RU2701494C1 - Recombinant yeast strain pichia pastoris - producer of beta-glucanase - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to microbiology and biotechnology. Disclosed is a recombinant yeast strain Pichia pastoris VKPM Y-4463, producing β-glucanase. Said strain contains bgl gene coding endo-β-1,3(4)-D-glucanase from Bacillus pumilus.

EFFECT: strain produces β-glucanase in amount of 618 units/ml of culture fluid.

1 cl, 2 dwg, 2 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штамма дрожжей Pichia pastoris, способного продуцировать бета-глюканазу (β-глюканазу).The invention relates to microbiology and biotechnology and relates to the production of a strain of the yeast Pichia pastoris, capable of producing beta-glucanase (β-glucanase).

β-глюканы представляют собой семейство полисахаридов, состоящих из мономеров D-глюкозы, соединенных посредством β-гликозидных связей и являются естественным компонентом клеточных стенок бактерий, грибов, дрожжей или злаков, таких как овес или ячмень. β-глюканы различного происхождения различаются структурой, уровнем разветвления и молекулярной массой, а также физико-химическими свойствами.β-glucans are a family of polysaccharides consisting of D-glucose monomers linked via β-glycosidic bonds and are a natural component of the cell walls of bacteria, fungi, yeast or cereals, such as oats or barley. β-glucans of various origins differ in structure, branching level and molecular weight, as well as physicochemical properties.

β- глюканазы - группа ферментов, катализирующих расщепление β-глюканов с β-1,2-, β-1,3-, β-1,4- и β-1,6-связями.β-glucanase is a group of enzymes that catalyze the cleavage of β-glucans with β-1,2-, β-1,3-, β-1,4- and β-1,6-bonds.

Важное значение среди ферментов, относящихся к этой группе имеют β-1,3-1,4-глюканазы, которые находят широкое применение, в частности, при производстве пищевых добавок [FEBS Lett., 1975, 52, 202-207], где их используют в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных с однокамерным желудком.Of great importance among the enzymes belonging to this group are β-1,3-1,4-glucanases, which are widely used, in particular, in the production of food additives [FEBS Lett., 1975, 52, 202-207], where used as an additive to the feed of farm animals with a single chamber stomach.

Корм для домашних животных, смешанный с ферментами β-1,3-1,4-глюканазы и ксиланазы, усиливает увеличение веса, потребление корма и усвояемость азота (+5,6%) и липидов (+6,2%), а также уменьшает образование липкого помета, что существенно уменьшает санитарные проблемы [Trends in Biotechnology, 1993, 11 (10), 424-430].Pet food mixed with β-1,3-1,4-glucanase and xylanase enzymes enhances weight gain, feed intake and digestibility of nitrogen (+ 5.6%) and lipids (+ 6.2%), as well as reduces the formation of sticky droppings, which significantly reduces sanitary problems [Trends in Biotechnology, 1993, 11 (10), 424-430].

Природными источниками β-глюканаз являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи и актиномицетыThe natural sources of β-glucanases are various microorganisms: bacteria, fungi, yeast and actinomycetes

Большинство кормовых ферментных препаратов, в состав которых входят β-глюканазы, имеют грибное происхождение. Однако, большой интерес представляет разработка рекомбинантных продуцентов ферментов на основе дрожжей, поскольку они более удобны для проведения генно-инженерных работ и быстрее накапливают целевой фермент в сравнении с грибными продуцентами.Most feed enzyme preparations, which include β-glucanases, are of fungal origin. However, the development of recombinant producers of yeast-based enzymes is of great interest, since they are more convenient for genetic engineering work and accumulate the target enzyme faster than mushroom producers.

Существенным преимуществом дрожжевых продуцентов является также то, что на их основе значительно легче создавать продуценты моноферментов, тогда как грибные продуценты обычно синтезируют комплексы целлюлитических ферментов. Промышленное получение моноферментов позволяет более эффективно решать задачи составления оптимальной композиции ферментов при использовании различных субстратов.A significant advantage of yeast producers is also that it is much easier to create mono-enzyme producers on their basis, while mushroom producers usually synthesize complexes of cellulitic enzymes. The industrial production of monozymes allows one to more efficiently solve the problem of compiling the optimal composition of enzymes using various substrates.

