RU2789442C1 - Biological preservation for vegetable forage and method for its production - Google Patents

Abstract

FIELD: agriculture.

SUBSTANCE: inventions relate to agriculture. A biological preparation for preserving vegetable feed consists of 3 parts of liquid microbial cultures of Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BX-99 in a ratio of 1:1 with a final concentration of at least 1.0⋅10⁹ CFU/cm³ and one part of a polyenzyme complex containing cellulase, activity of at least 400 U/cm³, xylanase, activity of at least 1700 U/cm³, and pectin-lyase, activity of at least 5000 U/cm³. A method for obtaining a biological preparation for preserving vegetable feed includes cultivating cultures of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus buchneri in a liquid nutrient lactose-molasses medium without aeration until the concentration of living microorganisms is at least 4.0⋅10⁹ CFU/cm³ and then mixing 3 parts of liquid microbial cultures of Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BX-99 in a ratio of 1:1 and one part of a polyenzymatic complex containing cellulase, activity of at least 400 CFU/cm³.

EFFECT: inventions make it possible to develop a biopreparation for preserving vegetable feed, which ensures the suppression of putrefactive bacteria that cause spoilage of feed.

2 cl, 9 tbl

Description

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, а именно к производству и консервированию кормов для крупного рогатого скота.The invention relates to agricultural microbiology, namely the production and conservation of feed for cattle.

Основой развития животноводства является создание прочной кормовой базы для скота. Высокие темпы производства могут быть достигнуты не только за счет повышения урожайности кормовых культур, но и с помощью мероприятий по улучшению качества и снижению потери питательной ценности кормов в процессе их заготовки, переработки и длительного хранения. Положительный результат зависит от выбора эффективною способа консервирования зеленой массы. В зимний период основным сочным кормом является силос, который обеспечивает полноценное кормление, а также позволяет максимально повысить продуктивность животных. Одним из существенных недостатков заготовки такого вида корма являются значительные потери питательных веществ исходного сырья в процессе силосования, вызванные присутствием гнилостных бактерий и других нежелательных микроорганизмов. Полностью избежать этих потерь невозможно, но их можно значительно снизить за счет применяемых консервантов химического и биологического происхождения.The basis for the development of animal husbandry is the creation of a solid fodder base for livestock. High production rates can be achieved not only by increasing the yield of fodder crops, but also by taking measures to improve the quality and reduce the loss of nutritional value of fodder during their harvesting, processing and long-term storage. A positive result depends on the choice of an effective method of preserving green mass. In winter, the main succulent feed is silage, which provides complete feeding, and also allows you to maximize the productivity of animals. One of the significant disadvantages of harvesting this type of feed is the significant loss of nutrients from the feedstock during ensiling, caused by the presence of putrefactive bacteria and other undesirable microorganisms. It is impossible to completely avoid these losses, but they can be significantly reduced by using preservatives of chemical and biological origin.

Известно применение органических кислот (муравьиной, пропионовой, молочной, уксусной) для консервирования трав и приготовления силоса. Однако они имеют ряд недостатков. При нарушении правил перевозки и хранен) я этих кислот (например, в неоцинкованной таре, при нарушении герметичности тары), а также при передозировании при внесении имеется опасность отравления животных. Полученный силос не является экологически чистым, может содержать сильно пахнущие компоненты, а применяемые химически препараты небезопасны для персонала.It is known the use of organic acids (formic, propionic, lactic, acetic) for the conservation of herbs and the preparation of silage. However, they have a number of disadvantages. In case of violation of the rules of transportation and storage) of these acids (for example, in non-galvanized containers, in case of violation of the tightness of the container), as well as in case of overdose during application, there is a danger of animal poisoning. The resulting silage is not environmentally friendly, it may contain strongly smelling components, and the chemical preparations used are unsafe for personnel.

При создании биологических консервантов для силосования зеленой массы производится целенаправленный отбор микроорганизмов которые обеспечивают за небольшой срок снижение рН силосуемой массы до необходим ого (4,2-4,3) ед. рН значения в течение 2-3 суток в результате молочнокислою брожения. Та же они ингибируют развитие нежелательной микрофлоры. Учитывая, что силосуемые травы используются в качестве корма сельскохозяйственных животных, входящие в состав заквасок микроорганизмы должны обладать пробиотическими свойствами.When creating biological preservatives for ensiling green mass, a targeted selection of microorganisms is carried out, which ensure a decrease in the pH of the ensiled mass to the required one (4.2-4.3) units in a short time. pH values within 2-3 days as a result of lactic acid fermentation. They also inhibit the development of unwanted microflora. Given that ensiled grasses are used as feed for farm animals, the microorganisms that make up the starter cultures must have probiotic properties.

