RU2783314C2

RU2783314C2 - Antibodies against ox40 and their use

Info

Publication number: RU2783314C2
Application number: RU2020116668A
Authority: RU
Inventors: И Ян; Янань ГО; Юньюнь ЧЭНЬ; Цзиншу СЕ; Чуньянь ДУН; Фан ЯН; Чэнюань ЛУ; Сяодун ЧЭН; Юэлэй ШЭНЬ; Цзянь НИ
Original assignee: Юкьюр (Бэйцзин) Байофарма Ко., Лтд
Filing date: 2017-11-24
Publication date: 2022-11-11

Abstract

FIELD: biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biochemistry, in particular to an antibody or its antigen-binding fragment, which binds to OX40, its production method, as well as to a conjugate containing it, and a composition. Nucleic acid encoding chains of the antibody or its antigen-binding fragment, which binds to OX40, as well as a vector containing it, and a cell are also disclosed. The invention also relates to the use of the above-mentioned antibody or its antigen-binding fragment for the production of a bispecific antibody.

EFFECT: invention allows for effective treatment of an individual with malignant tumor.

64 cl, 35 dwg, 16 tbl, 13 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящее изобретение относится к антителам против OX40 (представитель 4 суперсемейства рецепторов TNF, или TNFRSF4) и к их применениям.The present invention relates to antibodies against OX40 (a member of the 4 TNF receptor superfamily, or TNFRSF4) and their uses.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Злокачественная опухоль в настоящее время является одним из заболеваний, которые имеют наиболее высокую смертность у человека. В соответствии со статистическими данными Всемирной организации здравоохранения, в 2012 году частота встречаемости злокачественной опухоли по всему миру и смертельных случаев достигала 14 миллионов и 8,2 миллиона, соответственно. В Китае количество вновь диагностированных случаев злокачественной опухоли составило 3,07 миллиона, и число погибших составило 2,2 миллиона.Malignant tumor is currently one of the diseases that have the highest mortality rate in humans. According to statistics from the World Health Organization, in 2012 the incidence of cancer worldwide and deaths reached 14 million and 8.2 million, respectively. In China, the number of newly diagnosed cases of cancer was 3.07 million and the death toll was 2.2 million.

Недавний клинический и коммерческий успех антител против злокачественной опухоли создал значительный интерес к терапевтическим средствам на основе антител. Существует необходимость в разработке антител против злокачественной опухоли для применения в различных терапевтических средствах на основе антител для лечения злокачественных опухолей.The recent clinical and commercial success of antibodies against cancer has generated considerable interest in antibody therapeutics. There is a need to develop anti-cancer antibodies for use in various antibody-based therapeutics for the treatment of cancer.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к антителам против OX40, их антигенсвязывающим фрагментам, и к их применениям. The present invention relates to anti-OX40 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and their uses.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с OX40 (представитель 4 суперсемейства рецепторов TNF), содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3, где область CDR1 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VH, область CDR2 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VH, и область CDR3 VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VH; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область CDR1 VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VL, область CDR2 VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VL, и область CDR3 VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VL, где выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 VH и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 VL соответствуют одному из следующих: In one aspect, the present invention relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to OX40 (a member of the 4 TNF receptor superfamily) containing a heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3, where the CDR1 region The VH contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected VH CDR1 amino acid sequence, the VH CDR2 region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected VH CDR2 amino acid sequence, and the VH CDR3 region contains an amino acid sequence that at least 80% identical to the selected amino acid sequence of CDR3 VH; and a light chain variable region (VL) containing CDRs 1, 2 and 3, where the CDR1 VL region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected amino acid sequence of the CDR1 VL, the CDR2 VL region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected amino acid sequence of VL CDR2, and the CDR3 VL region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected amino acid sequence of CDR3 VL, where the selected amino acid sequences of CDR 1, 2 and 3 VH and the selected amino acid sequences of CDR 1, 2 and 3 VL correspond to one of the following:

(1) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO: 1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO: 4, 5, 6, соответственно; (1) the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VH are indicated in SEQ ID NO: 1, 2, 3, respectively, and the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VL are indicated in SEQ ID NO: 4, 5, 6, respectively;

(2) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO: 7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO: 10, 11, 12, соответственно;(2) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 7, 8, 9, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 10, 11, 12, respectively;

(3) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO: 13, 14, 15, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO: 16, 17, 18, соответственно;(3) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 13, 14, 15, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 16, 17, 18, respectively;

(4) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO: 19, 20, 21, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO: 22, 23, 24, соответственно.(4) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 19, 20, 21, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 22, 23, 24, respectively.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 13, 14 и 15, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, указанными в SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно.In some embodiments, the VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively, and the VL contains CDR 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4 , 5 and 6, respectively. In some embodiments, the VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 13, 14 and 15, respectively, and the VL contains CDR 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 16 , 17 and 18, respectively.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с OX40 человека. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human OX40.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV). In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a single chain variable fragment (scFV).

В одном аспекте изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, содержащим полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий:In one aspect, the invention also relates to nucleic acids containing a polynucleotide encoding a polypeptide comprising:

(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 56, 57, 58 или 80, связывается с OX40; (1) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and where VH, when paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence indicated in SEQ ID NO: 56, 57, 58 or 80, binds to OX40;

(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4, 5, и 6, соответственно, и где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 53, 54, 55 или 79, связывается с OX40;(2) an immunoglobulin light chain or fragment thereof comprising a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively, and where VL when paired with VH containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 53, 54, 55 or 79, associated with OX40;

(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65 или 82, связывается с OX40; или(3) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and where VH when it is paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65 or 82, binds to OX40; or

(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно, и где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, 60, 61 или 81, связывается с OX40;(4) an immunoglobulin light chain or fragment thereof comprising a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively, and where VL when paired with VH , containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 59, 60, 61 or 81, binds to OX40;

(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 13, 14 и 15, соответственно, и где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72 или 84, связывается с OX40;(5) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively, and where VH when it is paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72 or 84, binds to OX40;

(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно, и где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 66, 67, 68 или 83, связывается с OX40; (6) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, comprising a VL containing CDRs 1, 2, and 3, comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 16, 17, and 18, respectively, and where VL when paired with VH , containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 66, 67, 68 or 83, binds to OX40;

(7) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 19, 20 и 21, соответственно, и где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 76, 77, 78 или 86, связывается с OX40;(7) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 19, 20 and 21, respectively, and where VH when it is paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, 77, 78 or 86, binds to OX40;

(8) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 22, 23 и 24, соответственно, и где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 73, 74, 75 или 85, связывается с OX40.(8) an immunoglobulin light chain or fragment thereof comprising a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 22, 23 and 24, respectively, and where VL when paired with VH , containing the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 73, 74, 75 or 85, binds to OX40.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding an immunoglobulin heavy chain-containing polypeptide or fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2, and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 13, 14 и 15, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof containing a VH containing CDRs 1, 2, and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 13, 14, and 15, respectively.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin light chain or fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively.

В некоторых вариантах осуществления VH, когда она находится в паре с VL, специфически связывается с OX40 человека, или VL, когда она находится в паре с VH, специфически связывается с OX40 человека.In some embodiments, VH, when paired with VL, specifically binds to human OX40, or VL, when paired with VH, specifically binds to human OX40.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляет собой гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, и легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляет собой гуманизированную легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент.In some embodiments, the immunoglobulin heavy chain, or fragment thereof, is a humanized immunoglobulin heavy chain, or fragment thereof, and the immunoglobulin light chain, or fragment thereof, is a humanized immunoglobulin light chain, or fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.In some embodiments, the nucleic acid encodes a single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the nucleic acid is cDNA.

В одном аспекте изобретение также относится к векторам, содержащим одну или несколько нуклеиновых кислот, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с OX40.In one aspect, the invention also relates to vectors containing one or more nucleic acids, as described in the present description. In some embodiments, the vector encodes a VL region and a VH region that together bind to OX40.

В одном аспекте изобретение относится к паре векторов, где каждый вектор содержит одну из нуклеиновых кислот, как описано в настоящем описании, где вместе пара векторов кодируют область VL и область VH, которые вместе связываются с OX40.In one aspect, the invention relates to a pair of vectors, where each vector contains one of the nucleic acids as described in the present description, where together the pair of vectors encode a VL region and a VH region, which together bind to OX40.

В другом аспекте изобретение также относится к клетке, содержащей вектор или пару векторов, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку CHO.In another aspect, the invention also relates to a cell containing a vector or a pair of vectors, as described in the present description. In some embodiments, the cell is a CHO cell.

В одном аспекте изобретение также относится к клеткам, содержащим одну или несколько нуклеиновых кислот, как описано в настоящем описании, или к клеткам, содержащим две нуклеиновых кислоты, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновых кислоты вместе кодируют область VL и область VH, которые вместе связываются с OX40.In one aspect, the invention also relates to cells containing one or more nucleic acids, as described in the present description, or to cells containing two nucleic acids, as described in the present description. In some embodiments, the two nucleic acids together encode a VL region and a VH region that together bind to OX40.

В другом аспекте изобретение относится к способам получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Способы вовлекают культивирование клетки, как описано в настоящем описании, в условиях, достаточных, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент; и сбор антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцированного клеткой.In another aspect, the invention relates to methods for producing an antibody, or antigen-binding fragment thereof. The methods involve culturing the cell, as described herein, under conditions sufficient for the cell to produce an antibody or antigen-binding fragment; and collecting the antibody or antigen-binding fragment produced by the cell.

В одном аспекте изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с OX40, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одно из следующих: In one aspect, the invention relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to OX40 containing a heavy chain variable region (VH) containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to a selected VH sequence and a light chain variable region (VL) , containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the selected VL sequence, where the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 53, 54, 55 или 79, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 56, 57, 58 или 80; (1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 53, 54, 55, or 79 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 56, 57, 58, or 80;

(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 59, 60, 61 или 81, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65 или 82; (2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 59, 60, 61, or 81, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, or 82;

(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 66, 67, 68 или 83, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72 или 84; (3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 66, 67, 68, or 83, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, or 84;

(4) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, 74, 75 или 85, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76, 77, 78 или 86.(4) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 73, 74, 75, or 85, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 76, 77, 78, or 86.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 53 и VL содержит последовательность SEQ ID NO: 56. In some embodiments, the VH contains the sequence of SEQ ID NO: 53 and the VL contains the sequence of SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 55 и VL содержит последовательность SEQ ID NO: 58.In some embodiments, VH contains the sequence of SEQ ID NO: 55 and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 58.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 55 и VL содержит последовательность SEQ ID NO: 56.In some embodiments, VH contains the sequence of SEQ ID NO: 55 and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 56.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 73 и VL содержит последовательность SEQ ID NO: 77.In some embodiments, the VH contains the sequence of SEQ ID NO: 73 and the VL contains the sequence of SEQ ID NO: 77.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с OX40 человека.In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human OX40.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a single chain variable fragment (scFV).

