RU2795707C1 - TRANSFORMANT OGATAEA HAGLERORUM AS A PRODUCER OF THERMOSTABLE α-AMYLASE - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: transformant of the yeast Ogataea haglerorum, producing a thermostable α-amylase and containing an optimized synthetic gene in the chromosome, the nucleotide sequence of which is shown in the sequence listing under the number SEQ ID NO:1. The Ogataea haglerorum RNCIM Y-4980 strain, resistant to geneticin, and the strain Ogataea haglerorum RNCIM Y-5018, sensitive to geneticin, which are producers of thermostable α-amylase.

EFFECT: expansion of the arsenal of yeast recombinant microorganisms that produce α-amylase.

3 cl, 5 dwg, 1 tbl, 6 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и касается получения трансформанта дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующего термостабильную α-амилазу и содержащего в составе хромосомной ДНК экспрессионную кассету, в состав которой входит синтетическая последовательность гена с оптимизированными для метилотрофных дрожжей кодонами, кодирующая целевой фермент.The invention relates to the field of biotechnology and genetic engineering and concerns the production of a transformant of the yeast Ogataea haglerorum that produces a thermostable α-amylase and contains an expression cassette in the chromosomal DNA, which includes a synthetic gene sequence with codons optimized for methylotrophic yeast, encoding the target enzyme.

Уровень техникиState of the art

α-Амилаза (α-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, Е.С.3.2.1.1) - эндо-фермент, гидролизующий α-1,4-гликозидные связи в молекуле крахмала и таким образом разлагающий амилозную компоненту крахмала.α-Amylase (α-1,4-glucan-4-glucanohydrolase, E.C.3.2.1.1) is an endo-enzyme that hydrolyzes α-1,4-glycosidic bonds in the starch molecule and thus decomposes the amylose component of starch.

α-Амилаза - один из лидеров мирового рынка ферментов, на долю которого приходится 25-30% рынка [Biotechnol Appl Biochem., 2021, 1-10. DOI: 10.1002/bab.2140].α-Amylase is one of the leaders in the global enzyme market, accounting for 25-30% of the market [Biotechnol Appl Biochem., 2021, 1-10. DOI: 10.1002/bab.2140].

Источником генов, кодирующих α-амилазы. являются растения, животные и микроорганизмы, однако доминирующим источником α-амилаз для промышленного применения являются бактерии и грибы [Process Biochem., 2003, 38, 1599-1616. https://doi.org/10.1016/S0032-9592(03)00053-α-Амилаза используется в пищевой промышленности для разжижения крахмалсодержащего растительного сырья с целью получения глюкозо-фруктозных сиропов. Ферментативная конверсия крахмала включает 3 стадии: желатинизации, разжижения и осахаривания. Первые две стадии протекают при высокой температуре: желатинизацию крахмальных гранул проводят при температуре 105-110°С и рН 5,8-6,5 в течение 5 мин, а разжижение крахмала осуществляют при температуре 95°С в течение 2-3 ч, поэтому требуются термостабильные α-амилазы, которые имеют температурный оптимум около 90°С [Appl Biochem Biotechnol., 2010, 160 (8), 2401-2414. DOI: 10.1007/s12010-009-8735-4].Source of genes encoding α-amylases. are plants, animals and microorganisms, but the dominant source of α-amylases for industrial use are bacteria and fungi [Process Biochem., 2003, 38, 1599-1616. https://doi.org/10.1016/S0032-9592(03)00053-α-amylase is used in the food industry to liquefy starch-containing vegetable raw materials in order to obtain glucose-fructose syrups. Enzymatic conversion of starch includes 3 stages: gelatinization, liquefaction and saccharification. The first two stages proceed at a high temperature: gelatinization of starch granules is carried out at a temperature of 105-110°C and pH 5.8-6.5 for 5 minutes, and starch is liquefied at a temperature of 95°C for 2-3 hours, therefore thermostable α-amylases are required, which have a temperature optimum of about 90°C [Appl Biochem Biotechnol., 2010, 160 (8), 2401-2414. DOI: 10.1007/s12010-009-8735-4].

Другое важное применение α-амилазы - текстильная промышленность, где ее используют для расшлихтовки тканей. Этот процесс протекает при высокой температуре (80°С) непродолжительное время (10 мин), и в нем используют термостабильные α-амилазы [WO 99/35325].Another important use of α-amylase is in the textile industry, where it is used to desize fabrics. This process takes place at high temperature (80° C.) for a short time (10 min) and uses thermostable α-amylases [WO 99/35325].

Также α-амилазы применяются в моющих средствах, в бумажной и спиртовой промышленности [Process Biochem., 2003, 38, 1599 - 1616. https://doi.org/10.1016/S0032-9592(03)00053-01.Also, α-amylases are used in detergents, in the paper and alcohol industries [Process Biochem., 2003, 38, 1599 - 1616. https://doi.org/10.1016/S0032-9592(03)00053-01.

Максимально требованиям промышленного процесса гидролиза крахмала соответствуют α-амилазы из различных видов Bacillus [US2012252101; СА2798504; US2012282672; Int J Biol Macromol., 2010, 47(2), 288-91. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2010.04.006].The maximum requirements of the industrial starch hydrolysis process correspond to α-amylases from various Bacillus species [US2012252101; CA2798504; US2012282672; Int J Biol Macromol., 2010, 47(2), 288-91. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2010.04.006].

Термостабильные α-амилазы из В. licheniformis, В. amiloliquefaciens и В. stearothermophilus и их мутантные варианты, имеющие высокую гомологию аминокислотных последовательностей (не менее 79%) и являющиеся индустриально важными, относят к классу Termamyl-like α-амилаз [WO 99/23211, US20030170769 А1]. Среди них α-амилаза из В. licheniformis отличается исключительной температурной стабильностью (более 80%) активности остается после прогрева при температуре 90°С в течение 30 мин, оптимальная температура активности - 80-85°С) и низкой потребностью в ионах кальция [J. of Biological Chemistry, 1989, 264(32), 18933-18938], далее следует α-амилаза из В. stearothermophilus (остаточная активность 60% после прогрева при 80°С в течение 60 мин [Applied and Environmental Microbiology, 1983, 46(5), 1059-1065], в то время как α-амилаза из В. amiloliquefaciens быстро инактивируется при 90°С (время полужизни при 90°С почти в 100 раз ниже, чем у α-амилазы из В. licheniformis), но обладает более высокой удельной активностью, чем α-амилаза из В. licheniformis [J. of Biological Chemistry, 1989, 264(32), 18933-18938; Can. J. Microbiol., 2004, 50, 1-17. doi: 10.1139/W03-076].Thermostable α-amylases from B. licheniformis, B. amiloliquefaciens and B. stearothermophilus and their mutant variants, which have high amino acid sequence homology (at least 79%) and are industrially important, belong to the class Termamyl-like α-amylases [WO 99/ 23211, US20030170769 A1]. Among them, α-amylase from B. licheniformis is distinguished by exceptional temperature stability (more than 80%) of activity remains after heating at a temperature of 90 ° C for 30 minutes, the optimum activity temperature is 80-85 ° C) and a low need for calcium ions [J . of Biological Chemistry, 1989, 264(32), 18933-18938], followed by α-amylase from B. stearothermophilus (60% residual activity after heating at 80°C for 60 min [Applied and Environmental Microbiology, 1983, 46( 5), 1059-1065], while α-amylase from B. amiloliquefaciens is rapidly inactivated at 90°C (half-life at 90°C is almost 100 times lower than that of α-amylase from B. licheniformis), but has a higher specific activity than α-amylase from B. licheniformis [J. of Biological Chemistry, 1989, 264(32), 18933-18938; Can. J. Microbiol., 2004, 50, 1-17. doi: 10.1139 /W03-076].

В источниках известности описаны продуценты термостабильной α-амилазы на основе метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii (Pichia pastoris), которые являются широко используемым модельным организмом для экспрессии гетерологичных генов под контролем сильного регулируемого метанолом промотора гена АОХ1.Sources of fame describe producers of thermostable α-amylase based on the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris), which is a widely used model organism for the expression of heterologous genes under the control of a strong methanol-regulated promoter of the AOX1 gene.

Описан трансформант P. pastoris GS115, содержащий ген с оптимизированными для дрожжей P. pastoris кодонами (BlAmy-opt), кодирующий природную α-амилазу В. licheniformis (GenBank М38570). Трансформант при культивировании в колбах в богатой среде продуцирует α-амилазу с активностью 420 ед./мл КЖ через 144 ч культивирования при 30°С [BioMed Research International, 2015, Article ID 248680, 9 P. http://dx.doi.org/10.1155/2015/248680].A P. pastoris GS115 transformant containing a gene with P. pastoris yeast-optimized codons (BlAmy-opt) encoding natural B. licheniformis α-amylase (GenBank M38570) is described. The transformant, when cultivated in flasks in a rich medium, produces α-amylase with an activity of 420 U/ml QOL after 144 hours of cultivation at 30°C [BioMed Research International, 2015, Article ID 248680, 9 P. http://dx.doi. org/10.1155/2015/248680].

Описан трансформант P. pastoris GS115, содержащий ген с предпочтительными для дрожжей P. pastoris кодонами (Pic-bla), кодирующий α-амилазу из В. licheniformis WX-02 (NCBI Reference Sequence: СР012110.1). Трансформант при культивировании в колбах в богатой среде продуцирует α-амилазу с активностью 900 ед./мл КЖ через 168 ч культивирования при 28°С [3 Biotech, 2019, 9, 427. https://doi.org/10.1007/s13205-019-1943-x].A P. pastoris GS115 transformant containing a gene with P. pastoris yeast-preferred codons (Pic-bla) encoding α-amylase from B. licheniformis WX-02 is described (NCBI Reference Sequence: СР012110.1). The transformant, when cultivated in flasks in a rich medium, produces α-amylase with an activity of 900 units/ml QOL after 168 hours of cultivation at 28°C [3 Biotech, 2019, 9, 427. https://doi.org/10.1007/s13205- 019-1943-x].

