RU2795449C1 - New depsipeptide compounds with antibacterial activity - Google Patents
New depsipeptide compounds with antibacterial activity Download PDFInfo
- Publication number
- RU2795449C1 RU2795449C1 RU2022119467A RU2022119467A RU2795449C1 RU 2795449 C1 RU2795449 C1 RU 2795449C1 RU 2022119467 A RU2022119467 A RU 2022119467A RU 2022119467 A RU2022119467 A RU 2022119467A RU 2795449 C1 RU2795449 C1 RU 2795449C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibacterial
- compounds
- agents
- new
- antibacterial activity
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к новым антибактериальным депсипептидным соединениям и может быть использовано для создания средств для лечения микробных инфекций человека и животных.The present invention relates to new antibacterial depsipeptide compounds and can be used to create agents for the treatment of microbial infections in humans and animals.
Уровень техникиState of the art
Человек и животные часто подвергаются заражению микробными агентами, в том числе такими, как Streptococcus spp.; Arthrobacter spp.; Mycobacterium spp., Micrococcus spp.Humans and animals are often exposed to microbial agents, including Streptococcus spp.; Arthrobacter spp.; Mycobacterium spp., Micrococcus spp.
Основные группы антибиотиков, применяемых в лечении стрептококковых инфекций (бактериями Streptococcus spp.), - это пенициллины, цефалоспорины, макролиды и гликозамиды [https://medvestnik.ru/content/articles/Opublikovan-Kokreinovskii-obzor-sravneniya-antibiotikov-pri-streptokokkovoi-infekcii.html]. Пенициллин может быть препаратом выбора как при легкой, так и при тяжелой форме заболевания. Для пациентов с аллергией на пенициллин можно использовать эритромицин.The main groups of antibiotics used in the treatment of streptococcal infections (with Streptococcus spp. bacteria) are penicillins, cephalosporins, macrolides and glycosamides [https://medvestnik.ru/content/articles/Opublikovan-Kokreinovskii-obzor-sravneniya-antibiotikov-pri- streptokokkovoi-infekcii.html]. Penicillin may be the drug of choice for both mild and severe disease. For patients allergic to penicillin, erythromycin can be used.
Наиболее широко используемыми химиотерапевтическими агентами, применяемыми против Mycobacterium spp., являются антибиотики кларитромицин, азитромицин, рифампицин, рифабутин, этамбутол, стрептомицин и амикацин.The most widely used chemotherapeutic agents used against Mycobacterium spp. are the antibiotics clarithromycin, azithromycin, rifampicin, rifabutin, ethambutol, streptomycin and amikacin.
Одной из групп соединений, активных против указанных микроорганизмов, являются депсипептиды (ДП) - пептиды, в которых одна или более амидных групп замещены сложноэфирными группами. ДП относятся к нерибосомальным пептидам, которые синтезируются с помощью ферментных комплексов пептид-синтетаз, состоящих из повторяющихся доменов с модульной организацией для активации и связывания аминокислот. Основными продуцентами природных ДП являются почвенные бактерии, морские организмы и грибы.One of the groups of compounds active against these microorganisms are depsipeptides (DP) - peptides in which one or more amide groups are replaced by ester groups. DPs are nonribosomal peptides that are synthesized by enzymatic complexes of peptide synthetases consisting of repeating domains with a modular organization for activation and binding of amino acids. The main producers of natural DPs are soil bacteria, marine organisms, and fungi.
Эти соединения могут обладать антибактериальной, иммуномодулирующей, противоопухолевой активностью, а также эффективны против различных микроорганизмов и гельминтов.These compounds may have antibacterial, immunomodulatory, antitumor activity, and are also effective against various microorganisms and helminths.
Так, из уровня техники известны соединения, относящиеся к депсипептидам, обладающие противогельминтной активностью (патент RU 2715556 С2 опубл. 02.03.2020). Известно применение депсипептидов при лечении грибковых инфекций (патент RU 2745671 С2, опубл. 30.03.2021).Thus, compounds related to depsipeptides with anthelmintic activity are known from the prior art (patent RU 2715556 C2 publ. 02.03.2020). The use of depsipeptides in the treatment of fungal infections is known (patent RU 2745671 C2, publ. 30.03.2021).
