70, WO 1998/002463, WO 1992 /022583 and WO 1991/003493 disclose methods for adding additional binding domains or functional groups to an antibody or part of an antibody (for example, adding a diabody to the light chain of an antibody, or adding additional VL and VH domains to the light and heavy chains of an antibody, or adding a heterologous fusion protein, or linking multiple Fab domains to each other). Accordingly, in the molecules disclosed in these documents, the native structure of antibodies is modified to favor the ability to bind to additional types of antigens.

[000122] В данной области техники также упомянута возможность получения диател, которые отличаются от указанных природных антител своей способностью связывать два или более различных типов эпитопов (т.е. проявляющих биспецифичность или полиспецифичность в дополнение к двухвалентности или поливалентности) (см., например, Holliger et al. (1993) «'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) «A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity», J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) «Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications», Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) «Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange», Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) «A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain», Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) «Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System», Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) «Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy», Cancer Res. 69(12):4941-4944).[000122] Also mentioned in the art is the possibility of producing diabodies that differ from these natural antibodies in their ability to bind two or more different types of epitopes (i.e., exhibiting bispecificity or polyspecificity in addition to bivalency or polyvalency) (see, for example, Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004 /0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T et al (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications", Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange”, Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain", Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy", Cancer Res. 69(12):4941–4944).

[000123] Обеспечение немоноспецифических «диател» представляет значительное преимущество по сравнению с антителами: способность колигировать и колокализовать клетки, которые экспрессируют различные эпитопы. Таким образом, биспецифические диатела имеют широкое применение, включая терапию и иммунодиагностику. Биспецифичность обеспечивает большую гибкость в разработке и модификации диател для различных вариантов применения, обеспечивая повышенную авидность в отношении мультимерных антигенов, сшивание различных антигенов и направленное нацеливание на конкретные типы клеток, которое основано на присутствии обоих антигенов-мишеней. Благодаря своей двухвалентности, низким скоростям диссоциации и быстрому клиренсу из системы кровообращения (для диател небольшого размера около или ниже -50 кДа) молекулы диател, известные в данной области техники, также нашли особое применение в области визуализации опухолей (Fitzgerald et al. (1997) «Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris», Protein Eng. 10:1221). Особое значение имеет колигирование различных клеток, например, сшивание цитотоксических Т-клеток с опухолевыми клетками (Staerz et al. (1985) «Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells», Nature 314:628-631, и Holliger et al. (1996) «Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody», Protein Eng. 9:299-305), чтобы колокализовать Т-клетки в очагах опухолевых клеток.[000123] The provision of non-monospecific “diabodies” offers a significant advantage over antibodies: the ability to coligate and colocalize cells that express different epitopes. Thus, bispecific diabodies have a wide range of applications, including therapy and immunodiagnosis. Bispecificity provides greater flexibility in developing and modifying diabodies for different applications, providing increased avidity for multimeric antigens, cross-linking of different antigens, and targeted targeting of specific cell types that is based on the presence of both target antigens. Due to their divalency, low dissociation rates, and rapid clearance from the circulatory system (for small diabodies at or below -50 kDa), diabody molecules known in the art have also found particular application in the field of tumor imaging (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumor Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221). Of particular importance is the coligation of different cells, for example, the cross-linking of cytotoxic T cells with tumor cells (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells", Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299–305) to colocalize T cells within tumor cell foci.

[000124] В качестве альтернативы нацеливанию таких диател на связывание с Т-клетками эпитопсвязывающие домены диатела могут быть направлены к поверхностной детерминанте В-клетки, такой как CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 и CD74 (Moore, P.A. et al. (2011) «Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphomas», Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) «Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkiris Lymphomas», N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) «Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignanciess», Exp. Hematol. 36(7):755-768). Во многих исследованиях также было обнаружено, что связывание диатела с детерминантами эффекторных клеток, например, с рецепторами Fcγ (FcγR), активирует эффекторные клетки (Holliger et al. (1996) «Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispeciftc Diabody», Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) «Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Speciftc T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispeciftc Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispeciftc Fusion Proteins», Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Обычно активация эффекторных клеток запускается в результате связывания антигенсвязанного антитела с эффекторной клеткой за счет взаимодействия домен Fc-FcγR; соответственно, в этом отношении молекулы диатела могут проявлять Ig-подобную функциональность, независимо от того, содержат ли они домен Fc (например, как определено в любом анализе эффекторной функции, известном в данной области техники или приведенном в настоящем документе в качестве примера (например, анализ АЗКЦ)). За счет перекрестного связывания опухолевых и эффекторных клеток диатело не только сближает эффекторную клетку с опухолевой клеткой, но и приводит к эффективному уничтожению опухоли (см., например, Cao et al. (2003) «Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics», Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).[000124] As an alternative to targeting such diabodies for binding to T cells, the epitope-binding domains of the diabody can be directed to B cell surface determinants such as CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 and CD74 (Moore, P. A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimally Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphomas", Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) "Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell" Cell Non-Hodgkinis Lymphomas", N. Engl. J. Med. 359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) "Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies", Exp. Hematol. 36(7 ):755-768). Many studies have also found that binding of the diabody to effector cell determinants, such as Fcγ receptors (FcγR), activates effector cells (Holliger et al. (1996) Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispeciftc Diabody ", Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Speciftc T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispeciftc Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispeciftc Fusion Proteins", Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Typically, activation of effector cells is triggered by binding of an antigen-bound antibody to the effector cell through Fc-FcγR domain interactions; accordingly, in this regard, diabody molecules may exhibit Ig-like functionality regardless of whether they contain an Fc domain (e.g., as determined by any effector function assay known in the art or exemplified herein (e.g. ADCC analysis)). By cross-linking tumor and effector cells, the diabody not only brings the effector cell closer to the tumor cell, but also leads to effective tumor destruction (see, for example, Cao et al. (2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv Rev 55:171-197).

[000125] Однако вышеупомянутые преимущества сопряжены со значительными затратами. Для образования указанных немоноспецифических диател необходима успешная сборка двух или более отдельных и различных полипептидов (т.е. такой процесс образования требует, чтобы диатела были образованы за счет гетеродимеризации различных типов полипептидных цепей). Этот факт отличается от ситуации с моноспецифическими диателами, которые образуются за счет гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку по меньшей мере два различных полипептида (т.е. две полипептидные молекулы) должны быть обеспечены для образования немоноспецифического диатела и поскольку гомодимеризация таких полипептидов приводит к получению неактивных молекул (Takemura, S. et al. (2000) «Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System», Protein Eng. 13(8):583-588), получение указанных полипептидов должно быть выполнено так, чтобы предотвратить ковалентное связывание между полипептидами одного и того же типа (т.е., чтобы свести к минимуму их гомодимеризацию) (Takemura, S. et al. (2000) «Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System», Protein Eng. 13(8):583-588). В этой связи в данной области техники было предложена нековалентная связь таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) «Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications», Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) «A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domains», Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) «Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System», Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) «A Fully Human Recombinant IgG - Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity», J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).[000125] However, the above benefits come at a significant cost. The formation of these non-monospecific diabodies requires the successful assembly of two or more separate and distinct polypeptides (ie, such a formation process requires that the diabodies be formed by heterodimerization of different types of polypeptide chains). This fact differs from the situation with monospecific diabodies, which are formed due to homodimerization of identical polypeptide chains. Because at least two different polypeptides (i.e., two polypeptide molecules) must be provided to form a non-monospecific diabody and because homodimerization of such polypeptides results in inactive molecules (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody ( Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), the production of said polypeptides must be done in such a way as to prevent covalent binding between polypeptides of the same type (i.e., minimize their homodimerization) (Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588). In this regard, non-covalent linkage of such polypeptides has been proposed in the art (see, for example, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications", Prot. Engr Des Sel 17:21-27 Asano et al (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domains", Abstract 3P-683, J Biochem 76(8) :992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. ( 2005) "A Fully Human Recombinant IgG - Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

[000126] Однако в данной области техники установлено, что биспецифические диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются нестабильными и легко диссоциируют на нефункциональные мономеры с одной полипептидной цепью (см., например, Lu, D. et al. (2005) «A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity», J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).[000126] However, it is recognized in the art that bispecific diabodies composed of non-covalently linked polypeptides are unstable and readily dissociate into non-functional monomers with a single polypeptide chain (see, for example, Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).

[000127] В свете этой проблемы в данной области техники удалось разработать стабильные, ковалентно связанные гетеродимерные немоноспецифические диатела, названные диатела DART^®, см., например, Chichili, G.R. et al. (2015) «А CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates», Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) «Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion», J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) «Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold», Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) «Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma», Blood 117(17):4542-4551; патенты США Ms 8044180; 8133982; 8187593; 8193318; 8530627; 8669349; 8778339; 8784808; 8795667; 8802091; 8802093; 8946387; 8968730; и 8993730; публикации патентов США №№2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/0034221; 2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; и 2014/0099318; публикации европейских патентов ЕР 1868650; ЕР 2158221; ЕР 2247304; ЕР 2252631; ЕР 2282770; ЕР 2328934; ЕР 2376109; ЕР 2542256; ЕР 2601216; ЕР 2714079; ЕР 2714733; ЕР 2786762; ЕР 2839842; ЕР 2840091; и РСТ публикации №№ WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; и WO 2015/026894). Такие диатела содержат два или более ковалентно связанных полипептидов и включают конструирование одного или более остатков цистеина в каждой из применяемых полипептидных молекул. Например, было показано, что добавление остатка цистеина к С-концу указанных конструкций обеспечивает образование дисульфидной связи между полипептидными цепями, стабилизируя полученный гетеродимер без отрицательного влияния на характеристики связывания двухвалентной молекулы.[000127] In light of this problem, the art has been able to develop stable, covalently linked heterodimeric non-monospecific diabodies, termed ^DART® diabodies, see, for example, Chichili, GR et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates", Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion", J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Moore, P. A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimally Redirected T Cell Killing Of B-Cell Lymphoma”, Blood 117(17):4542-4551; US Patents Ms 8044180; 8133982; 8187593; 8193318; 8530627; 8669349; 8778339; 8784808; 8795667; 8802091; 8802093; 8946387; 8968730; and 8993730; US Patent Publications No. 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/0034221; 2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; and 2014/0099318; European patent publications EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; and PCT Publication No. WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; and WO 2015/026894). Such diabodies contain two or more covalently linked polypeptides and involve the construction of one or more cysteine residues in each of the polypeptide molecules used. For example, the addition of a cysteine residue to the C-terminus of these constructs has been shown to form a disulfide bond between the polypeptide chains, stabilizing the resulting heterodimer without negatively affecting the binding characteristics of the divalent molecule.

[000128] Простейшее диатело DART^® содержит две полипептидные цепи, каждая из которых содержит три домена (Фигура 1). Первая полипептидная цепь содержит: (i) первый домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), (ii) второй домен, который содержит связывающую область из вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), и (iii) третий домен, который способствует гетеродимеризации (домен, способствующий образованию гетеродимера) со второй полипептидной цепью диатела и образованию ковалентной связи первой полипептидной цепи со второй полипептидной цепью диатела. Вторая полипептидная цепь содержит комплементарный первый домен (домен VL2), комплементарный второй домен (домен VH1) и третий домен, который объединяется с третьим доменом первой полипептидной цепи, чтобы способствовать гетеродимеризации (домен, способствующий образованию гетеродимера) и образованию ковалентной связи с первой полипептидной цепью. Такие молекулы являются стабильными, эффективными и обладают способностью одновременно связываться с двумя или более антигенами. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения каждый из третьих доменов первой и второй полипептидных цепей содержит остаток цистеина («©»), который служит для связывания полипептидов вместе за счет дисульфидной связи. Третий домен одной или обеих полипептидных цепей может дополнительно содержать последовательность домена СН2-СН3 так, что соединение двух полипептидов диатела образует область Fc, которая способна связываться с рецептором Fc клеток (таких как В-лимфоциты, дендритные клетки, природные клетки-киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и тучные клетки). Было описано много вариантов таких молекул (см., например, публикации патентов США №№2013-0295121; 2010-0174053; 2007-0004909; 2009-0060910; публикации европейских патентов №№ЕР 2714079; ЕР 2601216; ЕР 2376109; ЕР 2158221 и РСТ публикации №№WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) и обеспечено в настоящем документе.[000128] The simplest diabody DART ^® contains two polypeptide chains, each of which contains three domains (Figure 1). The first polypeptide chain comprises: (i) a first domain that contains a binding region from a first immunoglobulin light chain variable domain (VL1), (ii) a second domain that contains a binding region from a second immunoglobulin heavy chain variable domain (VH2), and (iii ) a third domain that promotes heterodimerization (a domain that promotes the formation of a heterodimer) with the second polypeptide chain of the diabody and the formation of a covalent bond of the first polypeptide chain with the second polypeptide chain of the diabody. The second polypeptide chain contains a complementary first domain (VL2 domain), a complementary second domain (VH1 domain), and a third domain that combines with the third domain of the first polypeptide chain to promote heterodimerization (domain that promotes heterodimer formation) and formation of a covalent bond with the first polypeptide chain . Such molecules are stable, effective and have the ability to simultaneously bind to two or more antigens. According to one embodiment of the present invention, each of the third domains of the first and second polypeptide chains contains a cysteine residue ("©") that serves to link the polypeptides together via a disulfide bond. The third domain of one or both polypeptide chains may further comprise a CH2-CH3 domain sequence such that the joining of two polypeptides of the diabody forms an Fc region that is capable of binding to the Fc receptor of cells (such as B lymphocytes, dendritic cells, natural killer cells, macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils and mast cells). Many options for such molecules were described (see, for example, the publication of US patents No. 2013-0295121; 2010-0174053; 2007-0004909; 2009-0060910; publications of European patents 2714079; EP 2601216; EP 2158221 and PCT Publication No. WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665) and provided herein.

II. Компоненты предпочтительных CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретениюII. Components of Preferred CD137×TA Binding Molecules of the Present Invention

[000129] CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению состоят из полипептидов и могут состоять из двух, трех, четырех или более четырех полипептидных цепей. В настоящем документе термин «состоять из» является неограничивающим, таким образом, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, которые состоят из двух полипептидных цепей, могут иметь дополнительные полипептидные цепи. Такие цепи могут иметь ту же последовательность, что и другая полипептидная цепь связывающей молекулы, или их последовательность может отличаться от любой другой полипептидной цепи связывающей молекулы. [000129] The CD137xTA binding molecules of the present invention are composed of polypeptides and may consist of two, three, four or more than four polypeptide chains. As used herein, the term “consist of” is non-limiting, such that CD137×TA binding molecules of the present invention that are composed of two polypeptide chains may have additional polypeptide chains. Such chains may have the same sequence as another polypeptide chain of the binding molecule, or their sequence may differ from any other polypeptide chain of the binding molecule.

А. Предпочтительные «линкерные» пептидыA. Preferred “Linker” Peptides

[000130] Полипептиды CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению содержат домены, которым предшествуют, после которых следуют и/или соединяют их друг с другом «линкерные» пептиды, такие как линкер 1, линкер 2, линкер 3 и т.д. Несмотря на то, что в настоящем изобретении применяются определенные предпочтительные «линкерные» пептиды, в соответствии с представленными в настоящем документе идеями, альтернативные линкеры могут быть легко выявлены и применены для получения CD137×TA связывающих молекул.[000130] The CD137xTA binding molecule polypeptides of the present invention comprise domains that are preceded, followed and/or connected to each other by “linker” peptides, such as linker 1, linker 2, linker 3, etc. Although the present invention employs certain preferred "linker" peptides, in accordance with the teachings presented herein, alternative linkers can be readily identified and used to produce CD137xTA binding molecules.

[000131] Наиболее предпочтительно длина линкера 1, который разделяет такие домены VL и VH полипептидной цепи, выбрана, чтобы по существу или полностью предотвращать связывание таких доменов VL и VH друг с другом (например, 12 или менее остатков аминокислот в длину). Таким образом, домены VL1 и VH2 первой полипептидной цепи по существу или полностью не способны связываться друг с другом и не образуют эпитопсвязывающий сайт, который способен по существу связываться либо с первым, либо со вторым антигеном. Аналогичным образом, домены VL2 и VH1 второй полипептидной цепи по существу или полностью неспособны связываться друг с другом и не образуют эпитопсвязывающий сайт, который способен по существу связываться либо с первым, либо со вторым антигеном. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) имеет последовательность (SEQ ID NO: 16): которая является слишком короткой, чтоб обеспечить образование комплекса между доменами VL и VH одной и той же полипептидной цепи, в отличие от более длинного промежуточного спейсерного пептида, который применяется для получения молекул scFv (например, (SEQ ID NO: 17)).[000131] Most preferably, the length of linker 1 that separates such VL and VH domains of a polypeptide chain is selected to substantially or completely prevent such VL and VH domains from binding to each other (eg, 12 or less amino acid residues in length). Thus, the VL1 and VH2 domains of the first polypeptide chain are substantially or completely incapable of binding to each other and do not form an epitope-binding site that is substantially capable of binding to either the first or second antigen. Likewise, the VL2 and VH1 domains of the second polypeptide chain are substantially or completely unable to bind to each other and do not form an epitope-binding site that is substantially capable of binding to either the first or second antigen. A preferred intermediate spacer peptide (linker 1) has the sequence (SEQ ID NO: 16): which is too short to allow complex formation between the VL and VH domains of the same polypeptide chain, as opposed to the longer spacer peptide intermediate that is used to produce scFv molecules (e.g. (SEQ ID NO: 17)).

[000132] Линкер 2 предназначен для отделения домена VH полипептидной цепи от необязательно присутствующего домена, способствующего образованию гетеродимера, этой полипептидной цепи. Любой из различных линкеров можно применять в качестве линкера 2. Предпочтительная последовательность для такого линкера 2 имеет аминокислотную последовательность: (SEQ ID NO: 18), которая имеет остаток цистеина, который можно применять для ковалентной связи первой и второй полипептидных цепей друг с другом за счет дисульфидной связи, или (SEQ ID NO: 19), которая происходит из домена CH1 IgG. Поскольку линкер 2, (SEQ ID NO: 19), не имеет такого цистеина, применение такого линкера 2 предпочтительно связано с применением цистеинсодержащего домена, способствующего образованию гетеродимера, такого как Е-спираль, имеющая последовательность SEQ ID NO: 38, или K-спираль, имеющая последовательность SEQ ID NO: 39 (см. ниже).[000132] Linker 2 is designed to separate the VH domain of a polypeptide chain from an optional heterodimer-promoting domain of the polypeptide chain. Any of various linkers can be used as linker 2. The preferred sequence for such linker 2 has the amino acid sequence: (SEQ ID NO: 18) which has a cysteine residue that can be used to covalently link the first and second polypeptide chains to each other through a disulfide bond, or (SEQ ID NO: 19), which is derived from the CH1 domain of IgG. Since linker 2, (SEQ ID NO: 19) does not have such a cysteine, the use of such linker 2 preferably involves the use of a cysteine-containing heterodimer-forming domain, such as an E-helix having the sequence SEQ ID NO: 38 or a K-helix having the sequence SEQ ID NO: 39 (see below).

[000133] Одна из функций линкера 3 заключается в отделении домена, способствующего образованию гетеродимера, полипептидной цепи от домена Fc этой полипептидной цепи. Вторая функция заключается в создании цистеинсодержащего полипептидного домена. Любой из различных линкеров можно применять в качестве линкера 3. Предпочтительная последовательность для такого линкера 3 имеет аминокислотную последовательность: (SEQ ID NO: 20). Другая предпочтительная последовательность для линкера 3 имеет аминокислотную последовательность:(SEQ ID NO: 21).[000133] One of the functions of linker 3 is to separate the heterodimer formation domain of a polypeptide chain from the Fc domain of the polypeptide chain. The second function is to create a cysteine-containing polypeptide domain. Any of various linkers can be used as linker 3. The preferred sequence for such linker 3 has the amino acid sequence: (SEQ ID NO: 20). Another preferred sequence for linker 3 has the amino acid sequence: (SEQ ID NO: 21).

[000134] Функция линкера 4 заключается в отделении С-конца доменов СН2-СН3 области Fc («домен Fc») от N-конца домена VL. Любой из различных линкеров можно применять в качестве линкера 4. Предпочтительная последовательность для такого линкера 4 имеет аминокислотную последовательность:(SEQ ID NO: 22) или аминокислотную последовательность(SEQ ID NO: 23) или аминокислотную последовательность(SEQ ID NO: 24).[000134] The function of linker 4 is to separate the C-terminus of the CH2-CH3 domains of the Fc region ("Fc domain") from the N-terminus of the VL domain. Any of various linkers can be used as linker 4. The preferred sequence for such linker 4 has the amino acid sequence: (SEQ ID NO: 22) or amino acid sequence (SEQ ID NO: 23) or amino acid sequence (SEQ ID NO: 24).

[000135] Молекулы, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению могут включать дополнительные промежуточные спейсерные пептиды (линкеры), обычно такие линкеры будут включены между доменом, способствующим образованию гетеродимера (например, с Е-спиралью или K-спиралью), и доменом СН2-СН3 и/или между доменом СН2-СН3 и вариабельным доменом (т.е. VH или VL). Как правило, дополнительные линкеры будут содержать 3-20 остатков аминокислот и могут необязательно содержать полную шарнирную область IgG (предпочтительно цистеинсодержащую часть шарнирной области IgG) или ее часть. Линкеры, которые можно применять в молекулах биспецифических диател, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению, включают: (SEQ ID NO: 19), (SEQ ID NO: 20), (SEQ ID NO: 22), (SEQ ID NO: 23), (SEQ ID NO: 24), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 26), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 28), (SEQ ID NO: 29).(SEQ ID NO: 27) можно применять вместо или для простоты клонирования. Помимо этого непосредственно после аминокислот или (SEQ ID NO: 27) может быть расположена (SEQ ID NO: 20) с образованием альтернативных линкеров: (SEQ ID NO: 21); и (SEQ ID NO: 30). Биспецифические молекулы, содержащие область Fc, согласно настоящему изобретению могут включать шарнирную область IgG, такую как шарнирная область IgG человеческого антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее часть.[000135] The Fc region-containing molecules of the present invention may include additional intermediate spacer peptides (linkers), typically such linkers will be included between the heterodimer formation domain (eg, E-helix or K-helix) and the CH2- domain. CH3 and/or between the CH2-CH3 domain and the variable domain (ie VH or VL). Typically, additional linkers will contain 3-20 amino acid residues and may optionally contain the entire IgG hinge region (preferably the cysteine-containing portion of the IgG hinge region) or a portion thereof. Linkers that can be used in the Fc region-containing bispecific diabody molecules of the present invention include: (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20), (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 28) (SEQ ID NO: 29). (SEQ ID NO: 27) can be used instead or for ease of cloning. In addition, directly after the amino acids or (SEQ ID NO: 27) can be located (SEQ ID NO: 20) with the formation of alternative linkers: (SEQ ID NO: 21); And (SEQ ID NO: 30). The bispecific Fc region-containing molecules of the present invention may include an IgG hinge region, such as the IgG hinge region of a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 antibody, or a portion thereof.

В. Предпочтительные домены, способствующие образованию гетеродимераB. Preferred domains promoting heterodimer formation

[000136] Как указано выше, образование CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению включает сборку двух или более различных полипептидных цепей (т.е. гетеродимеризацию). Образование гетеродимеров первой и второй полипептидных цепей может быть обусловлено включением «доменов, способствующих образованию гетеродимера». Домены, способствующие образованию гетеродимера, могут представлять собой домен шарнирной области IgG (или полипептид, происходящий из шарнирной области, такой как, например, (SEQ ID NO: 31), (SEQ ID NO: 32) или(SEQ ID NO: 33) на одной полипептидной цепи и домен CL (или полипептид, происходящий из домена CL, такой как, например, (SEQ ID NO: 34) или (SEQ ID NO: 35) на другой полипептидной цепи (US 2007/0004909).[000136] As stated above, the formation of CD137xTA binding molecules according to the present invention involves the assembly of two or more different polypeptide chains (ie, heterodimerization). The formation of heterodimers of the first and second polypeptide chains may be due to the inclusion of “heterodimer-promoting domains.” Domains that promote heterodimer formation may be an IgG hinge domain (or a hinge region-derived polypeptide such as e.g. (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) or (SEQ ID NO: 33) on the same polypeptide chain and a CL domain (or a polypeptide derived from a CL domain, such as e.g. (SEQ ID NO: 34) or (SEQ ID NO: 35) on a different polypeptide chain (US 2007/0004909).

[000137] Однако более предпочтительно домены, способствующие образованию гетеродимера, согласно настоящему изобретению будут содержать тандемно повторяющиеся спиральные домены противоположного заряда, например, спиральные домены «Е-спираль» (SEQ ID NO: 36: остатки глутамата в которых будут образовывать отрицательный заряд при рН=7, тогда как другой из доменов, способствующих образованию гетеродимера, будет содержать четыре тандемных домена «K-спираль» (SEQ ID NO: 37: ), остатки лизина в которых будут образовывать положительный заряд при рН=7. Присутствие таких заряженных доменов способствует объединению первого и второго полипептидов и, соответственно, способствует гетеродимеризации. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения применяется домен, способствующий образованию гетеродимера, в котором один из четырех тандемных спиральных доменов «Е-спираль», имеющий последовательность SEQ ID NO: 36, был модифицирован для включения остатка цистеина: (SEQ ID NO: 38). Аналогичным образом, согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения применяется домен, способствующий образованию гетеродимера, в котором один из четырех спиральных доменов «K-спираль», имеющий последовательность SEQ ID NO: 37, был модифицирован для включения остатка цистеина: (SEQ ID NO: 39).[000137] More preferably, however, the heterodimer-forming domains of the present invention will comprise tandemly repeating helical domains of opposite charge, for example, "E-helix" helical domains (SEQ ID NO: 36: the glutamate residues in which will form a negative charge at pH=7, while the other of the domains promoting heterodimer formation will contain four tandem “K-helix” domains (SEQ ID NO: 37: ), lysine residues in which will form a positive charge at pH=7. The presence of such charged domains promotes the association of the first and second polypeptides and, accordingly, promotes heterodimerization. Another preferred embodiment of the present invention employs a heterodimer-forming domain in which one of the four tandem helical "E-helix" domains having the sequence SEQ ID NO: 36 has been modified to include a cysteine residue: (SEQ ID NO: 38). Likewise, another preferred embodiment of the present invention employs a heterodimer-forming domain in which one of the four "K-helix" helical domains having the sequence SEQ ID NO: 37 has been modified to include a cysteine residue: (SEQ ID NO: 39).

C. Ковалентное связывание полипептидных цепейC. Covalent binding of polypeptide chains

[000138] CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению модифицированы так, что пары их полипептидных цепей ковалентно связываются друг с другом за счет одного или более остатков цистеина, расположенных по всей длине, с получением ковалентно связанного молекулярного комплекса. Такие остатки цистеина могут быть введены в промежуточный линкер, который отделяет домены VL и VH полипептидов. Согласно другому варианту линкер 2 или линкер 3, или альтернативный линкер, могут содержать остаток цистеина. Наиболее предпочтительно один или более спиральных доменов из содержащего спираль домена, способствующего образованию гетеродимера, будут содержать замену аминокислоты, которая включает остаток цистеина, как в SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 39.[000138] The CD137×TA binding molecules of the present invention are modified such that pairs of their polypeptide chains are covalently linked to each other by one or more cysteine residues located along their entire length, resulting in a covalently linked molecular complex. Such cysteine residues can be introduced into an intermediate linker that separates the VL and VH domains of the polypeptides. In another embodiment, linker 2 or linker 3, or an alternative linker, may contain a cysteine residue. Most preferably, one or more helical domains of the helix-containing heterodimer-forming domain will contain an amino acid substitution that includes a cysteine residue, as in SEQ ID NO: 38 or SEQ ID NO: 39.

D. Предпочтительные домены FcD. Preferred Fc Domains

[000139] Домен Fc из Fc-несущей CD137×TA связывающей молекулы согласно настоящему изобретению может содержать полную область Fc (например, полную область Fc IgG) или только фрагмент полной области Fc. Таким образом, домен Fc из Fc-несущих CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению может содержать часть или весь домен СН2 и/или часть или весь домен СН3 полной области Fc или может содержать вариант последовательности СН2 и/или вариант последовательности СН3 (который может содержать, например, одну или более вставок и/или одну или более делеций по отношению к доменам СН2 или СН3 полной области Fc). Домен Fc биспецифических Fc-несущих диател согласно настоящему изобретению может содержать участки полипептида, отличные от области Fc, или может содержать части областей Fc, которые в природных условиях не являются полными, или может содержать неприродные ориентации доменов СН2 и/или СН3 (такие как, например, два домена СН2 или два домена СН3, или, в направлении от N-конца к С-концу, домен СН3, соединенный с доменом СН2, и т.д.).[000139] The Fc domain of an Fc-bearing CD137xTA binding molecule of the present invention may comprise a complete Fc region (eg, a complete IgG Fc region) or only a portion of a complete Fc region. Thus, the Fc domain of the Fc-bearing CD137xTA binding molecules of the present invention may contain part or all of the CH2 domain and/or part or all of the CH3 domain of the complete Fc region, or may contain a CH2 sequence variant and/or a CH3 sequence variant (which may contain, for example, one or more insertions and/or one or more deletions with respect to the CH2 or CH3 domains of the entire Fc region). The Fc domain of the bispecific Fc-carrying diabodies of the present invention may contain regions of the polypeptide other than the Fc region, or may contain portions of Fc regions that are not naturally complete, or may contain unnatural orientations of CH2 and/or CH3 domains (such as for example, two CH2 domains or two CH3 domains, or, in the N-terminal to C-terminal direction, a CH3 domain connected to a CH2 domain, etc.).

[000140] Несмотря на то, что домен Fc из Fc-несущей CD137×TA связывающей молекулы согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность природного домена Fc, предпочтительно домены СН2-СН3, которые образуют такой домен Fc, содержат одну или более замен так, чтобы полученный домен Fc обладал уменьшенным (например, менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 20% или менее чем 10% связывания, проявляемого такой молекулой, содержащей домен Fc с аминокислотной последовательностью природной области Fc) или по существу не детектируемым связыванием с FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) или FcγRIIIB (CD16b) (по сравнению со связыванием, проявляемым областью Fc дикого типа). Варианты Fc и мутантные формы, способные опосредовать такое измененное связывание, хорошо известны в данной области техники и включают замены аминокислот в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из: 234, 235, 265 и 297, при этом указанная нумерация соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat (см., например, патент США №5624821, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домен СН2-СН3 первой и/или третьей полипептидных цепей Fc-несущих молекул согласно настоящему изобретению включает любые 1, 2, 3 или 4 из замен: L234A, L235A, D265A, N297Q и N297G. Согласно другому варианту применяется домен СН2-СН3 природной области Fc, который исходно проявляет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcγRIIIA (CD16а) и/или сниженную эффекторную функцию (по отношению к связыванию и эффекторной функции, проявляемой областью Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 12)). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения Fc-несущие молекулы согласно настоящему изобретению содержат область Fc IgG2 (SEQ ID NO: 13) или область Fc IgG4 (SEQ ID NO: 15). При применении области Fc IgG4 настоящее изобретение также охватывает введение стабилизирующей мутации, такой как замена S228P в шарнирной области, описанной выше (см., например, SEQ ID NO: 11).[000140] Although the Fc domain of the Fc-bearing CD137×TA binding molecule of the present invention may contain the amino acid sequence of a natural Fc domain, preferably the CH2-CH3 domains that form such an Fc domain contain one or more substitutions such that the resulting Fc domain had reduced (e.g., less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 20%, or less than 10% of the binding exhibited by such an Fc domain-containing molecule with the amino acid sequence of a native Fc region) or essentially undetectable binding to FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) or FcγRIIIB (CD16b) (compared to the binding exhibited by the wild-type Fc region). Fc variants and mutant forms capable of mediating such altered binding are well known in the art and include amino acid substitutions at one or more positions selected from the group consisting of: 234, 235, 265 and 297, wherein numbering corresponds to numbering c using the EU index as set forth in Kabat (see, for example, US Pat. No. 5,624,821, incorporated herein by reference). In one embodiment of the present invention, the CH2-CH3 domain of the first and/or third polypeptide chains of the Fc-carrying molecules of the present invention includes any 1, 2, 3, or 4 of the substitutions L234A, L235A, D265A, N297Q, and N297G. Another embodiment utilizes a CH2-CH3 domain of a native Fc region that initially exhibits reduced (or substantially absent) binding to FcγRIIIA (CD16a) and/or reduced effector function (relative to the binding and effector function exhibited by the wild-type IgG1 Fc region ( SEQ ID NO: 12)). In a specific embodiment of the present invention, the Fc-carrying molecules of the present invention comprise an IgG2 Fc region (SEQ ID NO: 13) or an IgG4 Fc region (SEQ ID NO: 15). When using the IgG4 Fc region, the present invention also covers the introduction of a stabilizing mutation, such as the S228P substitution in the hinge region described above (see, for example, SEQ ID NO: 11).

[000141] Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения применяемый домен СН2-СН3 Fc-несущих CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению включает замену аланином в положении 234 и замену аланином в положении 235, при этом указанная нумерация соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как и изложено Kabat (SEQ ID NO: 40):[000141] In a preferred embodiment of the present invention, the applicable CH2-CH3 domain of the Fc-carrying CD137×TA binding molecules of the present invention comprises an alanine substitution at position 234 and an alanine substitution at position 235, wherein said numbering corresponds to the numbering using the EC suffix as and stated by Kabat (SEQ ID NO: 40):

где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.where X is lysine (K) or absent.

[000142] Период полужизни в сыворотке белков, содержащих области Fc, может быть увеличен за счет увеличения аффинности связывания области Fc с FcRn. В настоящем документе термин «период полужизни» означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое является мерой среднего времени существования молекул после их введения. Период полужизни может быть выражен как время, необходимое для удаления пятидесяти процентов (50%) известного количества молекулы из тела субъекта (например, пациента-человека или другого млекопитающего) или его конкретного компартмента, например, при измерении в сыворотке крови, т.е. период полужизни в кровотоке, или в других тканях. Обычно увеличение периода полужизни приводит к увеличению среднего времени удержания (МРТ) в кровотоке для введенной молекулы.[000142] The serum half-life of proteins containing Fc regions can be increased by increasing the binding affinity of the Fc region to FcRn. As used herein, the term "half-life" refers to the pharmacokinetic property of a molecule, which is a measure of the average time the molecules exist after administration. Half-life can be expressed as the time required to remove fifty percent (50%) of a known amount of a molecule from the body of a subject (eg, a human patient or other mammal) or a specific compartment thereof, for example, when measured in blood serum, i.e. half-life in the bloodstream or other tissues. Typically, an increase in half-life results in an increase in the mean retention time (MRT) in the bloodstream for the administered molecule.

[000143] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Fc- несущие CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно области Fc дикого типа так, что указанная молекула имеет увеличенный период полужизни (по сравнению с молекулой, содержащей область Fc дикого типа). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения Fc-несущие CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат вариант области Fc IgG, причем указанный вариант области Fc содержит замену аминокислоты, увеличивающую период полужизни. В данной области техники известны многочисленные замены аминокислот, способные увеличивать период полужизни Fc-несущей молекулы, см., например, замены аминокислот, описанные в патентах США №№6277375, 7083784; 7217797, 8088376; публикациях США №№2002/0147311; 2007/0148164; и РСТ публикациях №№WO 98/23289; WO 2009/058492; и WO 2010/033279, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Fc-несущая CD137×TA связывающая молекула, имеющая увеличенный период полужизни, может содержать две или более замен, выбранных из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, Н435К и Y436I, при этом указанная нумерация соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat.[000143] In some embodiments of the present invention, the Fc-bearing CD137xTA binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region, wherein the variant Fc region contains at least one amino acid modification relative to the wild-type Fc region such that the molecule has an increased period half-life (compared to a molecule containing the wild-type Fc region). In some embodiments, the Fc-carrying CD137xTA binding molecules of the present invention comprise a variant Fc region of an IgG, wherein the variant Fc region contains an amino acid substitution that increases the half-life. Numerous amino acid substitutions are known in the art that can increase the half-life of the Fc-carrying molecule, see, for example, the amino acid substitutions described in US patent No. 6277375, 7083784; 7217797, 8088376; US publications No. 2002/0147311; 2007/0148164; and PCT publications No. WO 98/23289; WO 2009/058492; and WO 2010/033279, which are incorporated herein by reference in their entirety. The Fc-carrying CD137xTA binding molecule having an extended half-life may contain two or more substitutions selected from: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K and Y436I, wherein the numbering indicated corresponds to the numbering using the EU index as set out in Kabat.

[000144] В частности, применяемый домен СН2-СН3 может содержать замены:[000144] In particular, the CH2-CH3 domain used may contain substitutions:

(A) M252Y, S254T и Т256Е;(A) M252Y, S254T and T256E;

(B) M252Y и S254T;(B) M252Y and S254T;

(C) M252Y и Т256Е;(C) M252Y and T256E;

(D) T250Q и M428L;(D) T250Q and M428L;

(E) T307Q и N434A;(E) T307Q and N434A;

(F) A378V и N434A;(F) A378V and N434A;

(G) N434A и Y436I;(G) N434A and Y436I;

(H) V308P и N434A; или(H) V308P and N434A; or

(I) K288D и H435K,(I) K288D and H435K,

при этом указанная нумерация соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat.wherein the numbering indicated corresponds to the numbering using the EU index as set out in Kabat.

[000145] Предпочтительная последовательность для доменов СН2 и СН3 содержит тройную замену аминокислот: M252Y/S254T/T256E (YTE), которая значительно увеличивает время полужизни в сыворотке (Dall'Acqua, W.F. et al. (2006) «Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn)», J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524), как в SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 42, которые представляют собой варианты домена СН2-СН3 IgG1, или как в SEQ ID NO: 43, которая представляет собой вариант домена СН2-СН3 IgG4: SEQ ID NO: 41:[000145] The preferred sequence for the CH2 and CH3 domains contains a triple amino acid substitution: M252Y/S254T/T256E (YTE), which significantly increases serum half-life (Dall'Acqua, W.F. et al. (2006) "Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn), J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524), as in SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: 42, which are CH2-CH3 domain variants IgG1, or as in SEQ ID NO: 43, which is a variant of the CH2-CH3 domain of IgG4: SEQ ID NO: 41:

SEQ ID NO: 42:SEQ ID NO: 42:

SEQ ID NO: 43:SEQ ID NO:43:

[000146] Настоящее изобретение также охватывает Fc-несущие CD137×TA связывающие молекулы, содержащие варианты домена Fc, которые проявляют измененную эффекторную функцию, измененный период полужизни в сыворотке, измененную стабильность, измененную восприимчивость к клеточным ферментам или измененную эффекторную функцию, согласно результатам NK-зависимого или макрофагозависимого анализа и т.д. Модификации домена Fc, выявленные как изменяющие эффекторную функцию, известны в данной области техники, включая модификации, которые увеличивают связывание с активирующими рецепторами (например, FcγRIIA (CD16A)) и уменьшают связывание с ингибирующими рецепторами (например, FcγRIIB (CD32B)) (см., например, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) «Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors», Cancer Res. 57(18):8882-8890). Примерные варианты доменов Fc человеческого IgG1 со сниженным связыванием с CD32B и/или увеличенным связыванием с CD16A содержат замены F243L, R292P, Y300L, V305I или P296L. Эти замены аминокислот могут присутствовать в домене Fc человеческого IgG1 в любой комбинации. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вариант домена Fc человеческого IgG1 содержит замену F243L, R292P и Y300L, причем указанная нумерация соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения вариант домена Fc человеческого IgG1 содержит замену F243L, R292P, Y300L, V305I и P296L, причем указанная нумерация соответствует нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Kabat.[000146] The present invention also covers Fc-bearing CD137xTA binding molecules containing Fc domain variants that exhibit altered effector function, altered serum half-life, altered stability, altered susceptibility to cellular enzymes, or altered effector function as determined by NK- dependent or macrophage-dependent analysis, etc. Fc domain modifications identified as altering effector function are known in the art, including modifications that increase binding to activating receptors (e.g., FcγRIIA (CD16A)) and decrease binding to inhibitory receptors (e.g., FcγRIIB (CD32B)) (see eg Stavenhagen, J.B. et al (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors", Cancer Res. 57(18): 8882-8890). Exemplary variants of human IgG1 Fc domains with reduced binding to CD32B and/or increased binding to CD16A contain substitutions F243L, R292P, Y300L, V305I, or P296L. These amino acid substitutions may be present in the Fc domain of human IgG1 in any combination. In one embodiment of the present invention, the human IgG1 Fc domain variant comprises the F243L, R292P, and Y300L substitutions, wherein the numbering corresponds to the EC index numbering as set forth in Kabat. According to another embodiment of the present invention, the human IgG1 Fc domain variant comprises the substitutions F243L, R292P, Y300L, V305I, and P296L, wherein the numbering corresponds to the EC index numbering as set forth in Kabat.

[000147] Домены СН2 и/или СН3 CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению не обязательно должны иметь идентичные последовательности и преимущественно модифицированы, чтобы способствовать гетеродимеризации между двумя СН2-СН3-несущими полипептидными цепями. Например, замена аминокислоты (предпочтительно замена аминокислотой, содержащей объемную боковую группу, образующую «выступ», например, триптофаном), может быть введена в домен СН2 или СН3 так, что стерическое влияние предотвратит взаимодействие с доменом, мутированным аналогичным образом, и приведет к спариванию мутированного домена с доменом, в который была введена комплементарная или содействующая мутация, т.е. «впадина» (например, замена глицином). Такие группы мутаций могут быть введены в любую пару полипептидов, содержащихся в биспецифической Fc-содержащей молекуле диатела, и, кроме того, введены в любую часть полипептидных цепей указанной пары. Способы модификации белков для стимулирования гетеродимеризации по отношению к гомодимеризации хорошо известны в данной области техники, в частности, касательно модификации молекул, подобных иммуноглобулинам, и охватываются настоящим изобретением (см., например, Ridgway et al. (1996) «'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization», Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) «Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library», J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) «A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis», J. Immunol. Methods 296:95-101; каждый из указанных документы полностью включен в настоящий документ посредством ссылки). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения «выступ» вводят в домены СН2-СН3 первой полипептидной цепи, и «впадину» вводят в домены СН2-СН3 третьей полипептидной цепи. Таким образом, «выступ» поможет предотвратить гомодимеризацию двух молекул первой полипептидной цепи за счет их доменов СН2 и/или СН3. Поскольку третья полипептидная цепь этого варианта реализации предпочтительно содержит замену «впадина», она будет способна гетеродимеризоваться с первой полипептидной цепью, а также гомодимеризоваться сама с собой (однако такая гомодимеризация не приводит к образованию молекулы, имеющей эпитопсвязывающие сайты). Предпочтительный «выступ» создают путем модификации нативного домена Fc IgG для включения модификации T366W. Предпочтительную «впадину» создают путем модификации нативного домена Fc IgG для включения модификации T366S, L368A и Y407V. Чтобы облегчить очистку гомодимера третьей полипептидной цепи от готового биспецифического Fc-несущего диатела, содержащего гетеродимеры первой и третьей полипептидных цепей, сайт связывания белка А доменов СН2 и СН3 третьей полипептидной цепи предпочтительно мутируют путем замены аминокислоты в положении 435 (H435R). Таким образом, гомодимер третьей полипептидной цепи не будет связываться с белком А, тогда как правильно собранное биспецифическое Fc-несущее диатело будет сохранять свою способность связывать белок А за счет сайта связывания белка А на первой полипептидной цепи.[000147] The CH2 and/or CH3 domains of the CD137×TA binding molecules of the present invention do not necessarily have identical sequences and are advantageously modified to promote heterodimerization between two CH2-CH3-bearing polypeptide chains. For example, an amino acid substitution (preferably a substitution containing an amino acid containing a bulky side group forming a "overhang", such as tryptophan) can be introduced into the CH2 or CH3 domain such that the steric effect will prevent interaction with the similarly mutated domain and result in pairing mutated domain with a domain into which a complementary or contributing mutation has been introduced, i.e. "hole" (for example, substitution with glycine). Such groups of mutations can be introduced into any pair of polypeptides contained in a bispecific Fc-containing diabody molecule, and, in addition, introduced into any part of the polypeptide chains of the specified pair. Methods for modifying proteins to promote heterodimerization relative to homodimerization are well known in the art, particularly with respect to modification of molecules like immunoglobulins, and are covered by the present invention (see, for example, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into- Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization", Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library", J. Mol Biol 270: 26-35, and Xie et al (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis", J Immunol Methods 296:95-101; each documents are incorporated herein by reference in their entirety). According to one embodiment of the present invention, the “overhang” is introduced into the CH2-CH3 domains of the first polypeptide chain, and the “notch” is introduced into the CH2-CH3 domains of the third polypeptide chain. Thus, the “overhang” will help prevent homodimerization of the two molecules of the first polypeptide chain due to their CH2 and/or CH3 domains. Because the third polypeptide chain of this embodiment preferably contains a "hole" substitution, it will be capable of heterodimerizing with the first polypeptide chain as well as homodimerizing with itself (however, such homodimerization does not result in the formation of a molecule having epitope-binding sites). The preferred overhang is created by modifying the native IgG Fc domain to include the T366W modification. The preferred “hole” is created by modifying the native IgG Fc domain to include modification T366S, L368A and Y407V. To facilitate purification of the third polypeptide chain homodimer from the finished bispecific Fc-carrying diabody containing heterodimers of the first and third polypeptide chains, the protein A binding site of the CH2 and CH3 domains of the third polypeptide chain is preferably mutated by replacing the amino acid at position 435 (H435R). Thus, the homodimer of the third polypeptide chain will not bind Protein A, whereas a properly assembled bispecific Fc-bearing diabody will retain its ability to bind Protein A due to the Protein A binding site on the first polypeptide chain.

[0001481 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 46 обеспечивают примерные предпочтительные последовательности для «несущих выступы» доменов СН2 и СН3, которые можно применять в CD137×TA связывающих молекулах согласно настоящему изобретению:[0001481 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 provide exemplary preferred sequences for the “overhang-bearing” CH2 and CH3 domains that can be used in the CD137xTA binding molecules of the present invention:

SEQ ID NO: 44:SEQ ID NO:44:

где X представляет собой лизин (K) или отсутствует,where X is lysine (K) or absent,

SEQ ID NO: 45:SEQ ID NO: 45:

SEQ ID NO: 46:SEQ ID NO:46:

[0001491 SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 обеспечивают примерные предпочтительные последовательности для «несущих впадину» доменов СН2 и СН3, которые можно применять в CD137×TA связывающих молекулах согласно настоящему изобретению:[0001491 SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 49 provide exemplary preferred sequences for the “hole-bearing” CH2 and CH3 domains that can be used in the CD137xTA binding molecules of the present invention:

SEQ ID NO: 47:SEQ ID NO:47:

SEQ ID NO: 48:SEQ ID NO:48:

SEQ ID NO: 49:SEQ ID NO:49:

[000150] Как будет отмечено, домены СН2-СН3 из SEQ ID NO: 45 и 48 представляют собой домены IgG4, тогда как домены СН2-СН3 из SEQ ID NO: 44, 46, 47 и 49 представляют собой домены IgG1. SEQ ID NO: 44, 46, 47 и 49 содержат замену аланином в положении 234 и замену аланином в положении 235 и, соответственно, образуют домен Fc, который проявляет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) или FcγRIIIB (CD16b) (по сравнению со связыванием, проявляемым областью Fc дикого типа (SEQ ID NO: 12). Кроме того, настоящее изобретение конкретно охватывает конструкции CD137×TA связывающих молекул, в которых отсутствует вышеуказанный С-концевой остаток лизина.[000150] As will be noted, the CH2-CH3 domains of SEQ ID NOs: 45 and 48 are IgG4 domains, while the CH2-CH3 domains of SEQ ID NOs: 44, 46, 47 and 49 are IgG1 domains. SEQ ID NOs: 44, 46, 47 and 49 contain an alanine substitution at position 234 and an alanine substitution at position 235 and accordingly form an Fc domain that exhibits reduced (or essentially absent) binding to FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A ), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a), or FcγRIIIB (CD16b) (compared to the binding exhibited by the wild-type Fc region (SEQ ID NO: 12). In addition, the present invention specifically covers constructs of CD137xTA binding molecules, in which lack the above C-terminal lysine residue.

[000151] Согласно варианту реализации, описанному выше, первая полипептидная цепь будет иметь «несущую выступ» последовательность СН2-СН3, такую как последовательность SEQ ID NO: 44. Однако, как будет понятно, «несущий впадину» домен СН2-СН3 (например, SEQ ID NO: 47) мог применяться в первой полипептидной цепи, и в этом случае «несущий выступ» домен СН2-СН3 (например, SEQ ID NO: 44) будет применяться в третьей полипептидной цепи.[000151] According to the embodiment described above, the first polypeptide chain will have a CH2-CH3 “knob-bearing” sequence, such as SEQ ID NO: 44. However, as will be appreciated, a CH2-CH3 “groove-bearing” domain (e.g. SEQ ID NO: 47) could be used in the first polypeptide chain, in which case the CH2-CH3 "overhang" domain (eg, SEQ ID NO: 44) would be used in the third polypeptide chain.

Е. Альбуминсвязывающий доменE. Albumin-binding domain

[000152] Как раскрыто в WO 2012/018687, для того чтобы улучшить фармакокинетические свойства диател в условиях in vivo, диатело может быть модифицировано, чтобы содержать полипептидную часть сывороточного связывающего белка на одном или более концах диатела. Такие соображения также применимы к триспецифическим связывающим молекулам согласно настоящему изобретению. Наиболее предпочтительно, если желательно включение полипептидной части сывороточного связывающего белка в триспецифические связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, такая полипептидная часть будет встроена на С-конце одной из полипептидных цепей триспецифической связывающей молекулы.[000152] As disclosed in WO 2012/018687, in order to improve the pharmacokinetic properties of the diabody under in vivo conditions, the diabody can be modified to contain a whey binding protein polypeptide moiety at one or more ends of the diabody. Such considerations also apply to the trispecific binding molecules of the present invention. Most preferably, if inclusion of a polypeptide portion of a serum binding protein is desired in the trispecific binding molecules of the present invention, such polypeptide portion will be inserted at the C-terminus of one of the polypeptide chains of the trispecific binding molecule.

[000153] Альбумин является самым распространенным белком в плазме крови и имеет период полужизни 19 дней у человека. Альбумин имеет несколько сайтов связывания небольших молекул, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и тем самым продлевать их периоды полужизни в сыворотке крови. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148 состоит из 46 остатков аминокислот, образующих стабильный трехвинтовой жгут, и обладает широкой альбуминсвязывающей специфичностью (Johansson, M.U. et al. (2002) «Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules», J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). Соответственно, особенно предпочтительная полипептидная часть сывороточного связывающего белка для улучшения фармакокинетических свойств диатела в условиях in vivo представляет собой альбуминсвязывающий домен (ABD) из стрептококкового белка G и более предпочтительно альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus dysgalactiae G148 (SEQ ID NO: 50): [000153] Albumin is the most abundant protein in blood plasma and has a half-life of 19 days in humans. Albumin has several small molecule binding sites that allow it to bind non-covalently to other proteins and thereby prolong their serum half-lives. Albumin-binding domain 3 (ABD3) of the G protein of Streptococcus strain G148 consists of 46 amino acid residues forming a stable three-helix bundle and has broad albumin-binding specificity (Johansson, MU et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin- Binding Modules,” J Biol Chem 277(10):8114–8120). Accordingly, a particularly preferred polypeptide moiety of the whey binding protein for improving the pharmacokinetic properties of the diabody in vivo is the albumin binding domain (ABD) of streptococcal protein G and more preferably the albumin binding domain 3 (ABD3) of the G protein of Streptococcus dysgalactiae strain G148 (SEQ ID NO: 50 ):

[000154] Как раскрыто в WO 2012/162068 (который включен в настоящую заявку посредством ссылки), «деиммунизированные» варианты, имеющие последовательность SEQ ID NO: 50, способны ослаблять или устранять связывание с ГКГС класса II. Исходя из результатов для комбинированных мутаций, следующие комбинации замен рассматривают как предпочтительные замены для получения указанного деиммунизированного альбуминсвязывающего домена: 66S/70S +71A; 66S/70S +79А; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64А/65А/71А+66Е; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64А/65А/79А+66Е. Варианты ABD содержат модификации L64A, I65A и D79A или модификации N66S, T70S и D79A. Варианты деиммунизированного ABD, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51, 52 или 53, являются особенно предпочтительными, поскольку указанные деиммунизированные альбуминсвязывающие домены проявляют по существу связывание дикого типа, обеспечивая при этом ослабленное связывание с ГКГС класса II:[000154] As disclosed in WO 2012/162068 (which is incorporated herein by reference), “deimmunized” variants having the sequence SEQ ID NO: 50 are capable of reducing or eliminating binding to MHC class II. Based on the results for the combined mutations, the following substitution combinations are considered as preferred substitutions to obtain the specified deimmunized albumin binding domain: 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. ABD variants contain modifications L64A, I65A and D79A or modifications N66S, T70S and D79A. Deimmunized ABD variants having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, 52, or 53 are particularly preferred because these deimmunized albumin-binding domains exhibit substantially wild-type binding while providing attenuated binding to MHC class II:

SEQ ID NO: NO:51:SEQ ID NO:NO:51:

SEQ ID NO: NO:52:SEQ ID NO:NO:52:

SEQ ID NO: NO:53:SEQ ID NO:NO:53:

[000155] Несмотря на то, что такие альбуминсвязывающие домены могут быть включены в любую из полипептидных цепей триспецифических связывающих молекул согласно настоящему изобретению, предпочтительно расположить такой домен в направлении С-конца относительно домена Е-спирали (или K-спирали) первой или третьей полипептидной цепи (за счет линкера, который находится между доменом Е-спирали (или K-спирали) и альбуминсвязывающим доменом (который предпочтительно представляет собой деиммунизированный альбуминсвязывающий домен)). Предпочтительная последовательность для такого линкера представляет собой SEQ ID NO: 26: GGGS.[000155] Although such albumin-binding domains may be included in any of the polypeptide chains of the trispecific binding molecules of the present invention, it is preferred that such domain be positioned C-terminal to the E-helix (or K-helix) domain of the first or third polypeptide chain (via a linker that is located between the E-helix (or K-helix) domain and the albumin-binding domain (which is preferably a deimmunized albumin-binding domain)). The preferred sequence for such a linker is SEQ ID NO: 26: GGGS.