Еще одной известной метилотрофной системой для гетерологичной экспрессии являются термотолерантные дрожжи Ogataea (Hansenula). Дрожжи рода Ogataea, как и дрожжи P. pastoris, обладают уникальной организацией и регуляцией метаболизма в присутствии метанола благодаря наличию сильных промоторов, индуцируемых метанолом. Подобно Р. pastoris, дрожжи рода Ogataea сочетают преимущества простоты выращивания на недорогой ростовой среде с высокой секретирующей способностью, а также при культивировании в биореакторе позволяют получать биомассу с высокой плотностью клеток, что способствует высокому выходу целевого продукта [FEMS Yeast Res., 2005, 5, 1079-1096; Microb. Cell Fact, 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148. DOI 10.1007/s00284-014-0568-x; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052. doi: 10.1093/femsle/fnz052].Another known methylotrophic system for heterologous expression is the thermotolerant yeast Ogataea (Hansenula). Yeast of the genus Ogataea, like the yeast P. pastoris, has a unique organization and regulation of metabolism in the presence of methanol due to the presence of strong promoters induced by methanol. Like P. pastoris, yeasts of the genus Ogataea combine the advantages of being easy to grow on an inexpensive growth medium with a high secretion ability, and when grown in a bioreactor, they allow obtaining biomass with a high cell density, which contributes to a high yield of the target product [FEMS Yeast Res., 2005, 5 , 1079-1096; Microb. Cell Fact, 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148. DOI 10.1007/s00284-014-0568-x; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052. doi:10.1093/femsle/fnz052].

В отличие от P. pastoris дрожжи рода Ogataea являются термотолерантными, что позволяет проводить ферментацию при температуре 37°С. Повышение температуры процесса ферментации снижает контаминацию и затраты на охлаждение биореактора [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] и в результате сокращает длительность ферментации.Unlike P. pastoris, yeasts of the genus Ogataea are thermotolerant, which allows fermentation at a temperature of 37°C. Increasing the temperature of the fermentation process reduces contamination and the cost of cooling the bioreactor [Appl. microbiol. Biotechnol., 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] and as a result shortens the fermentation time.

Для дрожжей О. haglerorum разработаны генетические технологии конструирования штаммов-продуцентов, включая экспрессионные вектора и метод введения ДНК в клетки реципиента [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56]. Дрожжи О. haglerorum использовали для получения продуцентов α-маннаназы из В. subtilis, фитазы из Е. coli [RU2747782, RU2764793, RU2771079].For the yeast O. haglerorum, genetic technologies have been developed for constructing producer strains, including expression vectors and a method for introducing DNA into recipient cells [Biotechnology, 2019, 35 (6), 51-56]. Yeast O. haglerorum was used to obtain producers of α-mannanase from B. subtilis, phytase from E. coli [RU2747782, RU2764793, RU2771079].

В настоящее время для достижения свойств фермента, требуемых для ферментативного гидролиза крахмала, включающих высокую термостабильность и удельную активность, и низкую зависимость от ионов кальция используют гибридные белки (химеры), в частности, полученные путем объединения последовательностей ДНК, кодирующих α-амилазы из различных бацилл как дикого типа, так и мутантных [ЕР 0252666, WO 97/41213, WO 99/46399, WO 99/23211, US 2010144575, US 2012208251].Currently, to achieve the properties of the enzyme required for the enzymatic hydrolysis of starch, including high thermal stability and specific activity, and low dependence on calcium ions, hybrid proteins (chimeras) are used, in particular, obtained by combining DNA sequences encoding α-amylases from various bacilli both wild-type and mutant [EP 0252666, WO 97/41213, WO 99/46399, WO 99/23211, US 2010144575, US 2012208251].

В качестве реципиентов для продукции α-амилазы для промышленного применения используют В. licheniformis, В. amyloliquefaciens, В. subtilis, В. stearothermophilus [Biotechnol Appl Biochem. 2021; 1-10. DOI: 10.1002/bab.2140].B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. stearothermophilus [Biotechnol Appl Biochem. 2021; 1-10. DOI: 10.1002/bab.2140].

В работе [WO 99/46399] описана гибридная α-амилаза типа Termamyl, зрелый пептид которой состоит с N-конца из аминокислотных остатков от α-амилазы из В. amyloliquefaciens, а с 36-ой аминокислоты из аминокислотных остатков от α-амилазы из В. licheniformis с заменами H156Y, А181Т, N190F, A209V Q264S.[WO 99/46399] describes a hybrid Termamyl-type α-amylase, the mature peptide of which consists of amino acid residues from the α-amylase from B. B. licheniformis with substitutions H156Y, A181T, N190F, A209V Q264S.

Большим преимуществом дрожжей по сравнению с бациллярными продуцентами является то, что в них преимущественно секретируются рекомбинантные белки и мало собственных секреторных белков.The great advantage of yeast over bacillary producers is that they predominantly secrete recombinant proteins and few of their own secretory proteins.

Однако известно, что процесс экспрессии гетерологичных генов и биосинтез белка достаточно избирателен и зависит от видовой принадлежности штамма-реципиента [Applied and Environmental Microbiology, 1983, 46(5), 1059-1065] и уж тем более результат экспрессии невозможно предсказать при выборе штамма-продуцента из другого царства микроорганизмов.However, it is known that the process of expression of heterologous genes and protein biosynthesis is quite selective and depends on the species of the recipient strain [Applied and Environmental Microbiology, 1983, 46(5), 1059-1065], and even more so, the result of expression cannot be predicted when choosing a strain- producer from another kingdom of microorganisms.

Работ по экспрессии химерных генов α-амилаз в дрожжах нами не выявлено.We have not found any works on the expression of chimeric α-amylase genes in yeast.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является совершенствование методик конструирования дрожжевых штаммов-продуцентов термостабильной α-амилазы.The technical problem to be solved by the claimed invention is the improvement of methods for constructing yeast strains producing thermostable α-amylase.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение арсенала дрожжевых рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих α-амилазу.The technical result of the claimed invention is the expansion of the arsenal of yeast recombinant microorganisms producing α-amylase.

Технический результат достигается путем получения трансформанта дрожжей Ogataea haglerorum продуцирующего и секретирующего в культуральную жидкость термостабильную α-амилазу, содержащего в составе хромосомы оптимизированный синтетический ген, кодирующий указанную α-амилазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.The technical result is achieved by obtaining a transformant of the yeast Ogataea haglerorum that produces and secretes a thermostable α-amylase into the culture liquid, containing an optimized synthetic gene encoding the specified α-amylase in the chromosome, the nucleotide sequence of which is shown in the sequence listing under the number SEQ ID NO:1.

Указанная последовательность синтезирована на основе последовательности, описанной в [WO 99/46399], путем оптимизации кодонов для метилотрофных дрожжей О. haglerorum.This sequence was synthesized based on the sequence described in [WO 99/46399] by codon optimization for the methylotrophic yeast O. haglerorum .

Оптимизацию нуклеотидной последовательности для гена, кодирующего гибридную α-амилазу типа Termamyl, осуществляют на основании данных о частоте встречаемости кодонов (http://www.kazusa.or.jp/codon/P.html). Полученная последовательность (далее AMYsyni), размером 1467 п. н. приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Последовательность синтезирована в компании Twist (https://www.twistbioscience.com/) по заказу НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика.Optimization of the nucleotide sequence for the gene encoding the hybrid α-amylase of the Termamyl type is carried out on the basis of codon frequency data (http://www.kazusa.or.jp/codon/P.html). The resulting sequence (hereinafter AMYsyni), 1467 bp in size. shown in the sequence listing under the number SEQ ID NO:1. The sequence was synthesized at the Twist company (https://www.twistbioscience.com/) by order of the National Research Center "Kurchatov Institute" - State Research Institute of Genetics.

Краткое описание чертежейBrief description of the drawings

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.The invention is illustrated by the following figures.

Фиг. 1 - Экспрессионная кассета.Fig. 1 - Expression cassette.

Фиг. 2 - Относительная активность α-амилазы при разных значениях рН.Fig. 2 - Relative activity of α-amylase at different pH values.

Фиг. 3 - Относительная активность α-амилазы при различных значениях температуры.Fig. 3 - Relative activity of α-amylase at various temperatures.

Фиг. 4 - Остаточная активность α-амилазы после прогревания КЖ с ферментом при температурах 80-100°С в течение 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут.Fig. 4 - Residual activity of α-amylase after heating the QOL with the enzyme at temperatures of 80-100°C for 5, 10, 15, 20, 30 and 60 minutes.

Фиг. 5 - SDS-PAGE электрофорез рекомбинантной α-амилазы, где:Fig. 5 - SDS-PAGE electrophoresis of recombinant α-amylase, where:

М - маркер молекулярного веса (кДа)M - molecular weight marker (kDa)

1 - Бесклеточная КЖ, полученная после культивирования штамма О. haglerorum N388;1 - Cell-free QOL obtained after cultivation of the strain O. haglerorum N388;

2 - Бесклеточная КЖ, обработанная ферментом EndoH;2 - Cell-free QOL treated with EndoH enzyme;

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Получение заявляемого трансформанта включает:Obtaining the claimed transformant includes:

- трансформацию в клетки дрожжей Ogataea haglerorum экспрессионной кассеты, содержащей- transformation into yeast cells Ogataea haglerorum of an expression cassette containing

- синтетический ген, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID N0:1, названный AMYsynt и кодирующий термостабильную α-амилазу,- a synthetic gene, the nucleotide sequence of which is given in the sequence listing under the number SEQ ID N0:1, called AMYsynt and encoding a thermostable α-amylase,

- промотор, работающий в дрожжах Ogataea (Hansenula),- a promoter active in the yeast Ogataea (Hansenula),

- сигнальный пептид для осуществления секреции фермента в культуральную жидкость,- a signal peptide for the secretion of the enzyme into the culture fluid,

- терминатор,- Terminator,

- маркерный ген с регуляторными элементами, HARS и, предпочтительно,- marker gene with regulatory elements, HARS and, preferably,

- сайт для гомологичной интеграции в хромосомную ДНК.- site for homologous integration into chromosomal DNA.