Циклический депсипептид - даптомицин - пройдя все стадии изучения, зарегистрирован как антибактериальный лекарственный препарат [Tedesco KL, Rybak MJ. Daptomycin. Pharmacotherapy. 2004 Jan;24(l):41-57. Review.]. Он был выделен из культуральной жидкости бактерии Streptomyces roseosporus как самый активный компонент смеси соединений с 13-членным аминокислотным циклом. Даптомицин проявлял высокую активность in vitro против грамположительных бактерий - энтерококков, включая устойчивые к ванкомицину (VRE), стафилококков, включая устойчивые к метициллину (MRSA), стрептококков и коринебактерий. Даптомицин в настоящее время активно применяется как препарат для лечения различных инфекций [Patel S, Saw S. Daptomycin. 2020 Apr 13. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan-. Available from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470407]. Состав лекарственной формы препарата даптомицина для инъекций совершенствуется, с тем чтобы улучшить его стабильность и скорость растворения, сохраняя при этом ту же эффективность [Frankenfeld С, Mittal S, Melendez Y, Mendez-Vigo L, Lamp KC, Keller KN, Bertolami SR. Daptomycin: a comparison of two intravenous formulations. Drug Des Devel Ther. 2018 Jun 29;12:1953-1958].Cyclic depsipeptide - daptomycin - having passed all the stages of study, registered as an antibacterial drug [Tedesco KL, Rybak MJ. Daptomycin. pharmaceutical therapy. 2004 Jan;24(l):41-57. Review.]. It was isolated from the culture liquid of the bacterium Streptomyces roseosporus as the most active component of a mixture of compounds with a 13-membered amino acid cycle. Daptomycin showed high activity in vitro against gram-positive bacteria - enterococci, including vancomycin-resistant (VRE), staphylococci, including methicillin-resistant (MRSA), streptococci and corynebacteria. Daptomycin is currently actively used as a drug for the treatment of various infections [Patel S, Saw S. Daptomycin. 2020 Apr 13. StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan-. Available from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470407]. The formulation of the daptomycin injection formulation has been improved in order to improve its stability and dissolution rate while maintaining the same efficacy [Frankenfeld C, Mittal S, Melendez Y, Mendez-Vigo L, Lamp KC, Keller KN, Bertolami SR. Daptomycin: a comparison of two intravenous formulations. Drug Des Devel Ther. 2018 Jun 29;12:1953-1958].
Известно изобретение, относящееся к улучшению способа очистки даптомицина (патент RU 2348647 С2, опубл. 10.03.2009). Усовершенствованный способ применения липопептидных антибиотиков, в частности даптомицина, бактерий, включая штаммы, устойчивые к действию других антибиотиков, представлен в патенте RU2363489C9, опубл. 2010-03-20).An invention is known relating to the improvement of the purification method of daptomycin (patent RU 2348647 C2, publ. 10.03.2009). An improved method of using lipopeptide antibiotics, in particular daptomycin, bacteria, including strains resistant to other antibiotics, is presented in patent RU2363489C9, publ. 2010-03-20).
Известны и другие депсипептидные соединения, обладающие антибактериальным действием, однако, часть из них по своим свойствам не удовлетворяют требованиям для получения на их основе лекарственных препаратов. Это такие соединения, как энниатины [Sy-Cordero АА, Реагсе CJ, Oberlies NH. Revisiting the enniatins: a review of their isolation, biosynthesis, structure determination and biological activities. J Antibiot (Tokyo). 2012 Nov;65(11):541-9.], боверицин [Wang Q, Xu L. Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: a short review. Molecules. 2012 Feb 24;17(3):2367-77], рамопланин A2 [Farver DK, Hedge DD, Lee SC. Ramoplanin: a lipoglycodepsipeptide antibiotic. Ann Pharmacother. 2005 May;39(5):863-8.], фузарицидины [Reimann M, Sandjo LP, Antelo L, Thines E, Siepe I, Opatz Т. A new member of the fusaricidin family - structure elucidation and synthesis of fusaricidin E. Beilstein J Org Chem. 2017 Jul 20;13:1430-1438], ацилдепсипептиды [Li Y, Lavey NP, Coker JA, Knobbe JE, Truong DC, Yu H, Lin YS, Nimmo SL,Duerfeldt AS. Consequences of Depsipeptide Substitution on the ClpP Activation Activity of Antibacterial Acyldepsipeptides. ACS Med Chem Lett. 2017 Oct 19;8(11):1171-1176. doi:10.1021/acsmedchemlett.7b00320.].Other depsipeptide compounds are also known that have an antibacterial effect, however, some of them do not meet the requirements for obtaining drugs based on them. These are compounds such as enniatines [Sy-Cordero AA, Reagse CJ, Oberlies NH. Revisiting the enniatins: a review of their isolation, biosynthesis, structure determination and biological activities. J Antibiot (Tokyo). 2012 Nov;65(11):541-9.], beauvericin [Wang Q, Xu L. Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: a short review. Molecules. 2012 Feb 24;17(3):2367-77], ramoplanin A2 [Farver DK, Hedge DD, Lee SC. Ramoplanin: a lipoglycodepsipeptide antibiotic. Ann Pharmacother. 2005 May;39(5):863-8.], fusaricidins [Reimann M, Sandjo LP, Antelo L, Thines E, Siepe I, Opatz T. A new member of the fusaricidin family - structure elucidation and synthesis of fusaricidin E. Beilstein J Org Chem. 2017 Jul 20;13:1430-1438], acyl depsipeptides [Li Y, Lavey NP, Coker JA, Knobbe JE, Truong DC, Yu H, Lin YS, Nimmo SL, Duerfeldt AS. Consequences of Depsipeptide Substitution on the ClpP Activation Activity of Antibacterial Acyldepsipeptides. ACS Med Chem Lett. 2017 Oct 19;8(11):1171-1176. doi:10.1021/acsmedchemlett.7b00320.].