В одном аспекте изобретение также относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно или не ковалентно связанные с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство (например, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин, майтанзиноиды, такие как DM-1 и DM-4, дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, эпирубицин, и циклофосфамид и аналоги).In one aspect, the invention also provides an antibody-drug conjugate comprising an antibody, or antigen-binding fragment thereof, covalently or non-covalently linked to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracine, maytansinoids such as DM- 1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide and analogs).

В одном аспекте изобретение также относится к способу лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль. Способы вовлекают введение индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или конъюгаты антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем описании.In one aspect, the invention also relates to a method of treating a subject having cancer. The methods involve administering to an individual a therapeutically effective amount of a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof, or antibody-drug conjugates, as described herein.

В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой нерезектабельную меланому или метастазирующую меланому.In some embodiments, the individual has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma.

В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), плоскоклеточную карциному головы и шеи (SCCHN), почечноклеточный рак (RCC), меланому, рак мочевого пузыря, тройной негативный рак молочной железы (TNBC), или карциному ободочной и прямой кишки.In some embodiments, the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC), head and neck squamous cell carcinoma (SCCHN), renal cell carcinoma (RCC), melanoma, bladder cancer, triple negative breast cancer (TNBC), or colon and rectal carcinoma. intestines.

В одном аспекте изобретение относится к способам снижения скорости роста опухоли. Способы вовлекают приведение в контакт опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или конъюгаты антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем описании.In one aspect, the invention relates to methods for reducing the rate of tumor growth. The methods involve contacting the tumor cell with an effective amount of a composition comprising an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, or antibody-drug conjugates, as described herein.

В другом аспекте изобретение относится к способам уничтожения опухолевой клетки. Способы вовлекают приведение в контакт опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или конъюгаты антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем описании.In another aspect, the invention relates to methods for killing a tumor cell. The methods involve contacting the tumor cell with an effective amount of a composition comprising an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, or antibody-drug conjugates, as described herein.

В одном аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.In one aspect, the invention relates to pharmaceutical compositions comprising an antibody or antigen-binding fragment as described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим конъюгаты антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.In another aspect, the invention provides pharmaceutical compositions comprising antibody-drug conjugates as described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

Как используют в рамках изобретения, термин "злокачественная опухоль" относится к клеткам, обладающим способностью к автономному росту. Примеры таких клеток включают клетки, имеющие аномальный статус или состояние, характеризующиеся быстрой пролиферацией и ростом клеток. Также подразумевается, что термин включает злокачественные образования, например, опухоли; онкогенные процессы, метастатические ткани и злокачественно трансформированные клетки, ткани или органы, независимо от гистологического типа или стадии инвазивности. Также включены злокачественные опухоли различных систем органов, таких как дыхательная, сердечно-сосудистая, почечная, репродуктивная, гематологическая, неврологическая, печеночная, желудочно-кишечная и эндокринная системы; а также аденокарциномы, которые включают злокачественные опухоли, такие как большинство случаев рака толстого кишечника, почечно-клеточную карциному, рак предстательной железы и/или опухоли яичка, немелкоклеточную карциному легкого и рак тонкого кишечника. Злокачественная опухоль, которая является "естественным образом возникшей", включает любую злокачественную опухоль, которая не является экспериментально индуцированной посредством имплантации злокачественных клеток индивидууму, и включает, например, спонтанно возникшую злокачественную опухоль, злокачественную опухоль, вызванную воздействием на пациента канцерогена(ов), злокачественную опухоль в результате встраивания трансгенного онкогена или нокаута гена опухолевой супрессии, и злокачественную опухоль, вызванную инфекциями, например, вирусными инфекциями. Термин "карцинома" является известным в данной области и относится к злокачественным опухолям эпителиальных или эндокринных тканей. Также термин включает карциносаркомы, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. "Аденокарцинома" относится к карциноме, которая происходит из железистой ткани или в которой опухолевые клетки образуют поддающиеся распознаванию железистые структуры. Термин "саркома" является известным в данной области и относится к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения. Термин "гематологические неопластические нарушения" включает заболевания, вовлекающие гиперпластические/неопластические клетки гемопоэтического происхождения. Гемопоэтическое неопластическое нарушение может возникать из миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий клеток, или из их клеток-предшественников.As used in the framework of the invention, the term "malignant tumor" refers to cells that have the ability to autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal status or condition characterized by rapid cell proliferation and growth. The term is also meant to include malignancies, eg tumors; oncogenic processes, metastatic tissues and malignantly transformed cells, tissues or organs, regardless of the histological type or stage of invasiveness. Also included are malignant tumors of various organ systems such as the respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas, which include malignancies such as most colon cancers, renal cell carcinoma, prostate and/or testicular cancer, non-small cell lung carcinoma, and small intestine cancer. A cancer that is "naturally occurring" includes any cancer that is not experimentally induced by implantation of cancer cells into an individual, and includes, for example, spontaneously occurring cancer, cancer caused by exposure of a patient to a carcinogen(s), cancer a tumor resulting from the insertion of a transgenic oncogene or a knockout of a tumor suppressor gene; and a cancer caused by infections such as viral infections. The term "carcinoma" is known in the art and refers to malignant tumors of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors consisting of carcinomatous and sarcomatous tissues. "Adenocarcinoma" refers to a carcinoma that originates from glandular tissue or in which tumor cells form identifiable glandular structures. The term "sarcoma" is known in the art and refers to malignant tumors of mesenchymal origin. The term "hematological neoplastic disorders" includes diseases involving hyperplastic/neoplastic cells of hematopoietic origin. A hematopoietic neoplastic disorder may arise from myeloid, lymphoid, or erythroid cell lines, or their progenitor cells.

Как используют в рамках изобретения, термин "антитело" относится к любой антигенсвязывающей молекуле, которая содержит по меньшей мере одну (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть) определяющих комплементарность областей (CDR) (например, все три CDR из легкой цепи иммуноглобулина или любые три CDR из тяжелой цепи иммуноглобулина) и способна специфически связываться с эпитопом. Неограничивающие примеры антител включают: моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), одноцепочечные антитела, химерные антитела, антитела человека и гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать Fc-область антитела человека. Термин "антитело" также включает производные, например, биспецифические антитела, одноцепоченые антитела, диантитела, линейные антитела и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.As used herein, the term "antibody" refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementarity-determining regions (CDRs) (e.g., all three CDRs from an immunoglobulin light chain or any three CDRs from an immunoglobulin heavy chain) and is capable of specifically binding to an epitope. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), single chain antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, the antibody may comprise the Fc region of a human antibody. The term "antibody" also includes derivatives, such as bispecific antibodies, single chain antibodies, diantibodies, linear antibodies, and polyspecific antibodies formed from antibody fragments.

Как используют в рамках изобретения, термин "антигенсвязывающий фрагмент" относится к части полноразмерного антитела, где часть антитела способна специфически связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи). Неограничивающие примеры фрагментов антител включают, например, Fab, Fab’, F(ab’)₂ и Fv-фрагменты.As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a portion of a full-length antibody, where the portion of the antibody is capable of specifically binding to an antigen. In some embodiments, the antigen-binding fragment contains at least one variable domain (eg, a heavy chain variable domain or a light chain variable domain). Non-limiting examples of antibody fragments include, for example, Fab, Fab', F(ab') ₂ and Fv fragments.

Как используют в рамках изобретения, термин "антитело человека" относится к антителу, которое кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой (например, реарранжированным локусом тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека), присутствующей у человека. В некоторых вариантах осуществления антитело человека получено от человека или продуцировано культурой клеток человека (например, гибридомные клетки человека). В некоторых вариантах осуществления антитело человека продуцируется клеткой, не являющейся человеческой (например, клеточная линия мыши или хомячка). В некоторых вариантах осуществления антитело человека продуцируется бактериальной или дрожжевой клеткой. В некоторых вариантах осуществления антитело человека продуцируется у трансгенного не являющегося человеком животного (например, животного семейства бычьих), содержащего нереарранжированный или реарранжированный локус иммуноглобулина человека (например, локус тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека).As used herein, the term "human antibody" refers to an antibody that is encoded by an endogenous nucleic acid (eg, a rearranged human immunoglobulin heavy or light chain locus) present in a human. In some embodiments, the human antibody is derived from a human or produced by a human cell culture (eg, human hybridoma cells). In some embodiments, the human antibody is produced by a non-human cell (eg, a mouse or hamster cell line). In some embodiments, the human antibody is produced by a bacterial or yeast cell. In some embodiments, the human antibody is produced from a transgenic non-human animal (eg, a bovine animal) containing an unrearranged or rearranged human immunoglobulin locus (eg, a human immunoglobulin heavy or light chain locus).

Как используют в рамках изобретения, термин "химерное антитело" относится к антителу, которое содержит последовательность, присутствующую по меньшей мере в двух различных антителах (например, антителах из двух различных видов млекопитающих, таких как антитело человека и мыши). Неограничивающим примером химерного антитела является антитело, содержащее последовательности вариабельных доменов (например, всю или часть последовательности вариабельного домена легкой цепи и/или тяжелой цепи) не являющегося человеческим антитела (например, мыши) и константные домены антитела человека. Дополнительные примеры химерных антител описаны в настоящем описании и известны в данной области.As used herein, the term "chimeric antibody" refers to an antibody that contains a sequence present in at least two different antibodies (eg, antibodies from two different mammalian species, such as a human and mouse antibody). A non-limiting example of a chimeric antibody is an antibody comprising the variable domain sequences (eg, all or part of the light chain and/or heavy chain variable domain sequence) of a non-human (eg, mouse) antibody and the constant domains of a human antibody. Additional examples of chimeric antibodies are described herein and are known in the art.