Близкими техническими решениями являются: закваски на основе лактобактерий (патент на изобретение RU 2168909 C1 «Штамм бактерий Lactobacillus plantarum для силосования кормов»; опубликован: 20.06.2001 Бюл. №17), закваски на основе ассоциации штаммов молочнокислых бактерий (патент на изобретение RU 265655С2 «Способ получения закваски для силосования кормов»; опубликован: 10.12.2005 бюл. №34), биоконсервант на основе смеси штаммов бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum и Propionibacterium acidipropionici (патент на изобретение

«Новый биоконсервант для силосования кормов и способ его получения»; опубликован: 19.02.2018 Бюл. №5). Основным недостатком всех перечисленных биопрепаратов является то, что они недостаточно эффективны при уборке многолетних бобовых, бобово-злаковых трав, а также однолетних вико-овсяных травосмесей. Эти травы в настоящее время преобладают в общей системе возделывания кормовых культур; однако из-за наличия в их составе плохогидролизуемых полимеров относятся к трудносилосуемым культурам.Close technical solutions are: starter cultures based on lactobacilli (invention patent RU 2168909 C1 "Lactobacillus plantarum bacterial strain for forage ensiling"; published: 06/20/2001 Bull. No. 17), starter cultures based on the association of lactic acid bacteria strains (invention patent RU 265655C2 "Method of obtaining starter for forage ensiling"; published: 10.12.2005 Bull. No. 34), a biopreservative based on a mixture of bacterial strains Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum and Propionibacterium acidipropionici (patent for invention

"A new biopreservative for forage ensiling and a method for its production"; published: 19.02.2018 Bull. No. 5). The main disadvantage of all the listed biological products is that they are not effective enough when harvesting perennial legumes, legumes and cereal grasses, as well as annual vetch-oat grass mixtures. These grasses currently dominate the overall forage cropping system; however, due to the presence of poorly hydrolysable polymers in their composition, they are classified as hard-to-silage crops.

Целью настоящего изобретения является разработка биопрепарата для консервирования растительных кормов, в том числе трудносилосуемых культур (однолетних и многолетних бобовых и злаковых).The aim of the present invention is the development of a biological product for the preservation of vegetable feed, including hard-to-silage crops (annual and perennial legumes and cereals).

В качестве прототипа использована композиция препаратов, представленная в патенте на изобретение RU 2705002 C2 «Композиция для получения высококачественных кормов из козлятника восточного и бобово-злаковых смесей на его основе» (опубликован: 01.11.2019 Бюл. №31). Предлагаемая композиция по патенту обеспечивает получение высококачественных объемистых кормов за счет повышения степени использования плохогидролизуемых полимеров консервируемого сырья в результате предварительного использования полиферментного препарата «Феркон», который содержит комплекс ферментов, подобранных с учетом особенностей углеводного состава многолетних бобовых трав. Это обеспечивает ферментацию сложных полисахаридов до моносахаров, необходимых для образования молочной кислоты. На следующем этапе предполагается применять бактериальные закваски, в состав которых включены молочнокислые бактерии. Таким образом, ферменты обеспечивают частичный гидролиз сложных трудноперевариваемых углеводов: целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых веществ, до глюкозы, а бактериальные молочнокислые культуры обеспечивают ее последующее быстрое и полное превращение в молочную кислоту. При этом силосуемая масса подкисляется до необходимою уровня и полученный корм сохраняется лучше.The composition of preparations presented in the patent for invention RU 2705002 C2 “Composition for obtaining high-quality feed from oriental goat’s rue and legume-cereal mixtures based on it” was used as a prototype (published: 11/01/2019 Bull. No. 31). The proposed composition according to the patent provides for the production of high-quality bulky feed by increasing the degree of use of poorly hydrolysable polymers of canned raw materials as a result of the preliminary use of the Ferkon polyenzyme preparation, which contains a complex of enzymes selected taking into account the characteristics of the carbohydrate composition of perennial legumes. This ensures the fermentation of complex polysaccharides to the monosaccharides necessary for the formation of lactic acid. At the next stage, it is supposed to use bacterial starter cultures, which include lactic acid bacteria. Thus, enzymes provide partial hydrolysis of complex indigestible carbohydrates: cellulose, hemicellulose, pectin, to glucose, and bacterial lactic acid cultures ensure its subsequent rapid and complete conversion into lactic acid. At the same time, the ensiled mass is acidified to the required level and the resulting feed is better preserved.

Недостатком предлагаемой композиции является двукратное (раздельное) внесение препаратов, входящих в ее состав, что увеличивает трудозатраты при применении данной технологии получения силоса.The disadvantage of the proposed composition is the double (separate) introduction of the drugs included in its composition, which increases labor costs when using this technology for producing silage.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового биопрепарата для консервирования растительных кормов, в том числе трудносилосуемых культур (однолетних и многолетних бобовых и злаковых), с высокой антагонистической активностью, обеспечивающего подавление гнилостных бактерий, вызывающих порчу кормов, при внесении биопрепарата в силосуемую массу и пробиотическими свойствами.The objective of the present invention is to develop a new biopreparation for the conservation of plant feed, including hard-to-silage crops (annual and perennial legumes and cereals), with high antagonistic activity, which ensures the suppression of putrefactive bacteria that cause feed spoilage when the biopreparation is introduced into the ensiled mass and probiotic properties.