Соединение тейксобактин, открытое в 2015 г как метаболит почвенной Р-протеобактериии Eleftheria terrae [Ling, L.L., Schneider, Т., Peoples, A.J., Spoering, A.L., Engels, I., Conlon, B.P., Mueller, A., Schaberle, T.F., Hughes, D.E., Epstein, S., Jones, M., 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517 (7535), 455-459], а впоследствии синтезированный [Karas JA, Chen F, Schneider-Futschik EK, Kang Z, Hussein M, Swarbrick J, Hoyer D, Giltrap AM, Payne RJ, Li J, Velkov T. Synthesis and structure-activity relationships of teixobactin. Ann N Y Acad Sci. 2020 Jan; 1459(1): 86-105. doi: 10.1111/nyas.14282], является перспективным кандидатом на разработку лекарственного средства [Teixobactin and preparation method thereof (патент CN107266531A)].The teixobactin compound, discovered in 2015 as a metabolite of the soil P-proteobacterium Eleftheria terrae [Ling, L.L., Schneider, T., Peoples, A.J., Spoering, A.L., Engels, I., Conlon, B.P., Mueller, A., Schaberle, T.F. , Hughes, D.E., Epstein, S., Jones, M., 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517 (7535), 455-459], and subsequently synthesized [Karas JA, Chen F, Schneider-Futschik EK, Kang Z, Hussein M, Swarbrick J, Hoyer D, Giltrap AM, Payne RJ, Li J, Velkov T. Synthesis and structure-activity relationships of teixobactin. Ann N Y Acad Sci. 2020 Jan; 1459(1): 86-105. doi: 10.1111/nyas.14282], is a promising candidate for drug development [Teixobactin and preparation method thereof (patent CN107266531A)].
Наиболее близким аналогом изобретения является суротомицин -антибактериальное средство, полусинтетический аналог даптомицина (патент RU 2666605 С2, опубл 06.11.2014), являющийся родственным соединением.The closest analogue of the invention is surotomycin, an antibacterial agent, a semi-synthetic analogue of daptomycin (patent RU 2666605 C2, publ 06.11.2014), which is a related compound.
Задачей, решаемой с помощью заявляемого изобретения, является представление новых депсипептидных соединений, обладающих антибактериальной активностью.The problem solved by the claimed invention is the presentation of new depsipeptide compounds with antibacterial activity.
Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention
В настоящем изобретении предложено соединение общей структурной формулы:The present invention provides a compound of the general structural formula:
где R представляет собой следующие радикалы:where R represents the following radicals:
или or
В другом аспекте нашего изобретения предлагается применение заявляемого соединения для приготовления средства, обладающего антибактериальной активностью.In another aspect of our invention, the use of the claimed compound for the preparation of an antibacterial agent is provided.
Технический результат заявляемого изобретения состоит в следующем.The technical result of the claimed invention is as follows.
Несмотря на успехи, связанные с применением существующих антибактериальных агентов, продолжает сохраняться потребность в новых антибиотиках. Для многих патогенов повторное взаимодействие с применяемыми антибиотиками, приводит к отбору вариантов штаммов, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. Потеря силы и эффективности антибиотика, определяемые возникновением механизмов устойчивости, приводит к неэффективности антибиотика и, следовательно, может вести к некоторым угрожающим жизни инфекциям, которые практически не поддаются лечению. Как только на рынке появляются и начинают применяться новые антибиотики, микроорганизмы начинают эволюционировать в сторону развития устойчивости к данным новым лекарствам, эффективно создавая потребность в создании новых антибактериальных агентов для борьбы с данными возникающими штаммами. Заявляемое изобретение расширяет спектр средств для борьбы с бактериальной инфекцией, которые могут быть использованы при создании антибактериальных средств.Despite the successes associated with the use of existing antibacterial agents, there continues to be a need for new antibiotics. For many pathogens, repeated exposure to applied antibiotics results in selection of strain variants that are resistant to a wide range of antibiotics. The loss of antibiotic potency and efficacy determined by the emergence of resistance mechanisms leads to antibiotic ineffectiveness and therefore can lead to some life-threatening infections that are practically untreatable. As new antibiotics enter the market and begin to be used, microorganisms begin to evolve towards the development of resistance to these new drugs, effectively creating a need for new antibacterial agents to combat these emerging strains. The claimed invention expands the range of agents for combating bacterial infection, which can be used in the creation of antibacterial agents.
Краткое описание поясняющих материаловBrief description of explanatory materials
Рис. 1. Структура (I), вместе с данными ЯМР. Протонные, углеродные и азотные химические сдвиги при 30С в CDCl3 показаны красным голубым и зеленым цветом соответственно.Rice. 1. Structure (I), along with NMR data. Proton, carbon and nitrogen chemical shifts at 30C in CDCl 3 are shown in red blue and green, respectively.
Рис. 2. Различающиеся фрагменты структуры компонентов (I) и (II) и ЯМР данные для этих фрагментов.Rice. 2. Different fragments of the structure of components (I) and (II) and NMR data for these fragments.