Как используют в рамках изобретения, термин "гуманизированное антитело" относится к не являющемуся человеческим антителу, которое содержит минимальную последовательность, происходящую из не являющегося человеческим иммуноглобулина (например, мыши), и содержит последовательности, происходящие из иммуноглобулина человека. В неограничивающих примерах гуманизированные антитела представляют собой антитела человека (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области (например, CDR) реципиентного антитела заменены остатками гипервариабельной области (например, CDR) не являющегося человеческим антитела (например, донорное антитело), например, антитела мыши, крысы или кролика, имеющего требуемую специфичность, аффинность или емкость. В некоторых вариантах осуществления каркасные остатки Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками не являющегося человеческим иммуноглобулина (например, мыши). В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не встречаются ни в реципиентном антителе, ни в донорном антителе. Эти модификации можно вносить для дальнейшего повышения эффективности антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного, и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель (CDR) соответствуют гипервариабельным петлям не являющегося человеческим иммуноглобулина (например, мыши), и все или по существу все из каркасных областей представляют собой каркасные области иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, константной области иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела можно получать с использованием способов молекулярной биологии, известных в данной области. Неограничивающие примеры способов получения гуманизированных антитела описаны в настоящем описании.As used herein, the term "humanized antibody" refers to a non-human antibody that contains a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin (eg, mouse) and contains sequences derived from a human immunoglobulin. In non-limiting examples, humanized antibodies are human antibodies (recipient antibody) in which hypervariable region (e.g., CDR) residues of the recipient antibody are replaced with hypervariable region (e.g., CDR) residues of a non-human antibody (e.g., donor antibody), e.g., a mouse antibody. , rat or rabbit having the desired specificity, affinity or capacity. In some embodiments, Fv framework residues of a human immunoglobulin are replaced with corresponding non-human (eg, mouse) immunoglobulin residues. In some embodiments, humanized antibodies may contain residues that are not found in either the recipient antibody or the donor antibody. These modifications can be made to further improve the performance of the antibody. In some embodiments, the humanized antibody contains substantially all of at least one, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the hypervariable loops (CDRs) correspond to hypervariable loops of a non-human immunoglobulin (e.g., mouse) and all or substantially all of the framework regions are human immunoglobulin framework regions. The humanized antibody may also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a human immunoglobulin constant region. Humanized antibodies can be generated using molecular biology techniques known in the art. Non-limiting examples of methods for producing humanized antibodies are described in the present description.

Как используют в рамках изобретения, термин "одноцепочечное антитело" относится к единому полипептиду, содержащему по меньшей мере два вариабельных домена иммуноглобулина (например, вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающих), который способен специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры одноцепочечных антител описаны в настоящем описании.As used herein, the term "single chain antibody" refers to a single polypeptide containing at least two immunoglobulin variable domains (eg, a mammalian immunoglobulin heavy chain or light chain variable domain) that is capable of specifically binding to an antigen. Non-limiting examples of single chain antibodies are described in the present description.

Как используют в рамках изобретения, термин "мультимерное антитело" относится к антителу, которое содержит четыре или более (например, шесть, восемь или десять) вариабельных доменов иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления мультимерное антитело способно сшивать одну молекулу-мишень (например, OX40) по меньшей мере с одной второй молекулой-мишенью (например, PD1) на поверхности клетки млекопитающего (например, T-клетки человека).As used herein, the term "multimeric antibody" refers to an antibody that contains four or more (eg, six, eight, or ten) immunoglobulin variable domains. In some embodiments, the multimeric antibody is capable of crosslinking one target molecule (eg, OX40) to at least one second target molecule (eg, PD1) on the surface of a mammalian cell (eg, human T cells).

Как используют в рамках изобретения, термины "индивидуум" и "пациент" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они описывают животное, как являющееся человеком, так и не являющееся человеком, которому предоставляют лечение способами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение предусматривает ветеринарные и не ветеринарные применения. Пациенты-люди могут представлять собой взрослых людей или молодых людей (например, людей в возрасте менее 18 лет). В дополнение к людям, пациенты включают, но не ограничиваются ими, мышей, крыс, хомячков, морских свинок, кроликов, хорьков, кошек, собак и приматов. Они включают, например, не являющихся человеком приматов (например, обезьяна, шимпанзе, горилла и т.п.), грызунов (например, крысы, мыши, песчанки, хомячки, хорьки, кролики), зайцеобразных, свиных (например, свинья, карликовая свинья), лошадиных, собачьих, кошачьих, бычьих и других домашних, сельскохозяйственных и зоопарковых животных.As used herein, the terms "subject" and "patient" are used interchangeably herein and describe an animal, both human and non-human, that is being treated with the methods of the present invention. The present invention provides for veterinary and non-veterinary applications. Human patients may be adults or young adults (eg, people less than 18 years of age). In addition to humans, patients include, but are not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. They include, for example, non-human primates (e.g. monkey, chimpanzee, gorilla, etc.), rodents (e.g. rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits), lagomorphs, porcine animals (e.g. pig, pygmy pig), equine, canine, feline, bovine and other domestic, agricultural and zoo animals.

Как используют в рамках изобретения, при указании на антитело, выражения "специфически связывающийся" и "специфически связывается" означает, что антитело взаимодействует с его молекулой-мишенью (например, OX40), предпочтительно с другими молекулами, поскольку взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (т.е. антигенная детерминанта или эпитоп) на молекуле-мишени; иными словами, реагент распознает и связывается с молекулами, которые включают специфическую структуру, а не со всеми молекулами в целом. Антитело, которое специфически связывается с молекулой-мишенью, может упоминаться как специфичное к мишени антитело. Например, антитело, которое специфически связывается с молекулой OX40, может упоминаться как OX40-специфическое антитело или антитело против OX40.As used herein, when referring to an antibody, the terms "specifically binding" and "specifically binding" mean that the antibody interacts with its target molecule (for example, OX40), preferably with other molecules, since the interaction depends on the presence of a particular structure ( i.e. antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent recognizes and binds to molecules that include a specific structure, and not to all molecules in general. An antibody that specifically binds to a target molecule may be referred to as a target-specific antibody. For example, an antibody that specifically binds to an OX40 molecule may be referred to as an OX40-specific antibody or an anti-OX40 antibody.

Как используют в рамках изобретения, термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо для указания на полимеры из аминокислот любой длины, составляющей по меньшей мере две аминокислоты.As used herein, the terms "polypeptide", "peptide" and "protein" are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length of at least two amino acids.

Как используют в рамках изобретения, термины "полинуклеотид", "молекула нуклеиновой кислоты" и "последовательность нуклеиновой кислоты" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для указания на полимеры из нуклеотидов любой длины, составляющей по меньшей мере два нуклеотида, и они включают, но не ограничиваются ими, ДНК, РНК, гибриды ДНК/РНК и их модификации.As used herein, the terms "polynucleotide", "nucleic acid molecule", and "nucleic acid sequence" are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, but are not limited to them, DNA, RNA, DNA/RNA hybrids and their modifications.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой относится настоящее изобретение. В настоящем описании описаны способы и материалы для применения в рамках настоящего изобретения; также можно использовать другие подходящие способы и материалы, известные в данной области. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, записи баз данных и другие ссылки, упоминаемые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. В случае противоречия настоящее описание, в том числе определения, имеет преимущество.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in the present description have the same meaning, which usually implies a specialist in the field to which the present invention relates. This description describes methods and materials for use in the framework of the present invention; other suitable methods and materials known in the art may also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and are not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries and other references mentioned in the present description are incorporated herein by reference in their entirety. In case of conflict, the present description, including the definitions, takes precedence.

Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из приведенного ниже подробного описания и чертежей, и из формулы изобретения.Other features and advantages of the invention will become apparent from the following detailed description and drawings, and from the claims.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙDESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На фиг. 1 представлена блок-схема, демонстрирующая первую часть иллюстративного протокола получения антител против OX40.In FIG. 1 is a block diagram showing the first part of an exemplary protocol for generating anti-OX40 antibodies.

На фиг. 2 представлена блок-схема, демонстрирующая вторую часть иллюстративного протокола получения антител против OX40.In FIG. 2 is a block diagram showing the second part of an exemplary protocol for generating anti-OX40 antibodies.

На фиг. 3 представлен набор графиков на основе результатов проточной цитометрии, демонстрирующих, что антитела против OX40 блокируют связывание между OX40 и OX40L.In FIG. 3 is a set of plots based on flow cytometry results demonstrating that anti-OX40 antibodies block binding between OX40 and OX40L.

На фиг. 4 представлен набор графиков на основе результатов проточной цитометрии, демонстрирующих, что антитела против OX40 могут связываться с OX40 человека.In FIG. 4 is a set of graphs based on flow cytometry results demonstrating that anti-OX40 antibodies can bind to human OX40.

На фиг. 5 представлен набор графиков, демонстрирующих результаты проточной цитометрии для перекрестной реактивности антител против OX40 в отношении OX40 обезьяны (rmOX40), мыши (mOX40) и химерного OX40 человека-мыши (chiOX40).In FIG. 5 is a set of graphs showing flow cytometry results for anti-OX40 antibody cross-reactivity with monkey OX40 (rmOX40), mouse (mOX40), and human-mouse chimeric OX40 (chiOX40).

На фиг. 6 представлен график, демонстрирующий скорость ассоциации и скорость диссоциации между химерным антителом против hOX40 (9H3-mHvKv-IgG1) и OX40 человека.In FIG. 6 is a graph showing the rate of association and rate of dissociation between a chimeric anti-hOX40 antibody (9H3-mHvKv-IgG1) and human OX40.

На фиг. 7 представлен график, демонстрирующий массу тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которых лечили антителами мыши против hOX40 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 и 14-7F11.In FIG. 7 is a graph showing body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with mouse anti-hOX40 antibodies 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 and 14-7F11.

На фиг. 8 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили антитела мыши против hOX40 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 и 14-7F11.In FIG. 8 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells injected with mouse anti-hOX40 antibodies 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17- 5D10, 08-6A11 and 14-7F11.

На фиг. 9 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили антитела мыши против hOX40 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 и 14-7F11.In FIG. 9 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells injected with mouse anti-hOX40 antibodies 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 and 14-7F11.

На фиг. 10 представлен график, демонстрирующий массу тела с течением времени мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили химерные антитела против hOX40.In FIG. 10 is a graph showing body weight over time of humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with chimeric anti-hOX40 antibodies.

На фиг. 11 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили химерные антитела против hOX40.In FIG. 11 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with chimeric anti-hOX40 antibodies.

На фиг. 12 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили химерные антитела против hOX40.In FIG. 12 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with chimeric anti-hOX40 antibodies.

На фиг. 13 представлен график, демонстрирующий массу тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили гуманизированные антитела против hOX40.In FIG. 13 is a graph showing body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with humanized anti-hOX40 antibodies.

На фиг. 14 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизирированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили антитела против hOX40.In FIG. 14 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with anti-hOX40 antibodies.