Поставленная задача решается путем создания комплексного биопрепарата для консервирования растительных кормов, в том числе трудносилосуемых культур, содержащего 3 части смешанных в соотношении 1:1 жидких микробных культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 с конечной концентрацией не 1енее 1,0⋅109 КОЕ/см³ и одной части полиферментного препарата.The task is solved by creating a complex biological product for the conservation of plant feed, including hard-to-silage crops, containing 3 parts of liquid microbial cultures mixed in a 1: 1 ratio of Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BX-99 with a final concentration of not less than 1.0⋅ 109 CFU/cm ³ and one part of polyenzymatic preparation.

Включение в состав штамма Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747 определяется тем, что эти микроорганизмы осуществляют гомоферментное молочнокислое брожение, то есть они образуют в основном молочную кислоту, которая составляет не менее 90% в их продуктах брожения. За счет этого они обеспечивают быстрое снижение рΗ до (3-5) ед. рН, что подавляет рост других бактерий, которые не могут развиваться в такой кислой среде. Выбор штамма Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ 3-11839 был обусловлен его пробиотическими свойствами.Inclusion in the composition of the strain Lactobacillus plantarum PL-99 VKPM B-11747 is determined by the fact that these microorganisms carry out homoenzymatic lactic acid fermentation, that is, they form mainly lactic acid, which is at least 90% in their fermentation products. Due to this, they provide a rapid decrease in pΗ to (3-5) units. pH, which inhibits the growth of other bacteria that cannot grow in such an acidic environment. The choice of the strain Lactobacillus buchneri BX-99 VKPM 3-11839 was due to its probiotic properties.

Учитывая это, были отобраны штаммы Lactobacillus plantarum ПЛ-99 ВКПМ В-11747 и Lactobacillus buchneri БХ-99 ВКПМ В-11839, не относящиеся к микроорганизмам, патогенным для человека и животных, согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Для повышения эффективности предлагаемо о препарата, особенно для консервирования трудносилосуемых кормовых культур в его состав включен полиферментный комплекс, содержащий целлюлазу (активность не менее 400 ед/см³), ксиланазу (активность не менее 1700 ед/см³) и пектин-лиазу (активность не менее 5000 ед/см³).With this in mind, strains of Lactobacillus plantarum PL-99 VKPM V-11747 and Lactobacillus buchneri BX-99 VKPM V-11839 were selected, not related to microorganisms pathogenic to humans and animals, according to the classification given in the Sanitary Rules SP 1.3.2322-08 . To improve the effectiveness of the proposed drug, especially for the conservation of hard-to-silage fodder crops, its composition includes a polyenzyme complex containing cellulase (activity not less than 400 U/cm ³ ), xylanase (activity not less than 1700 U/cm ³ ) and pectin-lyase (activity not less than 5000 units/ ^cm3 ).

Приготовление биопрепарата для консервирования растительных кормов осуществлялось следующим образом.The preparation of a biological product for the conservation of vegetable feed was carried out as follows.

Для приготовления микробных культур лактобактерий использовали жидкую питательную лактозно-мелассную среду состава, г/дм³:For the preparation of microbial cultures of lactobacilli, a liquid nutrient lactose-molasses medium was used with the composition, g/dm ³ :

меласса - 15,0 см³;molasses - 15.0 cm ³ ;

лактоза - 5,0;lactose - 5.0;

кукурузный экстракт - 5,0 см³;corn extract - 5.0 cm ³ ;

дрожжевой экстракт - 2,5;yeast extract - 2.5;

FeSO4⋅7Η2Ο - 0,05;Feso4⋅72 a - 0.05;

MnSO4⋅4Н2О - 0,05;MNSO4⋅4N2O - 0.05;

ацетат натрия - 5,0;sodium acetate - 5.0;

KH2PO4 - 1,8;KH2PO4 - 1.8;

дистиллированная вода до 1,0 дм³.distilled water up to 1.0 dm ³ .

Выращивание культур, входящих в состав биопрепарата, осуществляли в указанной жидкой питательной среде в бутылях емкостью 20,0 дм³. Объем жидкой питательной среды составлял 12,0 дм³. В качестве посевного материала использовали смесь культур Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri, выращенных на плотной питательной среде MRS-4. Продолжительность культивирования составляла (48±1) часов при температуре (37±1)°С без аэрации. Для создания анаэробных условий содержимое бутылей после посева продували аргоном. Культивирование лактобацилл в жидкой питательной среде обеспечивало концентрацию живых микроорганизмов не менее 4,0⋅109 КОЕ/см³. На следующем этапе в аппарате-смесителе смешивали 3 части жидких микробных культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 (в соотношении 1:1) и одну часть полиферментного комплекса. Полученную смесь перемешивали в течение 20 миг гг.The cultivation of cultures included in the composition of the biological product was carried out in the specified liquid nutrient medium in bottles with a capacity of 20.0 DM ³ . The volume of the liquid nutrient medium was 12.0 DM ³ . A mixture of cultures of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus buchneri grown on a dense nutrient medium MRS-4 was used as an inoculum. The duration of cultivation was (48±1) hours at a temperature of (37±1)°C without aeration. To create anaerobic conditions, the contents of the bottles were purged with argon after inoculation. Cultivation of lactobacilli in a liquid nutrient medium provided the concentration of living microorganisms not less than 4.0⋅109 CFU/cm ³ . At the next stage, 3 parts of liquid microbial cultures of Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BX-99 (at a ratio of 1:1) and one part of the polyenzyme complex were mixed in a mixer. The resulting mixture was stirred for 20 minutes.