Рис. 3а - Спектры MS1 молекулярного иона соединения (I) [М+Н]+ и [M+Na]+.Rice. 3a - MS1 spectra of the molecular ion of compound (I) [M+H]+ and [M+Na]+.
Рис. 3б - спектр MS2 молекулярного иона [М+Н]+ при 1190.4234,Rice. 3b - MS2 spectrum of the molecular ion [M+H]+ at 1190.4234,
Рис. 3в - схема фрагментации родительского иона.Rice. 3c - fragmentation scheme of the parent ion.
Рис. 4а - спектр MS2 молекулярного иона соединения (II) [М+Н]+ при 1154.4461,Rice. 4a - MS2 spectrum of the molecular ion of compound (II) [M+H]+ at 1154.4461,
Рис. 4б - схема фрагментации родительского иона.Rice. 4b is a diagram of the fragmentation of the parent ion.
Таблица 1 - Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) соединений I и II.Table 1 - Minimum inhibitory concentrations (MICs) of compounds I and II.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Пример 1. Характеристика штамма-продуцента, технология получения и определение подлинности полученных соединений.Example 1. Characteristics of the producer strain, production technology and determination of the authenticity of the obtained compounds.
Заявленные вещества структурной формулы (I) и (II) получают от штамма-продуцента Streptomyces sp. КММ 9044 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, справка о депонировании №16146-203 от 19.05.2022, который относится к роду Streptomyces sp.The claimed substances of structural formulas (I) and (II) are obtained from the producer strain Streptomyces sp. KMM 9044 from the collection of marine microorganisms of the TIBOC FEB RAS, deposit certificate No. 16146-203 dated May 19, 2022, which belongs to the genus Streptomyces sp.
Штамм Streptomyces sp.КММ 9044 выделен из образца грунта, методом прямого посева суспензии грунта на агаризованную среду SWM с добавлением морской воды следующего состава (г/л): пептон - 5.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкоза - 1.0; K2НРО4 - 0.2; MgSO4 - 0.05; 500 мл дистиллированной воды, 500 мл морской воды.The Streptomyces sp.KMM 9044 strain was isolated from a soil sample by direct inoculation of a soil suspension on an SWM agar medium with the addition of sea water of the following composition (g/l): peptone - 5.0; yeast extract - 2.5; glucose - 1.0; K 2 NPO 4 - 0.2; MgSO4 - 0.05; 500 ml distilled water, 500 ml sea water.
Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7-8 суток при температуре 28°С, поддерживали на агаризованной среде SY, хранили не более трех месяцев при температуре около 4°С в холодильной камере. Длительное хранение культуры осуществляли в жидком глицерине при -70°С.Streptomyces sp. KMM 9044 was grown on Petri dishes for 7-8 days at a temperature of 28°C, maintained on SY agar medium, stored for no more than three months at a temperature of about 4°C in a refrigerator. Long-term storage of the culture was carried out in liquid glycerol at -70°C.
На всех вышеуказанных средах цвет колоний изученного штамма КММ 9044 бесцветный или слегка желтоватый. Колонии на ранних стадиях роста непрозрачные, выпуклые, плотные, гладкие или слегка складчатые, обычно вросшие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на среде Sucrose yeast в течение 5-7 суток. Вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы. Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов стрептомицетов.On all the above media, the color of the colonies of the studied strain KMM 9044 is colorless or slightly yellowish. Colonies in the early stages of growth are opaque, convex, dense, smooth or slightly folded, usually grown into the agar. White aerial mycelium is formed on the Sucrose yeast medium within 5-7 days. Vegetative and aerial hyphae are weakly or intensively fragmented with age into rod-shaped immovable elements. The morphology of the studied strains is characteristic of the described species of streptomycetes.
На основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК штамм относен к роду Streptomyces (семейство Streptomycetaceae, класс Actinobacteria) и наиболее близок к известным видам S. pseudovenezuelae DSM 40212T (98.97% сходства), S. variegatus NRRL В-16380T (98.96%), S. cahuitamycinicus 13K301T (98.96%), S. qaidamensis S10T (98.83%), S cacaoi subsp.asoensis NRRL В-16592T (98.76%), S. phaeoluteigriseus DSM 41896T (98.76%), S. adustus WH-9T (98.69%) и S. humidus NBRC 12877T (98.69%).Based on the analysis of the nucleotide sequences of the 16S rRNA gene fragments, the strain belongs to the genus Streptomyces (family Streptomycetaceae, class Actinobacteria) and is closest to the known species S. pseudovenezuelae DSM 40212 T (98.97% similarity), S. variegatus NRRL B-16380 T (98.96% ), S. cahuitamycinicus 13K301 T (98.96%), S. qaidamensis S10 T (98.83%), S cacaoi subsp.asoensis NRRL В-16592 T (98.76%), S. phaeoluteigriseus DSM 41896 T (98.76%), S. adustus WH-9 T (98.69%) and S. humidus NBRC 12877 T (98.69%).