На фиг. 15 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили гуманизированные антитела против hOX40.In FIG. 15 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with humanized anti-hOX40 antibodies.

На фиг. 16 приведен набор изображений патологии ткани печени с окрашиванием H&E (400X). In FIG. 16 shows a set of H&E (400X) stained liver tissue pathology images.

На фиг. 17 приведен набор изображений патологии почки с окрашиванием H&E (400X).In FIG. 17 shows a set of H&E (400X) stained images of kidney pathology.

На фиг. 18 приведен набор изображений патологии ткани кишечника с окрашиванием H&E (400X).In FIG. 18 shows a set of H&E (400X) stained images of intestinal tissue pathology.

На фиг. 19 представлен график, демонстрирующий массе тела с течением времени мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3 и Китруду.In FIG. 19 is a graph showing the body weight over time of humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3 and Keytruda.

На фиг. 20 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3 и Китруду.In FIG. 20 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3 and Keytruda.

На фиг. 21 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3 и Китруду.In FIG. 21 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3 and Keytruda.

На фиг. 22 представлен график, демонстрирующий массу тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих злокачественные клетки EL4, которым вводили 9H3 и Китруду.In FIG. 22 is a graph showing body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing EL4 malignant cells treated with 9H3 and Keytruda.

На фиг 23 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих злокачественные клетки EL4, которым вводили 9H3 и Китруду. FIG. 23 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice with EL4 malignant cells treated with 9H3 and Keytruda.

На фиг. 24 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих злокачественные клетки EL4, которым вводили 9H3 и Китруду.In FIG. 24 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing EL4 malignant cells treated with 9H3 and Keytrude.

На фиг. 25 представлен график, демонстрирующий массу тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3, антитело против PD1 и/или антитело против PD-L1.In FIG. 25 is a graph showing body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3, anti-PD1 antibody, and/or anti-PD-L1 antibody.

На фиг. 26 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3, антитело против PD1 и/или антитело против PD-L1.In FIG. 26 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3, anti-PD1 antibody, and/or anti-PD-L1 antibody.

На фиг. 27 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3, антитело против PD1 и антитело против PD-L1.In FIG. 27 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3, anti-PD1 antibody, and anti-PD-L1 antibody.

На фиг. 28 представлен график, демонстрирующий массу тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3, антитело против LAG-3, антитело против TIGIT, антитело против BTLA, антитело против CTLA-4 и/или антитело против GITR.In FIG. 28 is a graph showing body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3, anti-LAG-3, anti-TIGIT, anti-BTLA, anti-CTLA- 4 and/or an anti-GITR antibody.

На фиг. 29 представлен график, демонстрирующий процентное изменение массы тела с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3, антитело против LAG-3, антитело против TIGIT, антитело против BTLA, антитело против CTLA-4 и/или антитело против GITR.In FIG. 29 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells treated with 9H3, anti-LAG-3, anti-TIGIT, anti-BTLA, anti- CTLA-4 and/or anti-GITR antibody.

На фиг. 30 представлен график, демонстрирующий размер опухоли с течением времени у мышей с гуманизированным OX40 (B-hOX40), имеющих опухолевые клетки MC-38, которым вводили 9H3, антитело против LAG-3, антитело против TIGIT, антитело против BTLA, антитело против CTLA-4 и/или антитело против GITR.In FIG. 30 is a graph showing tumor size over time in humanized OX40 (B-hOX40) mice bearing MC-38 tumor cells injected with 9H3, anti-LAG-3, anti-TIGIT, anti-BTLA, anti-CTLA- 4 and/or an anti-GITR antibody.

На фиг. 31 приведены последовательности CDR антител против OX40 антитела 9H3, 9A4, 5C1, 5D10 и их гуманизированных антител при определении с использованием нумерации Kabat.In FIG. 31 shows the CDR sequences of the anti-OX40 antibodies 9H3, 9A4, 5C1, 5D10 and their humanized antibodies as determined using Kabat numbering.

На фиг. 32 приведены CDR последовательности антител против OX40 9H3, 9A4, 5C1, 5D10 и их гуманизированных антител при определении с использованием нумерации Chothia.In FIG. 32 shows the CDR sequences of anti-OX40 antibodies 9H3, 9A4, 5C1, 5D10 and their humanized antibodies as determined using Chothia numbering.

На фиг. 33 приведены аминокислотные последовательности OX40 человека, OX40 мыши, OX40 обезьяны и химерного OX40.In FIG. 33 shows the amino acid sequences of human OX40, mouse OX40, monkey OX40, and chimeric OX40.

На фиг. 34 приведены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против OX40.In FIG. 34 shows the amino acid sequences of the heavy chain variable regions and the light chain variable regions of humanized anti-OX40 antibodies.

На фиг. 35 приведена аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антител мыши против hOX40 9H3, 9A4, 5C1 и 5D10.In FIG. 35 shows the amino acid sequence of the heavy chain and light chain variable regions of mouse anti-hOX40 antibodies 9H3, 9A4, 5C1 and 5D10.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

В настоящем описание представлены примеры антител, их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с OX40 (представитель 4 суперсемейства рецепторов TNF, или TNFRSF4; также известный как CD134).The present disclosure provides examples of antibodies, their antigen-binding fragments, that bind to OX40 (a member of the 4 TNF receptor superfamily, or TNFRSF4; also known as CD134).

Процесс активации T-клеток требует TCR для распознавания комплекса MHC-пептид в качестве первого сигнала. Кроме того, он также требует костимулирующих сигналов. OX40 представляет собой класс костимулирующих факторов для T-клеток, который принадлежит суперсемейству рецепторов факторов некроза опухоли (TNFR), и представляет собой трансмембранный белок типа I. OX40 может активировать внутриклеточную передачу сигнала PI3K-AKT, а также передачу сигнала NFAT. Эти сигналы оказывают положительный эффект на пролиферацию и выживаемость T-клеток. Кроме того, OX40 также может регулировать функцию и направление дифференцировки T-клеток.The T cell activation process requires the TCR to recognize the MHC-peptide complex as the first signal. In addition, it also requires costimulatory signals. OX40 is a class of costimulatory factors for T cells that belongs to the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily and is a type I transmembrane protein. OX40 can activate intracellular PI3K-AKT signaling as well as NFAT signaling. These signals have a positive effect on T cell proliferation and survival. In addition, OX40 can also regulate the function and direction of T cell differentiation.

OX40 на сегодняшний день является единственной костимулирующей молекулой, которая способна к формированию периферической толерантности. Он может нарушать иммунную толерантность опухоли и восстанавливать иммунный надзор. Использование OX40 в качестве новой мишени для иммунотерапии опухолей продемонстрировало определенные положительные эффекты. Однако, поскольку активирующее антитело должно иметь свой эпитоп для связывания и свое состояние, требуемое для точного совпадения с соответствующим лигандом для активации нижеследующего каскада передачи сигнала, которое сходно с ключом, который специфически соответствует замку, разработка этого типа антител является трудоемкой. Настоящее изобретение относится к нескольким антителам против OX40 и гуманизированным антителам против OX40, которые могут эффективно ингибировать рост опухоли и могут использоваться для лечения злокачественных опухолей.OX40 is currently the only costimulatory molecule capable of forming peripheral tolerance. It can disrupt the immune tolerance of the tumor and restore immune surveillance. The use of OX40 as a new target for tumor immunotherapy has demonstrated certain positive effects. However, since an activating antibody must have its epitope to bind and its state to exactly match the corresponding ligand to activate the downstream signaling cascade, which is similar to a key that specifically matches a lock, the development of this type of antibody is laborious. The present invention relates to several anti-OX40 antibodies and humanized anti-OX40 antibodies that can effectively inhibit tumor growth and can be used to treat malignant tumors.

OX40 и злокачественная опухольOX40 and cancer

Иммунная система может различать нормальные клетки в организме и клетки, которые она воспринимает как "чужеродные", что позволяет иммунной системе атаковать чужеродные клетки, сохраняя нормальные клетки. Этот механизм иногда вовлекает белки, называемые иммунными точками контроля. Иммунные точки контроля представляют собой молекулы иммунной системы, которые либо включают сигнал (костимулирующие молекулы), либо выключают сигнал.The immune system can distinguish between normal cells in the body and cells that it perceives as "foreign", which allows the immune system to attack foreign cells while keeping normal cells. This mechanism sometimes involves proteins called immune checkpoints. Immune checkpoints are immune system molecules that either turn on a signal (costimulatory molecules) or turn off a signal.

Ингибиторы иммунной точки контроля могут предотвращать атаку иммунной системы на нормальную ткань и, тем самым, предупреждать аутоиммунные заболевания. Многие опухолевые клетки также экспрессируют ингибиторы иммунной точки контроля. Эти опухолевые клетки ускользают от иммунного надзора посредством вовлечения определенных каскадов иммунных точек контроля, в частности, в T-клетках, специфичных к опухолевым антигенам (Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer". Cancer Control 21,1 (2014): 80-89). Поскольку многие иммунные точки контроля инициируются взаимодействиями лиганд-рецептор, их можно без труда блокировать антителами против лигандов и/или их рецепторов.Immune checkpoint inhibitors can prevent the immune system from attacking normal tissue and thereby prevent autoimmune diseases. Many tumor cells also express immune checkpoint inhibitors. These tumor cells elude immune surveillance through the involvement of certain cascades of immune checkpoints, particularly in T cells specific for tumor antigens (Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer". Cancer Control 21.1 ( 2014): 80-89). Because many immune checkpoints are initiated by ligand-receptor interactions, they can be readily blocked by antibodies against the ligands and/or their receptors.

Представитель 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли рецептор (TNFRSF4), также известный как CD134 и OX40, является представителем суперсемейства рецепторов TNFR, которые не экспрессируются конститутивно на покоящихся наивных T-клетках. OX40 представляет собой вторичную костимулирующую молекулу иммунной точки контроля, экспрессируемую через 24-72 часа после активации; ее лиганд, OX40L, также не экспрессируется на покоящихся антигенпредставляющих клетках, а экспрессируется после их активации.Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 (TNFRSF4), also known as CD134 and OX40, is a member of the TNFR receptor superfamily that is not constitutively expressed on resting naive T cells. OX40 is a secondary costimulatory immune checkpoint molecule expressed 24-72 hours after activation; its ligand, OX40L, is also not expressed on resting antigen-presenting cells, but is expressed after their activation.

