RU2783710C1 - Способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза. Способ включает: нанесение исследуемого материала на подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, на которую точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды физиологическим раствором, затем помещают в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на физиологическом растворе на 15 мин, затем подложку двукратно промывают физиологическим раствором, однократно дистиллированной водой и помещают в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, с экспозицией на 40 мин. После этого двукратно промывают подложку физиологическим раствором и однократно - дистиллированной водой, затем погружают ее на 3 мин в проявитель, при этом проявитель представляет собой водный раствор, состоящий из 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра и затем промывают проточной водой. Затем визуально определяют наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале. Если на подложке в местах нанесения материала формируются пятна, окрашенные в серый цвет от темно-серого до светло-серого, то исследуемый материал содержит возбудитель псевдотуберкулеза, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит возбудителя псевдотуберкулеза. Способ позволяет обнаруживать минимальные количества возбудителя псевдотуберкулеза, экспрессен (общее время проведения анализа -1 ч 10 мин), экономичен, прост в постановке и учете результатов реакции, доступен для широкого применения, в том числе в полевых условиях, не требует оснащения дорогостоящими реактивами, оборудованием и специально обученного персонала. 4 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике и иммунологии, и может быть использовано для обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза в клиническом материале и в объектах окружающей среды.

В настоящее время около 70% всех регистрируемых болезней человека имеют инфекционную этиологию. Контроль за распространением инфекций в мире актуален в условиях современных темпов и масштабов миграции населения. Псевдотуберкулез относится к «эмерджентным» (emergency) пищевым зоонозам, эпидемические проявления которого возникают внезапно, без видимых предвестников. По социально-экономической значимости, частоте распространения энтеропатогенные иерсинии в Европейском союзе занимают третье место после возбудителей сальмонеллеза и кампилобактериоза; в Российской Федерации псевдотуберкулез регистрируется практически повсеместно в виде спорадической и вспышечной заболеваемости, при этом наиболее высокие показатели характерны для сибирского, дальневосточного и северо-западного федеральных округов. Возникновение массовых эпидемических осложнений этой инфекционной болезни возможно также при стихийных бедствиях и катастрофах в местах размещения пострадавшего населения, в виду увеличения численности грызунов и появления среди них эпизоотий, что приводит к контаминации возбудителем воды и пищевых продуктов.

Важнейшей предпосылкой эффективности мероприятий, проводимых при возникновении эпидемических очагов, является своевременное обнаружение патогенных биологических агентов, что требует быстрой и достоверной диагностики. В этом плане методы, направленные на обнаружение специфических антигенов возбудителя как при исследовании клинического материала от больных, так и проб из объектов окружающей среды (пищевые продукты, вода, смывы и др.), являются наиболее перспективными.

В настоящее время известно достаточно много способов обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза: гемагглютинационные (реакция непрямой гемагглютинации - РИГА), агглютинационные (реакции коагглю-тинации и латекс-агглютинации), твердофазные иммунохимические методы (иммуноферментный анализ - ИФА), тонкослойный иммунный анализ и другие. Несмотря на эффективные диагностические возможности в эксперименте, разработанные способы обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза сложны, дороги и малодоступны, так как для их осуществления необходимы сложная аппаратура и специально обученный персонал. Поэтому разработка новых надежных, простых, экспрессных, не дорогих способов обнаружения возбудителя туберкулеза, не требующих использования сложной аппаратуры для постановки анализа и учета результатов и специальной подготовки персонала, пригодных для скрининга исследуемого материала как в период эпидемического неблагополучия, так и выполнения индивидуальных анализов для верификации диагноза, остается актуальной задачей.