Полученная готовая форма биопрепарата должна соответствовать следующим показателям:The resulting finished form of the biological product must meet the following criteria:

- внешний вид и цвет - жидкость от светло-серого до серого цвета;- appearance and color - liquid from light gray to gray;

- содержание жизнеспособных микробных клеток - не менее 1,0⋅109 КОЕ/см³;- content of viable microbial cells - not less than 1.0⋅109 CFU/cm ³ ;

- допустимое содержание посторонней микрофлоры - нe более 1,0⋅103 КОЕ/см³; не допускается наличие колиформных бактерий и плесневых гриб ив;- permissible content of foreign microflora - not more than 1.0⋅103 CFU/cm ³ ; the presence of coliform bacteria and mold fungus willows is not allowed;

- водородный показатель - (4,0±0,5) ед. рН.- pH index - (4.0±0.5) units. pH.

В ходе проведения исследований проводилась оценка кислотообразующих свойств лактобацилл.In the course of the research, the acid-forming properties of lactobacilli were evaluated.

В колбы к 250,0 см³ лактозо-мелассной среды вносили 15,0 см³ приготовленного биопрепарата. Перед началом исследований производили измерение рΗ до внесения культуры, затем сразу после внесения. Посевы инкубировал; в течение (48±1) часов при (37±1)°С, измеряли значения рН через каждые 8 часов и делали высевы на плотную питательную среду MRS-4 для определения биологической кон нитрации на первые и вторые сутки инкубации. Кислотность среды при выращивании лактобацилл определяли по концентрации ионов водорода. Для этого пробу культуральной жидкости наливали в стаканчик емкостью 25,0 см³ и опускали в него стеклянный электрод рН-метра. После того как значение стабилизировалось (примерно 30 секунд) снимали показания прибора.To 250.0 cm ³ of lactose-molasses medium, 15.0 cm ³ of the prepared biological product was added to the flasks. Before the start of the research, pH was measured before the introduction of the culture, then immediately after the introduction. Crops incubated; for (48 ± 1) hours at (37 ± 1)°C, pH values were measured every 8 hours and seeded on a dense nutrient medium MRS-4 to determine the biological concentration on the first and second days of incubation. The acidity of the medium during the cultivation of lactobacilli was determined by the concentration of hydrogen ions. To do this, a sample of the culture liquid was poured into a glass with a capacity of 25.0 cm ³ and the glass electrode of the pH meter was lowered into it. After the value stabilized (about 30 seconds), the instrument readings were taken.

Кроме того, определяли активность кислотообразования лактобактерий согласно ОФС.1.7.2.0009.15. Для этого по 2,5 см³ регидратированных рабочих культур лактобактерий вносили в колбы вместимостью 50,0 см³, содержащие 25,0 см³ стерильной питательной среды MRS-1. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (37±1)°С и инкубировали в течение (24±1) часов. После окончания выращивания содержимое колб перемешивали, и пробу каждого штамма в объеме 10,0 см³ переносили в отдельную коническую колбу объемом 100,0 см³, интенсивно встряхивали для равномерного перемешивания содержимого и добавляли 2-3 капли 1% раствора фенолфталеина. Полученную суспензию титровали 0,1 Μ раствором натрия гидроксида до появления стойкого розового окрашивания и достижения рН (8,5±0,1) ед. рН, которое контролировали потенциометрически, при этом учитывали количество см³ 0,1 Μ раствора натрия гидроксида, пошедшей на титрование. Кислотность выражали в градусах Тернера (оТ) и вычисляли по формуле:In addition, the acid formation activity of lactobacilli was determined according to GPM.1.7.2.0009.15. To do this, 2.5 cm ³ rehydrated working cultures of lactobacilli were introduced into flasks with a capacity of 50.0 cm ³ containing 25.0 cm ³ sterile nutrient medium MRS-1. Flasks with crops were placed in a thermostat at a temperature of (37±1)°C and incubated for (24±1) hours. After the cultivation was completed, the contents of the flasks were stirred, and a sample of each strain in a volume of 10.0 cm ³ was transferred into a separate conical flask with a volume of 100.0 cm ³ , vigorously shaken to evenly mix the contents, and 2-3 drops of a 1% phenolphthalein solution were added. The resulting suspension was titrated with 0.1 M sodium hydroxide solution until a persistent pink color appeared and pH (8.5 ± 0.1) units was reached. pH, which was controlled potentiometrically, while taking into account the amount of cm ³ 0.1 Μ of sodium hydroxide solution used for titration. Acidity was expressed in Turner degrees (oT) and calculated by the formula:

где:Where:

А - количество см³ 0,1 Μ раствора натрия гидроксида, прошедшего на титрование 10,0 см³ исследуемой микробной суспензии;A - the number of cm ³ 0.1 Μ sodium hydroxide solution, passed for titration 10.0 cm ³ of the microbial suspension under study;

К - поправка к титру 0,1 Μ раствора натрия гидроксида 10 - объем микробной суспензии, см³.K - amendment to the titer of 0.1 Μ sodium hydroxide solution 10 - volume of microbial suspension, cm ³ .

Результаты определения кислотности среды при выращивании лактобактерий представлены в таблице 1.The results of determining the acidity of the medium when growing lactobacilli are presented in table 1.

Полученные результаты показали, что изучаемые штаммы лактобактерий обладают способностью активно закислять среду, что обеспечит подавление маслянокислых и других гнилостных бактерий, вызывающих порчу кормов при силосовании.The results obtained showed that the studied strains of lactobacilli have the ability to actively acidify the environment, which will ensure the suppression of butyric and other putrefactive bacteria that cause feed spoilage during ensiling.

Также была определена активность кислотообразования лактобактерий методом кислотно-основного титрования в градусах Тернера. Полученные данные представлены в таблице 2,The activity of acid formation of lactobacilli was also determined by the method of acid-base titration in Turner degrees. The data obtained are presented in table 2,

Полученные результаты подтвердили, что все изучаемые штаммы лактобактерий обладают высокой активностью кислотообразования.The results obtained confirmed that all studied strains of lactobacilli have a high activity of acid formation.

Была проведена и оценка антагонистической активности биопрепарата.The antagonistic activity of the biological product was also evaluated.

Оценку антагонистической активности лактобактерий осуществляли с использованием двухслойной методики по Фредерику. Для этого на чашку с потной питательной средой MRS-4 с помощью бактериологической петли наносили 0 01 см³ суточной бульонной культуры лактобактерий, выращенной на жидкой питатетельной среде MRS-1. Посевы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение (24-4 4) часов. Для лизиса клеток лактобацилл, выросших на питательной среде, на крышку перевернутой чашки Петри помещали фильтровальную бумагу, наливали 1,0 см³ хлороформа и экспонировали в течение 30 минут, далее чашку проветривали в течение (3-5) мин.The evaluation of the antagonistic activity of lactobacilli was carried out using a two-layer method according to Frederick. For this purpose, 0.01 cm ³ of a daily broth culture of lactobacilli grown on liquid MRS-1 nutrient medium was applied to a cup with MRS-4 sweaty nutrient medium using a bacteriological loop. Crops were incubated at a temperature of (37±1)°C for (24-4 4) hours. For lysis of lactobacilli cells grown on a nutrient medium, filter paper was placed on the lid of an inverted Petri dish, 1.0 cm ³ of chloroform was poured and exposed for 30 minutes, then the dish was ventilated for (3-5) minutes.

В качестве индикаторных культур использовали

клинических культур различных видов, в большинстве своем резистентных к различному набору антибиотиков, находящихся в коллекции микроорганизмов ФБУН ΓΗД ПМБ, Оболенск, Россия. Индикаторные тест-штаммы, в отношении которых оценивали антагонистическую активность, в течение суток подращивали в мясопептонном бульоне, затем добавляли по 0.5 см3 к 2,5 см³ расплавленного и охлажденного до температуры (56±1)°С мясопептонного полужидкого агара, быстро перемешивали и выливали на поверхность чашек с колониями лактобацилл. Наклоняя чашку из стороны в сторону, равномерно распределяли полужидкий агар по поверхности питательной среды MRS-4. Затем посевы инкубировали в течение (24±1) ч при температуре (37±1)°С. Антагонистическая активность проявлялась образованием зон ингибирования роста тест-штаммов вокруг колоний лактобацилл.used as indicator cultures.

clinical cultures of various species, most of which are resistant to a different set of antibiotics, which are in the collection of microorganisms of the FBUN ΓΗD PMB, Obolensk, Russia. The indicator test strains, against which the antagonistic activity was evaluated, were grown during the day in meat-peptone broth, then 0.5 cm3 were added to 2.5 ^cm3 of semi-liquid meat-peptone agar melted and cooled to a temperature of (56 ± 1) ° C, quickly mixed and poured onto the surface of the cups with colonies of lactobacilli. By tilting the dish from side to side, semi-liquid agar was evenly distributed over the surface of the MRS-4 nutrient medium. Then the crops were incubated for (24±1) h at a temperature of (37±1)°C. Antagonistic activity was manifested by the formation of zones of inhibition of the growth of test strains around colonies of lactobacilli.

Уровень антагонистической активности оценивали по следующим критериям: нулевая - при ширине зоны отсутствия роста до 1,0 мм, низкая - (1,1-,9) мм, средняя - (5,0-8,9) мм, высокая - 9,0 мм и более.The level of antagonistic activity was assessed according to the following criteria: zero - with a zone of absence of growth up to 1.0 mm, low - (1.1-.9) mm, medium - (5.0-8.9) mm, high - 9, 0 mm and more.

Оценку антагонистической активности исследуемых культур лактобактерий (Lactobacillus plantarum ПЛ-99, Lactobacillus buchneri БХ-99) осуществляли в условиях in vitro совместно с ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск. Полученные данные представлены в таблице 3. Антагонистическая активность лактобактерий обеспечивает подавление гнилостных бактерий, вызывающих порчу кормов, при внесении биопрепарата в силосуемую массу.The antagonistic activity of the studied cultures of lactobacilli (Lactobacillus plantarum PL-99, Lactobacillus buchneri BH-99) was assessed in vitro together with the FBSI SRC PMB, Obolensk. The data obtained are presented in Table 3. The antagonistic activity of lactobacilli ensures the suppression of putrefactive bacteria that cause feed spoilage when the biological product is introduced into the silage mass.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что штаммы: Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 и их смесь, выращенные на среде MRS-4 и изученные по методике Фредерика обладают высокой антагонистической активностью в отношении всех культур индикаторных штаммов.Based on the results obtained, it can be concluded that the strains: Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BX-99 and their mixture, grown on MRS-4 medium and studied by the Frederick method, have high antagonistic activity against all cultures of indicator strains.

Была произведена оценка совместимости лактобацилл с полиферментным препаратом.An assessment was made of the compatibility of lactobacilli with a polyenzymatic preparation.

Для определения совместимости штаммов лактобацилл L. plantarum ПЛ-99, L. buchneri БХ-99) с полиферментным препаратом «Биоферм» проводили смешение в соотношении: 3 части культуры (75,0 см³) и 1 часть фермента (25,0 см³). Смеси хранили при температуре (22±2)°С и (4±2)°С. Проводили высевы на плотную питательную среду MRS-4 для определения биологической концентрации лактобацилл сразу после смешения, на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки.To determine the compatibility of strains of lactobacilli L. plantarum PL-99, L. buchneri BH-99) with the polyenzyme preparation "Bioferm", mixing was carried out in the ratio: 3 parts of the culture (75.0 cm ³ ) and 1 part of the enzyme (25.0 cm ³ ). The mixtures were stored at (22±2)°C and (4±2)°C. Seeding was carried out on a dense nutrient medium MRS-4 to determine the biological concentration of lactobacilli immediately after mixing, on days 1, 3, 7, 14 and 30.

Критерием отсутствия влияния полиферментного препарата служил показатель выживаемости смеси лактобактерий при хранении при различных температурных режимах в течение 30 суток. Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5.The criterion for the absence of the influence of the polyenzymatic preparation was the survival rate of the mixture of lactobacilli during storage at various temperature conditions for 30 days. The results obtained are presented in tables 4 and 5.

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что компоненты полиферментного препарата не вызывают значительно о снижения концентрации лактобактерий.Based on the results obtained, it can be concluded that the components of the polyenzymatic preparation do not cause a significant decrease in the concentration of lactobacilli.

Опыты по определению эффективности консервирования с использованием разработанного биологического препарата в отношении различных видов трав, в том числе трудносилосуемых, проводили в лабораторных условиях. Лабораторный метод позволяет проводить многовариантные исследования. Опыты были заложены и проводились в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению опытов по консервированию и хранению объемистых кормов». Силос заготавливается из клевера лугового, относящегося к трудносилосуемым культурам, а так же люцерны, бобово-злаковой смеси.Experiments to determine the effectiveness of conservation using the developed biological preparation in relation to various types of herbs, including hard-to-silage ones, were carried out in laboratory conditions. The laboratory method allows for multivariate studies. The experiments were laid down and carried out in accordance with the "Methodological recommendations for conducting experiments on the conservation and storage of bulky feed." Silage is harvested from red clover, which belongs to hard-to-silage crops, as well as alfalfa, a legume-cereal mixture.

Исходную зеленую массу измельчали до размера резки (1-2) см, обрабатывали консервантом из расчета 40,0 см³ на 1 т зеленой массы в соответствии с «Инструкция по применению универсального биологического препарата для к «сервирования растительных кормов» и закладывали (уплотняя) в предварительно подготовленные емкости, а затем тщательно утрамбовывали. Для закладки силоса были использованы стеклянные бутыли емкостью 0,5 дм3, оборудованные приспособлением для отведения газов брожения, выделяемых при силосовании. Используемые емкости удобны; ля заполнения и герметизации силосуемой массы. По окончании опытного периода определял ι кислотность силоса (ед. рН), содержание аммиака, количество кислот: молочной, уксусной, масляной, суммарное количество других кислот, а также содержание молочной кислоты от общей суммы кислот. Результаты проведенных испытаний представлены в таблице 6.The initial green mass was crushed to a cutting size (1-2) cm, treated with a preservative at the rate of 40.0 cm ³ per 1 ton of green mass in accordance with the "Instruction for the use of a universal biological preparation for serving vegetable feed" and laid (compacting) in pre-prepared containers, and then carefully tamped. For laying the silage, glass bottles with a capacity of 0.5 dm3 were used, equipped with a device for removing fermentation gases released during silage. The containers used are convenient; for filling and sealing the silage mass. At the end of the experimental period, we determined ι acidity of silage (pH units), ammonia content, the amount of acids: lactic, acetic, butyric, the total amount of other acids, as well as the content of lactic acid from the total amount of acids. The results of the tests performed are presented in table 6.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что в результате внесения в силосуемую массу разработанного биопрепарата происходит закисление всех видов исследуемых трав до величины рН (3,77-4,04) ед. рН за счет молочной кислоты, содержание которой составляет (88,53-93,65) % от суммы всех кислот.The analysis of the obtained results indicates that as a result of the introduction of the developed biological product into the silage mass, acidification of all types of the studied herbs occurs to a pH value of (3.77-4.04) units. pH due to lactic acid, the content of which is (88.53-93.65)% of the sum of all acids.

Для оценки эффективности разработанного биологического препарата на базе Кировской лугоболотной опытной станции были проведены полевые испытания по определению консервирующей способности. Силос был заготовлен из свежескошенной и провяленной массы многолетних злаковых трав. Исходную зеленую массу измельчали до размеров резки (2-3) см и закладывали в предварительно подготовленную траншею. Силосуемую массу в траншее укладывали ровными слоями по всей длине траншеи уплотнение закладываемой массы проводили в течение всего процесса заполнения траншеи, после чего силосохранилище немедленно укрывали полиэтиленовой пленкой и прижимали ее по всей поверхности грузом. Для сохранения качества приготовленного корма соблюдались правила, которые затрудняли проникновение воздуха и прежде всего не нарушалась монолитность корма в той его части, которая в этот день не будет использована. После выемки дневной порции корма срез силоса прикрывался газонепроницаемым пологом. Для силосования растительных кормов использовали экспериментальный образец закваски на основе штаммов Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri, а также полиферментного комплекса, содержащего целлюлазу, ксиланазу, пектин-лиазу. Общая активность ферментов составляет не менее 1700 ед./г.To evaluate the effectiveness of the developed biological preparation on the basis of the Kirov Meadow Swamp Experimental Station, field tests were carried out to determine the preservative capacity. The silage was harvested from freshly cut and dried mass of perennial grasses. The initial green mass was crushed to a cutting size (2-3) cm and laid in a previously prepared trench. The silage mass in the trench was laid in even layers along the entire length of the trench, the compaction of the laid mass was carried out during the entire process of filling the trench, after which the silo was immediately covered with a plastic film and pressed over the entire surface with a load. In order to preserve the quality of the prepared feed, rules were observed that made it difficult for air to penetrate and, above all, the solidity of the feed was not violated in that part of it that would not be used that day. After taking out the daily portion of feed, the silo section was covered with a gas-tight canopy. For ensiling plant feed, an experimental sample of a starter culture based on strains of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus buchneri, as well as a polyenzyme complex containing cellulase, xylanase, and pectin-lyase, was used. The total activity of enzymes is at least 1700 units/g.

Для силосования растительной массе 1,0 дм³ биопрепарата разводили в 24 дм³ водопроводной воды и после тщательно перемешивания внос ι ли в силосуемую массу. При таком способе приготовления на 1 тонну силосуемой массы приходится 1,0 дм³ рабочего раствора.For ensiling the plant mass, 1.0 dm ³ of the biological product was diluted in 24 dm ³ of tap water, and after thorough mixing, ι was added to the silage mass. With this method of preparation, 1.0 dm ³ of the working solution per 1 ton of ensiled mass.

Оценку изменения рН в силосуемой массу проводили через один месяц после закладки и через 7 месяцев - на момент вскрытия траншеи. Результаты оценки изменения рН представлены в таблице 7.The pH change in the ensiled mass was assessed one month after laying and after 7 months - at the time of opening the trench. The results of the assessment of the change in pH are presented in table 7.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в результате внесения разрабатываемого препарата в силосуемую массу происходило закисление корма за счет молочной и уксусной кислот. Среднесуточные надои молока при использовании этого силоса составили 24,1 кг/сутки от коровы при среднем аналогичном показателе по Кировской области 21,8 кг/сутки.The results obtained indicate that as a result of the introduction of the developed drug into the silage mass, the feed was acidified due to lactic and acetic acids. The average daily milk yield when using this silage amounted to 24.1 kg/day per cow, with an average similar indicator for the Kirov region of 21.8 kg/day.