Результаты анализа геномной сборки Streptomyces sp.КММ 9044 показали, что штамм имеет размер генома 7.15 млн п.н. и ГЦ-состав ДНК-71.1 мол%.The results of the analysis of the genomic assembly of Streptomyces sp.KMM 9044 showed that the strain has a genome size of 7.15 million bp. and HC-composition of DNA-71.1 mol%.
Технология получения стрептоциннамидов основана на культивировании штамма-продуцента КММ 9044 и извлечении субстанции из культуральной жидкости (КЖ) указанного штамма методом твердофазной экстракции и жидкостной хроматографии. Она состоит из следующих этапов.The technology for obtaining streptocinnamides is based on the cultivation of the producer strain KMM 9044 and the extraction of the substance from the culture liquid (CL) of the indicated strain by the method of solid-phase extraction and liquid chromatography. It consists of the following steps.
1. Подготовка посевного материала. Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7 сут при температуре 28 С на среде Sucrose yeast (SY) следующего состава (г/л): сахароза - 40.0, дрожжевой экстракт - 5.0, K2HPO4 - 1.5, MgSO4×7H2O - 3.1, NaCl - 2.0, (NH4)2SO4 - 2.0, FeSO4×6H2O - 0.001, MnCl2×7H2O - 0.001, ZnSO4×7H2O - 0.001, глюкоза - 2.0, агар - 15.0, дистиллированная вода - до 1 л, рН 6.8.1. Preparation of seed. Streptomyces sp. KMM 9044 was grown on Petri dishes for 7 days at a temperature of 28 C on a Sucrose yeast (SY) medium with the following composition (g/L): sucrose, 40.0; yeast extract, 5.0; K 2 HPO 4 , 1.5 ; O , 3.1 ; NaCl , 2.0 ; _ - 15.0, distilled water - up to 1 l, pH 6.8.
2. Выращивание посевного материала 1-й генерации (первого инокулята). Культуру переносили с поверхности агаризованной среды в колбу Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл питательной среды SY. Культивирование осуществляли при 28 С в течение 5 сут на термостатируемой качалке Innova 40 (New Brunswick Scientific) при 150 об/мин.2. Growing seed material of the 1st generation (first inoculum). The culture was transferred from the surface of the agar medium to a 750 ml Erlenmeyer flask with 50 ml of SY nutrient medium. Cultivation was carried out at 28°C for 5 days on a thermostatically controlled shaker Innova 40 (New Brunswick Scientific) at 150 rpm.
3. Выращивание посевного материала 2 генерации (второго инокулята). Посевную культуру второй генерации выращивали в среде SY в аналогичных условиях в течение 5 сут, используя для засева первый инокулят в количестве 5% об.3. Growing inoculum of the 2nd generation (second inoculum). The seed culture of the second generation was grown in the SY medium under similar conditions for 5 days, using the first inoculum for seeding in the amount of 5% vol.
4. Культивирование в ферментере. Культивирование проводили в ферментере BIOSTAT A plus (Sartorius BBI Systems) объемом 2 л. В ферментер, содержащий 1350 мл стерильной среды SY, вносили посевной материал в объеме 10% (150 мл культуры на 1.5 л среды) и 150 мл стерильного раствора глюкозы с концентрацией 20 г/л (конечная концентрация 2 г/л). Культивирование проводили при температуре 28°С. Концентрацию растворенного кислорода (pO2) поддерживали на уровне 90%, скорость перемешивания составила 300 об/мин, количество стерильного воздуха, подаваемого в аппарат, - 1.5 л/мин, рН среды поддерживали в интервале 6.8 титрованием 25% раствором аммиака. Пеногаситель силикон (0.01%) вносили в конце первого дня культивирования. Продолжительность ферментации 43 ч.4. Cultivation in a fermenter. Cultivation was carried out in a 2 L BIOSTAT A plus fermenter (Sartorius BBI Systems). Inoculation material in a volume of 10% (150 ml of culture per 1.5 L of medium) and 150 ml of sterile glucose solution at a concentration of 20 g/L (final concentration 2 g/L) were added to a fermenter containing 1350 ml of sterile SY medium. Cultivation was carried out at a temperature of 28°C. The concentration of dissolved oxygen (pO2) was maintained at 90%, the stirring speed was 300 rpm, the amount of sterile air supplied to the apparatus was 1.5 L/min, and the pH of the medium was maintained in the range of 6.8 by titration with 25% ammonia solution. Silicone defoamer (0.01%) was added at the end of the first day of cultivation. Fermentation time 43 hours.
5. Отделение КЖ от биомассы. Выращенную культуру центрифугировали на скорости 10000 rpm (центрифуга Beckman J2-21), после чего супернатант фильтровали. Были использованы стекловолоконные фильтры Whatman glass microfiber GF/A и MF-Millipore MCE membrane с диаметром пор 0.45 мкм. Полученный объем КЖ составил 1.2 л.5. Separation of QOL from biomass. The grown culture was centrifuged at 10,000 rpm (Beckman J2-21 centrifuge), after which the supernatant was filtered. Whatman glass microfiber GF/A and MF-Millipore MCE membrane glass fiber filters with a pore diameter of 0.45 µm were used. The resulting volume of QOL was 1.2 liters.