F. Предпочтительные опухолевые антигены (ТА) и примерные вариабельные доменыF. Preferred Tumor Antigens (TAs) and Exemplary Variable Domains

[000156] CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитопсвязывающий сайт, специфичный для эпитопа опухолевого антигена. Примерные опухолевые антигены («ТА»), которые могут быть связаны CD137×TA связывающими молекулами согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются указанными: антиген рака толстой кишки 19.9; онкофетальный белок 5Т4; антиген 4.2 муцинов при раке желудка; антиген колоректальной карциномы А33 (Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998); ADAM-9 (публикация патента США 2006/0172350, РСТ публикация WO 06/084075); онкофетальный антиген альфа-фетопротеин, AFP (Malaguarnera, G. et al. (2010) «Serum markers of hepatocellular carcinoma», Dig. Dis. Sci. 55(10):2744-2755); ALCAM (PCT публикация WO 03/093443); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); бета-катенин (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); карбоксипептидазу M (публикация патента США 2006/0166291); Bl (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); CD5 (Calin, G.A et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Thomas, D.A et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36); CD20 (Cang, S. et al. (2012) «Novel CD20 Monoclonal Antibodies For Lymphoma Therapy», J. Hematol. Oncol. 5:64 pp. 1-9); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18; 8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD30 (Muta, H. et al. (2013) «CD30: From Basic Research To Cancer Therapy», Immunol. Res. 57(1-3): 151-158); CD33 (Walter, R.B. et al. (2012) «Acute myeloid leukemia stem cells and CD33-targeted immunotherapy», Blood 119(26):6198-6208); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD46 (патент США №7148038; РСТ публикация №WO 03/032814; Russell, S. et al. (2004) «CD46: A Complement Regulator And Pathogen Receptor That Mediates Links Between Innate And Acquired Immune Function», Tissue Antigens 64(2): 111-118); CD52 (Hoelzer, D. et al. (2013) «Targeted therapy with monoclonal antibodies in acute lymphoblastic leukemia», Curr. Opin. Oncol. 25(6):701-706); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD123 (Taussig, D. et al. (2005) «Hematopoietic Stem Cells Express Multiple Myeloid Markers: Implications For The Origin And Targeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia», Blood 106:4086-4092); CD317 (Palma, G. et al. (2012) «Plasmacytoids Dendritic Cells Are A Therapeutic Target In Anticancer Immunity», Biochim. Biophys. Acta. 1826(2):407-414; CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (карциноэмбриональный антиген Mathelin, С.2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CEACAM5 и CEACAM6 (РСТ публикация №WO 2011/034660; Zheng, С. et al. (2011) «A Novel Anti- CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity», PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11); C017-1A (Adkins, J.C. et al. (1998) «Edrecolomab (Monoclonal Antibody 17-1А)», Drugs 56(4):619-626); CO-43 (антиген группы крови Leb) и CO-514 (антиген группы крови Lea) (Garratty, G. (1995) «Blood Group Antigens As Tumor Markers, Parasitic/Bacterial/Viral Receptors, And Their Association With Immunologically Important Proteins», Immunol. Invest. 24(l-2):213-232; CTLA-1 и CTLA-4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); цитокератин 8 (РСТ публикация №WO 03/024191); антиген D1.1 (Dao, Т. et al. (2009) «Identification Of A Human Cyclin D1-Derived Peptide That Induces Human Cytotoxic CD4 T Cells», PLoS One. 4(8):e6730); DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) «TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics», Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera, L. (2009) «Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family», Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3): 173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) «Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy», Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) «Following the TRAIL to Apoptosis», Immunologic Res. 35(3):249-262); ряд E₁ (группа крови В); ЭФР-Р (рецептор эпидермального фактора роста, Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); рецепторы эфрина (и, в частности, EphA2 (патент США №7569672, РСТ публикация WO 06/084226); Erb (ErbB1, ErbB3, ErbB4, Zhou, Н. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon, E. et al. 2004 bit J Oncol. 24(5): 1325-1338); антиген аденокарциномы легких F3 (Greulich, H. et al. (2012) «Functional analysis of receptor tyrosine kinase mutations in lung cancer identifies oncogenic extracellular domain mutations of ERBB2», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 109(36):14476-14481); антиген FC10.2 (Loveless, W. et al. (1990) «Developmental Patterning Of The Carbohydrate Antigen FC10.2 During Early Embryogenesis In The Chick», Development 108(1):97-106); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1): 123-128); GD2/GD3/GD49/GM2/GM3 (Livingston, P.O. et at. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-25); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) «Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma», J. Clin. Immunol. 2:135-140); gp37 (Т-клеточный антиген лейкоза человека, Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) «Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3)», J. Immunol. 141:1398-1403); gp75 (антиген меланомы; Vijayasardahl et al. (1990) «The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse В (Brown) Locus Gene Product», J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); антиген CD20 В-клеточной лимфомы человека (Reff et al. (1994) «Depletion Of В Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20», Blood 83:435-445); антиген глобулы молочного жира человека; Е6 папилломавируса человека/Е7 папилломавируса человека (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59); HMW-MAA (высокомолекулярный антиген меланомы) (Natali et al. (1987) «Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance», Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) «Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies», J. Clin. Invest. 86:2136-2144); антиген I (дифференцировочный антиген) (Feizi (1985) «Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens», Nature 314:53-57), такой как I(Ma), обнаруженный при аденокарциномах желудка; интегрин альфа-V-бета-6 интегрин-β6 (ITGB6) (РСТ публикация № WO 03/087340); JAM-3 (РСТ публикация № WO 06/084078); рецептор интерлейкина-13 α2 (IL13Rα2) (Bodhinayake, I. et al. (2014) «Targeting A Heterogeneous Tumor: The Promise Of The Interleukin-13 Receptor α2», Neurosurgery 75(2):N18-9); JAM-3 (РСТ публикация WO 06/084078); KID3 (РСТ публикация WO 05/028498); KID31 (PCT публикация WO 06/076584); общий антиген карциномы KS 1/4 (Perez et al. (1989) «Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker», J. Immunol. 142:3662-3667; et al. (1991) «Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes», Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); общий антиген карциномы KS 1/4 (Perez et al. (1989) «Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The KsI/4 Epithelial Carcinoma Marker», J. Immunol. 142:3662-3667; et al. (1991) «Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes», Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); антигены карциномы легких человека L6 и L20 ( et al. (1986) «Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma», Cancer Res. 46:3917-3923); LEA (, N. et al. (2012) «Sialyl Lewis x expression in cervical scrapes of premalignant lesions», J. Biosci. 37(6):999-1004); LUCA-2 (публикация патента США №2006/0172349; PCT публикация WO 06/083852); M1:22:25:8; М18, М39 (Cambier, L. et al. (2012) «М19 Modulates Skeletal Muscle Differentiation And Insulin Secretion In Pancreatic B-Cells Through Modulation Of Respiratory Chain Activity», PLoS One 7(2):e31815; Pui, C.H. et al. (1991) «Characterization of childhood acute leukemia with multiple myeloid and lymphoid markers at diagnosis and at relapse», Blood 78(5): 1327-1337); MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep.7(5):377-82; Myl, MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-ацетилглюкозаминилтрансферазу (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6; 1473(l):21-34); неогликопротеин (Legendre, H. et al. (2004) «Prognostic Stratification Of Dukes В Colon Cancer By A Neoglycoprotein», Int. J. Oncol. 25(2):269-276); NS-10; OFA-1 и OFA-2 (Takahashi, M. (1984) «A Study On Clinical Significance Of Oncofetal Antigen-1 In Gynecologic Tumors», Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. 36(12):2613-2618); онкостатин M (рецептор онкостатина бета) (патент США №7572896, PCT публикация WO 06/084092); р15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (простатический специфический антиген; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); РЕМА (антиген полиморфного эпителиального муцина) (Chu, N.J. et al. (2015) «Nonviral Oncogenic Antigens and the Inflammatory Signals Driving Early Cancer Development as Targets for Cancer Immunoprevention», Clin. Cancer Res. 21(7): 1549-1557); PIPA (патент США №7405061, PCT публикация WO 04/043239); простатическую кислую фосфатазу (Tailor et al. (1990) «Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone», Nucl. Acids Res. 18(16):4928); R24 (Zhou, M. et al. (2008) «Constitutive Overexpression Of A Novel 21 Kda Protein By Hodgkin Lymphoma And Aggressive Non-Hodgkin Lymphomas», Mol. Cancer 7:12); ROR1 (патент США №5843749); Rabbani, H. et al. (2010) «Expression Of ROR1 In Patients With Renal Cancer-A Potential Diagnostic Marker», Iran Biomed. J. 14(3):77-82); сфинголипиды (Hakomori, S. (1998) «Cancer-Associated Glycosphingolipid Antigens: Their Structure, Organization, And Function», Acta Anat. (Basel) 161(1-4):79-90); SSEA-1, SSEA-3 и SSEA-4 (Muramatsu, T. et al. (2004) «Carbohydrate Antigens Expressed On Stem Cells And Early Embryonic Cells», Glycoconj. J. 21(1-2):41-45); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); происходящий из Т-клеточного рецептора пептид (Edelson (1998) «Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy», Cancer J Sci Am. 4:62-71); T₅A₇ (Hogg, R.J. et al. (1991) «A monoclonal antibody exhibiting reactivity with both X-hapten- and lactose- bearing glycolipids», Tissue Antigens 37(1):33-38); TAG-72 (Yokota et al. (1992) «Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms», Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (группа крови A) (Gooi, H.C. et al. (1983) «Monoclonal antibody reactive with the human epidermal-growth-factor receptor recognizes the blood-group- A antigen», Biosci. Rep. 3(11): 1045-1052); рецептор TNF (рецептор TNF-α, рецептор TNF-β или рецептор TNF-γ (van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA-1-85 (группа крови H) (Williams, B.P. et al. (1988) «Biochemical and genetic analysis of the OKa blood group antigen», Immunogenetics 27(5):322-329); рецептор трансферрина (патент США №7572895, РСТ публикация WO №05/121179); TSTA, опухолеспецифичный трансплантационный антиген ( et al. (1985) {(Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas», Cancer. Res. 45:2210-2188); VEGF-R (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8); и гаптен Y, Le^y (Durrant, L.G. et al. (1989) ((Development Of An ELISA To Detect Early Local Relapse Of Colorectal Саnсеr», Br. J. Cancer 60(4): 533-537).[000156] CD137xTA binding molecules of the present invention contain at least one epitope-binding site specific for a tumor antigen epitope. Exemplary tumor antigens (“TA”) that may be bound by CD137×TA binding molecules according to the present invention include, but are not limited to: colon cancer antigen 19.9; oncofetal protein 5T4; mucin antigen 4.2 for gastric cancer; colorectal carcinoma antigen A33 (Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998); ADAM-9 (US Patent Publication 2006/0172350, PCT Publication WO 06/084075); oncofetal antigen alpha-fetoprotein, AFP (Malaguarnera, G. et al. (2010) “Serum markers of hepatocellular carcinoma”, Dig. Dis. Sci. 55(10):2744-2755); ALCAM (PCT publication WO 03/093443); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenin (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, RC Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); carboxypeptidase M (US Patent Publication 2006/0166291); Bl (Egloff, AM et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); CD5 (Calin, GA et al. 2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD20 (Thomas, DA et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5): 1125-36); CD20 (Cang, S. et al. (2012) "Novel CD20 Monoclonal Antibodies For Lymphoma Therapy", J. Hematol. Oncol. 5: 64 pp. 1-9); CD22 (Kreitman, RJ 2006 AAPS J. 18; 8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91- 107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD28 (Bataille, R 2006 Haematologica 91(9): 1234-40) CD30 (Muta, H. et al. (2013) "CD30: From Basic Research To Cancer Therapy", Immunol. Res. 57(1-3): 151-158 ); CD33 (Walter, RB et al. (2012) “Acute myeloid leukemia stem cells and CD33-targeted immunotherapy,” Blood 119(26):6198-6208); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1 ):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann NY Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, JG 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46) ; CD56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9): 1234-40); CD46 (US Patent No. 7148038; PCT Publication No. WO 03/032814; Russell, S. et al. (2004) “CD46: A Complement Regulator And Pathogen Receptor That Mediates Links Between Innate And Acquired Immune Function,” Tissue Antigens 64(2 ): 111-118); CD52 (Hoelzer, D. et al. (2013) “Targeted therapy with monoclonal antibodies in acute lymphoblastic leukemia,” Curr. Opin. Oncol. 25(6):701-706); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, PG et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48); CD123 (Taussig, D. et al. (2005) “Hematopoietic Stem Cells Express Multiple Myeloid Markers: Implications For The Origin And Targeted Therapy Of Acute Myeloid Leukemia,” Blood 106:4086-4092); CD317 (Palma, G. et al. (2012) "Plasmacytoids Dendritic Cells Are A Therapeutic Target In Anticancer Immunity", Biochim. Biophys. Acta. 1826(2):407-414; CDK4 (Lee, YM et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (carcinoembryonic antigen Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, FI et al. 2005 Rev Invest Clin. 57( 6):814-9); CEACAM5 and CEACAM6 (PCT publication No. WO 2011/034660; Zheng, S. et al. (2011) “A Novel Anti- CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells- Mediated Tumor Immunity", PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11); C017-1A (Adkins, JC et al. (1998) "Edrecolomab (Monoclonal Antibody 17-1A)", Drugs 56(4) :619-626); CO-43 (Leb blood group antigen) and CO-514 (Lea blood group antigen) (Garratty, G. (1995) “Blood Group Antigens As Tumor Markers, Parasitic/Bacterial/Viral Receptors, And Their Association With Immunologically Important Proteins", Immunol. Invest. 24(l-2):213-232; CTLA-1 and CTLA-4 (Peggs, KS et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); cytokeratin 8 (PCT publication No. WO 03/024191); D1.1 antigen (Dao, T. et al. (2009) "Identification Of A Human Cyclin D1-Derived Peptide That Induces Human Cytotoxic CD4 T Cells", PLoS One. 4(8):e6730); DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) “TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics”, Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera, L. (2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family", Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3): 173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy ", Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, BR et al. (2006) "Following the TRAIL to Apoptosis", Immunologic Res. 35(3):249-262); row E ₁ (blood group B); EGF-R (epidermal growth factor receptor, Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No: S228-32); ephrin receptors (and, in particular, EphA2 (US patent No. 7569672, PCT publication WO 06/084226); Erb (ErbB1, ErbB3, ErbB4, Zhou, N. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon , E. et al. 2004 bit J Oncol. 24(5): 1325-1338); lung adenocarcinoma antigen F3 (Greulich, H. et al. (2012) “Functional analysis of receptor tyrosine kinase mutations in lung cancer identifies oncogenic extracellular domain mutations of ERBB2", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 109(36):14476-14481); antigen FC10.2 (Loveless, W. et al. (1990) "Developmental Patterning Of The Carbohydrate Antigen FC10 .2 During Early Embryogenesis In The Chick", Development 108(1):97-106); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1): 123- 128); GD2/GD3/GD49/GM2/GM3 (Livingston, PO et at. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10): 1018-25); GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma", J. Clin. Immunol. 2:135-140); gp37 (Human T-cell leukemia antigen, Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3)", J. Immunol 141:1398-1403); gp75 (melanoma antigen; Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse In (Brown) Locus Gene Product", J. Exp. Med. 171(4): 1375-1380); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); human B-cell lymphoma antigen CD20 (Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20", Blood 83:435-445); human milk fat globule antigen; Human papillomavirus E6/Human papillomavirus E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59); HMW-MAA (high molecular weight melanoma antigen) (Natali et al. (1987) “Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance”, Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies", J. Clin. Invest. 86:2136-2144 ); antigen I (differentiation antigen) (Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens", Nature 314:53-57), such as I(Ma), found in gastric adenocarcinomas; integrin alpha-V-beta-6 integrin-β6 (ITGB6) (PCT Publication No. WO 03/087340); JAM-3 (PCT publication No. WO 06/084078); interleukin-13 receptor α2 (IL13Rα2) (Bodhinayake, I. et al. (2014) “Targeting A Heterogeneous Tumor: The Promise Of The Interleukin-13 Receptor α2”, Neurosurgery 75(2):N18-9); JAM-3 (PCT publication WO 06/084078); KID3 (PCT publication WO 05/028498); KID31 (PCT publication WO 06/076584); common carcinoma antigen KS 1/4 (Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker", J. Immunol. 142:3662-3667; et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes", Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); common carcinoma antigen KS 1/4 (Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The KsI/4 Epithelial Carcinoma Marker", J. Immunol. 142:3662-3667; et al. (1991) "Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes", Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); human lung carcinoma antigens L6 and L20 ( et al. (1986) "Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma", Cancer Res. 46:3917-3923); LEA ( , N. et al. (2012) "Sialyl Lewis x expression in cervical scrapes of premalignant lesions", J. Biosci. 37(6):999-1004); LUCA-2 (US Patent Publication No. 2006/0172349; PCT Publication WO 06/083852); M1:22:25:8; M18, M39 (Cambier, L. et al. (2012) "M19 Modulates Skeletal Muscle Differentiation And Insulin Secretion In Pancreatic B-Cells Through Modulation Of Respiratory Chain Activity", PLoS One 7(2):e31815; Pui, CH et al (1991) “Characterization of childhood acute leukemia with multiple myeloid and lymphoid markers at diagnosis and at relapse,” Blood 78(5): 1327-1337); MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5): 377-82; Myl, MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3 ):323-31); N-acetylglucosaminyltransferase (Dennis, JW 1999 Biochim Biophys Acta. 6; 1473(l):21-34); neoglycoprotein (Legendre, H. et al. (2004) “Prognostic Stratification Of Dukes In Colon Cancer By A Neoglycoprotein", Int. J. Oncol. 25(2):269-276); NS-10; OFA-1 and OFA-2 (Takahashi, M. (1984) "A Study On Clinical Significance Of Oncofetal Antigen -1 In Gynecologic Tumors", Nihon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. 36(12):2613-2618); oncostatin M (oncostatin beta receptor) (US patent No. 7572896, PCT publication WO 06/084092); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (prostate specific antigen; Cracco, CM et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (Ragupathi , G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); PEMA (polymorphic epithelial mucin antigen) (Chu, NJ et al. (2015) "Nonviral Oncogenic Antigens and the Inflammatory Signals Driving Early Cancer Development as Targets for Cancer Immunoprevention", Clin. Cancer Res. 21(7): 1549-1557); PIPA (US Patent No. 7405061, PCT Publication WO 04/043239); prostatic acid phosphatase (Tailor et al. (1990) “Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone,” Nucl. Acids Res. 18(16):4928); R24 (Zhou, M. et al. (2008) “Constitutive Overexpression Of A Novel 21 Kda Protein By Hodgkin Lymphoma And Aggressive Non-Hodgkin Lymphomas,” Mol. Cancer 7:12); ROR1 (US Patent No. 5843749); Rabbani, H. et al. (2010) "Expression Of ROR1 In Patients With Renal Cancer-A Potential Diagnostic Marker", Iran Biomed. J. 14(3):77-82); sphingolipids (Hakomori, S. (1998) “Cancer-Associated Glycosphingolipid Antigens: Their Structure, Organization, And Function”, Acta Anat. (Basel) 161(1-4):79-90); SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4 (Muramatsu, T. et al. (2004) "Carbohydrate Antigens Expressed On Stem Cells And Early Embryonic Cells", Glycoconj. J. 21(1-2):41-45) ; sTn (Holmberg, LA 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); T-cell receptor-derived peptide (Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy", Cancer J Sci Am. 4:62-71); T ₅ A ₇ (Hogg, RJ et al. (1991) "A monoclonal antibody exhibiting reactivity with both X-hapten- and lactose-bearing glycolipids", Tissue Antigens 37(1):33-38); TAG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms", Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (blood group A) (Gooi, H. C. et al. (1983) “Monoclonal antibody reactive with the human epidermal-growth-factor receptor recognizes the blood-group- A antigen,” Biosci. Rep. 3(11): 1045- 1052); TNF receptor (TNF-α receptor, TNF-β receptor or TNF-γ receptor (van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA-1-85 (blood group H) (Williams, BP et al. (1988) “Biochemical and genetic analysis of the OKa blood group antigen,” Immunogenetics 27(5):322 -329); transferrin receptor (US patent No. 7572895, PCT publication WO No. 05/121179); TSTA, tumor-specific transplantation antigen ( et al. (1985) {(Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas", Cancer. Res. 45:2210-2188); VEGF-R (O'Dwyer. PJ 2006 Oncologist. 11(9):992-8); and hapten Y, Le ^y (Durrant, LG et al. (1989) ((Development Of An ELISA To Detect Early Local Relapse Of Colorectal Cancer", Br. J. Cancer 60(4): 533-537).

[000157] Антитела, которые распознают такие опухолевые антигены, известны в данной области техники или могут быть получены с использованием хорошо известных способов, включая те, которые описаны в WO 2002/014870. Примерные антитела, которые содержат домены VL и VH, способные связываться с опухолевым антигеном, и последовательности или полипептидные цепи которых, соответственно, можно применять при конструировании CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению, перечислены в таблице 1. Примерные домены VH и VL для антител, связывающихся с несколькими опухолевыми антигенами, представлены ниже.[000157] Antibodies that recognize such tumor antigens are known in the art or can be prepared using well known methods, including those described in WO 2002/014870. Exemplary antibodies that contain VL and VH domains capable of binding to a tumor antigen, and the sequences or polypeptide chains of which, respectively, can be used in the construction of CD137xTA binding molecules according to the present invention are listed in Table 1. Exemplary VH and VL domains for antibodies , binding to several tumor antigens are presented below.

1. Антитела, которые связываются с HER2/neu1. Antibodies that bind to HER2/neu

[000158] HER2/neu представляет собой рецепторный белок массой 185 кДа, который первоначально был выявлен как продукт трансформирующего гена из нейробластом химически обработанных крыс. HER2/neu интенсивно изучали из-за его роли при некоторых карциномах человека и в процессе развития млекопитающих (Hynes et al. (1994) «The Biology of erbB-2/neu/HER-2 and its Role in Cancer», Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) «The neu-Oncogene: Signal Transduction Pathways, Transformation Mechanisms and Evolving Therapies», Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) «Requirement for Neuregulin Receptor erbB2 in Neural and Cardiac Development», Nature 378:394-398).[000158] HER2/neu is a 185 kDa receptor protein that was originally identified as a transforming gene product from chemically treated rat neuroblastomas. HER2/neu has been intensively studied because of its role in some human carcinomas and during mammalian development (Hynes et al. (1994) “The Biology of erbB-2/neu/HER-2 and its Role in Cancer,” Biochim. Biophys Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) "The neu-Oncogene: Signal Transduction Pathways, Transformation Mechanisms and Evolving Therapies", Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) "Requirement for Neuregulin" Receptor erbB2 in Neural and Cardiac Development,” Nature 378:394–398).

[000159] Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к HER2/neu можно применять в соответствии с настоящим изобретением, и принципы настоящего изобретения проиллюстрированы в отношении опухолевого антигена HER2/neu. Примерные антитела, которые связывают человеческий HER2/neu, включают «маргетуксимаб», «трастузумаб» и «пертузумаб». Маргетуксимаб (также известный как MGAH22; per. номер CAS 1350624-75-7, см., например, патент США №8802093) представляет собой оптимизированное по Fc моноклональное антитело, которое связывается с HER2/neu и опосредует повышенную активность АЗКЦ. Трастузумаб (также известный как rhuMAB4D5 и продаваемый как герцептин (Herceptin^®); рег. номер CAS 180288-69-1; см. патент США №5821337) представляет собой гуманизированный вариант антитела 4D5, имеющий константные области IgG1/каппа. Пертузумаб (также известный как rhuMAB2C4 и продаваемый как перджета (Perjeta™); рег. номер CAS 380610-27-5; см., например, WO 2001/000245) представляет собой гуманизированный вариант антитела 2С4, имеющий константные области IgG1/каппа. Также обеспечены дополнительные антитела к HER2/neu.[000159] The epitope binding site of any anti-HER2/neu antibody can be used in accordance with the present invention, and the principles of the present invention are illustrated in relation to the HER2/neu tumor antigen. Exemplary antibodies that bind human HER2/neu include margetuximab, trastuzumab, and pertuzumab. Margetuximab (also known as MGAH22; per. CAS number 1350624-75-7, see, for example, US patent No. 8802093) is an Fc-optimized monoclonal antibody that binds to HER2/neu and mediates increased ADCC activity. Trastuzumab (also known as rhuMAB4D5 and marketed as Herceptin ^® ; CAS Reg. No. 180288-69-1; see US Pat. No. 5,821,337) is a humanized version of the 4D5 antibody having IgG1/kappa constant regions. Pertuzumab (also known as rhuMAB2C4 and marketed as Perjeta™; CAS Reg. No. 380610-27-5; see, for example, WO 2001/000245) is a humanized variant of the 2C4 antibody having IgG1/kappa constant regions. Additional antibodies to HER2/neu are also provided.

(а) Маргетуксимаб(a) Margetuximab

[000160] Аминокислотная последовательность домена VH маргетуксимаба представляет собой (SEQ ID NO: 54) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000160] The amino acid sequence of the VH domain of margetuximab is (SEQ ID NO: 54) (CDR _H residues are underlined):

[000161] Аминокислотная последовательность домена VL маргетуксимаба представляет собой (SEQ ID NO: 55) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000161] The amino acid sequence of the VL domain of margetuximab is (SEQ ID NO: 55) (CDR _L residues are underlined):

[000162] Аминокислотные последовательности полных тяжелых и легких цепей маргетуксимаба известны в данной области техники (см., например, WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94).[000162] The amino acid sequences of the complete heavy and light chains of margetuximab are known in the art (see, for example, WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94).

(b) Трастузумаб(b) Trastuzumab

[000163] Аминокислотная последовательность домена VH трастузумаба представляет собой (SEQ ID NO: 56) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000163] The amino acid sequence of the VH domain of trastuzumab is (SEQ ID NO: 56) (CDR _H residues are underlined):

[000164] Аминокислотная последовательность домена VL трастузумаба представляет собой (SEQ ID NO: 57) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000164] The amino acid sequence of the VL domain of trastuzumab is (SEQ ID NO: 57) (CDR _L residues are underlined):

(c) Пертузумаб(c) Pertuzumab

[000165] Аминокислотная последовательность домена VH пертузумаба представляет собой (SEQ ID NO: 58) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000165] The amino acid sequence of the VH domain of pertuzumab is (SEQ ID NO: 58) (CDR _H residues are underlined):

[000166] Аминокислотная последовательность домена VL пертузумаба представляет собой (SEQ ID NO: 59) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000166] The amino acid sequence of the VL domain of pertuzumab is (SEQ ID NO: 59) (CDR _L residues are underlined):

(d) MAB-1 к HER2(d) MAB-1 to HER2

[000167] Антитело MAB-1 к HER2 представляет собой мышиное моноклональное антитело к HER2/neu, которое связывает эпитоп HER2/neu, который отличается от эпитопа, распознаваемого маргетуксимабом, трастузумабом и пертузумабом. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к HER2 (называемого в настоящем документе VH МАВ-1 к HER2) представляет собой (SEQ ID NO: 60) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000167] Anti-HER2 antibody MAB-1 is a mouse monoclonal antibody to HER2/neu that binds to an epitope of HER2/neu that is different from the epitope recognized by margetuximab, trastuzumab, and pertuzumab. The amino acid sequence of the MAB-1 anti-HER2 VH domain (referred to herein as MAB-1 anti-HER2 VH) is (SEQ ID NO: 60) (CDR _H residues are underlined):

[000168] Аминокислотные последовательности CDR_H из VH MAB-1 к HER2 представляют собой:[000168] The amino acid sequences of the CDR _H from the MAB-1 VH to HER2 are:

CDR_H1 (SEQ ID NO: 177): NYGMNCDR _H 1 (SEQ ID NO: 177): NYGMN

CDR_H2 (SEQ ID NO: 178): WINTNIGEPTYTEEFKGCDR _H 2 (SEQ ID NO: 178): WINTNIGEPTYTEEFKG

CDR_H3 (SEQ ID NO: 179): DDGYGNRVSYCDR _H 3 (SEQ ID NO: 179): DDGYGNRVSY

[000169] Аминокислотная последовательность домена VL MAB-1 к HER2 (называемого в настоящем документе VL МАВ-1 к HER2) представляет собой (SEQ ID NO: 61) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000169] The amino acid sequence of the MAB-1 anti-HER2 VL domain (referred to herein as MAB-1 anti-HER2 VL) is (SEQ ID NO: 61) (CDR _L residues are underlined):

[000170] Аминокислотные последовательности CDR_L из VL МАВ-1 к HER2 представляют собой:[000170] The amino acid sequences of CDR _L from VL of MAB-1 to HER2 are:

CDR_L1 (SEQ ID NO: 180): KASQDINSYLSCDR _L 1 (SEQ ID NO: 180): KASQDINSYLS

CDR_L2 (SEQ ID NO: 181): RANRLVDCDR _L 2 (SEQ ID NO: 181): RANRLVD

CDR_L3 (SEQ ID NO: 182): LQHDEFPWTCDR _L 3 (SEQ ID NO: 182): LQHDEFPWT

(e) Гуманизированное MAB-1 к HER2(e) Humanized anti-HER2 MAB-1

[000171] Антитело MAB-1 к HER2 было гуманизировано с образованием антитела hMAB-1 к HER2. Аминокислотная последовательность домена VH такого гуманизированного антитела (VH hMAB-1 к HER2) представляет собой (SEQ ID NO: 62) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000171] The anti-HER2 antibody MAB-1 was humanized to form the anti-HER2 antibody hMAB-1. The amino acid sequence of the VH domain of such a humanized antibody (VH hMAB-1 anti-HER2) is (SEQ ID NO: 62) (CDR _H residues are underlined):

где: X₁ представляет собой D или Е и Х₂ представляет собой G или I.where: X ₁ represents D or E and X ₂ represents G or I.

[000172] Аминокислотная последовательность домена VL такого гуманизированного антитела (VL hMAB-1 к HER2) представляет собой (SEQ ID NO: 63) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000172] The amino acid sequence of the VL domain of such a humanized antibody (hMAB-1 anti-HER2 VL) is (SEQ ID NO: 63) (CDR _L residues are underlined):

где: Х₃ представляет собой N или S; Х₄ представляет собой S, Т или N; Х₅ представляет собой V или Q и Х₆ представляет собой D, Е или S.where: X ₃ represents N or S; X ₄ represents S, T or N; X ₅ represents V or Q and X ₆ represents D, E or S.

[000173] Были выделены три варианта доменов VH hMAB-1 к HER2: VH1 hMAB-1 к HER2, VH2 hMAB-1 к HER2 и VH3 hMAB-1 к HER2. Аминокислотные последовательности таких вариантов доменов VH hMAB-1 к HER2 представлены ниже.[000173] Three hMAB-1 anti-HER2 VH domain variants have been identified: VH1 hMAB-1 anti-HER2, VH2 hMAB-1 anti-HER2, and VH3 hMAB-1 anti-HER2. The amino acid sequences of such variants of the hMAB-1 VH domains to HER2 are presented below.

[000174] Аминокислотная последовательность VH1 hMAB-1 к HER2 представляет собой (SEQ ID NO: 64) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что второй и третий остатки CDR_H3 представляют собой D и G, соответственно)[000174] The amino acid sequence of hMAB-1 VH1 to HER2 is (SEQ ID NO: 64) (CDR _H residues are underlined; note that the second and third CDR _H 3 residues are D and G, respectively)

[000175] Аминокислотная последовательность VH2 hMAB-1 к HER2 представляет собой (SEQ ID NO: 65) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что второй и третий остатки CDR_H3 представляют собой Е и G, соответственно):[000175] The amino acid sequence of hMAB-1 VH2 to HER2 is (SEQ ID NO: 65) (CDR _H residues are underlined; note that the second and third CDR _H 3 residues are E and G, respectively):

[000176] Аминокислотная последовательность VH3 hMAB-1 к HER2 представляет собой (SEQ ID NO: 66) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что второй и третий остатки CDR_H3 представляют собой D и I, соответственно):[000176] The amino acid sequence of hMAB-1 VH3 to HER2 is (SEQ ID NO: 66) (CDR _H residues are underlined; note that the second and third CDR _H 3 residues are D and I, respectively):

[000177] Таким образом, аминокислотные последовательности CDR_H1 из VH1 hMAB-1 к HER2, VH2 hMAB-1 к HER2 и VH3 hMAB-1 к HER2 являются идентичными (NYGMN; SEQ ID NO: 177) и аминокислотные последовательности CDR_H2 из VH1 hMAB-1 к HER2, VH2 hMAB-1 к HER2 и VH3 hMAB-1 к HER2 являются идентичными (SEQ ID NO: 178). Однако аминокислотные последовательности CDR_H3 из VH1 hMAB-1 к HER2, VH2 hMAB-1 к HER2 и VH3 hMAB-1 к HER2 различаются:[000177] Thus, the amino acid sequences of CDR _H 1 from VH1 hMAB-1 to HER2, VH2 hMAB-1 to HER2 and VH3 hMAB-1 to HER2 are identical (NYGMN; SEQ ID NO: 177) and the amino acid sequences of CDR _H 2 from VH1 hMAB-1 to HER2, VH2 hMAB-1 to HER2 and VH3 hMAB-1 to HER2 are identical (SEQ ID NO: 178). However, the amino acid sequences of CDR _H 3 from VH1 hMAB-1 to HER2, VH2 hMAB-1 to HER2 and VH3 hMAB-1 to HER2 are different:

CDR_H3 из VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 183): DDGYGNRVSYCDR _H 3 from VH1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 183): DDGYGNRVSY

CDR_H3 из VH2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 184): DEGYGNRVSYCDR _H 3 from VH2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 184): DEGYGNRVSY

CDR_H3 из VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 185): DDIYGNRVSYCDR _H 3 from VH3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 185): DDIYGNRVSY

[000178] Были выделены три варианта доменов VL hMAB-1 к HER2: VL1 hMAB-1 к HER2, VL2 hMAB-1 к HER2 и VL3 hMAB-1 к HER2. Аминокислотные последовательности таких вариантов доменов VH hMAB-1 к HER2 представлены ниже.[000178] Three hMAB-1 anti-HER2 VL domain variants have been identified: hMAB-1 anti-HER2 VL1, hMAB-1 anti-HER2 VL2, and hMAB-1 anti-HER2 VL3. The amino acid sequences of such variants of the hMAB-1 VH domains to HER2 are presented below.

[000179] Аминокислотная последовательность VL1 hMAB-1 к HER2 представляет собой (SEQ ID NO: 67) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что седьмой и восьмой остатки CDR_L1 представляют собой N и S, соответственно, и что шестой и седьмой остатки CDR_L2 представляют собой V и D, соответственно):[000179] The amino acid sequence of hMAB-1 VL1 to HER2 is (SEQ ID NO: 67) (CDR _L residues are underlined; it should be noted that the seventh and eighth residues of CDR _L 1 are N and S, respectively, and that the sixth and the seventh CDR _L 2 residues are V and D, respectively):

[000180] Аминокислотная последовательность VL2 hMAB-1 к HER2 представляет собой (SEQ ID NO: 68) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что седьмой и восьмой остатки CDR_L1 представляют собой N и Т, соответственно, и что шестой и седьмой остатки CDR_L2 представляют собой V и Е, соответственно):[000180] The amino acid sequence of hMAB-1 VL2 to HER2 is (SEQ ID NO: 68) (CDR _L residues are underlined; it should be noted that the seventh and eighth residues of CDR _L 1 are N and T, respectively, and that the sixth and the seventh CDR _L 2 residues are V and E, respectively):

[000181] Аминокислотная последовательность VL3 hMAB-1 к HER2 представляет собой (SEQ ID NO: 69) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что седьмой и восьмой остатки CDR_L1 представляют собой S и N, соответственно, и что шестой и седьмой остатки CDR_L2 представляют собой Q и S, соответственно):[000181] The amino acid sequence of hMAB-1 VL3 to HER2 is (SEQ ID NO: 69) (CDR _L residues are underlined; it should be noted that the seventh and eighth residues of CDR _L 1 are S and N, respectively, and that the sixth and the seventh CDR _L 2 residues are Q and S, respectively):

[000182] Таким образом, аминокислотные последовательности CDR_L3 из VL1 hMAB-1 к HER2, VL2 hMAB-1 к HER2 и VL3 hMAB-1 к HER2 являются идентичными (LQHDEFPWT; SEQ ID NO: 182). Однако аминокислотные последовательности CDR_L1 и CDR_L2 из VL1 hMAB-1 к HER2, VL2 hMAB-1 к HER2 и VL3 hMAB-1 к HER2 различаются:[000182] Thus, the amino acid sequences of CDR _L 3 of VL1 hMAB-1 to HER2, VL2 hMAB-1 to HER2, and VL3 hMAB-1 to HER2 are identical (LQHDEFPWT; SEQ ID NO: 182). However, the amino acid sequences of CDR _L 1 and CDR _L 2 of VL1 hMAB-1 to HER2, VL2 hMAB-1 to HER2 and VL3 hMAB-1 to HER2 are different:

CDR_L1 из VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 186): KASQDINSYLSCDR _L 1 from VL1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 186): KASQDINSYLS

CDR_L1 из VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 187): KASQDINTYLSCDR _L 1 from VL2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 187): KASQDINTYLS

CDR_L1 из VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 188): KASQDISNYLSCDR _L 1 from VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 188): KASQDISNYLS

CDR_L2 из VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 189): RANRLVDCDR _L 2 from VL1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 189): RANRLVD

CDR_L2 из VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 190): RANRLVECDR _L 2 from VL2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 190): RANRLVE

CDR_L2 из VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 191): RANRLQSCDR _L 2 from VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 191): RANRLQS

[000183] Любой из таких гуманизированных доменов VH и VL hMAB-1 к HER2, включая любые домены, включенные в общую(ие) последовательность(и) доменов VH и/или VL hMAB-1 к HER2, представленных выше, можно применять для образования антитела, диатела или связывающей молекулы, способных связывать Her2/neu.[000183] Any of such humanized hMAB-1 anti-HER2 VH and VL domains, including any domains included in the general sequence(s) of the hMAB-1 anti-HER2 VH and/or VL domains presented above, can be used to form an antibody, diabody or binding molecule capable of binding Her2/neu.

(f) Другие антитела к HER2/neu(f) Other anti-HER2/neu antibodies

[000184] В дополнение к указанным выше предпочтительным связывающим молекулам, направленным против HER2/neu, согласно настоящему изобретению предусмотрено применение любой из следующих Her-2-связывающих молекул: 1.44.1; 1.140; 1.43; 1.14.1; 1.100.1; 1.96; 1.18.1; 1.20; 1.39; 1.24; и 1.71.3 (патенты США №№8350011; 8858942; и РСТ публикация патента WO 2008/019290); F5 и С1 (патенты США №№7892554; 8173424; 8974792; и РСТ публикация патента WO 99/55367); а также Her-2-связывающих молекул из публикаций патентов США 2011/0097323, 2013/017114, 2014/0328836, 2016/0130360 и 2016/0257761, и РСТ публикации патента WO 2011/147986), все из этих публикаций включены в настоящий документ посредством ссылки на раскрытие в них связывающих молекул, направленных против HER2/neu.[000184] In addition to the above preferred anti-HER2/neu binding molecules, the present invention provides for the use of any of the following Her-2 binding molecules: 1.44.1; 1.140; 1.43; 1.14.1; 1.100.1; 1.96; 1.18.1; 1.20; 1.39; 1.24; and 1.71.3 (US Patent Nos. 8350011; 8858942; and PCT Patent Publication WO 2008/019290); F5 and C1 (US Patent Nos. 7892554; 8173424; 8974792; and PCT patent publication WO 99/55367); as well as Her-2 binding molecules from US Patent Publications 2011/0097323, 2013/017114, 2014/0328836, 2016/0130360 and 2016/0257761, and PCT Patent Publication WO 2011/147986), all of which are incorporated herein by reference to the disclosure thereof of binding molecules directed against HER2/neu.

[000185] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×HER2/neu связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH любого из маргетуксимаба, трастузумаба, пертузумаба, hMAB-1 к HER2 или любого из других антител к HER2/neu, обеспеченных в настоящем документе; и более предпочтительно они содержат 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH таких моноклональных антител к HER2/neu.[000185] The present invention particularly includes and covers CD137xHER2/neu binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 of the CDR _H domain of the VH of any of margetuximab, trastuzumab, pertuzumab, hMAB-1 to HER2 or any of the other anti-HER2/neu antibodies provided herein; and more preferably they contain 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 of the VH CDR _H domain of such anti-HER2/neu monoclonal antibodies.

2. Антитела, которые связываются с EphA22. Antibodies that bind to EphA2

[000186] Рецепторная тирозинкиназа, рецептор 2 эфрина типа A (EphA2), обычно экспрессируется в местах межклеточного контакта в эпителиальных тканях взрослых, однако недавние исследования показали, что она также сверхэкспрессируется в различных типах эпителиальных карцином, причем наибольший уровень экспрессии EphA2 наблюдается в метастатических поражениях. Высокие уровни экспрессии EphA2 были обнаружены при широком спектре разных видов рака и во многих опухолевых клеточных линиях, включая рак предстательной железы, рак молочной железы, немелкоклеточный рак легких и меланому (Xu, J. et al. (2014) «High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome», Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) «EphA2 is a Mediator ofVemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma», Cancer Discov. pii: CD-14-0295). EphA2, по-видимому, является не только маркером рака, но, очевидно, постоянно сверхэкспрессируется и функционально изменяется при многих видах рака человека (Chen, P. et al. (2014) «EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells», Oncol. Lett. 8(1):41-46).[000186] The receptor tyrosine kinase ephrin receptor 2 type A (EphA2) is typically expressed at sites of cell-cell contact in adult epithelial tissues, but recent studies have shown that it is also overexpressed in various types of epithelial carcinomas, with the highest levels of EphA2 expression observed in metastatic lesions . High levels of EphA2 expression have been found in a wide range of different cancers and in many tumor cell lines, including prostate cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer and melanoma (Xu, J. et al. (2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With a Poor Disease Outcome", Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) "EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma,” Cancer Discov. pii: CD-14-0295). EphA2 appears not only to be a cancer marker, but appears to be consistently overexpressed and functionally altered in many human cancers (Chen, P. et al. (2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells ", Oncol. Lett. 8(1):41-46).

Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к EphA2 можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Ниже представлены несколько примерных мышиных антител к EphA2, гуманизированные производные таких антител являются особенно предпочтительными.The epitope binding site of any anti-EphA2 antibody can be used in accordance with the present invention. Several exemplary murine anti-EphA2 antibodies are presented below; humanized derivatives of such antibodies are particularly preferred.

(a) МАВ-1 к EphA2(a) MAB-1 to EphA2

[000187] Антитело МАВ-1 к EphA2 представляет собой мышиное моноклональное антитело к EphA2. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к EphA2 представляет собой (SEQ ID NO: 128) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000187] Anti-EphA2 antibody MAB-1 is a murine monoclonal antibody against EphA2. The amino acid sequence of the VH domain of MAB-1 to EphA2 is (SEQ ID NO: 128) (CDR residues are underlined):

[000188] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-1 к EphA2 представляет собой (SEQ ID NO: 129) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000188] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-1 to EphA2 is (SEQ ID NO: 129) (CDR residues are underlined):

(b) МАВ-2 к EphA2(b) MAB-2 to EphA2

[000189] Антитело МАВ-2 к EphA2 представляет собой мышиное моноклональное антитело к EphA2. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-2 к EphA2 представляет собой (SEQ ID NO: 130) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000189] Anti-EphA2 antibody MAB-2 is a murine monoclonal antibody against EphA2. The amino acid sequence of the VH domain of MAB-2 to EphA2 is (SEQ ID NO: 130) (CDR residues are underlined):

[000190] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-2 к EphA2 представляет собой (SEQ ID NO: 131) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000190] The amino acid sequence of the MAB-2 VL domain of EphA2 is (SEQ ID NO: 131) (CDR residues are underlined):

(c) МАВ-3 к EphA2(c) MAB-3 to EphA2

[000191] Антитело МАВ-3 к EphA2 представляет собой мышиное моноклональное антитело к EphA2. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-3 к EphA2 представляет собой (SEQ ID NO: 132) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000191] Anti-EphA2 antibody MAB-3 is a murine monoclonal antibody against EphA2. The amino acid sequence of the VH domain of MAB-3 to EphA2 is (SEQ ID NO: 132) (CDR residues are underlined):

[000192] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-3 к EphA2 представляет собой (SEQ ID NO: 133) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000192] The amino acid sequence of the MAB-3 VL domain of EphA2 is (SEQ ID NO: 133) (CDR residues are underlined):

(d) Другие антитела к EphA2(d) Other antibodies to EphA2

[000193] В дополнение к указанным выше антителам к EphA2 согласно настоящему изобретению предусмотрено применение любого из следующих антител к EphA2: SPL1, LUCA19, SG5 или LUCA40 (см. РСТ публикацию патента WO 2006/084226); В13 (см. патент США №7101976); D7 (см. патент США №7192698); В-233 и ЕА2 (см. РСТ публикацию патента WO 2003/094859).[000193] In addition to the above-mentioned anti-EphA2 antibodies, the present invention provides for the use of any of the following anti-EphA2 antibodies: SPL1, LUCA19, SG5 or LUCA40 (see PCT patent publication WO 2006/084226); B13 (see US patent No. 7101976); D7 (see US patent No. 7192698); B-233 and EA2 (see PCT patent publication WO 2003/094859).

[000194] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×EphA2 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH моноклональных антител к EphA2, МАВ-1 к EphA2, МАВ-2 к EphA2 и МАВ-3 к EphA2.[000194] The present invention particularly includes and covers CD137xEphA2 binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 from the CDR _H domain of the VH monoclonal antibodies to EphA2, MAB-1 to EphA2, MAB-2 to EphA2 and MAB-3 to EphA2.

3. Антитела, которые связываются с 5Т43. Antibodies that bind to 5T4

[000195] Онкофетальный белок, 5Т4, представляет собой ассоциированный с опухолью белок, который экспонирован на клеточной мембране многих видов карциномы, включая карциному почек, карциному толстой кишки, карциному предстательной железы, карциному легких и острый лимфобластный лейкоз (см. Boghaert, E.R. et al. (2008) «The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin», Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) «Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin», Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6). Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к 5Т4 можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Ниже представлены два примерных антитела к 5Т4, «МАВ-1 к 5Т4» и «МАВ-2 к 5Т4». Дополнительные антитела к 5Т4 описаны в данной области техники (см., например, патенты США №№8084249; 8409577; 8759495; 8409577; РСТ публикации №№WO 2013/041687; WO 2014/137931; WO 2016/022939).[000195] Oncofetal protein, 5T4, is a tumor-associated protein that is exposed on the cell membrane of many types of carcinoma, including renal carcinoma, colon carcinoma, prostate carcinoma, lung carcinoma and acute lymphoblastic leukemia (see Boghaert, E.R. et al (2008) "The Oncofetal Protein, 5T4, Is a Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin", Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. ( 2014) "Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin", Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6). The epitope binding site of any anti-5T4 antibody can be used in accordance with the present invention. Below are two example antibodies to 5T4, “MAB-1 to 5T4” and “MAB-2 to 5T4”. Additional antibodies to 5T4 are described in the art (see, for example, US patent No. 8084249; 8409577; 8759495; 8409577; PCT publication No. WO 2013/041687; WO 2014/137931; WO 2016/022939).

(а) МАВ-1 к 5Т4(a) MAV-1 to 5T4

[000196] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к 5Т4 представляет собой (SEQ ID NO: 134) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000196] The amino acid sequence of the VH domain of MAB-1 to 5T4 is (SEQ ID NO: 134) (CDR residues are underlined):

[000197] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-1 к 5Т4 представляет собой (SEQ ID NO: 135) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000197] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-1 to 5T4 is (SEQ ID NO: 135) (CDR residues are underlined):

(b) MAB-2 к 5T4(b) MAB-2 to 5T4

[000198] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-2 к 5T4 представляет собой (SEQ ID NO: 136) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000198] The amino acid sequence of the VH domain of MAB-2 to 5T4 is (SEQ ID NO: 136) (CDR residues are underlined):

[000199] Аминокислотная последовательность домена VL MAB-2 к 5T4 представляет собой (SEQ ID NO: 137) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000199] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-2 to 5T4 is (SEQ ID NO: 137) (CDR residues are underlined):

[000200] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×5T4 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH моноклональных антител к 5Т4, МАВ-1 к 5Т4 или МАВ-2 к 5Т4, или любого из антител к 5Т4, обеспеченных в WO 2007/106744; WO 2013/041687 или WO 2015/184203.[000200] The present invention particularly includes and covers CD137x5T4 binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 from the CDR _H domain of the VH monoclonal antibodies to 5T4, MAB-1 to 5T4 or MAB-2 to 5T4, or any of the antibodies to 5T4 provided in WO 2007/106744; WO 2013/041687 or WO 2015/184203.

4. Антитела, которые связываются с В7-Н34. Antibodies that bind to B7-H3

[000201] В7-Н3 представляет собой опухолевый антиген, который сверхэкспрессируется на широком спектре типов плотных опухолей и является членом семейства В7 молекул, которые участвуют в иммунной регуляции (см. патент США №8802091; US 2014/0328750; US 2013/0149236; Loo, D. et al. (2012) «Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity», Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845). В частности, несколько независимых исследований показали, что клетки злокачественных опухолей человека (например, опухолевые клетки нейробластом и рака желудка, рака яичников и немелкоклеточного рака легких) проявляют существенное повышение экспрессии белка В7-Н3 и что такая повышенная экспрессия была связана с повышенной степенью тяжести заболевания (Zang, X. et al. (2007) «TheB7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition», Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), это свидетельствует о том, что В7-Н3 используется опухолями как путь уклонения от надзора иммунной системы (Hofmeyer, K. et al. (2008) «The Contrasting Role Qf B7-H3», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).[000201] B7-H3 is a tumor antigen that is overexpressed on a wide range of solid tumor types and is a member of the B7 family of molecules that are involved in immune regulation (see US Patent No. 8802091; US 2014/0328750; US 2013/0149236; Loo , D. et al (2012) "Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity", Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845). In particular, several independent studies have shown that human malignant tumor cells (eg, neuroblastoma and gastric, ovarian, and non-small cell lung cancer tumor cells) exhibited significant increases in B7-H3 protein expression and that such increased expression was associated with increased disease severity (Zang, X. et al. (2007) "TheB7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition", Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), this suggests that B7-H3 is used by tumors as an evasion route immune system surveillance (Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role of Qf B7-H3”, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30): 10277-10278).