Известен способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза методом флуоресцирующих антител (МФА) с использованием иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих псевдотуберкулезных адсорбированных лошадиных производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов. Для постановки МФА исследуемый образец растворяют в 1 мл дистиллированной воды в течение 3 мин при встряхивании, далее разводят 0,9% раствором натрия хлорида рН 7,2 до титра, соответствующего рабочему разведению препарата, указанному на этикетке ампулы. На поверхность фиксированного и высушенного мазка, помещенного во влажную камеру, наносят каплю рабочего разведения иммуноглобулинов флуоресцирующих псевдотуберкулезных. Через 20 мин мазки ополаскивают дистиллированной водой и промывают 0,9% раствором натрия хлорида 2 раза по 5 мин. После этого препараты вновь ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. На готовые мазки наносят каплю глицерина, накрывают покровным стеклом и просматривают в люминесцентном микроскопе с применением иммерсионного нефлуоресцирующего масла. Постановку МФА осуществляют прямым методом на люминесцентном микроскопе с использованием иммерсионных объективов при увеличении 7×90 и специального иммерсионного не флуоресцирующего масла с nD²⁰=1,515±0,002. Интенсивность специфической флуоресценции оценивают по следующей шкале: 4+ - очень яркое изумрудно-зеленое свечение по периферии клеток с четко выраженной морфологией; 3+ - свечение менее яркое, но морфология клеток хорошо различима; 2+ - свечение слабое, морфология клетки различается с трудом; 1+ - очень слабое свечение, морфология клетки не различима. Положительным результатом считается люминесценция клеток на 4+ и 3+при наличии не менее 3-5 специфически светящихся клеток в препарате. (Беседнова Н.Н. Применение метода флюоресцирующих антител с целью выявления возбудителя псевдотуберкулеза // Журн. микроб. - 1973 - №5. -. 28-31; Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство/ Под ред. академика РАМН Г.Г. Онищенко, академика РАМН В.В. Кутырева - изд. 2-е переработанное и дополненное - М.: ЗАО «Шико», 2013. - С. 501).

Однако данный способ дорог и малодоступен, т.к. для его осуществления необходимо оснащение лаборатории люминесцентным микроскопом (дорогостоящее оборудование) и расходными материалами: люминесцирующими сыворотками, не флуоресцирующим иммерсионным маслом, специальными стеклами для люминесцентной микроскопии.

Наиболее близким к предлагаемому является способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза, включающий адсорбцию исследуемого материала, содержащего корпускулярные антигены Yersinia pseudotuberculosis, на нитроцеллюлозной мембране, промывание фосфатно-буферным раствором (ФБР) с добавлением твина 20, блокирование свободных сайтов связывания раствором 1% казеината натрия, промывание подложки ФБР с твином 20 и водой, детекцию адсорбированных на твердой фазе антигенов с помощью соответствующих IgG, меченных наночастицами коллоидного металла (серебра) размером 5-9 нм, промывание подложки ФБР-твином и водой. Визуализацию результатов реакции проводили погружением мембран в раствор проявителя, состоящего из метола, лимонной кислоты и азотнокислого серебра, с последующим промыванием ее проточной водой. Пробы, содержащие искомые антигены, выявлялись в виде серых пятен (разной интенсивности окрашивания). В отрицательных контролях окрашивание не развивалось. Общее время проведения анализа -2 ч. Чувствительность анализа 5⋅10⁵ м.к./мл. (Загоскина Т.Ю., Чеснокова М.В., Климов В.Т., Попова Ю.О., Марков Е.Ю., Старикова О.А. Конструирование тест-системы с наночастицами коллоидного серебра для обнаружения возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в дот-иммуноанализе//Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2017. - №1. - С. 58.).

Однако данный способ имеет следующие недостатки: казеинат натрия используется в виде суспензии, т.к. очень плохо растворяется в жидкостях. Для того чтобы суспензия прочно не адсорбировалась на мембране, не забивала нанесенный исследуемый материал и не ухудшила в последствии условия взаимодействия иммунных реагентов требуется дополнительное перемешивание раствора на этапе забивки свободных участков на подложке раствором казеината натрия с постоянным использованием шуттель-аппарата и более тщательная промывка мембраны: в большем объеме промывающей жидкости и более длительным периодом отмывки. Это удлиняет время обнаружения возбудителя. Используемые в процессе осуществления способа реагенты для приготовления раствора для промывания подложки (фосфатно-буферный раствор, твин 20) влияют на скорость и прочность связывания иммунных реагентов, снижают интенсивность окрашивания пятен, в результате чего не всегда можно четко визуализировать полученный результат, что снижет чувствительность анализа.

Задача изобретения - расширение арсенала способов обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза, повышение чувствительности способа, сокращение времени обнаружения.