6. Подготовка сорбционного картриджа. Картридж заполняли полимерным сорбентом LPS-500-H, фракция 70 мкм (компании «Техносорбент») насыпным способом. Использовали картридж объемом 45 мл, вес сорбента около 7.5 г. 6. Preparation of the sorption cartridge. The cartridge was filled with polymeric sorbent LPS-500-H,
7. Нанесение КЖ на полимерный сорбент. Картридж промывали 150 мл ацетонитрила (АЦН) и активировали 150 мл дистиллированной воды с помощью перистальтического насоса Masterflex Easy-Load 11 при скорости потока 15 мл/мин. При той же скорости наносили КЖ; по окончании картридж промывали 150 мл воды. Картридж можно использовать повторно, но не более 5 раз.7. Application of CL on a polymeric sorbent. The cartridge was washed with 150 ml of acetonitrile (ACN) and activated with 150 ml of distilled water using a Masterflex Easy-Load 11 peristaltic pump at a flow rate of 15 ml/min. QOL was applied at the same speed; when finished, the cartridge was washed with 150 ml of water. The cartridge can be reused, but not more than 5 times.
8. Элюирование с картриджа с использованием флэш-хроматографа. Картридж присоединяли к линии подачи элюента хроматографа PuriFlash 5.250 и элюировали со скоростью 15 мл/мин смесью растворителей вода - АЦН (степень чистоты "для ВЭЖХ"). Содержание АЦН в элюенте было задано по следующей программе: начальный состав - 5%; 1 мин - 45%, 10 мин - 45%, 11 мин - 100%, 22 мин - 100%. Состав элюата контролировали с помощью УФ детектора при длине волны 290 нм. УФ профили имели два пика: мажорный пик в области 5-6 мин, отвечающий сумме нецелевых соединений, и минорный пик в области 13-15 мин, содержащий целевые соединения Scm А и Scm В, УФ спектр которых имеет максимум при 290 нм. Данную фракцию объемом около 30 мл собирали с помощью коллектора фракций.8. Elution from the cartridge using a flash chromatograph. The cartridge was attached to the eluent line of a PuriFlash 5.250 chromatograph and eluted at a rate of 15 ml/min with a mixture of solvents water - ACN (HPLC grade). The content of ACN in the eluent was set according to the following program: initial composition - 5%; 1 min - 45%, 10 min - 45%, 11 min - 100%, 22 min - 100%. The composition of the eluate was monitored using a UV detector at a wavelength of 290 nm. The UV profiles had two peaks: a major peak at 5–6 min, corresponding to the sum of non-target compounds, and a minor peak at 13–15 min, containing the target compounds Scm A and Scm B, whose UV spectrum has a maximum at 290 nm. This fraction of about 30 ml was collected using a fraction collector.
9. Очистка субстанции. Очистку Scm А и Scm В проводили методом ВЭЖХ (хроматограф Шимадзу Нексера). Весь объем фракции после картриджа помещали в колбу роторного испарителя (Buchi Rotavapor), концентрировали примерно в 5 раз. К раствору добавляли раствор 0.1% уксусной кислоты - половину от полученного объема (в конкретном случае 30 мл концентрировали до 6 мл и добавляли 3 мл раствора уксусной кислоты). При наличии осадка раствор центрифугируют на скорости 10000 rpm, супернатант переносят в пробирки. Разделение проводят колонке полупрепаративного размера на сорбенте типа С18, фракция 5 или 10 мкм, при том же составе элюента, температуре термостата колонки и длине волны УФ детектора, как в п. 5. Расходы элюента и объем пробы, элюируемой за один цикл разделения, выбирают в зависимости от размера колонки. На колонке 9.2×150 мм проводили разделения порциями по 1.5 мл при скорости потока 3 мл/мин. Продолжительность каждого разделения составляет 20 мин. Для очистки всего объема фракции требуется повторить операцию несколько раз, в данном случае 6 раз.9. Purification of substance. Scm A and Scm B were purified by HPLC (Shimazu Necker chromatograph). The entire volume of the fraction after the cartridge was placed in a flask of a rotary evaporator (Buchi Rotavapor), concentrated by about 5 times. A solution of 0.1% acetic acid was added to the solution - half of the volume obtained (in the specific case, 30 ml was concentrated to 6 ml and 3 ml of acetic acid solution was added). In the presence of a precipitate, the solution is centrifuged at a speed of 10000 rpm, the supernatant is transferred into test tubes. Separation is carried out on a semi-preparative size column on a C18 sorbent,
10. Получение сухого продукта из растворов фракций. Растворы фракций объединяют, сливают в колбу и высушивают на роторном испарителе с минимальным подогревом или на лиофильной сушке с центрифугой типа MiVac. Общий выход вещества составляет 3-5 мг на 1 л КЖ. Количество извлекаемого продукта и соотношение компонентов Scm А и Scm В в образцах может варьировать из-за влияния разных факторов на продукцию штамма.10. Obtaining a dry product from solutions of fractions. Fraction solutions are combined, poured into a flask and dried on a rotary evaporator with minimal heating or freeze-drying with a MiVac centrifuge. The total yield of the substance is 3-5 mg per 1 liter of QOL. The amount of the extracted product and the ratio of the Scm A and Scm B components in the samples may vary due to the influence of various factors on the production of the strain.