[000202] Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к В7-Н3 можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Одним примерным антителом, которое связывает человеческий В7-Н3, является «эноблитузумаб». Эноблитузумаб (также известный как MGA271; рег. номер CAS 1353485-38-7; см., например, патент США №8802091) представляет собой Fc-оптимизированное моноклональное антитело, которое связывается с В7-Н3 и обеспечивает повышенную активность АЗКЦ. Также представлены дополнительные примерные антитела к В7-Н3.[000202] The epitope binding site of any anti-B7-H3 antibody can be used in accordance with the present invention. One exemplary antibody that binds human B7-H3 is enoblituzumab. Enoblituzumab (also known as MGA271; CAS Reg. No. 1353485-38-7; see, for example, US Pat. No. 8802091) is an Fc-optimized monoclonal antibody that binds to B7-H3 and provides enhanced ADCC activity. Additional exemplary antibodies to B7-H3 are also provided.

(a) Эноблитузумаб(a) Enoblituzumab

[000203] Аминокислотная последовательность домена VH эноблитузумаба представляет собой (SEQ ID NO: 138) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000203] The amino acid sequence of the VH domain of enoblituzumab is (SEQ ID NO: 138) (CDR _H residues are underlined):

[000204] Аминокислотная последовательность VL домена эноблитузумаба представляет собой (SEQ ID NO: 139) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000204] The amino acid sequence of the VL domain of enoblituzumab is (SEQ ID NO: 139) (CDR _L residues are underlined):

(b) BRCA69D(b) BRCA69D

[000205] Антитело BRCA69D представляет собой мышиное моноклональное антитело к В7-Н3. Аминокислотная последовательность домена VH BRCA69D (SEQ ID NO: 140) представлена ниже (остатки CDR_H выделены подчеркиванием).[000205] The BRCA69D antibody is a mouse monoclonal antibody to B7-H3. The amino acid sequence of the VH domain of BRCA69D (SEQ ID NO: 140) is shown below (CDR _H residues are underlined).

[000206] Аминокислотная последовательность домена VL BRCA69D (SEQ ID NO: 141) представлена ниже (остатки CDR_L выделены подчеркиванием).[000206] The amino acid sequence of the VL domain of BRCA69D (SEQ ID NO: 141) is shown below (CDR _L residues are underlined).

(c) Гуманизированное BRCA69D(c) Humanized BRCA69D

[000207] Антитело BRCA69D было гуманизировано с получением двух вариантов доменов VH, VH1 hBRCA69D и VH2 hBRCA69D; и двух вариантов доменов VL, VL1 hBRCA69D и VL2 hBRCA69D, которые можно применять в любой комбинации VH/VL для получения функционального гуманизированного связывающего домена. Аминокислотные последовательности таких гуманизированных вариантов представлены ниже.[000207] The BRCA69D antibody has been humanized to produce two variant VH domains, VH1 hBRCA69D and VH2 hBRCA69D; and two VL domain variants, VL1 hBRCA69D and VL2 hBRCA69D, which can be used in any VH/VL combination to produce a functional humanized binding domain. The amino acid sequences of such humanized variants are presented below.

[000208] Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 hBRCA69D представляет собой (SEQ ID NO: 142) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000208] The amino acid sequence of the VH domain from VH1 hBRCA69D is (SEQ ID NO: 142) (CDR _H residues are underlined):

[000209] Аминокислотная последовательность домена VH из VH2 hBRCA69D представляет собой (SEQ ID NO: 143) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000209] The amino acid sequence of the VH domain from VH2 hBRCA69D is (SEQ ID NO: 143) (CDR _H residues are underlined):

[000210] Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 hBRCA69D представляет собой (SEQ ID NO: 144) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием).[000210] The amino acid sequence of the VL domain of hBRCA69D VL1 is (SEQ ID NO: 144) (CDR _L residues are underlined).

[000211] Аминокислотная последовательность домена VL из VL2 hBRCA69D представляет собой (SEQ ID NO: 145) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием).[000211] The amino acid sequence of the VL domain of hBRCA69D VL2 is (SEQ ID NO: 145) (CDR _L residues are underlined).

(d) PRCA157(d) PRCA157

[000212] Антитело PRCA157 представляет собой мышиное моноклональное антитело к В7-Н3. Аминокислотная последовательность домена VH PRCA157 представляет собой (SEQ ID NO: 146) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием).[000212] Antibody PRCA157 is a mouse monoclonal antibody to B7-H3. The amino acid sequence of the VH domain of PRCA157 is (SEQ ID NO: 146) (CDR _H residues are underlined).

[000213] Аминокислотная последовательность домена VL PRCA157 представляет собой (SEQ ID NO: 147) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием).[000213] The amino acid sequence of the PRCA157 VL domain is (SEQ ID NO: 147) (CDR _H residues are underlined).

(e) Гуманизированное антитело PRCA157(e) Humanized antibody PRCA157

[000214] Антитело PRCA157 было гуманизировано с получением одного гуманизированного домена VH, VH1 hPRCA157, и одного гуманизированного домена VL, VL1 hPRCA157, для получения функционального гуманизированного связывающего домена. Аминокислотные последовательности гуманизированного PRCA157 представлены ниже.[000214] The PRCA157 antibody was humanized to produce one humanized VH domain, VH1 hPRCA157, and one humanized VL domain, VL1 hPRCA157, to produce a functional humanized binding domain. The amino acid sequences of humanized PRCA157 are presented below.

[000215] Аминокислотная последовательность домена VH из VH1 hPRCA157 представляет собой (SEQ ID NO: 202) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000215] The amino acid sequence of the VH domain from VH1 hPRCA157 is (SEQ ID NO: 202) (CDR _H residues are underlined):

[000216] Аминокислотная последовательность домена VL из VL1 hPRCA157 представляет собой (SEQ ID NO: 203) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000216] The amino acid sequence of the VL domain from hPRCA157 VL1 is (SEQ ID NO: 203) (CDR _L residues are underlined):

(f) Другие антитела к B7-H3(f) Other antibodies to B7-H3

[000217] В дополнение к указанным выше предпочтительным связывающим молекулам, направленным против В7-Н3, согласно настоящему изобретению предусмотрено применение любой из следующих связывающих молекул, направленных против В7-Н3: LUCA1; BLA8; РА20; или SKN2 (см. патенты США №№7527969; 8779098 и РСТ публикацию патента WO 2004/001381); М30; сМ30; M30-H1-L1; М30-Н1-L2; M30-H1-L3; M30-H1-L4; M30-H1-L5; M30-H1-L6; M30-H1-L7; M30-H4-L1; М30-H4-L2; M30-H4-L3; и M30-H4-L4 (см. публикацию патента США 2013/0078234 и РСТ публикацию патента WO 2012/147713); и 8Н9 (см. патенты США №№7666424; 7737258; 7740845; 8148154; 8414892; 8501471; 9062110; публикацию патента США 2010/0143245 и РСТ публикацию патента WO 2008/116219).[000217] In addition to the above preferred anti-B7-H3 binding molecules, the present invention provides for the use of any of the following anti-B7-H3 binding molecules: LUCA1; BLA8; PA20; or SKN2 (see US patent No. 7527969; 8779098 and PCT patent publication WO 2004/001381); M30; sM30; M30-H1-L1; M30-H1-L2; M30-H1-L3; M30-H1-L4; M30-H1-L5; M30-H1-L6; M30-H1-L7; M30-H4-L1; M30-H4-L2; M30-H4-L3; and M30-H4-L4 (see US Patent Publication 2013/0078234 and PCT Patent Publication WO 2012/147713); and 8H9 (see US patents No. 7666424; 7737258; 7740845; 8148154; 8414892; 8501471; 9062110; US patent publication 2010/0143245 and PCT patent publication WO 2008/116219).

[000218] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×B7-H3 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH любого из BRCA69D, гуманизированного BRCA69D, PRCA157, гуманизированного PRCA157 или эноблитузумаба или любого другого антитела к В7-Н3, обеспеченного в настоящем документе; и более предпочтительно имеют 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH таких моноклональных антител к В7-Н3.[000218] The present invention particularly includes and covers CD137xB7-H3 binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 of the CDR _H domain of the VH of any of BRCA69D, humanized BRCA69D, PRCA157, humanized PRCA157 or enoblituzumab or any other anti-B7-H3 antibody provided herein; and more preferably have 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 of the VH CDR _H domain of such anti-B7-H3 monoclonal antibodies.

5. Антитела, которые связываются с GpA335. Antibodies that bind to GpA33

[000219] Трансмембранный гликопротеин А33 массой 43 кДа (gpA33) экспрессируется в >95% случаев всех колоректальных карцином (Heath, J.K. et al. (1997) «The Human А33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) «Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epitheliums, Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) «ЕрСАМ and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasias, J. Clin. Pathol. 59(3):260-263). Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к gpA33 можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Примерное антитело к gpA33 («МАВ-1 к gpA33») представлено ниже.[000219] The 43 kDa transmembrane glycoprotein A33 (gpA33) is expressed in >95% of all colorectal carcinomas (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epitheliums, Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N. A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasias, J. Clin. Pathol. 59(3):260-263 ). The epitope binding site of any anti-gpA33 antibody can be used in accordance with the present invention. An exemplary anti-gpA33 antibody (“anti-gpA33 MAB-1”) is provided below.

[000220] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к gpA33 представляет собой (SEQ ID NO: 148) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000220] The amino acid sequence of the VH domain of MAB-1 to gpA33 is (SEQ ID NO: 148) (CDR residues are underlined):

[000221] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-1 к gpA33 представляет собой (SEQ ID NO: 149) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000221] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-1 to gpA33 is (SEQ ID NO: 149) (CDR residues are underlined):

[000222] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×gpA33 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH моноклональных антител к gpA33 МАВ-1 к gpA33 или любого из моноклональных антител к gpA33, обеспеченных в WO 2015/026894.[000222] The present invention particularly includes and covers CD137xgpA33 binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL CDR _L region and/or 1, 2 or all 3 from the CDR _H domain VH of anti-gpA33 MAB-1 monoclonal antibodies or any of the anti-gpA33 monoclonal antibodies provided in WO 2015/026894.

6. Антитела, которые связываются с СЕАСАМ5 и СЕАСАМ66. Antibodies that bind to SEACAM5 and SEACAM6

[000223] Было обнаружено, что родственные карциноэмбриональному антигену молекулы клеточной адгезии 5 и 6 (СЕАСАМ5) и 6 (СЕАСАМ6) ассоциированы с различными типами рака, включая медуллярный рак щитовидной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, рак легких, разные виды рака головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак эндометрия, рак молочной железы, гематопоэтический рак, лейкоз и рак яичников (РСТ публикация №WO 2011/034660), и в частности, колоректальный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, немелкоклеточный рак легких (NSCL), карциному молочной железы, карциному щитовидной железы, карциному желудка, карциному яичников и карциному матки (Zheng, С. et al. (2011) «А Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity», PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11). Было обнаружено, что CEACAM5 сверхэкспрессируется в 90% случаев рака желудочно-кишечного тракта, колоректального рака и рака поджелудочной железы, в 70% клеток немелкоклеточного рака легких и в 50% случаев рака молочной железы (Thompson, J.A. et al. (1991) «Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives», J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366). Сверхэкспрессированная родственная карциноэмбриональному антигену молекула клеточной адгезии 6 (СЕАСАМ6) играет важную роль в инвазии и метастазировании различных видов рака человека, включая медуллярный рак щитовидной железы, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, рак легких, разные виды рака головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак эндометрия, рак молочной железы, гематопоэтический рак, лейкоз и рак яичников (РСТ публикация №WO 2011/034660; Deng, X., et al. (2014) «Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinomas, Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) «Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis», Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) «Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung», Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) «Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer», Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) «Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells», Eur. J. Cancer 44(12): 1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) «Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers», BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15). Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Примерные антитела к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 представлены ниже,[000223] Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules 5 and 6 (CEACAM5) and 6 (CEACAM6) have been found to be associated with various types of cancer, including medullary thyroid cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, cancer lung, various types of head and neck cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, endometrial cancer, breast cancer, hematopoietic cancer, leukemia and ovarian cancer (PCT publication no. WO 2011/034660), and in particular colorectal cancer , gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, non-small cell lung cancer (NSCL), breast carcinoma, thyroid carcinoma, gastric carcinoma, ovarian carcinoma and uterine carcinoma (Zheng, S. et al. (2011) “A Novel Anti- CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity,” PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11). CEACAM5 was found to be overexpressed in 90% of gastrointestinal, colorectal, and pancreatic cancers, 70% of non-small cell lung cancers, and 50% of breast cancers (Thompson, J.A. et al. (1991) "Carcinoembryonic" Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives," J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366). Overexpressed carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6) plays an important role in the invasion and metastasis of various human cancers, including medullary thyroid cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, lung cancer, various types of head cancer and neck, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer, endometrial cancer, breast cancer, hematopoietic cancer, leukemia and ovarian cancer (PCT Publication No. WO 2011/034660; Deng, X., et al. (2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinomas, Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) "Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumorigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis", Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) "Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung", Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) "Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer", Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) "Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells", Eur. J Cancer 44(12): 1770–1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) "Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers", BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15). The epitope binding site of any anti-CEACAM5/CEACAM6 antibody can be used in accordance with the present invention. Exemplary antibodies to CEACAM5/CEACAM6 are presented below,

(а) 16С3(a) 16С3

[000224] Аминокислотная последовательность домена VH гуманизированного антитела к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 16С3 (ЕР 2585476) представляет собой (SEQ ID NO: 150) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000224] The amino acid sequence of the VH domain of the humanized anti-CEACAM5/CEACAM6 antibody 16C3 (EP 2585476) is (SEQ ID NO: 150) (CDR residues are underlined):

[000225] Аминокислотная последовательность домена VL гуманизированного антитела к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 16С3 (ЕР 2585476) представляет собой (SEQ ID NO: 151) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000225] The amino acid sequence of the VL domain of the humanized anti-CEACAM5/CEACAM6 antibody 16C3 (EP 2585476) is (SEQ ID NO: 151) (CDR residues are underlined):

(b) hMN15(b) hMN15

[000226] Аминокислотная последовательность домена VH гуманизированного антитела к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 hMN15 (WO 2011/034660) представляет собой (SEQ ID NO: 152) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000226] The amino acid sequence of the VH domain of the humanized anti-CEACAM5/CEACAM6 antibody hMN15 (WO 2011/034660) is (SEQ ID NO: 152) (CDR residues are underlined):

[000227] Аминокислотная последовательность домена VL гуманизированного антитела к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 hMN15 (WO 2011/034660) представляет собой (SEQ ID NO: 153) (остатки CDR выделены подчеркиванием):[000227] The amino acid sequence of the VL domain of the humanized anti-CEACAM5/CEACAM6 antibody hMN15 (WO 2011/034660) is (SEQ ID NO: 153) (CDR residues are underlined):

[000228] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×CEACAM5/CEACAM6 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH моноклональных антител к СЕАСАМ5/СЕАСАМ6 16С3 или hMN15.[000228] The present invention particularly includes and covers CD137xCEACAM5/CEACAM6 binding molecules that contain a VL and/or VH domain, and/or 1, 2 or all 3 of the CDR _L region of VL and/or 1, 2 or all 3 of the CDR _H domain of the VH monoclonal antibodies to CEACAM5/CEACAM6 16C3 or hMN15.

7. Антитела, которые связываются с CD197. Antibodies that bind to CD19

[000229] CD19 (поверхностный антиген В-лимфоцитов В4, номер доступа в Genbank М28170) представляет собой компонент комплекса В-клеточного рецептора (BCR) и является положительным регулятором передачи сигналов с участием В-клеток, который модулирует порог активации В-клеток и гуморального иммунитета. CD19 является одним из наиболее повсеместно экспрессируемых антигенов в линии В-клеток и экспрессируется на >95% злокачественных В-клеточных опухолей, включая острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и неходжкинскую лимфому (NHL). В частности, экспрессия CD19 поддерживается на В-клеточных лимфомах, которые становятся устойчивыми к терапии, направленной против CD20 (Davis et al. (1999) «Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.» Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999). CD19 также был предложен в качестве мишени для лечения аутоиммунных заболеваний (Tedder (2009) «CD19: А Promising В Cell Target For Rheumatoid Arthritis», Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577).[000229] CD19 (B cell surface antigen B4, Genbank accession number M28170) is a component of the B cell receptor (BCR) complex and is a positive regulator of B cell signaling that modulates the threshold of B cell activation and humoral immunity. CD19 is one of the most ubiquitously expressed antigens in the B cell lineage and is expressed on >95% of B cell malignancies, including acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL), and non-Hodgkin lymphoma (NHL). In particular, CD19 expression is maintained in B-cell lymphomas that become resistant to anti-CD20 therapy (Davis et al. (1999) Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression ." Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999). CD19 has also been proposed as a target for the treatment of autoimmune diseases (Tedder (2009) "CD19: A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis", Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577).

[000230] Примерное антитело, которое связывается с человеческим CD19 и которое можно применять в настоящем изобретении, представляет собой антитело к CD19, раскрытое в WO 2016/048938 (называемое в настоящем документе «МАВ-1 к CD19»).[000230] An exemplary antibody that binds to human CD19 and that can be used in the present invention is the anti-CD19 antibody disclosed in WO 2016/048938 (referred to herein as “anti-CD19 MAB-1”).

[000231] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к CD19 (SEQ ID NO: 204) представлена ниже (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000231] The amino acid sequence of the VH domain of MAB-1 to CD19 (SEQ ID NO: 204) is presented below (CDR _H residues are underlined):

[000232] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-1 к CD19 (SEQ ID NO: 205) представлена ниже (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000232] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-1 to CD19 (SEQ ID NO: 205) is presented below (CDR _L residues are underlined):

[000233] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×CD19 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH моноклонального антитела к CD19 МАВ-1 к CD19 или любого из антител к CD19, раскрытых в патенте США US7112324, или присутствующих в блинатумомабе (блинцито (BLINCYTO^®); аминокислотная последовательность может быть найдена в WHO Drug Information, 2009, Recommended INN: List 62, 23(3):240-241) и дувортуксизумабе (известном как MGD011; аминокислотная последовательность может быть найдена в WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629). 8. Антитела, которые связываются с CD123[000233] The present invention particularly includes and covers CD137xCD19 binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL region CDR _L and/or 1, 2 or all 3 from the CDR _H domain of the VH of the anti-CD19 monoclonal antibody MAB-1 or any of the anti-CD19 antibodies disclosed in US Pat. No. 7,112,324 or present in blinatumomab ( ^BLINCYTO® ); the amino acid sequence can be found in WHO Drug Information, 2009, Recommended INN: List 62, 23(3):240-241) and duvortuxizumab (known as MGD011; amino acid sequence can be found in WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629). 8. Antibodies that bind to CD123

[000234] CD123 (альфа-субъединица рецептора интерлейкина 3, IL-3Ra) представляет собой молекулу массой 40 кДа и является частью рецепторного комплекса интерлейкина 3 (Stomski, F.C. et al. (1996) «Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulftde-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Bindings Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046). Интерлейкин 3 (ИЛ-3) запускает раннюю дифференцировку мультипотентных стволовых клеток в клетки эритроидных, миелоидных и лимфоидных предшественников. Сообщалось, что CD123 сверхэкспрессируется на злокачественных клетках при широком спектре гематологических злокачественных новообразований, включая острый миелолейкоз (ОМЛ) и миелодиспластический синдром (МДС) (, L. et al. (2001) «Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies», Haematologica 86(12):1261-1269). Сверхэкспрессия CD123 ассоциирована с более неблагоприятным прогнозом при ОМЛ (Tettamanti, M.S. et al. (2013) «Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors», Br. J. Haematol. 161:389-401).[000234] CD123 (interleukin 3 receptor alpha subunit, IL-3Ra) is a 40 kDa molecule and is part of the interleukin 3 receptor complex (Stomski, FC et al. (1996) "Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha-And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required for Receptor Activation But Not High-Affinity Bindings Mol Cell Biol 16(6):3035–3046). Interleukin 3 (IL-3) triggers the early differentiation of multipotent stem cells into erythroid, myeloid, and lymphoid progenitor cells. CD123 has been reported to be overexpressed on malignant cells in a wide range of hematological malignancies, including acute myeloid leukemia (AML) and myelodysplastic syndrome (MDS) ( , L. et al. (2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed in Hematologic Malignancies,” Haematologica 86(12):1261–1269). Overexpression of CD123 is associated with a poorer prognosis in AML (Tettamanti, MS et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors", Br. J. Haematol. 161 :389-401).

[000235] Примерное антитело, которое связывается с человеческим CD123 и которое можно применять в настоящем изобретении, представляет собой «МАВ-1 к CD123» (см., например, РСТ публикацию патента WO 2015/026892).[000235] An exemplary antibody that binds to human CD123 and that can be used in the present invention is “anti-CD123 MAB-1” (see, for example, PCT patent publication WO 2015/026892).

[000236] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к CD123 (SEQ ID NO: 206) представлена ниже (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000236] The amino acid sequence of the VH domain of MAB-1 to CD123 (SEQ ID NO: 206) is presented below (CDR _H residues are underlined):

[000237] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-1 к CD123 (SEQ ID NO: 207) представлена ниже (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000237] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-1 to CD123 (SEQ ID NO: 207) is presented below (CDR _L residues are underlined):

[000238] Настоящее изобретение, в частности, включает и охватывает CD137×CD123 связывающие молекулы, которые содержат домен VL и/или VH, и/или 1, 2 или все 3 из CDR_L области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR_H домена VH моноклонального антитела к CD123, МАВ-1 к CD123, или любого из антител к CD123, раскрытых в US 2017/081424 и WO 2016/036937, или присутствующих в JNJ-63709178 (Johnson & Johnson, см. также WO 2016/036937) и XmAb 14045 (Xencor, см. также US 2017/081424).[000238] The present invention particularly includes and covers CD137xCD123 binding molecules that contain a VL and/or VH domain and/or 1, 2 or all 3 of the VL region CDR _L and/or 1, 2 or all 3 from the CDR _H domain VH of an anti-CD123 monoclonal antibody, anti-CD123 MAB-1, or any of the anti-CD123 antibodies disclosed in US 2017/081424 and WO 2016/036937, or present in JNJ-63709178 (Johnson & Johnson, see also WO 2016/036937) and XmAb 14045 (Xencor, see also US 2017/081424).

G. Предпочтительные вариабельные домены CD137G. Preferred CD137 Variable Domains

[000239] Эпитопсвязывающий сайт любого антитела к CD137 можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Примерные антитела, которые связывают человеческий CD137, включают «урелумаб» и «утомилумаб», которые в настоящее время проходят оценку в клинических исследованиях с участием человека. Урелумаб (также известный как BMS-663513, обозначенный в настоящем документе «МАВ-1 к CD137») представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, имеющее константные области IgG4/каппа (см. патент США №8137667). Утомилумаб (также известный как PF-05082566, обозначенный в настоящем документе «МАВ-2 к CD137») представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, имеющее константные области IgC2/лямбда (см. патент США №8337850). Дополнительные примерные антитела, которые являются иммуноспецифичными для человеческого CD137 (обозначены «МАВ-3 к CD137», «МАВ-4 к CD137» и «МАВ-5 к CD137»), представлены ниже.[000239] The epitope binding site of any anti-CD137 antibody can be used in accordance with the present invention. Exemplary antibodies that bind human CD137 include urelumab and utomilumab, which are currently being evaluated in human clinical studies. Urelumab (also known as BMS-663513, referred to herein as “anti-CD137 MAB-1”) is a fully human monoclonal antibody having IgG4/kappa constant regions (see US Pat. No. 8,137,667). Utomilumab (also known as PF-05082566, referred to herein as “anti-CD137 MAB-2”) is a fully human monoclonal antibody having IgC2/lambda constant regions (see US Pat. No. 8,337,850). Additional exemplary antibodies that are immunospecific for human CD137 (designated "MAB-3 to CD137", "MAB-4 to CD137" and "MAB-5 to CD137") are presented below.

1. МАВ-1 к CD1371. MAB-1 to CD137

[000240] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-1 к CD137 (VH МАВ-1 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 70) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000240] The amino acid sequence of the MAB-1 anti-CD137 VH domain (MAB-1 anti-CD137 VH) is (SEQ ID NO: 70) (CDR _H residues are underlined):

[000241] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-1 к CD137 (VL МАВ-1 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 71) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000241] The amino acid sequence of the MAB-1 anti-CD137 VL domain (MAB-1 anti-CD137 VL) is (SEQ ID NO: 71) (CDR _L residues are underlined):

2. МАВ-2 к CD1372. MAV-2 to CD137

[000242] Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-2 к CD137 (VH к МАВ-2 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 72) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000242] The amino acid sequence of the VH domain of MAB-2 to CD137 (VH to MAB-2 to CD137) is (SEQ ID NO: 72) (CDR _H residues are underlined):

[000243] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-2 к CD137 (VL к МАВ-2 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 73) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000243] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-2 to CD137 (VL to MAB-2 to CD137) is (SEQ ID NO: 73) (CDR _L residues are underlined):

3. МАВ-3 к CD1373. MAB-3 to CD137

[000244] МАВ-3 к CD137 представляет собой новое мышиное моноклональное антитело. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-3 к CD137 (VH МАВ-3 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 74) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000244] Anti-CD137 MAB-3 is a novel murine monoclonal antibody. The amino acid sequence of the VH domain of MAB-3 to CD137 (VH of MAB-3 to CD137) is (SEQ ID NO: 74) (CDR _H residues are underlined):

[000245] Аминокислотные последовательности CDR_H из VH МАВ-3 к CD137 представляют собой:[000245] The amino acid sequences of the CDR _H from the MAB-3 VH to CD137 are:

CDR_H1 (SEQ ID NO: 154): SYWINCDR _H 1 (SEQ ID NO: 154): SYWIN

CDR_H2 (SEQ ID NO: 155): NIYPSDSYTNYNQKFKDCDR _H 2 (SEQ ID NO: 155): NIYPSDSYTNYNQKFKD

CDR_H3 (SEQ ID NO: 156): DYGSSYSFDYCDR _H 3 (SEQ ID NO: 156): DYGSSYSFDY

[000246] Аминокислотная последовательность домена VL МАВ-3 к CD137 (VL МАВ-3 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 75) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000246] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-3 to CD137 (VL of MAB-3 to CD137) is (SEQ ID NO: 75) (CDR _L residues are underlined):

[000247] Аминокислотные последовательности CDR_L из VL МАВ-3 к CD137 представляют собой:[000247] The amino acid sequences of CDR _L from VL MAB-3 to CD137 are:

CDR_L1 (SEQ ID NO: 157): RPSQDISNYLNCDR _L 1 (SEQ ID NO: 157): RPSQDISNYLN

CDR_L2 (SEQ ID NO: 158): YTSRLRSCDR _L 2 (SEQ ID NO: 158): YTSRLRS

CDR_L3 (SEQ ID NO: 159): QQGDTLPYTCDR _L 3 (SEQ ID NO: 159): QQGDTLPYT

4. hMAB-3 к CD1374. hMAB-3 to CD137

[000248] Антитело МАВ-3 к CD137 было гуманизировано с образованием антитела hMAB-3 к CD137. Аминокислотная последовательность домена VH такого гуманизированного антитела (VH1 hMAB-3 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 76) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000248] The anti-CD137 antibody MAB-3 was humanized to form the anti-CD137 antibody hMAB-3. The amino acid sequence of the VH domain of such a humanized antibody (VH1 hMAB-3 anti-CD137) is (SEQ ID NO: 76) (CDR _H residues are underlined):

[0002491 Домен VH гуманизированного антитела hMAB-3 к CD137 (VH1 hMAB-3 к CD137) был оптимизирован для получения домена VH, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77:[0002491 The VH domain of the humanized anti-CD137 antibody hMAB-3 (VH1 hMAB-3 anti-CD137) has been optimized to produce a VH domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77:

где: X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅ представляют собой:where: X ₁₀ X ₁₁ X ₁₂ X ₁₃ X ₁₄ X ₁₅ represent:

AYSFHP (1A; SEQ ID NO: 78), илиAYSFHP (1A; SEQ ID NO: 78), or

AYSMST (1B; SEQ ID NO: 79), илиAYSMST (1B; SEQ ID NO: 79), or

AYSYSL (1С; SEQ ID NO: 80), илиAYSYSL (1C; SEQ ID NO: 80), or

SYSYNV (1D; SEQ ID NO: 81).SYSYNV (1D; SEQ ID NO: 81).

[000250] Как указано выше, соответствующая исходная последовательность (присутствующая в SEQ ID NO: 74) представляет собой SYSFDY (SEQ ID NO: 160).[000250] As stated above, the corresponding parent sequence (present in SEQ ID NO: 74) is SYSFDY (SEQ ID NO: 160).

[000251] Домен VL гуманизированного антитела hMAB-3 к CD137 (VL hMAB-3 к CD137) был оптимизирован для получения домена VL, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82:[000251] The VL domain of the humanized anti-CD137 antibody hMAB-3 (hMAB-3 anti-CD137 VL) has been optimized to produce a VL domain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 82:

где: X₇ представляет собой D или G; X₈ представляет собой G или K.where: X ₇ represents D or G; X ₈ represents G or K.

[000252] Были выделены четыре варианта доменов VH1 hMAB-3 к CD137: VH1A hMAB-3 к CD137, VH1B hMAB-3 к CD137, VH1C hMAB-3 к CD137 и VH1D hMAB-3 к CD137. Аминокислотные последовательности таких вариантов доменов VH1 hMAB-3 к CD137 представлены ниже.[000252] Four hMAB-3 anti-CD137 VH1 domain variants have been identified: VH1A hMAB-3 anti-CD137, VH1B hMAB-3 anti-CD137, VH1C hMAB-3 anti-CD137, and VH1D hMAB-3 anti-CD137. The amino acid sequences of such variants of the VH1 domains of hMAB-3 to CD137 are presented below.

[000253] Аминокислотная последовательность VH1A hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 83) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 5-10 CDR₃H представляют собой AYSFHP (SEQ ID NO: 78):[000253] The amino acid sequence of hMAB-3 VH1A to CD137 is (SEQ ID NO: 83) (CDR _H residues are underlined; note that CDR ₃ H residues 5-10 are AYSFHP (SEQ ID NO: 78):

[000254] Аминокислотная последовательность VH1B hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 84) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 5-10 CDR₃H представляют собой AYSMST (SEQ ID NO: 79):[000254] The amino acid sequence of hMAB-3 VH1B to CD137 is (SEQ ID NO: 84) (CDR _H residues are underlined; note that CDR ₃ H residues 5-10 are AYSMST (SEQ ID NO: 79):

[000255] Аминокислотная последовательность VH1C hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 85) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 5-10 CDR₃H представляют собой AYSYSL (SEQ ID NO: 80):[000255] The amino acid sequence of hMAB-3 VH1C to CD137 is (SEQ ID NO: 85) (CDR _H residues are underlined; note that CDR ₃ H residues 5-10 are AYSYSL (SEQ ID NO: 80):

[000256] Аминокислотная последовательность VH1D hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 86) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 5-10 CDR₃H представляют собой SYSYNV (ID; SEQ ID NO: 81):[000256] The amino acid sequence of hMAB-3 VH1D to CD137 is (SEQ ID NO: 86) (CDR _H residues are underlined; note that CDR ₃ H residues 5-10 are SYSYNV (ID; SEQ ID NO: 81) :

[000257] Таким образом, аминокислотные последовательности CDR_H1 из VH1A hMAB-3 к CD137, VH1B hMAB-3 к CD137, VH1C hMAB-3 к CD137 и VH1D hMAB-3 к CD137 являются идентичными (SEQ ID NO: 154), и аминокислотные последовательности CDR_H2 из VH1A hMAB-3 к CD137, VH1B hMAB-3 к CD137, VH1C hMAB-3 к CD137 и VH1D hMAB-3 к CD137 являются идентичными (SEQ ID NO: 155). Однако аминокислотные последовательности CDR_H3 из VH1A hMAB-3 к CD137, VH1B hMAB-3 к CD137, VH1C hMAB-3 к CD137 и VH1D hMAB-3 к CD137 различаются:[000257] Thus, the amino acid sequences of CDR _H 1 of VH1A hMAB-3 to CD137, VH1B hMAB-3 to CD137, VH1C hMAB-3 to CD137 and VH1D hMAB-3 to CD137 are identical (SEQ ID NO: 154), and the amino acid sequences of CDR _H 2 from VH1A hMAB-3 to CD137, VH1B hMAB-3 to CD137, VH1C hMAB-3 to CD137 and VH1D hMAB-3 to CD137 are identical (SEQ ID NO: 155). However, the amino acid sequences of CDR _H 3 from VH1A hMAB-3 to CD137, VH1B hMAB-3 to CD137, VH1C hMAB-3 to CD137 and VH1D hMAB-3 to CD137 are different:

CDR_H3 из VH1A hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 161): DYGSAYSFHPCDR _H 3 from VH1A hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 161): DYGSAYSFHP

CDR_H3 из VH1B hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 162): DYGSAYSMSTCDR _H 3 from VH1B hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 162): DYGSAYSMST

CDR_H3 из VH1C hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 163): DYGSAYSYSLCDR _H 3 from VH1C hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 163): DYGSAYSYSL

CDR_H3 из VH1D hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 164): DYGSSYSYNVCDR _H 3 from VH1D hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 164): DYGSSYSYNV

[000258] Были выделены три варианта доменов VL hMAB-3 к CD137: VL1 hMAB-3 к CD137, VL2 hMAB-3 к CD137 и VL3 hMAB-3 к CD137. Аминокислотные последовательности таких вариантов доменов VL hMAB-3 к CD137 представлены ниже.[000258] Three variant hMAB-3 anti-CD137 VL domains have been identified: VL1 hMAB-3 anti-CD137, VL2 hMAB-3 anti-CD137, and VL3 hMAB-3 anti-CD137. The amino acid sequences of such variants of hMAB-3 VL domains to CD137 are presented below.

[000259] Аминокислотная последовательность VL1 hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 87) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 41 и 42 представляют собой D и G, соответственно):[000259] The amino acid sequence of hMAB-3 VL1 to CD137 is (SEQ ID NO: 87) (CDR _L residues are underlined; note that residues 41 and 42 are D and G, respectively):

[000260] Аминокислотная последовательность VL2 hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 88) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 41 и 42 оба представляют собой G):[000260] The amino acid sequence of hMAB-3 VL2 to CD137 is (SEQ ID NO: 88) (CDR _L residues are underlined; note that residues 41 and 42 are both G):

[000261] Аминокислотная последовательность VL3 hMAB-3 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 89) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что остатки 41 и 42 представляют собой D и K, соответственно):[000261] The amino acid sequence of hMAB-3 VL3 to CD137 is (SEQ ID NO: 89) (CDR _L residues are underlined; note that residues 41 and 42 are D and K, respectively):

[000262] Домен VH из VH1B hMAB-3 к CD137 был деиммунизирован, как описано в примерах ниже. Аминокислотные последовательности трех полученных деиммунизированных доменов VH, обозначенных VH1E hMAB-3 к CD137, VH1F hMAB-3 к CD137 и VH1G hMAB-3 к CD137, имеющих замену аминокислотного остатка в положении 38 и/или 48 согласно Kabat, представлены ниже. Конкретно предусмотрено, что выявленные замены R38K и/или I48A могут быть включены в любой из раскрытых доменов VH hMAB-3 к CD137. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения замена аминокислоты K38R включена в SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 или SEQ ID NO: 86.[000262] The VH domain of hMAB-3 VH1B to CD137 was deimmunized as described in the examples below. The amino acid sequences of the three deimmunized VH domains obtained, designated VH1E hMAB-3 anti-CD137, VH1F hMAB-3 anti-CD137 and VH1G hMAB-3 anti-CD137, having an amino acid residue substitution at position 38 and/or 48 according to Kabat, are presented below. It is specifically contemplated that the identified R38K and/or I48A substitutions may be included in any of the disclosed hMAB-3 VH domains to CD137. In a specific embodiment of the present invention, the K38R amino acid substitution is included in SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, or SEQ ID NO: 86.

[000263] Аминокислотная последовательность VH1E hMAB-3 к CD137, содержащая K38R, представляет собой (SEQ ID NO: 208) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замена выделена двойным подчеркиванием):[000263] The amino acid sequence of hMAB-3 VH1E to CD137 containing K38R is (SEQ ID NO: 208) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000264] Аминокислотная последовательность VH1F hMAB-3 к CD137, содержащая I48A, представляет собой (SEQ ID NO: 209) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000264] The amino acid sequence of hMAB-3 VH1F to CD137 containing I48A is (SEQ ID NO: 209) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000265] Аминокислотная последовательность VH1G hMAB-3 к CD137, содержащая K38R/I48A (SEQ ID NO: 210) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000265] Amino acid sequence of hMAB-3 VH1G to CD137 containing K38R/I48A (SEQ ID NO: 210) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000266] Домен VL из VL3 hMAB-3 к CD137 был деиммунизирован, как описано в примерах ниже. Аминокислотные последовательности двенадцати из полученных деиммунизированных доменов VL, обозначенных VL4-VL15 hMAB-3 к CD137, имеющих замену остатка аминокислоты в положении 24, 25, 44, 48, 52 и/или 54 согласно Kabat, представлены ниже. Конкретно предусмотрено, что выявленные замены, R24Q, Р25А, V44A, I48A, S52T, S52G и/или L54A, могут быть включены в любой из раскрытых доменов VL hMAB-3 к CD137, представленных выше, с получением деиммунизированного домена VL. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения замены аминокислот R24Q, Р25А, I48A, S52G и L54A включены в SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 89. Согласно другому конкретному варианту реализации замены аминокислот R24Q, Р25А, 148A, S52T и L54A включены в SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 или SEQ ID NO: 89.[000266] The VL domain of hMAB-3 VL3 to CD137 was deimmunized as described in the examples below. The amino acid sequences of twelve of the resulting deimmunized VL domains, designated VL4-VL15 hMAB-3 to CD137, having amino acid residue substitutions at positions 24, 25, 44, 48, 52 and/or 54 according to Kabat are presented below. It is specifically contemplated that the identified substitutions, R24Q, P25A, V44A, I48A, S52T, S52G and/or L54A, can be incorporated into any of the disclosed hMAB-3 anti-CD137 VL domains presented above to produce a deimmunized VL domain. In a specific embodiment of the present invention, the amino acid substitutions R24Q, P25A, I48A, S52G, and L54A are included in SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, or SEQ ID NO: 89. In another specific embodiment of the amino acid substitution R24Q, P25A, 148A, S52T, and L54A are included in SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, or SEQ ID NO: 89.

[000267] Аминокислотная последовательность VL4 hMAB-3 к CD137, содержащая R24Q/P25A, представляет собой (SEQ ID NO: 211) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000267] The amino acid sequence of VL4 hMAB-3 to CD137 containing R24Q/P25A is (SEQ ID NO: 211) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000268] Аминокислотная последовательность VL5 hMAB-3 к CD137, содержащая V44A, представляет собой (SEQ ID NO: 212) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замена выделена двойным подчеркиванием):[000268] The amino acid sequence of hMAB-3 anti-CD137 VL5 containing V44A is (SEQ ID NO: 212) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000269] Аминокислотная последовательность VL6 hMAB-3 к CD137, содержащая L54A, представляет собой (SEQ ID NO: 213) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замена выделена двойным подчеркиванием):[000269] The amino acid sequence of hMAB-3 anti-CD137 VL6 containing L54A is (SEQ ID NO: 213) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000270] Аминокислотная последовательность VL7 hMAB-3к CD137, содержащая R24Q/P25A/V44A, представляет собой (SEQ ID NO: 214) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000270] The amino acid sequence of VL7 hMAB-3k CD137 containing R24Q/P25A/V44A is (SEQ ID NO: 214) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000271] Аминокислотная последовательность VL8 hMAB-3к CD137, содержащая R24Q/P25A/V44A/L54A, представляет собой (SEQ ID NO: 215) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000271] The amino acid sequence of hMAB-3k CD137 VL8 containing R24Q/P25A/V44A/L54A is (SEQ ID NO: 215) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000272] Аминокислотная последовательность VL9 hMAB-3 к CD137, содержащая R24Q/P25A/L54A, представляет собой (SEQ ID NO: 216) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000272] The amino acid sequence of VL9 hMAB-3 to CD137 containing R24Q/P25A/L54A is (SEQ ID NO: 216) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000273] Аминокислотная последовательность VL10 hMAB-3 к CD137, содержащая S52T, представляет собой (SEQ ID NO: 217) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000273] The amino acid sequence of hMAB-3 VL10 to CD137 containing S52T is (SEQ ID NO: 217) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000274] Аминокислотная последовательность VL11 hMAB-3 к CD137, содержащая S52G, представляет собой (SEQ ID NO: 218) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000274] The amino acid sequence of hMAB-3 VL11 to CD137 containing S52G is (SEQ ID NO: 218) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000275] Аминокислотная последовательность VL12 hMAB-3 к CD137, содержащая I48A/S52T, представляет собой (SEQ ID NO: 219) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000275] The amino acid sequence of VL12 hMAB-3 to CD137 containing I48A/S52T is (SEQ ID NO: 219) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000276] Аминокислотная последовательность VL13 hMAB-3 к CD137, содержащая I48A/S52G, представляет собой (SEQ ID NO: 220) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000276] The amino acid sequence of VL13 hMAB-3 to CD137 containing I48A/S52G is (SEQ ID NO: 220) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000277] Аминокислотная последовательность VL14 hMAB-3к CD137, содержащая R24Q/P25A/S52T/L54A, представляет собой (SEQ ID NO: 221) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000277] The amino acid sequence of VL14 hMAB-3k CD137 containing R24Q/P25A/S52T/L54A is (SEQ ID NO: 221) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000278] Аминокислотная последовательность VL15 hMAB-3к CD137, содержащая R24Q/P25A/S52G/L54A, представляет собой (SEQ ID NO: 222) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием; замены выделены двойным подчеркиванием):[000278] The amino acid sequence of VL15 hMAB-3k CD137 containing R24Q/P25A/S52G/L54A is (SEQ ID NO: 222) (CDR _H residues are underlined; substitutions are double underlined):

[000279] Таким образом, аминокислотные последовательности CDR_L3 из VL3-VL15 hMAB-3 к CD137 являются идентичными (QQGDTLPYT; SEQ ID NO: 159). Однако аминокислотные последовательности CDR_L1 и/или CDR_L2 из VL4 hMAB-3 к CD137 и VL6-VL15 hMAB-3 к CD137 различаются:[000279] Thus, the amino acid sequences of CDR _L 3 from VL3-VL15 hMAB-3 to CD137 are identical (QQGDTLPYT; SEQ ID NO: 159). However, the amino acid sequences of CDR _L 1 and/or CDR _L 2 from VL4 hMAB-3 to CD137 and VL6-VL15 hMAB-3 to CD137 differ:

[000280] CDR_L1 из VL4, VL7, VL8, VL9, VL14 и VL15 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 223): [000280] CDR _L 1 of hMAB-3 VL4, VL7, VL8, VL9, VL14 and VL15 to CD137 (SEQ ID NO: 223):

CDR_L2 из VL6, VL8 и VL9 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 224): CDR _L 2 from VL6, VL8 and VL9 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 224):

CDR_L2 из VL10 и VL12 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 225): CDR _L 2 from VL10 and VL12 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 225):

CDR_L2 из VL11 и VL13 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 226): CDR _L 2 from VL11 and VL13 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 226):

CDR_L2 из VL14 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 227): CDR _L 2 from VL14 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 227):

CDR_L2 из VL15 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 228): CDR _L 2 from VL15 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 228):

[000281] CDR, домен VL и/или домен VH любого из таких гуманизированных, оптимизированных и/или деиммунизированных доменов VH и VL hMAB-3 к CD137, включая любые включенные в общую(ие) последовательность(и) доменов VH и/или VL hMAB-3 к CD137, представленных выше, можно применять для образования антитела, диатела или связывающей молекулы, способной связывать CD137.[000281] CDR, VL domain and/or VH domain of any such humanized, optimized and/or deimmunized VH and VL domains of hMAB-3 to CD137, including any included in the general sequence(s) of VH and/or VL domains The anti-CD137 hMAB-3 presented above can be used to form an antibody, diabody, or binding molecule capable of binding CD137.

5. МАВ-4 к CD1375. MAV-4 to CD137

[000282] МАВ-4 к CD137 представляет собой новое мышиное моноклональное антитело. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-4 к CD137 (VH МАВ-4 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 90) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000282] Anti-CD137 MAB-4 is a novel murine monoclonal antibody. The amino acid sequence of the VH domain of MAB-4 to CD137 (VH of MAB-4 to CD137) is (SEQ ID NO: 90) (CDR _H residues are underlined):

[000283] Аминокислотные последовательности CDR_H из VH MAB-4 к CD137 представляют собой:[000283] The amino acid sequences of the CDR _H from the MAB-4 VH to CD137 are:

CDR_H1 (SEQ ID NO: 165): SYWINCDR _H 1 (SEQ ID NO: 165): SYWIN

CDR_H2 (SEQ ID NO: 166): NIYPSDSYTNYDQKFKDCDR _H 2 (SEQ ID NO: 166): NIYPSDSYTNYDQKFKD

CDR_H3 (SEQ ID NO: 167): SGEYGKIGYYAMDYCDR _H 3 (SEQ ID NO: 167): SGEYGKIGYYAMDY

[000284] Аминокислотная последовательность домена VL MAB-4 к CD137 (VL MAB-4 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 91) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000284] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-4 to CD137 (VL MAB-4 to CD137) is (SEQ ID NO: 91) (CDR _L residues are underlined):

[000285] Аминокислотные последовательности CDR_L из VL MAB-4 к CD137 представляют собой:[000285] The amino acid sequences of CDR _L from VL MAB-4 to CD137 are:

CDR_L1 (SEQ ID NO: 168): RASQDISNYLNCDR _L 1 (SEQ ID NO: 168): RASQDISNYLN

CDR_L2 (SEQ ID NO: 169): YTSRLHSCDR _L 2 (SEQ ID NO: 169): YTSRLHS

CDR_L3 (SEQ ID NO: 170): QQGNTLPYTCDR _L 3 (SEQ ID NO: 170): QQGNTLPYT

6. hMAB-4 к CD1376. hMAB-4 to CD137

[000286] Антитело MAB-4 к CD137 было гуманизировано с образованием антитела hMAB-4 к CD137. Аминокислотная последовательность домена VH гуманизированного антитела hMAB-4 к CD137 (VH1 hMAB-4 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 92) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000286] The anti-CD137 antibody MAB-4 was humanized to form the anti-CD137 antibody hMAB-4. The amino acid sequence of the VH domain of the humanized anti-CD137 antibody hMAB-4 (VH1 hMAB-4 anti-CD137) is (SEQ ID NO: 92) (CDR _H residues are underlined):

[000287] Домен VL гуманизированного антитела hMAB-4 к CD137 был гуманизирован и оптимизирован для получения домена VL (VL hMAB-3 к CD137), имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93 (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000287] The VL domain of the humanized anti-CD137 antibody hMAB-4 has been humanized and optimized to produce a VL domain (hMAB-3 anti-CD137 VL) having the amino acid sequence SEQ ID NO: 93 (CDR _L residues are underlined):

где Х₉ представляет собой F или Y.where X ₉ represents F or Y.

[000288] Были выделены два варианта доменов VL hMAB-4 к CD137: VL1 hMAB-4 к CD137 и VL2 hMAB-4 к CD137. Аминокислотные последовательности таких вариантов доменов VL hMAB-4 к CD137 представлены ниже.[000288] Two variant hMAB-4 anti-CD137 VL domains have been identified: VL1 hMAB-4 anti-CD137 and VL2 hMAB-4 anti-CD137. The amino acid sequences of such variants of hMAB-4 VL domains to CD137 are presented below.

[000289] Аминокислотная последовательность VL1 hMAB-4 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 94) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что остаток 87 представляет собой F):[000289] The amino acid sequence of hMAB-4 VL1 to CD137 is (SEQ ID NO: 94) (CDR _L residues are underlined; note that residue 87 is F):

[000290] Аминокислотная последовательность VL2 hMAB-4 к CD137 представляет собой (SEQ ID NO: 95) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием; следует отметить, что остаток 87 представляет собой Y):[000290] The amino acid sequence of hMAB-4 VL2 to CD137 is (SEQ ID NO: 95) (CDR _L residues are underlined; note that residue 87 is Y):

7. MAB-5 к CD1377. MAB-5 to CD137

[000291] MAB-5 к CD137 представляет собой новое мышиное моноклональное антитело. Аминокислотная последовательность домена VH МАВ-5 к CD137 (VH МАВ-5 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 96) (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000291] Anti-CD137 MAB-5 is a novel murine monoclonal antibody. The amino acid sequence of the VH domain of MAB-5 to CD137 (VH of MAB-5 to CD137) is (SEQ ID NO: 96) (CDR _H residues are underlined):

[000292] Аминокислотные последовательности CDR_H из VH МАВ-5 к CD137 представляют собой:[000292] The amino acid sequences of the CDR _H from the VH of MAB-5 to CD137 are:

CDR_H1 (SEQ ID NO: 171): SYDISCDR _H 1 (SEQ ID NO: 171): SYDIS

CDR_H2 (SEQ ID NO: 172): VWTGGGTNYNSAFMSCDR _H 2 (SEQ ID NO: 172): VWTGGGTNYNSAFMS

CDR_H3 (SEQ ID NO: 173): VDYCDR _H 3 (SEQ ID NO: 173): VDY

[000293] Аминокислотная последовательность домена VL MAB-5 к CD137 (VL MAB-5 к CD137) представляет собой (SEQ ID NO: 97) (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000293] The amino acid sequence of the VL domain of MAB-5 to CD137 (VL MAB-5 to CD137) is (SEQ ID NO: 97) (CDR _L residues are underlined):

[000294] Аминокислотные последовательности CDR_L из VL MAB-5 к CD137 представляют собой:[000294] The amino acid sequences of CDR _L from VL MAB-5 to CD137 are:

CDR_L1 (SEQ ID NO: 174): RSSQSLVHSNGNTYLHCDR _L 1 (SEQ ID NO: 174): RSSQSLVHSNGNTYLH

CDR_L2 (SEQ ID NO: 175): KVSNRFSCDR _L 2 (SEQ ID NO: 175): KVSNRFS

CDR_L3 (SEQ ID NO: 176): SQSTHVPWTCDR _L 3 (SEQ ID NO: 176): SQSTHVPWT

III. CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретениюIII. CD137xTA binding molecules according to the present invention

[000295] Настоящее изобретение, в частности, относится к трехвалентным CD137×TA связывающим молекулам, которые содержат домен Fc, Fc-несущим CD137×TA диателам DART^®, способным одновременно связываться с CD137 и ТА, и другим Fc-несущим CD137×TA связывающим молекулам, способным одновременно связываться с CD137 и ТА. Настоящее изобретение также относится к применению таких молекул в лечении рака и других заболеваний и состояний. Несмотря на то, что неоптимизированные CD137×TA связывающие молекулы являются полностью функциональными, также как и в случае улучшений, достигнутых в экспрессии генов за счет оптимизации кодонов (см., например, Grosjean, Н. et al. (1982) «Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes» Gene 18(3): 199-209), существует возможность дополнительного улучшения стабильности и/или функции CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению путем модификации или оптимизации их последовательности.[000295] The present invention particularly relates to trivalent CD137×TA binding molecules that contain an Fc domain, Fc-bearing CD137×TA ^DART® diabodies capable of simultaneously binding to CD137 and TA, and other Fc-bearing CD137×TA binding molecules that can simultaneously bind to CD137 and TA. The present invention also relates to the use of such molecules in the treatment of cancer and other diseases and conditions. Although non-optimized CD137xTA binding molecules are fully functional, so are the improvements achieved in gene expression through codon optimization (see, for example, Grosjean, H. et al. (1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes" Gene 18(3): 199-209), it is possible to further improve the stability and/or function of the CD137xTA binding molecules of the present invention by modification or optimization of their sequence.

A. CD137×TA Fc-несущие диатела DART^® A. CD137×TA Fc-carrying diabodies DART ^®

[000296] Настоящее изобретение, в частности, охватывает широкий спектр Fc-несущих диател DART^®, способных одновременно связываться с CD137 и ТА. Примерные CD137×TA Fc-несущие диатела DART^® описаны ниже.[000296] The present invention, in particular, covers a wide range of Fc-carrying DART ^® diabodies capable of simultaneously binding to CD137 and TA. Exemplary CD137xTA Fc-carrying ^DART® diabodies are described below.