Также были определены потребительские свойства заявляемого биопрепарата Анализ результатов теоретической оценки показателя минимальной эффективной дозы молочнокислых микроорганизмов, обеспечивающей силосование трав, свидетельствует о том, что эта величина составляет не менее 1,0⋅104 КОЕ в 1 г силосуемой массы. Для оценки минимальной эффективной дозы в одном см³ разработанного препарата был произведен расчет этой величины с учетом разбавления конечного продукта перед его применением. Величина минимально эффективной дозы микроорганизмов в 1,0 см³ закваски для силосования с учетом того, что на одну тонну зеленой массы наносят 40 см³ биопрепарата составляет по формуле:The consumer properties of the claimed biological product were also determined. To estimate the minimum effective dose in one cm ³ of the developed drug, this value was calculated taking into account the dilution of the final product before its use. The value of the minimum effective dose of microorganisms in 1.0 cm ³ of ensiling starter, taking into account the fact that 40 cm ³ of a biological product is applied per ton of green mass, is according to the formula:

Таким образом, установлено, что минимальная концентрация лактобактерий в разрабатываемом препарате для силосования трав должна быть не менее 2,5⋅108 живых микробных клеток. В свежеприготовленном продукте это значение в 40 раз больше.Thus, it has been established that the minimum concentration of lactobacilli in the developed preparation for grass ensiling should be at least 2.5⋅108 living microbial cells. In a freshly prepared product, this value is 40 times greater.

Оценку изменения минимальной эффективной кон нитрации микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата, осуществляли при хранении при температуре (4±2)°С и (24±2)°С. С этой целью оценивали показатель КОЕ, который оп оделяли через 1, 3 и 6 месяцев хранения. Результаты исследований представлены в таблицах 8 и 9.The assessment of changes in the minimum effective concentration of microorganisms that are part of the biological product was carried out during storage at a temperature of (4±2)°C and (24±2)°C. For this purpose, the CFU index was evaluated, which was determined after 1, 3, and 6 months of storage. The research results are presented in tables 8 and 9.

Полученные результаты показали, что при температуре хранения (4±2)°С концентрация лактобактерий через 6 месяцев остается выше минимальной эффективной концентрации, тогда как при температуре (24±2)°С концентрация лактобактерий соответствует минимально эффективной только в течение 3 месяцев в хранения.The results obtained showed that at a storage temperature of (4±2)°C, the concentration of lactobacilli after 6 months remains above the minimum effective concentration, while at a temperature of (24±2)°C, the concentration of lactobacilli corresponds to the minimum effective concentration only during 3 months of storage.

Исходя из полученных результатов режим хранения готового универсального биопрепарата для консервирования растительных кормов - 6 месяцев при температуре (4±2)°С.Based on the obtained results, the storage mode of the finished universal biological product for the conservation of vegetable feed is 6 months at a temperature of (4±2)°C.

Claims (2)

1. Биологический препарат для консервирования растительных кормов, состоящий из 3 частей жидких микробных культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 в соотношении 1:1 с конечной концентрацией не менее 1,0⋅10⁹ КОЕ/см³ и одной части полиферментного комплекса, содержащего целлюлазу, активность не менее 400 ед/см³, ксиланазу, активность не менее 1700 ед/см³, и пектин-лиазу, активность не менее 5000 ед/см³.1. Biological preparation for preserving vegetable feed, consisting of 3 parts of liquid microbial cultures Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BX-99 in a ratio of 1:1 with a final concentration of at least 1.0⋅10 ⁹ CFU / cm ³ and one part polyenzymatic complex containing cellulase, activity not less than 400 U/cm ³ , xylanase, activity not less than 1700 U/cm ³ , and pectin-lyase, activity not less than 5000 U/cm ³ . 2. Способ получения биологического препарата для консервирования растительных кормов по п. 1, включающий культивирование культур Lactobacillus plantarum и Lactobacillus buchneri в жидкой питательной лактозно-мелассной среде без аэрации до достижения концентрации живых микроорганизмов не менее 4,0⋅10⁹ КОЕ/см³ и последующее смешение 3 частей жидких микробных культур Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 в соотношении 1:1 и одной части полиферментного комплекса, содержащего целлюлазу, активность не менее 400 ед/см³, ксиланазу, активность не менее 1700 ед/см³, и пектин-лиазу, активность не менее 5000 ед/см³.2. A method for obtaining a biological preparation for preserving vegetable feed according to claim 1, including cultivating cultures of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus buchneri in a liquid nutrient lactose-molasses medium without aeration until the concentration of live microorganisms is not less than 4.0⋅10 ⁹ CFU/cm ³ and subsequent mixing of 3 parts of liquid microbial cultures of Lactobacillus plantarum PL-99 and Lactobacillus buchneri BH-99 in a ratio of 1:1 and one part of a polyenzymatic complex containing cellulase, activity of at least 400 U/cm ³ , xylanase, activity of at least 1700 U/cm ³ and pectin-lyase, activity not less than 5000 U/cm ³ .