Все этапы технологии могут быть масштабированы при использовании соответствующего оборудования и на общих принципах, применяемых при динамических сорбционных процессах.All stages of the technology can be scaled using the appropriate equipment and on the general principles used in dynamic sorption processes.
В результате были получены соединения Scm A(Z) (структурная формула I) и, Scm B(Z) (структурная формула II). Структурные формулы установлены по результатам ЯМР-спектроскопии (рис. 1, 2) и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (рис. 3, 4).As a result, compounds Scm A(Z) (structural formula I) and Scm B(Z) (structural formula II) were obtained. Structural formulas were established from the results of NMR spectroscopy (Figs. 1, 2) and high resolution tandem mass spectrometry (Figs. 3, 4).
Анализ спектров ЯМР позволил прямо выяснить структуру циклического депсипептида, состоящего из семи аминокислотных остатков: треонина, двух лейцинов, пролина, трех непротеиногенных аминокислот и глицериновой кислоты. О-ацилированный треонин находится на N-конце пептидной части, за ним следует лейцин, затем О-ацетилированный 4-ацетокси-5-метилпролин, затем лейцин, N-гидроксивалин и, наконец, пролин на С-конце. Треонин N-ацилируется 2-метокси-6,8-дихлор-7-гидроксикоричной кислотой в Z-конформации, и его боковая цепь образует сложноэфирную связь с 3-гидрокси-4-хлорвалином. Наконец, цикл замыкается через глицериновую кислоту, соединяющую карбонил пролина и амид хлоргидроксивалина. Важно отметить, что амид модифицирован гидроксильной группой, что непосредственно наблюдается в 1Н ЯМР при 8,19 м.д. Две аминокислоты в структуре, 3-гидрокси-4-хлорвалин и транс-4-ацетокси-5-метил-L-пролин, являются редкими фрагментами в депсипептидах. Новый антибиотик получил название стрептоциннамид A(Z).An analysis of the NMR spectra made it possible to directly elucidate the structure of a cyclic depsipeptide consisting of seven amino acid residues: threonine, two leucines, proline, three nonproteinogenic amino acids, and glyceric acid. O-acylated threonine is at the N-terminus of the peptide moiety, followed by leucine, then O-acetylated 4-acetoxy-5-methylproline, then leucine, N-hydroxyvaline, and finally proline at the C-terminus. Threonine is N-acylated with 2-methoxy-6,8-dichloro-7-hydroxycinnamic acid in the Z conformation and its side chain forms an ester bond with 3-hydroxy-4-chlorovaline. Finally, the cycle closes through glyceric acid, connecting proline carbonyl and chlorohydroxyvaline amide. It is important to note that the amide is modified with a hydroxyl group, which is directly observed in 1H NMR at 8.19 ppm. Two amino acids in the structure, 3-hydroxy-4-chlorovaline and trans-4-acetoxy-5-methyl-L-proline, are rare moieties in depsipeptides. The new antibiotic was named streptocinnamide A(Z).
Пример 2.Example 2
Подтверждение антибактериальной активности заявленных соединений.Confirmation of the antibacterial activity of the claimed compounds.
Для тестирования были использованы штаммы Micrococcus sp.КММ 1467 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова, Arthrobacter sp.21022 (АТСС) и Mycobacterium smegmatis АТСС 700084 из коллекции Lytech Co. Ltd.The strains of Micrococcus sp. KMM 1467 from the collection of marine microorganisms of the TIBOKh named after M. G.B. Elyakova, Arthrobacter sp.21022 (ATCC) and Mycobacterium smegmatis ATCC 700084 from the collection of Lytech Co. Ltd.
Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) бактерий определяли серийными двукратными разведениями (0,1-10000 нг/мл) в бульоне 2YT (BD, США). МИК определяли как наименьшую концентрацию, препятствующую росту тестируемого организма в 96-луночном планшете после 16 ч культивирования. Для Mycobacterium smegmatis МИК определяли через 60 ч культивирования. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли как наименьшую концентрацию, препятствующую повторному культивированию тест-организма через 24 ч инкубации. Длительное культивирование приводит к разложению Scm и к завышенным значениям МИК. Временной ход роста бактерий отслеживали при 800 нм с использованием многорежимного считывающего устройства Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).Minimal inhibitory concentrations (MICs) of bacteria were determined by serial two-fold dilutions (0.1-10000 ng/ml) in 2YT broth (BD, USA). The MIC was defined as the lowest concentration that interfered with the growth of a test organism in a 96-well plate after 16 hours of culture. For Mycobacterium smegmatis, MICs were determined after 60 hours of cultivation. The minimum bactericidal concentration (MBC) was defined as the lowest concentration preventing re-cultivation of the test organism after 24 h of incubation. Prolonged cultivation results in Scm degradation and inflated MIC values. The temporal course of bacterial growth was monitored at 800 nm using a Varioskan Flash multimode reader (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
Оба варианта структур имеют противомикробную активность, причем для репортерного штамма Micrococcus sp.КММ 1467 величины минимальных ингибирующих концентраций (МИК) были на уровне нг/мл: 6 нг/мл для Scm А и 2 нг/мл для Scm В, т.е. значения для эпокси-производного в несколько раз ниже, чем значения для хлор-производного.Both variants of the structures have antimicrobial activity, and for the reporter strain Micrococcus sp.KMM 1467, the values of the minimum inhibitory concentrations (MIC) were at the level of ng/ml: 6 ng/ml for Scm A and 2 ng/ml for Scm B, i.e. the values for the epoxy derivative are several times lower than those for the chlorine derivative.