[000297] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения такие Fc-несущие антитела будут содержать две полипептидные цепи. Как показано на Фигуре 2, первая из таких полипептидных цепей может содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, вариабельный домен легкой цепи (VL), способный связываться с эпитопом «первого» антигена (VL1) (CD137 или ТА), вариабельный домен тяжелой цепи (VH), способный связываться с эпитопом «второго» антигена (VH2) (ТА, если VL1 был выбран для связывания с эпитопом CD137; CD137, если VL1 был выбран для связывания с эпитопом ТА), цистеинсодержащий линкер, домен СН2-СН3 и С-конец. Вторая из таких полипептидных цепей может содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, вариабельный домен легкой цепи (VL), способный связываться с эпитопом «второго» антигена (VL2) (ТА, если первым антигеном был CD137; CD137, если первым антигеном был ТА), вариабельный домен тяжелой цепи (VH), способный связываться с эпитопом «второго» антигена (VH2) (ТА, если VL2 был выбран для связывания с эпитопом CD137; CD137, если VL2 был выбран для связывания с эпитопом ТА), цистеинсодержащий линкер, домен СН2-СН3 и С-конец. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет вариабельный домен легкой цепи (VL1 или VL2) от вариабельного домена тяжелой цепи (VH1 или VH2).[000297] According to one embodiment of the present invention, such Fc-bearing antibodies will contain two polypeptide chains. As shown in Figure 2, the first of such polypeptide chains may contain, in an N-terminal to C-terminal direction, an N-terminal light chain variable domain (VL) capable of binding to an epitope of the “first” antigen (VL1) (CD137 or TA), a heavy chain variable domain (VH) capable of binding to the epitope of the “second” antigen (VH2) (TA if VL1 was selected to bind to the CD137 epitope; CD137 if VL1 was selected to bind to the TA epitope), cysteine-containing linker, CH2-CH3 domain and C-terminus. The second of such polypeptide chains may contain, in an N-terminal to C-terminal direction, an N-terminal light chain variable domain (VL) capable of binding to an epitope of a “second” antigen (VL2) (TA if the first antigen was CD137 ; CD137, if the first antigen was TA), a heavy chain variable domain (VH) capable of binding to the epitope of the “second” antigen (VH2) (TA, if VL2 was selected to bind to the CD137 epitope; CD137, if VL2 was selected to bind with the TA epitope), cysteine-containing linker, CH2-CH3 domain and C-terminus. An intermediate linker peptide (linker 1) separates the light chain variable domain (VL1 or VL2) from the heavy chain variable domain (VH1 or VH2).

[000298] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения Fc-несущие антитела согласно настоящему изобретению содержат три полипептидные цепи и изображены на Фигурах 4А-4В. Первая полипептидная цепь такого диатела содержит четыре домена: (i) VL1-содержащий домен, (ii) VH2-содержащий домен, (iii) домен, который способствует гетеродимеризации («домен, способствующий образованию гетеродимера») и образованию ковалентной связи со второй полипептидной цепью диатела, и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3. Вторая полипептидная цепь таких Fc-содержащих диател содержит: (i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации («домен, способствующий образованию гетеродимера») и образованию ковалентной связи с первой полипептидной цепью диатела. Третья полипептидная цепь таких Fc-несущих диател содержит последовательность СН2-СН3. Таким образом, первая и вторая полипептидные цепи таких Fc-несущих диател объединяются с образованием сайта связывания VL1/VH1, который способен связываться с первым эпитопом (1), а также сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом (2). Предпочтительные Fc-несущие диатела согласно настоящему изобретению представляют собой CD137×TA биспецифические диатела, которые способны связываться с «первым эпитопом», который может представлять собой либо CD137, либо ТА, и «вторым эпитопом», который представляет собой ТА, если первым эпитопом является CD137, и CD137, если первым эпитопом является ТА. Первый и второй полипептиды связаны друг с другом за счет одной или более дисульфидных связей с участием остатков цистеина в их соответствующих линкерах и/или третьих доменах. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи образуют комплекс друг с другом с образованием домена Fc, который стабилизирован за счет дисульфидной связи. Такие диатела обладают повышенной активностью. Предпочтительные Fc-несущие диатела согласно настоящему изобретению могут иметь одну из двух ориентации (таблица 2):[000298] According to another embodiment of the present invention, the Fc-bearing antibodies of the present invention contain three polypeptide chains and are depicted in Figures 4A-4B. The first polypeptide chain of such a diabody contains four domains: (i) a VL1-containing domain, (ii) a VH2-containing domain, (iii) a domain that promotes heterodimerization (“heterodimer formation domain”) and the formation of a covalent bond with the second polypeptide chain diabodies, and (iv) a domain containing the CH2-CH3 sequence. The second polypeptide chain of such Fc-containing diabodies contains: (i) a VL2-containing domain, (ii) a VH1-containing domain, and (iii) a domain that promotes heterodimerization (“heterodimer formation domain”) and formation of a covalent bond with the first polypeptide diabody chain. The third polypeptide chain of such Fc-carrying diabodies contains the sequence CH2-CH3. Thus, the first and second polypeptide chains of such Fc-bearing diabodies combine to form a VL1/VH1 binding site that is capable of binding to the first epitope (1), as well as a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to the second epitope (2). Preferred Fc-bearing diabodies of the present invention are CD137×TA bispecific diabodies that are capable of binding to a “first epitope” which may be either CD137 or TA, and a “second epitope” which is TA if the first epitope is CD137, and CD137 if the first epitope is TA. The first and second polypeptides are linked to each other by one or more disulfide bonds involving cysteine residues in their respective linkers and/or third domains. Notably, the first and third polypeptide chains form a complex with each other to form an Fc domain, which is stabilized by a disulfide bond. Such diabodies have increased activity. Preferred Fc-carrying diabodies according to the present invention can have one of two orientations (Table 2):

[000299] Как показано на Фигуре 4А, в первом варианте реализации, первая из таких трех полипептидных цепей может содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, вариабельный домен легкой цепи (VL), способный связываться с эпитопом «первого» антигена (VL1) (либо CD137, либо ТА), вариабельный домен тяжелой цепи (VH), способный связываться с эпитопом «второго» антигена (VH2) (ТА в качестве первого антигена, если вторым антигеном являлся CD137; CD137 в качестве первого антигена, если вторым антигеном являлся ТА), цистеинсодержащий домен, домен, способствующий образованию гетеродимера, второй цистеинсодержащий домен, домен СН2-СН3 и С-конец. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет вариабельный домен легкой цепи (VL1) от вариабельного домена тяжелой цепи (VH2). Предпочтительно вариабельный домен тяжелой цепи (VH1) соединен с доменом, способствующим образованию гетеродимера, промежуточным линкерным пептидом (линкер 2). Согласно предпочтительному варианту реализации CD137×TA биспецифического Fc-несущего диатела С-конец домена, способствующего образованию гетеродимера, соединен с доменами СН2-СН3 области Fc («домен Fc») с помощью промежуточного линкерного пептида (линкер 3) или промежуточного пептидного спейсера (линкер 3). Таким образом, наиболее предпочтительно первая из трех полипептидных цепей будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу: VL1 - линкер 1 - VH2 - линкер 2 - домен, способствующий образованию гетеродимера, - линкер 3 - домен Fc.[000299] As shown in Figure 4A, in a first embodiment, the first of such three polypeptide chains may comprise, in an N-terminal to C-terminal direction, an N-terminal light chain variable domain (VL) capable of binding to an epitope "first" antigen (VL1) (either CD137 or TA), a heavy chain variable domain (VH) capable of binding to an epitope of the "second" antigen (VH2) (TA as the first antigen if the second antigen was CD137; CD137 as the first antigen, if the second antigen was TA), a cysteine-containing domain, a domain promoting heterodimer formation, a second cysteine-containing domain, a CH2-CH3 domain, and the C-terminus. An intermediate linker peptide (linker 1) separates the light chain variable domain (VL1) from the heavy chain variable domain (VH2). Preferably, the heavy chain variable domain (VH1) is connected to the heterodimer formation domain by an intermediate linker peptide (linker 2). In a preferred embodiment of the CD137×TA bispecific Fc-carrying diabody, the C-terminus of the heterodimer-promoting domain is linked to the CH2-CH3 domains of the Fc region (“Fc domain”) via a linker peptide intermediate (linker 3) or a peptide spacer intermediate (linker 3). Thus, most preferably, the first of the three polypeptide chains will contain, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: VL1 - linker 1 - VH2 - linker 2 - heterodimer formation domain - linker 3 - Fc domain.

[000300] Вторая из таких трех полипептидных цепей будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу: N-конец, вариабельный домен легкой цепи (VL), способный связываться с эпитопом «второго» антигена (VL2), вариабельный домен тяжелой цепи (VH), способный связываться с эпитопом «первого» антигена (VH1), цистеинсодержащий домен, домен, способствующий образованию гетеродимера, и С-конец. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет вариабельный домен легкой цепи (VL2) от вариабельного домена тяжелой цепи (VH1). Предпочтительно вариабельный домен тяжелой цепи (VH1) соединен с доменом, способствующим образованию гетеродимера, промежуточным линкерным пептидом (линкер 2). Таким образом, наиболее предпочтительно вторая из трех полипептидных цепей будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу: VL2 - линкер 1 - VH1 - линкер 2 - домен, способствующий образованию гетеродимера.[000300] The second of such three polypeptide chains will contain, in the direction from N-terminus to C-terminus: N-terminus, a light chain variable domain (VL) capable of binding to the epitope of a “second” antigen (VL2), a heavy chain variable domain chain (VH), capable of binding to the epitope of the “first” antigen (VH1), a cysteine-containing domain, a domain that promotes heterodimer formation, and the C-terminus. An intermediate linker peptide (linker 1) separates the light chain variable domain (VL2) from the heavy chain variable domain (VH1). Preferably, the heavy chain variable domain (VH1) is connected to the heterodimer formation domain by an intermediate linker peptide (linker 2). Thus, most preferably, the second of the three polypeptide chains will contain, in the direction from the N-terminus to the C-terminus: VL2 - linker 1 - VH1 - linker 2 - heterodimer formation domain.

[000301] Третья из таких трех полипептидных цепей будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу, цистеинсодержащий пептид (такой как линкер 3) и домены СН2-СН3 области Fc («домен Fc»). Поскольку третья полипептидная цепь не содержит домен VL или домен VH, третья полипептидная цепь может быть идентична в двух или более различных CD137×TA биспецифических Fc-несущих диателах согласно настоящему изобретению.[000301] The third of such three polypeptide chains will contain, in an N-terminal to C-terminal direction, a cysteine-containing peptide (such as linker 3) and the CH2-CH3 domains of an Fc region (“Fc domain”). Since the third polypeptide chain does not contain a VL domain or a VH domain, the third polypeptide chain may be identical in two or more different CD137xTA bispecific Fc-bearing diabodies according to the present invention.

[000302] Согласно другому варианту, как показано на Фигуре 4В, во втором варианте реализации, первая из таких трех полипептидных цепей будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, цистеинсодержащий пептид (такой как линкер 3), домены СН2-СН3 области Fc («домен Fc»), промежуточный спейсерный пептид (линкер 4), вариабельный домен легкой цепи (VL), способный связываться с эпитопом «первого» антигена (VL1) (либо CD137, либо ТА), вариабельный домен тяжелой цепи (VH), способный связываться с эпитопом «второго» антигена (VH2) (ТА, если первым антигеном являлся CD137; CD137, если первым антигеном являлся ТА), цистеинсодержащий линкер, домен, способствующий образованию гетеродимера, и С-конец. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет вариабельный домен легкой цепи (VL1) от вариабельного домена тяжелой цепи (VH2). Предпочтительно вариабельный домен тяжелой цепи (VH1) соединен с доменом, способствующим образованию гетеродимера, с помощью промежуточного линкерного пептида (линкер 2). Наиболее предпочтительно, в такой альтернативной ориентации, первая из трех полипептидных цепей, соответственно, будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу: линкер 3 - домен Fc - линкер 4 - VL1 - линкер 1 - VH2 - линкер 2 - домен, способствующий образованию гетеродимера. Вторая и третья полипептидные цепи такого альтернативного диатела могут быть идентичны второй и третьей полипептидным цепям из первого варианта реализации.[000302] In another embodiment, as shown in Figure 4B, in the second embodiment, the first of such three polypeptide chains will comprise, in an N-terminal to C-terminal direction, an N-terminal cysteine-containing peptide (such as linker 3) , CH2-CH3 domains of the Fc region ("Fc domain"), intermediate spacer peptide (linker 4), variable light chain (VL) domain capable of binding to the epitope of the "first" antigen (VL1) (either CD137 or TA), variable a heavy chain domain (VH) capable of binding to the epitope of the “second” antigen (VH2) (TA if the first antigen was CD137; CD137 if the first antigen was TA), a cysteine-containing linker, a domain promoting heterodimer formation, and a C-terminus. An intermediate linker peptide (linker 1) separates the light chain variable domain (VL1) from the heavy chain variable domain (VH2). Preferably, the heavy chain variable domain (VH1) is connected to the heterodimer formation domain via a linker peptide intermediate (linker 2). Most preferably, in such an alternative orientation, the first of the three polypeptide chains will respectively comprise, in the direction from N-terminus to C-terminus: linker 3 - Fc domain - linker 4 - VL1 - linker 1 - VH2 - linker 2 - domain , promoting the formation of a heterodimer. The second and third polypeptide chains of such an alternative diabody may be identical to the second and third polypeptide chains of the first embodiment.

[000303] В каждом из приведенных выше вариантов реализации вариабельный домен легкой цепи первой полипептидной цепи (VL1) координировано отобран так, чтобы он мог взаимодействовать с вариабельным доменом тяжелой цепи второй полипептидной цепи (VH1) с образованием функционального эпитопсвязывающего сайта, который способен иммуноспецифично связывать эпитоп первого антигена (т.е. либо ТА, либо CD137). Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второй полипептидной цепи (VL2) координировано отобран так, чтобы он мог взаимодействовать с вариабельным доменом тяжелой цепи первой полипептидной цепи (VH2) с образованием функционального эпитопсвязывающего сайта, который способен иммуноспецифично связывать эпитоп второго антигена (т.е. либо ТА, либо CD137). Таким образом, отбор вариабельных доменов легкой цепи и вариабельных доменов тяжелой цепи координируется таким образом, что две полипептидные цепи совместно содержат эпитопсвязывающие сайты, способные связываться с CD137 и ТА.[000303] In each of the above embodiments, the light chain variable domain of the first polypeptide chain (VL1) is coordinately selected so that it can interact with the heavy chain variable domain of the second polypeptide chain (VH1) to form a functional epitope-binding site that is capable of immunospecifically binding the epitope the first antigen (i.e. either TA or CD137). Likewise, the light chain variable domain of the second polypeptide chain (VL2) is coordinately selected so that it can interact with the heavy chain variable domain of the first polypeptide chain (VH2) to form a functional epitope-binding site that is capable of immunospecifically binding the epitope of the second antigen (i.e. either TA or CD137). Thus, the selection of light chain variable domains and heavy chain variable domains is coordinated such that the two polypeptide chains jointly contain epitope-binding sites capable of binding to CD137 and TA.

[000304] Предпочтительные Fc-несущие диатела согласно настоящему изобретению представляют собой ковалентно связанные четырехвалентные диатела, имеющие четыре эпитопсвязывающих сайта, которые содержат четыре полипептидные цепи, и изображены на Фигурах 3А-3С. Первая и третья полипептидные цепи такого диатела содержат: (i) VL1-содержащий домен, (ii) VH2-содержащий домен, (iii) домен, способствующий образованию гетеродимера, и (iv) домен, содержащий последовательность СН2-СН3. Вторая и четвертая полипептидные цепи содержат: (i) VL2-содержащий домен, (ii) VH1-содержащий домен, и (iii) домен, способствующий образованию гетеродимера, причем домены, способствующие образованию гетеродимера, способствуют димеризации и ковалентному связыванию первой/третьей полипептидных цепей со второй/четвертой полипептидными цепями. Предпочтительно домены VH соединены с доменами, способствующими образованию гетеродимера, с помощью промежуточных линкерных пептидов (линкер 2). Согласно предпочтительному варианту реализации CD137×TA биспецифического Fc-несущего диатела С-конец домена, способствующего образованию гетеродимера, первой полипептидной цепи соединен с доменами СН2-СН3 с помощью промежуточного линкерного пептида (линкер 3) или промежуточного спейсерного пептида (линкер 3). Домены VL и/или VH третьей и четвертой полипептидных цепей и домены VL и/или VH первой и второй полипептидных цепей могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить четырехвалентное связывание, которое является либо моноспецифическим, либо биспецифическим, либо тетраспецифическим. Условные сокращения «VL3» и «VH3» обозначают, соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают «третий» эпитоп такого диатела. Аналогичным образом, условные сокращения «VL4» и «VH4» обозначают, соответственно, вариабельный домен легкой цепи и вариабельный домен тяжелой цепи, которые связывают «четвертый» эпитоп такого диатела. Общая структура полипептидных цепей типичных четырехцепочечных биспецифических диател, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению представлена в таблице 3:[000304] Preferred Fc-bearing diabodies of the present invention are covalently linked tetravalent diabodies having four epitope binding sites that contain four polypeptide chains and are depicted in Figures 3A-3C. The first and third polypeptide chains of such a diabody contain: (i) a VL1-containing domain, (ii) a VH2-containing domain, (iii) a heterodimer-forming domain, and (iv) a domain containing the CH2-CH3 sequence. The second and fourth polypeptide chains contain: (i) a VL2-containing domain, (ii) a VH1-containing domain, and (iii) a heterodimer-promoting domain, wherein the heterodimer-promoting domains promote dimerization and covalent binding of the first/third polypeptide chains with second/fourth polypeptide chains. Preferably, the VH domains are connected to the heterodimer formation domains via intermediate linker peptides (linker 2). In a preferred embodiment of the CD137xTA bispecific Fc-carrying diabody, the C-terminus of the heterodimer-promoting domain of the first polypeptide chain is linked to the CH2-CH3 domains by an intermediate linker peptide (linker 3) or an intermediate spacer peptide (linker 3). The VL and/or VH domains of the third and fourth polypeptide chains and the VL and/or VH domains of the first and second polypeptide chains may be the same or different to provide tetravalent binding that is either monospecific, bispecific, or tetraspecific. The abbreviations “VL3” and “VH3” denote, respectively, the light chain variable domain and the heavy chain variable domain, which bind the “third” epitope of such a diabody. Likewise, the abbreviations “VL4” and “VH4” denote, respectively, the light chain variable domain and the heavy chain variable domain, which bind the “fourth” epitope of such a diabody. The general structure of the polypeptide chains of typical four-chain bispecific diabodies containing the Fc region according to the present invention is presented in table 3:

[000305] Согласно предпочтительным вариантам реализации CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-несущими диателами, которые состоят в общей сложности из четырех полипептидных цепей (Фигура 3А-3С). CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению представляют собой биспецифические, четырехвалентные Fc-несущие диатела, которые содержат два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных для CD137 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом CD137 или с различными эпитопами CD137), и два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных для опухолевого антигена (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом ТА или с различными эпитопами ТА или с различными эпитопами разных ТА).[000305] In preferred embodiments, the CD137xTA binding molecules of the present invention are bispecific, tetravalent (ie, have four epitope binding sites) Fc-bearing diabodies that consist of a total of four polypeptide chains (Figures 3A-3C). The CD137xTA binding molecules of the present invention are bispecific, tetravalent Fc-bearing diabodies that contain two epitope-binding sites immunospecific for CD137 (which may be capable of binding to the same CD137 epitope or to different CD137 epitopes), and two epitope-binding sites sites that are immunospecific for the tumor antigen (which may be able to bind to the same TA epitope or to different TA epitopes or to different epitopes of different TAs).

[000306] Дополнительные предпочтительные Fc-несущие диатела согласно настоящему изобретению содержат пять полипептидных цепей и изображены на Фигуре 5A-5D. Первая полипептидная цепь такого диатела содержит: (i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен, и (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3. Первая полипептидная цепь может представлять собой тяжелую цепь антитела, которое содержит VH1 и константную область тяжелой цепи. Вторая и пятая полипептидные цепи такого диатела содержат: (i) VL1-содержащий домен, и (ii) CL-содержащий домен. Вторая и/или пятая полипептидные цепи такого диатела могут представлять собой легкие цепи антитела, которое содержит VL1, комплементарный VH1 первой/третьей полипептидной цепи. Первая, вторая и/или пятая полипептидные цепи могут быть выделены из природного антитела. Согласно другому варианту они могут быть сконструированы рекомбинантно. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения вторая и пятая полипептидные цепи имеют одинаковую аминокислотную последовательность. Третья полипептидная цепь такого диатела содержит: (i) VH1-содержащий домен, (ii) CH1-содержащий домен, (iii) домен, содержащий последовательность СН2-СН3, (iv) VL2-содержащий домен, (v) VH3-содержащий домен, и (vi) домен, способствующий образованию гетеродимера, причем домены, способствующие образованию гетеродимера, способствуют димеризации третьей цепи с четвертой цепью. Четвертый полипептид таких диател содержит: (i) VL3-содержащий домен, (ii) VH2-содержащий домен, и (iii) домен, который способствует гетеродимеризации и образованию ковалентной связи с третьей полипептидной цепью диатела. Предпочтительно С-конец VH3- и VH2-содержащих доменов третьей и четвертой полипептидных цепей соединен с доменом, способствующим образованию гетеродимера, с помощью промежуточного линкерного пептида (линкер 2), и С-конец доменов СН2-СН3 третьей полипептидной цепи соединен с VL2-содержащим доменом с помощью промежуточного линкерного пептида (линкер 4).[000306] Additional preferred Fc-carrying diabodies according to the present invention contain five polypeptide chains and are depicted in Figure 5A-5D. The first polypeptide chain of such a diabody contains: (i) a VH1-containing domain, (ii) a CH1-containing domain, and (iii) a domain containing the CH2-CH3 sequence. The first polypeptide chain may be an antibody heavy chain that contains VH1 and a heavy chain constant region. The second and fifth polypeptide chains of such a diabody contain: (i) a VL1-containing domain, and (ii) a CL-containing domain. The second and/or fifth polypeptide chains of such a diabody may be the light chains of an antibody that contains VL1 complementary to the VH1 of the first/third polypeptide chain. The first, second and/or fifth polypeptide chains can be isolated from a natural antibody. According to another option, they can be constructed recombinantly. According to a preferred embodiment of the present invention, the second and fifth polypeptide chains have the same amino acid sequence. The third polypeptide chain of such a diabody contains: (i) a VH1-containing domain, (ii) a CH1-containing domain, (iii) a domain containing the CH2-CH3 sequence, (iv) a VL2-containing domain, (v) a VH3-containing domain, and (vi) a heterodimer formation promoting domain, wherein the heterodimer formation promoting domains promote dimerization of the third strand with the fourth strand. The fourth polypeptide of such diabodies contains: (i) a VL3-containing domain, (ii) a VH2-containing domain, and (iii) a domain that promotes heterodimerization and formation of a covalent bond with the third polypeptide chain of the diabody. Preferably, the C-terminus of the VH3- and VH2-containing domains of the third and fourth polypeptide chains is connected to the heterodimer formation domain via an intermediate linker peptide (linker 2), and the C-terminus of the CH2-CH3 domains of the third polypeptide chain is connected to the VL2-containing domain domain using an intermediate linker peptide (linker 4).

[000307] Соответственно, первая и вторая, а также третья и пятая полипептидные цепи таких диател объединяются с образованием двух сайтов связывания VL1/VH1, способных связывать первый эпитоп. Третья и четвертая полипептидные цепи таких диател объединяются с образованием сайта связывания VL2/VH2, который способен связываться со вторым эпитопом, а также сайта связывания VL3/VH3, который способен связываться с третьим эпитопом. Первый и третий полипептиды связаны друг с другом за счет дисульфидной связи с участием остатков цистеина в их соответствующих константных областях. Примечательно, что первая и третья полипептидные цепи образуют комплекс друг с другом с образованием области Fc. Такие биспецифические диатела обладают повышенной активностью. На Фигурах 5A-5D проиллюстрирована структура таких диател. Следует понимать, что домены VL1/VH1, VL2/VH2 и VL3/VH3 могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим. Однако, как предусмотрено в настоящем документе, эти домены предпочтительно отобраны так, чтобы связывать CD137 и ТА.[000307] Accordingly, the first and second, as well as the third and fifth polypeptide chains of such diabodies combine to form two VL1/VH1 binding sites capable of binding the first epitope. The third and fourth polypeptide chains of such diabodies combine to form a VL2/VH2 binding site that is capable of binding to a second epitope, as well as a VL3/VH3 binding site that is capable of binding to a third epitope. The first and third polypeptides are linked to each other by a disulfide bond involving cysteine residues in their respective constant regions. Notably, the first and third polypeptide chains form a complex with each other to form the Fc region. Such bispecific diabodies have increased activity. Figures 5A-5D illustrate the structure of such diabodies. It should be understood that the VL1/VH1, VL2/VH2 and VL3/VH3 domains may be the same or different to provide binding that is monospecific, bispecific or trispecific. However, as provided herein, these domains are preferably selected to bind CD137 and TA.

[000308] Домены VL и VH полипептидных цепей отбирают так, чтобы они образовывали сайты связывания VL/VH, специфичные для желательного эпитопа. Сайты связывания VL/VH, образованные за счет объединения полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить четырехвалентное связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или тетраспецифическим. В частности, домены VL и VH могут быть отобраны так, что биспецифическое диатело может содержать два сайта связывания для первого эпитопа и два сайта связывания для второго эпитопа или три сайта связывания для первого эпитопа и один сайт связывания для второго эпитопа, или два сайта связывания для первого эпитопа, один сайт связывания для второго эпитопа и один сайт связывания для третьего эпитопа (как изображено на Фигурах 5A-5D). Общая структура полипептидных цепей типичных пятицепочечных диател, содержащих область Fc, согласно настоящему изобретению представлена в таблице 4:[000308] The VL and VH domains of the polypeptide chains are selected to form VL/VH binding sites specific for the desired epitope. The VL/VH binding sites formed by combining polypeptide chains can be the same or different to provide tetravalent binding that is monospecific, bispecific, trispecific or tetraspecific. In particular, the VL and VH domains may be selected such that the bispecific diabody may contain two binding sites for a first epitope and two binding sites for a second epitope, or three binding sites for a first epitope and one binding site for a second epitope, or two binding sites for the first epitope, one binding site for the second epitope, and one binding site for the third epitope (as depicted in Figures 5A-5D). The general structure of the polypeptide chains of typical five-chain diabodies containing the Fc region according to the present invention is presented in Table 4:

[000309] Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению являются биспецифическими, четырехвалентными (т.е. обладают четырьмя эпитопсвязывающими сайтами) Fc-несущими диателами, которые состоят в общей сложности из пяти полипептидных цепей, имеющих два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных для CD137 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом CD137 или с различными эпитопами CD137), и два эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных для ТА (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом ТА или с различными эпитопами ТА или с различными эпитопами разных ТА). Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению представляют собой биспецифические, четырехвалентные Fc-несущие диатела, которые содержат три эпитопсвязывающих сайта, иммуноспецифичных для CD137 (которые могут быть способны связываться с одним и тем же эпитопом CD137 или с двумя или тремя различными эпитопами CD137), и один эпитопсвязывающий сайт, специфичный для ТА.[000309] In a preferred embodiment of the present invention, the CD137xTA binding molecules of the present invention are bispecific, tetravalent (i.e., four epitope binding sites) Fc-bearing diabodies that consist of a total of five polypeptide chains having two epitope binding sites , immunospecific for CD137 (which may be able to bind to the same CD137 epitope or to different CD137 epitopes), and two epitope-binding sites immunospecific for TA (which may be able to bind to the same TA epitope or to different TA epitopes or with different epitopes of different TAs). In another embodiment of the present invention, the CD137xTA binding molecules of the present invention are bispecific, tetravalent Fc-bearing diabodies that contain three epitope-binding sites immunospecific for CD137 (which may be capable of binding to the same CD137 epitope or two or three different epitopes of CD137), and one epitope-binding site specific for TA.

В. Трехвалентные CD137×TA связывающие молекулыB. Trivalent CD137xTA binding molecules

[000310] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению являются трехвалентными и будут содержать первый эпитопсвязывающий сайт (например, VL1 и VH1), второй эпитопсвязывающий сайт (например, VL2 и VH2) и третий эпитопсвязывающий сайт (например, VL3 и VH3) и, соответственно, будут способны связываться с эпитопом ТА, эпитопом CD137 и третьим эпитопом, причем третий эпитоп может представлять собой:[000310] In one embodiment of the present invention, the CD137xTA binding molecules of the present invention are trivalent and will comprise a first epitope binding site (e.g., VL1 and VH1), a second epitope binding site (e.g., VL2 and VH2), and a third epitope binding site (e.g., VL3 and VH3) and, accordingly, will be able to bind to the TA epitope, the CD137 epitope and a third epitope, wherein the third epitope may be:

(a) тот же или другой эпитоп ТА;(a) same or different TA epitope;

(b) тот же или другой эпитоп CD137; или(b) the same or a different CD137 epitope; or

(c) эпитоп другого ТА.(c) epitope of another TA.

[000311] Предпочтительно такие «трехвалентные CD137×TA связывающие молекулы» согласно настоящему изобретению будут содержать два эпитопсвязывающих сайта для эпитопа CD137 (эти эпитопы могут быть одинаковыми или различными) и один эпитопсвязывающий сайт для эпитопа ТА.[000311] Preferably, such "trivalent CD137xTA binding molecules" according to the present invention will contain two epitope binding sites for the CD137 epitope (these epitopes may be the same or different) and one epitope binding site for the TA epitope.

[000312] В целом такие трехвалентные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению состоят из трех, четырех, пяти или более пяти полипептидных цепей, которые благодаря одной или более дисульфидным связям между парами таких полипептидов образуют ковалентно связанный молекулярный комплекс, который содержит «связывающий домен, характерный для диатела» и «связывающий домен, не характерный для диатела».[000312] In general, such trivalent CD137xTA binding molecules of the present invention consist of three, four, five, or more than five polypeptide chains which, through one or more disulfide bonds between pairs of such polypeptides, form a covalently linked molecular complex that contains a “binding domain , characteristic of a diabody" and "binding domain not characteristic of a diabody".

[000313] «Связывающий домен, характерный для диатела» представляет собой эпитопсвязывающий домен диатела и, в частности, диатела DART^®. Термины «диатело» и «диатело DART^®» обсуждались выше. Связывающий домен «не характерным для диатела» предназначен для обозначения связывающего домена, который не имеет структуры связывающего домена, характерного для диатела. Предпочтительно связывающий домен, не характерный для диатела, представляет собой связывающий домен Fab-типа или связывающий домен scFv-типа. В настоящем документе термин «связывающий домен Fab-типа» относится к эпитопсвязывающему домену, который образуется в результате взаимодействия домена VL легкой цепи иммуноглобулина и комплементарного домена VH тяжелой цепи иммуноглобулина. Связывающие домены Fab-типа отличаются от связывающего домена, характерного для диатела, тем, что две полипептидные цепи, которые образуют связывающий домен Fab-типа, содержат только один эпитопсвязывающий домен, тогда как две полипептидные цепи, которые образуют связывающий домен, характерный для диатела, содержат по меньшей мере два эпитопсвязывающих домена. Связывающие домены scFv-типа отличаются от связывающего домена, характерного для диатела, тем, что домены VL и VH одной и той же полипептидной цепи взаимодействуют с образованием эпитопсвязывающего домена. Таким образом, в настоящем документе связывающие домены Fab-типа и связывающие домены scFv-типа отличаются от связывающего домена, характерного для диатела.[000313] A “diabody-specific binding domain” is the epitope-binding domain of a diabody and, in particular, a ^DART® diabody. The terms "diabody" and " ^DART® diabody" have been discussed above. A “non-diabody-specific” binding domain is intended to mean a binding domain that does not have the structure of a diabody-specific binding domain. Preferably, the non-diabody binding domain is a Fab-type binding domain or a scFv-type binding domain. As used herein, the term “Fab-type binding domain” refers to an epitope-binding domain that is formed by the interaction of the VL domain of an immunoglobulin light chain and the complementary VH domain of an immunoglobulin heavy chain. Fab-type binding domains differ from the diabody-specific binding domain in that the two polypeptide chains that form the Fab-type binding domain contain only one epitope-binding domain, whereas the two polypeptide chains that form the diabody-specific binding domain contain only one epitope-binding domain. contain at least two epitope-binding domains. The scFv-type binding domains differ from the diabody binding domain in that the VL and VH domains of the same polypeptide chain interact to form an epitope-binding domain. Thus, herein, Fab-type binding domains and scFv-type binding domains are different from the diabody-specific binding domain.

[000314] Соответственно, трехвалентные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат:[000314] Accordingly, the trivalent CD137xTA binding molecules of the present invention preferably contain:

(i) «первый» эпитопсвязывающий домен, который способен иммуноспецифично связываться с «первым» эпитопом;(i) a “first” epitope-binding domain that is capable of immunospecifically binding to the “first” epitope;

(ii) «второй» эпитопсвязывающий домен, который способен иммуноспецифично связываться со «вторым» эпитопом;(ii) a “second” epitope-binding domain that is capable of immunospecifically binding to the “second” epitope;

(iii) «третий» эпитопсвязывающий домен, который способен иммуноспецифично связываться с «третьим» эпитопом; и(iii) a “third” epitope-binding domain that is capable of immunospecifically binding to the “third” epitope; And

(iv) домен Fc, который образован за счет объединения двух доменов СН2-СН3 друг с другом;(iv) an Fc domain, which is formed by combining two CH2-CH3 domains with each other;

причем:and:

(A) «первый» эпитопсвязывающий домен и «второй» эпитопсвязывающий домен оба представляют собой «связывающие домены, характерные для диатела»;(A) the “first” epitope-binding domain and the “second” epitope-binding domain are both “diabody-specific binding domains”;

(B) «третий» эпитопсвязывающий домен представляет собой связывающий домен, не характерный для диатела; и(B) the “third” epitope-binding domain is a binding domain not specific to the diabody; And

(C) один из таких «первого», «второго» или «третьего» эпитопсвязывающих доменов связывает эпитоп ТА, и другой из таких «первого», «второго» или «третьего» эпитопсвязывающих доменов связывает эпитоп CD137;(C) one of such “first,” “second,” or “third” epitope-binding domains binds a TA epitope, and another of such “first,” “second,” or “third” epitope-binding domains binds a CD137 epitope;

[000315] Эпитоп, который связан оставшимся эпитопсвязывающим доменом, может представлять собой любой желательный эпитоп, предпочтительно эпитоп CD137. Такой эпитоп может быть идентичен или может отличаться от эпитопа CD137, связываемого другими эпитопсвязывающими доменами молекулы.[000315] The epitope that is bound by the remaining epitope binding domain can be any desired epitope, preferably the CD137 epitope. Such an epitope may be identical to or different from the CD137 epitope bound by other epitope-binding domains of the molecule.

[000316] На Фигуре 6А-6Н схематически представлены домены предпочтительных трехвалентных CD137×TA связывающих молекул. На Фигурах 6A-6D схематически проиллюстрированы домены предпочтительных трехвалентных CD137×TA связывающих молекул, которые состоят из ковалентного комплекса четырех полипептидных цепей и имеют один сайт связывания, не характерный для диатела (VL3/VH3 и, соответственно, являются одновалентными для такого эпитопа), и два сайта связывания, характерных для диатела (VL1/VH1 и VL2/VH2 и, соответственно, являются одновалентными для каждого из таких эпитопов). На Фигурах 6Е-6Н схематически показаны домены предпочтительных трехвалентных CD137×TA связывающих молекул, которые состоят из ковалентного комплекса трех полипептидных цепей и имеют один сайт связывания, не характерный для диатела (VL3/VH3 и, соответственно, являются одновалентными для такого эпитопа), и два сайта связывания, характерных для диатела (VL1/VH1 и VL2/VH2 и, соответственно, являются одновалентными для каждого из таких эпитопов). Сайт связывания, не характерный для диатела, показанный на Фигурах 6А-6Н, представляет собой связывающий домен Fab-типа на Фигурах 6A-6D и представляет собой связывающий домен scFv-типа на Фигурах 6Е-6Н. Как указано ниже, сайты связывания VL/VH, образованные за счет объединения полипептидных цепей, могут быть одинаковыми или различными, чтобы обеспечить трехвалентное связывание, которое является моноспецифическим, биспецифическим или триспецифическим.[000316] Figures 6A-6H are schematic representations of the domains of preferred trivalent CD137xTA binding molecules. Figures 6A-6D schematically illustrate the domains of preferred trivalent CD137xTA binding molecules, which consist of a covalent complex of four polypeptide chains and have a single binding site not characteristic of the diabody (VL3/VH3 and, accordingly, are monovalent for such an epitope), and two binding sites characteristic of the diabody (VL1/VH1 and VL2/VH2 and, accordingly, are monovalent for each of these epitopes). Figures 6E-6H schematically illustrate the domains of preferred trivalent CD137xTA binding molecules, which consist of a covalent complex of three polypeptide chains and have a single binding site not characteristic of the diabody (VL3/VH3 and, accordingly, are monovalent for such an epitope), and two binding sites characteristic of the diabody (VL1/VH1 and VL2/VH2 and, accordingly, are monovalent for each of these epitopes). The non-diabody binding site shown in Figures 6A-6H is a Fab-type binding domain in Figures 6A-6D and is a scFv-type binding domain in Figures 6E-6H. As discussed below, the VL/VH binding sites formed by combining the polypeptide chains can be the same or different to provide trivalent binding that is monospecific, bispecific or trispecific.

IV Примерные CD137×TA связывающие молекулыIV Exemplary CD137xTA binding molecules

[000317] Согласно настоящему изобретению предложены CD137×TA связывающие молекулы, которые представляют собой биспецифические четырехвалентные Fc-несущие диатела, способные одновременно и специфично связываться с CD137 и с ТА. Как указано выше, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать четыре или пять полипептидных цепей. Полипептидные цепи семи примерных CD137×TA связывающих молекул, способных связываться с CD137 и ТА, HER2/neu, представлены ниже (обозначены «DART-A», «DART-B», «DART-C», «DART-D», «DART-E», «DART-F», «DART-G», «DART-G1», «DART-G2», «DART-G3» и «DART-G4», соответственно). Согласно настоящему изобретению также предложены CD137×TA связывающие молекулы, которые представляют собой биспецифические трехвалентные связывающие молекулы, способные одновременно и специфично связываться с CD137 и с ТА. Как указано выше, трехвалентные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут содержать четыре полипептидные цепи. Полипептидные цепи примерной CD137×TA триспецифической связывающей молекулы, способной связываться с CD137 и ТА, HER2/neu, и ее оптимизированные варианты представлены ниже (обозначены «TRIDENT-A», «TRIDENT-A1», «TRIDENT-A2», «TRIDENT-А3», «TRIDENT-A5», «TRIDENT-B», «TRIDENT-B2» и «TRIDENT-В5», соответственно).[000317] The present invention provides CD137xTA binding molecules, which are bispecific tetravalent Fc-carrying diabodies capable of simultaneously and specifically binding to CD137 and TA. As stated above, the CD137xTA binding molecules of the present invention may contain four or five polypeptide chains. The polypeptide chains of seven exemplary CD137xTA binding molecules capable of binding to CD137 and TA, HER2/neu are presented below (designated “DART-A”, “DART-B”, “DART-C”, “DART-D”, “ DART-E", "DART-F", "DART-G", "DART-G1", "DART-G2", "DART-G3" and "DART-G4", respectively). The present invention also provides CD137xTA binding molecules, which are bispecific trivalent binding molecules capable of simultaneously and specifically binding to CD137 and TA. As stated above, the trivalent CD137×TA binding molecules of the present invention may contain four polypeptide chains. Polypeptide chains of an exemplary CD137×TA trispecific binding molecule capable of binding to CD137 and TA, HER2/neu, and optimized variants thereof are presented below (designated “TRIDENT-A”, “TRIDENT-A1”, “TRIDENT-A2”, “TRIDENT- A3", "TRIDENT-A5", "TRIDENT-B", "TRIDENT-B2" and "TRIDENT-B5", respectively).

A. DART-AA.DART-A

[000318] DART-A состоит из четырех полипептидных цепей, из которых первая и третья полипептидные цепи являются идентичными, и вторая и четвертая полипептидные цепи являются идентичными (см. Фигуру 3В).[000318] DART-A consists of four polypeptide chains, of which the first and third polypeptide chains are identical, and the second and fourth polypeptide chains are identical (see Figure 3B).

[000319] Первая и третья полипептидные цепи DART-А содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VL_HER2/neu) (VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 38), линкер (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 30)), домен CH2-CH3 примерного человеческого IgG1, у которого по существу отсутствует эффекторная функция (SEQ ID NO: 40), и С-конец.[000319] The first and third polypeptide chains of DART-A contain, from N-terminus to C-terminus, the N-terminus VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VL _HER2/neu ) (VL2 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 68)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (E-helix) E VAA CE K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 38), linker (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 30)), CH2-CH3 domain of exemplary human IgG1, which essentially lacks effector function (SEQ ID NO: 40), and C-terminus .

[000320] Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART-А представляет собой (SEQ ID NO: 98):[000320] The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART-A is (SEQ ID NO: 98):

[000321] Соответственно, первая и третья полипептидные цепи DART-А состоят из: SEQ ID NO: 68 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 40.[000321] Accordingly, the first and third polypeptide chains of DART-A consist of: SEQ ID NO: 68 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 40.

[000322] Вторая и четвертая полипептидные цепи DART-А содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VL_CD137 (VL1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 87)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu (VH1 hMAB-1 к HER2, SEQ ID NO: 64)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 39)), и С-конец.[000322] The second and fourth polypeptide chains of DART-A contain, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VL _CD137 (VL1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 87)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu (VH1 hMAB-1 to HER2, SEQ ID NO : 64)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (K-helix) ( K VAA CK E -K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO: 39)), and C-terminus.

[000323] Соответственно, вторая и четвертая полипептидные цепи DART-А состоят из: SEQ ID NO: 87 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 39.[000323] Accordingly, the second and fourth polypeptide chains of DART-A consist of: SEQ ID NO: 87 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 39.

[000324] Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART-А представляет собой (SEQ ID NO: 99):[000324] The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART-A is (SEQ ID NO: 99):

В. DART-ВV. DART-V

[000325] DART-B состоит из четырех полипептидных цепей, из которых первая и третья полипептидные цепи являются идентичными, и вторая и четвертая полипептидные цепи являются идентичными (см. Фигуру 3В).[000325] DART-B consists of four polypeptide chains, of which the first and third polypeptide chains are identical, and the second and fourth polypeptide chains are identical (see Figure 3B).

[000326] Первая и третья полипептидные цепи DART-B содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VL_HER2/neu) (VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 38)), линкер (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 30)), домен CH2-CH3 примерного человеческого IgG1, у которого по существу отсутствует эффекторная функция (SEQ ID NO: 40), и С-конец.[000326] The first and third polypeptide chains of DART-B contain, from N-terminus to C-terminus, the N-terminus VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VL _HER2/neu ) (VL3 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 69)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (E-helix) ( E VAA CE K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 38)), linker (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 30)), CH2-CH3 domain of exemplary human IgG1, which essentially lacks effector function (SEQ ID NO: 40), and C -end.

[000327] Соответственно, первая и третья полипептидные цепи DART-B состоят из: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 40.[000327] Accordingly, the first and third polypeptide chains of DART-B consist of: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 40.

[000328] Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART-B представляет собой (SEQ ID NO: 100):[000328] The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART-B is (SEQ ID NO: 100):

[000329] Вторая и четвертая полипептидные цепи DART-B содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VL_CD137 (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu (VH1 hMAB-1 к HER2, SEQ ID NO: 64)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 39)), и С-конец.[000329] The second and fourth polypeptide chains of DART-B contain, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VL _CD137 (VL3 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu (VH1 hMAB-1 to HER2, SEQ ID NO : 64)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (K-helix) ( K VAA CK E -K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO: 39)), and C-terminus.

[000330] Соответственно, вторая и четвертая полипептидные цепи DART-B состоят из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 39.[000330] Accordingly, the second and fourth polypeptide chains of DART-B consist of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 39.

[000331] Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART-B представляет собой (SEQ ID NO: 101):[000331] The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART-B is (SEQ ID NO: 101):

С. DART-СS. DART-S

[000332] DART-C состоит из четырех полипептидных цепей, из которых первая и третья полипептидные цепи являются идентичными, и вторая и четвертая полипептидные цепи являются идентичными (см. Фигура 3В).[000332] DART-C consists of four polypeptide chains, of which the first and third polypeptide chains are identical, and the second and fourth polypeptide chains are identical (see Figure 3B).

[000333] Первая и третья полипептидные цепи DART-С содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VL_CD137 (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 38)), линкер (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 30)), домен СН2-СН3 примерного человеческого IgG1, у которого по существу отсутствует эффекторная функция (SEQ ID NO: 40), и С-конец.[000333] The first and third polypeptide chains of DART-C contain, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VL _CD137 (VL3 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (E-helix) ( E VAA CE K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 38)), linker (LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 30)), CH2-CH3 domain of exemplary human IgG1, which essentially lacks effector function (SEQ ID NO: 40), and C- end.

[000334] Соответственно, первая и третья полипептидные цепи DART-С состоят из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 40.[000334] Accordingly, the first and third polypeptide chains of DART-C consist of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 40.

[000335] Аминокислотная последовательность первой и третьей полипептидных цепей DART-C представляет собой (SEQ ID NO: 102):[000335] The amino acid sequence of the first and third polypeptide chains of DART-C is (SEQ ID NO: 102):

[000336] Вторая и четвертая полипептидные цепи DART-C содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VL_HER2/neu (VL3 hMAB-1 к HER2, SEQ ID NO: 69)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137 (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 39)), и С-конец.[000336] The second and fourth polypeptide chains of DART-C contain, in a direction from N-terminus to C-terminus, the N-terminus, the VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VL _HER2/neu (VL3 hMAB-1 to HER2, SEQ ID NO: 69)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (K-helix) ( K VAA CK E- K VAAL K E-KVAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO: 39)), and the C-terminus.

[000337] Соответственно, вторая и четвертая полипептидные цепи DART-С состоят из: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 39.[000337] Accordingly, the second and fourth polypeptide chains of DART-C consist of: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 39.

[000338] Аминокислотная последовательность второй и четвертой полипептидных цепей DART-C представляет собой (SEQ ID NO: 103):[000338] The amino acid sequence of the second and fourth polypeptide chains of DART-C is (SEQ ID NO: 103):

D. DART-DD.DART-D

[000339] DART-D состоит из пяти полипептидных цепей, из которых вторая и пятая являются идентичными (см. Фигуру 5А, причем VL2/VH2 идентичны VL3/VH3, и Фигуру 5В).[000339] DART-D consists of five polypeptide chains, of which the second and fifth are identical (see Figure 5A, with VL2/VH2 identical to VL3/VH3, and Figure 5B).

[000340] Первая полипептидная цепь DART-D содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), домен CH1 человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирную область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 7) и «несущий впадину» домен СН2 и домен СНЗ (SEQ ID NO: 47).[000340] The first polypeptide chain of DART-D contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), the CH1 domain of human IgG1 (SEQ ID NO: 3), the hinge region of human IgG1 (SEQ ID NO: 7), and the “hole-bearing” CH2 domain and CH3 domain (SEQ ID NO: 47).

[000341] Соответственно, первая полипептидная цепь DART-D состоит из: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47.[000341] Accordingly, the first polypeptide chain of DART-D consists of: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47.

[000342] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART-D представляет собой (SEQ ID NO: 104):[000342] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of DART-D is (SEQ ID NO: 104):

[000343] Вторая и пятая полипептидные цепи DART-D содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VL_HER2/neu) (VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69)), каппа-домен CL человеческого IgG (SEQ ID NO: 1) и С-конец.[000343] The second and fifth polypeptide chains of DART-D contain, from N-terminus to C-terminus, the N-terminus VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VL _HER2/neu ) (VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69)), human IgG kappa CL domain (SEQ ID NO: 1) and C-terminus.

[000344] Соответственно, вторая и пятая полипептидные цепи DART-D состоят из: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 1.[000344] Accordingly, the second and fifth polypeptide chains of DART-D consist of: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 1.

[000345] Аминокислотная последовательности второй и пятой полипептидных цепей DART-D представляет собой (SEQ ID NO: 105):[000345] The amino acid sequence of the second and fifth polypeptide chains of DART-D is (SEQ ID NO: 105):

[000346] Третья полипептидная цепь DART-D содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), домен CH1 человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирную область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 7), «несущий выступ» домен CH2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 44), промежуточный линкерный пептид (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD 137 (VH_CD137) (VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 36)), и С-конец.[000346] The third polypeptide chain of DART-D contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), human IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 3), human IgG1 hinge region (SEQ ID NO: 7), CH2 “load-bearing” domain and CH3 domain (SEQ ID NO: 44), intermediate linker peptide (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 75)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD 137 (VH _CD137 ) (VH MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 74)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO : 18)), domain promoting heterodimer formation (E-helix) ( E VAAL E K -E VAAL E K -E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 36)), and C-terminus.

[000347] Соответственно, третья полипептидная цепь DART-D состоит из: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44- SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 74- SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36.[000347] Accordingly, the third polypeptide chain of DART-D consists of: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36.

[000348] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи DART-D представляет собой (SEQ ID NO: 106):[000348] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of DART-D is (SEQ ID NO: 106):

[000349] Четвертая полипептидная цепь DART-D содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO: 37), и С-конец.[000349] The fourth polypeptide chain of DART-D contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 75)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 74)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer-promoting domain (K-helix) ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO: 37), and C-terminus.

[000350] Соответственно, четвертая полипептидная цепь DART-D состоит из: SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.[000350] Accordingly, the fourth polypeptide chain of DART-D consists of: SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.

[000351] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи DART-D представляет собой (SEQ ID NO: 107):[000351] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of DART-D is (SEQ ID NO: 107):

Е. DART-EE. DART-E

[000352] DART-E состоит из пяти полипептидных цепей, из которых вторая и пятая являются идентичными (см. Фигуру 5А, причем VL2/VH2 идентичны VL3/VH3, и Фигуру 5С).[000352] DART-E consists of five polypeptide chains, of which the second and fifth are identical (see Figure 5A, with VL2/VH2 identical to VL3/VH3, and Figure 5C).

[000353] Первая полипептидная цепь DART-E содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD 137 (VH_CD137) (VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74)), домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирный домен IgG1 (SEQ ID NO: 7), «несущий впадину» домен CH2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 47) и С-конец.[000353] The first polypeptide chain of DART-E contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD 137 (VH _CD137 ) (VH MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 74)), IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 3), IgG1 hinge domain (SEQ ID NO: 7), CH2 domain and CH3 domain (SEQ ID NO: 47) and C-terminus.

[000354] Соответственно, первая полипептидная цепь DART-E состоит из: SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47.[000354] Accordingly, the first polypeptide chain of DART-E consists of: SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47.

[000355] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи DART-E представляет собой (SEQ ID NO: 108):[000355] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of DART-E is (SEQ ID NO: 108):

[000356] Вторая и пятая полипептидные цепи DART-E содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VL_CD137u) (VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75)), каппа-домен CL человеческого IgG (SEQ ID NO: 1) и С-конец.[000356] The second and fifth polypeptide chains of DART-E contain, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VL _CD137u ) (VL MAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 75)), human IgG kappa CL domain (SEQ ID NO: 1) and C-terminus.

[000357] Соответственно, вторая и пятая полипептидные цепи DART-E состоят из: SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 1[000357] Accordingly, the second and fifth polypeptide chains of DART-E consist of: SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 1

[000358] Аминокислотная последовательность второй и пятой полипептидных цепей DART-E представляет собой (SEQ ID NO: 109):[000358] The amino acid sequence of the second and fifth polypeptide chains of DART-E is (SEQ ID NO: 109):

[000359] Третья полипептидная цепь DART-E содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD137 (VH_CD137) (VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74)), домен CH1 человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирную область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 7), «несущий выступ» домен CH2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 44), промежуточный линкерный пептид (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), домен VL моноклонального антитела, способного связывать HER2/neu (VL_HER2/neu) (VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 36)), и С-конец.[000359] The third polypeptide chain of DART-E contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to CD137 (VH _CD137 ) (VH MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO : 74)), CH1 domain of human IgG1 (SEQ ID NO: 3), hinge region of human IgG1 (SEQ ID NO: 7), "load-bearing" CH2 domain and CH3 domain (SEQ ID NO: 44), intermediate linker peptide ( GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), VL domain of a monoclonal antibody capable of binding HER2/neu (VL _HER2/neu ) (VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 64)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG ( SEQ ID NO: 18)), domain promoting heterodimer formation (E-helix) ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 36)), and C- end.