Процесс трансформации экспрессионной кассеты в клетки дрожжей Ogataea (Hansenula) осуществляют, в частности, методом электоропорации [Yeast Metabolic Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2014, 1152, Chapter 3, 43-62. DOI 10.1007/978-1-4939-0563-8_3] или методом с использованием ацетата лития [Curr. Genet. 1990, 18, 169-170. https://doi.org/10.1007/BF003126061, а интеграцию экспрессионной кассеты осуществляют путем гомологичной или негомологичной рекомбинации;The process of transformation of the expression cassette into cells of the yeast Ogataea (Hansenula) is carried out, in particular, by the method of electroporation [Yeast Metabolic Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, 2014, 1152, Chapter 3, 43-62. DOI 10.1007/978-1-4939-0563-8_3] or the lithium acetate method [Curr. Genet. 1990, 18, 169-170. https://doi.org/10.1007/BF003126061, and integration of the expression cassette is carried out by homologous or non-homologous recombination;

Получают трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент термостабильной α-амилазы.Yeast transformant Ogataea haglerorum is obtained - a producer of thermostable α-amylase.

Для повышения продуктивности полученного трансформанта проводят:To increase the productivity of the obtained transformant, the following is carried out:

- удаление селективного маркера, обеспечивающего устойчивость дрожжей к генетицину (G418), за счет индукции рекомбинации по lox-сайтам в присутствии cre-рекомбиназы;- removal of a selective marker that provides yeast resistance to geneticin (G418) due to the induction of recombination at lox sites in the presence of cre-recombinase;

- увеличение числа копий экспрессионной кассеты в хромосомной ДНК трансформанта О. haglerorum путем повторной трансформации кассетой;- increase in the number of copies of the expression cassette in the chromosomal DNA of the O. haglerorum transformant by re-transformation with the cassette;

- анализ полученных трансформантов на способность секретировать активную α-амилазу в культуральную жидкость в процессе ферментации.- analysis of the obtained transformants for the ability to secrete active α-amylase into the culture liquid during fermentation.

Осуществляют отбор наиболее продуктивного штамма Ogataea haglerorum N388, из которого затем за счет рекомбинации по lox-сайтам в присутствии сrе-рекомбиназы получают безмаркерный штамм Ogataea haglerorum N404.The most productive strain of Ogataea haglerorum N388 is selected, from which a marker-free strain of Ogataea haglerorum N404 is then obtained by recombination at lox sites in the presence of cre-recombinase.

Конструирование экспрессионной кассеты осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами рода Ogataea (Hansenula). В качестве промоторов могут быть использованы, например, МОХ, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, РМА1, АОХ, MAL, АМО, TEF1, РЕХ14, РЕХ11 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148. DOI 10.1007/s00284-014-0568-x; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, fny238, 6 p.doi: 10.1093/femsle/fny238; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x].The construction of the expression cassette is carried out by standard methods of genetic engineering [Sambrook J., Maniatis T., Fritsch E. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] using genetic elements suitable for working with yeasts of the genus Ogataea (Hansenula). As promoters, for example, MOX, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, PMA1, AOX, MAL, AMO, TEF1, PEX14, PEX11 can be used [FEMS Yeast Research, 2005 , 5, 1079-1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148. DOI 10.1007/s00284-014-0568-x; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, fny238, 6 p.doi: 10.1093/femsle/fny238; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x].

В качестве сигнальных пептидов используют, например, лидерную последовательность PHO1, пре-про-лидерную последовательность MFα из Saccharomyces cerevisiae или Ogataea thermomethanolica, GAM1 из Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148. DOI 10.1007/s00284-014-0568-x; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178(4), 710-724. doi: 10.1007/s12010-015-1904-8].As signal peptides, for example, PHO1 leader sequence, MFα pre-proleader sequence from Saccharomyces cerevisiae or Ogataea thermomethanolica, GAM1 from Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148. DOI 10.1007/s00284-014-0568-x; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178(4), 710-724. doi: 10.1007/s12010-015-1904-8].

В качестве терминаторов транскрипции используют, например, последовательности генов МОХ, AMO1, РН05, АОХ1 [Appl. Microbiol. Biotechnol, 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193. doi:10.1016/S1567-1356(03)00148-X; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184. doi: 10.1016/S1567-1356(03)00150-8].As transcription terminators, for example, the sequences of the MOX, AMO1, PH05, AOX1 genes are used [Appl. microbiol. Biotechnol, 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193. doi:10.1016/S1567-1356(03)00148-X; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184. doi: 10.1016/S1567-1356(03)00150-8].

В качестве селективных маркеров используют, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, или генетицину (G418), или гигромицину В, или норзеотрицину, или бластицидину, а также гены, комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме дрожжей рода Ogataea, такие как LEU2, HIS3, TRP3, ADE2, URA3, МЕТ6, ADE11 [FEMS Yeast Res, 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x; Yeast, 1995, 11,343-353].As selectable markers, for example, genes of resistance to antibiotics zeocin, or geneticin (G418), or hygromycin B, or norseothricin, or blasticidin, as well as genes complementing auxotrophic mutations in the genome of the yeast of the genus Ogataea, such as LEU2, HIS3, TRP3 are used. , ADE2, URA3, MET6, ADE11 [FEMS Yeast Res, 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x; Yeast, 1995, 11,343-353].

В качестве последовательностей, обеспечивающих эффективную трансформацию и автономную репликацию, используют, например, HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gen Genet. 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178 (15), 4420-4428].As sequences that provide efficient transformation and autonomous replication, use, for example, HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gene Genet. 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178(15), 4420-4428].

В качестве сайтов для гомологичной интеграции используют, например, последовательности генов МОХ, TRP, URA3, LEU2, GAP, кластер генов для рибосомальной ДНК, HARS, АМО, TEF1 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193. doi:10.1016/S1567-1356(03)00148-X; FEMS Yeast Res, 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей рода Ogataea.As sites for homologous integration, for example, MOX, TRP, URA3, LEU2, GAP, gene cluster for ribosomal DNA, HARS, AMO, TEF1 gene sequences are used [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096. doi:10.1016/j.femsyr.2005.06.004; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193. doi:10.1016/S1567-1356(03)00148-X; FEMS Yeast Res, 2012, 12, 271-278. DOI: 10.1111/j.1567-1364.2011.00772.x] or other sequences homologous to regions of the yeast chromosome of the genus Ogataea.

Поставленная задача решена также тем, что получен штамм О. haglerorum N388 ВКПМ Y-4980 - продуцент термостабильной α-амилазы, устойчивый к генетицину (G418).The problem was also solved by the fact that the obtained strain O. haglerorum N388 VKPM Y-4980 is a producer of thermostable α-amylase, resistant to geneticin (G418).

Поставленная задача решена также тем, что получен штамм О. haglerorum N404 - ВКПМ Y-5018 - продуцент термостабильной α-амилазы, чувствительный к генетицину (G418).The problem was also solved by the fact that the obtained strain O. haglerorum N404 - VKPM Y-5018 - producer of thermostable α-amylase, sensitive to geneticin (G418).

В источниках известности не описаны дрожжи вида О. haglerorum, продуцирующие рекомбинантную α-амилазу. Их способность продуцировать и секретировать фермент термостабильную α-амилазу впервые показана нами.In the sources of fame, the yeast of the species O. haglerorum is not described, producing recombinant α-amylase. Their ability to produce and secrete the thermostable α-amylase enzyme was shown by us for the first time.

Пример 1. Получение трансформанта дрожжей Ogataea haglerorum - продуцента термостабильной α-амилазыExample 1. Obtaining a transformant of the yeast Ogataea haglerorum - a producer of thermostable α-amylase

Трансформант дрожжей О. haglerorum получают путем введения в штамм-реципиент О. haglerorum ВКПМ Y-2584 [Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012] экспрессионной кассеты, содержащей синтетический ген с оптимизированными для метилотрофных дрожжей кодонами, кодирующий α-амилазу.Yeast transformant O. haglerorum is obtained by introducing into the recipient strain O. haglerorum VKPM Y-2584 [Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012] expression cassette containing a synthetic gene with codons optimized for methylotrophic yeast encoding α-amylase.

Для конструирования экспрессионной плазмиды используют вектор pMOX-MFopt-HARS (6966 п. н.), полученный на основе вектора рМОХ-Km-HARS [Биотехнология, 2019, 35(6), 51-56], в котором фрагмент ДНК, содержащий сигнальную последовательность MFα Saccharomyces cerevisiae, заменяют на сигнальную последовательность MFα opt, оптимизированную по кодоновому составу для дрожжей рода Ogataea, приведенную в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. Последовательность SEQ ID NO:2 идентична последовательности нуклеотидов сигнального пептида MFα Saccharomyces cerevisiae на 89,7% согласно программе AlignX в Vector NTI.To construct an expression plasmid, the pMOX-MFopt-HARS vector (6966 bp) obtained on the basis of the pMOX-Km-HARS vector [Biotechnology, 2019, 35(6), 51-56] is used, in which the DNA fragment containing the signal the MFα sequence of Saccharomyces cerevisiae is replaced with the MFα opt signal sequence, codon-optimized for the yeast of the genus Ogataea, shown in the sequence listing under SEQ ID NO:2. The sequence of SEQ ID NO:2 is identical to the sequence of nucleotides of the signal peptide MFα Saccharomyces cerevisiae by 89.7% according to the program AlignX in Vector NTI.

Последовательность SEQ ID NO:1 встраивают в состав вектора рМОХ-MFopt-HARS по сайтам EcoRI и NotI и получают экспрессионную плазмиду pMOX-AMYsynt размером 8433 п. н.The sequence of SEQ ID NO:1 is inserted into the pMOX-MFopt-HARS vector at the EcoRI and NotI sites, and the 8433 bp pMOX-AMYsynt expression plasmid is obtained.