В настоящее время наиболее перспективным является создание продуцентов на основе рекомбинантных штаммов метилотрофных дрожжей рода Pichia, Komagataella или Hansenula [J Ind Microbiol Biotechnol 2009, 36: 1435-1438],Currently, the most promising is the creation of producers based on recombinant strains of methylotrophic yeast of the genus Pichia, Komagataella or Hansenula [J Ind Microbiol Biotechnol 2009, 36: 1435-1438],

Использование метилотрофных дрожжей позволяет достичь высоких скоростей экспрессии гетерологичных белков с высокой плотностью клеток, а также высокого уровня и качества N-гликозилирования белков.The use of methylotrophic yeast allows one to achieve high expression rates of heterologous proteins with a high cell density, as well as a high level and quality of N-glycosylation of proteins.

Особенно часто для высокоуровневой экспрессии геретологичных белков используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [FEMS Microbiol.Rev., 2000, 24,45-66].Especially often, methylotrophic yeast Pichia pastoris is used for high-level expression of hertologous proteins [FEMS Microbiol.Rev., 2000, 24.45-66].

Показано [J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2012 39(6), 869-876], что ген bgl16C1 из Penicillium pinophilum, кодирующий эндо-1,3(4)-β-D-глюканазу, эффективно экспрессируется в клетках дрожжей Pichia pastoris, при этом активность рекомбинантной бета-глюканазы в культуральной жидкости при культивировании в 15-литровом ферментере составляет 28721 ед/мг.Shown [J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2012 39 (6), 869-876] that the bgl16C1 gene from Penicillium pinophilum encoding endo-1,3 (4) -β-D-glucanase is efficiently expressed in Pichia pastoris yeast cells, while the activity of recombinant beta -glucanase in the culture fluid when cultured in a 15-liter fermenter is 28721 units / mg

Известны также рекомбинантные штаммы Pichia pastoris, продуцирующие термостабильную β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus amyloliquefaciens. [CN101899458]Also known are recombinant strains of Pichia pastoris producing thermostable β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus amyloliquefaciens. [CN101899458]

В работе [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22] описан ген bgl из Bacillus pumilus, кодирующий бета-глюканазу, относящуюся к классу эндо-β-1,3(4)-D-глюканаз (Е.С. 3.2.1.6).In [Biotechnology, 2018, T. 34, No. 5, P. 12-22], the bgl gene from Bacillus pumilus is described, encoding beta-glucanase belonging to the class of endo-β-1,3 (4) -D-glucanases ( E.S. 3.2.1.6).

Поскольку гены β-глюканаз различного происхождения экспрессируются в дрожжах Pichia pastoris с различной эффективностью [Биотехнология, 2018, 34(4), 26-36], для конструирования эффективных продуцентов важным является выбор генов, кодирующих β-глюканазу и эффективно работающих в дрожжах Pichia pastoris.Since β-glucanase genes of different origin are expressed in Pichia pastoris yeast with different efficiency [Biotechnology, 2018, 34 (4), 26-36], it is important to select β-glucanase-coding genes that work efficiently in Pichia pastoris yeast to construct effective producers .

Для создания промышленно значимых продуцентов ведут поиск новых высокоактивных β-глюканаз, обладающих свойствами, необходимыми для их индустриального использования и способных эффективно выражаться в дрожжах.In order to create industrially significant producers, they are searching for new highly active β-glucanases that possess the properties necessary for their industrial use and that can efficiently express themselves in yeast.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-глюканазу.The task of the invention is to expand the arsenal of recombinant microorganisms producing β-glucanase.

Задача решена путем получения рекомбинантного штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4463, продуцирующего β-глюканазу, содержащего ген bgl, кодирующий эндо-β-1,3(4)-D-глюканазу из Bacillus pumilus.The problem was solved by obtaining a recombinant strain of yeast Pichia pastoris VKPM Y-4463 producing β-glucanase containing the bgl gene encoding endo-β-1,3 (4) -D-glucanase from Bacillus pumilus.

Заявляемый рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris получен путем интеграции в состав хромосомы штамма дрожжей Pichia pastoris (His4^-) экспрессионной кассеты, в состав которой входит ген bgl из Bacillus pumilus.The inventive recombinant strain of Pichia pastoris yeast is obtained by integration into the chromosome of the strain of Pichia pastoris yeast (His4 ^- ) expression cassette, which contains the bgl gene from Bacillus pumilus.