[000360] Соответственно, третья полипептидная цепь DART-E состоит из: SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36[000360] Accordingly, the third polypeptide chain of DART-E consists of: SEQ ID NO: 74 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36

[000361] Аминокислотная последовательность третьих полипептидных цепей DART-Е представляет собой (SEQ ID NO: 110):[000361] The amino acid sequence of the third polypeptide chains of DART-E is (SEQ ID NO: 110):

[000362] Четвертая полипептидная цепь DART-E содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать HER2/neu (VL_HER2/neu) (VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO: 37), и С-конец.[000362] The fourth polypeptide chain of DART-E contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding HER2/neu (VL _HER2/neu ) (VL3 hMAB-1 anti-HER2 ( SEQ ID NO: 69)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer formation domain (K-helix) ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO: 37), and the C-terminus.

[000363] Соответственно, четвертая полипептидная цепь DART-E состоит из: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18- SEQ ID NO: 37.[000363] Accordingly, the fourth polypeptide chain of DART-E consists of: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.

[000364] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи DART-E представляет собой (SEQ ID NO: 111):[000364] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of DART-E is (SEQ ID NO: 111):

F. DART-FF.DART-F

[000365] DART-F состоит из пяти полипептидных цепей, из которых вторая и пятая являются идентичными (см. Фигуру 5А, причем VL2/VH2 идентичны VL3/VH3, и Фигуру 5В).[000365] DART-F consists of five polypeptide chains, of which the second and fifth are identical (see Figure 5A, with VL2/VH2 identical to VL3/VH3, and Figure 5B).

[000366] Первая полипептидная цепь DART-F идентична первой полипептидной цепи DART-D (SEQ ID NO: 104).[000366] The first polypeptide chain of DART-F is identical to the first polypeptide chain of DART-D (SEQ ID NO: 104).

[000367] Вторая и пятая полипептидные цепи DART-F идентичны второй и пятой полипептидным цепям DART-D (SEQ ID NO: 105).[000367] The second and fifth polypeptide chains of DART-F are identical to the second and fifth polypeptide chains of DART-D (SEQ ID NO: 105).

[000368] Третья полипептидная цепь DART-F содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирный домен IgG1 (SEQ ID NO: 7), «несущий выступ» домен CH2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 44), промежуточный линкерный пептид (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 91)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 90)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 36)), и С-конец.[000368] The third polypeptide chain of DART-F contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 3), IgG1 hinge domain (SEQ ID NO: 7), CH2 “load-bearing” domain and CH3 domain (SEQ ID NO: 44), intermediate linker peptide (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL MAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 91)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH MAB-4 anti-CD137 (SEQ ID NO: 90)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18) ), a domain promoting heterodimer formation (E-helix) ( E VAAL E K- E VAAL E K -E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 36)), and a C-terminus.

[000369] Соответственно, третья полипептидная цепь DART-F состоит из: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 91 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 90 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36[000369] Accordingly, the third polypeptide chain of DART-F consists of: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 91 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 90 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36

[000370] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи DART-F представляет собой (SEQ ID NO: 112):[000370] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of DART-F is (SEQ ID NO: 112):

[000371] Четвертая полипептидная цепь DART-F содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 91)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 90)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO: 37), и С-конец.[000371] The fourth polypeptide chain of DART-F contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL MAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 91)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH MAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 90)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), heterodimer-promoting domain (K-helix) ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO: 37), and C-terminus.

[000372] Соответственно, четвертая полипептидная цепь DART-F состоит из: SEQ ID NO: 91 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 90 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.[000372] Accordingly, the fourth polypeptide chain of DART-F consists of: SEQ ID NO: 91 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 90 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.

[000373] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи DART-F представляет собой (SEQ ID NO: 113):[000373] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of DART-F is (SEQ ID NO: 113):

G. DART-GG.DART-G

[000374] DART-G состоит из пяти полипептидных цепей, из которых вторая и пятая являются идентичными (см. Фигуру 5А, причем VL2/VH2 идентичны VL3/VH3, и Фигуру 5В).[000374] DART-G consists of five polypeptide chains, of which the second and fifth are identical (see Figure 5A, with VL2/VH2 identical to VL3/VH3, and Figure 5B).

[000375] Первая полипептидная цепь DART-G идентична первой полипептидной цепи DART-D (SEQ ID NO: 104).[000375] The first polypeptide chain of DART-G is identical to the first polypeptide chain of DART-D (SEQ ID NO: 104).

[000376] Вторая и пятая полипептидные цепи DART-G идентичны второй и пятой полипептидным цепям DART-D (SEQ ID NO: 105).[000376] The second and fifth polypeptide chains of DART-G are identical to the second and fifth polypeptide chains of DART-D (SEQ ID NO: 105).

[000377] Третья полипептидная цепь DART-G содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), домен CH1 IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирный домен IgG1 (SEQ ID NO: 7), «несущий выступ» домен CH2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 44), промежуточный линкерный пептид (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептидный (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 36)), и С-конец.[000377] The third polypeptide chain of DART-G contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), IgG1 CH1 domain (SEQ ID NO: 3), IgG1 hinge domain (SEQ ID NO: 7), CH2 “load-bearing” domain and CH3 domain (SEQ ID NO: 44), intermediate linker peptide (GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO: 24)), VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL3 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide (linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18) ), a domain promoting heterodimer formation (E-helix) ( E VAAL E K- E VAAL E K -E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO: 36)), and a C-terminus.

[000378] Соответственно, третья полипептидная цепь DART-G состоит из: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36.[000378] Accordingly, the third polypeptide chain of DART-G consists of: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 44 - SEQ ID NO: 24 - SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 36.

[000379] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи DART-G представляет собой (SEQ ID NO: 114):[000379] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of DART-G is (SEQ ID NO: 114):

[000380] Можно применять альтернативные варианты третьей полипептидной цепи DART-G, в которых аминокислотные остатки SEQ ID NO: 76 (домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137)) заменены аминокислотными остатками SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137) или SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137)). Оптимизированные молекулы, содержащие такие полипептидные цепи, описаны ниже.[000380] Alternative versions of the third polypeptide chain of DART-G may be used in which amino acid residues SEQ ID NO: 76 (VH domain of monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 )) are replaced by amino acid residues SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137) or SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137)). Optimized molecules containing such polypeptide chains are described below.

Четвертая полипептидная цепь DART-G содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAALKE-KVAALKE -KVAALKE-KVAALKE) (SEQ ID NO: 37)), и С-конец.The fourth polypeptide chain of DART-G contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL3 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 89)) , intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide ( linker 2; GGCGGG (SEQ ID NO: 18)), domain promoting heterodimer formation (K-helix) ( K VAAL K E- K VAAL K E - K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO: 37 )), and C-terminus.

[000381] Соответственно, четвертая полипептидная цепь DART-G состоит из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.[000381] Accordingly, the fourth polypeptide chain of DART-G consists of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 37.

[000382] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи DART-G представляет собой (SEQ ID NO: 119):[000382] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of DART-G is (SEQ ID NO: 119):

[000383] Можно применять альтернативные варианты четвертой полипептидной цепи DART-G, в которых аминокислотные остатки SEQ ID NO: 76 (домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137)) заменены аминокислотными остатками SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137) или SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137)). Оптимизированные молекулы, содержащие такие полипептидные цепи, описаны ниже.[000383] Alternative variants of the fourth polypeptide chain of DART-G may be used in which amino acid residues SEQ ID NO: 76 (VH domain of monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 )) are replaced by amino acid residues SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137) or SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137)). Optimized molecules containing such polypeptide chains are described below.

Н. Оптимизированное DART-GH. Optimized DART-G

[000384] Оптимизированные варианты DART-G, обозначенные «DART-G1», «DART-G2», «DART-G3» и «DART-G4», состоят из пяти полипептидных цепей и содержат HER2/neu-связывающие домены антитела hMAB-1 к HER2 (1.3) и CD137-связывающие домены любого антитела hMAB-3 к CD137 (1A.3)-(1D.3).[000384] Optimized variants of DART-G, designated "DART-G1", "DART-G2", "DART-G3" and "DART-G4", consist of five polypeptide chains and contain the HER2/neu binding domains of the hMAB antibody 1 to HER2 (1.3) and CD137-binding domains of any hMAB-3 anti-CD137 antibody (1A.3)-(1D.3).

[000385] Первая полипептидная цепь таких оптимизированных вариантов DART-G имеет ту же аминокислотную последовательность, что и первая полипептидная цепь DART-G (SEQ ID NO: 104)[000385] The first polypeptide chain of such optimized DART-G variants has the same amino acid sequence as the first polypeptide chain of DART-G (SEQ ID NO: 104)

[000386] Вторая и пятая полипептидные цепи таких оптимизированных вариантов DART-G имеют ту же аминокислотную последовательность, что и вторая и пятая полипептидные цепи DART-G (SEQ ID NO: 105).[000386] The second and fifth polypeptide chains of such optimized DART-G variants have the same amino acid sequence as the second and fifth polypeptide chains of DART-G (SEQ ID NO: 105).

[000387] Третья и четвертая полипептидные цепи таких оптимизированных вариантов DART-G имеют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 120 (DART-G1); SEQ ID NO: 116 и SEQ ID NO: 121 (DART-G2); SEQ ID NO: 117 и SEQ ID NO: 122 (DART-G3); или SEQ ID NO: 118 и SEQ ID NO: 123 (DART-G4), как указано ниже.[000387] The third and fourth polypeptide chains of such optimized DART-G variants have the amino acid sequences of SEQ ID NO: 115 and SEQ ID NO: 120 (DART-G1); SEQ ID NO: 116 and SEQ ID NO: 121 (DART-G2); SEQ ID NO: 117 and SEQ ID NO: 122 (DART-G3); or SEQ ID NO: 118 and SEQ ID NO: 123 (DART-G4) as follows.

[000388] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи оптимизированного DART-G1, содержащая SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 115:[000388] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of the optimized DART-G1 containing SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 115:

[000389] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи оптимизированного DART-G2, содержащая SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 116:[000389] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of the optimized DART-G2 containing SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 116:

[000390] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи оптимизированного DART-G3, содержащая SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 117:[000390] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of the optimized DART-G3 containing SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 117:

[000391] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи оптимизированного DART-G4, содержащая SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 118:[000391] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of the optimized DART-G4 containing SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 118:

[000392] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи оптимизированного DART-G1, содержащая SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 120:[000392] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of the optimized DART-G1 containing SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 120:

[000393] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи оптимизированного DART-G2, содержащая SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 121:[000393] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of the optimized DART-G2 containing SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 121:

[000394] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи оптимизированного DART-G3, содержащая SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 122:[000394] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of the optimized DART-G3 containing SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 122:

[000395] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи оптимизированного DART-G4, содержащая SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 123:[000395] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of the optimized DART-G4 containing SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 123:

I. TRIDENT-AI.TRIDENT-A

[000396] TRIDENT-A представляет собой трехвалентную CD137×CD137×TA связывающую молекулу, имеющую два сайта связывания CD 137 и один сайт связывания для примерного ТА, HER2/neu. TRIDENT-A состоит из четырех полипептидных цепей (см. Фигуру 6А, причем VL1/VH1 (сайт А) идентичны VL2/VH2 (сайт В) и связывают CD 137, и VL3/VH3 (сайт С) связывают HER2/neu)).[000396] TRIDENT-A is a trivalent CD137xCD137xTA binding molecule having two CD 137 binding sites and one binding site for the exemplary TA, HER2/neu. TRIDENT-A consists of four polypeptide chains (see Figure 6A, with VL1/VH1 (site A) identical to VL2/VH2 (site B) and binding CD 137, and VL3/VH3 (site C) binding HER2/neu)).

[000397] Первая полипептидная цепь TRIDENT-A содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD 137 (VL_CD137) (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD 137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 38)), промежуточный линкерный пептид (GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 21)), «несущий выступ» домен СН2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 44) и С-конец.[000397] The first polypeptide chain of TRIDENT-A contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD 137 (VL _CD137 ) (VL3 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO : 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD 137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)) , intermediate linker peptide (linker 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), cysteine-containing domain promoting heterodimer (E-helix) formation ( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K ( SEQ ID NO: 38)), intermediate linker peptide (GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 21)), overhang domain CH2 and CH3 domain (SEQ ID NO: 44) and C-terminus.

[000398] Соответственно, первая полипептидная цепь TRIDENT-A состоит из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO: 44.[000398] Accordingly, the first polypeptide chain of TRIDENT-A consists of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO: 44.

[000399] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи TRIDENT-A представляет собой (SEQ ID NO: 192):[000399] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of TRIDENT-A is (SEQ ID NO: 192):

[000400] Вторая полипептидная цепь TRIDENT-А содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD 137 (VL_CD137) (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD 137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), цистеинс о держащий домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 39)), и С-конец.[000400] The second polypeptide chain of TRIDENT-A contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD 137 (VL _CD137 ) (VL3 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO : 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD 137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)) , intermediate linker peptide (linker 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), cysteine containing domain promoting heterodimer formation (K-helix) ( K VAA CK E -K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO: 39)), and C-terminus.

[000401] Соответственно, вторая полипептидная цепь TRIDENT-А состоит из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 39[000401] Accordingly, the second polypeptide chain of TRIDENT-A consists of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 39

[000402] Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи TRIDENT-A представляет собой (SEQ ID NO: 197):[000402] The amino acid sequence of the second polypeptide chain of TRIDENT-A is (SEQ ID NO: 197):

[000403] Можно применять альтернативную первую и вторую полипептидные цепи TRIDENT-A, в которых аминокислотные остатки SEQ ID NO: 76 (домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137)) заменены аминокислотными остатками SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 208 (VH1E hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 209 (VH1F hMAB-3 к CD137) или SEQ ID NO: 210 (VH1G hMAB-3 к CD137) и/или аминокислотные остатки SEQ ID NO: 89 (домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD 137 (VH_CD137)) заменены аминокислотными остатками SEQ ID NO: 211 (VL4 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 212 (VL5 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 213 (VL6 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 214 (VL7 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 215 (VL8 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 216 (VL9 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 217 (VL10 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 218 (VL11 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 219 (VL12 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 220 (VL13 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 221 (VL14 hMAB-3 к CD137) или SEQ ID NO: 222 (VL15 hMAB-3 к CD137) Оптимизированные/деиммунизированные молекулы, содержащие множество таких полипептидных цепей, описаны ниже.[000403] Alternative first and second polypeptide chains of TRIDENT-A may be used in which amino acid residues SEQ ID NO: 76 (VH domain of monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 )) are replaced by amino acid residues SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB- 3 to CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO : 208 (VH1E hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 209 (VH1F hMAB-3 to CD137) or SEQ ID NO: 210 (VH1G hMAB-3 to CD137) and/or amino acid residues SEQ ID NO: 89 (domain The VL of a monoclonal antibody capable of binding CD 137 (VH _CD137 )) is replaced by amino acid residues SEQ ID NO: 211 (VL4 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 212 (VL5 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 213 ( VL6 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 214 (VL7 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 215 (VL8 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 216 (VL9 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 217 (VL10 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 218 (VL11 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 219 (VL12 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 220 (VL13 hMAB -3 to CD137), SEQ ID NO: 221 (VL14 hMAB-3 to CD137) or SEQ ID NO: 222 (VL15 hMAB-3 to CD137) Optimized/deimmunized molecules containing multiple such polypeptide chains are described below.

[000404] Третья полипептидная цепь TRIDENT-A содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VH_HER2/neu) (VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64)), домен CH1 человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирную область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 7) и «несущий впадину» домен СН2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 47). Соответственно, третья полипептидная цепь TRIDENT-A состоит из: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47 и имеет ту же аминокислотную последовательность, что и первая полипептидная цепь DART-D (SEQ ID NO: 104), представленная выше.[000404] The third polypeptide chain of TRIDENT-A contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VH _HER2/neu ) (VH1 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 64)), the CH1 domain of human IgG1 (SEQ ID NO: 3), the hinge region of human IgG1 (SEQ ID NO: 7) and the “groove-bearing” domain CH2 and CH3 domain (SEQ ID NO: 47). Accordingly, the third TRIDENT-A polypeptide chain consists of: SEQ ID NO: 64 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47 and has the same amino acid sequence as the first DART-D polypeptide chain ( SEQ ID NO: 104) presented above.

[000405] Четвертая полипептидная цепь TRIDENT-A содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с HER2/neu (VL_HER2/neu) (VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69)), каппа-домен CL человеческого IgG (SEQ ID NO: 1) и С-конец. Соответственно, четвертая полипептидная цепь TRIDENT-A состоит из: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 1 и имеет ту же аминокислотную последовательность, что и вторая, и пятая полипептидные цепи DART-D (SEQ ID NO: 105), предоставленные выше.[000405] The fourth polypeptide chain of TRIDENT-A contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to HER2/neu (VL _HER2/neu ) (VL3 hMAB-1 anti-HER2 (SEQ ID NO: 69)), human IgG kappa CL domain (SEQ ID NO: 1) and C-terminus. Accordingly, the fourth TRIDENT-A polypeptide chain consists of: SEQ ID NO: 69 - SEQ ID NO: 1 and has the same amino acid sequence as the second and fifth DART-D polypeptide chains (SEQ ID NO: 105) provided above .

1. Оптимизированные варианты TRIDENT-A1. Optimized TRIDENT-A variants

[000406] Оптимизированные варианты TRIDENT-A, обозначенные «TRIDENT-A1», «TRIDENT-A2», «TRIDENT-А3» и «TRIDENT-A4», состоят из четырех полипептидных цепей и содержат HER2/neu-связывающие домены антитела hMAB-1 к HER2 (1.3) и CD137-связывающие домены любого антитела hMAB-3 к CD137 (1A.3)-(1D.3).[000406] Optimized variants of TRIDENT-A, designated "TRIDENT-A1", "TRIDENT-A2", "TRIDENT-A3" and "TRIDENT-A4", consist of four polypeptide chains and contain the HER2/neu binding domains of the hMAB antibody 1 to HER2 (1.3) and CD137-binding domains of any hMAB-3 anti-CD137 antibody (1A.3)-(1D.3).

[000407] Третья полипептидная цепь такого оптимизированного TRIDENT-А имеет ту же аминокислотную последовательность, что и третья полипептидная цепь TRIDENT-А, которая, как отмечено выше, идентична первой полипептидной цепи DART-D (SEQ ID NO: 104).[000407] The third polypeptide chain of such optimized TRIDENT-A has the same amino acid sequence as the third polypeptide chain of TRIDENT-A, which, as noted above, is identical to the first polypeptide chain of DART-D (SEQ ID NO: 104).

[000408] Четвертая полипептидная цепь такого оптимизированного TRIDENT-А имеет ту же аминокислотную последовательность, что и четвертая полипептидная цепь TRIDENT-A, которая, как отмечено выше, идентична второй и пятой полипептидным цепям DART-D (SEQ ID NO: 105).[000408] The fourth polypeptide chain of such optimized TRIDENT-A has the same amino acid sequence as the fourth polypeptide chain of TRIDENT-A, which, as noted above, is identical to the second and fifth polypeptide chains of DART-D (SEQ ID NO: 105).

[000409] Первая и вторая полипептидные цепи таких оптимизированных вариантов TRIDENT-A имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 193 и SEQ ID NO: 198 (TRIDENT-A1); SEQ ID NO: 194 и SEQ ID NO: 199 (TRIDENT-A2); SEQ ID NO: 195 и SEQ ID NO: 200 (TRIDENT-A3); или SEQ ID NO: 196 и SEQ ID NO: 201 (TRIDENT-A4), представленные ниже.[000409] The first and second polypeptide chains of such optimized TRIDENT-A variants have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 193 and SEQ ID NO: 198 (TRIDENT-A1); SEQ ID NO: 194 and SEQ ID NO: 199 (TRIDENT-A2); SEQ ID NO: 195 and SEQ ID NO: 200 (TRIDENT-A3); or SEQ ID NO: 196 and SEQ ID NO: 201 (TRIDENT-A4) below.

[000410] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи TRIDENT-A1, содержащая SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 193:[000410] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of TRIDENT-A1 containing SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 193:

[000411] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи TRIDENT-A2, содержащая SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 194:[000411] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of TRIDENT-A2 containing SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 194:

[000412] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи TRIDENT-А3, содержащая SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 195:[000412] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of TRIDENT-A3 containing SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 195:

[000413] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи TRIDENT-A4, содержащая SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 196:[000413] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of TRIDENT-A4 containing SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 196:

[000414] Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи TRIDENT-A1, содержащая SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 198:[000414] The amino acid sequence of the second polypeptide chain of TRIDENT-A1 containing SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 198:

[000415] Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи TRIDENT-A2, содержащая SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 199:[000415] The amino acid sequence of the second polypeptide chain of TRIDENT-A2 containing SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 199:

[000416] Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи TRIDENT-А3, содержащая SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 200:[000416] The amino acid sequence of the second polypeptide chain of TRIDENT-A3 containing SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 200:

[000417] Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи TRIDENT-A4, содержащая SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137), представляет собой SEQ ID NO: 201:[000417] The amino acid sequence of the second polypeptide chain of TRIDENT-A4 containing SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137) is SEQ ID NO: 201:

2. Деиммунизированные варианты TRIDENT-A2. Deimmunized TRIDENT-A variants

[000418] Деиммунизированные варианты TRIDENT-A состоят из четырех полипептидных цепей и содержат HER2/neu-связывающие домены антитела hMAB-1 к HER2 (1.3) и домен VH CD 137 любого из VH1E-VH1G hMAB-3 к CD137 и домен VL CD 137 любого из VL4-VL15 hMAB-3 к CD137.[000418] TRIDENT-A deimmunized variants consist of four polypeptide chains and contain the HER2/neu binding domains of the anti-HER2 antibody hMAB-1 (1.3) and the VH domain CD 137 of any of the VH1E-VH1G hMAB-3 anti-CD137 and the VL domain CD 137 any of VL4-VL15 hMAB-3 to CD137.

[000419] Примерный деиммунизированный вариант TRIDENT-A, обозначенный «TRIDENT-A5», состоит из четырех полипептидных цепей и содержит HER2/neu-связывающие домены антитела hMAB-1 к HER2 (1.3) и CD137-связывающие домены любого антитела hMAB-3 к CD137 (1Е.15).[000419] An exemplary deimmunized variant of TRIDENT-A, designated "TRIDENT-A5", consists of four polypeptide chains and contains the HER2/neu binding domains of the anti-HER2 antibody hMAB-1 (1.3) and the CD137 binding domains of any anti-HER2 antibody hMAB-3 (1.3). CD137 (1E.15).

[000420] Аминокислотная последовательность первой полипептидной цепи TRIDENT-A5 (содержащая VH1E hMAB-3 к CD137 и VL15 hMAB-3 к CD137), представляет собой (SEQ ID NO: 229):[000420] The amino acid sequence of the first polypeptide chain of TRIDENT-A5 (containing VH1E hMAB-3 anti-CD137 and VL15 hMAB-3 anti-CD137) is (SEQ ID NO: 229):

[000421] Аминокислотная последовательность второй полипептидной цепи TRIDENT-A5 (содержащая VH1E hMAB-3 к CD137 и VL15 hMAB-3 к CD137) представляет собой SEQ ID NO: 230:[000421] The amino acid sequence of the second polypeptide chain of TRIDENT-A5 (containing VH1E hMAB-3 anti-CD137 and VL15 hMAB-3 anti-CD137) is SEQ ID NO: 230:

[000422] Третья полипептидная цепь такого деиммунизированного TRIDENT-А5 имеет ту же аминокислотную последовательность, что и третья полипептидная цепь TRIDENT-A, которая, как отмечено выше, идентична первой полипептидной цепи DART-D (SEQ ID NO: 104).[000422] The third polypeptide chain of such deimmunized TRIDENT-A5 has the same amino acid sequence as the third polypeptide chain of TRIDENT-A, which, as noted above, is identical to the first polypeptide chain of DART-D (SEQ ID NO: 104).

[000423] Четвертая полипептидная цепь такого деиммунизированного TRIDENT-A5 имеет ту же аминокислотную последовательность, что и четвертая полипептидная цепь TRIDENT-A, которая, как указано выше, идентичная второй и пятой полипептидным цепям DART-D (SEQ ID NO: 105).[000423] The fourth polypeptide chain of such deimmunized TRIDENT-A5 has the same amino acid sequence as the fourth polypeptide chain of TRIDENT-A, which, as stated above, is identical to the second and fifth polypeptide chains of DART-D (SEQ ID NO: 105).

J. TRIDENT-BJ.TRIDENT-B

[000424] TRIDENT-B представляет собой трехвалентную CD137×CD137×TA связывающую молекулу, имеющую два сайта связывания CD137 и один сайт связывания для примерного ТА, 5Т4. TRIDENT-B состоит из четырех полипептидных цепей (см. Фигуру 6А, причем VL1/VH1 (сайт А) идентичны VL2/VH2 (сайт В) и связывают CD137, и VL3/VH3 (сайт С) связывают 5Т4).[000424] TRIDENT-B is a trivalent CD137xCD137xTA binding molecule having two binding sites for CD137 and one binding site for the exemplary TA, 5T4. TRIDENT-B consists of four polypeptide chains (see Figure 6A, with VL1/VH1 (site A) identical to VL2/VH2 (site B) and binding CD137, and VL3/VH3 (site C) binding 5T4).

[000425] Первая полипептидная цепь TRIDENT-B содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (Е-спираль) (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 38)), промежуточный линкерный пептид (GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 21)), «несущий выступ» домен СН2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 44) и С-конец. Соответственно, первая полипептидная цепь TRIDENT-B состоит из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO: 44 и имеет ту же аминокислотную последовательность, что и первая полипептидная цепь TRIDENT-A (SEQ ID NO: 192), представленная выше.[000425] The first polypeptide chain of TRIDENT-B contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL3 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide (linker 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), cysteine-containing domain promoting heterodimer formation (E-helix) ( E VAA CE K-EVAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO : 38)), intermediate linker peptide (GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 21)), "overhang" domain CH2 and domain CH3 (SEQ ID NO: 44) and C-terminus. Accordingly, the first polypeptide chain of TRIDENT-B consists of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 38 - SEQ ID NO: 21 - SEQ ID NO : 44 and has the same amino acid sequence as the first polypeptide chain of TRIDENT-A (SEQ ID NO: 192) presented above.

[000426] Вторая полипептидная цепь TRIDENT-B содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VL_CD137) (VL3 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 89)), промежуточный линкерный пептид (линкер 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137) (VH1 hMAB-3 к CD137 (SEQ ID NO: 76)), промежуточный линкерный пептид (линкер 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), цистеинсодержащий домен, способствующий образованию гетеродимера (K-спираль) (KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 39)), и С-конец. Соответственно, вторая полипептидная цепь TRIDENT-B состоит из: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 39 и имеет ту же аминокислотную последовательность, что и вторая полипептидная цепь TRIDENT-A (SEQ ID NO: 197), предоставленная выше.[000426] The second polypeptide chain of TRIDENT-B contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VL _CD137 ) (VL3 hMAB-3 anti-CD137 (SEQ ID NO: 89)), intermediate linker peptide (linker 1; GGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)), VH domain of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 ) (VH1 hMAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 76)), intermediate linker peptide (linker 2; ASTKG (SEQ ID NO: 19)), cysteine-containing domain promoting heterodimer formation (K-helix) ( K VAA CK E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO: 39)), and C-terminus. Accordingly, the second TRIDENT-B polypeptide chain consists of: SEQ ID NO: 89 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 39 and has the same amino acid sequence as the second TRIDENT-A polypeptide chain (SEQ ID NO: 197) provided above.

[000427] Можно применять альтернативные варианты первой и второй полипептидных цепей TRIDENT-B, в которых аминокислотные остатки SEQ ID NO: 76 (домен VH моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137)) заменены аминокислотными остатками SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 208 (VH1E hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 209 (VH1F hMAB-3 к CD137) или SEQ ID NO: 210 (VH1G hMAB-3 к CD137) и/или аминокислотные остатки SEQ ID NO: 89 (домен VL моноклонального антитела, способного связывать CD137 (VH_CD137)) заменены аминокислотными остатками SEQ ID NO: 211 (VL4 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 212 (VL5 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 213 (VL6 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 214 (VL7 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 215 (VL8 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 216 (VL9 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 217 (VL10 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 218 (VL11 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 219 (VL12 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 220 (VL13 hMAB-3 к CD137), SEQ ID NO: 221 (VL14 hMAB-3 к CD137) или SEQ ID NO: 222 (VL15 hMAB-3 к CD137). Оптимизированные/деиммунизированные молекулы, содержащие множество таких полипептидных цепей, описаны в настоящем документе и имеют те же аминокислотные последовательности, что и первая и вторая полипептидные цепи оптимизированных/деиммунизированных молекул TRIDENT-A (например, TRIDENT-А1 TRIDENT-A5).[000427] Alternative variants of the first and second polypeptide chains of TRIDENT-B may be used in which amino acid residues SEQ ID NO: 76 (VH domain of monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 )) are replaced by amino acid residues SEQ ID NO: 83 (VH1A hMAB -3 to CD137), SEQ ID NO: 84 (VH1B hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 85 (VH1C hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 86 (VH1D hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 208 (VH1E hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 209 (VH1F hMAB-3 to CD137) or SEQ ID NO: 210 (VH1G hMAB-3 to CD137) and/or amino acid residues SEQ ID NO: 89 ( domain VL of a monoclonal antibody capable of binding CD137 (VH _CD137 )) are replaced by amino acid residues SEQ ID NO: 211 (VL4 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 212 (VL5 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 213 ( VL6 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 214 (VL7 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 215 (VL8 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 216 (VL9 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 217 (VL10 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 218 (VL11 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 219 (VL12 hMAB-3 to CD137), SEQ ID NO: 220 (VL13 hMAB -3 to CD137), SEQ ID NO: 221 (VL14 hMAB-3 to CD137) or SEQ ID NO: 222 (VL15 hMAB-3 to CD137). Optimized/deimmunized molecules containing multiple such polypeptide chains are described herein and have the same amino acid sequences as the first and second polypeptide chains of optimized/deimmunized TRIDENT-A molecules (eg, TRIDENT-A1 TRIDENT-A5).

[000428] Третья полипептидная цепь TRIDENT-B содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VH моноклонального антитела, способного связываться с 5Т4 (VH_5T4) (VH1 hMAB-1 к 5Т4 (SEQ ID NO: 134)), домен CH1 человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3), шарнирную область человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 7) и «несущий впадину» домен СН2 и домен СН3 (SEQ ID NO: 47). Соответственно, первая полипептидная цепь TRIDENT-B состоит из: SEQ ID NO: 134 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47[000428] The third polypeptide chain of TRIDENT-B contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VH domain of a monoclonal antibody capable of binding to 5T4 (VH _5T4 ) (VH1 hMAB-1 to 5T4 (SEQ ID NO : 134)), the CH1 domain of human IgG1 (SEQ ID NO: 3), the hinge region of human IgG1 (SEQ ID NO: 7), and the “groove-bearing” domain CH2 and CH3 domain (SEQ ID NO: 47). Accordingly, the first polypeptide chain of TRIDENT-B consists of: SEQ ID NO: 134 - SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 47

[000429] Аминокислотная последовательность третьей полипептидной цепи TRIDENT-B представляет собой (SEQ ID NO: 231):[000429] The amino acid sequence of the third polypeptide chain of TRIDENT-B is (SEQ ID NO: 231):

[000430] Четвертая полипептидная цепь TRIDENT-В содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться с 5Т4 (VL_5T4) (VL1 hMAB-1 к 5Т4 (SEQ ID NO: 135)), каппа-домен CL человеческого IgG (SEQ ID NO: 1) и С-конец. Соответственно, четвертая полипептидная цепь TRIDENT-B состоит из: SEQ ID NO: 135 - SEQ ID NO: 1.[000430] The fourth polypeptide chain of TRIDENT-B contains, in an N-terminal to C-terminal direction, the N-terminal VL domain of a monoclonal antibody capable of binding to 5T4 (VL _5T4 ) (VL1 hMAB-1 to 5T4 (SEQ ID NO : 135)), human IgG kappa CL domain (SEQ ID NO: 1) and C-terminus. Accordingly, the fourth TRIDENT-B polypeptide chain consists of: SEQ ID NO: 135 - SEQ ID NO: 1.

[000431] Аминокислотная последовательность четвертой полипептидной цепи TRIDENT-B представляет собой (SEQ ID NO: 232):[000431] The amino acid sequence of the fourth polypeptide chain of TRIDENT-B is (SEQ ID NO: 232):

1. Оптимизированные и деиммунизированные варианты TRIDENT-B1. Optimized and deimmunized TRIDENT-B variants

[000432] Оптимизированные и деиммунизированные варианты TRIDENT-B состоят из четырех полипептидных цепей и содержат 5Т4-связывающие домены антитела hMAB-1 к 5Т4, а также домен VH CD137 любого из VH1A-VH1G hMAB-3 к CD137 и домен VL CD137 любого из VL3-VL15 hMAB-3 к CD137.[000432] The optimized and deimmunized TRIDENT-B variants consist of four polypeptide chains and contain the 5T4 binding domains of the hMAB-1 anti-5T4 antibody, as well as the VH domain CD137 of any of the VH1A-VH1G hMAB-3 anti-CD137 and the VL domain CD137 of any of the VL3 -VL15 hMAB-3 to CD137.

[000433] Примерные оптимизированные и деиммунизированные варианты TRIDENT-B, обозначенные «TRIDENT-B2» и «TRIDENT-B5», состоят из четырех полипептидных цепей и содержат 5Т4-связывающие домены антитела hMAB-1 к 5Т4 и CD137-связывающие домены антитела hMAB-3 к CD137 (1 В.3) и hMAB-3 к CD137 (1Е.15), соответственно.[000433] Exemplary optimized and deimmunized variants of TRIDENT-B, designated "TRIDENT-B2" and "TRIDENT-B5", consist of four polypeptide chains and contain the 5T4 binding domains of the hMAB-1 antibody to 5T4 and the CD137 binding domains of the hMAB-1 antibody 3 to CD137 (1B.3) and hMAB-3 to CD137 (1E.15), respectively.

[000434] Первая полипептидная цепь TRIDENT-В2 имеет ту же аминокислотную последовательность, что и первая полипептидная цепь TRIDENT-A2 (SEQ ID NO: 194), представленная выше.[000434] The TRIDENT-B2 first polypeptide chain has the same amino acid sequence as the TRIDENT-A2 first polypeptide chain (SEQ ID NO: 194) presented above.

[000435] Вторая полипептидная цепь TRIDENT-B2 имеет ту же аминокислотную последовательность, что и вторая полипептидная цепь TRIDENT-А2 (SEQ ID NO: 199), представленная выше.[000435] The second polypeptide chain of TRIDENT-B2 has the same amino acid sequence as the second polypeptide chain of TRIDENT-A2 (SEQ ID NO: 199) presented above.

[000436] Первая полипептидная цепь TRIDENT-В5 имеет ту же аминокислотную последовательность, что и первая полипептидная цепь TRIDENT-A5 (SEQ ID NO: 229), представленная выше.[000436] The TRIDENT-B5 first polypeptide chain has the same amino acid sequence as the TRIDENT-A5 first polypeptide chain (SEQ ID NO: 229) presented above.

[000437] Вторая полипептидная цепь TRIDENT-B5 имеет ту же аминокислотную последовательность, что и второй полипептид TRIDENT-A5 (SEQ ID NO: 230), представленный выше.[000437] The second TRIDENT-B5 polypeptide chain has the same amino acid sequence as the second TRIDENT-A5 polypeptide (SEQ ID NO: 230) presented above.

[000438] Третьи полипептидные цепи как примерных оптимизированных вариантов, так и деиммунизированных вариантов TRIDENT-B имеют ту же аминокислотную последовательность, что и третья полипептидная цепь TRIDENT-В (SEQ ID NO: 231).[000438] The third polypeptide chains of both the exemplary optimized variants and the deimmunized TRIDENT-B variants have the same amino acid sequence as the third polypeptide chain of TRIDENT-B (SEQ ID NO: 231).

[000439] Четвертая полипептидная цепь как примерных оптимизированных вариантов, так и деиммунизированных вариантов TRIDENT-B имеет ту же аминокислотную последовательность, что и четвертая полипептидная цепь TRIDENT-B (SEQ ID NO: 232).[000439] The fourth polypeptide chain of both the exemplary optimized variants and the deimmunized TRIDENT-B variants has the same amino acid sequence as the fourth polypeptide chain of TRIDENT-B (SEQ ID NO: 232).

K. Альтернативные CD137×TA связывающие молекулыK. Alternative CD137xTA binding molecules

[000440] Как будет понятно в свете настоящего описания, дополнительные CD137×TA связывающие молекулы, имеющие общую структуру любой из приведенных выше примерных молекул и содержащие сайт связывания для альтернативного опухолевого антигена и/или имеющие оптимизированный/деиммунизированный сайт связывания CD137, могут быть сконструированы с применением доменов VL и VH альтернативных антител к опухолевому антигену вместо доменов VL и VH антител к HER2/neu или антител к 5Т4 и/или доменов VL и VH любого из оптимизированных/деиммунизированных антител к CD137, раскрытых в настоящем документе. Аналогичным образом, как предусмотрено в настоящем документе, альтернативные CD137×TA связывающие молекулы также могут быть сконструированы с включением альтернативных линкеров и/или доменов, способствующих образованию гетеродимера.[000440] As will be appreciated in light of the present disclosure, additional CD137xTA binding molecules having the general structure of any of the above exemplary molecules and containing a binding site for an alternative tumor antigen and/or having an optimized/deimmunized CD137 binding site can be designed with using the VL and VH domains of alternative tumor antigen antibodies instead of the VL and VH domains of anti-HER2/neu antibodies or anti-5T4 antibodies and/or the VL and VH domains of any of the optimized/deimmunized anti-CD137 antibodies disclosed herein. Likewise, as provided herein, alternative CD137xTA binding molecules can also be designed to include alternative linkers and/or domains that promote heterodimer formation.

V. Контрольные молекулыV. Control molecules

[000441] Для того чтобы продемонстрировать в большей степени свойства CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению, ниже представлены контрольные антитела, домены VL и VH которых можно применять для получения контрольных Fc-несущих диател и других контрольных связывающих молекул.[000441] To further demonstrate the properties of the CD137xTA binding molecules of the present invention, reference antibodies whose VL and VH domains can be used to produce control Fc-carrying diabodies and other control binding molecules are provided below.

[000442] Антитело к флуоресцеину 4-4-20 (Gruber, М. et al. (1994) ((Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli», J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) «Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family», J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569) представляет собой подходящее контрольное антитело, диатела. Аминокислотные последовательности вариабельного легкого и вариабельного тяжелого доменов антитела к флуоресцеину 4-4-20 представлены далее:[000442] Fluorescein Antibody 4-4-20 (Gruber, M. et al. (1994) (Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli, J. Immunol. 152(11): 5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family", J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569) is a suitable control antibody, diabodies The amino acid sequences of the variable light and variable heavy domains of the anti-fluorescein antibody 4-4-20 are presented below:

[000443] Аминокислотная последовательность домена VH антитела к флуоресцеину 4-4-20 (SEQ ID NO: 124) представлена ниже (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000443] The amino acid sequence of the VH domain of the anti-fluorescein antibody 4-4-20 (SEQ ID NO: 124) is shown below (CDR _H residues are underlined):

EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDYWGQ GTSVTVSSEVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWM NWVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET YYSDSVKG RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY WGQ GTSVTVSS

[000444] Аминокислотная последовательность домена VL антитела к флуоресцеину 4-4-20 (SEQ ID NO: 125) представлена ниже (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000444] The amino acid sequence of the VL domain of the anti-fluorescein antibody 4-4-20 (SEQ ID NO: 125) is shown below (CDR _L residues are underlined):

DWMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP WTFGGGTKLE IKDWMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IK

[000445] Паливизумаб (см., например, Protein Data Bank (PDB) ID No. 2HWZ) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (IgG), направленное против эпитопа в антигенном сайте А белка F РСВ, и представляет собой подходящее контрольное антитело, домены VL и VH которого можно применять для получения контрольных диател и других контрольных связывающих молекул. Альтернативные антитела к гликопротеину F РСВ включают мотавизумаб (см., например, PDB ID No. 3IXT) и вариант паливизумаба, модифицированный для удаления остатков цистеина из CDR1 легкой цепи. Вариант паливизумаба применяли для получения контрольных молекул, представленных ниже.[000445] Palivizumab (see, for example, Protein Data Bank (PDB) ID No. 2HWZ) is a humanized monoclonal antibody (IgG) directed against an epitope at the antigenic site A of the RSV F protein, and is a suitable control antibody, VL domains and VH of which can be used to prepare control diabodies and other control binding molecules. Alternative antibodies to RSV F glycoprotein include motavizumab (see, for example, PDB ID No. 3IXT) and a variant of palivizumab modified to remove cysteine residues from the light chain CDR1. The palivizumab variant was used to generate the control molecules shown below.

[000446] Аминокислотная последовательность домена VH варианта паливизумаба (SEQ ID NO: 126) представлена ниже (остатки CDR_H выделены подчеркиванием):[000446] The amino acid sequence of the VH domain of the palivizumab variant (SEQ ID NO: 126) is shown below (CDR _H residues are underlined):

QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS MITNWYFDVW GAGTTVTVSSQVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVG WIR QPPGKALEWL AD IWWDDKKD YNPSLKS RLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCAR S MITNWYFDV W GAGTTVTVSS

[000447] Аминокислотная последовательность домена VL варианта паливизумаба (SEQ ID NO: 127) представлена ниже (остатки CDR_L выделены подчеркиванием):[000447] The amino acid sequence of the VL domain of the palivizumab variant (SEQ ID NO: 127) is shown below (CDR _L residues are underlined):

DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT SKIASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG TKLEIKDIQMTQSPST LSASVGDRVT ITC RASQSVG YMH WYQQKPG KAPKLLIY DT SKIAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYC FQG SGYPFT FGGG TKLEIK

VI. Обобщенное описание CD137×TA связывающих и контрольных молекулVI. General description of CD137xTA binding and control molecules

[000448] В таблице 5 обобщены характерные признаки доменов DART-А - DART-G, TRIDENT-A-A5:[000448] Table 5 summarizes the characteristic features of the DART-A - DART-G, TRIDENT-A-A5 domains:

[000449] В таблице 6 представлены характерные признаки дополнительных молекул DART и TRIDENT, которые были получены:[000449] Table 6 shows the characteristics of additional DART and TRIDENT molecules that were obtained:

VII. Фармацевтические композицииVII. Pharmaceutical compositions

[000450] Композиции согласно настоящему изобретению включают нерасфасованные лекарственные композиции, которые можно применять при изготовлении фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиций) и фармацевтических композиций (т.е. композиций, которые пригодны для введения субъекту или пациенту), которые можно применять при получении стандартных лекарственных форм. Такие композиции содержат CD137×TA связывающую молекулу согласно настоящему изобретению или комбинацию таких агентов и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно композиции согласно настоящему изобретению содержат профилактически или терапевтически эффективное количество CD137×TA биспецифического Fc-несущего диатела согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.[000450] The compositions of the present invention include bulk drug compositions that can be used in the manufacture of pharmaceutical compositions (e.g., crude or non-sterile compositions) and pharmaceutical compositions (i.e., compositions that are suitable for administration to a subject or patient) that can be used for obtaining standard dosage forms. Such compositions contain the CD137xTA binding molecule of the present invention or a combination of such agents and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, the compositions of the present invention contain a prophylactically or therapeutically effective amount of a CD137xTA bispecific Fc-carrying diabody of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.

[000451] Настоящее изобретение также охватывает фармацевтические композиции, содержащие CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению и одну или более дополнительных молекул, которые эффективны при стимуляции иммунного ответа (например, ингибитор контрольной точки иммунного ответа) и/или в комбинации с одной или более дополнительными молекулами, которые специфично связывают опухолевый антиген (например, опухолеспецифичное моноклональное антитело или диатело), которые специфичны для по меньшей мере одного конкретного опухолевого антигена (ТА, как описано выше), и фармацевтически приемлемый носитель.[000451] The present invention also includes pharmaceutical compositions comprising the CD137xTA binding molecules of the present invention and one or more additional molecules that are effective in stimulating an immune response (eg, an immune checkpoint inhibitor) and/or in combination with one or more additional molecules that specifically bind a tumor antigen (eg, a tumor-specific monoclonal antibody or diabody) that are specific for at least one specific tumor antigen (TA, as described above), and a pharmaceutically acceptable carrier.

[000452] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, в частности, у человека. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательному веществу или среде, с которыми вводят терапевтическое средство. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости. Водные носители, такие как солевые растворы, водные растворы декстрозы и глицерина являются предпочтительными, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно.[000452] In a specific embodiment of the present invention, the term “pharmaceutically acceptable” means approved by a regulatory agency of the federal or state government or listed in the United States Pharmacopoeia or other generally accepted pharmacopoeia for use in animals and, in particular, in humans. The term "carrier" refers to the diluent, adjuvant (eg, Freund's adjuvant (complete and incomplete), excipient or vehicle with which the therapeutic agent is administered. Such pharmaceutical carriers may be sterile liquids. Aqueous vehicles such as saline solutions, aqueous dextrose solutions and glycerol are preferred when the pharmaceutical composition is administered intravenously.

[000453] Обычно ингредиенты композиций согласно настоящему изобретению поставляются либо по отдельности, либо смешанными в виде стандартной лекарственной формы, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если композиция предназначена для введения путем инфузии, она может распределяться с флаконом для инфузии, содержащим стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если композиция предназначена для введения путем инъекции, может быть обеспечена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора для смешивания ингредиентов перед введением.[000453] Typically, the ingredients of the compositions of the present invention are supplied either separately or mixed in unit dosage form, for example, as a dry lyophilized powder or an anhydrous concentrate in a hermetically sealed container, such as an ampoule or sachet, indicating the amount of active agent. If the composition is to be administered by infusion, it may be dispensed with an infusion bottle containing sterile water or pharmaceutical grade saline. If the composition is to be administered by injection, an ampoule of sterile water for injection or saline may be provided to mix the ingredients before administration.

[000454] Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более контейнеров, содержащих CD137×TA связывающую молекулу согласно настоящему изобретению, по отдельности или с другими агентами, предпочтительно с фармацевтически приемлемым носителем. Помимо этого один или более других профилактических или терапевтических агентов, которые можно применять для лечения заболевания, также могут быть включены в фармацевтическую упаковку или набор. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. При желании с таким (и) контейнером (ами) может быть связано уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, причем это уведомление отражает одобрение этим агентством изготовления, применения или продажи для введения человеку.[000454] The present invention also provides a pharmaceutical package or kit containing one or more containers containing the CD137xTA binding molecule of the present invention, alone or with other agents, preferably with a pharmaceutically acceptable carrier. In addition, one or more other prophylactic or therapeutic agents that can be used to treat a disease may also be included in the pharmaceutical package or kit. The present invention also provides a pharmaceutical package or kit containing one or more containers filled with one or more ingredients of the pharmaceutical compositions of the present invention. If desired, such container(s) may be accompanied by a notice in a form prescribed by a government agency regulating the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, which notice reflects such agency's approval of the manufacture, use, or sale for administration to humans.

[000455] Набор может содержать CD137×TA связывающую молекулу согласно настоящему изобретению. Набор может дополнительно содержать один или более других профилактических и/или терапевтических агентов, которые можно применять для лечения рака, в одном или более контейнерах; и/или набор может дополнительно содержать одно или более цитотоксических антител, которые связывают один или более опухолевых антигенов (ТА). Согласно определенным вариантам реализации другой профилактический или терапевтический агент представляет собой химиотерапевтическое средство. Согласно другим вариантам реализации профилактическое или терапевтическое средство представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.[000455] The kit may contain a CD137xTA binding molecule according to the present invention. The kit may further contain one or more other prophylactic and/or therapeutic agents that can be used to treat cancer in one or more containers; and/or the kit may further contain one or more cytotoxic antibodies that bind one or more tumor antigens (TAs). In certain embodiments, the other prophylactic or therapeutic agent is a chemotherapeutic agent. In other embodiments, the prophylactic or therapeutic agent is a biological or hormonal therapeutic agent.

VIII. Способы введенияVIII. Methods of administration

[000456] Композиции согласно настоящему изобретению могут быть обеспечены для лечения, профилактики и улучшения одного или более симптомов, ассоциированных с раком или другим заболеванием, или нарушением, путем введения субъекту эффективного количества молекулы согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции, содержащей молекулу согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительному аспекту такие композиции являются по существу чистыми (т.е. по существу не содержат вещества, которые ограничивают их действие или вызывают нежелательные побочные эффекты). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, такое как млекопитающее, отличное от примата (например, бычьих, лошадиных, кошачьих, собачьих, грызунов и т.д.), или примата (например, обезьяну, такую как яванская макака, человек и т.д.). В предпочтительном варианте реализации субъект представляет собой человека.[000456] Compositions of the present invention may be provided for the treatment, prevention, and amelioration of one or more symptoms associated with cancer or other disease or disorder by administering to a subject an effective amount of a molecule of the present invention or a pharmaceutical composition containing a molecule of the present invention. In a preferred aspect, such compositions are substantially pure (ie, substantially free of substances that limit their effect or cause undesirable side effects). In a specific embodiment of the present invention, the subject is an animal, preferably a mammal, such as a non-primate mammal (e.g., bovine, equine, feline, canine, rodent, etc.), or a primate (e.g., a monkey such as a Javan monkey). macaque, human, etc.). In a preferred embodiment, the subject is a human.

[000457] Различные системы доставки известны и могут применяться для введения молекул и композиций согласно настоящему изобретению, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или гибридный белок, опосредуемый рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) «Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System», J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д.[000457] Various delivery systems are known and can be used to administer the molecules and compositions of the present invention, for example, encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules, recombinant cells capable of expressing an antibody or fusion protein, receptor-mediated endocytosis (see, for example, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System", J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construction of a nucleic acid as part of a retroviral or other vector, etc.

[000458] Способы введения молекулы согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются указанными, парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и через слизистые оболочки (например, интраназальный и пероральный пути). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и слизистую оболочку кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным.[000458] Methods of administration of the molecule of the present invention include, but are not limited to, parenteral (eg, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous), epidural, and mucosal (eg, intranasal and oral routes). In a specific embodiment of the present invention, the CD137xTA binding molecules of the present invention are administered intramuscularly, intravenously, or subcutaneously. The compositions can be administered by any convenient route, for example, by infusion or bolus injection, by absorption through epithelial or mucous membranes (for example, oral mucosa, rectal mucosa and intestinal mucosa, etc.) and can be administered together with other biologically active agents. Administration may be systemic or local.

[000459] Согласно настоящему изобретению также предложены CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, упакованные в герметически закрытый контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества молекулы. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению поставляются в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере и могут быть восстановлены, например, с применением воды или солевого раствора до соответствующей концентрации для введения субъекту. Предпочтительно CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению поставляются в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметически закрытом контейнере.[000459] The present invention also provides the CD137xTA binding molecules of the present invention, packaged in a hermetically sealed container, such as an ampoule or sachet, indicating the amount of the molecule. In one embodiment, the CD137xTA binding molecules of the present invention are provided as a dry, sterilized, lyophilized powder or anhydrous concentrate in a sealed container and can be reconstituted, for example, using water or saline to the appropriate concentration for administration to a subject. Preferably, the CD137xTA binding molecules of the present invention are supplied as a dry, sterile, lyophilized powder in a hermetically sealed container.

[000460] Лиофилизированные CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению следует хранить при температуре от 2 до 8°С в их оригинальном контейнере, и молекулы следует вводить в течение 12 часов, предпочтительно в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 3 часов или в течение 1 часа после восстановления. В альтернативном варианте реализации CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению поставляются в жидкой форме в герметически закрытом контейнере с указанием количества и концентрации молекулы, гибридного белка или конъюгированной молекулы. Предпочтительно жидкая форма CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению поставляется в герметически закрытом контейнере.[000460] The lyophilized CD137xTA binding molecules of the present invention should be stored at 2 to 8° C. in their original container, and the molecules should be administered within 12 hours, preferably within 6 hours, within 5 hours, within 3 hours or within 1 hour after recovery. In an alternative embodiment, the CD137xTA binding molecules of the present invention are provided in liquid form in a sealed container indicating the amount and concentration of the molecule, fusion protein, or conjugated molecule. Preferably, the liquid form of the CD137xTA binding molecules of the present invention is supplied in a hermetically sealed container.

[000461] Количество композиции согласно настоящему изобретению, которое будет эффективным в лечении, предотвращении или улучшении одного или более симптомов, ассоциированных с нарушением, может быть определено с помощью стандартных клинических методик. Точная доза, которая будет применяться в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности состояния и должна определяться в соответствии с суждением практикующего врача и обстоятельствами каждого пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тестовых систем в условиях in vitro или в моделях на животных.[000461] The amount of a composition of the present invention that will be effective in treating, preventing, or ameliorating one or more symptoms associated with a disorder can be determined using standard clinical techniques. The exact dose to be used in a formulation will also depend on the route of administration and the severity of the condition and should be determined in accordance with the judgment of the practitioner and the circumstances of each patient. Effective doses can be extrapolated from dose-response curves obtained from in vitro test systems or animal models.