Плазмиду pMOX-AMYsynt обрабатывают ферментом BpiI и выделяют экспрессионную кассету размером 5536 п. н. (фиг.1), в состав которой входят следующие генетические элементы:Plasmid pMOX-AMYsynt is digested with BpiI and a 5536 bp expression cassette is isolated. (figure 1), which includes the following genetic elements:

1. Синтетический ген AMYsynt, встроенный в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью оптимизированного сигнального пептида MFα opt из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, транскрипция которого находится под контролем промотора рМОХ, наработанного с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 (линия CBS4732).1. Synthetic AMYsynt gene inserted into the reading frame with the nucleotide sequence of the optimized signal peptide MFα opt from the yeast Saccharomyces cerevisiae, the transcription of which is under the control of the pMOX promoter, generated using the chromosomal DNA of the Ogataea polymorpha strain VKPM Y-1546 (line CBS4732).

2. Терминатор транскрипции tMOX, наработанный с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546.2. Transcription terminator tMOX generated using chromosomal DNA of Ogataea polymorpha strain VKPM Y-1546.

3. Дрожжевой селективный маркер KmMX, фланкированный сайтами lox66 и lox71, транскрипция которого находится под контролем промотора pGAPD гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, наработанного с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 и терминатора транскрипции tTEF. Устойчивость дрожжей Ogataea haglerorum к антибиотику генетицину (G418) обеспечивает маркер KmMX.3. Yeast selective marker KmMX flanked by lox66 and lox71 sites, whose transcription is under the control of the pGAPD promoter of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene, generated using the chromosomal DNA of the Ogataea polymorpha strain VKPM Y-1546 and the transcription terminator tTEF. The resistance of the yeast Ogataea haglerorum to the antibiotic geneticin (G418) is provided by the KmMX marker.

4. Последовательность HARS, наработанную с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-916 (линия DL1), обеспечивающую сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма и являющуюся возможным местом интеграции.4. HARS sequence generated using chromosomal DNA of the Ogataea polymorpha strain VKPM Y-916 (DL1 line), which ensures the preservation of the transformable DNA in the cells of the recipient strain and is a possible site of integration.

5. Область интеграции - нуклеотидная последовательность 3'- области региона МОХ.5. Integration region - nucleotide sequence of the 3' region of the MOX region.

Экспрессионную кассету трансформируют в штамм О. haglerorum ВКПМ Y-2584. Компетентные клетки готовят, как описано [Valeria Mapelli (ed.), Yeast Metabolic Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. - Vol.1152. - Chapter 3. DOI 10.1007/978-l-4939-0563-8_3, © Springer Science+Business Media, LLC 2014]. Электропорацию проводят на электропораторе GenePulser Xcell (Bio-Rad) при 1500 В, 200 Ом, 25uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин при качании.The expression cassette is transformed into a strain of O. haglerorum VKPM Y-2584. Competent cells are prepared as described [Valeria Mapelli (ed.), Yeast Metabolic Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. - Vol.1152. - Chapter 3. DOI 10.1007/978-l-4939-0563-8_3, © Springer Science+Business Media, LLC 2014]. Electroporation was performed on a GenePulser Xcell electroporator (Bio-Rad) at 1500 V, 200 ohms, 25uF. After electroporation, 1 ml of YP liquid medium (wt.%: yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) is added to the cells with the addition of glucose (2 wt.%), the cell suspension is transferred into sterile test tubes of 1.5 ml and incubated at 37° C. for 60 min with shaking.

Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) и генетицина (G418) в количестве 300 мкг/мл при температуре 37°С в течение 3-х суток.The selection of transformants is carried out on YP agar medium (wt. %: yeast extract - 1, peptone - 2, agar - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt. %) and geneticin (G418) in an amount of 300 μg / ml at temperature 37°C for 3 days.

Отбор наиболее продуктивных трансформантов осуществляют по результатам их культивирования по следующей схеме:The selection of the most productive transformants is carried out according to the results of their cultivation according to the following scheme:

- Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/40.- The inoculum is grown in test tubes (50 ml) with 5 ml of YP liquid nutrient medium supplemented with glucose (2 wt %) at 37°C for 24 hours on a shaker (250 rpm). The inoculation of the fermentation medium is carried out in a ratio of 1/40.

- Ферментацию проводят при 37°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 6 дней. Через 24 ч культивирования начинают индукцию метанолом, который добавляют в количестве 3 об.%, затем такое же количество метанола добавляют на 48 ч культивирования. В качестве контроля используют штамм О. haglerorum ВКПМ Y-2584, содержащий экспрессионный вектор pMOX-MFopt-HARS.- Fermentation is carried out at 37°C on a rocking chair (250 rpm) in YP nutrient medium with the addition of glucose (2 wt.%) for 6 days. After 24 hours of cultivation, induction with methanol is started, which is added in an amount of 3 vol.%, then the same amount of methanol is added for 48 hours of cultivation. The strain O. haglerorum VKPM Y-2584 containing the pMOX-MFopt-HARS expression vector is used as a control.

Продуктивность трансформантов О. haglerorum оценивают по активности секретированной α-амилазы. Для этого клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения амилазной активности по методу с 3,5-динитросалициловой кислотой (ДНС) [Anal. Chem. - 1959. - Vol.31. - No. 3. - P.426-428], используя глюкозу как стандарт. В качестве субстрата используют растворимый крахмал.The productivity of O. haglerorum transformants is assessed by the activity of secreted α-amylase. For this, transformant cells are precipitated by centrifugation, and the supernatant is used to determine amylase activity according to the method with 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) [Anal. Chem. - 1959. - Vol.31. - No. 3. - P.426-428], using glucose as a standard. Soluble starch is used as a substrate.

Стандартная реакционная смесь состоит из 0,1 мл раствора 1% субстрата (вес/объем) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0 и 0,1 мл образца фермента (супернатант). Перед проведением реакции образцы фермента разбавляют в 10, 100, 300, 500, 800, 1000 раз стерильной водой. Время реакции 10 минут. Затем в пробирки добавляют 0,3 мл 1% раствора ДНС, перемешивают и помещают пробирки в термостат на 98°С на 5 мин. Оптическую плотность всех образцов (калибровка, опытные пробы, контрольные пробы) определяют при длине волны 540 нм в плашках на 96 лунок на спектрофотометре Multiskan spectrum (Thermo Fisher Scientific, США) с помощью программы Skanlt RE for MSS 2.4.4. Все измерения проводят трижды.The standard reaction mixture consists of 0.1 ml of a solution of 1% substrate (w/v) in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0 and 0.1 ml of the enzyme sample (supernatant). Before the reaction, enzyme samples are diluted 10, 100, 300, 500, 800, 1000 times with sterile water. Reaction time 10 minutes. Then add 0.3 ml of 1% SDS solution to the tubes, mix and place the tubes in a thermostat at 98°C for 5 minutes. The optical density of all samples (calibration, experimental samples, control samples) is determined at a wavelength of 540 nm in 96-well plates on a Multiskan spectrum spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, USA) using the Skanlt RE for MSS 2.4.4 program. All measurements are carried out three times.

За единицу ферментативной активности α-амилазы (1 ед.) принимают количество фермента, действующего на субстрат с высвобождением 1 μМ восстанавливающих Сахаров (глюкозы) за одну минуту в следующих условиях проведения реакции: температура 70°С, рН 7,0, продолжительность гидролиза 10 минут.A unit of enzymatic activity of α-amylase (1 unit) is taken as the amount of enzyme acting on the substrate with the release of 1 μM of reducing sugars (glucose) per minute under the following reaction conditions: temperature 70°C, pH 7.0, duration of hydrolysis 10 minutes.

Среди проверенных трансформантов отбирают наиболее продуктивный, стабильный трансформант О. haglerorum N372, который при культивировании в пробирках продуцируют α-амилазу с активностью 795 ед./мл КЖ.Among the tested transformants, the most productive, stable transformant of O. haglerorum N372 is selected, which, when cultivated in test tubes, produces α-amylase with an activity of 795 units/ml QOL.

Тестирование на стабильность наследования признака «устойчивость к генетицину» проводят следующим образом. Трансформант О. haglerorum N372 растят в неселективных условиях, в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %), в пробирках на качалке при 37°С в течение 24 ч, затем производят пять последовательных пересевов культуры из неселективных условий в пробирки со свежей средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). Пробирки инкубируют на качалке при 37°С в течение 24 ч. Затем рассевают культуру до отдельных колоний на чашки Петри с агаризованной неселективной средой YP, содержащей глюкозу (2 мас. %). С помощью репликатора отбирают 100 независимых колоний и анализируют их на способность расти на селективной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (300 мкг/мл) и контрольной среде - YP с глюкозой (2 мас. %). Отсутствие колоний, не растущих на селективной среде с антибиотиком, указывает на то, что экспрессионная кассета содержится в клетках трансформантов в составе хромосомной ДНК.Testing for the stability of the inheritance of the trait "resistance to geneticin" is carried out as follows. The transformant O. haglerorum N372 is grown under non-selective conditions, in a liquid YP medium with glucose (2 wt.%), in test tubes on a shaker at 37°C for 24 h, then five successive transfers of the culture are made from non-selective conditions into test tubes with fresh medium. YP containing glucose (2 wt. %). The tubes are incubated on a shaker at 37°C for 24 hours. Then the culture is seeded to individual colonies on Petri dishes with agarized non-selective YP medium containing glucose (2 wt.%). Using a replicator, 100 independent colonies are selected and analyzed for their ability to grow on YP selective medium with glucose (2 wt.%) and geneticin (300 μg/ml) and control medium - YP with glucose (2 wt.%). The absence of colonies that do not grow on the selective medium with the antibiotic indicates that the expression cassette is contained in the transformant cells as part of the chromosomal DNA.