Экспрессия OX40 на поверхности T-клеток мыши, как правило, происходит через от 24 ч до 96 ч после распознавания собственного антигена. Связывание рецептора OX40 на T-клетках (in vitro) с использованием антител-агонистов OX40, прямо стимулирует повышение выживаемости различных подгрупп эффекторных T-клеток. Более того, иммуносупрессивная подгруппа CD4+ T-клеток, называемая регуляторными T-клетками (Treg), также экспрессирует высокие уровни OX40. Следует отметить, что Treg мыши, по-видимому, конститутивно экспрессируют OX40, в то время как в Treg человека уровень OX40 повышается при активации. Treg могут ингибировать эффекторные T-клетки посредством секреции иммуносупрессивных цитокинов, таких как трансформирующий фактор роста-бета (TGFb) и интерлейкин-10 (IL-10). Этим негативным регуляторам может противостоять стимуляция OX40 на эффекторных T-клетках и других костимулирующих рецепторов TNFRSF, таких как 41BB (CD137) и индуцируемый глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухоли (GITR) (CD357).Expression of OX40 on the surface of mouse T cells typically occurs 24 to 96 hours after self-antigen recognition. Binding of the OX40 receptor on T cells ( in vitro ) using OX40 agonist antibodies directly promotes survival of various effector T cell subgroups. Moreover, an immunosuppressive subgroup of CD4+ T cells called regulatory T cells (Treg) also express high levels of OX40. Of note, mouse Tregs appear to constitutively express OX40, while in human Tregs, OX40 is elevated upon activation. Tregs can inhibit effector T cells through the secretion of immunosuppressive cytokines such as transforming growth factor-beta (TGFb) and interleukin-10 (IL-10). These negative regulators can be counteracted by OX40 stimulation on effector T cells and other co-stimulatory TNFRSF receptors such as 41BB (CD137) and glucocorticoid-inducible tumor necrosis factor receptor (GITR) (CD357).

Передача сигнала OX40 влияет на функцию Treg и снижает их способность к подавлению, предположительно посредством прямого ингибирования экспрессии FoxP3. Передача сигнала OX40 также действует на образование Treg: она является строгим антагонистом TGFb и опосредуемого антигеном конвертирования наивных T-клеток в FoxP3þ Treg.OX40 signaling affects Treg function and reduces their ability to suppress, presumably through direct inhibition of FoxP3 expression. OX40 signaling also acts on Treg formation: it is a strong antagonist of TGFb and antigen-mediated conversion of naive T cells to FoxP3þ Tregs.

Поскольку передача сигнала OX40 стимулирует биологическую активность CD4+ и CD8+ T-клеток и противодействует функциям Treg, OX40 представляет собой мишень для иммуномодулирования при иммунотерапии злокачественной опухоли, например, передачу сигнала OX40 можно индуцировать антителами-агонистами, специфичными к OX40. Подробное описание, касающееся OX40 и его роли в качестве иммуномодулирующей мишени для иммунотерапии злокачественной опухоли, может быть найдено, например, в Aspeslagh, et al. "Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy". European Journal of Cancer 52 (2016): 50-66; Curti, et al.". OX40 является мощной иммуностимулирующей мишенью у пациентов со злокачественной опухолью на поздней стадии". Cancer research 73,24 (2013): 7189-7198, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.Since OX40 signaling stimulates the biological activity of CD4+ and CD8+ T cells and counteracts Treg functions, OX40 is a target for immunomodulation in cancer immunotherapy, for example, OX40 signaling can be induced by agonist antibodies specific for OX40. A detailed description regarding OX40 and its role as an immunomodulatory target for cancer immunotherapy can be found, for example, in Aspeslagh, et al. "Rationale for anti-OX40 cancer immunotherapy". European Journal of Cancer 52 (2016): 50-66; Curti, et al. "OX40 is a potent immunostimulatory target in patients with advanced cancer." Cancer research 73,24 (2013): 7189-7198, which are incorporated herein by reference in their entirety.

Настоящее изобретение относится к нескольким антителам против OX40, их антигенсвязывающим фрагментам и способам применения этих антител против OX40 и антигенсвязывающих фрагментов для ингибирования роста опухоли и для лечения злокачественных опухолей.The present invention relates to several anti-OX40 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and methods of using these anti-OX40 antibodies and antigen-binding fragments to inhibit tumor growth and to treat malignant tumors.

Антитела и антигенсвязывающие фрагментыAntibodies and antigen-binding fragments

Настоящее изобретение относится к антителам против OX40 и их антигенсвязывающим фрагментам. Как правило, антитела (также называемые иммуноглобулинами) состоят из двух классов полипептидных цепей: легкие цепи и тяжелые цепи. Неограничивающее антитело по настоящему изобретению может быть интактным антителом из четырех цепей иммуноглобулинов, содержащих две тяжелых цепи и две легких цепи. Тяжелая цепь антитела может представлять собой цепь любого изотипа, включая IgM, IgG, IgE, IgA или IgD, или подизотипа, включая IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 и т.д. Легкая цепь может представлять собой легкую цепь каппа или легкую цепь лямбда. Антитело может содержать две идентичных копии легкой цепи и две идентичных копии тяжелой цепи. Тяжелые цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, V_H) и множество константных доменов (или константные области), связаны друг с другом посредством образования дисульфидных связей в их константных доменах с образованием "ствола" антитела. Каждая из легких цепей, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, V_L) и один константный домен (или константную область), связана с одной тяжелой цепью посредством образования дисульфидных связей. Вариабельная область каждой легкой цепи находится параллельно вариабельной области тяжелой цепи, с которой она связана. Вариабельные области как легких цепей, так и тяжелых цепей, содержат три гипервариабельных области, чередующиеся с более консервативными каркасными областями (FR).The present invention relates to antibodies against OX40 and their antigennegative fragments. Typically, antibodies (also called immunoglobulins) are made up of two classes of polypeptide chains: light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present invention may be an intact four chain immunoglobulin antibody containing two heavy chains and two light chains. The heavy chain of an antibody can be any isotype, including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD, or subisotype, including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain may be a kappa light chain or a lambda light chain. The antibody may contain two identical copies of the light chain and two identical copies of the heavy chain. The heavy chains, each containing one variable domain (or variable region, V _H ) and a plurality of constant domains (or constant regions), are linked to each other via disulfide bonds in their constant domains to form an antibody "stem". Each of the light chains, each containing one variable domain (or variable region, V _L ) and one constant domain (or constant region), is linked to one heavy chain through the formation of disulfide bonds. The variable region of each light chain is parallel to the variable region of the heavy chain to which it is linked. The variable regions of both light chains and heavy chains contain three hypervariable regions interspersed with more conserved framework regions (FRs).

Эти гипервариабельные области, известные как определяющие комплементарность области (CDR), образуют петли, которые составляют основную антигенсвязывающую поверхность антитела. Четыре каркасных области по большей части принимают конформацию бета-слоев, и CDR формируют петли, соединяющие, и в некоторых случаях образующие часть, структуры бета-слоев. CDR в каждой цепи удерживаются вблизи каркасными областями и с CDR из другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающей области.These hypervariable regions, known as complementarity determining regions (CDRs), form loops that make up the main antigen-binding surface of an antibody. The four framework regions largely adopt the beta sheet conformation, and the CDRs form loops connecting, and in some cases forming part of, the beta sheet structures. The CDRs in each strand are held close by the framework regions and, with CDRs from the other strand, contribute to the formation of the antigen-binding region.

Способы идентификации областей CDR антитела посредством анализа аминокислотной последовательности антитела хорошо известны, и часто используется ряд определений CDR. Определение по Kabat основано на вариабельности последовательностей и определение по Chothia основано на положении областей структурных петель. Эти способы и определения описаны, например, в Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan. 1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Если в настоящем описании не указано конкретно, в настоящем описании по умолчанию используют нумерацию по Kabat.Methods for identifying CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of an antibody are well known, and a number of CDR definitions are often used. The Kabat definition is based on sequence variability and the Chothia definition is based on the position of structural loop regions. These methods and definitions are described, for example, in Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains," Molecular immunology 45.14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132:211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al., Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan. 1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Unless specifically stated in the present description, Kabat numbering is used by default in the present description.

CDR важны для распознавания эпитопа антигена. Как используют в рамках изобретения, "эпитоп" является наименьшей частью молекулы-мишени, с которой может связываться антигенсвязывающий домен антитела. Минимальный размер антитела может составлять приблизительно три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот, однако эти аминокислоты не должны находиться в виде непрерывной линейной последовательности первичной структуры антигена, поскольку эпитоп может зависеть от трехмерной конфигурации антигена, основанной на вторичной и третичной структуре антигена.CDRs are important for antigen epitope recognition. As used herein, an "epitope" is the smallest portion of a target molecule to which the antigen-binding domain of an antibody can bind. The minimum size of an antibody can be approximately three, four, five, six, or seven amino acids, however, these amino acids need not be in a continuous linear sequence of the primary antigen structure, since the epitope may depend on the three-dimensional configuration of the antigen based on the secondary and tertiary structure of the antigen.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой интактную молекулу иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). Подклассы IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) являются в высокой степени консервативными, отличаются их константными областями и, в частности, их шарнирными областями и верхними CH2-доменами. Последовательности и различия подклассов IgG известны в данной области и описаны, например, в Vidarsson, et al., "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.In some embodiments, the antibody is an intact immunoglobulin molecule (eg, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) are highly conserved, differing in their constant regions and in particular their hinge regions and upper CH2 domains. The sequences and distinctions of IgG subclasses are known in the art and are described, for example, in Vidarsson, et al., "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions." Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67.2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Антитело также может представлять собой молекулу иммуноглобулина, которая происходит из любого вида (например, человек, грызун, мышь, животное семейства верблюжьих). Антитела, описанные в настоящем описании, также включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические антитела и химерные антитела, которые включают связывающий домен иммуноглобулина, слитый с другим полипептидом. Термин "антигенсвязывающий домен" или "антигенсвязывающий фрагмент" представляет собой часть антитела, которая сохраняет активность интактного антитела в отношении специфического связывания, т.е. любую часть антитела, которая способна специфически связываться с эпитопом на молекуле-мишени интактного антитела. Она включает, например, Fab, Fab', F(ab')2 и варианты этих ферментов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой, например, scFv, Fv, Fd, dAb, биспецифическое антитело, биспецифический scFv, диантитело, линейное антитело, молекулу одноцепочечного антитела, мультиспецифическое антитело, образованное из фрагментов антител, и любой полипептид, который включает связывающий домен, который представляет собой или является гомологичным связывающему домену антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих доменов включают, например, CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи интактного антитела, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи интактного антитела, полноразмерные тяжелые или легкие цепи интактного антитела, или индивидуальные CDR либо из тяжелой цепи, либо из легкой цепи интактного антитела.The antibody may also be an immunoglobulin molecule that is derived from any species (eg, human, rodent, mouse, camelid). The antibodies described herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, polyspecific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The term "antigen binding domain" or "antigen binding fragment" is the portion of an antibody that retains the specific binding activity of an intact antibody, i. any portion of an antibody that is capable of specifically binding to an epitope on an intact antibody target molecule. It includes, for example, Fab, Fab', F(ab')2 and variants of these enzymes. Thus, in some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof can be, for example, a scFv, Fv, Fd, dAb, a bispecific antibody, a bispecific scFv, a diantibody, a linear antibody, a single chain antibody molecule, a multispecific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain that is or is homologous to the binding domain of an antibody. Non-limiting examples of antigen binding domains include, for example, heavy chain and/or light chain CDRs of an intact antibody, heavy and/or light chain variable regions of an intact antibody, full-length heavy or light chains of an intact antibody, or individual CDRs from either the heavy chain or the light chain. intact antibody.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может образовывать часть химерного рецептора антигена (CAR). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена представляет собой слитую конструкцию одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), как описано в настоящем описании, слитых с трансмембранным доменом и эндодоменом CD3-зета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена также содержит внутриклеточные сигнальные домены из различных рецепторов костимулирующих белков (например, CD28, 41BB, ICOS). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор антигена содержит множество сигнальных доменов, например, CD3z-CD28-41BB или CD3z-CD28-OX40, для повышения эффективности. Таким образом, в одном аспекте изобретение, кроме того, относится к клеткам (например, T-клеткам), которые экспрессируют химерные рецепторы антигенов, как описано в настоящем описании.In some embodiments, the antigen-binding fragment may form part of a chimeric antigen receptor (CAR). In some embodiments, the chimeric antigen receptor is a single chain variable fragment (scFv) fusion construct, as described herein, fused to a transmembrane domain and a CD3-zeta endodomain. In some embodiments, the chimeric antigen receptor also contains intracellular signaling domains from various costimulatory protein receptors (eg, CD28, 41BB, ICOS). In some embodiments, the implementation of the chimeric antigen receptor contains multiple signaling domains, such as CD3z-CD28-41BB or CD3z-CD28-OX40, to improve efficiency. Thus, in one aspect, the invention further provides cells (eg, T cells) that express chimeric antigen receptors as described herein.