[000462] В настоящем документе термин «эффективное количество» фармацевтической композиции, в одном варианте реализации, представляет собой количество, достаточное для достижения благоприятных или желательных результатов, включая, но не ограничиваясь указанными, клинические результаты, такие как уменьшение симптомов, вызванных заболеванием, ослабление симптома заболевания (например, пролиферации раковых клеток, наличия опухоли, метастазов опухоли и т.д.), чтобы повысить качество жизни тех, кто страдает этим заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства, например, за счет нацеливания и/или интернализации, задержку прогрессирования заболевания и/или увеличение продолжительности выживания индивидуумов.[000462] As used herein, the term "effective amount" of a pharmaceutical composition, in one embodiment, is an amount sufficient to achieve beneficial or desired results, including, but not limited to, clinical results such as reduction of symptoms caused by a disease, weakening symptom of a disease (e.g. proliferation of cancer cells, presence of a tumor, tumor metastasis, etc.) to improve the quality of life of those suffering from the disease, reducing the dose of other drugs needed to treat the disease, enhancing the effect of another drug, e.g. , through targeting and/or internalization, delaying disease progression and/or increasing the survival time of individuals.

[000463] Такое эффективное количество можно вводить один или несколько раз. Для целей данного изобретения эффективное количество лекарственного препарата, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для уменьшения пролиферации (или эффекта) присутствующего вируса и для уменьшения и/или задержки развития заболевания (например, рака), будь то непосредственно или косвенно. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения эффективное количество лекарственного препарата, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнуто в сочетании с другим лекарственным препаратом, соединением или фармацевтической композицией, но не обязательно. Таким образом, «эффективное количество» может рассматриваться в отношении введения одного или более химиотерапевтических агентов, и один агент может считаться введенным в эффективном количестве, если, в сочетании с одним или более другими агентами, может быть достигнут или достигается желательный результат. Несмотря на то, что индивидуальные потребности различаются, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств каждого компонента находится в пределах квалификации в данной области техники.[000463] Such an effective amount may be administered one or more times. For purposes of this invention, an effective amount of a drug, compound or pharmaceutical composition is an amount sufficient to reduce the proliferation (or effect) of a virus present and to reduce and/or delay the progression of a disease (eg, cancer), whether directly or indirectly. In some embodiments of the present invention, an effective amount of a drug, compound, or pharmaceutical composition may be provided in combination with, but not necessarily, another drug, compound, or pharmaceutical composition. Thus, an “effective amount” may be considered in relation to the administration of one or more chemotherapeutic agents, and one agent may be considered to be administered in an effective amount if, in combination with one or more other agents, the desired result can be or is achieved. Although individual needs vary, determination of optimal ranges of effective amounts of each component is within the skill of the art.

[000464] Для CD137×TA связывающих молекул, охватываемых настоящим изобретением, вводимую пациенту дозу предпочтительно определяют на основании массы тела (кг) субъекта-реципиента. Вводимая доза, как правило, составляет от приблизительно 0,01 мкг/кг до приблизительно 150 мг/кг или более от массы тела субъекта.[000464] For CD137×TA binding molecules covered by the present invention, the dose administered to a patient is preferably determined based on the body weight (kg) of the recipient subject. The dose administered is typically from about 0.01 μg/kg to about 150 mg/kg or more of the subject's body weight.

[000465] Дозировка и частота введения CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению может быть уменьшена или изменена путем усиления поглощения и проникновения в ткани CD137×TA связывающих молекул с помощью таких модификаций как, например, липидирование.[000465] The dosage and frequency of administration of the CD137xTA binding molecules of the present invention can be reduced or modified by enhancing the uptake and tissue penetration of the CD137xTA binding molecules through modifications such as lipidation.

[000466] Дозировка CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению, вводимых пациенту, может быть рассчитана для применения в качестве терапии одним агентом. Согласно другому варианту CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению применяют в комбинации с другими терапевтическими композициями так, что вводимая пациенту дозировка ниже, чем при применении указанных молекул в качестве терапии одним агентом.[000466] The dosage of CD137×TA binding molecules of the present invention administered to a patient can be calculated for use as a single agent therapy. In another embodiment, the CD137xTA binding molecules of the present invention are used in combination with other therapeutic compositions such that the dosage administered to the patient is lower than when the molecules are used as single agent therapy.

[000467] Лечение субъекта с применением терапевтически или профилактически эффективного количества CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению может включать однократное введение или предпочтительно может включать несколько введений. В предпочтительном примере субъекта лечат с применением такого диатела один раз в неделю, один раз в две недели (т.е. один раз каждые две недели) или один раз каждые три недели в течение от 1 до 52 недель. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить один раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки. Согласно другому варианту фармацевтические композиции можно вводить один раз в неделю, два раза в неделю, один раз каждые две недели, один раз в месяц, один раз каждые шесть недель, один раз каждые два месяца, два раза в год или один раз в год. Также следует понимать, что эффективная дозировка молекул, применяемых для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в ходе конкретного лечения.[000467] Treatment of a subject with a therapeutically or prophylactically effective amount of CD137xTA binding molecules according to the present invention may involve a single administration, or preferably may involve multiple administrations. In a preferred example, the subject is treated with such a diabody once a week, once every two weeks (ie, once every two weeks), or once every three weeks for 1 to 52 weeks. The pharmaceutical compositions of the present invention can be administered once a day, twice a day or three times a day. In another embodiment, the pharmaceutical compositions can be administered once a week, twice a week, once every two weeks, once a month, once every six weeks, once every two months, twice a year, or once a year. It should also be understood that the effective dosage of the molecules used for treatment may increase or decrease during a particular treatment.

IX. Применение композиций согласно настоящему изобретению.IX. Use of compositions according to the present invention.

[000468] CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны связывать Т-клетки (АПК) (например, за счет связывания с CD 137, экспрессируемым на поверхности таких Т-клеток) и способны связывать ТА-экспрессирующие опухолевые клетки (например, за счет связывания с ТА, экспрессируемым на поверхности таких опухолевых клеток). Таким образом, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны ко локализовать Т-клетки с опухолевыми клетками, экспрессирующими ТА, и, соответственно, могут применяться для лечения любого заболевания или состояния, ассоциированного или характеризующегося экспрессией ТА. Таким образом, но не ограничиваясь этим, фармацевтические композиции, содержащие такие молекулы, можно применять для диагностики или лечения видов рака, которые экспрессируют ТА, включая такие виды рака, которые характеризуются наличием раковой клетки, включая, но не ограничиваясь раковой клеткой, острого миелолейкоза, опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухолей сонных артерий, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной карциномы почек, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, экстраскелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластического заболевания, герминогенной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, глиобластомы, опухоли из островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, злокачественной мезотелиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли околощитовидной железы, педиатрического рака, опухоли оболочек периферических нервов, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, постериорной увеальной меланомы, редкого гематологического заболевания, карциномы почек, метастатического рака почек, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичек, рака тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы или рака матки.[000468] The CD137xTA binding molecules of the present invention are capable of binding T cells (APC) (e.g., by binding to CD 137 expressed on the surface of such T cells) and are capable of binding TA-expressing tumor cells (e.g., by binding to TA expressed on the surface of such tumor cells). Thus, the CD137xTA binding molecules of the present invention are capable of colocalizing T cells with tumor cells expressing TA, and accordingly can be used to treat any disease or condition associated with or characterized by TA expression. Thus, but not limited to, pharmaceutical compositions containing such molecules can be used for the diagnosis or treatment of cancers that express TA, including those characterized by the presence of a cancer cell, including, but not limited to, a cancer cell, acute myeloid leukemia, adrenal tumors, AIDS-associated cancer, alveolar soft tissue sarcoma, astrocytic tumor, bladder cancer, bone cancer, brain and spinal cord cancer, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal carcinoma, clear cell carcinoma, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing tumor, extraskeletal myxoid chondrosarcoma, fibrogenesis imperfecta, fibrous dysplasia of bone, gallbladder or bile duct cancer, gastric cancer, gestational trophoblastic disease, germ cell tumor, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, islet cell tumor, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, leukemia, lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/malignant lipomatous tumor, liver cancer, lymphoma, lung cancer, medulloblastoma, melanoma, meningioma, malignant mesothelioma, multiple endocrine neoplasia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumors, non-small cell lung cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, pharyngeal cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, pediatric cancer, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, posterior uveal melanoma, rare hematological disease, renal carcinoma, metastatic renal cancer, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, gastric cancer, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic cancer, thymoma, metastatic thyroid cancer or uterine cancer.

[000469] В частности, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно применять для лечения разных видов плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN), разных видов рака мочевого пузыря, разных видов рака молочной железы, разных видов колоректального рака, разных видов рака желудка, глиобластом, разных видов рака почек, разных видов рака легких, включая немелкоклеточный рак легких (NSCLC), меланом, разных видов рака яичников, разных видов рака поджелудочной железы, разных видов рака глотки, разных видов рака предстательной железы, карцином почек и опухолей из небольших округлых синих клеток у детей, включая нейробластомы и рабдомиосаркомы, каждая из которых экспрессирует ТА на высоком уровне.[000469] In particular, the CD137xTA binding molecules of the present invention can be used to treat various types of squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN), various types of bladder cancer, various types of breast cancer, various types of colorectal cancer, various types of gastric cancer , glioblastomas, different types of kidney cancer, different types of lung cancer, including non-small cell lung cancer (NSCLC), melanomas, different types of ovarian cancer, different types of pancreatic cancer, different types of pharyngeal cancer, different types of prostate cancer, kidney carcinomas and tumors from small round blue cells in children, including neuroblastomas and rhabdomyosarcomas, each of which expresses TA at high levels.

[000470] CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно дополнительно применять при изготовлении лекарственных средств для лечения описанных выше состояний.[000470] The CD137xTA binding molecules of the present invention can further be used in the manufacture of medicaments for the treatment of the conditions described above.

[000471] Как продемонстрировано в настоящем документе, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению повышают активность агентов, нацеленных на опухоль. В соответствии с этим CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно дополнительно применять в комбинации с другими агентами, нацеленными на опухоль, включая, но не ограничиваясь указанными, антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, scFv, Fab, F(ab)₂ и т.д., TandAb и т.д.), полиспецифическую связывающую молекулу (например, диатело, биспецифическое антитело, трехвалентную связывающую молекулу и т.д.), способные связывать желательный ТА. Конкретно предусмотрено, что агент, нацеленный на опухоль, может связывать тот же или другой ТА, что и CD137×TA связывающая молекула, применяемая в таких комбинациях. В конкретных вариантах реализации агент, нацеленный на опухоль, представляет собой полиспецифическую молекулу, которая связывается с ТА и эпитопом, экспрессируемым на Т-клетках, включая, например, CD3 и/или CD8. Примерные агенты, нацеленные на опухоль, включают, но не ограничиваются указанными, молекулы, которые связываются с ТА и CD3 («TA×CD3»). Примерные TA×CD3 связывающие молекулы (например, биспецифические антитела, молекулы DART^®, молекулы BiTe^®, TandAb и т.д.) и способы их получения, которые можно применять в таких комбинациях, хорошо известны в данной области техники (см., например, WO 2013026835, WO 2013158856, WO 2014047231; WO 2014110601; WO 2014131711; WO 2015/026894; WO 2015026892; WO 2015/184203; WO 2016/036937; WO 2016182751; WO 2017091656; WO 2017/142928; WO 2017118675).[000471] As demonstrated herein, the CD137xTA binding molecules of the present invention enhance the activity of tumor-targeting agents. Accordingly, the CD137xTA binding molecules of the present invention can further be used in combination with other tumor-targeting agents, including, but not limited to, an antibody, an antigen binding fragment of an antibody (e.g., scFv, Fab, F(ab) ₂ and etc., TandAb, etc.), a multispecific binding molecule (eg, diabody, bispecific antibody, trivalent binding molecule, etc.) capable of binding the desired TA. It is specifically contemplated that the tumor-targeting agent may bind the same or a different TA as the CD137×TA binding molecule used in such combinations. In specific embodiments, the tumor-targeting agent is a multispecific molecule that binds to TA and an epitope expressed on T cells, including, for example, CD3 and/or CD8. Exemplary tumor-targeting agents include, but are not limited to, molecules that bind to TA and CD3 (“TA×CD3”). Exemplary TAxCD3 binding molecules (eg, bispecific antibodies, ^DART® molecules, ^BiTe® molecules, TandAb, etc.) and methods for their preparation that can be used in such combinations are well known in the art (see, e.g. , WO 2013026835, WO 2013158856, WO 2014047231; WO 2014110601; WO 2014131711; WO 2015/026894; WO 2015026892; WO 2015/184203; WO 201 6/036937; WO 2016182751; WO 2017091656; WO 2017/142928; WO 2017118675).

[000472] Как предусмотрено в настоящем документе, применение CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению в комбинации с агентом, нацеленным на опухоль (например, TA×CD3 связывающей молекулой), может приводить к активации ингибирующего иммунного модулятора, белка запрограммированной гибели клеток 1 («PD-1», также известного как «CD279»). PD-1 опосредует ингибирование иммунной системы, связывая PD-L1 и PD-L2 (также известные как В7-Н1 и B7-DC) (Flies, D.B. et at. (2007) «The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity», J. Immunother. 30(3):251-260; патенты США №№6803192; 7794710; публикации заявок на патент США №№2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; РСТ публикации №WO 01/39722; WO 02/086083). Однако, как показано в настоящем документе, дополнительное добавление агента, который ингибирует ингибирующую активность PD-1 («ингибитор контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1»), подавляет экспрессию PD-1 и дополнительно повышает активность CD137×TA и агентов, нацеленных на опухоль, таких как TA×CD3 связывающие молекулы. В частности, настоящее изобретение охватывает ингибиторы контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, содержащие эпитопсвязывающий сайт антитела, которое связывает PD-1.[000472] As provided herein, use of the CD137×TA binding molecules of the present invention in combination with a tumor-targeting agent (eg, a TA×CD3 binding molecule) can result in activation of the inhibitory immune modulator, programmed cell death protein 1 ( "PD-1", also known as "CD279"). PD-1 mediates immune system inhibition by binding PD-L1 and PD-L2 (also known as B7-H1 and B7-DC) (Flies, D.B. et al. (2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ", J. Immunother. 30(3):251-260; US patents No. 6803192; 7794710; US patent application publications No. 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; PCT publication No. WO 01/39722; WO 02/086083). However, as shown herein, the additional addition of an agent that inhibits the inhibitory activity of PD-1 ("PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor") suppresses PD-1 expression and further increases the activity of CD137xTA and agents tumor-targeting molecules, such as TA×CD3 binding molecules. In particular, the present invention covers PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitors containing an epitope-binding site of an antibody that binds PD-1.

[000473] Соответственно, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно дополнительно применять в комбинации с другими агентами, нацеленными на опухоль, в дополнительной комбинации с ингибитором контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1. Ингибиторы контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1 включают, но не ограничиваются указанными, антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, scFv, Fab, F(ab)₂ и т.д., TandAb и т.д.), полиспецифическую связывающую молекулу (например, диатело, биспецифическое антитело, трехвалентную связывающую молекулу и т.д.), способную связываться с PD-1 и/или PD-L1. Примерные ингибиторы контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1 и способы их изготовления, которые можно применять в таких комбинациях, хорошо известны в данной области техники (см., например, патенты США №№9617338; 9273135; 9062112; 8981063; 8779108; 8609089; 8552154; 8460927; 8008449; публикации патентов США №№2015/0197571; 2016/0075782; 2016/0159905; 2016/0319019; 2017/0044259; РСТ публикации патентов №№ WO 2004/056875; WO 2006/121168; WO 2008/156712; WO 2012/135408; WO 2012/145549; WO 2013/014668; WO 2014/055897; WO 2013/079174; WO 2014/179664; WO 2014/194302; WO 2015/109124; WO 2015/112800; WO 2015/112805; WO 2016/000619; WO 2016007235; WO 2016/061142; WO 2016/111645; WO 2016/210262; WO 2016/014688; WO 2016/077397; WO 2017/019846; WO 2017/079112; WO 2017/087547; и WO 2017/106656).[000473] Accordingly, the CD137xTA binding molecules of the present invention can be further used in combination with other tumor-targeting agents, in additional combination with a PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor. PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitors include, but are not limited to, an antibody, an antigen binding fragment of an antibody (e.g., scFv, Fab, F(ab) ₂ , etc., TandAb, etc.), a multispecific binding molecule (eg, diabody, bispecific antibody, trivalent binding molecule, etc.) capable of binding to PD-1 and/or PD-L1. Exemplary PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitors and methods for making them that can be used in such combinations are well known in the art (see, for example, US Pat. Nos. 9,617,338; 9273135; 9062112; 8981063; 8779108 ; 8609089; 8552154; 8460927; 8008449; US patent publications No. 2015/0197571; 2016/0075782; 2016/0159905; 2016/0319019; 2017/0044259; PCT patent publications No. WO 2004/056875; WO 2006/121168; WO 2008/156712; WO 2012/135408; WO 2012/145549; WO 2013/014668; WO 2014/055897; WO 2013/079174; WO 2014/179664; WO 2014/194302; WO 2 015/109124;WO 2015/112800;WO 2015/112805; WO 2016/000619; WO 2016007235; WO 2016/061142; WO 2016/111645; WO 2016/210262; WO 2016/014688; WO 2016/077397; WO 20 17/019846; WO 2017/079112; WO 2017/ 087547; and WO 2017/106656).

[000474] При применении таких комбинаций конкретно предусмотрено, что одна или более молекул могут быть введены субъекту «одновременно» (например, CD137×TA связывающая молекула может быть введена одновременно с введением TA×CD3 связывающей молекулы и/или ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1) и/или что одну или более молекул можно вводить «последовательно» (например, вводят CD137×TA связывающую молекулу и позднее вводят TA×CD3 связывающую молекулу и/или ингибитор контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, или наоборот).[000474] When such combinations are used, it is specifically contemplated that one or more molecules may be administered to a subject "simultaneously" (e.g., a CD137xTA binding molecule may be administered simultaneously with the administration of a TAxCD3 binding molecule and/or a PD immune checkpoint inhibitor -1/PD-L1) and/or that one or more molecules can be administered “sequentially” (eg, CD137xTA binding molecule is administered and later TAxCD3 binding molecule and/or PD-1/PD immune checkpoint inhibitor is administered -L1, or vice versa).

X. Конкретные варианты реализации изобретенияX. Specific embodiments of the invention

[000475] Настоящее изобретение было описано выше в общих чертах, оно будет более понятно со ссылкой на следующие пронумерованные варианты реализации («Е»), которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное:[000475] The present invention has been described above in general terms and will be better understood with reference to the following numbered embodiments (“E”), which are presented by way of illustration and are not intended to limit the present invention unless otherwise indicated:

E1. CD137×TA связывающая молекула, которая характеризуется тем, что такая связывающая молекула способна специфично связываться с эпитопом CD137 и эпитопом опухолевого антигена (ТА) и такая CD137×TA связывающая молекула содержит первый вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; и при этомE1. CD137×TA binding molecule, which is characterized in that such binding molecule is capable of specifically binding to a CD137 epitope and a tumor antigen (TA) epitope, and such CD137×TA binding molecule contains a first light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a first heavy chain variable domain, which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and wherein

(G) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(G) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 light chain VL CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 74);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-3 VH heavy chain CDR to CD137 (SEQ ID NO: 74);

(H) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 91); и(H) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-4 light chain VL CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 91); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-4 к CD137 (SEQ ID NO: 90);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-4 VH heavy chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 90);

(I) (1) C CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-5 к CD137 (SEQ ID NO: 97); и(I) (1) C CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-5 VL light chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 97); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH МАВ-5 к CD137 (SEQ ID NO: 96);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the MAB-5 VH heavy chain CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 96);

(J) (1) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 первого вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 75); и(J) (1) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the first light chain variable domain are the MAB-3 light chain VL CDRs to CD137 (SEQ ID NO: 75); And

(2) CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3 первого вариабельного домена тяжелой цепи представляют собой CDR тяжелой цепи VH1A МАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 83);(2) CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3 of the first heavy chain variable domain are the VH1A heavy chain CDRs of MAB-3 to CD137 (SEQ ID NO: 83);

Е2. CD137×TA связывающая молекула по п. Е1, которая характеризуется тем, что указанный первый вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:E2. CD137xTA binding molecule according to claim E1, which is characterized in that said first heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) ЬМАВ-3 к CD137 (SEQ ID NO: 77); или(A) LMAV-3 to CD137 (SEQ ID NO: 77); or

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92).

Е3. CD137×TA связывающая молекула по п. Е1 или Е2, которая характеризуется тем, что указанный первый вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:E3. CD137xTA binding molecule according to claim E1 or E2, which is characterized in that said first light chain variable domain contains the amino acid sequence:

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 93).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 93).

Е4. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е3, которая характеризуется тем, что указанный первый вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:E4. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E3, which is characterized in that said first heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

E5. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е4, которая характеризуется тем, что указанный первый вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:E5. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E4, which is characterized in that said first light chain variable domain contains the amino acid sequence:

E6. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е5, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) выбран из группы опухолевых антигенов, состоящей из: 19.9; онкофетального белка 5Т4; антигена 4.2; А33; AFP; ALCAM; BAGE; бета-катенина; СА125; карбоксипептидазы М; B1;CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; СЕА; CEACAM5; СЕАСАМ6; СО-43; СО-514; CTLA-1; CTLA-4; цитокератина 8; ряда Е1; ЭФР-Р; рецептора эфрина; Erb; F3; FC10.2; GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19-9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; антигена CD20 В-лимфомы человека; антигена жировых глобул человеческого молока; Е6 папилломавируса человека/Е7 папилломавируса человека; HMW-MAA; антигена I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; общего антигена карциномы KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; М18; М39; MAGE; MART; My1; MUC-1; MUM-1; N-ацетилглюкозаминилтрансферазы; неогликопротеина; NS-10; OFA-1; OFA-2; онкостатина M; p15; PSA; PSMA; РЕМА; PIPA; простатической кислой фосфатазы; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; пептида, происходящего из рецептора Т-клеток; TAG-72; TL5; рецептора TNF-α; рецептора TNF-β; рецептора TNF-γ; TRA-1-85; рецептора трансферрина; TSTA; и VEGF-R.E6. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E5, which is characterized in that the specified tumor antigen (TA) is selected from the group of tumor antigens consisting of: 19.9; oncofetal protein 5T4; antigen 4.2; A33; AFP; ALCAM; BAGE; beta-catenin; CA125; carboxypeptidase M; B1;CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD123; CD317; CEA; CEACAM5; SEASAM6; SO-43; SO-514; CTLA-1; CTLA-4; cytokeratin 8; row E1; EGF-R; ephrin receptor; Erb; F3; FC10.2; GAGE GD2; GD3; GD49; GM2; GM3; GICA 19-9; gp37; gp75; gp100; HER-2/neu; human B lymphoma antigen CD20; human milk fat globule antigen; E6 human papillomavirus/E7 human papillomavirus; HMW-MAA; antigen I; ITGB6; IL13Rα2; JAM-3; KID3; KID31; common carcinoma antigen KS 1/4; KS 1/4; KSA; L6; L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; MAGE; MART; My1; MUC-1; MUM-1; N-acetylglucosaminyltransferase; neoglycoprotein; NS-10; OFA-1; OFA-2; oncostatin M; p15; PSA; PSMA; REMA; PIPA; prostatic acid phosphatase; R24; ROR1; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; T-cell receptor-derived peptide; TAG-72; TL5; TNF-α receptor; TNF-β receptor; TNF-γ receptor; TRA-1-85; transferrin receptor; TSTA; and VEGF-R.

Е7. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е5, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) выбран из опухолевых антигенов в таблице 1.E7. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E5, which is characterized in that the specified tumor antigen (TA) is selected from the tumor antigens in table 1.

Е8. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е7, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой: HER2/neu, EphA2 или 5Т4.E8. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E7, which is characterized by the fact that the specified tumor antigen (TA) is: HER2/neu, EphA2 or 5T4.

Е9. CD137×TA связывающая молекула по п. Е8, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu и CD137×TA связывающая молекула содержит второй вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; и при этом:E9. CD137×TA binding molecule according to claim E8, which is characterized in that said tumor antigen (TA) is HER2/neu and the CD137×TA binding molecule contains a second light chain variable domain, which contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a first heavy chain variable domain, which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and wherein:

Е10. CD137×TA связывающая молекула по п. Е9, в которой:E10. CD137xTA binding molecule according to clause E9, in which:

(3) CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 второго вариабельного домена легкой цепи представляют собой CDR легкой цепи VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69);(3) CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 of the second light chain variable domain are the hMAB-1 light chain VL3 CDRs to HER2 (SEQ ID NO: 69);

иAnd

E11. CD137×TA связывающая молекула по п.ЕЮ, которая характеризуется тем, что указанный второй вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:E11. CD137xTA binding molecule according to paragraph EE, which is characterized in that the specified second variable domain of the heavy chain contains the amino acid sequence:

(A) VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64);(A) VH1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 64);

(C) VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66).(C) VH3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 66).

E12. CD137×TA связывающая молекула по пп. Е10 или Е11, которая характеризуется тем, что указанный второй вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:E12. CD137xTA binding molecule according to claims. E10 or E11, which is characterized in that said second light chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 67);(A) VL1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 67);

(C) VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69).(C) VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69).

E13. CD137×TA связывающая молекула по п. Е8, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой 5Т4 и CD137×TA связывающая молекула содержит второй вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3 , и первый вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; и при этом:E13. CD137×TA binding molecule according to claim E8, which is characterized in that said tumor antigen (TA) is 5T4 and the CD137×TA binding molecule contains a second light chain variable domain, which contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3 , and a first heavy chain variable domain, which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and wherein:

Е14. CD137×TA связывающая молекула по п. Е13, которая характеризуется тем, что указанный второй вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность: VH1 МАВ-1 (SEQ ID NO: 135).E14. CD137xTA binding molecule according to claim E13, which is characterized in that said second heavy chain variable domain contains the amino acid sequence: VH1 MAB-1 (SEQ ID NO: 135).

Е15. CD137×TA связывающая молекула по п. Е13 или Е14, которая характеризуется тем, что указанный второй вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность: VH1 МАВ-1 (SEQ ID NO: 136).E15. A CD137xTA binding molecule according to claim E13 or E14, which is characterized in that said second light chain variable domain contains the amino acid sequence: VH1 MAB-1 (SEQ ID NO: 136).

Е16. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е15, причем указанная молекула представляет собой биспецифическое четырехвалентное Fc-несущее диатело, содержащее первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи, при этом указанные полипептидные цепи образуют ковалентно связанный комплекс.E16. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E15, wherein said molecule is a bispecific tetravalent Fc-bearing diabody containing first, second, third and fourth polypeptide chains, said polypeptide chains forming a covalently linked complex.

Е17. CD137×TA связывающая молекула по п. Е16, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu и при этом:E17. CD137xTA binding molecule according to clause E16, which is characterized in that the specified tumor antigen (TA) is HER2/neu and at the same time:

(В) вторая и четвертая полипептидные цепи имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 101; или(B) the second and fourth polypeptide chains have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101; or

Е18. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-Е15, причем указанная молекула является биспецифической и четырехвалентной и содержит первую, вторую, третью, четвертую и пятую полипептидные цепи, при этом указанные полипептидные цепи образуют ковалентно связанный комплекс.E18. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E15, wherein said molecule is bispecific and tetravalent and contains first, second, third, fourth and fifth polypeptide chains, said polypeptide chains forming a covalently linked complex.

Е19. CD137×TA связывающая молекула по п. Е15, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu и при этом:E19. CD137xTA binding molecule according to clause E15, which is characterized in that the specified tumor antigen (TA) is HER2/neu and at the same time:

илиor

E20. CD137×TA связывающая молекула по любому из пп. Е1-15, причем указанная молекула является биспецифической и трехвалентной и содержит первую, вторую, третью и четвертую полипептидные цепи, при этом указанные полипептидные цепи образуют ковалентно связанный комплекс.E20. CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-15, wherein said molecule is bispecific and trivalent and contains first, second, third and fourth polypeptide chains, said polypeptide chains forming a covalently linked complex.

Е21. CD137×TA связывающая молекула по п. Е20, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой HER2/neu и при этом:E21. CD137xTA binding molecule according to clause E20, which is characterized in that the specified tumor antigen (TA) is HER2/neu and at the same time:

(D) указанная четвертая полипептидная цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105(D) said fourth polypeptide chain has the amino acid sequence SEQ ID NO: 105

Е23. CD137×TA связывающая молекула по п. Е20, которая характеризуется тем, что указанный опухолевый антиген (ТА) представляет собой 5Т4 и при этом:E23. CD137xTA binding molecule according to clause E20, which is characterized in that the specified tumor antigen (TA) is 5T4 and at the same time:

Е24. Фармацевтическая композиция, содержащая CD137×TA связывающую молекулу по любому из пп. Е1-Е23 и физиологически приемлемый носитель.E24. A pharmaceutical composition containing a CD137×TA binding molecule according to any one of paragraphs. E1-E23 and a physiologically acceptable carrier.

Е25. Применение CD137×TA связывающей молекулы по любому из пп. Е1-Е23 или фармацевтической композиции по п. Е24 в лечении заболевания или состояния, ассоциированного или характеризующегося экспрессией опухолевого антигена (ТА).E25. Use of a CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E23 or a pharmaceutical composition according to claim E24 in the treatment of a disease or condition associated with or characterized by the expression of a tumor antigen (TA).

Е26. Применение по п. Е25, которое характеризуется тем, что указанное заболевание или состояние, ассоциированное или характеризующееся экспрессией опухолевого антигена (ТА), представляет собой рак.E26. Use according to claim E25, which is characterized in that said disease or condition associated with or characterized by the expression of a tumor antigen (TA) is cancer.

Е27. CD137-связывающая молекула, которая содержит вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; причем:E27. A CD137-binding molecule that contains a light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a heavy chain variable domain that contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and:

Е28. CD137-связывающая молекула по п. Е27, которая характеризуется тем, что указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:E28. A CD137-binding molecule according to clause E27, which is characterized in that said heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92).

Е29. CD137-связывающая молекула по п. Е27 или Е28, которая характеризуется тем, что указанный вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:E29. A CD137-binding molecule according to claim E27 or E28, which is characterized in that said light chain variable domain contains the amino acid sequence:

(B) hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 93).(B) hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 93).

Е30. CD137-связывающая молекула по любому из пп. Е27-Е29, которая характеризуется тем, что указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:E30. CD137-binding molecule according to any one of paragraphs. E27-E29, which is characterized in that said heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(I) VH1 hMAB-4 к CD137 (SEQ ID NO: 92)(I) VH1 hMAB-4 to CD137 (SEQ ID NO: 92)

Е31. CD137-связывающая молекула по любому из пп. Е27-Е30, которая характеризуется тем, что указанный вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:E31. CD137-binding molecule according to any one of paragraphs. E27-E30, which is characterized in that said light chain variable domain contains the amino acid sequence:

E32. CD137-связывающая молекула по любому из пп. Е27-31, причем указанная молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.E32. CD137-binding molecule according to any one of paragraphs. E27-31, wherein said molecule is an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

Е33. Фармацевтическая композиция, содержащая CD137-связывающую молекулу по любому из пп. Е27-Е32 и физиологически приемлемый носитель.E33. A pharmaceutical composition containing a CD137-binding molecule according to any one of paragraphs. E27-E32 and a physiologically acceptable carrier.

Е34. Применение CD137-связывающей молекулы по любому из пп. Е27-Е31 или фармацевтической композиции по п. Е33 в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с подавленной иммунной системой или характеризующегося экспрессией опухолевого антигена (ТА).E34. Use of a CD137-binding molecule according to any one of claims. E27-E31 or a pharmaceutical composition according to claim E33 in the treatment of a disease or condition associated with a suppressed immune system or characterized by the expression of a tumor antigen (TA).

Е35. Применение по п. Е34, которое характеризуется тем, что указанное состояние, ассоциированное с подавленной иммунной системой или характеризующееся экспрессией опухолевого антигена (ТА), представляет собой рак.E35. Use according to claim E34, which is characterized in that said condition, associated with a suppressed immune system or characterized by the expression of a tumor antigen (TA), is cancer.

Е36. HER2/neu-связывающая молекула, которая содержит вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; причем:E36. a HER2/neu binding molecule that contains a light chain variable domain that contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a heavy chain variable domain that contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; and:

Е37. HER2/neu-связывающая молекула по п. Е36, в которой:E37. HER2/neu-binding molecule according to clause E36, in which:

иAnd

Е38. HER2/neu-связывающая молекула по п. Е337, которая характеризуется тем, что указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность:E38. HER2/neu-binding molecule according to item E337, which is characterized in that the specified heavy chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64);(A) VH1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 64);

(C) VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66)(C) VH3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 66)

E39. HER2/neu-связывающая молекула по пп. E37-E38, которая характеризуется тем, что указанный вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:E39. HER2/neu-binding molecule according to claims. E37-E38, which is characterized in that said light chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) VL1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 67);(A) VL1 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 67);

(C) VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69)(C) VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69)

E40. HER2/neu-связывающая молекула по любому из пп. E36-E39, которая характеризуется тем, что указанная молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.E40. HER2/neu-binding molecule according to any one of paragraphs. E36-E39, which is characterized in that the specified molecule is an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

Е41. Фармацевтическая композиция, содержащая HER2/neu-связывающую молекулу по любому из пп. Е36-Е40 и физиологически приемлемый носитель.E41. A pharmaceutical composition containing a HER2/neu-binding molecule according to any one of paragraphs. E36-E40 and a physiologically acceptable carrier.

Е42. Применение HER2/heu-связывающей молекулы по любому из пп. Е33-Е37 или фармацевтической композиции по п. Е41 в лечении заболевания или состояния, ассоциированного или характеризующегося экспрессией HER2/neu.E42. Use of a HER2/heu binding molecule according to any one of claims. E33-E37 or a pharmaceutical composition according to claim E41 in the treatment of a disease or condition associated with or characterized by the expression of HER2/neu.

Е43. Применение по п. Е42, которое характеризуется тем, что указанное состояние, ассоциированное или характеризующееся экспрессией HER2/neu, представляет собой рак.E43. Use according to claim E42, which is characterized in that said condition associated with or characterized by the expression of HER2/neu is cancer.

Е44. Способ повышения активности агента, нацеленного на опухоль, включающий введение указанного агента, нацеленного на опухоль, в комбинации с CD137×TA связывающей молекулой по любому из пп. Е1-Е23 или фармацевтической композицией по варианту реализации Е24.E44. A method of increasing the activity of a tumor-targeting agent, comprising administering said tumor-targeting agent in combination with a CD137xTA binding molecule according to any one of claims. E1-E23 or the pharmaceutical composition of embodiment E24.

Е45. Способ лечения заболевания или состояния, ассоциированного с подавленной иммунной системой или характеризующегося экспрессией опухолевого антигена (ТА), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, CD137×TA связывающей молекулы по любому из пп. Е1-Е23 или фармацевтической композиции по п. Е24.E45. A method of treating a disease or condition associated with a suppressed immune system or characterized by the expression of a tumor antigen (TA), comprising administering to a subject in need thereof a CD137×TA binding molecule according to any one of claims. E1-E23 or the pharmaceutical composition according to item E24.

Е46. Способ по п.Е45, который характеризуется тем, что указанное состояние, ассоциированное с подавленной иммунной системой или характеризующееся экспрессией опухолевого антигена (ТА), представляет собой рак.E46. The method according to claim E45, which is characterized in that said condition associated with a suppressed immune system or characterized by the expression of a tumor antigen (TA) is cancer.

Е47. Способ по п. Е45 или Е46, дополнительно включающий введение агента, нацеленного на опухоль.E47. The method according to claim E45 or E46, further comprising administering an agent targeting the tumor.

Е48. Способ по любому из пп. Е44-Е47, дополнительно включающий введение ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1.E48. The method according to any one of paragraphs. E44-E47, further comprising administration of a PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor.

Е49. Способ по п. Е44 или Е47, который характеризуется тем, что указанный агент, нацеленный на опухоль, представляет собой антитело, эпитопсвязывающий фрагмент антитела или агент, который опосредует перенаправленное уничтожение клетки-мишени Т-клетками.E49. The method of claim E44 or E47, wherein said tumor-targeting agent is an antibody, an epitope-binding fragment of an antibody, or an agent that mediates redirected killing of a target cell by T cells.

Е50. Способ по п. Е48 или Е49, который характеризуется тем, что указанный ингибитор контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1 представляет собой антитело к PD-1 или антитело к PD-L1.E50. The method of claim E48 or E49, wherein said PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

Е51. Способ по любому из пп. Е48-Е50, который характеризуется тем, что указанный ингибитор контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1 содержит домены VH и VL антитела, отобранного из тех, которые перечислены в таблице 7: E51. The method according to any one of paragraphs. E48-E50, which is characterized in that said PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor contains the VH and VL domains of an antibody selected from those listed in Table 7:

Е52. Применение по пп. Е26, Е35, Е42 или способ по любому из пп. Е46-Е51, которые характеризуются тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из: острого миелолейкоза, опухоли надпочечников, СПИД-ассоциированного рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухолей сонных артерий, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной карциномы почек, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, экстраскелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластического заболевания, герминогенной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, глиобластомы, опухоли из островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, злокачественной мезотелиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли околощитовидной железы, педиатрического рака, опухоли оболочек периферических нервов, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, постериорной увеальной меланомы, редкого гематологического заболевания, карциномы почек, метастатического рака почек, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичек, рака тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы или рака маткиE52. Application according to paragraphs. E26, E35, E42 or the method according to any one of paragraphs. E46-E51, which are characterized in that said cancer is selected from the group consisting of: acute myeloid leukemia, adrenal tumor, AIDS-associated cancer, alveolar soft tissue sarcoma, astrocytic tumor, bladder cancer, bone cancer, brain and spinal cord cancer, metastatic brain tumor, breast cancer, carotid tumors, cervical cancer, chondrosarcoma, chordoma, chromophobe renal carcinoma, clear cell carcinoma, colon cancer, colorectal cancer, cutaneous benign fibrous histiocytoma, desmoplastic small round cell tumor, ependymoma, Ewing tumor, extraskeletal myxoid chondrosarcoma, bone fibrogenesis imperfecta, fibrous dysplasia of bone, gallbladder or bile duct cancer, gastric cancer, gestational trophoblastic disease, germ cell tumor, head and neck cancer, hepatocellular carcinoma, glioblastoma, islet cell tumor, Kaposi's sarcoma, kidney cancer, leukemia , lipoma/benign lipomatous tumor, liposarcoma/malignant lipomatous tumor, liver cancer, lymphoma, lung cancer, medulloblastoma, melanoma, meningioma, malignant mesothelioma, multiple endocrine neoplasia, multiple myeloma, myelodysplastic syndrome, neuroblastoma, neuroendocrine tumors, non-small cell cancer lungs, cancer ovarian, pancreatic cancer, pharyngeal cancer, papillary thyroid carcinoma, parathyroid tumor, pediatric cancer, peripheral nerve sheath tumor, pheochromocytoma, pituitary tumor, prostate cancer, posterior uveal melanoma, rare hematological disease, renal carcinoma, metastatic renal cancer, rhabdoid tumor, rhabdomyosarcoma, sarcoma, skin cancer, soft tissue sarcoma, squamous cell carcinoma, gastric cancer, synovial sarcoma, testicular cancer, thymic cancer, thymoma, metastatic thyroid cancer or uterine cancer

Е53. Применение по пп. Е26, Е35, Е42 или способ по любому из пп. Е46-Е51, которые характеризуются тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака желудка, глиобластомы, рака почек, рака легких, меланомы, нейробластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, рака предстательной железы, карциномы почек, рабдомиосаркомы и плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN).E53. Application according to paragraphs. E26, E35, E42 or the method according to any one of paragraphs. E46-E51, which are characterized in that said cancer is selected from the group consisting of: bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, stomach cancer, glioblastoma, kidney cancer, lung cancer, melanoma, neuroblastoma, ovarian cancer, pancreatic cancer , pharyngeal cancer, prostate cancer, renal carcinoma, rhabdomyosarcoma and squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN).

ПРИМЕРЫEXAMPLES

[000476] Следующие примеры иллюстрируют различные способы для композиций в способах диагностики или лечения согласно настоящему изобретению. Примеры предназначены для иллюстрации и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.[000476] The following examples illustrate various methods for compositions in diagnostic or treatment methods according to the present invention. The examples are intended to be illustrative and in no way limit the scope of the present invention.

Пример 1Example 1

Гуманизация МАВ-1 к HER2Humanization of MAB-1 to HER2

[0004771 В РСТ публикации WO 2001/036005 раскрыто антитело к HER2/neu, обозначенное в упомянутом документе «8Н11», однако представленные в нем последовательности доменов VL и VH являются неточными. Антитело 8Н11 связывается с эпитопом HER2/neu, который отличается от эпитопа, связываемого трастузумабом, маргетуксимабом и пертузумабом.[0004771 PCT publication WO 2001/036005 discloses an anti-HER2/neu antibody, referred to as “8H11” in that document, however, the sequences of the VL and VH domains presented therein are imprecise. Antibody 8H11 binds to an epitope of HER2/neu that is different from the epitope bound by trastuzumab, margetuximab and pertuzumab.

[000478] Были установлены корректные последовательности для доменов VH и VL антитела к HER2/neu, 8Н11 (чтобы обеспечить VH МАВ-1 к HER2 (SEQ ID NO: 60) и VL МАВ-1 к HER2 (SEQ ID NO: 61)), и затем проводили несколько раундов гуманизации для того чтобы получить описанный выше гуманизированный домен VH «VH1 hMAB-1 к HER2» (SEQ ID NO: 64) и гуманизированный домен VL «VL1 hMAB-1 к HER2» (SEQ ID NO: 67). В ходе этих действий в доменах VH1 hMAB-1 к HER2 и VL1 hMAB-1 к HER2 было выявлено несколько возможных недостатков последовательностей, и были сделаны замены, которые устраняли эти недостатки при сохранении аффинности связывания. В частности:[000478] The correct sequences for the VH and VL domains of the anti-HER2/neu antibody, 8H11, have been established (to provide the VH of MAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 60) and VL of MAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 61)) , and then carried out several rounds of humanization to obtain the humanized VH domain "VH1 hMAB-1 to HER2" (SEQ ID NO: 64) described above and the humanized VL domain "VL1 hMAB-1 to HER2" (SEQ ID NO: 67) . During these steps, several possible sequence deficiencies were identified in the VH1 domains of hMAB-1 to HER2 and VL1 of hMAB-1 to HER2, and substitutions were made that addressed these deficiencies while maintaining binding affinity. In particular:

(1) сайт изомеризации аспарагиновой кислоты был выявлен в положении 96 согласно Kabat домена VH1 hMAB-1 к HER2 и был скорректирован с помощью либо замены D96E, либо замены G97I, как в VH2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 65) и VH3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 66), соответственно;(1) an aspartic acid isomerization site was identified at position 96 of the Kabat domain of hMAB-1 VH1 to HER2 and was corrected by either the D96E substitution or the G97I substitution as in VH2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 65) and VH3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 66), respectively;

(2) возможный сайт дезамидирования аспарагина был выявлен в положении 30 согласно Kabat домена VL1 hMAB-1 к HER2 и был скорректирован с помощью либо замены N30S, либо замены S31T, как в VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69) и VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68), соответственно;(2) a possible asparagine deamidation site was identified at position 30 according to the Kabat domain of the VL1 hMAB-1 to HER2 and was corrected by either the N30S substitution or the S31T substitution as in the VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69) and VL2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 68), respectively;

(3) возможный сайт изомеризации аспарагиновой кислоты был выявлен в положении D56 согласно Kabat домена VL1 hMAB-1 к HER2 и был скорректирован с помощью замены: V55Q, D56E или D56S, как в VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69) и VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68).(3) a possible aspartic acid isomerization site was identified at position D56 according to the Kabat domain of VL1 hMAB-1 to HER2 and was corrected by substitution: V55Q, D56E or D56S, as in VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69) and VL2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 68).

[000479] Гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей hMAB-1 к HER2 можно применять в любой комбинации, и определенные комбинации гуманизированных цепей упоминаются со ссылкой на конкретные домены VH/VL. Например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 hMAB-1 к HER2 и VL3 hMAB-1 к HER2, называется в настоящем документе «hMAB-1 к HER2 (1.3)».[000479] Humanized hMAB-1 heavy and light chain variable domains to HER2 can be used in any combination, and certain combinations of humanized chains are referred to with reference to specific VH/VL domains. For example, a humanized antibody comprising VH1 hMAB-1 anti-HER2 and VL3 hMAB-1 anti-HER2 is referred to herein as “hMAB-1 anti-HER2 (1.3)”.

[000480] Гуманизированные варианты отбирали так, чтобы получить улучшенную аффинность связывания по сравнению с исходным мышиным антителом, и, как описано, они могут быть дополнительно модифицированы для устранения недостатков последовательностей (например, сайтов изомеризации, дезамидирования), как описано выше. Аффинность связывания нескольких комбинаций гуманизированных доменов VH и VL исследовали с помощью BIACORE^®. Соответственно, внеклеточную часть человеческого HER2, гибридизованную с гистидинсодержащим пептидом («huHER2»), пропускали над поверхностью, покрытой иммобилизованным антителом. В общих чертах, каждую испытываемую молекулу захватывали на поверхность, покрытую козьим F(ab)₂ к человеческой области Fc, и затем инкубировали в присутствии различных концентраций (6,25 нМ - 50 нМ) huHER2. Кинетику связывания определяли с помощью анализа связывания BIACORE^® (нормированная модель связывания Ленгмюра в соотношении 1:1). Рассчитанные k_a, k_d и K_D из этих исследований представлены в таблице 8.[000480] Humanized variants are selected to provide improved binding affinity compared to the parent mouse antibody and, as described, can be further modified to overcome sequence deficiencies (eg, isomerization sites, deamidation) as described above. The binding affinities of several combinations of humanized VH and VL domains were examined using BIACORE ^® . Accordingly, the extracellular portion of human HER2 hybridized with a histidine-containing peptide (“huHER2”) was passed over an antibody-coated surface. In general, each test molecule was captured onto a surface coated with a goat F(ab) ₂ to human Fc region and then incubated in the presence of various concentrations (6.25 nM - 50 nM) of huHER2. Binding kinetics were determined using the BIACORE ^® binding assay (1:1 normalized Langmuir binding model). The calculated k _a , k _d and K _D from these studies are presented in Table 8.

[000481] В отдельном исследовании кинетику связывания CD137×TA биспецифического диатела, DART-В (описанного выше), определяли для связывания с человеческим HER2 и HER2 яванской макаки по существу, как описано выше. Рассчитанные ka, kd и KD из этих исследований представлены в таблице 9.[000481] In a separate study, the binding kinetics of the CD137xTA bispecific diabody, DART-B (described above), was determined for binding to human HER2 and cynomolgus HER2 essentially as described above. The calculated ka, kd and KD from these studies are presented in Table 9.

Пример 2Example 2

Выделение и характеристика мышиных моноклональных антител к CD137Isolation and characterization of mouse monoclonal antibodies to CD137

[000482] Панель мышиных моноклональных антител, специфичных для человеческого CD137, подвергали скринингу для выявления антител, обладающих высокой аффинностью связывания. Три антитела отбирали для дальнейшего исследования. Для таких оценок очищенную общую популяцию Т-клеток (см. выше) стимулировали гранулами, направленными против CD3/CD28 (клетки:гранулы = 1:1), в течение 72 часов в присутствии ИЛ-2 (100 Ед/мл). По 100 мкл активированных Т-клеток (1,0×10⁶ клеток/мл) и 100 мкл последовательно разведенного (5- или 10-кратные разведения) испытываемого изделия (антитела или биспецифического диатела) добавляли в каждую лунку планшета (ов) для микротитрования, смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Клетки промывали буфером для FACS и затем в каждую лунку добавляли вторичное антитело (АФЦ-конъюгированное антитело к человеческой области Fc); смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем клетки промывали буфером для FACS, и в каждую лунку добавляли антитела к поверхностным маркерам Т-клеток (антитело к CD4, меченое V510, и антитело к CD8, меченое FITC); смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Клетки промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для FACS и анализировали методом проточной цитометрии (BD LSR Fortessa или FACSCanto II) для сбора клеточных событий. Анализ данных проводили с помощью FloJo v10.[000482] A panel of mouse monoclonal antibodies specific for human CD137 was screened to identify antibodies with high binding affinity. Three antibodies were selected for further study. For these assessments, a purified total T cell population (see above) was stimulated with anti-CD3/CD28 beads (cells:beads = 1:1) for 72 hours in the presence of IL-2 (100 U/ml). 100 μl of activated T cells (1.0 x 10 ⁶ cells/ml) and 100 μl of serially diluted (5- or 10-fold dilutions) test article (antibody or bispecific diabody) were added to each well of the microtiter plate(s). , mixed and incubated at room temperature for 45 min. The cells were washed with FACS buffer and then a secondary antibody (AFC-conjugated antibody to the human Fc region) was added to each well; mixed and incubated at room temperature for 30 min. Cells were then washed with FACS buffer, and antibodies to T cell surface markers (V510-labeled CD4 and FITC-labeled anti-CD8) were added to each well; mixed and incubated at room temperature for 30 min. Cells were washed and resuspended in 100 μl of FACS buffer and analyzed by flow cytometry (BD LSR Fortessa or FACSCanto II) to collect cellular events. Data analysis was performed using FloJo v10.

[000483] Было обнаружено, что два таких отобранных антитела, МАВ-3 к CD137 и МАВ-4 к CD137, проявляют сильное связывание с человеческим CD137 и способны блокировать связывание между CD137 и его природными лигандами. Третье из таких отобранных антител, МАВ-5 к CD137, проявляло более низкое связывание с человеческим CD137 и не было способно блокировать связывание между CD 137 и его природными лигандами.[000483] Two such selected antibodies, anti-CD137 MAB-3 and anti-CD137 MAB-4, have been found to bind strongly to human CD137 and are capable of blocking binding between CD137 and its natural ligands. The third of these selected antibodies, anti-CD137 MAB-5, exhibited lower binding to human CD137 and was unable to block binding between CD 137 and its natural ligands.

[000484] Получали химерные антитела, имеющие области Fc человеческого IgGl и мышиные домены VH/VL (обозначенные: chMAB-1 к CD137, chMAB-2 к CD137, chMAB-3 к CD137, chMAB-4 к CD137 и chMAB-5 к CD137, соответственно), и испытывали их способность связываться с активированными CD8⁺ Т-клетками. Как показано на Фигуре 7, отобранные антитела проявляли диапазон величин аффинности связывания.[000484] Chimeric antibodies were prepared having human IgG1 Fc regions and mouse VH/VL domains (designated: chMAB-1 anti-CD137, chMAB-2 anti-CD137, chMAB-3 anti-CD137, chMAB-4 anti-CD137 and chMAB-5 anti-CD137 , respectively) and tested their ability to bind to activated CD8 ⁺ T cells. As shown in Figure 7, the selected antibodies exhibited a range of binding affinities.

[000485] Биннинг эпитопов выполняли с помощью исследований перекрестной конкуренции. Результаты этих исследований и исследований связывания лигандов свидетельствуют о том, что:[000485] Epitope binning was performed using cross-competition studies. The results of these studies and ligand binding studies indicate that:

(1) МАВ-2 к CD137, МАВ-3 к CD137 и МАВ-4 к CD137 конкурируют с CD137L за связывание с CD137, однако МАВ-2 к CD137 распознает эпитоп CD137, который отличается от эпитопа, распознаваемого МАВ-1 к CD137, МАВ-3 к CD137, МАВ-4 к CD137 и МАВ-5 к CD137;(1) Anti-CD137 MAB-2, anti-CD137 MAB-3, and anti-CD137 MAB-4 compete with CD137L for binding to CD137, but anti-CD137 MAB-2 recognizes an epitope of CD137 that is different from the epitope recognized by anti-CD137 MAB-1, MAV-3 to CD137, MAV-4 to CD137 and MAV-5 to CD137;

(2) МАВ-1 к CD137 и МАВ-5 к CD137 не конкурируют с CD137L за связывание с CD137;(2) anti-CD137 MAB-1 and anti-CD137 MAB-5 do not compete with CD137L for binding to CD137;

(3) МАВ-3 к CD137 и МАВ-4 к CD137 проявляют конкуренцию с МАВ-1 к CD137, но связывают другой эпитоп, о чем свидетельствует их способностью конкурировать за связывание лиганда;(3) anti-CD137 MAB-3 and anti-CD137 MAB-4 exhibit competition with anti-CD137 MAB-1 but bind a different epitope, as evidenced by their ability to compete for ligand binding;

(4) МАВ-5 к CD137 распознает эпитоп, который отличается от эпитопов, распознаваемых МАВ-1 к CD137, МАВ-2 к CD137, МАВ-3 к CD137 или МАВ-4 к CD137.(4) Anti-CD137 MAB-5 recognizes an epitope that is different from the epitopes recognized by anti-CD137 MAB-1, anti-CD137 MAB-2, anti-CD137 MAB-3, or anti-CD137 MAB-4.