В отношении других патогенов активность соединений была существенно ниже. Были измерены МИКи для Scm А и получены значения, отраженные в табл. 1.Against other pathogens, the activity of the compounds was significantly lower. MICs were measured for Scm A and the values shown in Table 1 were obtained. 1.
Claims (5)
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2795449C1 true RU2795449C1 (en) | 2023-05-03 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1535383A3 (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-07 | Рон-Пуленк Санте (Фирма) | Method of producing biologically active substances 55185 rp and 59451 rf possessing immunodepressive effect |
RU2348647C2 (en) * | 2001-08-06 | 2009-03-10 | Кьюбист Фармасьютикалз, Инк | New depsipeptides and methods of their obtainment |
RU2351608C2 (en) * | 2002-06-28 | 2009-04-10 | Авентис Фарма С.А. | NOVEL VERSIONS OF POLYPEPTIDE PapM OF BACTERIA GENUS Streptomyces |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1535383A3 (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-07 | Рон-Пуленк Санте (Фирма) | Method of producing biologically active substances 55185 rp and 59451 rf possessing immunodepressive effect |
RU2348647C2 (en) * | 2001-08-06 | 2009-03-10 | Кьюбист Фармасьютикалз, Инк | New depsipeptides and methods of their obtainment |
RU2351608C2 (en) * | 2002-06-28 | 2009-04-10 | Авентис Фарма С.А. | NOVEL VERSIONS OF POLYPEPTIDE PapM OF BACTERIA GENUS Streptomyces |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Sivanathan, S et al "Cyclodepsipeptides: A rich source of biologically active compounds for drug research", Molecules, 2014, 19(8), 12368-12420. Phyo, M.Y. et al "Triproamide and pemukainalides, cyclic depsipeptides from the marine cyanobacterium Symploca hydnoides", J. Nat. Prod., 14.01.2022, 85, 485-492. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6218398B1 (en) | Nocathiacin antibiotics | |
KR0139628B1 (en) | Antibiotic mersacidine, process for producing it and its use as a medicament | |
JPH0362715B2 (en) | ||
RU2795449C1 (en) | New depsipeptide compounds with antibacterial activity | |
Veilumuthu et al. | Antimicrobial compounds produced by Streptomyces sp. VITGV01 against selected human pathogens | |
KR20090082504A (en) | Aminothiazole macrocycles, their use as antibacterial compounds and processes for their production | |
AU2007237861B2 (en) | Novel antibacterial compounds | |
Wei et al. | Two piperazic acid-containing cyclic hexapeptides from Streptomyces alboflavus 313 | |
RU2627187C1 (en) | Bacillus pumilus strain and method for obtaining amikumacin a antibiotic with its application | |
RU2228337C2 (en) | Vancoresmycin (variants), its application, strain amycolatopsis of species hil-006734 for its preparing | |
RU2784815C1 (en) | STREPTOMYCES sp. KMM 9044 - PRODUCER OF COMPOUNDS WITH ANTIBACTERIAL ACTIVITY | |
FI101402B (en) | A method for preparing a new antibiotic, balhimycin | |
JPH02128693A (en) | Novel antitumor antibiotic complex bbm-1675 | |
AU631666B2 (en) | Antibiotics plusbacin | |
US5451570A (en) | Antibiotic, balhimycin, a process for its production and its use as pharmaceutical | |
JP3523290B2 (en) | Compounds 31668P and 31668U, methods for their preparation and their use | |
KR19980017913A (en) | Novel Bacillus sp. Microorganisms and methods for preparing macrolactin A therefrom | |
JPH0430400B2 (en) | ||
EP1448784A1 (en) | Antibiotics ge 81112 factors a, b, b1, pharmaceutically acceptable salts and compositions, and use thereof | |
NZ571636A (en) | Novel antibacterial compounds comprising multiple thiazole rings isolated from Kocuria | |
JPH02142799A (en) | Novel glycopeptide antbiotics decaplanine | |
WO2014053873A1 (en) | Polymeric prodrug conjugates | |
MXPA00012161A (en) | Nocathiacin antibiotics | |
ZA200006693B (en) | Nocathiacin antibiotics. |