Штамм является продуцентом эндо-β-1,3(4)-D-глюканазы и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Pichia pastoris ВКПМ Y-4463.The strain is a producer of endo-β-1,3 (4) -D-glucanase and deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) SIC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika as Pichia pastoris VKPM Y-4463.

Культурально-морфологические характеристики полученного штамма:Cultural and morphological characteristics of the obtained strain:

При культивировании при температуре 28°C в течение 48 часов на агаризованной среде YP состава (мас. %: пептон-2, дрожжевой экстракт - 1, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.When cultured at a temperature of 28 ° C for 48 hours on an agarized YP medium of the composition (wt.%: Peptone-2, yeast extract - 1, agar - 2, water - the rest) with the addition of glucose (2 wt.%), The cells have oval, 3-4 microns in diameter. Cells are budded, while budding is true, versatile. True mycelium is not formed.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспора.Sporulation occurs when the culture is incubated on an agar medium of the following composition (wt.%): Potassium chloride - 1.0, sodium acetate - 0.5, glucose - 1.0, agar - 2.0, water - the rest. Askeys have a tetrahedral shape, include 4 ascospores.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.On a YP agar medium supplemented with glucose (2 wt.%), The colonies are light beige with a smooth edge, a matte surface, a lenticular profile and a pasty consistency.

При росте в жидкой среде YP (мас. %: пептон-2, дрожжевой экстракт-1, вода - остальное) с добавлением глюкозы (мас.2%) при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.When growing in a liquid medium YP (wt.%: Peptone-2, yeast extract-1, water - the rest) with the addition of glucose (wt. 2%) at 28 ° C for 24 hours of cultivation, the liquid is cloudy, the precipitate is white, coagulation not observed, does not form parietal films.

Физиолого-биохимические признаки полученного штамма:Physiological and biochemical characteristics of the obtained strain:

Штамм способен к росту, как в аэробных, так и в анаэробных условиях.The strain is capable of growth, both under aerobic and anaerobic conditions.

В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.It is capable of using methanol, ethanol, glucose, glycerin, lactate, succinate as the sole carbon source; it is not able to assimilate maltose, sucrose, acetate, starch, and lactose.

При культивировании в присутствии метанола штамм способен синтезировать β-глюканазу.When cultured in the presence of methanol, the strain is able to synthesize β-glucanase.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами.The invention is illustrated by the following figures.

Фиг. 1. Экспрессионная кассета 1FIG. 1. Expression cassette 1

Фиг. 2 Электрофорез гена bgl Bacillus pumilusFIG. 2 Electrophoresis of the bgl Bacillus pumilus gene

Изобретение подтверждено следующими примерами.The invention is confirmed by the following examples.

Пример 1. Конструирование штамма дрожжей Pichia pastoris, несущего ген bgl из Bacillus pumilusExample 1. Construction of a yeast strain Pichia pastoris carrying the bgl gene from Bacillus pumilus

Получают плазмидный вектор pPIC-bglPum, содержащий интегративную экспрессионную кассету.The plasmid vector pPIC-bglPum containing the integrative expression cassette is obtained.

В качестве источника гена bgl используют тотальную геномную ДНК штамма Bacillus pumilus Bg57 ВКПМ В-13195. [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22] Синтезируют ДНК гена bgl методом ПЦР с использованием праймеров bgl-pum-1 и bgl-pum-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции для клонирования - EcoRI и NotI, соответственно:The total genomic DNA of the strain Bacillus pumilus Bg57 VKPM B-13195 is used as the source of the bgl gene. [Biotechnology, 2018, T. 34, No. 5, P. 12-22] Synthesis of the bgl gene DNA by PCR using bgl-pum-1 and bgl-pum-2 primers containing restriction sites at the 5'-ends for cloning EcoRI and NotI, respectively:

bgl-pum-1 5'-aagaattccaaacgggcgggtcgttttatga-3'bgl-pum-1 5'-aagaattccaaacgggcgggtcgttttatga-3 '

bgl-pum-2 5'- aagcggccgcttatctttttgtgtaacgca-3'bgl-pum-2 5'- aagcggccgcttatctttttgtgtaacgca-3 '

Полученный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и NotI и клонируют в состав экспрессионного вектора pPIC9The resulting DNA fragment is treated with restriction enzymes EcoRI and NotI and cloned into the expression vector pPIC9

(http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520).(http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/V17520).