[000486] Также испытывали способность химерных антител индуцировать высвобождение цитокинов (например, ИФН-γ, TNF-α) из Т-клеток (т.е. их агонистическую активность) в отсутствие лиганда. Для таких оценок очищенную общую популяцию Т-клеток (см. выше) ресуспендировали в средах для анализа и помещали в инкубатор для тканевых культур на ночь. Опухолевые клетки-мишени (включая ЛМТ-1, N87) получали из культуры. После промывки клеточную массу ресуспендировали в культуральных средах при плотности клеток 1,0×10⁵ клеток/мл. По 10⁴ клеток затем добавляли в каждую лунку белого планшета с плоским дном, помещенного в инкубатор для тканевых культур на ночь. На следующий день измеряли плотность и жизнеспособность общей популяции покоящихся человеческих Т-клеток на основании исключения трипанового синего с использованием счетчика Beckman Coulter Vi-Cell и доводили до плотности 2×10⁶ клеток/мл. Опухолевые клетки-мишени, предварительно высеянные на планшет, промывали один раз средами для анализа.[000486] The ability of chimeric antibodies to induce the release of cytokines (eg, IFN-γ, TNF-α) from T cells (ie, their agonist activity) in the absence of ligand was also tested. For these assessments, the purified total T cell population (see above) was resuspended in assay media and placed in a tissue culture incubator overnight. Target tumor cells (including LMT-1, N87) were obtained from culture. After washing, the cell mass was resuspended in culture media at a cell density of 1.0×10 ⁵ cells/ml. 10 ⁴ cells were then added to each well of a white flat-bottom plate placed in a tissue culture incubator overnight. The next day, the density and viability of the total population of resting human T cells was measured by trypan blue exclusion using a Beckman Coulter Vi-Cell counter and adjusted to a density of 2 x 10 ⁶ cells/ml. Target tumor cells, previously seeded onto the plate, were washed once with assay media.

[000487] Для анализов высвобождения цитокинов: 50 мкл последовательно разведенного испытываемого изделия (антитела (+/- сшивание с (Fab)'₂ к человеческой Fc), диатела, трехвалентные молекулы и т.д.), 50 мкл предварительно промытых Dynabead αCD3 (REF 11151D; Invitrogen от Thermo Fisher Scientific) в количестве 2×10⁶ гранул/мл, 50 мкл/лунку общей популяции человеческих Т-клеток в количестве 2×10⁶ клеток/мл и 50 мкл сред для анализа по отдельности или содержащих 1,6 мкг/мл αCD28 (каталожный номер 555725; BD Pharmigen) добавляли в каждую лунку аналитического планшета. Конечный объем в каждой лунке в планшете составлял 200 мкл. Для тех контрольных лунок, которые не содержали испытываемое изделие или гранулы αCD3, добавляли среды для анализа, чтобы довести общий объем до 200 мкл, и планшеты инкубировали в течение 72 часов в инкубаторе для тканевых культур. Супернатанты затем собирали из каждой лунки и измеряли высвобожденные цитокинов ИФН-γ, TNF-α и ИЛ-2R с использованием набора для ИФА цитокинов от R&D System (Human IL-2 DuoSet ELISA (каталожный номер: DY202), Human IFN-gamma DuoSet ELISA (каталожный номер: DY285) и Human TNF-alpha DuoSet ELISA (каталожный номер: DY210) или аналогичных коммерческих реагентов. Способы проведения ИФА были предоставлены с наборами. Для анализа данных использовали Microsoft Excel и SoftMax Pro, чтобы экстраполировать уровни цитокинов, которые были представлены в графической форме с помощью Prism.[000487] For cytokine release assays: 50 μl of serially diluted test article (antibodies (+/- cross-linking with (Fab)' ₂ to human Fc), diabodies, trivalent molecules, etc.), 50 μl of prewashed Dynabead αCD3 ( REF 11151D; Invitrogen from Thermo Fisher Scientific) at ^2x106 beads/ml, 50 µl/well of total human T cell population at ^2x106 cells/ml and 50 µl assay media alone or containing 1, 6 μg/ml αCD28 (cat. no. 555725; BD Pharmigen) was added to each well of the assay plate. The final volume in each well in the plate was 200 μl. For those control wells that did not contain test article or αCD3 beads, assay media were added to bring the total volume to 200 μl and the plates were incubated for 72 hours in a tissue culture incubator. Supernatants were then collected from each well and the released cytokines IFN-γ, TNF-α and IL-2R were measured using a cytokine ELISA kit from R&D System (Human IL-2 DuoSet ELISA (cat. no.: DY202), Human IFN-gamma DuoSet ELISA (catalog number: DY285) and Human TNF-alpha DuoSet ELISA (catalog number: DY210) or similar commercial reagents. ELISA methods were provided with the kits. Data analysis used Microsoft Excel and SoftMax Pro to extrapolate the levels of cytokines that were provided in graphical form using Prism.

[000488] Как показано на Фигуре 8, каждое из МАВ-1 к CD137, chMAB-3 к CD137 и chMAB-4 к CD137 проявляло сильную агонистическую активность, МАВ-2 к CD137 проявляло меньшую агонистическую активность, и МАВ-5 к CD137 не проявляло агонистическую активность в отсутствие лиганда.[000488] As shown in Figure 8, anti-CD137 MAB-1, anti-CD137 chMAB-3, and anti-CD137 chMAB-4 each exhibited strong agonist activity, anti-CD137 MAB-2 exhibited less agonistic activity, and anti-CD137 MAB-5 did not. exhibited agonistic activity in the absence of ligand.

[000489] Также испытывали способность химерных антител chMAB-3 к CD137 и chMAB-4 к CD137 индуцировать высвобождение цитокинов (например, ИФН-γ, TNF-α) из общей популяции Т-клеток в отсутствие и в присутствии лиганда и/или клеток-мишеней. Общую популяцию Т-клеток человека очищали из донорских МКПК с использованием набора Dynabeads Untouched Human T Cells (Invitrogen, каталожный номер 11344D) в соответствии с протоколом изготовителя. Результаты исследования высвобождения ИФН-γ представлены на Фигуре 9. На Фигуре 9 показана индукция ИФН-γ общей популяцией Т-клеток через 72 часа после стимуляции гранулами, покрытыми антителом к CD3, в присутствии или в отсутствие 1 мкг/мл химерных антител к CD137 (chMAB-3 к CD137 или chMAB-5 к CD137) и в присутствии или в отсутствие 1 мкг/мл CD-137L-His и 4 мкг/мл hFc F(ab)'₂. На Фигуре показано, что индукция ИФН-γ происходила в присутствии или в отсутствие CD137-His, и что большую индукцию наблюдали для ЛМТ-1/общей популяции Т-клеток по сравнению с той, которая наблюдалась только для общей популяции Т-клеток. Аналогичные результаты получали для TNF-α.[000489] The ability of the chimeric antibodies chMAB-3 to CD137 and chMAB-4 to CD137 to induce the release of cytokines (eg, IFN-γ, TNF-α) from the general population of T cells in the absence and presence of ligand and/or cells was also tested. targets. The total human T cell population was purified from donor PBMCs using the Dynabeads Untouched Human T Cells kit (Invitrogen, catalog no. 11344D) according to the manufacturer's protocol. The results of the IFN-γ release assay are presented in Figure 9. Figure 9 shows the induction of IFN-γ by the total T cell population 72 hours after stimulation with anti-CD3 antibody-coated beads in the presence or absence of 1 μg/ml chimeric anti-CD137 antibodies ( chMAB-3 to CD137 or chMAB-5 to CD137) and in the presence or absence of 1 μg/ml CD-137L-His and 4 μg/ml hFc F(ab)' ₂ . The Figure shows that IFN-γ induction occurred in the presence or absence of CD137-His, and that greater induction was observed for LMT-1/total T cell population compared to that observed for the total T cell population alone. Similar results were obtained for TNF-α.

[000490] В присутствии как Т-клеток, так и клеток-мишеней, или только Т-клеток, chMAB-3 к CD137 проявляло сильную агонистическую активность, которая была сопоставимой в присутствии или в отсутствие лиганда. Напротив, chMAB-5 к CD137 проявляло минимальную агонистическую активность в отсутствие лиганда и значительно повышенную агонистическую активность в присутствии лиганда.[000490] In the presence of both T cells and target cells, or T cells alone, anti-CD137 chMAB-3 exhibited potent agonist activity that was comparable in the presence or absence of ligand. In contrast, anti-CD137 chMAB-5 exhibited minimal agonist activity in the absence of ligand and significantly increased agonist activity in the presence of ligand.

Пример 3Example 3

Гуманизация мышиных моноклональных антител к CD137Humanization of mouse monoclonal antibodies to CD137

[000491] Антитела МАВ-3 к CD137 и МАВ-4 к CD137 отбирали для гуманизации. Проводили четыре раунда гуманизации МАВ-3 к CD137 с получением одного гуманизированного домена VH, обозначенного «VH1 hMAB-3 к CD137» (SEQ ID NO: 76), и трех гуманизированных доменов VL, обозначенных «VL1 hMAB-3 к CD137» (SEQ ID NO: 87), «VL2 hMAB-3 к CD137»(SEQ ID NO: 88) и «VL3 hMAB-3 к CD137» (SEQ ID NO: 89).[000491] Antibodies MAB-3 to CD137 and MAB-4 to CD137 were selected for humanization. Four rounds of humanization of MAB-3 to CD137 were performed to produce one humanized VH domain designated “VH1 hMAB-3 anti-CD137” (SEQ ID NO: 76) and three humanized VL domains designated “VL1 hMAB-3 anti-CD137” (SEQ ID NO: 87), “VL2 hMAB-3 to CD137” (SEQ ID NO: 88) and “VL3 hMAB-3 to CD137” (SEQ ID NO: 89).

[000492] Проводили три раунда гуманизации МАВ-4 к CD137 с получением одного гуманизированного домена VH, обозначенного «VH1 hMAB-4 к CD137» (SEQ ID NO: 92), и двух гуманизированных доменов VL, обозначенных «VL1 hMAB-4 к CD137» (SEQ ID NO: 94) и «VL2 hMAB-4 к CD137» (SEQ ID NO: 95).[000492] Three rounds of humanization of MAB-4 to CD137 were performed to produce one humanized VH domain, designated "VH1 hMAB-4 to CD137" (SEQ ID NO: 92), and two humanized VL domains, designated "VL1 hMAB-4 to CD137 " (SEQ ID NO: 94) and "VL2 hMAB-4 to CD137" (SEQ ID NO: 95).

[000493] Гуманизированные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей конкретного антитела к CD137 (например, МАВ-3 к CD137) можно применять в любой комбинации, и определенные комбинации гуманизированных цепей упоминаются со ссылкой на конкретные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее VH1 hMAB-3 к CD137 и VL3 hMAB-3 к CD137, называется в настоящем документе «hMAB-3 к CD137 (1.3)».[000493] Humanized heavy and light chain variable domains of a particular anti-CD137 antibody (e.g., anti-CD137 MAB-3) may be used in any combination, and certain combinations of humanized chains are referred to with reference to specific VH/VL domains, for example, a humanized antibody comprising VH1 hMAB-3 anti-CD137 and VL3 hMAB-3 anti-CD137 are referred to herein as “hMAB-3 anti-CD137 (1.3)”.

[000494] Величины аффинности связывания химерных антител, имеющих мышиные вариабельные домены, и полностью гуманизированных антител исследовали с помощью Biacore.[000494] The binding affinities of chimeric antibodies having murine variable domains and fully humanized antibodies were examined using Biacore.

[000495] Соответственно, внеклеточную часть человеческого CD137, гибридизованную с гистидинс о держащим пептидом («huCD137»), пропускали над поверхностью, покрытой иммобилизованным антителом. В общих чертах, каждую испытываемую молекулу захватывали на поверхность, покрытую козьим F(ab)₂ к человеческой Fc, и затем инкубировали в присутствии различных концентраций (25 нМ и 100 нМ) huCD137. Кинетику связывания определяли с помощью анализа связывания BIACORE^® (нормированная модель связывания Ленгмюра в соотношении 1:1). Рассчитанные k_a, k_d и K_D из этих исследований представлены в таблице 10 и свидетельствуют о том, что гуманизированные MAT проявляли приблизительно 2-кратное снижение аффинности связывания по сравнению с мышиными антителами.[000495] Accordingly, the extracellular portion of human CD137 hybridized with the histidine holding peptide (“huCD137”) was passed over the surface coated with the immobilized antibody. In general, each test molecule was captured onto a goat F(ab) ₂ to human Fc-coated surface and then incubated in the presence of various concentrations (25 nM and 100 nM) of huCD137. Binding kinetics were determined using the BIACORE ^® binding assay (1:1 normalized Langmuir binding model). Calculated k _a , k _d and K _D from these studies are presented in Table 10 and indicate that the humanized MAbs exhibited approximately a 2-fold reduction in binding affinity compared to murine antibodies.

Пример 4Example 4

Характеристика CD137×TA связывающих молекулCharacteristics of CD137×TA binding molecules

[000496] Как описано выше, получали ряд примерных CD137×TA связывающих молекул, способных связываться с CD 137 и примерным ТА, HER2/neu. В частности, получали шесть биспецифических диател (обозначенных «DART-A», «DART-B» и «DART-C», «DART-D», «DART-E» и «DART-G»), содержащих домены МАВ-3 к CD137 или hMAB-3 к CD137, одно биспецифическое диатело (обозначенное «DART-F»), содержащее домены МАВ-4 к CD137, два биспецифических диатела (обозначенных «DART-1» и «DART-4»), содержащих домены МАВ-1 к CD1370, и два биспецифических диатела (обозначенных «DART-2» и «DART-5»), содержащих домены МАВ-2 к CD137, каждое из которых содержало домены hMAB-1 к HER2. DART-A, DART-B, DART-C, DART-1 и DART-2 имеют общую структуру, показанную на Фигуре 3 В (DART-А, DART-B, DART-1 и DART-2 имеют структуру, показанную на Фигуре 3Е; DART-C имеет структуру, показанную на Фигуре 3D). DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-4 и DART-5 имеют общую структуру, показанную на Фигуре 5А (DART-D, DART-F, DART-G, DART-4 и DART-5 имеют структуру, показанную на Фигуре 5В; DART-E имеет структуру, показанную на Фигуре 5С).[000496] As described above, a number of exemplary CD137xTA binding molecules capable of binding to CD 137 and the exemplary TA, HER2/neu, were prepared. In particular, six bispecific diabodies (designated "DART-A", "DART-B" and "DART-C", "DART-D", "DART-E" and "DART-G") containing MAB domains were prepared. 3 anti-CD137 or hMAB-3 anti-CD137, one bispecific diabody (designated "DART-F") containing the MAB-4 anti-CD137 domains, two bispecific diabodies (designated "DART-1" and "DART-4") containing the domains anti-CD1370 MAB-1, and two bispecific diabodies (designated “DART-2” and “DART-5”) containing anti-CD137 MAB-2 domains, each containing hMAB-1 anti-HER2 domains. DART-A, DART-B, DART-C, DART-1 and DART-2 have the general structure shown in Figure 3 B (DART-A, DART-B, DART-1 and DART-2 have the structure shown in Figure 3E; DART-C has the structure shown in Figure 3D). DART-D, DART-E, DART-F, DART-G, DART-4 and DART-5 have the general structure shown in Figure 5A (DART-D, DART-F, DART-G, DART-4 and DART- 5 have the structure shown in Figure 5B; DART-E has the structure shown in Figure 5C).

[000497] Получали другую примерную CD137×TA связывающую молекулу, способную связываться с CD137 и примерным ТА, EphA2 (обозначена «DART-7»). DART-7 представляет собой биспецифическое диатело, имеющее структуру, представленную на Фигуре 3 В, содержащее МАВ-1 к CD137 и гуманизированные домены МАВ-3 к EphA2.[000497] Another exemplary CD137xTA binding molecule capable of binding to CD137 and the exemplary TA, EphA2 (designated "DART-7") was prepared. DART-7 is a bispecific diabody having the structure shown in Figure 3 B, containing anti-CD137 MAB-1 and humanized anti-EphA2 MAB-3 domains.

[000498] Помимо этого получали три контрольные молекулы, «DART-3», содержащую hMAB-1 к HER2 и варианты доменов паливизумаба (HER2×RSV), «DART-6», содержащую варианты доменов паливизумаба и домены МАВ-3 к CD137 (RSV×CD137), и «DART-8», содержащую гуманизированное МАВ-3 к EphA2 и варианты доменов паливизумаба (EphA2×RSV).[000498] In addition, three control molecules were obtained, "DART-3", containing hMAB-1 to HER2 and variant domains of palivizumab (HER2xRSV), "DART-6", containing variant domains of palivizumab and domains of MAB-3 to CD137 ( RSV×CD137), and “DART-8” containing humanized MAB-3 to EphA2 and palivizumab domain variants (EphA2×RSV).

[000499] CD137×TA связывающие молекулы, имеющие два сайта связывания для CD137 и 2 сайта связывания для HER2/neu, и контрольная молекула CD137×RSV (DART-6) связывались с CD137, присутствующим на поверхности активированных Т-клеток. Напротив, контрольная молекула HER2/neu×RSV (DART-3) не проявляла какое-либо связывание. В этом анализе DART-1 проявляла самое высокое связывание, и DART-5 проявляла самое низкое связывание, при этом остальные испытанные молекулы (DART-В, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-2, DART-4 и DART-6) проявляли сопоставимое связывание (Фигура 10). Относительные положения доменов, связывающих HER2/neu и CD137, оказывали минимальное влияние на связывание CD137 или не оказывали влияния в этом анализе для молекул, имеющих структуру, представленную на Фигуре 3 В (сравните DART-B/DART-C), или структуру, представленную на Фигуре 5В-5С (сравните DART-D/DART-E).[000499] CD137xTA binding molecules having two binding sites for CD137 and 2 binding sites for HER2/neu, and a control molecule CD137xRSV (DART-6) bound to CD137 present on the surface of activated T cells. In contrast, the control molecule HER2/neu×RSV (DART-3) did not show any binding. In this assay, DART-1 exhibited the highest binding and DART-5 exhibited the lowest binding, with the remaining molecules tested (DART-B, DART-C, DART-D, DART-E, DART-F, DART-2, DART-4 and DART-6) showed comparable binding (Figure 10). The relative positions of the HER2/neu and CD137 binding domains had minimal or no effect on CD137 binding in this assay for molecules having the structure shown in Figure 3 B (compare DART-B/DART-C) or the structure shown in Figure 5B-5C (compare DART-D/DART-E).

[000500] Аналогичным образом, оценивали способность CD137×TA связывающих молекул связываться с HER2/neu, присутствующим на поверхности клеток-мишеней рака желудка N87 (Фигуры 11А-11В). Контрольная молекула RSV×CD137 (DART-6) не проявляла какое-либо связывание. Относительные положения доменов, связывающих HER2/neu и CD137, оказывали минимальное влияние на связывание HER2/neu или не оказывали влияния в этом анализе для молекул, имеющих структуру, представленную на Фигуре 3 В (сравните DART-B/DART-C). Напротив, DART-E проявляла уменьшенное связывание HER2/neu по сравнению с DART-D, это указывает на возможность существования позиционного эффекта на связывание HER2/neu для молекул, имеющих структуру, представленную на Фигуре 5В-5С, или на то, что связывание, опосредуемое конкретно HER2/neu-связывающими доменами hMAB-1 к HER2 (1.3), проявляет позиционный эффект.[000500] Similarly, the ability of CD137xTA binding molecules to bind to HER2/neu present on the surface of target N87 gastric cancer cells was assessed (Figures 11A-11B). The control molecule RSV×CD137 (DART-6) did not show any binding. The relative positions of the HER2/neu and CD137 binding domains had minimal or no effect on HER2/neu binding in this assay for molecules having the structure shown in Figure 3 B (compare DART-B/DART-C). In contrast, DART-E exhibited reduced HER2/neu binding compared to DART-D, indicating that there may be a positional effect on HER2/neu binding for molecules having the structure shown in Figures 5B-5C, or that binding mediated specifically by the HER2/neu binding domains of hMAB-1 to HER2 (1.3), exhibits a positional effect.

[000501] Дополнительно оценивали способность CD137×TA связывающих молекул, DART-В, DART-D, DART-G и контрольных молекул DART-3 и DART-6 связываться с CD137, экспрессируемым клетками СНО (Фигура 12А) и активированными Т-клетками (Фигура 12В).[000501] Additionally, the ability of the CD137xTA binding molecules, DART-B, DART-D, DART-G, and the control molecules DART-3 and DART-6, to bind to CD137 expressed by CHO cells (Figure 12A) and activated T cells ( Figure 12B).

[000502] Дополнительно оценивали способность CD137×TA связывающих молекул, DART-В, DART-D, DART-G и контрольных молекул DART-3 и DART-6 связываться с HER2/neu, экспрессируемым на клетках N87 (Фигура 13А) и клетках JIMT-1 (Фигура 13В). Для такой оценки в каждую лунку аналитического (их) планшета (ов) для микротитрования добавляли по 100 мкл клеток-мишеней, экспрессирующих HER2/neu (1,0×10⁶ клеток/мл), и 100 мкл последовательно разведенного (5- или 10-кратные разведения) испытываемого изделия (биспецифическое диатело), смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Клетки промывали буфером для FACS и затем в каждую лунку добавляли вторичное антитело (АФЦ-конъюгированное антитело к человеческой области Fc); смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Клетки промывали и ресуспендировали в 100 мкл буфера для FACS и анализировали методом проточной цитометрии (BD LSR Fortessa или FACSCanto II) для сбора клеточных событий. Анализ данных выполняли с помощью FloJo v10. HER2×CD137 связывающие молекулы, имеющие структуру, представленную на Фигуре 3 В, проявляли незначительно лучшее связывание с HER2/neu, чем молекулы, имеющие структуру, представленную на Фигуре 5А-5С (сравните DART-B/DART-D). Контрольная молекула RSV×CD137 (DART-6) не проявляла какое-либо связывание. CD137×TA биспецифические диатела, имеющие мышиный или гуманизированный сайт связывания CD 137, проявляли сходное связывание с HER2/neu (сравните DART-D/DART-G).[000502] Additionally, the ability of the CD137xTA binding molecules, DART-B, DART-D, DART-G and the control molecules DART-3 and DART-6 to bind to HER2/neu expressed on N87 cells (Figure 13A) and JIMT cells was assessed -1 (Figure 13B). For this assessment, 100 μl of target cells expressing HER2/neu (1.0 x 10 ⁶ cells/ml) and 100 μl of serially diluted (5- or 10 -fold dilutions) of the test article (bispecific diabody), were mixed and incubated at room temperature for 45 minutes. The cells were washed with FACS buffer and then a secondary antibody (AFC-conjugated antibody to the human Fc region) was added to each well; mixed and incubated at room temperature for 30 min. Cells were washed and resuspended in 100 μl of FACS buffer and analyzed by flow cytometry (BD LSR Fortessa or FACSCanto II) to collect cellular events. Data analysis was performed using FloJo v10. HER2xCD137 binding molecules having the structure shown in Figure 3 B exhibited marginally better binding to HER2/neu than molecules having the structure shown in Figure 5A-5C (compare DART-B/DART-D). The control molecule RSV×CD137 (DART-6) did not show any binding. CD137xTA bispecific diabodies having a murine or humanized CD 137 binding site exhibited similar binding to HER2/neu (compare DART-D/DART-G).

[000503] На Фигурах 14А-14В представлены результаты первого типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненного по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ) в присутствии или в отсутствие клеток-мишеней, экспрессирующих примерный ТА, HER2/neu. На Фигурах показаны результаты исследований DART-1, DART-2, DART-3, DART-4, DART-5, DART-6, DART-A, DART-D, DART-E и DART-F (с использованием описанных выше протоколов) в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (3⁺) (Фигура 14А) или JIMT-1 (2⁺) (Фигура 14В), HER2/neu-отрицательных клеток-мишеней Hs700T или без клеток-мишеней. Результаты показывают, что контрольные молекулы DART-3 и DART-6 не проявляли костимулирующую активность. CD137×TA связывающие молекулы не проявляли какую-либо наблюдаемую костимулирующую активность в отсутствие клеток-мишеней или с HER2/neu-отрицательными клетками-мишенями. DART-D и DART-F, содержащие новые антитела к CD137 (МАВ-3 и МАВ-4 к CD137, соответственно), проявляли самую высокую костимулирующую активность в присутствии любой линии клеток-мишеней. DART-E (содержащая замененные домены HER2/neu и CD137) проявляла более низкую костимулирующую активность, в частности, в присутствии клеток-мишеней N87. Сходные закономерности наблюдали для ИЛ-2 и TNF-α.[000503] Figures 14A-14B show the results of a first representative assay of the ability of CD137xTA binding molecules to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (performed essentially as described in Example 2 above and using IFN-γ release as an example) in presence or absence of target cells expressing the exemplary TA, HER2/neu. The Figures show the results of the DART-1, DART-2, DART-3, DART-4, DART-5, DART-6, DART-A, DART-D, DART-E and DART-F studies (using the protocols described above ) in the presence of HER2/neu-expressing N87( ³⁺ ) target cells (Figure 14A) or JIMT-1( ²⁺ ) (Figure 14B), HER2/neu-negative Hs700T target cells, or no target cells. The results show that the control molecules DART-3 and DART-6 did not exhibit co-stimulatory activity. CD137xTA binding molecules did not exhibit any observable co-stimulatory activity in the absence of target cells or with HER2/neu-negative target cells. DART-D and DART-F containing novel anti-CD137 antibodies (MAB-3 and MAB-4 anti-CD137, respectively) exhibited the highest co-stimulatory activity in the presence of any target cell line. DART-E (containing exchanged HER2/neu and CD137 domains) exhibited lower co-stimulatory activity, particularly in the presence of N87 target cells. Similar patterns were observed for IL-2 and TNF-α.

[000504] На Фигурах 15А-15В представлены результаты второго типичного анализа способности CD137×TA связывающих молекул опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненном по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ). На Фигурах показаны результаты испытаний DART-1, DART-2, DART-3, DART-4, DART-5, DART-6, DART-B, DART-D и DART-G (с использованием описанных выше протоколов) в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (Фигура 15А) или JIMT-1 (Фигура 15В), HER2/neu-отрицательных клеток-мишеней Hs700T или без клеток-мишеней.[000504] Figures 15A-15B show the results of a second representative assay for the ability of CD137xTA binding molecules to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (performed essentially as described in Example 2 above and using IFN-γ release as an example). The Figures show the results of testing DART-1, DART-2, DART-3, DART-4, DART-5, DART-6, DART-B, DART-D and DART-G (using the protocols described above) in the presence of HER2 /neu-expressing N87 (Figure 15A) or JIMT-1 (Figure 15B) target cells, HER2/neu-negative Hs700T target cells, or no target cells.

[000505] Результаты показывают, что контрольные молекулы DART-3 и DART-6 не проявляли костимулирующую активность. CD137×TA связывающие молекулы не проявляли какую-либо наблюдаемую костимулирующую активность в отсутствие клеток-мишеней или с HER2/neu-отрицательными клетками-мишенями. DART-D и DART-G, содержащие новое антитело к CD137, МАВ-3 к CD137 (мышиное и гуманизированное, соответственно), проявляли самую высокую костимулирующую активность в присутствии любой линии клеток-мишеней. DART-G проявляла самую высокую костимулирующую активность, несмотря на то, что она проявляла незначительно более низкое связывание с поверхностью клеток, экспрессирующих CD137. Как подробно описано выше, DART-B и DART-G содержат идентичные сайты связывания HER2 и CD137, но имеют структуры, показанные на Фигуре 3В и Фигуре 5В, соответственно. DART-G проявляла более высокую костимулирующую активность, чем DART-B, в присутствии любой линии клеток-мишеней.[000505] The results show that the control molecules DART-3 and DART-6 did not exhibit co-stimulatory activity. CD137xTA binding molecules did not exhibit any observable co-stimulatory activity in the absence of target cells or with HER2/neu-negative target cells. DART-D and DART-G containing a novel anti-CD137 antibody, MAB-3 anti-CD137 (murine and humanized, respectively), exhibited the highest co-stimulatory activity in the presence of any target cell line. DART-G exhibited the highest co-stimulatory activity, although it exhibited marginally lower binding to the surface of CD137-expressing cells. As detailed above, DART-B and DART-G contain identical binding sites for HER2 and CD137, but have the structures shown in Figure 3B and Figure 5B, respectively. DART-G exhibited higher co-stimulatory activity than DART-B in the presence of either target cell line.

[000506] Дополнительно оценивали способность CD137×TA связывающей молекулы, DART-G, и контрольных молекул, DART-3 и DART-6, опосредовать дозозависимую передачу сигнала Т-клетками с участием пути NF/κВ в репортерной клеточной линии, экспрессирующей CD137 (Jurkat-NF-κB-Luc), в присутствии клеток-мишеней, положительных или отрицательных в отношении примерного ТА, HER2/neu. В общих чертах, репортерные клетки Jurkat-NF-κB-Luc, сверхэкспрессирующие CD137, культивировали совместно с клетками JIMT-1, экспрессирующими HER2/neu (Фигура 16А), или с отрицательными по HER2/neu клетками KG-1 (Фигура 16В) в присутствии повышающихся концентраций DART-G, DART-3 или DART-6. После инкубации передачу сигнала измеряли на основании люминесценции, используя относительную световую единицу люминесценции (RLU) в качестве регистрируемого показателя. Результаты показывают, что CD137×TA связывающие молекулы, такие как DART-G, опосредуют дозозависимую передачу сигнала Т-клетками, которая зависит от присутствия ТА-экспрессирующих клеток-мишеней.[000506] Additionally, the ability of the CD137×TA binding molecule, DART-G, and control molecules, DART-3 and DART-6, to mediate dose-dependent T cell signaling involving the NF/κB pathway was assessed in a reporter cell line expressing CD137 (Jurkat -NF-κB-Luc), in the presence of target cells positive or negative for the exemplary TA, HER2/neu. In general, Jurkat-NF-κB-Luc reporter cells overexpressing CD137 were cocultured with JIMT-1 cells expressing HER2/neu (Figure 16A) or with HER2/neu negative KG-1 cells (Figure 16B) in presence of increasing concentrations of DART-G, DART-3 or DART-6. After incubation, signal transduction was measured based on luminescence using relative luminescence unit (RLU) as the recording metric. The results indicate that CD137xTA binding molecules such as DART-G mediate dose-dependent T cell signaling that is dependent on the presence of TA-expressing target cells.

[000507] Дополнительно оценивали способность CD137×TA связывающей молекулы, DART-А, и контрольных молекул, DART-3 и DART-6, опосредовать повышенную пролиферацию Т-клеток в присутствии клеток, экспрессирующих различные уровни примерного ТА, HER2/Neu. В общих чертах, CFSE-меченые человеческие Т-клетки ± субоптимальная стимуляция αCD3/αCD28 культивировали совместно с клетками-мишенями HER2/neu-high N87 (Фигура 17, панели А-С и J-K), клетками-мишенями HER2/neu-low MCF-7 (Фигура 17, панели D-F и L-M) или культивировали по отдельности (Фигура 17, панели G-I и N-O) в присутствии DART-А (Фигура 17, панели A, D и G), DART-3 (Фигура 17, В, Е и Н), DART-6 (Фигура 17, панели С, F и I) или без молекул (Фигура 17, панели J, L и N) и контролировали пролиферацию Т-клеток. Результаты показывают, что CD137×TA связывающие молекулы, такие как DART-А, повышают пролиферацию Т-клеток. Такая повышенная пролиферация Т-клеток зависит от экспрессии ТА и коррелирует с уровнями экспрессии ТА.[000507] Additionally, the ability of the CD137×TA binding molecule, DART-A, and control molecules, DART-3 and DART-6, to mediate increased T cell proliferation in the presence of cells expressing varying levels of the exemplary TA, HER2/Neu, was assessed. In summary, CFSE-labeled human T cells ± suboptimal αCD3/αCD28 stimulation were cocultured with HER2/neu-high N87 target cells (Figure 17, panels A-C and J-K), HER2/neu-low MCF target cells -7 (Figure 17, panels D-F and L-M) or cultured alone (Figure 17, panels G-I and N-O) in the presence of DART-A (Figure 17, panels A, D and G), DART-3 (Figure 17, B, E and H), DART-6 (Figure 17, panels C, F and I) or without molecules (Figure 17, panels J, L and N) and monitored T cell proliferation. The results show that CD137xTA binding molecules, such as DART-A, increase T cell proliferation. This increased T cell proliferation is dependent on TA expression and correlates with TA expression levels.

[000508] Маргетуксимаб представляет собой Fc-оптимизированное моноклональное антитело к HER2/neu, которое может индуцировать повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность после связывания опухолевой клетки-мишени. Как отмечено выше, МАВ-1 к HER2 связывается с эпитопом HER2/neu, который отличается от того, который связывается маргетуксимабом. Активность антитела к ТА, маргетуксимаба, направленную на уничтожение клеток-мишеней, исследовали в комбинации с CD137×TA связывающей молекулой, DART-1, или контрольной молекулой, DART-3 (HER2×RSV). В общих чертах, клетки-мишени N87, которые были модифицированы для экспрессии репортерного гена люциферазы (luc) (клетки N87/GFP/Luc), инкубировали с очищенными эффекторными NK-клетками при соотношении эффектор : мишень (Е : Т) 2:1 с повышающимися концентрациями маргетуксимаба в комбинации с фиксированной концентрацией (0,1 мкг/мл) DART-1 или DART-3 в течение 72 часов, и цитотоксичность определяли с помощью люминесцентного (LUM) анализа, в котором измеряли клеточную активность люциферазы клеток-мишеней, используя относительную световую единицу люминесценции (RLU) в качестве регистрируемого показателя (Фигура 18А). Помимо этого оценивали экспрессию маркера активации, CD69, NK-клетками (CD3^-/CD56⁺) из этого анализа (Фигура 18В). Результаты этого исследования демонстрируют, что CD137×TA связывающая молекула, DART-1, повышает как опосредуемую маргитуксимабом активность АЗКЦ против клеток-мишеней N87/Luc, так и опосредуемую маргитуксимабом активацию CD69 на NK-клетках по сравнению с контрольной молекулой, способной связываться только с HER2/neu.[000508] Margetuximab is an Fc-optimized anti-HER2/neu monoclonal antibody that can induce enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity upon binding to a target tumor cell. As noted above, anti-HER2 MAB-1 binds to an epitope of HER2/neu that is different from that bound by margetuximab. The target cell killing activity of the anti-TA antibody, margetuximab, was examined in combination with the CD137xTA binding molecule, DART-1, or the control molecule, DART-3 (HER2xRSV). In general, N87 target cells that had been modified to express a luciferase (luc) reporter gene (N87/GFP/Luc cells) were incubated with purified effector NK cells at an effector:target (E:T) ratio of 2:1 with increasing concentrations of margetuximab in combination with a fixed concentration (0.1 μg/ml) of DART-1 or DART-3 for 72 hours, and cytotoxicity was determined using a luminescence (LUM) assay, which measures the cellular luciferase activity of target cells using relative luminescence unit (RLU) as the recording indicator (Figure 18A). In addition, expression of the activation marker, CD69, by NK cells (CD3 ^- /CD56 ⁺ ) from this assay was assessed (Figure 18B). The results of this study demonstrate that the CD137xTA binding molecule, DART-1, increases both margituximab-mediated ADCC activity against N87/Luc target cells and margituximab-mediated CD69 activation on NK cells compared with a control molecule capable of binding only to HER2/neu.

[000509] Исследовали способность CD137×TA связывающей молекулы, обозначенной «DART-7», которая связывает иллюстративный ТА, EphA2, опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненном по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ). CD137×TA связывающую молекулу DART-7 и контрольную молекулу DART-8 испытывали (используя описанные выше протоколы) в присутствии EphA2-экспрессирующих клеток-мишеней Hs700T (Фигура 19А) или EphA2-отрицательных клеток-мишеней Hs700T (EphA2.KO) (Фигура 19В), или без клеток-мишеней. Результаты показывают, что CD137×TA связывающая молекула DART-7 проявляла костимулирующую активность в присутствии EphA2-экспрессирующих клеток, но не проявляла какую-либо наблюдаемую костимулирующую активность в отсутствие клеток-мишеней или с EphA2-отрицательными клетками-мишенями. Контрольная молекула DART-8 не проявляла костимулирующую активность.[000509] The ability of a CD137xTA binding molecule, designated "DART-7", which binds an exemplary TA, EphA2, to mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (performed essentially as described in Example 2 above, and in Example 2) was examined. release of IFN-γ). The CD137xTA binding molecule DART-7 and the control molecule DART-8 were tested (using the protocols described above) in the presence of EphA2-expressing Hs700T target cells (Figure 19A) or EphA2-negative Hs700T target cells (EphA2.KO) (Figure 19B ), or without target cells. The results show that the CD137xTA binding molecule DART-7 exhibited costimulatory activity in the presence of EphA2-expressing cells, but did not exhibit any observable costimulatory activity in the absence of target cells or with EphA2-negative target cells. The control molecule DART-8 did not exhibit costimulatory activity.

[000510] Костимулирующую активность CD137×TA связывающих молекул на популяциях Т-клеток исследовали, оценивая долю Т-клеток центральной памяти (Tcm) и Т-клеток эффекторной памяти (Tem). В общих чертах, человеческие Т-клетки культивировали совместно с EphA2-положительными клетками-мишенями аденокарциномы толстой кишки Соlо205 в течение 5 дней при субоптимальных условиях стимуляции в присутствии CD137×TA связывающей молекулы DART-7 или контрольных молекул DART-8 или DART-6. После совместного культивирования процент клеток Tcm (CCR7⁺CD45RA^-) и Tem (CCR7^-CD45RA^-) определяли в селективно пропущенных подгруппах CD4⁺ и CD8⁺. Результаты, обобщенные в таблице 11, показывают, что наблюдается существенное увеличение доли CD8⁺ Tcm и типов Tem-клеток и что это увеличение требует связывания как CD137, так и ТА (например, EphA2). Эти результаты указывают на то, что CD137×TA связывающие молекулы индуцируют существенное увеличение доли клеток CD8⁺ Tcm и Tem в присутствии соответствующих клеток, экспрессирующих опухолевый антиген. Нацеленный Т-клеточный агонизм, проявляемый CD137×TA связывающими молекулами, может позволить индуцировать активацию CD137, заякоренного на опухолевых клетках, при этом ограничивая системную активацию иммунных клеток и связанные побочные эффекты.[000510] The costimulatory activity of CD137xTA binding molecules on T cell populations was examined by assessing the proportion of central memory T cells (Tcm) and effector memory T cells (Tem). In general, human T cells were cocultured with EphA2-positive colon adenocarcinoma target cells Colo205 for 5 days under suboptimal stimulation conditions in the presence of the CD137xTA binding molecule DART-7 or control molecules DART-8 or DART-6. After co-culture, the percentage of Tcm (CCR7 ⁺ CD45RA ^- ) and Tem (CCR7 ^- CD45RA ^- ) cells was determined in the selectively skipped CD4 ⁺ and CD8 ⁺ subsets. The results, summarized in Table 11, show that there is a significant increase in the proportion of CD8 ⁺ Tcm and Tem cell types and that this increase requires the binding of both CD137 and TA (eg, EphA2). These results indicate that CD137xTA binding molecules induce a significant increase in the proportion of CD8 ⁺ Tcm and Tem cells in the presence of corresponding tumor antigen-expressing cells. Targeted T cell agonism exerted by CD137xTA binding molecules may allow the induction of CD137-anchored activation on tumor cells while limiting systemic immune cell activation and associated side effects.

[000511] Помимо этого конструировали и испытывали CD137×TA связывающие молекулы, имеющие один сайт связывания для CD137 и один или более сайтов связывания для HER2/neu (см., например. Фигуру 4А, 5А и 6А). Такие молекулы являются одновалентными для CD137 и проявляют уменьшенное связывание с активированными Т-клетками, как и ожидалось, учитывая их уменьшенную авидность. Такие молекулы проявили различное связывание с клетками-мишенями N87. Однако ни одна из одновалентных для CD137 молекул не проявляла какую-либо костимулирующую активность в анализах высвобождения цитокинов Т-клетками. Это наблюдение указывает на то, что для ко стимулирующей активности в этих анализах могут потребоваться по меньшей мере два сайта связывания CD137.[000511] In addition, CD137xTA binding molecules having one binding site for CD137 and one or more binding sites for HER2/neu were designed and tested (see, for example, Figures 4A, 5A and 6A). Such molecules are monovalent for CD137 and exhibit reduced binding to activated T cells, as expected given their reduced avidity. Such molecules showed differential binding to N87 target cells. However, none of the CD137 monovalent molecules exhibited any costimulatory activity in T cell cytokine release assays. This observation suggests that at least two CD137 binding sites may be required for costimulatory activity in these assays.

Пример 5Example 5

Оптимизация гуманизированного МАВ-3 к CD137Optimization of humanized MAB-3 to CD137

[000512] Как отмечено выше, гуманизация МАВ-3 к CD137 привела приблизительно к 2-кратной потере аффинности связывания (см., например, таблицу 9 выше). Оптимизацию применяли для выявления клонов гуманизированного МАВ-3 к CD137, имеющих сопоставимую или лучшую аффинность связывания, чем исходное мышиное антитело. В общих чертах, случайный мутагенез использовали для введения замен в домены CDR_H3 тяжелой цепи (положения 99-102 согласно Kabat) hMAB-3 к CD137 (1.3). Чтобы выявить клоны, имеющие повышенное связывание с CD137, применяли три раунда селекционного скрининга с повышением жесткости условий. 48 клонов отбирали в раундах 2 и 3 и оценивали их аффинность в качестве диател (имеющих структуру, показанную на Фигуре 5В). В таблице 12 представлено выравнивание аминокислотной последовательности остатков 99-102 согласно Kabat CDR_H3 из четырех клонов, отобранных на основании повышенного связывания с hCD137.[000512] As noted above, humanization of MAB-3 to CD137 resulted in an approximately 2-fold loss of binding affinity (see, for example, Table 9 above). Optimization was used to identify humanized MAB-3 anti-CD137 clones having comparable or better binding affinity than the parent mouse antibody. In general, random mutagenesis was used to introduce substitutions into the heavy chain CDR _H 3 domains (positions 99-102 according to Kabat) of hMAB-3 to CD137 (1.3). To identify clones with increased binding to CD137, three rounds of selection screening were used with increasing stringency of conditions. 48 clones were selected in rounds 2 and 3 and their affinity as diabodies (having the structure shown in Figure 5B) was assessed. Table 12 shows the amino acid sequence alignment of residues 99-102 according to Kabat CDR _H 3 from four clones selected on the basis of increased binding to hCD137.

[000513] Аминокислотные последовательности этих клонов включали в 5-цепочечное диатело DART-G для получения оптимизированных молекул DART-G (обозначенных DART-G1, DART-G2; DART-G3 и DART-G4). Аффинность связывания DART-G2, DART-G3 и DART-G4 оценивали с помощью BIAcore (таблица 11). Для такой оценки His-меченый растворимый человеческий CD137 (huCD137) или CD137 яванской макаки (cynoCD137) (содержащий внеклеточную часть CD137 человека или яванской макаки, гибридизованную с гистидинсодержащим пептидом) пропускали над поверхностью, покрытой иммобилизованным антителом. В общих чертах, каждую испытываемую молекулу захватывали на поверхность, покрытую козьим F(ab)₂ к человеческой Fc, и затем инкубировали в присутствии различных концентраций (6,25-100 нМ) huCD137 или cynoCD137. Кинетику связывания определяли с помощью анализа связывания BIACORE^® (нормированная модель связывания Ленгмюра в соотношении 1:1). Рассчитанные k_a, k_d и K_D из этих исследований представлены в таблице 13.[000513] The amino acid sequences of these clones were incorporated into a 5-stranded DART-G diabody to produce optimized DART-G molecules (designated DART-G1, DART-G2; DART-G3 and DART-G4). The binding affinities of DART-G2, DART-G3 and DART-G4 were assessed using BIAcore (Table 11). For this assessment, His-tagged soluble human CD137 (huCD137) or cynoCD137 (cynoCD137) (containing the extracellular portion of human or cynomolgus CD137 hybridized with a histidine-containing peptide) was passed over a surface coated with immobilized antibody. In general, each test molecule was captured onto a goat F(ab) ₂ to human Fc-coated surface and then incubated in the presence of varying concentrations (6.25-100 nM) of huCD137 or cynoCD137. Binding kinetics were determined using the BIACORE ^® binding assay (1:1 normalized Langmuir binding model). The calculated k _a , k _d and K _D from these studies are presented in Table 13.

[000514] Способность диател связывать CD137 оценивали, как описано выше. Результаты этого исследования представлены на Фигурах 20А-20В. Как отмечено выше, DART-G, имеющая сайты связывания hMAB-3 к CD137 (1.3) для CD137, проявляла незначительно более низкое связывание по сравнению с конструкциями, имеющими такую же структуру, но содержащими сайты связывания CD137 мышиного МАВ-3 к CD137 (DART-6). HER2×CD137 диатела, содержащие оптимизированные домены VH hMAB-3 к CD137, проявляли более высокое связывание, при этом относительная активность связывания молекул с человеческим CD137 была следующей: DART-G4 > DART-G3 > DART-G2 ≈ DART-6 > DART-G. DART-G и оптимизированные варианты проявляли практически идентичное связывание с HER2 на поверхности множества типов клеток-мишеней, включая клетки N87, JIMT-1 и MDA-MB231.[000514] The ability of the diabodies to bind CD137 was assessed as described above. The results of this study are presented in Figures 20A-20B. As noted above, DART-G having hMAB-3 binding sites to CD137 (1.3) for CD137 exhibited slightly lower binding compared to constructs having the same structure but containing mouse MAB-3 binding sites to CD137 CD137 (DART -6). HER2xCD137 diabodies containing optimized hMAB-3 VH domains to CD137 exhibited higher binding, with the relative binding activity of the molecules to human CD137 being as follows: DART-G4 > DART-G3 > DART-G2 ≈ DART-6 > DART- G. DART-G and the optimized variants exhibited nearly identical binding to HER2 on the surface of multiple target cell types, including N87, JIMT-1, and MDA-MB231 cells.

[000515] На Фигурах 21А-21С показаны результаты типичного анализа способности DART-3, DART-6, DART-B, DART-D, DART-G, DART-G2, DART-G3 и DART-G4 опосредовать ко стимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненном по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ). Высвобождение цитокинов измеряли, как описано выше, в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (Фигура 21А), клеток-мишеней JIMT-1 (Фигура 21В) или клеток-мишеней MDA-231 (Фигура 21C), или без клеток-мишеней.[000515] Figures 21A-21C show the results of a typical assay for the ability of DART-3, DART-6, DART-B, DART-D, DART-G, DART-G2, DART-G3, and DART-G4 to mediate stimulatory activity in the assay release of cytokines by T cells (done essentially as described in Example 2 above, and exemplified by the release of IFN-γ). Cytokine release was measured as described above in the presence of HER2/neu-expressing N87 target cells (Figure 21A), JIMT-1 target cells (Figure 21B) or MDA-231 target cells (Figure 21C), or without targets.

[000516] Результаты показывают, что контрольные диатела DART-3 и DART-6 не проявляли костимулирующую активность. CD137×TA связывающие молекулы не проявляли какую-либо наблюдаемую костимулирующую активность в отсутствие клеток-мишеней или с HER2/neu-отрицательными клетками-мишенями. DART-G, содержащая новое гуманизированное антитело к CD137, hMAB-3 к CD137, проявляла самую высокую костимулирующую активность в присутствии любой клеточной линии-мишени. TNF-α и ИЛ-2 показали сходные профили высвобождения.[000516] The results indicate that the control diabodies DART-3 and DART-6 did not exhibit co-stimulatory activity. CD137xTA binding molecules did not exhibit any observable co-stimulatory activity in the absence of target cells or with HER2/neu-negative target cells. DART-G containing a novel humanized anti-CD137 antibody, hMAB-3 anti-CD137, exhibited the highest co-stimulatory activity in the presence of any target cell line. TNF-α and IL-2 showed similar release profiles.

[000517] Было обнаружено, что костимулирующая активность оптимизированных вариантов DART-G2, DART-G3 и DART-G4 обратно пропорциональна повышенному связыванию с CD137, экспрессированным на поверхности клеток, это указывает на то, что более высокая аффинность связывания, по-видимому, не коррелирует непосредственно с костимулирующей активностью в этом анализе. Однако, как показано ниже, оптимизированные варианты имеют сопоставимую активность в других функциональных анализах. Эти характерные признаки делают оптимизированные по аффинности варианты особенно подходящими для детектирования экспрессии CD137 и для диагностических анализов, в которых измеряют экспрессию CD137, в дополнение к их применению в качестве костимулирующих агентов.[000517] The co-stimulatory activity of the optimized variants DART-G2, DART-G3 and DART-G4 was found to be inversely related to increased binding to CD137 expressed on the cell surface, indicating that the higher binding affinity does not appear to correlates directly with costimulatory activity in this assay. However, as shown below, the optimized variants have comparable activity in other functional assays. These characteristic features make affinity optimized variants particularly suitable for detecting CD137 expression and for diagnostic assays that measure CD137 expression, in addition to their use as co-stimulatory agents.

[000518] Исследовали способность CD137×TA связывающих молекул опосредовать перенаправленное уничтожение опухолевых клеток-мишеней клетками. В общих чертах, клетки-мишени N87/GFP/Luc (модифицированные для экспрессии репортерного гена люциферазы (luc)) инкубировали с общей популяцией Т-клеток в условиях субоптимальной стимуляции в течение 72 часов в отсутствие или в присутствии DART-В, DART-G, DART-G1, DART-G2, DART-G3, DART-G4 или контрольных молекул DART-3 или DART-6 (каждая по 0,001, 0,01, 0,1 и 1 мкг/мл) по существу, как описано выше для анализов костимуляции. В конце инкубации цитотоксичность определяли с помощью люминесцентного (LUM) анализа, в котором измеряли клеточную активность люциферазы клеток-мишеней, используя относительную световую единицу люминесценции (RLU) в качестве регистрируемого показателя (Фигура 22). Каждая из исследованных CD137×TA связывающих молекул проявляла некоторую степень активности в отношении перенаправленного уничтожения клеток, причем DART-G проявляла наибольшую активность, и DART-B проявляла наименьшую активность. Напротив, контрольные молекулы не проявляли детектируемую активность в отношении перенаправленного уничтожения клеток. Результаты этого исследования демонстрируют, что CD137×TA связывающие молекулы способны опосредовать перенаправленное уничтожение опухолевых клеток.[000518] The ability of CD137xTA binding molecules to mediate redirected killing of target tumor cells by cells was examined. In general, N87/GFP/Luc target cells (modified to express a luciferase (luc) reporter gene) were incubated with a general population of T cells under suboptimal stimulation conditions for 72 hours in the absence or presence of DART-B, DART-G , DART-G1, DART-G2, DART-G3, DART-G4, or DART-3 or DART-6 control molecules (each 0.001, 0.01, 0.1 and 1 μg/ml) essentially as described above for costimulation analyses. At the end of incubation, cytotoxicity was determined using a luminescence luminescence (LUM) assay, which measures the cellular luciferase activity of target cells using relative luminescence unit (RLU) as a recording metric (Figure 22). Each of the CD137xTA binding molecules tested exhibited some degree of activity in redirecting cell killing, with DART-G having the most activity and DART-B having the least activity. In contrast, control molecules did not exhibit detectable activity in redirecting cell killing. The results of this study demonstrate that CD137xTA binding molecules are capable of mediating redirected tumor cell killing.