Пример 2. Получение штамма О. haglerorum N388, устойчивого к генетицинуExample 2 Preparation of O. haglerorum strain N388 resistant to geneticin

Для повышения продуктивности трансформанта, которую оценивают по активности α-амилазы в культуральной жидкости, проводят повторную трансформацию экспрессионной кассетой, для чего из хромосомной ДНК трансформанта О. haglerorum N372 удаляют селективный маркер KmMX методом рекомбинации по lox сайтам в присутствии Cre рекомбиназы [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197]. От трансформанта отбирают колонию, которая не растет на среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (300 мкг/мл), но растет на полной среде без антибиотика, и называют О. haglerorum N382. Клон О. haglerorum N382, чувствительный к генетицину, культивируют в пробирках в YP среде с глюкозой (2%) с последующей индукцией метанолом и измеряют активность α-амилазы. Клон О. haglerorum N382 продуцирует α-амилазу с активностью 800 ед./мл КЖ.To increase the productivity of the transformant, which is assessed by the activity of α-amylase in the culture fluid, re-transformation is carried out with an expression cassette, for which the selective marker KmMX is removed from the chromosomal DNA of the transformant O. haglerorum N372 by recombination at lox sites in the presence of Cre recombinase [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197]. From the transformant, a colony was selected that did not grow on YP medium with glucose (2 wt %) and geneticin (300 μg/ml), but grew on complete medium without antibiotic, and was named O. haglerorum N382. Clone O. haglerorum N382, sensitive to geneticin, cultured in test tubes in YP medium with glucose (2%), followed by induction with methanol and measure the activity of α-amylase. Clone O. haglerorum N382 produces α-amylase with an activity of 800 U/ml QOL.

Компетентные клетки О. haglerorum N382 трансформируют экспрессионной кассетой (фиг.1). Анализируют 24 независимых трансформанта, устойчивых к генетицину. Отбор наиболее продуктивных трансформантов осуществляют по результатам их культивирования в пробирках. В качестве контроля проводят культивирование в пробирке родительского штамма О. haglerorum N382. Отбирают один стабильный, наиболее продуктивный трансформант О. haglerorum N388, который продуцирует α-амилазу с активностью 2150 ед./мл КЖ за 144 ч культивирования, является устойчивым к генетицину и содержит минимум две копии экспрессионной кассеты.Competent O. haglerorum N382 cells are transformed with an expression cassette (FIG. 1). Analyze 24 independent transformants resistant to geneticin. The selection of the most productive transformants is carried out according to the results of their cultivation in test tubes. As a control, in vitro cultivation of the parent strain O. haglerorum N382 is carried out. One stable, most productive transformant of O. haglerorum N388 was selected, which produces α-amylase with an activity of 2150 U/ml QOL for 144 hours of cultivation, is resistant to geneticin and contains at least two copies of the expression cassette.

Отобранный трансформант О. haglerorum N388, устойчивый к генетицину (G418), депонируют в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1) как штамм Ogataea haglerorum N388 ВКПМ Y-4980.The selected transformant O. haglerorum N388, resistant to geneticin (G418), is deposited at the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) of the National Research Center "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika (117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1) as an Ogataea strain haglerorum N388 VKPM Y-4980.

Штамм Ogataea haglerorum N388 ВКПМ Y-4980 характеризуется следующими признаками:The strain Ogataea haglerorum N388 VKPM Y-4980 is characterized by the following features:

Культурально-морфологическая характеристика заявляемого штамма:Cultural and morphological characteristics of the proposed strain:

При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) и генетицина (300 мкг/мл) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.When cultivated at 37°C for 48 h on YP agar medium supplemented with glucose-2 (wt %) and geneticin (300 μg/mL), the cells are oval, 3–4 μm in diameter. Cells bud, while budding is true, multilateral. True mycelium does not form.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают до 4-х аскоспор.Sporulation occurs when the culture is incubated on an agar medium of the following composition (wt %): potassium chloride - 0.5, sodium acetate - 1.0, agar - 2.0, water - the rest at 25°C for 3-4 days. Asci have a tetrahedral shape, include up to 4 ascospores.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) и генетицина (300 мкг/мл) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.On YP agar medium supplemented with glucose (2, wt %) and geneticin (300 µg/mL), light beige colonies with a smooth edge, matte surface, lenticular profile, and pasty consistency were observed.

При росте в жидкой среде YP с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) и генетицина (300 мкг/мл) при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.Growth in a YP liquid medium with the addition of glucose-2 (wt %) and geneticin (300 μg/mL) at 37°C for 24 hours of cultivation results in a cloudy liquid, a white precipitate, no coagulation, and no parietal films.

Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма: Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.Physiological and biochemical characteristics of the proposed strain: The strain is capable of growth in both aerobic and anaerobic conditions. The strain is capable of using glucose, glycerol, methanol, ethanol, L-rhamnose, sucrose, and maltose as the only source of carbon; unable to assimilate D-gluconate, L-arabinose, succinate, lactose, starch.

Штамм способен синтезировать α-амилазу при культивировании в пробирках в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) в условиях индукции метанолом.The strain is capable of synthesizing α-amylase when cultured in test tubes in liquid YP medium with glucose (2 wt %) under induction conditions with methanol.

Пример 3. Получение штамма О. haglerorum N404, чувствительного к генетицинуExample 3 Preparation of O. haglerorum strain N404 susceptible to geneticin

Устойчивость штамма к антибиотикам затрудняет его использование в промышленности, т.к. требует дополнительных затрат при утилизации клеточной биомассы, и получение антибиотикочувствительного штамма помогает в решении этой проблемы.The resistance of the strain to antibiotics makes it difficult to use it in industry, because. requires additional costs for the utilization of cell biomass, and obtaining an antibiotic-sensitive strain helps to solve this problem.

Из трансформанта О. haglerorum N388 удаляют ген KmMX, обеспечивающий клеткам дрожжей устойчивость к генетицину, методом рекомбинации по lox - сайтам в присутствии Cre - рекомбиназы [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197].From the transformant O. haglerorum N388, the KmMX gene, which provides yeast cells with resistance to geneticin, is removed by recombination at lox sites in the presence of Cre recombinase [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197].

Трансформант О. haglerorum N388 выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) и генетицина в количестве 300 мкг/мл при 37°С в течение 6 ч до достижения культурой оптической плотности (OD₆₀₀) 1,5. Клетки собирают центрифугированием (здесь и далее 6000 об/мин) в течение 10 мин при комнатной температуре, ресуспендируют в буфере TED состава: 100 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8.0, 25 мМ дитиотрейтола, приготовленном на воде SQ, инкубируют при 37°С в течение 15 мин и собирают центрифугированием в течение 10 мин при комнатной температуре. Далее клетки промывают дважды холодным буфером STM состава: 270 мМ сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ MgCl2, приготовленном на воде SQ, собирают центрифугированием в течение 10 мин при температуре 5°С. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в холодном растворе STM в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 60 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 200 нг ДНК плазмиды с Cre рекомбиназой и инкубируют на льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 1500 В, 200 Ом, 25 uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин при качании.Transformant O. haglerorum N388 is grown in liquid nutrient medium YP (wt. %: yeast extract - 1, peptone - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt. %) and geneticin in the amount of 300 μg/ml at 37°C within 6 hours until the culture reaches an optical density (OD ₆₀₀ ) of 1.5. Cells are harvested by centrifugation (hereinafter 6000 rpm) for 10 min at room temperature, resuspended in TED buffer composition: 100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8.0, 25 mM dithiothreitol prepared in water SQ, incubated at 37°C for 15 min and collected by centrifugation for 10 min at room temperature. Next, the cells are washed twice with cold STM buffer of the composition: 270 mM sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM MgCl2 prepared in SQ water, and harvested by centrifugation for 10 min at 5°C. The cells thus treated are resuspended in cold STM solution at a concentration of 1-5×10 ⁹ cells/ml. A 60 µl aliquot of the cell suspension is transferred to a chilled eppendorf, 200 ng of plasmid DNA with Cre recombinase is added and incubated on ice for 5 minutes. The mixture of cells and DNA is transferred to a pre-chilled electroporation cuvette. Electroporation is carried out at 1500 V, 200 ohms, 25 uF. After electroporation, 1 ml of liquid YP medium with glucose (2 wt %) is added to the cells, the cell suspension is transferred into sterile 1.5 ml tubes and incubated at 37° C. for 60 min with shaking.

Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и гигромицином в количестве 200 мкг/мл при температуре 37°С в течение 4-х суток.The selection of transformants is carried out on YP agar medium with glucose (2 wt %) and hygromycin in the amount of 200 μg/ml at 37°C for 4 days.

Биомассу трех независимых трансформантов переносят в три пробирки с 3 мл среды YP с гигромицином в количестве 200 мкг/мл и метанолом, используемым в качестве источника углерода и индуктора биосинтеза Cre рекомбиназы. Пробирки инкубируют при 37°С в течение 48 ч при качании. Затем делают рассев культуры из пробирок до отдельных колоний на среду YP с глюкозой (2 мас. %) на три чашки Петри. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение 72 ч. Анализируют 100 независимо отобранных колоний с каждой чашки. В лунки репликатора добавляют 200 мкл стерильной воды, в каждую лунку репликатора переносят с помощью зубочистки биомассу одной колонии, затем делают реплику из репликатора на три чашки Петри со средами YP с глюкозой (2 мас. %), YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином в количестве 300 мкг/мл и YP с глюкозой (2 мас. %) и гигромицином в количестве 200 мкг/мл. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение 48 ч. Отбирают колонии, которые растут на среде YP с глюкозой (2 мас. %), но не растут на средах с антибиотиками.The biomass of three independent transformants was transferred into three tubes with 3 ml of YP medium containing 200 μg/ml of hygromycin and methanol used as a carbon source and inducer of Cre recombinase biosynthesis. The tubes are incubated at 37° C. for 48 hours while shaking. Then the culture is sieved from test tubes to individual colonies on YP medium with glucose (2 wt. %) on three Petri dishes. Cups are incubated in a thermostat at 37°C for 72 hours Analyze 100 independently selected colonies from each cup. 200 μl of sterile water is added to the wells of the replicator, the biomass of one colony is transferred to each well of the replicator with a toothpick, then a replica is made from the replicator into three Petri dishes with YP with glucose (2 wt. %), YP with glucose (2 wt. %) ) and geneticin at 300 µg/ml and YP with glucose (2 wt %) and hygromycin at 200 µg/ml. The dishes are incubated in a thermostat at 37°C for 48 hours. Colonies are selected that grow on YP medium with glucose (2 wt.%), but do not grow on media with antibiotics.

Проводят культивирование отобранных колоний в пробирках по следующей схеме:The selected colonies are cultivated in test tubes according to the following scheme:

- Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/40.- The inoculum is grown in test tubes (50 ml) with 5 ml of YP liquid nutrient medium supplemented with glucose (2 wt %) at 37°C for 24 hours on a shaker (250 rpm). The inoculation of the fermentation medium is carried out in a ratio of 1/40.

- Ферментацию проводят при 37°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 дней. Через 24 ч культивирования начинают индукцию метанолом, который добавляют в количестве 3 об.%, затем такое же количество метанола добавляют на 48 ч культивирования. В качестве контроля используют штамм О. haglerorum N388.- Fermentation is carried out at 37°C on a rocking chair (250 rpm) in YP nutrient medium with the addition of glucose (2 wt.%) for 5 days. After 24 hours of cultivation, induction with methanol is started, which is added in an amount of 3 vol.%, then the same amount of methanol is added for 48 hours of cultivation. Strain O is used as a control . haglerorum N388.

Продуктивность чувствительных к антибиотикам генетицину и гигромицину колоний О. haglerorum оценивают по активности секретированной α-амилазы. Для этого клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения амилазной активности по методу с 3,5-динитросалициловой кислотой (ДНС) [Anal. Chem. - 1959. - Vol.31. - No. 3. - P.426-428], используя глюкозу как стандарт. В качестве субстрата используют растворимый крахмал.The productivity of antibiotic-sensitive geneticin and hygromycin colonies of O. haglerorum is assessed by the activity of secreted α-amylase. For this, transformant cells are precipitated by centrifugation, and the supernatant is used to determine amylase activity according to the method with 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) [Anal. Chem. - 1959. - Vol.31. - No. 3. - P.426-428], using glucose as a standard. Soluble starch is used as a substrate.

Отбирают клон N404, который продуцирует α-амилазу с активностью 2350 ед./мл за 144 ч культивирования в пробирках при температуре 37°С, что сравнимо с продуктивностью родителя - штамма О. haglerorum N388.Selected clone N404, which produces α-amylase with an activity of 2350 units/ml for 144 hours of cultivation in test tubes at a temperature of 37°C, which is comparable to the productivity of the parent strain O. haglerorum N388.

Клон О. haglerorum N404 депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1) как штамм Ogataea haglerorum N404 ВКПМ Y-5018.The clone O. haglerorum N404 was deposited at the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) of the National Research Center "Kurchatov Institute" (117545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1) as strain Ogataea haglerorum N404 VKPM Y-5018.

Штамм Ogataea haglerorum N404 ВКПМ Y-5018 характеризуется следующими признаками:The strain Ogataea haglerorum N404 VKPM Y-5018 is characterized by the following features:

Культурально-морфологическая характеристика заявляемого штамма:Cultural and morphological characteristics of the proposed strain:

При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.When cultivated at a temperature of 37°C for 48 h on YP agar medium with the addition of glucose - 2 (wt %), the cells have an oval shape, 3-4 μm in diameter. Cells bud, while budding is true, multilateral. True mycelium does not form.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают до 4-х аскоспор.Sporulation occurs when the culture is incubated on an agar medium of the following composition (wt %): potassium chloride - 0.5, sodium acetate - 1.0, agar - 2.0, water - the rest at 25°C for 3-4 days. Asci have a tetrahedral shape, include up to 4 ascospores.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.On YP agar medium supplemented with glucose (2, wt %), light beige colonies with a smooth edge, matte surface, lenticular profile, and pasty consistency.

При росте в жидкой среде YP с добавлением глюкозы - 2 (мас. %), при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.Growth in a YP liquid medium with the addition of glucose - 2 (wt.%), at 37°C for 24 hours of cultivation - the liquid is turbid, the precipitate is white, no coagulation is observed, no wall films are formed.

Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма:Physiological and biochemical characteristics of the proposed strain:

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.The strain is capable of growth under both aerobic and anaerobic conditions.

В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.The strain is capable of using glucose, glycerol, methanol, ethanol, L-rhamnose, sucrose, and maltose as the sole source of carbon; unable to assimilate D-gluconate, L-arabinose, succinate, lactose, starch.

Штамм способен синтезировать α-амилазу при культивировании в пробирках в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) в условиях индукции метанолом.The strain is capable of synthesizing α-amylase when cultured in test tubes in liquid YP medium with glucose (2 wt %) under induction conditions with methanol.

Пример 4. Культивирование штамма Ogataea haglerorum N388 в колбахExample 4 Cultivation of the strain Ogataea haglerorum N388 in flasks

Посевную культуру штамма готовят в пробирке в 5 мл среды YP с глюкозой (2 мас. %). Пробирку инкубируют при 37°С в течение 20 ч на качалке (250 об/мин). В колбу на 0,75 л со 100 мл жидкой среды YP с глицерином (2 мас. %) переносят 2,5 мл посевной культуры и колбу инкубируют при 37°С на качалке (250 об/мин) в течение 144 часов. Метанол (3 об.%) добавляют к культуре через 24 и 48 часов культивирования. Биомассу отделяют центрифугированием в течение 15 мин.The seed culture of the strain is prepared in a test tube in 5 ml of YP medium with glucose (2 wt %). The tube is incubated at 37°C for 20 hours on a shaker (250 rpm). Into a 0.75 L flask with 100 ml of YP liquid medium with glycerol (2 wt %), 2.5 ml of inoculum are transferred and the flask is incubated at 37° C. on a shaker (250 rpm) for 144 hours. Methanol (3 vol.%) is added to the culture after 24 and 48 hours of cultivation. The biomass is separated by centrifugation for 15 minutes.

Активность «-амилазы определяют по методу ДНС при температуре 70°С и рН 7,0.The activity of α-amylase is determined by the CSN method at a temperature of 70°C and pH 7.0.

Проводят по три независимых культивирования.Spend three independent cultivation.

Штамм Ogataea haglerorum N388 продуцирует α-амилазу, активность фермента составляет, соответственно, 2200, 2080, 2470 ед./мл КЖ через 144 ч культивирования.The strain Ogataea haglerorum N388 produces α-amylase, the activity of the enzyme is, respectively, 2200, 2080, 2470 U/ml QOL after 144 hours of cultivation.

Пример 5. Культивирование штамма Ogataea haglerorum N404 в колбах Посевную культуру штамма готовят в пробирке в 5 мл среды YP с глюкозой (2 мас. %). Пробирку инкубируют при 37°С в течение 20 ч на качалке (250 об/мин). В колбу на 0,75 л со 100 мл жидкой среды YP с глицерином (2 мас. %) переносят 2,5 мл посевной культуры и колбу инкубируют при 37°С на качалке (250 об/мин) в течение 144 часов. Метанол (3 об.%) добавляют к культуре через 24 и 48 часов культивирования. Биомассу отделяют центрифугированием в течение 15 мин.Example 5. Cultivation of the Ogataea haglerorum N404 strain in flasks The seed culture of the strain is prepared in a test tube in 5 ml of YP medium with glucose (2 wt. %). The tube is incubated at 37°C for 20 hours on a shaker (250 rpm). Into a 0.75 L flask with 100 ml of YP liquid medium with glycerol (2 wt %), 2.5 ml of inoculum are transferred and the flask is incubated at 37° C. on a shaker (250 rpm) for 144 hours. Methanol (3 vol.%) is added to the culture after 24 and 48 hours of cultivation. The biomass is separated by centrifugation for 15 minutes.

Активность α-амилазы определяют по методу ДНС при температуре 70°С и рН 7,0.The activity of α-amylase is determined by the method of DNS at a temperature of 70°C and pH 7.0.

Проводят по три независимых культивирования.Spend three independent cultivation.

Штамм Ogataea haglerorum N404 продуцирует α-амилазу, активность фермента составляет, соответственно, 2310, 2240, 2500 ед./мл КЖ через 144 ч культивирования.The strain Ogataea haglerorum N404 produces α-amylase, the activity of the enzyme is 2310, 2240, 2500 units/ml QOL, respectively, after 144 hours of cultivation.

Пример 6. Характеристика рекомбинантной α-амилазы рН-профилъ активности рекомбинантной α-амилазыExample 6 Characterization of Recombinant α-Amylase pH Profile of Recombinant α-Amylase Activity

Для определения оптимального значения рН для функционирования фермента активность α-амилазы по отношению к субстрату (1% раствор растворимого крахмала, вес/объем) измеряют в диапазоне значений рН 1.0-10.0 с использованием 0,1М растворов цитратного (рН 1,0 - 3,0), ацетатного (рН 4,0-5,0), фосфатного (рН 6,0-8,0) и боратного (рН 9,0-10,0) буферов. Реакцию проводят при температуре 70°С в течение 10 мин. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех независимых реакциях в диапазоне значений рН 1.0-10.0.To determine the optimal pH value for the functioning of the enzyme, the activity of α-amylase in relation to the substrate (1% solution of soluble starch, w/v) is measured in the range of pH 1.0-10.0 using 0.1 M solutions of citrate (pH 1.0 - 3, 0), acetate (pH 4.0-5.0), phosphate (pH 6.0-8.0) and borate (pH 9.0-10.0) buffers. The reaction is carried out at a temperature of 70°C for 10 minutes. Relative activity is calculated as a percentage of the average maximum enzyme activity measured in three independent reactions in the pH range of 1.0-10.0.

Результаты измерений, приведены на фиг.2. Полученные результаты показывают, что рекомбинантная α-амилаза, синтезированная дрожжами Ogataea haglerorum проявляет наибольшую активность в диапазоне рН 5,0-7,0 с оптимумом при рН 7,0.The measurement results are shown in Fig.2. The results obtained show that recombinant α-amylase synthesized by the yeast Ogataea haglerorum exhibits the highest activity in the pH range of 5.0-7.0 with an optimum at pH 7.0.

Температурный профиль активности рекомбинантной α-амилазыTemperature profile of recombinant α-amylase activity

Для определения температурного профиля активности фермента α-амилазы проводят реакции образцов с субстратом (1% раствор растворимого крахмала, вес/объем) в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,0) в диапазоне температур от 35 до 100°С с шагом 5°С. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех реакциях в диапазоне значений температур от 35 до 100°С. Результаты приведены на фиг.3.To determine the temperature profile of the activity of the α-amylase enzyme, reactions of samples with a substrate (1% solution of soluble starch, w/v) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) are carried out in the temperature range from 35 to 100°C in increments of 5° WITH. Relative activity is calculated as a percentage of the average maximum activity of the enzyme, measured in three reactions in the temperature range from 35 to 100°C. The results are shown in Fig.3.

Наибольшую активность рекомбинантная α-амилаза проявляет в интервале температур от 65 до 95°С (сохраняет не менее 80% активности), с оптимумом при 85°С.Recombinant α-amylase exhibits the highest activity in the temperature range from 65 to 95°C (retains at least 80% of activity), with an optimum at 85°C.

Термостабильность рекомбинантной α-амилазы при разных температурахThermal stability of recombinant α-amylase at different temperatures

Определение термостабильности рекомбинантного фермента при различных температурах проводят путем предварительного прогревания культуральной жидкости, содержащей фермент, при температурах 80, 85, 90, 95 и 100°С в течение 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут. Образцы охлаждают до комнатной температуры. После чего проводят реакцию с субстратом при температуре 70°С в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,0). Относительную активность рассчитывают, как процент от значения активности непрогретого фермента. Измерения проводят в трех повторностях. Результаты приведены на фиг.4.Determination of the thermal stability of the recombinant enzyme at different temperatures is carried out by preheating the culture liquid containing the enzyme at temperatures of 80, 85, 90, 95 and 100°C for 5, 10, 15, 20, 30 and 60 minutes. The samples are cooled to room temperature. Then carry out the reaction with the substrate at a temperature of 70°C in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0). Relative activity is calculated as a percentage of the unheated enzyme activity value. Measurements are carried out in triplicate. The results are shown in Fig.4.

Полученные результаты показывают, что фермент практически не теряет активности при прогревании при температурах 80°С и 85°С в течение 60 мин. Если рекомбинантную α-амилазу выдержать при температурах 90, 95 и 100°С в течение 5 мин, фермент сохраняет более 75% активности. Выдерживание α-амилазы при температуре 95°С или 100°С более длительное время приводит к снижению активности фермента, однако даже после прогревания при температуре 100°С в течении 60 мин рекомбинантный фермент не инактивируется, остаточная активность составляет 30%. Таким образом, рекомбинантная α-амилаза, синтезируемая дрожжами Ogataea haglerorum, является термостабильным ферментом. Определение молекулярного веса рекомбинантной α-амилазы Для определения молекулярного веса рекомбинантной α-амилазы проводят электрофоретическое разделение белков из образца КЖ в 12%) полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) в камере для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad (Bio-Rad США). Для визуализации белков используют Кумасси бриллиантовый синий R250 (фиг.5). Как показал анализ аминокислотной последовательности, проведенный с использованием программы NetNGlyc 1.0 Server, в аминокислотной последовательности α-амилазы содержится пять потенциальных сайтов N-гликозилирования Asn-Arg-Thr, однако с наибольшей вероятностью гликозилированы только три из них. Для дегликозилирования рекомбинантной α-амилазы используют фермент EndoH (Endoglycosidase Н from Streptomyces plicatus, Sigma-Aldrich, США).The results obtained show that the enzyme practically does not lose activity when heated at temperatures of 80°C and 85°C for 60 min. If the recombinant α-amylase is kept at temperatures of 90, 95 and 100°C for 5 min, the enzyme retains more than 75% of its activity. Keeping α-amylase at a temperature of 95°C or 100°C for a longer time leads to a decrease in the activity of the enzyme, however, even after heating at a temperature of 100°C for 60 min, the recombinant enzyme is not inactivated, the residual activity is 30%. Thus, the recombinant α-amylase synthesized by the yeast Ogataea haglerorum is a thermostable enzyme. Determination of the molecular weight of recombinant α-amylase To determine the molecular weight of recombinant α-amylase, electrophoretic separation of proteins from a QOL sample in 12%) polyacrylamide gel under denaturing conditions (SDS-PAGE) in a Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad vertical electrophoresis chamber (Bio -Rad USA). For protein visualization, Coomassie Brilliant Blue R250 was used (FIG. 5). Analysis of the amino acid sequence using the NetNGlyc 1.0 Server program showed that the amino acid sequence of α-amylase contains five potential Asn-Arg-Thr N-glycosylation sites, but only three of them are most likely glycosylated. For deglycosylation of recombinant α-amylase, the EndoH enzyme (Endoglycosidase H from Streptomyces plicatus, Sigma-Aldrich, USA) is used.

Дегликозилирование рекомбинантной α-амилазы в КЖ проводят в течение 3 часов при 37°С в соответствии с инструкцией производителя.Deglycosylation of recombinant α-amylase in QOL is carried out for 3 hours at 37°C in accordance with the manufacturer's instructions.

Установлено, что рекомбинантная α-амилаза, синтезированная дрожжами О. haglerorum представляет собой гликозилированный белок с молекулярным весом 65-100 кДа.It has been established that the recombinant α-amylase synthesized by the yeast O. haglerorum is a glycosylated protein with a molecular weight of 65-100 kDa.

Молекулярный вес N-дегликозилированного белка составляет приблизительно 56 кДа (расчетное значение 55,65 кДа по программе Protein Parameters: https://protparam.net/index.html).The molecular weight of the N-deglycosylated protein is approximately 56 kDa (calculated value of 55.65 kDa by Protein Parameters: https://protparam.net/index.html).

В таблице 1 приведено сравнение свойств полученной α-амилазы из штамма Ogataea haglerorum N404 ВКПМ Y-5018 и термостабильных α-амилаз, полученных в клетках дрожжей P. pastoris.Table 1 compares the properties of the obtained α-amylase from the strain Ogataea haglerorum N404 VKPM Y-5018 and thermostable α-amylases obtained in P. pastoris yeast cells.

Таким образом, по своим свойствам рекомбинантная α-амилаза, наработанная клетками термотолерантных метилотрофных дрожжей О. haglerorum, сравнима с α-амилазами типа Termamyl, наработанными дрожжами P. pastoris (Табл. 1)Thus, in terms of its properties, the recombinant α-amylase produced by the cells of the thermotolerant methylotrophic yeast O. haglerorum is comparable to Termamyl-type α-amylases produced by the yeast P. pastoris (Table 1)

Полученная α-амилаза сравнима также с коммерческой α-амилазой BAN (гибридная termamyl - like α-амилаза с заменами H156Y, А181Т, N190F, A209V Q264S, наработанная в Bacillus amyloliquefaciens), и α-амилазой Termamyl wt из Bacillus licheniformis, которые сохраняют 57% и 52% активности, соответственно, после инкубации фермента при 95°С в течение 30 мин [US7625737].The resulting α-amylase is also comparable to commercial α-amylase BAN (hybrid termamyl - like α-amylase with substitutions H156Y, A181T, N190F, A209V Q264S, produced in Bacillus amyloliquefaciens), and Termamyl wt α-amylase from Bacillus licheniformis, which retain 57 % and 52% activity, respectively, after enzyme incubation at 95°C for 30 min [US7625737].

α-Амилаза, наработанная в дрожжах О. haglerorum, сохраняет 52% активности после выдерживания образца КЖ (рН 6,5) без субстрата при температуре 95°С в течение 30 мин, что позволяет использовать ее в технологических процессах, протекающих при высоких температурах, в частности в пищевой промышленности для разжижения крахмалсодержащего растительного сырья с целью получения глюкозо-фруктозных сиропов, в текстильной промышленности для расшлихтовки тканей.α-Amylase produced in the yeast O. haglerorum retains 52% of its activity after keeping the QOL sample (pH 6.5) without a substrate at a temperature of 95°C for 30 min, which makes it possible to use it in technological processes occurring at high temperatures, in particular in the food industry for liquefying starch-containing vegetable raw materials in order to obtain glucose-fructose syrups, in the textile industry for desizing fabrics.

Полученные штаммы Ogataea haglerorum N388 ВКПМ Y-4980 и Ogataea haglerorum N404 ВКПМ Y-5018 продуцируют термостабильную α-амилазу в колбах в богатой среде с активностью в среднем, соответственно, 2250 ед./мл КЖ и 2350 ед./мл КЖ через 144 ч культивирования, что значительно выше показателей трансформантов дрожжей P. pastoris GS115, синтезирующих в колбах в богатой среде α-амилазу из В. licheniformis с активностью 420 ед./мл через 144 ч культивирования [BioMed Research International, 2015, Article ID 248680, 9 P. http://dx.doi.org/10.1155/2015/248680] или α-амилазу из В. licheniformis WX-02 с активностью 900 ед./мл через 168 ч культивирования [3 Biotech, 2019, 9, 427. https://doi.org/10.1007/s13205-019-1943-x].The obtained strains Ogataea haglerorum N388 VKPM Y-4980 and Ogataea haglerorum N404 VKPM Y-5018 produce thermostable α-amylase in flasks in a rich medium with an average activity of 2250 U/ml QOL and 2350 U/ml QOL after 144 h, respectively. cultivation, which is significantly higher than the parameters of P. pastoris GS115 yeast transformants synthesizing α-amylase from B. licheniformis in flasks in a rich medium with an activity of 420 units/ml after 144 hours of cultivation [BioMed Research International, 2015, Article ID 248680, 9 P . http://dx.doi.org/10.1155/2015/248680] or α-amylase from B. licheniformis WX-02 with an activity of 900 units/ml after 168 hours of cultivation [3 Biotech, 2019, 9, 427. https ://doi.org/10.1007/s13205-019-1943-x].

Штамм Ogataea haglerorum N404 ВКПМ Y-5018 в отличие от Ogataea haglerorum N388 ВКПМ Y-4980 не содержит маркер устойчивости к генетицину (G418), что дает ему преимущество при использовании в промышленности. После культивирования бесклеточную КЖ используют для выделения и очистки фермента, а клеточную биомассу утилизируют, и устойчивость штаммов к антибиотикам - это серьезная угроза для экологии и для здравоохранения. Получение антибиотикочувствительных штаммов является важной мерой по профилактике и контролю распространения резистентности в окружающей среде, решению проблемы утилизации устойчивых к антибиотикам штаммов.The strain Ogataea haglerorum N404 VKPM Y-5018, unlike Ogataea haglerorum N388 VKPM Y-4980, does not contain a marker of resistance to geneticin (G418), which gives it an advantage when used in industry. After cultivation, cell-free CL is used to isolate and purify the enzyme, and the cell biomass is utilized, and the resistance of strains to antibiotics is a serious threat to the environment and health. Obtaining antibiotic-susceptible strains is an important measure to prevent and control the spread of resistance in the environment, to solve the problem of utilization of antibiotic-resistant strains.

--->--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing <!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru" <ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" fileName="Yeast nonEnglishFreeTextLanguageCode="en" dtdVersion="V1_3" fileName="Yeast

transformant Ogataea haglerorum-producer of thermostable transformant Ogataea haglerorum-producer of thermostable

alpha-amylase.xml" softwareName="WIPO Sequence" alpha-amylase.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-09-20">softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-09-20">

<ApplicationIdentification> <ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode> <IPOfficeCode>EN</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022119881/20(041870)</ApplicationNumberText> <ApplicationNumberText>2022119881/20(041870)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-07-20</FilingDate> <FilingDate>2022-07-20</FilingDate>

</ApplicationIdentification> </ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Национальный исследовательский <ApplicantName languageCode="en">National Research

центр &quot;Курчатовский институт&quot;</ApplicantName>Center &quot;Kurchatov Institute&quot;</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>National Research Centre &quot;Kurchatov <ApplicantNameLatin>National Research Center &quot;Kurchatov

Institute&quot;</ApplicantNameLatin>Institute&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Трансформант дрожжей Ogataea <InventionTitle languageCode="en">Ogataea yeast transform

haglerorum-продуцент термостабильной альфа-амилазы.</InventionTitle>haglerorum is a thermostable alpha-amylase producer.</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity> <SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1"> <SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>1467</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>1467</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1467</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..1467</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>

<INSDQualifier> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1"> <INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDQualifier>

</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>

</INSDFeature> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>attactaaaacttctgccgttaatggtactttgatgcagtactttgaat <INSDSeq_sequence>attactaaaacttctgccgttaatggtactttgatgcagtactttgaat

ggtatactcctaacgacggtcaacactggaaaagattgcagaatgatgctgaacacttgtctgatatcggggtatactcctaacgacggtcaacactggaaaagattgcagaatgatgctgaacacttgtctgatatcgg

tattactgccgtttggattccaccagcttacaagggaacttctcaagctgatgttggttacggtgcttactattactgccgtttggattccaccagcttacaagggaacttctcaagctgatgttggttacggtgcttac

gacttgtatgatttgggtgagtttcaccaaaaaggtactgttagaaccaagtacggtactaaaggagagtgacttgtatgatttgggtgagtttcaccaaaaaggtactgttagaaccaagtacggtactaaaggagagt

tgcaatctgctatcaaatctttgcactccagagacattaacgtttacggtgatgttgtcatcaaccacaatgcaatctgctatcaaatctttgcactccagagacattaacgtttacggtgatgttgtcatcaaccacaa

aggtggtgctgatgctaccgaagatgttactgctgttgaagtcgatccagctgacagaaacagagttattaggtggtgctgatgctaccgaagatgttactgctgttgaagtcgatccagctgacagaaacagagttatt

tctggagaacacttgattaaagcctggacccactttcactttccaggaagaggatctacttactccgatttctggagaacacttgattaaagcctggacccactttcactttcggaagaggatctacttactccgatt

ttaaatggtactggtatcactttgacggaaccgattgggacgagtccagaaagttgaacagaatctataattaaatggtactggtatcactttgacggaaccgattgggacgagtccagaaagttgaacagaatctataa

gtttcaaggaaagacctgggattgggaagtttccaatgaatttggtaactacgactatttgatgtatgccgtttcaaggaaagacctgggattgggaagtttccaatgaatttggtaactacgactatttgatgtatgcc

gacatcgattatgaccaccctgatgtcgttgcagaaattaagagatggggtacttggtatgccaatgaatgacatcgattatgaccaccctgatgtcgttgcagaaattaagagatggggtacttggtatgccaatgaat

tgcaattggacggtttcagattggatgctgtcaaacacattaaattttcttttttgagagattgggttaatgcaattggacggtttcagattggatgctgtcaaacacattaaattttcttttttgagagattgggttaa

ccacgtcagagagaaaactggtaaggaaatgtttactgttgctgaatattggtctaatgacttgggtgccccacgtcagagagaaaactggtaaggaaatgtttactgttgctgaatattggtctaatgacttgggtgcc

ttggaaaactacttgaacaaaaccaactttaatcactctgtctttgacgttccattgcactatcagttccttggaaaactacttgaacaaaaccaactttaatcactctgtctttgacgttccattgcactatcagttcc

acgctgcatctactcagggaggtggttacgatatgagaaaattgttgaacggtactgtcgtttccaagcaacgctgcatctactcagggaggtggttacgatatgagaaaattgttgaacggtactgtcgtttccaagca

cccattgaaatctgttacctttgtcgataaccacgatacccagccaggacaatctttggagtccactgtccccattgaaatctgttacctttgtcgataaccacgatacccagccaggacaatctttggagtccactgtc

caaacctggtttaagccattggcttacgccttcattttgaccagagagtctggataccctcaggttttctcaaacctggtttaagccattggcttacgccttcattttgaccagagagtctggataccctcaggttttct

acggtgatatgtacggtactaaaggagactcccagagagaaattcctgccttgaaacacaaaattgaaccacggtgatatgtacggtactaaaggagactcccagagagaaattcctgccttgaaacacaaaattgaacc

tatcttgaaagctagaaaacagtatgcttacggagcacagcacgattacttcgaccaccacgacattgtctatcttgaaagctagaaaacagtatgcttacggagcacagcacgattacttcgaccaccacgacattgtc

ggttggactagagaaggtgactcttccgttgctaattccggtttggctgccttgattactgacggaccagggttggactagaagaaggtgactcttccgttgctaattccggtttggctgccttgattactgacggaccag

gtggagctaagagaatgtacgtcggtagacaaaacgccggtgagacttggcacgacattaccggaaacaggtggagctaagagaatgtacgtcggtagacaaaacgccggtgagacttggcacgacattaccggaaacag

atccgagccagttgtcatcaactctgaaggatggggagagtttcacgtcaacggtggatctgtttccattatccgagccagttgtcatcaactctgaaggatggggagagtttcacgtcaacggtggatctgtttccatt

tacgttcaaagatagtaa</INSDSeq_sequence>tacgttcaaagatagtaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </INSDSeq>

</SequenceData> </SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2"> <SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq> <INSDSeq>

<INSDSeq_length>273</INSDSeq_length> <INSDSeq_length>273</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype> <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division> <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table> <INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature> <INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key> <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..273</INSDFeature_location> <INSDFeature_location>1..273</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals> <INSDFeature_quals>

<INSDQualifier> <INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2"> <INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name> <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value> <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier> </INSDQualifier>

</INSDFeature_quals> </INSDFeature_quals>

</INSDFeature> </INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table> </INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgagatttccttcgatttttaccgcagttctgttcgcagcatcctccg <INSDSeq_sequence>atgagatttccttcgatttttaccgcagttctgttcgcagcatcctccg

cattggctgctccagtcaacactaccacagaagatgaaaccgcacaaattccggctgaagctgtcatcggcattggctgctccagtcaacactaccacagaagatgaaaccgcacaaattccggctgaagctgtcatcgg

ttactcggatctggaaggcgatttcgatgttgctgttttgccattttccaactcgaccaataacggactgttactcggatctggaaggcgatttcgatgttgctgttttgccattttccaactcgaccaataacggactg

ttgtttatcaatactaccattgcctcgattgctgctaaggaagaaggcgtgtctctggagaagagagaggttgtttatcaatactaccattgcctcgattgctgctaaggaagaaggcgtgtctctggagaagagagagg

ctgaagcttacgta</INSDSeq_sequence>ctgaagcttacgta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq> </INSDSeq>

</SequenceData> </SequenceData>

</ST26SequenceListing></ST26SequenceListing>

<---<---

Claims (3)

1. Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, содержащий в составе хромосомы оптимизированный синтетический ген, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, продуцирующий термостабильную α-амилазу.1. Ogataea haglerorum yeast transformant containing an optimized synthetic gene in the chromosome, the nucleotide sequence of which is shown in the sequence listing under the number SEQ ID NO:1, producing thermostable α-amylase. 2. Штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-4980, устойчивый к генетицину - продуцент термостабильной α-амилазы.2. Strain Ogataea haglerorum VKPM Y-4980, resistant to geneticin - producer of thermostable α-amylase. 3. Штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-5018, чувствительный к генетицину - продуцент термостабильной α-амилазы.3. Strain Ogataea haglerorum VKPM Y-5018, sensitive to geneticin - producer of thermostable α-amylase.

Images