В некоторых вариантах осуществления scFV имеет один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи.In some embodiments, the scFV has one heavy chain variable domain and one light chain variable domain.

Антитела против OX40 и антигенсвязывающие фрагментыAnti-OX40 antibodies and antigen-binding fragments

Изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с OX40. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, способны связываться с OX40 и могут стимулировать каскад передачи сигнала OX40, таким образом усиливая иммунный ответ. Настоящее изобретение относится, например, к антителам мыши против OX40 07-9H3 ("9H3"), 07-9A4 ("9A4"), 11-5C1 ("5C1") и 17-5D10 ("5D10"), и к их химерным антителам, гуманизированным антителам (например, антитела, как показано в таблице 3).The invention relates to antibodies and their antigen-binding fragments that specifically bind to OX40. The antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to OX40 and may stimulate the OX40 signaling cascade, thereby enhancing the immune response. The present invention relates, for example, to mouse anti-OX40 antibodies 07-9H3 ("9H3"), 07-9A4 ("9A4"), 11-5C1 ("5C1") and 17-5D10 ("5D10"), and their chimeric antibodies, humanized antibodies (eg antibodies as shown in Table 3).

Последовательности CDR для 9H3 и происходящих из 9H3 антител (например, гуманизированных антител) включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 1-3, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 4-6, как определено в соответствии с нумерацией Kabat. CDR также могут быть определены в соответствии с системой Chothia. В соответствии с нумерацией Chothia, последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 25-27, и последовательности CDR вариабельного домена легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 28-30. The CDR sequences for 9H3 and 9H3-derived antibodies (e.g., humanized antibodies) include the heavy chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 1-3, and the light chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 4-6, as determined according to Kabat numbering. CDRs can also be determined according to the Chothia system. According to Chothia numbering, heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 25-27 and light chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 28-30.

Аналогично, последовательности CDR для 9A4, и происходящих из 9A4 антител включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 7-9, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 10-12, как определено в соответствии с нумерацией Kabat. В соответствии с нумерацией Chothia, последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 31-33, и CDR вариабельного домена легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 34-36.Similarly, the CDR sequences for 9A4 and 9A4-derived antibodies include the heavy chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 7-9, and the light chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 10-12, as determined according to Kabat numbering. According to Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 31-33 and the light chain variable CDRs are shown in SEQ ID NOs: 34-36.

Последовательности CDR для 5C1, и происходящих из 5C1 антител включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 13-15, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 16-18, как определено в соответствии с нумерацией Kabat. В соответствии с нумерацией Chothia, последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 37-39, и CDR вариабельного домена легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 40-42.The CDR sequences for 5C1 and 5C1-derived antibodies include the heavy chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 13-15, and the light chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 16-18, as determined according to Kabat numbering. According to Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 37-39 and the light chain variable CDRs are shown in SEQ ID NOs: 40-42.

Последовательности CDR для 5D10 и происходящих из 5D10 антител включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 19-21, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 22-24, как определено в соответствии с нумерацией Kabat. В соответствии с нумерацией Chothia, последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи указаны в SEQ ID NO: 43-45, и CDR вариабельного домена легкой цепи указаны в SEQ ID NO: 46-48.The CDR sequences for 5D10 and 5D10-derived antibodies include the heavy chain variable domain CDR, SEQ ID NO: 19-21, and the light chain variable domain CDR, SEQ ID NO: 22-24, as determined according to Kabat numbering. According to Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 43-45 and the light chain variable CDRs are shown in SEQ ID NOs: 46-48.

Также предусматривается аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи гуманизированных антител. Поскольку существуют различные способы гуманизации антител мыши (например, последовательность может быть заменена другими аминокислотами), тяжелая цепь и легкая цепь антитела могут иметь более одной версии гуманизированных последовательностей. Аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9H3 указаны в SEQ ID NO: 53-55. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9H3 указаны в SEQ ID NO: 56-58. Любые из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 53-55) могут находиться в паре с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 56-58).Also provided is the amino acid sequence of the heavy chain variable region and the light chain variable region of humanized antibodies. Because there are various ways to humanize mouse antibodies (for example, the sequence can be replaced with other amino acids), the heavy chain and light chain of an antibody can have more than one version of the humanized sequences. The amino acid sequences for the heavy chain variable region of the humanized 9H3 antibody are shown in SEQ ID NOS: 53-55. The amino acid sequences for the light chain variable region of the humanized 9H3 antibody are shown in SEQ ID NOS: 56-58. Any of these heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 53-55) can be paired with any of these light chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 56-58).

Аналогично, аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 9A4 указаны в SEQ ID NO: 59-61. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 9A4 указаны в SEQ ID NO: 62-65. Любые из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 59-61) могут находиться в паре с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 62-65).Similarly, the amino acid sequences for the heavy chain variable region of the humanized antibody 9A4 are shown in SEQ ID NOS: 59-61. The amino acid sequences for the light chain variable region of the humanized 9A4 antibody are shown in SEQ ID NOS: 62-65. Any of these heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 59-61) can be paired with any of these light chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 62-65).

Аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 5C1 указаны в SEQ ID NO: 66-68. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 5C1 указаны в SEQ ID NO: 69-72. Любые из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 66-68) могут находиться в паре с любыми из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 69-72).The amino acid sequences for the heavy chain variable region of the humanized 5C1 antibody are shown in SEQ ID NOS: 66-68. The amino acid sequences for the light chain variable region of the humanized 5C1 antibody are shown in SEQ ID NOS: 69-72. Any of these heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 66-68) can be paired with any of these light chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 69-72).

Аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 5D10 указаны в SEQ ID NO: 73-75. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 5D10 указаны в SEQ ID NO: 76-78. Любые из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 73-75) могут находиться в паре с любыми из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76-78).Amino acid sequences for the heavy chain variable region of the humanized antibody 5D10 are shown in SEQ ID NOS: 73-75. The amino acid sequences for the light chain variable region of the humanized antibody 5D10 are shown in SEQ ID NOS: 76-78. Any of these heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 73-75) can be paired with any of these light chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 76-78).

Как показано на фиг. 34 процент гуманизации означает процентную идентичность последовательности вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи по сравнению с последовательностями антител человека в базе данных International Immunogenetics Information System (IMGT). Наилучшее совпадение означает, что последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи является более близкой к конкретному виду, чем к другому виду. Например, наилучшее совпадение с человеком означает, что последовательность является более близкой к человеку, чем к другим видам. Наилучшее совпадение с человеком и Macaca fascicularis означает, что последовательность имеет одинаковую процентную идентичность с последовательностью человека и с последовательностью Macaca fascicularis, и эта процентная идентичность является наиболее высокой по сравнению с последовательностями другого вида. В некоторых вариантах осуществления процент гуманизации превышает 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95%. Подробное описание того, как определять процент гуманизации и как определять наилучшие совпадения известно в данной области и представлено, например, в Jones, Tim D., et al. "The INNs and outs of antibody nonproprietary names." MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor & Francis, 2016, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Высокий процент гуманизации часто имеет различные преимущества, например, является более безопасным и более эффективным для человека, с большей вероятностью будет переноситься человеком и/или с меньшей вероятностью будет иметь побочные эффекты.As shown in FIG. 34 percent humanization means percent sequence identity of the heavy chain or light chain variable region compared to human antibody sequences in the International Immunogenetics Information System (IMGT) database. The best match means that the heavy chain or light chain variable region sequence is closer to a particular species than to another species. For example, the best human match means that the sequence is closer to humans than to other species. The best match with human and Macaca fascicularis means that the sequence has the same percent identity with the human sequence and with the Macaca fascicularis sequence, and this percent identity is the highest compared to sequences of another species. In some embodiments, the percentage of humanization is greater than 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 % or 95%. A detailed description of how to determine the percentage of humanization and how to determine the best matches is known in the art and is presented, for example, in Jones, Tim D., et al. "The INNs and outs of antibody nonproprietary names." MAbs. Vol. 8. No. 1. Taylor & Francis, 2016, which is incorporated herein by reference in its entirety. A high percentage of humanization often has various benefits, such as being safer and more effective in humans, more likely to be tolerated by humans, and/or less likely to have side effects.