Технический результат достигается тем, что на твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды физиологическим раствором (0,15 М хлорид натрия) (ФР), затем помещают подложку в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин (без дополнительного перемешивания). Далее подложку двукратно промывают ФР, однократно дистиллированной водой и помещают в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, на 40 мин. После двукратного промывания подложки ФР и однократного - дистиллированной водой, погружают подложку на 3 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, и затем промывают проточной водой. Наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале определяют визуально по формированию окрашенных в серый цвет разной интенсивности: от темно-серого (4+) до светло серого (1+) пятен в местах нанесения материала, отсутствие окрашивания указывает на отрицательный результат. Общее время проведения анализа 1 ч 10 мин. Чувствительность анализа 10⁴ м.к./мл.

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что на твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды физиологическим раствором (0,15 М хлорид натрия), затем помещают в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин. После чего подложку двукратно промывают ФР, однократно дистиллированной водой и помещают в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, с экспозицией на 40 мин. Вновь двукратно промывают подложку ФР и однократно - дистиллированной водой, погружают на 3 мин. в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, и промывают проточной водой. Визуально определяют наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале: если на подложке формируются пятна, окрашенные в серый цвет разной интенсивности в местах нанесения материала, то исследуемый материал содержит возбудитель псевдотуберкулеза, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит возбудителя псевдотуберкулеза.

Таким образом, предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и специальной литературы показал, что предлагаемый способ отличается не только от прототипа, но и от других способов обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза. Предлагаемые режимы способа позволяют быстро получить четкое интенсивное окрашивание пятен на подложке, за счет сохранения прочности связывания исследуемого материала с иммуноглобулином G, меченным коллоидным серебром. Таким образом, предлагаемый способ позволяет с высокой чувствительностью, быстро обнаруживать возбудителя псевдотуберкулеза в клиническом материале и в объектах окружающей среды. Предлагаемые режимы способа позволяют повысить эффективность обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза за счет высокой чувствительности (10⁴ м.к./мл), методического упрощения осуществления способа в виду независимости от приборного обеспечения и дорогостоящих реактивов, простоты в постановке и учете результатов реакции.

При этом предлагаемый способ специфичен, характеризуется отсутствием положительного реагирования с использованными гетерологичными штаммами Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Yersinia pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл, инактивированными кипячением на водяной бане в течение 20 мин., и позволяет обнаруживать возбудителя псевдотуберкулеза в концентрациях ≥ 10⁴ м.к./мл в объеме пробы 1-2 мкл.

Данный способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза может быть использован в клинических, санитарно-гигиенических и научно-исследовательских лабораториях, занимающихся исследованиями на псевдотуберкулез. Предлагаемый способ доступен для широкого применения, дешев, его можно осуществить в слабо оснащенных лабораториях и полевых условиях.

Таким образом, предлагаемый способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза осуществляется следующим образом: на твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл. После полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды физиологическим раствором (ФР), затем ее помещают в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин. После чего подложку двукратно промывают ФР и однократно дистиллированной водой, далее помещают в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, на 40 мин. После двукратного промывания подложки ФР и однократного - дистиллированной водой погружают на 3 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, и затем промывают проточной водой. После чего визуально определяют наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале: если на подложке формируются серые пятна разной интенсивности (1+ - 4+) в местах нанесения материала, - исследуемый материал содержит возбудитель псевдотуберкулеза, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит возбудителя псевдотуберкулеза. Чувствительность анализа составляет ≥ 10⁴ м.к./мл Y. pseudotuberculosis в объеме пробы 1-2 мкл. Общее время проведения анализа -1 ч 10 мин.

Параллельно ставят отрицательные контроли (разводящая жидкость, гетерологичные микроорганизмы Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл, инактивированные кипячением на водяной бане в течение 20 мин). В местах нанесения возбудителя псевдотуберкулеза формируются серые пятна, в местах нанесения разводящей жидкости и гетерологичных микроорганизмов серые пятна не формируются, подложка сохраняет первоначальный белый цвет.

Пример 1. Обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в биологическом материале проводили по предлагаемому способу как описано выше: на твердую подложку (нитроцеллюлозную мембрану) с размером пор 0,17 мкм точечно наносили в виде капель испражнения здорового лабораторного животного, контаминированные штаммами Y. pseudotuberculosis №65 и №71 концентрацией 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл в объеме 1 мкл (1 г испражнений, контаминированные штаммами Y. pseudotuberculosis №65 и №71 концентрацией 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, суспендировали в 10 мл дистиллированной воды) из рабочей коллекции отдела эпидемиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали физиологическим раствором, затем оставшиеся свободные участки на подложке блокировали погружением подложки в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин. После чего подложку двукратно промывали ФР и однократно дистиллированной водой, затем помещали в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, на 40 мин. После двукратного промывания подложки ФР и однократного - дистиллированной водой, ее погружали на 3 мин. в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, после чего промывали проточной водой. Визуально определяли наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале: на подложке в местах нанесения образцов (испражнения), контаминированных Y. pseudotuberculosis в концентрациях 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, формировались пятна серого цвета интенсивностью 1+ - 4+, в местах нанесения отрицательных кон-тролей (разводящая жидкость, гетерологичные микроорганизмы Esche-richia coli, Y. enterocolitica, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл, (инактивированные кипячением на водяной бане в течение 20 мин), окрашенных пятен не регистрировалось. Чувствительность анализа составляла ≥ 10⁴ м.к./мл Y. pseudotuberculosis в объеме пробы 1 мкл. Общее время проведения анализа - 1 ч 10 мин.

Одновременно проводили обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в биологическом материале по способу-прототипу: на нитроцеллюлоз-ную мембрану точечно наносили в виде капель испражнения здорового лабораторного животного, контаминированные штаммами Y. pseudotuberculosis №65 и №71 концентрацией 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл в объеме 1 мкл (1 г испражнений, контаминированные штаммами Y. pseudotuberculosis №65 и №71 концентрацией 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, суспендировали в 10 мл дистиллированной воды). После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали 0.01 М фосфатным буфером рН 7,2, содержащим 0,05 % твина 20, затем оставшиеся свободные участки на подложке блокировали погружением подложки в 1% раствор казеината натрия на ФБР на 30 мин. при постоянном перемешивании на шуттель-аппарате. После чего подложку интенсивно (15-20 мин) двукратно промывали ФБР-твином и однократно дистиллированной водой, затем помещали в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, на 1 ч. После двукратного промывания подложки ФБР и однократного -дистиллированной водой, ее погружали на 5 мин. в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, после чего про-мывали проточной водой. Визуально регистрировали результат анализа: на подложке в местах нанесения образцов (испражнения), контаминированных Y. pseudotuberculosis в концентрациях 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, формировались пятна серого цвета интенсивностью 1+ - 3+, в местах нанесения Y. pseudotuberculosis в концентрации 10⁴, 5⋅10⁴ и в местах нанесения отрицательных контролей (разводящая жидкость, гетерологичные микроорганизмы Escherichia coli, Y. enterocolitica, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл, инактивированные кипячением на водяной бане в течение 20 мин), окрашенных пятен не регистрировалось. Чувствительность анализа составляла ≥ 10⁵ м.к./мл Y. pseudotuberculosis в объеме пробы 1 мкл, но интенсивность окраски сформировавшихся пятен была ниже. Время проведения анализа - 2 ч.

В МФА все образцы биологического материала от животного давали изумрудно-зеленое свечение на 2+ и 4+. Разводящая жидкость и гетерологичные микроорганизмы E. coli, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Y. pestis EV, взятые в концентрациях < 10⁸ м.к./мл в качестве отрицательных контролей (для проверки специфичности), не флуоресцировали.

Пример 2. Обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале (смыв с овощей (капуста), контаминированном возбудителем псевдотуберкулеза) проводили, как описано выше: на нитроцеллюлозную мембрану (твердую подложку с размером пор 0,45 мкм) точечно наносили в виде капель объемом 2 мкл исследуемые образцы (смывы с капусты, контаминированные штаммами Y. pseudotuberculosis №№65, 71, 74, 66, 44 концентрацией 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл) из рабочей коллекции отдела эпидемиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института. После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали физиологическим раствором, затем оставшиеся свободные участки на подложке блокировали погружением подложки в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин. После чего подложку двукратно промывали ФР и однократно дистиллированной водой, затем ее помещали в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, на 40 мин. После двукратного промывания подложки ФР и однократного - дистиллированной водой, ее погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, после чего промывали проточной водой. Визуально регистрировали результат анализа: на подложке места нанесения образцов (смывов с капусты), контаминированных Y. pseudotuberculosis в концентрациях 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, окрашивались в серый цвет интенсивностью 1+ - 4+, в местах нанесения отрицательных контролей (разводящая жидкость, гетерологичные микроорганизмы Е. coli, S. typhimurium, Sh. flexneri, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл, инактивированные кипячением на водяной бане в течение 20 мин), окрашивание отсутствовало. Чувствительность анализа составляла ≥ 10⁴ м.к./мл Y. pseudotuberculosis в объеме пробы 2 мкл. Общее время проведения анализа - 1 ч 10 мин.

Одновременно проводили обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале (смыв с овощей (капуста), контаминированном возбудителем псевдотуберкулеза) по способу-прототипу (на подложку точечно наносили в виде капель объемом 2 мкл исследуемые образцы (смывы с капусты, контаминированные штаммами Y. pseudotuberculosis №№65, 71, 74, 66, 44 концентрацией 10⁴, 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл). Визуально регистрировали результат анализа: на подложке места нанесения образцов (смывов с капусты), контаминированных Y. pseudotuberculosis в концентрациях 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, окрашивались в серый цвет интенсивностью 1+ - 3+, в местах нанесения Y. pseudotuberculosis в концентрации 10⁴, 5⋅10⁴ окрашивание отсутствовало, в отрицательных контролях (разводящая жидкость, гетерологичные микроорганизмы Е. coli, S. typhimurium, Sh. flexneri, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл, инактивированные кипячением на водяной бане в течение 20 мин), окрашивание отсутствовало. Чувствительность анализа составляла ≥ 10⁵ м.к./мл Y. pseudotuberculosis в объеме пробы 2 мкл, но интенсивность окраски сформировавшихся пятен была ниже. Общее время проведения анализа -2 ч.

В МФА все исследованные образцы смывов с капусты, контаминированные Y. pseudotuberculosis в концентрациях 5⋅10⁴, 10⁵, 5⋅10⁵, 10⁶, 5⋅10⁶, 10⁷, 5⋅10⁷, 10⁸, 5⋅10⁸, 10⁹ м.к./мл, давали изумрудно-зеленое свечение на 2+ - 3+. Образцы смывов, контаминированные Y. pseudotuberculosis в концентрации 10⁴ и отрицательные контроли (разводящая жидкость, гетерологичные микроорганизмы Е. coli, S. typhimurium, Sh. flexneri, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл), не флуоресцировали.

Пример 3.

Обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в клиническом материале, поступившем из инфекционной больницы, от больной с установленным диагнозом «псевдотуберкулез» проводили следующим образом: на твердую подложку с размером пор 0,17 мкм точечно наносили в виде капель испражнения больной в объеме 1 мкл (1 г испражнений, суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора). После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФР, затем оставшиеся свободные участки на подложке блокировали погружением подложки в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин. После чего подложку двукратно промывали ФР и однократно дистиллированной водой, затем помещали в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра, на 40 мин. После двукратного промывания подложки ФР и однократного - дистиллированной водой, ее погружали на 3 мин. в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, после чего промывали проточной водой. Визуально определяли наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале: на подложке в местах нанесения образцов (испражнения) формировались пятна серого цвета интенсивностью 4+, в местах нанесения отрицательных контролей (разводящая жидкость), окрашенных пятен не регистрировалось. Общее время проведения анализа - 1 ч 10 мин.

Одновременно проводили обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в клиническом материале, поступившем из инфекционной больницы, от больной с установленным диагнозом «псевдотуберкулез» по способу-прототипу (на подложку точечно наносили в виде капель испражнения в объеме 1 мкл -1 г испражнений, суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора). Визуально определяли наличие возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале: на подложке в местах нанесения образцов (испражнения) формировались пятна серого цвета интенсивностью 3+, в местах нанесения отрицательных контролей (разводящая жидкость), окрашенных пятен не регистрировалось. Общее время проведения анализа -2 ч.

В МФА все образцы клинического материала от больной давали изумрудно-зеленое свечение на 4+. Разводящая жидкость не флуоресцировала.

Пример 4.

Обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в клиническом материале, поступившем из инфекционной больницы, от больного с установленным диагнозом «дизентерия» проводили следующим образом: на твердую подложку с размером пор 0,45 мкм точечно наносили в виде капель испражнения больного в объеме 1 мкл (1 г испражнений, суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора). После полного впитывания материала и подсыхания подложки ее помещали в чашку Петри и дважды промывали ФР, затем оставшиеся свободные участки на подложке блокировали погружением подложки в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на ФР на 15 мин. После чего подложку двукратно промывали ФР и однократно дистиллированной водой, затем помещали в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра, на 40 мин. После двукратного промывания подложки ФР и однократного - дистиллированной водой, ее погружали на 3 мин в водный раствор, содержащий 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра, после чего промывали проточной водой. Визуально оценивали результаты анализа: на подложке в местах нанесения образцов (испражнения) и в местах нанесения отрицательных контролей (разводящая жидкость), окрашенных пятен не регистрировалось. Общее время проведения анализа - 1 ч10 мин.

Одновременно проводили обнаружение возбудителя псевдотуберкулеза в клиническом материале, поступившем из инфекционной больницы, от больного с установленным диагнозом «дизентерия» по способу-прототипу (на подложку точечно наносили в виде капель испражнения в объеме 1 мкл (1 г испражнений, суспендировали в 10 мл стерильного физиологического раствора). Визуально оценивали результаты анализа: на подложке в местах нанесения образцов (испражнения) и в местах нанесения отрицательных контролей (разводящая жидкость), окрашенных пятен не регистрировалось. Общее время проведения анализа -2 ч.

В МФА все образцы клинического материала от больного и разводящая жидкость были отрицательными.

Указанный способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза использован при анализе 35 штаммов Y. pseudotuberculosisws рабочей коллекции отдела эпидемиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института. По сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза более чувствителен, доступен, экономически выгоден, экспрессен, не требует использования дополнительного оборудования и реактивов, позволяет легче регистрировать результаты анализа за счет формирования более четких, интенсивнее окрашенных пятен, может осуществляться в слабо оснащенных лабораториях, в полевых условиях в режиме ЧС.

Чувствительность предлагаемого способа обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза составляет ≥ 10⁴ м.к./мл в исследуемом образце объемом 1-2 мкл. Общее время проведения анализа - 1 ч10 мин. Ложноположительные результаты при исследовании разводящей жидкости и гетерологичных микроорганизмов Е. coli, S. typhimurium, Sh. flexneri, Y. pestis EV в концентрациях < 10⁸ м.к./мл отсутствуют.

Claims (1)

1. Способ обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза, включающий нанесение исследуемого материала на подложку, блокирование свободных сайтов связывания раствором инертного белка, помещение подложки в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, погружение подложки в раствор проявителя, состоящего из лимонной кислоты, метола и азотнокислого серебра, с последующим промыванием ее проточной водой, и визуальное определение наличия возбудителя псевдотуберкулеза в исследуемом материале: если на подложке в местах нанесения материала формируются пятна, окрашенные в серый цвет от темно-серого до светло-серого, то исследуемый материал содержит возбудитель псевдотуберкулеза, если на подложке нет окрашивания - материал не содержит возбудителя псевдотуберкулеза, отличающийся тем, что используют твердую подложку с размером пор 0,17-0,45 мкм, на которую точечно наносят исследуемый материал в объеме 1-2 мкл, после полного впитывания исследуемого материала подложку промывают дважды физиологическим раствором, затем помещают в 2% раствор бычьего сывороточного альбумина на физиологическом растворе на 15 мин, затем подложку двукратно промывают физиологическим раствором, однократно дистиллированной водой и помещают в раствор иммуноглобулина G, выделенного из агглютинирующей псевдотуберкулезной сыворотки, меченного частицами коллоидного серебра размером 5-9 нм, с экспозицией на 40 мин, после чего двукратно промывают подложку физиологическим раствором и однократно - дистиллированной водой, затем погружают ее на 3 мин в проявитель, при этом проявитель представляет собой водный раствор, состоящий из 0,5% лимонной кислоты, 0,1% метола и 0,2% азотнокислого серебра.