В состав экспрессионного плазмидного вектора pPIC-bglPum входят следующие генетические элементы:The composition of the expression plasmid vector pPIC-bglPum includes the following genetic elements:

1. Ген bgl_Bacillus pumilus, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем AOX1 промотора1. The bgl_Bacillus pumilus gene, integrated into a single reading frame with the nucleotide sequence of the α-factor signal peptide, under the control of the AOX1 promoter

2. Терминатор транскрипции TTAOX12. TTAOX1 transcription terminator

3. Дрожжевой селективный маркер His43. Yeast selective marker His4

4. Область интеграции - нуклеотидная последовательность гена АОХ14. The area of integration is the nucleotide sequence of the AOX1 gene

5. Селективный маркер для клеток Е.coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.5. A selective marker for E. coli cells is the bla gene, which encodes β-lactamase, which confers ampicillin resistance to cells.

6. Бактериальный pUC origin.6. Bacterial pUC origin.

Для получения интегративной экспрессионной кассеты 1 (фиг. 1) плазмиду pPIC-bglPum обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII.To obtain the integrative expression cassette 1 (Fig. 1), the plasmid pPIC-bglPum is treated with BglII restriction endonuclease.

Полученную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в клетки штамма Pichia pastoris (His4^-), которые предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP с добавлением глюкозы (мас. 2 %) до концентрации 1×10⁸ клеток на 1 мл. Клетки центрифугируют, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Промытые клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут, затем промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10⁹ клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.The resulting integrative expression cassette was transformed into cells of the Pichia pastoris strain (His4 ^- ), which were previously grown in YP liquid medium supplemented with glucose (wt. 2%) to a concentration of 1 × 10 ⁸ cells per 1 ml. The cells are centrifuged, washed in ice-cold sterile water, and then in an ice-cold solution of 1M sorbitol. The washed cells are incubated in a 25 mM dithiothreitol solution for 15 minutes, then washed in an ice-cold solution of 1 M sorbitol. The cells thus treated are resuspended in an ice-cold solution of 1 M sorbitol at a concentration of 1-5 × 10 ⁹ cells per ml. An aliquot of 40 μl of the cell suspension was transferred to chilled eppendorf, 400 ng of DNA of the expression integration cassette was added, and incubated in ice for 5 minutes. The mixture of cells and DNA is transferred to a pre-cooled cell for electroporation. Electroporation is carried out under the following conditions: 1.5 kV, 400 Ohms, 25uF. After poreing, add 1 ml of ice-cold 1M sorbitol solution.

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YNB (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 суток при температуре 30°С.The transformants are selected on YNB agar medium (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, India) with the addition of glucose (2 wt.%) For 5 days at a temperature of 30 ° C.

Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде YP с добавлением метанола (3 мас. %) в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 72 ч на качалке (250 об/мин). В качестве контроля используют штамм Pichia pastoris (His4^-)To select the most productive transformants, they are cultured in a YP liquid fermentation medium supplemented with methanol (3 wt.%) In 96-well plates at 30 ° C for 72 hours on a shaker (250 rpm). As a control, a strain of Pichia pastoris (His4 ^- ) is used

Определение активности β-глюканазы в культуральной жидкости проводят с использованием ДНС метода [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом. В каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата β-глюкана ячменя в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.The determination of β-glucanase activity in the culture fluid is carried out using the DNS method [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] in a 96-well plate as follows. 25 μl of a 1% solution of barley β-glucan substrate in 0.5 M acetate buffer (pH 6) and 25 μl of culture fluid are mixed in each well. Incubation is carried out at 50 ° C for 10 minutes, after which 50 μl of a DNS solution is added to the well. The tablet is heated at 99 ° C for 10 minutes and the absorbance of the colored solution is measured at a wavelength of 546 nm. A glucose solution is used as a standard.

По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант №123, который при культивировании в планшете синтезирует β-глюканазу в количестве 118 ед/мл культуральной жидкости. Трансформант депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Pichia pastoris_ВКПМ Y-4463.According to the fermentation results, the most productive transformant No. 123 is selected, which, when cultured in a plate, synthesizes β-glucanase in the amount of 118 units / ml of culture fluid. The transformant was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) SIC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetika as Pichia pastoris_VKPM Y-4463.

Для подтверждения наличия в хромосоме штамма вставки гена bgl Bacillus pumilus методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют хромосомальную ДНК, выделенную из клеток штамма Pichia pastoris_ВКПМ Y-4463 и специфические праймеры BglPum-f и BglPum-rTo confirm the presence of the bgl Bacillus pumilus bgl gene insertion method in the chromosome by polymerase chain reaction (PCR), chromosomal DNA isolated from cells of the Pichia pastoris_VKPM strain Y-4463 and specific primers BglPum-f and BglPum-r are used

BglPum -f 5'-ggttatgtgttctgggaacctc-3',BglPum -f 5'-ggttatgtgttctgggaacctc-3 ',

BglPum-r 5'-ttatctttttgtgtaacgca-3'BglPum-r 5'-ttatctttttgtgtaacgca-3 '

Режим реакции ПЦР:PCR reaction mode:

95°С - 3 мин - 1 цикл95 ° C - 3 min - 1 cycle

30 циклов:30 cycles:

95°С - 30 сек.95 ° C - 30 sec.

60°С - 30 сек.60 ° С - 30 sec.

72°С - 60 сек.72 ° C - 60 sec.

72°С - 5 мин. - 1 цикл72 ° C - 5 min. - 1 cycle

Для контроля величины амплифицированного фрагмента ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) (линия 2, фиг. 2, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.). Наработка фрагмента ДНК размером 642 п.н. (линия 1 фиг. 2) свидетельствует о присутствии в хромосоме штамма вставки гена bgl Bacillus pumilusTo control the magnitude of the amplified DNA fragment during electrophoresis, the molecular marker GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) was used (line 2, Fig. 2, the size of the fragments from the bottom up 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500 , 1000, 750, 500, 250 bp). 642 bp DNA fragment production (line 1 of Fig. 2) indicates the presence of a bacillus pumilus bgl gene insertion strain on the chromosome

Пример 2. Продукция фермента β-глюканазы заявляемым штаммом Pichia pastoris ВКПМ Y-4463Example 2. Production of the enzyme β-glucanase of the claimed strain of Pichia pastoris VKPM Y-4463

Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.The seed culture is grown in test tubes (50 ml) with 10 ml of YP liquid nutrient medium with the addition of glucose (2 wt.%) At 30 ° C for 24 hours on a shaker (250 rpm). Sowing the fermentation medium is carried out in a ratio of 1/10.

Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 0,5, пептон - 1, вода - остальное с добавлением глюкозы (1 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Через 18 часов добавляют метанол (1 мас. %) Ферментацию продолжают в течение 72 часов, добавляя метанол (1 мас. %) через каждые 24 часа. После окончания ферментации определяют количество фермента β-глюканазы в культуральной жидкости с использованием ДНС метода.Fermentation is carried out at 30 ° C on a shaker (250 rpm) in a nutrient medium composition (wt.%): Yeast extract - 0.5, peptone - 1, water - the rest with the addition of glucose (1 wt.%) In test tubes ( 50 ml) with a working volume of 5 ml. After 18 hours, methanol (1 wt.%) Was added. Fermentation was continued for 72 hours, adding methanol (1 wt.%) Every 24 hours. After fermentation is completed, the amount of β-glucanase enzyme in the culture fluid is determined using the DNS method.

Через 72 часа ферментации количество фермента составило 618 ед/мл культуральной жидкости.After 72 hours of fermentation, the amount of enzyme was 618 u / ml of culture fluid.

Claims (1)

Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4463, содержащий ген bgl, кодирующий эндо-β-1,3(4)-D-глюканазу из Bacillus pumilus - продуцент β-глюканазы.Recombinant yeast strain Pichia pastoris VKPM Y-4463 containing the bgl gene encoding endo-β-1,3 (4) -D-glucanase from Bacillus pumilus - producer of β-glucanase.

Images