Пример 6Example 6

Характеристика трехвалентных CD137×TA связывающих молекулCharacterization of trivalent CD137×TA binding molecules

[000519] Как отмечено выше, CD137×TA связывающие молекулы, имеющие один сайт связывания для CD137 и один или более сайтов связывания для HER2/neu, не проявляли какую-либо костимулирующую активность в анализах высвобождения цитокинов Т-клетками. Это наблюдение указывает на то, что для костимулирующей активности могут потребоваться по меньшей мере два сайта связывания CD137. Чтобы ответить на этот вопрос, получали набор примерных трехвалентных CD137×TA связывающих молекул, способных связываться с CD137 и с примерным ТА, HER2/neu. Эти молекулы включали четыре биспецифические трехвалентные связывающие молекулы «TRIDENT-A», «TRIDENT-A2», «TRIDENT-A3» и «TRIDENT-A4», соответственно, каждая из которых содержит два домена hMAB-3 к CD137 и один домен hMAB-1 к HER2 (CD137×CD137×HER2). Структура и последовательности этих примерных CD137×TA связывающих молекул подробно представлены выше. Помимо этого получали две контрольные молекулы «TRIDENT-1», содержащую один вариант домена паливизумаба и два оптимизированных домена hMAB-3 к CD137 (CD137×CD137×RSV), и «TRIDENT-2», содержащую один домен hMAB-1 к HER2, один домен 4-4-20 и один вариант домена паливизумаба (RSV×FITC×HER2). Трехвалентные молекулы имеют общую структуру, показанную на Фигуре 6А, и были получены и охарактеризованы, как подробно описано ниже, для определения их способности связываться с HER2/neu, присутствующим на поверхности мишени N87(3⁺), JIMT-1(2⁺) и MCF-7(1⁺) с помощью анализа FACS, по существу, как описано выше. Также оценивали CD137×TA связывающие молекулы, имеющие два сайта связывания для CD137 и два сайта связывания для HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 и DART-G4).[000519] As noted above, CD137xTA binding molecules having one binding site for CD137 and one or more binding sites for HER2/neu did not exhibit any costimulatory activity in T cell cytokine release assays. This observation suggests that co-stimulatory activity may require at least two CD137 binding sites. To answer this question, a set of exemplary trivalent CD137×TA binding molecules capable of binding to CD137 and the exemplary TA, HER2/neu, was prepared. These molecules included four bispecific trivalent binding molecules "TRIDENT-A", "TRIDENT-A2", "TRIDENT-A3" and "TRIDENT-A4", respectively, each containing two hMAB-3 domains to CD137 and one hMAB- domain 1 to HER2 (CD137×CD137×HER2). The structure and sequences of these exemplary CD137xTA binding molecules are presented in detail above. In addition, two control molecules “TRIDENT-1” were obtained, containing one variant of the palivizumab domain and two optimized hMAB-3 domains to CD137 (CD137×CD137×RSV), and “TRIDENT-2”, containing one hMAB-1 domain to HER2, one 4-4-20 domain and one palivizumab domain variant (RSV×FITC×HER2). The trivalent molecules have the general structure shown in Figure 6A and were prepared and characterized as detailed below to determine their ability to bind to HER2/neu present on the surface of the target N87(3 ⁺ ), JIMT-1(2 ⁺ ), and MCF-7( ¹⁺ ) by FACS analysis essentially as described above. CD137xTA binding molecules having two binding sites for CD137 and two binding sites for HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 and DART-G4) were also evaluated.

[000520] Как показано на Фигуре 23А-23С, молекулы, которые содержат один или два HER2/neu-связывающих домена, связывались со всеми тремя типами клеток-мишеней. Следует отметить, что кривые связывания молекул, имеющих два сайта связывания HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 и DART-G4), быстрее достигают насыщения, в частности, на клетках, имеющих высокие уровни HER2/neu на клеточной поверхности. Это указывает на то, что некоторые молекулы проявляют двухвалентное связывание (т.е. связывание двух молекул HER2/neu на поверхности). Двухвалентное связывание более вероятно в присутствии высоких концентраций лиганда-мишени.[000520] As shown in Figures 23A-23C, molecules that contain one or two HER2/neu binding domains bound to all three target cell types. It should be noted that the binding curves of molecules having two HER2/neu binding sites (DART-G, DART-G2, DART-G3 and DART-G4) reach saturation more quickly, in particular on cells having high levels of HER2/neu at cell surface. This indicates that some molecules exhibit divalent binding (ie, binding of two HER2/neu molecules at the surface). Divalent binding is more likely in the presence of high concentrations of the target ligand.

[000521] CD137×TA связывающие молекулы, имеющие два сайта связывания для CD 137 и один сайт связывания для HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 и TRIDENT-A4), контрольные молекулы CD137×CD137×RSV и TA×FITC×RSV (TRIDENT-1 и TRIDENT-2) и CD137×TA связывающие молекулы, имеющие два сайта связывания для CD137 и 2 сайта связывания для HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 и DART-G4), также оценивали с помощью анализа FACS по существу, как описано в примере 2 выше, для определения их способности связывать CD137, присутствующий на поверхности активированных CD4⁺ (Фигура 24А) и CD8⁺ (Фигура 24В) Т-клеток. Молекулы, которые содержали два CD137-связывающих домена, проявляли сильное связывание с активированными Т-клетками. Улучшенное связывание наблюдали для примерных HER2×CD137 диател, содержащих оптимизированные домены VH hMAB-3 к CD137, описанные выше. Как и ожидалось, контрольная молекула TA×FITC×RSV (TRIDENT-2) не проявляла какое-либо связывание с активированными Т-клетками.[000521] CD137xTA binding molecules having two binding sites for CD 137 and one binding site for HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 and TRIDENT-A4), CD137xCD137xRSV control molecules and TA×FITC×RSV (TRIDENT-1 and TRIDENT-2) and CD137×TA binding molecules having two binding sites for CD137 and 2 binding sites for HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 and DART- G4) were also assessed by FACS assay as described in Example 2 above to determine their ability to bind CD137 present on the surface of activated CD4 ⁺ (Figure 24A) and CD8 ⁺ (Figure 24B) T cells. Molecules that contained two CD137-binding domains exhibited strong binding to activated T cells. Improved binding was observed for exemplary HER2xCD137 diabodies containing the optimized hMAB-3 anti-CD137 VH domains described above. As expected, the control molecule TAxFITCxRSV (TRIDENT-2) did not show any binding to activated T cells.

[000522] В другом исследовании оценивали способность CD137×TA связывающих молекул, имеющих два сайта связывания для CD137 и один сайт связывания для HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 и TRIDENT-A4), CD137×TA связывающей молекулы, имеющей два сайта связывания для CD137 и два сайта связывания для HER2/neu (DART-G4), и контрольной молекулы TA×FITC×RSV (TRIDENT-2) опосредовать конъюгацию клетка-клетка между клетками, экспрессирующими CD137, и клетками-мишенями, экспрессирующими HER2/neu. Для такой оценки 1,5×10⁴ CD137-экспрессирующих клеток СНО, меченых РKН26, инкубировали совместно с 1,5×10⁴ HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней (N87 (уровень экспрессии HER2: 3⁺), JIMT-1 (уровень экспрессии HER2: 2⁺) или MCF-7 (уровень экспрессии HER2: 1⁺), меченых CFSE, в соотношении 1:1 в присутствии последовательно разведенного (10-кратные разведения) испытываемого изделия в течение 30 мин. при комнатной температуре. Затем образцы анализировали методом проточной цитометрии, чтобы определить процент конъюгированных клеток (CFSE⁺/PKH26⁺) в качестве регистрируемого показателя для конъюгации клетка-клетка. Как показано на Фигуре 25А-25С, молекулы, которые содержали по меньшей мере один HER2/neu-связывающий домен и два CD137-связывающих домена, могли опосредовать конъюгацию клетка-клетка, в то время как контрольная молекула была неактивной. Для всех активных молекул активность конъюгации клетка-клетка коррелировала с уровнем экспрессии HER2/neu.[000522] Another study assessed the ability of CD137xTA binding molecules having two binding sites for CD137 and one binding site for HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 and TRIDENT-A4), CD137xTA binding molecule having two binding sites for CD137 and two binding sites for HER2/neu (DART-G4), and the control molecule TAxFITCxRSV (TRIDENT-2) mediate cell-cell conjugation between cells expressing CD137 and target cells , expressing HER2/neu. For this assessment, 1.5 x 10 ⁴ CD137-expressing CHO cells labeled with PKH26 were co-incubated with 1.5 x 10 ⁴ HER2/neu-expressing target cells (N87 (HER2 expression level: 3 ⁺ ), JIMT-1 ( expression level of HER2: 2 ⁺ ) or MCF-7 (expression level of HER2: 1 ⁺ ) labeled with CFSE, in a 1:1 ratio in the presence of serially diluted (10-fold dilutions) test article for 30 minutes at room temperature. Then samples were analyzed by flow cytometry to determine the percentage of conjugated cells (CFSE ⁺ /PKH26 ⁺ ) as a recording indicator for cell-cell conjugation.As shown in Figure 25A-25C, molecules that contained at least one HER2/neu-binding domain and two CD137-binding domains could mediate cell-cell conjugation while the control molecule was inactive.For all active molecules, cell-cell conjugation activity correlated with the level of HER2/neu expression.

[000523] В другом исследовании оценивали способность CD137×TA связывающих молекул, имеющих два сайта связывания для CD137 и один сайт связывания для HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 и TRIDENT-A4), контрольных молекул CD137×RSV и TA×FITC×RSV (TRIDENT-1 и TRIDENT-2) и CD137×TA связывающих молекул, имеющих два сайта связывания для CD137 и два сайта связывания для HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 и DART-G4), опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненном по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ) в присутствии или в отсутствие клеток-мишеней, экспрессирующих примерный ТА, HER2/neu. Высвобождение цитокинов измеряли, как описано выше, в присутствии HER2/neu-экспрессирующих клеток-мишеней N87 (Фигура 26А), клеток-мишеней JIMT-1 (Фигура 26В) или без клеток-мишеней (Фигура 26С).[000523] Another study assessed the ability of CD137xTA binding molecules having two binding sites for CD137 and one binding site for HER2/neu (TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 and TRIDENT-A4), control CD137x molecules RSV and TA×FITC×RSV (TRIDENT-1 and TRIDENT-2) and CD137×TA binding molecules having two binding sites for CD137 and two binding sites for HER2/neu (DART-G, DART-G2, DART-G3 and DART-G4) mediate co-stimulatory activity in a T cell cytokine release assay (performed essentially as described in Example 2 above and exemplified by IFN-γ release) in the presence or absence of target cells expressing the exemplary TA, HER2/ neu. Cytokine release was measured as described above in the presence of HER2/neu-expressing N87 target cells (Figure 26A), JIMT-1 target cells (Figure 26B), or without target cells (Figure 26C).

[000524] Результаты показывают, что примерные CD137×TA связывающие молекулы проявляют костимулирующую активность в присутствии любой линии клеток-мишеней, причем активность коррелирует с уровнем экспрессии HER2/neu. TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 и TRIDENT-A4 (каждая из которых имеет два сайта связывания для CD137 и один сайт связывания для HER2/neu) проявляли более высокую костимулирующую активность в отношении клеток JIMT-1 (HER2⁺⁺), чем DART-G, DART-G2, DART-G3 или DART-G4 (с двумя сайтами связывания для CD137 и 2 сайтами связывания для HER2/neu). CD137×TA связывающие молекулы не проявляли какую-либо наблюдаемую костимулирующую активность в отсутствие клеток-мишеней или с HER2/neu-отрицательными клетками-мишенями. Контрольные молекулы TRIDENT-1 и TRIDENT-2 не проявляли костимулирующую активность.[000524] The results indicate that exemplary CD137xTA binding molecules exhibit co-stimulatory activity in the presence of any target cell line, and the activity correlates with the level of HER2/neu expression. TRIDENT-A, TRIDENT-A2, TRIDENT-A3 and TRIDENT-A4 (each having two binding sites for CD137 and one binding site for HER2/neu) exhibited higher co-stimulatory activity against JIMT-1 cells (HER2 ⁺⁺ ) than DART-G, DART-G2, DART-G3 or DART-G4 (with two binding sites for CD137 and 2 binding sites for HER2/neu). CD137xTA binding molecules did not exhibit any observable co-stimulatory activity in the absence of target cells or with HER2/neu-negative target cells. The control molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2 did not exhibit costimulatory activity.

Пример 7Example 7

CD137×TA связывающие молекулы повышают активацию Т-клетокCD137xTA binding molecules increase T cell activation

[000525] Как описано выше, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению могут повышать размножение и активацию Т-клеток (см., например. Фигуры 17А-17O) и эффекторную функцию NK (АЗКЦ), опосредуемую нацеленным на опухоль агентом (см., например, повышение опосредуемой маргетуксимабом АЗКЦ, Фигура 18А-18В). Известно, что биспецифические молекулы TA×CD3 (например, антитела DART, молекулы BiTE^® и т.д.), которые связываются с ТА и с CD3, опосредуют перенаправленное уничтожение клеток-мишеней, экспрессирующих ТА, Т-клетками и стимулируют размножение и активацию Т-клеток (см., например, РСТ публикации №WO 2017/030926; WO 2016/048938; и WO 2015/026892). Способность CD137×TA связывающих молекул согласно настоящему изобретению повышать активацию Т-клеток и перенаправленное уничтожение Т-клетками, опосредуемое такими агентами, нацеленными на опухоль, оценивали в нескольких исследованиях с использованием примерных TA×CD3 биспецифических молекул.[000525] As described above, the CD137xTA binding molecules of the present invention can enhance T cell expansion and activation (see, e.g., Figures 17A-17O) and NK effector function (ADCC) mediated by a tumor-targeting agent (see eg, increase in margetuximab-mediated ADCC, Figure 18A-18B). Bispecific TA×CD3 molecules (e.g., DART antibodies, BiTE ^® molecules, etc.) that bind to TA and CD3 are known to mediate redirected killing of target TA-expressing cells by T cells and stimulate proliferation and activation T cells (see, for example, PCT Publication No. WO 2017/030926; WO 2016/048938; and WO 2015/026892). The ability of the CD137xTA binding molecules of the present invention to enhance T cell activation and redirected T cell killing mediated by such tumor-targeting agents has been assessed in several studies using exemplary TAxCD3 bispecific molecules.

[000526] В одном из таких исследований способность примерной CD137×TA связывающей молекулы TRIDENT-A4 усиливать перенаправленное уничтожение Т-клетками, опосредуемое TA×CD3 диателом, которое связывается с иллюстративным ТА gpA33, оценивали с использованием анализа цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) на основе люциферазы. В общих чертах, общую популяцию Т-клеток инкубировали с клетками Со1о205, модифицированными для экспрессии репортерного гена люциферазы (luc) (Colo205/luc), при соотношении эффектор : мишень (Е : Т) 3:1 в присутствии TRIDENT-A4 или контрольной молекулы TRIDENT-1 в комбинации с TA×CD3 диателом или контрольным Irrel×CD3 биспецифическим диателом (содержащим нецелевой связывающий домен (4-4-20 к флуоресцеину) вместо gpA33). В конце инкубации цитотоксичность определяли с помощью люминесцентного (LUM) анализа, в котором измеряли клеточную активность люциферазы клеток-мишеней, используя относительную световую единицу люминесценции (RLU) в качестве регистрируемого показателя (Фигура 27). Результаты этого исследования демонстрируют, что CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению способны повышать перенаправленное уничтожение Т-клетками, опосредуемое TA×CD3 биспецифическими молекулами.[000526] In one such study, the ability of the exemplary CD137xTA binding molecule TRIDENT-A4 to enhance redirected T cell killing mediated by a TAxCD3 diabody that binds to the exemplary gpA33 TA was assessed using a cytotoxic T lymphocyte (CTL) assay based on luciferase. In general, a general population of T cells was incubated with Colo205 cells modified to express the luciferase (luc) reporter gene (Colo205/luc) at an effector:target (E:T) ratio of 3:1 in the presence of TRIDENT-A4 or a control molecule TRIDENT-1 in combination with a TA×CD3 diabody or a control Irrel×CD3 bispecific diabody (containing a non-target binding domain (4-4-20 to fluorescein) instead of gpA33). At the end of incubation, cytotoxicity was determined using a luminescence luminescence (LUM) assay, which measures the cellular luciferase activity of target cells using relative luminescence unit (RLU) as a recording metric (Figure 27). The results of this study demonstrate that the CD137xTA binding molecules of the present invention are capable of enhancing redirected T cell killing mediated by TAxCD3 bispecific molecules.

[000527] В другом исследовании способность примерной CD137×TA связывающей молекулы TRIDENT-A2 повышать размножение Т-клеток и противоопухолевую активность в комбинации in vivo оценивали в модели карциномы яичников SK-OV3 (экспрессирующей ТА HER2/neu и 5Т4). В этом исследовании активность TRIDENT-A2 исследовали по отдельности или в комбинации с TA×CD3 диателом, которое связывается с иллюстративным ТА, 5Т4 (5T4×CD3), и необязательно в дополнительной комбинации с MAT к PD-1 (MAT 7 к чPD-1 (1.2) IgG4 (Р), см., например, SEQ ID NO: 264 и 266 из РСТ публикации WO 2017/019846).[000527] In another study, the ability of the exemplary CD137xTA binding molecule TRIDENT-A2 to enhance T cell expansion and antitumor activity in combination in vivo was assessed in the SK-OV3 ovarian carcinoma model (expressing HER2/neu and 5T4 TAs). In this study, the activity of TRIDENT-A2 was tested alone or in combination with a TAxCD3 diabody that binds to an exemplary TA, 5T4 (5T4xCD3), and optionally in additional combination with an anti-PD-1 MAT (MAT 7 anti-hPD-1 (1.2) IgG4 (P), see for example SEQ ID NO: 264 and 266 of PCT publication WO 2017/019846).

[000528] В общих чертах, свежеизолированные МКПК вводили путем ретроорбитальной инъекции мышам NSG.MHCI^-/- (по 7 самок мышей в группе для контроля опухолей; по 3 в группе для профилирования Т-клеток и опухолей) на 0 день исследования. Клетки SK-OV3 (5×10⁶) смешивали в соотношении 1:1 с матригелем и вводили подкожно на 0 день исследования. На 7 день исследования мыши получали антитело к CD4, ОKТ4 (начальная доза 10 мг/кг подкожно, и затем 5 мг/кг в/б два раза в неделю), чтобы устранить CD4⁺ Т-клетки. Начиная с 22 дня, мыши получали внутривенные (в/в) инъекции: контрольной среды; TRIDENT-A2 (2,5 мг/кг, один раз в неделю); TA×CD3 диатела (0,01 мг/кг, два раза в неделю); комбинацию TRIDENT-A2 (2,5 мг/кг, один раз в неделю) и TA×CD3 диатела (0,01 мг/кг, два раза в неделю); MAT к PD-1 (5 мг/кг один раз в неделю); или комбинацию TRIDENT-A2 (2,5 мг/кг; один раз в неделю), TA×CD3 диатела (0,01 мг/кг, два раза в неделю) и MAT к PD-1 (5 мг/кг, один раз в неделю).[000528] In general, freshly isolated PBMCs were administered by retroorbital injection to NSG.MHCI ^-/- mice (7 female mice per tumor control group; 3 per T cell and tumor profiling group) on day 0 of the study. SK-OV3 cells (5×10 ⁶ ) were mixed in a 1:1 ratio with Matrigel and injected subcutaneously on day 0 of the study. On day 7 of the study, mice received the anti-CD4 antibody, OKT4 (initial dose of 10 mg/kg SC followed by 5 mg/kg IP twice weekly) to eliminate CD4 ⁺ T cells. Starting on day 22, mice received intravenous (IV) injections of: control medium; TRIDENT-A2 (2.5 mg/kg, once a week); TA×CD3 diabody (0.01 mg/kg, twice a week); combination of TRIDENT-A2 (2.5 mg/kg, once a week) and TA×CD3 diabody (0.01 mg/kg, twice a week); MAT to PD-1 (5 mg/kg once a week); or a combination of TRIDENT-A2 (2.5 mg/kg; once weekly), TA×CD3 diabody (0.01 mg/kg, twice weekly) and anti-PD-1 MAT (5 mg/kg, once weekly) in Week).

[000529] Т-клеточные маркеры оценивали с помощью анализа FACS через 7 дней после введения испытываемых изделий, и рост опухоли контролировали в течение всего исследования. Экспрессию Т-клеточных маркеров CD4, CD8, CD69 и PD-1, присутствующих в 1 мг опухоли, образец которой отбирали на 7 день после обработки, представляли в графической форме на Фигуре 28А, Фигуре 28В, Фигуре 28С и Фигуре 28D, соответственно. Эти данные показывают, что CD137×TA связывающая молекула TRIDENT-A2 повышает активацию и размножение Т-клеток (на примере увеличения экспрессии CD4, CD8 и CD69), опосредуемые TA×CD3 диателом. Экспрессия молекулы контрольной точки иммунного ответа PD-1 повышалась при обработке TA×CD3 диателом по отдельности. Обработка комбинацией CD137×TA связывающей молекулы TRIDENT-A2 и TA×CD3 диатела дополнительно повышала экспрессию молекулы контрольной точки иммунного ответа PD-1, наблюдаемую при обработке только TA×CD3 диателом, и это свидетельствует о том, что активность комбинации может быть повышена с помощью добавления ингибитора контрольной точки иммунного ответа. Действительно, добавление MAT к PD-1, примерного ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, к комбинации TRIDENT-A2/TA×CD3 диатела ингибировало повышение экспрессии PD-1 и дополнительно повышало активацию и пролиферацию Т-клеток.[000529] T cell markers were assessed by FACS analysis 7 days after administration of the test articles, and tumor growth was monitored throughout the study. The expression of T cell markers CD4, CD8, CD69 and PD-1 present in 1 mg of tumor sampled on day 7 post-treatment was presented graphically in Figure 28A, Figure 28B, Figure 28C and Figure 28D, respectively. These data demonstrate that the CD137xTA binding molecule TRIDENT-A2 enhances T cell activation and expansion (as exemplified by increased expression of CD4, CD8, and CD69) mediated by the TAxCD3 diabody. Expression of the immune checkpoint molecule PD-1 was increased by treatment with TA×CD3 diabody alone. Treatment with a combination of the CD137xTA binding molecule TRIDENT-A2 and the TAxCD3 diabody further increased the expression of the immune checkpoint molecule PD-1 observed with treatment with the TAxCD3 diabody alone, suggesting that the activity of the combination could be enhanced by adding an immune checkpoint inhibitor. Indeed, addition of the anti-PD-1 MAT, an exemplary PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor, to the TRIDENT-A2/TA×CD3 diabody combination inhibited the increase in PD-1 expression and further increased T cell activation and proliferation.

[000530] Рост опухоли в ходе исследования представлен в графической форме на Фигуре 29, на которой показано, что CD137×TA связывающая молекула TRIDENT-A2 повышает противоопухолевую активность TA×CD3 диатела. Помимо этого добавление ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, MAT к PD-1, к комбинации еще более повышало противоопухолевую активность комбинации. Результаты этого исследования демонстрируют, что CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, в частности, те, которые имеют два сайта связывания для CD137 и один сайт связывания для ТА, повышают активацию и пролиферацию Т-клеток, а также уничтожение Т-клетками клеток-мишеней в комбинации с агентом, нацеленным на опухоль. Соответственно, CD137×TA связывающие молекулы согласно настоящему изобретению можно преимущественно применять в комбинации с агентами, нацеленными на опухоль, в частности, с теми, которые опосредуют активацию Т-клеток, активацию NK-клеток и/или стимулируют экспрессию CD137 в таких клетках. Кроме того, эти исследования демонстрируют, что добавление ингибитора контрольной точки иммунного ответа PD-1/PD-L1, такого как антитело к PD-1 или антитело к PD-L1, может дополнительно повышать активацию и пролиферацию Т-клеток, а также уничтожение клеток-мишеней Т-клетками.[000530] Tumor growth during the study is presented graphically in Figure 29, which shows that the CD137xTA binding molecule TRIDENT-A2 enhances the antitumor activity of the TAxCD3 diabody. In addition, adding the PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor, an anti-PD-1 MAT, to the combination further enhanced the antitumor activity of the combination. The results of this study demonstrate that the CD137xTA binding molecules of the present invention, particularly those having two binding sites for CD137 and one binding site for TA, increase T cell activation and proliferation, as well as T cell killing of T cells. targets in combination with a tumor-targeting agent. Accordingly, the CD137xTA binding molecules of the present invention can advantageously be used in combination with tumor-targeting agents, in particular those that mediate T cell activation, NK cell activation and/or stimulate CD137 expression in such cells. Additionally, these studies demonstrate that the addition of a PD-1/PD-L1 immune checkpoint inhibitor, such as anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody, can further enhance T cell activation and proliferation, as well as cell killing -targets by T cells.

Пример 8Example 8

Исследования стабильностиStability studies

[000531] Оценивали температуру плавления (Tm) и другие параметры стабильности примерных трехвалентных CD137×TA связывающих молекул TRIDENT-А (содержащей hMAB-3 к CD137 (1.3)) и оптимизированных вариантов TRIDENT-A1 (содержащей hMAB-3 к CD137 (1А.3)), TRIDENT-A2 (содержащей hMAB-3 к CD137 (1 В.3)), TRIDENT-A3 (содержащей hMAB-3 к CD137 (1С.3)) и TRIDENT-A4 (содержащей hMAB-3 к CD137 (1D.3)). Tm очищенного материала (>95% согласно результатам определения методом гель-проникающей хроматографии (ГХ) высокого давления (ВЭГХ)) оценивали с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). В общих чертах, степень чистоты измеряли методом ВЭЖХ-ГХ с использованием Agilent 1260 Infinity II HPLC, соединенного с колонкой Waters Acquity UPLC ВЕН (200, 1,7 мкм, 4,6×150 мм). Подвижный буфер представлял собой 20 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, 0,02% азида натрия, рН=7,2. Скорость потока составляла 0,4 мл/мин в течение 5 минут. Процент чистоты определяли по % площади кривой поглощения для пика мономера при 280 нм. Измерения термостабильности выполняли на MicroCal VP-Capillary DSC (Malvern Instruments, Inc.) при температуре 15-95°C с линейным увеличением 1°С/мин.[000531] Melting temperature (Tm) and other stability parameters of exemplary trivalent CD137xTA binding molecules TRIDENT-A (containing hMAB-3 to CD137 (1.3)) and optimized variants of TRIDENT-A1 (containing hMAB-3 to CD137 (1A. 3)), TRIDENT-A2 (containing hMAB-3 to CD137 (1 B.3)), TRIDENT-A3 (containing hMAB-3 to CD137 (1C.3)) and TRIDENT-A4 (containing hMAB-3 to CD137 ( 1D.3)). The Tm of the purified material (>95% as determined by high pressure gel permeation chromatography (GC)) was assessed using differential scanning calorimetry (DSC). In general terms, purity was measured by HPLC-GC using an Agilent 1260 Infinity II HPLC coupled to a Waters Acquity UPLC BEN column (200 , 1.7 µm, 4.6×150 mm). The running buffer was 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 0.02% sodium azide, pH=7.2. The flow rate was 0.4 ml/min for 5 minutes. The percentage of purity was determined by the % area of the absorption curve for the monomer peak at 280 nm. Thermal stability measurements were performed on a MicroCal VP-Capillary DSC (Malvern Instruments, Inc.) at 15–95°C with a ramp of 1°C/min.

[000532] Чтобы оценить другие параметры стабильности, очищенные CD137×TA связывающие молекулы (1 мг/мл в ФСБ, рН=7,2, если не указано иное) подвергали оценке в стрессовых условиях, повторно оценивали с помощью ВЭГХ и сравнивали значения со значениями, полученными для молекулы, не подвергнутой стрессу. Использовали следующие стрессовые условия: три цикла замораживания (1 час при -80°С) с последующим оттаиванием; затем хранение в течение 2 и 7 дней при 25°С или 40°С; затем хранение в течение 0, 2, 7 дней при 25°С в 20 мМ ацетате натрия, рН=5,5; хранение в течение 0, 2, 7 дней при 25°С в 10 мМ гистидине НСl, рН=6,5. Результаты этих исследований приведены в таблице 14.[000532] To evaluate other stability parameters, purified CD137×TA binding molecules (1 mg/ml in PBS, pH=7.2 unless otherwise noted) were evaluated under stress conditions, re-evaluated by HPLC and compared with values , obtained for a molecule not subjected to stress. The following stress conditions were used: three cycles of freezing (1 hour at -80°C) followed by thawing; then storage for 2 and 7 days at 25°C or 40°C; then storage for 0, 2, 7 days at 25°C in 20 mM sodium acetate, pH=5.5; storage for 0, 2, 7 days at 25°C in 10 mM histidine HCl, pH=6.5. The results of these studies are shown in Table 14.

[000533] Начальная точка Tm и Tm CD137-связывающих областей (Tm1 находятся в оптимальном диапазоне для TRIDENT-A и TRIDENT-A2. Однако начальная точка Tm и Tm1 ниже как для TRIDENT-A3, так и для TRIDENT-A4. Только TRIDENT-A2 была стабильной при 40°С (2 день и 7 день) в ФСБ, остальные молекулы были чувствительны к этим условиям хранения. TRIDENT-A и TRIDENT-A2 обе были стабильны в ацетате, рН=5,5, тогда как TRIDENT-A3 и TRIDENT-A4 обе были чувствительны к инкубации с ацетатом, рН=5,5. Все испытанные молекулы были стабильны в гистидине при рН=6,5. Основываясь на результатах этих исследований, ранжирование по стабильности в испытываемых буферах является следующим TRIDENT-A2 > TRIDENT-A > TRIDENT-А3 > TRIDENT-A4.[000533] The Tm and Tm starting point of the CD137 binding regions (Tm1) are in the optimal range for TRIDENT-A and TRIDENT-A2. However, the Tm and Tm1 starting point are lower for both TRIDENT-A3 and TRIDENT-A4. TRIDENT-A only A2 was stable at 40°C (day 2 and day 7) in PBS, the remaining molecules were sensitive to these storage conditions.TRIDENT-A and TRIDENT-A2 were both stable in acetate, pH=5.5, while TRIDENT-A3 and TRIDENT-A4 were both sensitive to incubation with acetate, pH=5.5. All molecules tested were stable in histidine at pH=6.5. Based on the results of these studies, the ranking for stability in the test buffers is TRIDENT-A2 > TRIDENT-A > TRIDENT-A3 > TRIDENT-A4.

Пример 9Example 9

Костимулирующая активность с Т-клетками яванской макакиCostimulatory activity with cynomolgus T cells

[000534] Как отмечено выше, молекулы, содержащие связывающие домены МАВ-3 к CD137 (или их гуманизированные, оптимизированные варианты), связывают как CD137 человека, так и CD137 яванской макаки. Типичные CD137×TA связывающие молекулы, TRIDENT-A2 и TRIDENT-B2, имеющие два сайта связывания для CD137 и один сайт связывания для HER2/neu или 5Т4, оценивали для определения их способности опосредовать костимулирующую активность в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками яванской макаки. Структура и последовательности этих примерных CD137×TA связывающих молекул подробно представлены выше. Также были включены контрольные молекулы TRIDENT-1 и TRIDENT-2. Анализ высвобождения цитокинов выполняли по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ, в присутствии или в отсутствие клеток-мишеней, за исключением того, что использовали общую популяцию Т-клеток яванской макаки. Для этих исследований применяли клетки-мишени JIMT-1, экспрессирующие HER2/neu и 5Т4.[000534] As noted above, molecules containing MAB-3 CD137 binding domains (or humanized, optimized variants thereof) bind both human and cynomolgus CD137. Representative CD137xTA binding molecules, TRIDENT-A2 and TRIDENT-B2, which have two binding sites for CD137 and one binding site for HER2/neu or 5T4, were evaluated to determine their ability to mediate co-stimulatory activity in a cynomolgus T cell cytokine release assay. The structure and sequences of these exemplary CD137xTA binding molecules are presented in detail above. The control molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2 were also included. The cytokine release assay was performed essentially as described in Example 2 above and for IFN-γ release, in the presence or absence of target cells, except that a general population of cynomolgus T cells was used. JIMT-1 target cells expressing HER2/neu and 5T4 were used for these studies.

[000535] Результаты представлены на Фигуре 30 и показывают, что контрольные молекулы TRIDENT-1 и TRIDENT-2 не проявляли костимулирующую активность. В то время как CD137×TA связывающие молекулы TRIDENT-A2 и TRIDENT-B2 (содержащие гуманизированное/оптимизированное антитело к CD137, hMAB-3 к CD137 (1В.3)) обе проявляли костимулирующую активность, зависящую от дозы.[000535] The results are presented in Figure 30 and show that the control molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-2 did not exhibit co-stimulatory activity. While the CD137xTA binding molecules TRIDENT-A2 and TRIDENT-B2 (containing a humanized/optimized anti-CD137 antibody, hMAB-3 anti-CD137 (1B.3)) both exhibited dose-dependent co-stimulatory activity.

Пример 10Example 10

Деиммунизация CD137Deimmunization of CD137

[000536] Анализ hMAB-3 к CD137 (1В.3) in silico выявил два потенциальных пептида, связывающих ГКГС класса II (Т-клеточные эпитопы), в домене VH и три потенциальных пептида, связывающих ГКГС класса II, в домене VL. Панель аминокислотных замен hMAB-3 к CD137 (1В.3) исследовали для выявления замен (которые могут представлять собой единичные аминокислотные замены или группы замен) для устранения/снижения потенциальной иммуногенности выявленных Т-клеточных эпитопов. В частности, замены аминокислот вводили в двух положениях (остатки 38 и 48 согласно Kabat) для деиммунизации VH1B hMAB-3 к CD137 и не более чем в шести положениях (остатки 24, 15, 44, 48, 52 и 54 согласно Kabat) для деиммунизации VL3 hMAB-3 к CD137. Замененные остатки аминокислот в доменах VH и VL заключены в рамку, и нумерация согласно Kabat указана стрелками на Фигурах 31А и 31В, соответственно. Получали антитела IgG1 (имеющие домен Fc 234A/235A (SEQ ID NO: 40)), содержащие варианты VH и/или VL hMAB-3 к CD137 (1В.3), имеющие различные замены в этих положениях, по отдельности и/или в комбинации, и характеризовали их способность связывать CD137 с помощью Attana Cell A200 QCM. В общих чертах, hMAB-3 к CD137 (1В.3) и деиммунизированные варианты независимо захватывали на сенсорном чипе Attana, покрытом кроличьим поликлональным антителом к Fc человеческого IgG, и растворимый гибридный человеческий белок CD137, несущий His-метку, пропускали над чипом в концентрации 11,1, 33,3, 100 и 300 мМ. Сенсограммы деиммунизированных вариантов сравнивали с таковыми hMAB-3 к CD137 (1В.3) и оценивали. Антитела также были охарактеризованы по их термостабильности с помощью DSC по существу, как описано выше в примере 8. Результаты для ряда таких вариантов обобщены в таблице 15, аминокислотные последовательности этих вариантов представлены выше.[000536] In silico analysis of hMAB-3 against CD137 (1B.3) identified two potential MHC class II binding peptides (T cell epitopes) in the VH domain and three potential MHC class II binding peptides in the VL domain. The panel of hMAB-3 anti-CD137 amino acid substitutions (1B.3) was examined to identify substitutions (which may be single amino acid substitutions or groups of substitutions) to eliminate/reduce the potential immunogenicity of the identified T-cell epitopes. Specifically, amino acid substitutions were introduced at two positions (residues 38 and 48 according to Kabat) to deimmunize VH1B hMAB-3 to CD137 and at no more than six positions (residues 24, 15, 44, 48, 52 and 54 according to Kabat) to deimmunize VL3 hMAB-3 to CD137. Replaced amino acid residues in the VH and VL domains are boxed and Kabat numbering is indicated by arrows in Figures 31A and 31B, respectively. IgG1 antibodies (having Fc 234A/235A domain (SEQ ID NO: 40)) containing VH and/or VL variants of hMAB-3 to CD137 (1B.3) having various substitutions at these positions, individually and/or in combinations and characterized their ability to bind CD137 using Attana Cell A200 QCM. In general, anti-CD137 hMAB-3 (1B.3) and deimmunized variants were independently captured on an Attana sensor chip coated with a rabbit polyclonal anti-human IgG Fc antibody, and a soluble human CD137 fusion protein carrying a His tag was passed over the chip at a concentration 11.1, 33.3, 100 and 300 mM. Sensograms of deimmunized variants were compared with those of hMAB-3 to CD137 (1B.3) and evaluated. Antibodies were also characterized for their thermostability using DSC essentially as described above in Example 8. The results for a number of such variants are summarized in Table 15, the amino acid sequences of these variants are presented above.

[000537] Было выявлено большое количество деиммунизированных вариантов, которые сохраняют как активность связывания CD137, так и термическую стабильность. Большинство деиммунизированных вариантов, содержащих замену I48A домена VH, проявляли некоторое снижение как связывания CD137, так и начальной точки Tm.[000537] A large number of deimmunized variants have been identified that retain both CD137 binding activity and thermal stability. Most deimmunized variants containing the I48A substitution of the VH domain exhibited some reduction in both CD137 binding and the Tm start point.

[000538] Способность деиммунизированных hMAB-3 к CD137 (1Е.15) и hMAB-3 к CD137 (1G.15), а также исходного гуманизированного hMAB-3 к CD137 (1В.3) связываться с активированными CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками испытывали по существу, как описано выше. Как показано на Фигурах 32А-32В, кривая связывания деиммунизированного антитела hMAB-3 к CD137 (1Е.15) не изменилась, в то время как hMAB-3 к CD137 (1G.15) проявляло незначительно сниженное связывание как с CD4⁺, так и с CD8⁺ Т-клетками.[000538] Ability of deimmunized hMAB-3 anti-CD137 (1E.15) and hMAB-3 anti-CD137 (1G.15), as well as the original humanized hMAB-3 anti-CD137 (1B.3) to bind to activated CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T -cells were tested essentially as described above. As shown in Figures 32A-32B, the binding curve of the deimmunized anti-CD137 antibody hMAB-3 (1E.15) was unchanged, while the anti-CD137 hMAB-3 (1G.15) exhibited slightly reduced binding to both CD4 ⁺ and with CD8 ⁺ T cells.

[0005391 Агонистическую активность hMAB-3 к CD137 (1Е.15) и hMAB-3 к CD137 (1G.15) в условиях in vitro оценивали в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненном по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ) в отсутствие сшивания или с ним. Ни одно из антител на основе hMAB-3 к CD137 не проявило активность в отсутствие сшивания (Фигура 33А), при этом сшитое hMAB-3 к CD137 (1Е.15) проявляло агонистическую активность, сходную с таковой hMAB-3 к CD137 (1В.3), в то время как hMAB-3 к CD137 (1G.15) проявляло незначительное снижение агонистической активности, вероятно, вследствие сниженного связывания с CD137 (Фигура 33В). Как сообщалось выше, МАВ-1 к CD137 проявляло агонистическую активность в присутствии и в отсутствие сшивания.[0005391 The in vitro agonistic activity of hMAB-3 to CD137 (1E.15) and hMAB-3 to CD137 (1G.15) was assessed in a T cell cytokine release assay (performed essentially as described in Example 2 above and exemplified by the release of IFN-γ) in the absence of cross-linking or with it. None of the hMAB-3 anti-CD137 antibodies were active in the absence of cross-linking (Figure 33A), while cross-linked hMAB-3 anti-CD137 (1E.15) exhibited agonistic activity similar to that of hMAB-3 anti-CD137 (1B. 3), while anti-CD137 hMAB-3 (1G.15) exhibited a slight decrease in agonist activity, likely due to reduced binding to CD137 (Figure 33B). As reported above, anti-CD137 MAB-1 exhibited agonistic activity in the presence and absence of cross-linking.

Пример 11Example 11

Трехвалентные CD137×TA связывающие молекулы, содержащие деиммунизированные CD137-связывающие доменыTrivalent CD137xTA binding molecules containing deimmunized CD137 binding domains

[000540] Как описано выше, домены VH и VL hMAB-3 к CD137 гуманизировали, оптимизировали и деиммунизировали. Примерные биспецифические четырехвалентные и/или трехвалентные CD137×TA связывающие молекулы получали путем включения таких доменов VH и VL. Одну такую биспецифическую трехвалентную связывающую молекулу «TRIDENT-B5», содержащую CD137-связывающие домены hMAB-3 к CD137 (1Е.15), получали и оценивали в ряде анализов. Структура и последовательность этой примерной CD137×TA связывающей молекулы подробно представлена выше. В эти исследования включали TRIDENT-B2 и одну или более контрольных молекул: TRIDENT-1, TRIDENT-2, TRIDENT-3, TRIDENT-4.[000540] As described above, the VH and VL domains of hMAB-3 to CD137 were humanized, optimized, and deimmunized. Exemplary bispecific tetravalent and/or trivalent CD137×TA binding molecules were prepared by incorporating such VH and VL domains. One such bispecific trivalent binding molecule, "TRIDENT-B5", containing the CD137-binding domains of hMAB-3 to CD137 (1E.15), was prepared and evaluated in a number of assays. The structure and sequence of this exemplary CD137xTA binding molecule is detailed above. These studies included TRIDENT-B2 and one or more control molecules: TRIDENT-1, TRIDENT-2, TRIDENT-3, TRIDENT-4.

[000541] Оценивали способность TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 и контрольных молекул TRIDENT-1, TRIDENT-3 и TRIDENT-4 связываться с активированными CD8⁺ Т-клетками и/или 5Т4, присутствующим на поверхности клеток-мишеней (высоко экспрессирующие клетки карциномы молочной железы JIMT-1 и слабо экспрессирующие клетки карциномы яичника SKOV-3), по существу, как описано выше. Как показано на Фигуре 34А, все молекулы, содержащие два CD137-связывающих домена (TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 и контрольные молекулы TRIDENT-1 и TRIDENT-4), проявляли сходное связывание с активированными CD8⁺ Т-клетками, в то время как контрольная молекула, не содержащая CD137-связывающие домены (TRIDENT-3), не связывалась. Аналогичным образом, все молекулы, имеющие 5Т4-связывающий домен (TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 и контрольная TRIDENT-3), проявляли сходное сильное связывание с клетками-мишенями, экспрессирующими высокие уровни 5Т4 (JIMT-1, Фигура 34В), и более слабое связывание к клеткам-мишеням, экспрессирующим низкие уровни 5Т4 (SKOV-3, Фигура 34С), в то время как контрольные молекулы, не содержащие 5Т4-связывающий домен (TRIDENT-1 и TRIDENT-4), не связывались ни с одним типом клеток-мишеней, экспрессирующих 5Т4.[000541] The ability of TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 and the control molecules TRIDENT-1, TRIDENT-3 and TRIDENT-4 to bind to activated CD8 ⁺ T cells and/or 5T4 present on the surface of target cells (highly expressing carcinoma cells) was assessed breast JIMT-1 and weakly expressing ovarian carcinoma cells SKOV-3) essentially as described above. As shown in Figure 34A, all molecules containing two CD137-binding domains (TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 and the control molecules TRIDENT-1 and TRIDENT-4) exhibited similar binding to activated CD8 ⁺ T cells, while a control molecule lacking CD137-binding domains (TRIDENT-3) did not bind. Likewise, all molecules having a 5T4 binding domain (TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 and control TRIDENT-3) exhibited similar strong binding to target cells expressing high levels of 5T4 (JIMT-1, Figure 34B), and more weak binding to target cells expressing low levels of 5T4 (SKOV-3, Figure 34C), while control molecules lacking the 5T4 binding domain (TRIDENT-1 and TRIDENT-4) did not bind to any cell type -targets expressing 5T4.

[000542] Агонистическую активность TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 и контрольных молекул TRIDENT-1, TRIDENT-3 и TRIDENT-4 в условиях in vitro оценивали в анализе высвобождения цитокинов Т-клетками (выполненном по существу, как описано в примере 2 выше, и на примере высвобождения ИФН-γ) в присутствии или в отсутствие клеток-мишеней, экспрессирующих различные уровни примерного ТА, клеток 5Т4 (JIMT-1 (5Т4^hi) или клеток SKOV-3 (5Т4^lo).[000542] The in vitro agonist activity of TRIDENT-B2, TRIDENT-B5 and the control molecules TRIDENT-1, TRIDENT-3 and TRIDENT-4 was assessed in a T cell cytokine release assay (performed essentially as described in Example 2 above, and exemplified by the release of IFN-γ in the presence or absence of target cells expressing varying levels of proximal TA, 5T4 cells (JIMT-1 (5T4 ^hi ) or SKOV-3 cells (5T4 ^lo ).

[000543] Как показано на Фигурах 35А-35С, TRIDENT-1, TRIDENT-4 (не содержащая 5Т4-связывающий домен) не проявляли костимулирующую активность. Также было обнаружено, что TRIDENT-3 (не содержащая CD137-связывающие домены) не обладает какой-либо костимулирующей активностью. TRIDENT-B2 и TRIDENT-B5 проявляли сходную дозозависимую костимулирующую активность в присутствии клеток-мишеней JIMT-1, экспрессирующих высокие уровни 5Т4 (Фигура 35А), но незначительную или отсутствующую костимулирующую активность в присутствии клеток-мишеней SKOV-3, экспрессирующих низкие уровни 5Т4 (Фигура 35В), или в отсутствие клеток-мишеней (Фигура 35С).[000543] As shown in Figures 35A-35C, TRIDENT-1, TRIDENT-4 (lacking the 5T4 binding domain) did not exhibit co-stimulatory activity. It was also found that TRIDENT-3 (which does not contain CD137-binding domains) does not have any co-stimulatory activity. TRIDENT-B2 and TRIDENT-B5 exhibited similar dose-dependent costimulatory activity in the presence of JIMT-1 target cells expressing high levels of 5T4 (Figure 35A), but little or no costimulatory activity in the presence of SKOV-3 target cells expressing low levels of 5T4 ( Figure 35B), or in the absence of target cells (Figure 35C).

[000544] Результаты этих исследований показывают, что CD137×TA связывающие молекулы, содержащие деиммунизированные домены VH и VL hMAB-3 к CD137 (1Е.15), проявляют сопоставимые профили связывания и костимулирующей активности, как и CD137×TA связывающие молекулы, содержащие оптимизированные домены VH и VL hMAB-3 к CD137 (1В.3).[000544] The results of these studies indicate that CD137xTA binding molecules containing deimmunized VH and VL domains of hMAB-3 to CD137 (1E.15) exhibit comparable binding and co-stimulatory activity profiles as CD137xTA binding molecules containing optimized VH and VL domains of hMAB-3 to CD137 (1B.3).

[000545] Все публикации и патенты, упомянутые в этом описании, включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была конкретно и индивидуально указана для полного включения посредством ссылки. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано применительно к его конкретным вариантам реализации, следует понимать, что в него могут быть внесены дополнительные модификации и подразумевается, что настоящая заявка охватывает любые изменения, варианты применения или адаптации настоящего изобретения в целом в соответствии с принципами настоящего изобретения, и включая такие отступления от настоящего изобретения, которые соответствуют известной или обычной практике в области техники, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применены к существенным признакам, изложенным выше в настоящем документе.[000545] All publications and patents mentioned in this specification are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication or patent application had been specifically and individually indicated to be incorporated by reference in its entirety. Although the present invention has been described with respect to specific embodiments thereof, it is understood that further modifications may be made thereto, and it is intended that this application covers any modifications, uses or adaptations of the present invention as a whole in accordance with the principles hereof. invention, and including such departures from the present invention as are consistent with known or customary practice in the field of technology to which the present invention relates and which may be applied to the essential features set forth hereinabove.

Claims

1. HER2/neu-связывающая молекула, содержащая вариабельный домен легкой цепи, который содержит CDR_L1, CDR_L2 и CDR_L3, и вариабельный домен тяжелой цепи, который содержит CDR_H1, CDR_H2 и CDR_H3; при этом:1. A HER2/neu binding molecule comprising a light chain variable domain which contains CDR _L 1, CDR _L 2 and CDR _L 3, and a heavy chain variable domain which contains CDR _H 1, CDR _H 2 and CDR _H 3; wherein:

(A) (1) указанный вариабельный домен легкой цепи содержит CDR_L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:187, CDR_L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:190, и CDR_L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:182; или(A) (1) said light chain variable domain comprises CDR _L 1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:187, CDR _L 2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:190, and CDR _L 3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 182; or

(2) указанный вариабельный домен легкой цепи содержит CDR_L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:188, CDR_L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:191, и CDR_L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:182;(2) said light chain variable domain comprises CDR _L 1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:188, CDR _L 2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:191, and CDR _L 3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:182;

иAnd

(B) указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR_H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:177, CDR_H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:178, и CDR_H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:179.(B) said heavy chain variable domain comprises CDR _H 1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:177, CDR _H 2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:178, and CDR _H 3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:179.

2. HER2/neu-связывающая молекула по п. 1, отличающаяся тем, что указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64).2. The HER2/neu-binding molecule according to claim 1, characterized in that said heavy chain variable domain contains the amino acid sequence VH1 of hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 64).

3. HER2/neu-связывающая молекула по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность:3. HER2/neu-binding molecule according to claim 1 or 2, characterized in that said light chain variable domain contains the amino acid sequence:

(A) VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68); или(A) VL2 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 68); or

(B) VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69).(B) VL3 hMAB-1 to HER2 (SEQ ID NO: 69).

4. HER2/neu-связывающая молекула по п. 3, отличающаяся тем, что 4. HER2/neu-binding molecule according to claim 3, characterized in that

указанный вариабельный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность VH1 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 64); иsaid heavy chain variable domain contains the amino acid sequence of hMAB-1 VH1 to HER2 (SEQ ID NO: 64); And

указанный вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность VL2 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 68).said light chain variable domain contains the amino acid sequence of hMAB-1 anti-HER2 VL2 (SEQ ID NO: 68).

5. HER2/neu-связывающая молекула по п. 3, отличающаяся тем, что 5. HER2/neu-binding molecule according to claim 3, characterized in that

указанный вариабельный домен легкой цепи содержит аминокислотную последовательность VL3 hMAB-1 к HER2 (SEQ ID NO: 69).said light chain variable domain contains the amino acid sequence of hMAB-1 anti-HER2 VL3 (SEQ ID NO: 69).

6. HER2/neu-связывающая молекула по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что указанная молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.6. HER2/neu-binding molecule according to any one of paragraphs. 1-5, characterized in that said molecule is an antibody or an antigen-binding fragment thereof.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая HER2/neu-связывающую молекулу по любому из пп. 1-6 и физиологически приемлемый носитель, для лечения заболевания или состояния, ассоциированного с или характеризующегося экспрессией HER2/Neu.7. Pharmaceutical composition containing a HER2/neu-binding molecule according to any one of paragraphs. 1-6 and a physiologically acceptable carrier, for the treatment of a disease or condition associated with or characterized by the expression of HER2/Neu.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанное состояние, ассоциированное с или характеризующееся экспрессией HER2/neu, представляет собой рак.8. The pharmaceutical composition according to claim 7, characterized in that said condition associated with or characterized by the expression of HER2/neu is cancer.

9. Фармацевтическая композиция по п. 8, отличающаяся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака желудка, глиобластомы, рака почек, рака легких, меланомы, нейробластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, рака предстательной железы, почечно-клеточной карциномы, рабдомиосаркомы и плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN).9. The pharmaceutical composition according to claim 8, characterized in that said cancer is selected from the group consisting of: bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, stomach cancer, glioblastoma, kidney cancer, lung cancer, melanoma, neuroblastoma, ovarian cancer , pancreatic cancer, pharyngeal cancer, prostate cancer, renal cell carcinoma, rhabdomyosarcoma and squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN).

10. Применение HER2/neu-связывающей молекулы по любому из пп. 1-6 или фармацевтической композиции по п. 7 в лечении заболевания или состояния, ассоциированного с или характеризующегося экспрессией HER2/Neu.10. Use of a HER2/neu-binding molecule according to any one of paragraphs. 1-6 or a pharmaceutical composition according to claim 7 in the treatment of a disease or condition associated with or characterized by the expression of HER2/Neu.

11. Применение по п. 10, отличающееся тем, что указанное состояние, ассоциированное с или характеризующееся экспрессией HER2/neu, представляет собой рак.11. Use according to claim 10, characterized in that said condition associated with or characterized by the expression of HER2/neu is cancer.

12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что указанный рак выбран из группы, состоящей из: рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака желудка, глиобластомы, рака почек, рака легких, меланомы, нейробластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, рака предстательной железы, почечно-клеточной карциномы, рабдомиосаркомы и плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN).12. Use according to claim 11, characterized in that said cancer is selected from the group consisting of: bladder cancer, breast cancer, colorectal cancer, stomach cancer, glioblastoma, kidney cancer, lung cancer, melanoma, neuroblastoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, pharyngeal cancer, prostate cancer, renal cell carcinoma, rhabdomyosarcoma and squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN).