RU2796935C1 - Method of production of nutrient media used for cultivation of mold fungi - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method of the production of a nutrient medium for the cultivation of mold fungi is proposed, the method involves the use of potato juice in a liquid state as one of the components, bringing it to a pH value of 5.6±0.2 0.01N with sulfuric acid at 25°C and mixing in a given ratio with crystalline glucose and agar. The resulting mixture was thoroughly mixed, dried for 3.5 h at 105°C, then for 4 h at 60°C in an oven, the dried mass is crushed before passing through a 180 µm sieve.

EFFECT: invention provides expansion of the arsenal of nutrient media for the cultivation of mold fungi using a by-product of potato starch production.

1 cl, 1 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства питательных сред для культивирования, идентификации и подсчета дрожжей и плесневых грибов.The invention relates to the microbiological industry and concerns the production of nutrient media for the cultivation, identification and counting of yeasts and molds.

Культивирование, идентификация и подсчет микроорганизмов является важным технологическим процессом в промышленной и экспериментальной микробиологии. Для культивирования, идентификации и подсчета микроорганизмов (выращивание в искусственных условиях in vitro) необходимы особые субстраты – питательные среды. Подбор питательных сред в соответствии с пищевыми и другими физиологическими потребностями микроорганизма является основой успешного культивирования, обеспечивающего и поддержание активности штаммов, и их качество, что нередко определяет результаты всего исследования. Исходя из вышеизложенного, изыскание новых, экологически чистых и экономически оправданных источников сырья, а также путей повышения его биологической полноценности с целью разработки высококачественных питательных сред, актуальной и своевременной задачей является создание оптимальных условий для жизнедеятельности микроорганизмов.Cultivation, identification and enumeration of microorganisms is an important technological process in industrial and experimental microbiology. For the cultivation, identification and enumeration of microorganisms (cultivation under artificial conditions in vitro), special substrates are needed - nutrient media. The selection of nutrient media in accordance with the nutritional and other physiological needs of the microorganism is the basis for successful cultivation, which ensures both the maintenance of the activity of strains and their quality, which often determines the results of the entire study. Based on the foregoing, the search for new, environmentally friendly and economically justified sources of raw materials, as well as ways to increase its biological usefulness in order to develop high-quality nutrient media, is an urgent and timely task to create optimal conditions for the life of microorganisms.

Проблема создания новых экологически чистых питательных сред из экономически оправданных источников сырья может быть решена в результате использования одного из побочных продуктов производства картофельного крахмала – картофельного сока.The problem of creating new environmentally friendly nutrient media from economically viable sources of raw materials can be solved by using one of the by-products of potato starch production - potato juice.

Картофельный сок содержит сухие вещества (не менее 1,5 %), из которых не менее 22 % составляют белки. Значение рН сока составляет 5,6–6,2. Высокая кислотность клеточного сока обусловлена наличием в клубнях значительного количества органических кислот. Среди них преобладают лимонная, яблочная, щавелевая, пировиноградная, винная, янтарная и некоторые другие кислоты. Особенно много в клубнях лимонной кислоты (до 0,4–0,6%). При исследовании клеточного сока обнаружено не менее 12 свободных аминокислот, среди которых имеются жизненно необходимые: валин, лейцин, метионин, лизин, аргинин.Potato juice contains dry matter (at least 1.5%), of which at least 22% are proteins. The pH value of the juice is 5.6-6.2. The high acidity of the cell sap is due to the presence of a significant amount of organic acids in the tubers. Citric, malic, oxalic, pyruvic, tartaric, succinic and some other acids predominate among them. Especially a lot in the tubers of citric acid (up to 0.4-0.6%). In the study of cell sap, at least 12 free amino acids were found, among which there are vital ones: valine, leucine, methionine, lysine, arginine.

В свежем картофельном соке и мезге содержатся также витамины, такие как С, РР, В₉, каротин, пантотеновая кислота.Fresh potato juice and pulp also contain vitamins such as C, PP, B ₉ , carotene, pantothenic acid.

Широко представлены зольные элементы сока. Около 60% золы приходится на долю оксида калия. В золе сока содержатся практически все микроэлементы. Исследование углеводов клеточного сока показало, что они, в основном, представлены моносахарами: глюкозой, маннозой, фруктозой. Содержание редуцирующих сахаров зависит от сорта, степени зрелости клубней, условий выращивания и хранения (Дышлюк Л.С., Асякина Л.К., Карчин К.В., Зимина М.И. Изучение химического состава и показателей безопасности отходов картофелекрахмального производства. Современные проблемы науки и образования. 2014. №3. Интернет ресурс www. Science-education.ru. Сетевое издание «Современные проблемы науки и образования» ISSN 2070-7428).The ash elements of the juice are widely represented. About 60% of the ash is potassium oxide. The ashes of the juice contain almost all trace elements. The study of cell sap carbohydrates showed that they are mainly represented by monosaccharides: glucose, mannose, fructose. The content of reducing sugars depends on the variety, maturity of tubers, growing and storage conditions (Dyshlyuk L.S., Asyakina L.K., Karchin K.V., Zimina M.I. Study of the chemical composition and safety indicators of potato starch production waste. Modern Problems of Science and Education, 2014, No. 3. Internet resource www.Science-education.ru, online edition "Modern Problems of Science and Education" ISSN 2070-7428).

Известен способ создания питательной основы для микробиологических сред, включающий обработку исходного сырья, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют предварительно подготовленный картофель или различные картофельные отходы, которые подвергают развариванию при избыточном давлении. Проводят двухстадийную обработку амилолитическими ферментами, причем на первой стадии осуществляют разжижение крахмала, а на второй – осахаривание с последующим фильтрованием, упариванием и подкислением органическими кислотами. Патент BY №16895, С1, 2013. Предложенный способ является сложным для практического применения и энергетически затратным, т.к. требует применения ферментов и сгущения продукта в выпарных аппаратах.A known method of creating a nutrient base for microbiological media, including the processing of raw materials, characterized in that the raw materials used are pre-prepared potatoes or various potato waste, which is subjected to boiling under excessive pressure. A two-stage treatment with amylolytic enzymes is carried out, and at the first stage, starch is liquefied, and at the second stage, saccharification is carried out, followed by filtration, evaporation and acidification with organic acids. Patent BY No. 16895, C1, 2013. The proposed method is difficult for practical application and energy-consuming, because requires the use of enzymes and thickening of the product in evaporators.

Другим вариантом использования побочных продуктов переработки картофеля в качестве компонента питательной среды для микробиологических производств является использование картофельного отвара (SU 969717 A1. 1984). Для приготовления отвара 400 г тщательно вымытого, неочищенного, нарезанного кусочками картофеля варят в 1 л воды в течение 20 мин. После фильтрации отвар доводят до 1 л кипяченой водой и используют для приготовления среды. В отваре расплавляют при подогревании 15–20 г агара, среду разливают в колбы и стерилизуют при 1,3 атм. в течение 25–35 мин. Перед использованием для посевов к среде добавляют 12,5–20 мл 40 %-ного стерильного раствора глюкозы. рH среды доводят до показателя 3,7 добавлением 20%-ного водного раствора стерильной лимонной кислоты в количестве 15–20 мл, содержащем 3,5 г сухой лимонной кислоты на 1 л среды. На подготовленную таким образом питательную среду высевают исследуемую микрофлору.Another option for using by-products of potato processing as a component of a nutrient medium for microbiological production is the use of potato broth (SU 969717 A1. 1984). To prepare a decoction, 400 g of thoroughly washed, unpeeled, sliced potatoes are boiled in 1 liter of water for 20 minutes. After filtration, the decoction is brought to 1 liter with boiled water and used to prepare the medium. In the decoction, 15–20 g of agar are melted by heating, the medium is poured into flasks and sterilized at 1.3 atm. within 25–35 minutes. Before use for inoculation, 12.5–20 ml of a 40% sterile glucose solution is added to the medium. The pH of the medium is adjusted to 3.7 by adding a 20% aqueous solution of sterile citric acid in an amount of 15–20 ml, containing 3.5 g of dry citric acid per 1 liter of medium. The studied microflora is sown on the thus prepared nutrient medium.

Картофельный отвар широко применяется в практике создания средств для микробиологических производств (R. E. Beever, E. G. Bollard. The Nature of the Stimulation of Fungal Growth by Potato Extract. The Journal of General and Applied Microbiology. 1970. Vol.60, Iss. 2. https://doi.org/10.1099/00221287-60-2-273).Potato decoction is widely used in the practice of creating funds for microbiological production (R. E. Beever, E. G. Bollard. The Nature of the Stimulation of Fungal Growth by Potato Extract. The Journal of General and Applied Microbiology. 1970. Vol. 60, Iss. 2. https: //doi.org/10.1099/00221287-60-2-273).

Экстракт готовили из 400 г очищенных клубней на литр воды следующим образом: клубни очищали от кожуры, измельчали в трех четвертях конечного количества воды и кипятили при постоянном помешивании в течение 5 минут. Смесь замораживали при температуре –10° в течение ночи и после оттаивания фуговали на центрифуге. Фильтрат хранили в пластиковых бутылках при температуре –10°. При необходимости порции размораживали и фильтровали, чтобы получить слегка опалесцирующий экстракт. Были изучены различные составы сред с использованием картофельного отвара.The extract was prepared from 400 g of peeled tubers per liter of water as follows: the tubers were peeled, crushed in three quarters of the final amount of water and boiled with constant stirring for 5 minutes. The mixture was frozen at a temperature of –10°C overnight and, after thawing, was ground in a centrifuge. The filtrate was stored in plastic bottles at –10°C. If necessary, portions were thawed and filtered to obtain a slightly opalescent extract. Various media compositions were studied using potato broth.

Недостатком метода применения картофельного отвара является необходимость варки картофеля и его реализации. Кроме того, определенные технические сложности представляет процесс замораживания картофельного отвара.The disadvantage of the method of using potato broth is the need for boiling potatoes and its implementation. In addition, the process of freezing potato broth presents certain technical difficulties.

Проблема заключается в оптимизации процесса производства питательной среды.The problem lies in optimizing the culture medium production process.

Проблема решается заменой картофельного отвара на побочный продукт картофелекрахмального производства – картофельный сок, в составе которого значительно больше питательных веществ, способствующих метаболизму исследуемых микроорганизмов.The problem is solved by replacing potato broth with a by-product of potato starch production - potato juice, which contains much more nutrients that promote the metabolism of the studied microorganisms.

Способ осуществляют следующим образом. Картофельный сок доводят до pH 5,6±0,2 при 25°C, и в сухом или жидком состоянии тщательно смешивают с агаром и кристаллической глюкозой в соотношении 0,5-15 кг сухих веществ картофельного сока: 2-50 кг кристаллической глюкозы : 5-45 кг агара, предпочтительнее из расчета: 8 частей сухих веществ картофельного сока с кристаллической глюкозой : 5 частей агара. Полученную смесь высушивают при температуре 25–150°C. При применении сухого картофельного сока, проводят только смешивание в заданной пропорции.The method is carried out as follows. Potato juice is adjusted to pH 5.6 ± 0.2 at 25°C, and in a dry or liquid state, thoroughly mixed with agar and crystalline glucose in the ratio of 0.5-15 kg of potato juice solids: 2-50 kg of crystalline glucose: 5-45 kg of agar, preferably at the rate of: 8 parts of potato juice solids with crystalline glucose : 5 parts of agar. The resulting mixture is dried at a temperature of 25–150°C. When using dry potato juice , only mixing is carried out in a given proportion.

Пример 1. Питательная среда для культивирования, идентификации и подсчета дрожжей и плесневых грибов.Example 1 Nutrient medium for cultivation, identification and enumeration of yeasts and moulds.

Картофельный сок с содержанием сухих веществ 6,3% доводят до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивают с агаром в соотношении 200 мл картофельного сока: 47,25 г агара. Тщательно перемешивают для равномерного распределения картофельного сока по массе агара. Полученную смесь высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу. Высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм. В полученную измельченную массу добавляют кристаллическую глюкозу массой 63 г и тщательно перемешивают. Влажность готового продукта составила 12,9%.Potato juice with a solids content of 6.3% is adjusted to pH 5.6±0.2 with 0.01N sulfuric acid at 25°C and mixed with agar in the ratio of 200 ml of potato juice: 47.25 g of agar. Thoroughly mix for uniform distribution of potato juice over the mass of agar. The resulting mixture is dried for 3.5 hours at 105°C, then 4 hours at 60°C in an oven. The dried mass is crushed before passing through the meshes of a sieve with holes of 180 microns. Crystalline glucose weighing 63 g is added to the resulting crushed mass and mixed thoroughly. The moisture content of the finished product was 12.9%.

Пример 2. Питательная среда для культивирования, идентификации и подсчета дрожжей и плесневых грибов.Example 2 Nutrient medium for cultivation, identification and enumeration of yeasts and moulds.

Картофельный сок с содержанием сухих веществ 6,3% доводят до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивают с глюкозой и агаром в соотношении 300 мл картофельного сока : 94,50 г глюкозы : 70,88 г агара. Полученную массу тщательно перемешивают и высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу. Смесь периодически перемешивают во избежание карамелизации. Высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм. Получен порошкообразный продукт влажностью 11,6%.Potato juice with a solids content of 6.3% is adjusted to pH 5.6±0.2 with 0.01 N sulfuric acid at 25°C and mixed with glucose and agar in the ratio of 300 ml of potato juice : 94.50 g glucose : 70 .88 g agar. The resulting mass is thoroughly mixed and dried for 3.5 hours at 105°C, then 4 hours at 60°C in an oven. The mixture is stirred periodically to avoid caramelization. The dried mass is crushed before passing through the meshes of a sieve with holes of 180 microns. A powdered product with a moisture content of 11.6% was obtained.

Проведены исследования по апробации питательных сред, полученных по описаниям примеров 1 и 2 в сравнении с питательной средой из картофельного отвара (КСА), приготовленной вручную, и средой PDA. 200 г неочищенного картофеля, порезанного кусочками кипятили в 1000 мл воды 20 минут, затем фильтровали и добавляли 10 г сахарозы и питательной среды PDA (Sigma, USA), в которой в качестве компонента используется картофельный отвар. Результаты исследований показаны на фигуре.Studies were conducted to test the nutrient media obtained according to the descriptions of examples 1 and 2 in comparison with a nutrient medium from potato broth (KSA), prepared by hand, and PDA medium. 200 g of unpeeled potatoes, cut into pieces, were boiled in 1000 ml of water for 20 minutes, then filtered and 10 g of sucrose and PDA nutrient medium (Sigma, USA) were added, in which potato broth was used as a component. The research results are shown in the figure.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что применение картофельного сока в качестве одного из компонентов питательной среды вместо картофельного отвара позволяет улучшить ее качество.Based on the results obtained, it can be concluded that the use of potato juice as one of the components of the nutrient medium instead of potato broth improves its quality.

Пример 3. Питательная среда для культивирования дрожжей и плесневых грибов.Example 3. Nutrient medium for cultivation of yeasts and molds.

Питательная среда для культивирования дрожжей и плесневых грибов создается для выращивания биомассы микрофлоры в ферментерах.Nutrient medium for the cultivation of yeasts and molds is created for growing the biomass of microflora in fermenters.

Картофельный сок сгущают под разряжением 0,01–0,03 мПа в выпарном аппарате до концентрации 8,0 % СВ. В горячий картофельный сок вводят кристаллическую глюкозу из расчета 1 часть сухих веществ картофельного сока: 5 частей кристаллической глюкозы. Полученную жидкость охлаждают до 25 °C и доводят рН до значения 5,1±0,2 0,01N серной кислотой.Potato juice is thickened under a vacuum of 0.01–0.03 MPa in an evaporator to a concentration of 8.0% dry matter. Crystalline glucose is added to hot potato juice at the rate of 1 part of potato juice solids: 5 parts of crystalline glucose. The resulting liquid is cooled to 25 °C and the pH is adjusted to 5.1 ± 0.2 with 0.01 N sulfuric acid.

Claims (1)

Способ производства питательной среды, применяемой для культивирования плесневых грибов, предусматривающий использование в качестве одного из компонентов картофельного сока – побочного продукта производства картофельного крахмала в жидком состоянии, доведении его до значения рН 5,6±0,2 0,01N серной кислотой при 25°C и смешивании в соотношении: 0,5–15 кг сухих веществ картофельного сока : 2–50 кг кристаллической глюкозы : 5–45 кг агара; полученную смесь тщательно перемешивают, высушивают 3,5 ч при 105°C, затем 4 ч при 60°C в сушильном шкафу, высушенную массу измельчают до прохождения через ячейки сита с отверстиями 180 мкм.A method for the production of a nutrient medium used for the cultivation of mold fungi, involving the use of potato juice as one of the components - a by-product of the production of potato starch in a liquid state, bringing it to a pH value of 5.6 ± 0.2 with 0.01N sulfuric acid at 25 ° C and mixing in the ratio: 0.5–15 kg of solids of potato juice: 2–50 kg of crystalline glucose: 5–45 kg of agar; the resulting mixture is thoroughly mixed, dried for 3.5 h at 105°C, then 4 h at 60°C in an oven, the dried mass is crushed before passing through sieve cells with openings of 180 μm.

Images