Более того, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, также могут содержать одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранных из группы SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 7-9, SEQ ID NO: 13-15, SEQ ID NO: 19-21, SEQ ID NO: 25-27, SEQ ID NO: 31-33, SEQ ID NO: 37-39 и SEQ ID NO: 43-45; и/или одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи, выбранных из группы SEQ ID NO: 4-6, SEQ ID NO: 10-12, SEQ ID NO: 16-18, SEQ ID NO: 22-24, SEQ ID NO: 28-30, SEQ ID NO: 34-36, SEQ ID NO: 40-42 и SEQ ID NO: 46-48.Moreover, in some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein may also contain one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 1-3, SEQ ID NOs: 7-9 , SEQ ID NO: 13-15, SEQ ID NO: 19-21, SEQ ID NO: 25-27, SEQ ID NO: 31-33, SEQ ID NO: 37-39 and SEQ ID NO: 43-45; and/or one, two or three light chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 4-6, SEQ ID NOs: 10-12, SEQ ID NOs: 16-18, SEQ ID NOs: 22-24, SEQ ID NO: 28-30, SEQ ID NO: 34-36, SEQ ID NO: 40-42 and SEQ ID NO: 46-48.

В некоторых вариантах осуществления антитела могут иметь вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VH, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VH, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VL, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VL, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VL. Выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL представлены на фиг.31 (CDR по Kabat) и фиг.32 (CDR по Chothia).In some embodiments, the antibodies may have a heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, where the CDR1 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90 % or 95% identical to the selected amino acid sequence of the CDR1 VH, the CDR2 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95% identical to the selected amino acid sequence of the CDR2 VH, and the CDR3 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90% or 95% identical to the selected amino acid sequence of the VH CDR3, and a light chain variable region (VL) containing CDRs 1, 2, 3, where the CDR1 region contains or consists of amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90% or 95% identical to the selected amino acid sequence of the CDR1 VL, the CDR2 region contains or with consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95% identical to the selected CDR2 VL amino acid sequence, and the CDR3 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90 % or 95% identical to the selected amino acid sequence of CDR3 VL. Selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 and selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in FIG . 31 (CDR by Kabat) and FIG. 32 (CDR by Chothia).

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 1 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 2 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 3 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 1 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 2 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 7 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 8 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 9 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 7 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 8 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 9 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 13 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 14 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 15 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 13 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 14 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 15 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 19 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 20 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 21 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 19 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 20 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 21 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 25 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 26 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 27 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 25 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 26 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 27 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 31 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 32 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 33 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 31 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 32 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 33 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 37 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 38 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 39 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 37 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 38 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 39 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 43 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 44 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 45 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 43 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 44 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 45 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 4 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 5 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 6 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 4 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 5 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 6 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 10 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 11 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 12 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 10 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 11 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 12 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 16 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 17 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 18 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 16 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 17 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 18 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 22 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 23 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 24 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 22 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 23 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 24 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 28 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 29 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 30 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 28 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 29 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 30 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 34 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 35 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 36 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 34 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 35 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 36 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 40 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 41 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 42 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот. In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 40 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 41 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 42 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем описании, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три из CDR SEQ ID NO: 46 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 47 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот; SEQ ID NO: 48 с нулем, одной или двумя инсерциями, делециями или заменами аминокислот.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three of the CDRs of SEQ ID NO: 46 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 47 with zero, one or two insertions, deletions or amino acid substitutions; SEQ ID NO: 48 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

Инсерции, делеции и замены могут находиться в последовательности CDR или на одном или обоих концах последовательности CDR.Insertions, deletions and substitutions may be in the CDR sequence or at one or both ends of the CDR sequence.

Также изобретение относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с OX40. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VL. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 53, 54, 55 или 79, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 56, 57, 58 или 80. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 59, 60, 61 или 81, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65 или 82. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 66, 67, 68 или 83, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72 или 84. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, 74, 75 или 85, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76, 77, 78 или 86.The invention also relates to antibodies or antigen-binding fragments thereof that bind to OX40. Antibodies or antigen-binding fragments thereof comprise a heavy chain variable region (VH) containing or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95% identical to the selected VH sequence and a light chain variable region (VL) containing or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95% identical to the selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 53, 54, 55, or 79, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 56, 57, 58, or 80. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 59, 60, 61, or 81, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 62, 63, 64, 65, or 82. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 66, 67, 68, or 83 , and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, or 84. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 73, 74, 75, or 85, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 76, 77, 78 or 86.

Для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот последовательности выравнивают для целей оптимального сравнения (например, можно вносить пропуски в одну или обе из первой и второй аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания и негомологичные последовательности можно не рассматривать для целей сравнения). Длина выравниваемой последовательности с целью сравнения составляет по меньшей мере 80% от длины эталонной последовательности, и в некоторых вариантах осуществления составляет по меньшей мере 90%, 95% или 100%. Затем проводят сравнение аминокислотных остатков или нуклеотидов в соответствующих положениях аминокислот или положениях нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и в соответствующем положении во второй последовательности, тогда молекулы являются идентичными в этом положении. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, которые имеют последовательности, учитывая количество пропусков и длину каждого пропуска, которые необходимо вносить для оптимального выравнивания двух последовательностей. Для целей настоящего изобретения сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями можно проводить с использованием оценочной матрицы Blossum 62 со штрафом за пропуск 12, штрафом за продолжение пропуска 4, и штрафом за пропуск со сдвигом рамки 5.To determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, sequences are aligned for purposes of optimal comparison (e.g., gaps can be made in one or both of the first and second amino acid or nucleic acid sequences for optimal alignment, and non-homologous sequences may be omitted for purposes of comparison ). The length of the aligned sequence for comparison purposes is at least 80% of the length of the reference sequence, and in some embodiments is at least 90%, 95%, or 100%. The amino acid residues or nucleotides are then compared at the respective amino acid positions or nucleotide positions. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules are identical at that position. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions that the sequences have, given the number of gaps and the length of each gap that must be made to optimally align the two sequences. For purposes of the present invention, sequence comparison and determination of percent identity between two sequences can be performed using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap extension penalty of 4, and a frameshift gap penalty of 5.

Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или легкую цепь иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь иммуноглобулина содержит CDR, как показано на фиг. 31 или фиг. 32, или имеет последовательности, как показано на фиг. 34 или фиг. 35. Когда полипептиды находятся в паре с соответствующим полипептидом (например, соответствующей вариабельной областью тяжелой цепи или соответствующей вариабельной областью легкой цепи), находящиеся в паре полипептиды связываются с OX40 (например, OX40 человека).The invention also relates to a nucleic acid containing a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin light chain. An immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin light chain contains a CDR as shown in FIG. 31 or FIG. 32 or has sequences as shown in FIG. 34 or FIG. 35 . When the polypeptides are paired with a corresponding polypeptide (eg, the corresponding heavy chain variable region or the corresponding light chain variable region), the paired polypeptides bind to OX40 (eg, human OX40).

Антитела против OX40 и антигенсвязывающие фрагменты также могут представлять собой варианты антител (включая производные и конъюгаты) или фрагменты антител и мультиспецифические (например, биспецифические) антитела или фрагменты антител. Дополнительные антитела, описанные в настоящем описании, представляют собой поликлональные, моноклональные, мультиспецифические (мультимерные, например, биспецифические), антитела человека, химерные антитела (например, химера человек-мышь), одноцепочечные антитела, внутриклеточно продуцированные антитела (т.е. интраантитела) и их антигенсвязывающие фрагменты. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой IgG-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.Anti-OX40 antibodies and antigen binding fragments can also be antibody variants (including derivatives and conjugates) or antibody fragments and multispecific (eg, bispecific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies described herein are polyclonal, monoclonal, multispecific (multimeric, e.g., bispecific), human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera), single chain antibodies, intracellularly produced antibodies (i.e., intraantibodies) and their antigen-binding fragments. Antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

Фрагменты антител являются пригодными для применения в описанных способах при условии, что они сохраняют желаемую аффинность и специфичность полноразмерного антитела. Таким образом, фрагмент антитела, которое связывается с OX40, сохраняет способность связываться с OX40. Fv-фрагмент представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный распознающий и связывающий антиген участок. Эта область состоит из димера из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в прочной ассоциации, которая может иметь ковалентную природу, например, в scFv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий центр на поверхности димера VH-VL. В совокупности, шесть CDR или их подгруппа сообщают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных к антигену) может обладать способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно и с более низкой аффинностью, чем у целого связывающего участка.Antibody fragments are suitable for use in the methods described, provided they retain the desired affinity and specificity of the full length antibody. Thus, an antibody fragment that binds to OX40 retains the ability to bind to OX40. An Fv fragment is an antibody fragment that contains a complete antigen-recognizing and antigen-binding region. This region consists of a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain in a tight association, which may be covalent in nature, such as in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. Collectively, the six CDRs, or a subset thereof, confer antigen-binding specificity on the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific to an antigen) may have the ability to recognize and bind an antigen, albeit usually at a lower affinity than the entire binding site.

Одноцепочечные фрагменты Fv или (scFv) содержат домены VH и VL (или области) антитела, где эти домены находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать требуемую структуру для связывания антигена.Single chain Fv or (scFv) fragments contain the VH and VL domains (or regions) of an antibody, where these domains are in the same polypeptide chain. Typically, the scFv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the scFv to form the desired structure for antigen binding.

Fab-фрагмент содержит вариабельный и константный домен легкой цепи и вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. F(ab')2-фрагменты антител содержат пару Fab-фрагментов, которые обычно ковалентно связаны вблизи их С-концов остатками цистеина между ними. Также в данной области известны другие химические связи между фрагментами антител.The Fab fragment contains the variable and constant domain of the light chain and the variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F(ab')2 antibody fragments contain a pair of Fab fragments that are typically covalently linked near their C-terminus with cysteine residues in between. Other chemical bonds between antibody fragments are also known in the art.

Диантитела представляют собой небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими центрами, которые содержат VH, связанную с VL, в одной полипептидной цепи (VH и VL). С использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить образование пар между двумя доменами на одной цепи, домены вынуждают образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих центра.Diantibodies are small antibody fragments with two antigen-binding sites that contain a VH linked to a VL in the same polypeptide chain (VH and VL). By using a linker that is too short to allow pairing between two domains on the same strand, the domains are forced to pair with complementary domains on the other strand and create two antigen binding sites.

Линейные антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.Linear antibodies contain a pair of tandem Fd segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen-binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific.

Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть модифицированы в Fc-области для обеспечения желаемых эффекторных функций или времени полужизни в сыворотке.The antibodies and antibody fragments of the present invention can be modified in the Fc region to provide desired effector functions or serum half-life.

Мультимеризацию антител можно проводить посредством естественной агрегации антител или способами химического или рекомбинантного связывания, известными в данной области. Например, некоторый процент очищенных препаратов антител (например, очищенных молекул IgG₁) спонтанно образует белковые агрегаты, содержащие гомодимеры антител и другие мультимеры антител более высокого порядка.Antibody multimerization can be carried out by natural antibody aggregation or by chemical or recombinant linkage methods known in the art. For example, a certain percentage of purified antibody preparations (eg, purified IgG ₁ molecules) spontaneously form protein aggregates containing antibody homodimers and other higher order antibody multimers.

Альтернативно гомодимеры антител могут быть образованы способами химического связывания, известными в данной области. Например, для получения мультимеров антител можно использовать гетеробифункциональные сшивающие средства, включая, но не ограничиваясь ими, SMCC (сукцинимидил-4-(малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат) и SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат). Иллюстративный протокол получения гомодимеров антител описан в Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997). Гомодимеры антител можно конвертировать в гомодимеры Fab’₂ путем расщепления пепсином. Другим способом получения гомодимеров антител является использование аутофильного пептида T15, описанного в Zhao et al. (J. Immunol. 25:396-404, 2002).Alternatively, antibody homodimers can be formed by chemical coupling methods known in the art. For example, heterobifunctional crosslinkers can be used to prepare antibody multimers, including but not limited to SMCC (succinimidyl-4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) and SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate). An exemplary protocol for the production of antibody homodimers is described in Ghetie et al. ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7509-7514, 1997). Antibody homodimers can be converted to Fab' ₂ homodimers by pepsin digestion. Another way to obtain antibody homodimers is to use the autophilic T15 peptide described in Zhao et al. ( J. Immunol. 25:396-404, 2002).

В некоторых вариантах осуществления мультиспецифиеское антитело представляет собой биспецифическое антитело. Биспецифические антитела можно получать путем конструирования поверхности контакта между парой молекул антител для максимизации процента гетеродимеров, которые выделяют из рекомбинантной клеточной культуры. Например, поверхность контакта может содержать по меньшей мере часть CH3-домена константного домена антитела. В этом способе одну или несколько небольших боковых цепей аминокислот с поверхности контакта первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозин или триптофан). На поверхности контакта второй молекулы антитела создают компенсаторные "полости" идентичного или сходного размера с более крупной боковой цепью(ями) путем замены больших боковых цепей аминокислот на меньшие (например, аланин или треонин). Это обеспечивает механизм увеличения выхода гетеродимера относительно нежелательных конечных продуктов, таких как гомодимеры. Этот способ описан, например, в WO 96/27011, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.In some embodiments, the multispecific antibody is a bispecific antibody. Bispecific antibodies can be generated by designing a contact surface between a pair of antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are isolated from the recombinant cell culture. For example, the contact surface may contain at least a portion of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the contact surface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan). At the contact surface of the second antibody molecule, compensatory "cavities" of identical or similar size to the larger side chain(s) are created by replacing large amino acid side chains with smaller ones (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of the heterodimer relative to undesired end products such as homodimers. This method is described, for example, in WO 96/27011, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Биспецифические антитела антитела включают сшитые антитела или "гетероконъюгаты" антител. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Гетероконъюгаты антител также можно получать с использованием любых удобных способов сшивания. Подходящие сшивающие агенты и способы сшивания хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.Bispecific antibodies antibodies include cross-linked antibodies or "heteroconjugates" of antibodies. For example, one of the antibodies in a heteroconjugate can be linked to avidin and the other to biotin. Antibody heteroconjugates can also be made using any convenient crosslinking technique. Suitable cross-linking agents and cross-linking methods are well known in the art and are described in US Pat. No. 4,676,980, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Способы получения биспецифических антител из фрагментов антител также известны в данной области. Например, биспецифические антитела можно получать с использованием химического сшивания. Brennan et al. (Science 229:81, 1985) описывают методику, в которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению для получения F(ab’)₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии комплексообразующего агента для дитиола арсенита натрия для стабилизации соседних дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидов. Затем полученные Fab’-фрагменты конвертируют в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных Fab’ с TNB обратно конвертируют в Fab’-тиол посредством восстановления меркаптоэтиламином, а затем смешивают с эквимоляным количеством другого производного Fab’ с TNB с получением биспецифического антитела.Methods for producing bispecific antibodies from antibody fragments are also known in the art. For example, bispecific antibodies can be generated using chemical crosslinking. Brennan et al. ( Science 229:81, 1985) describe a procedure in which intact antibodies are subjected to proteolytic cleavage to obtain F(ab') ₂ fragments. These fragments are reduced in the presence of a sodium arsenite dithiol complexing agent to stabilize adjacent dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfides. The resulting Fab' fragments are then converted into thionitrobenzoate (TNB) derivatives. One of the TNB Fab' derivatives is then back converted to Fab'-thiol by reduction with mercaptoethylamine and then mixed with an equimolar amount of another TNB Fab' derivative to form a bispecific antibody.

Любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, можно конъюгировать со стабилизирующей молекулой (например, молекула, которая увеличивает время полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента у индивидуума или в растворе). Неограничивающие примеры стабилизирующих молекул включают: полимер (например, полиэтиленгликоль) или белок (например, сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека). Конъюгация со стабилизирующей молекулой может увеличивать время полужизни или продлевать биологическую активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента in vitro (например, в культуре тканей или при хранении в качестве фармацевтической композиции) или in vivo (например, у человека).Any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may be conjugated to a stabilizing molecule (eg, a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in an individual or in solution). Non-limiting examples of stabilizing molecules include: polymer (eg, polyethylene glycol) or protein (eg, serum albumin, such as human serum albumin). Conjugation to a stabilizing molecule may increase the half-life or prolong the biological activity of the antibody or antigen-binding fragment in vitro (eg, in tissue culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (eg, in humans).

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, можно конъюгировать с терапевтическим средством. Конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть ковалентно или нековалентно связан с терапевтическим средством. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство (например, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин, майтанзиноиды, такие как DM-1 и DM-4, дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, эпирубицин и циклофосфамид, и аналоги).In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be conjugated to a therapeutic agent. An antibody-drug conjugate containing an antibody or antigen-binding fragment thereof can be covalently or non-covalently linked to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracine, maytansinoids such as DM- 1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin, and cyclophosphamide, and analogues).

Характеристики антителCharacteristics of antibodies

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем описании, могут блокировать связывание между OX40 и OX40L.The antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can block binding between OX40 and OX40L.

В некоторых вариантах осуществления посредством связывания с OX40 антитело может стимулировать каскад передачи сигнала OX40 и усиливать иммунный ответ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, являются агонистами OX40. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты являются агонистами OX40.In some embodiments, by binding to OX40, an antibody can stimulate the OX40 signaling cascade and enhance the immune response. Thus, in some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments thereof, as described herein, are OX40 agonists. In some embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, are OX40 agonists.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, могут повышать иммунный ответ, активность OX40, активность или количество T-клеток (например, CD8+ и/или CD4+ клеток) по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз, в 10 раз или в 20 раз. В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, могут снижать активность или количество Treg по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, в 2 раза, в 3 раза, в 5 раз, в 10 раз или в 20 раз.In some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments thereof, as described herein, can increase the immune response, OX40 activity, T-cell (e.g., CD8+ and/or CD4+ cells) activity or number by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2x, 3x, 5x, 10x or 20x. In some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments thereof, as described herein, can reduce Treg activity or amount by at least 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2x, 3x, 5x, 10x or 20x.

В некоторых вариантах осуществления антитело (или его антигенсвязывающие фрагменты) специфически связывается с OX40 (например, OX40 человека, OX40 обезьяны, OX40 мыши и/или химерный OX40) со скоростью диссоциации (koff) менее 0,1 с^-1, менее 0,01 с^-1, менее 0,001 с^-1, менее 0,0001 с^-1 или менее 0,0001 с^-1. В некоторых вариантах осуществления скорость диссоциации (koff) превышает 0,01 с^-1, превышает 0,001 с^-1, превышает 0,0001 с^-1, превышает 0,0001 с^-1 или превышает 0,00001 с^-1.In some embodiments, the antibody (or antigen-binding fragments thereof) specifically binds to OX40 (e.g., human OX40, monkey OX40, mouse OX40, and/or chimeric OX40) with a dissociation rate (koff) of less than 0.1 s ^-1 , less than 0.01 s ^-1 , less than 0.001 s ^-1 , less than 0.0001 s ^-1 or less than 0.0001 s ^-1 . In some embodiments, the dissociation rate (koff) is greater than 0.01 s ^-1 , greater than 0.001 s ^-1 , greater than 0.0001 s ^-1 , greater than 0.0001 s ^-1 , or greater than 0.00001 s ^-1 .

В некоторых вариантах осуществления кинетическая скорость ассоциации (kon) превышает 1×10²/Мс, превышает 1×10³/Мс, превышает 1×10⁴/Мс, превышает 1×10⁵/Мс, или превышает 1×10⁶/Мс. В некоторых вариантах осуществления кинетическая скорость ассоциации (kon) составляет менее 1×10⁵/Мс, менее 1×10⁶/Мс или менее 1×10⁷/Мс.In some embodiments, the association kinetic rate (kon) is greater than 1x10 ² /Ms, greater than 1x10 ³ /Ms, greater than 1x10 ⁴ /Ms, greater than 1x10 ⁵ /Ms, or greater than 1x10 ⁶ /Ms . In some embodiments, the association kinetic rate (kon) is less than 1x10 ⁵ /Ms, less than 1x10 ⁶ /Ms, or less than 1x10 ⁷ /Ms.

Аффинность может быть установлена из частного кинетических констант скорости (KD=koff/kon). В некоторых вариантах осуществления KD составляет менее 1×10^-6M, менее 1×10^-7M, менее 1×10^-8 M, менее 1×10^-9 M или менее 1×10^-10 M. В некоторых вариантах осуществления KD составляет менее 30 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ. В некоторых вариантах осуществления KD составляет более чем 1×10^-7M, более чем 1×10^-8M, более чем 1×10^-9 M, более чем 1×10^-10 M, более чем 1×10^-11 M или более чем 1×10^-12 M. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с OX40 человека с KD, меньшей или равной приблизительно 1,5 нМ.Affinity can be determined from the partial kinetic rate constants (KD=koff/kon). In some embodiments, the KD is less than 1×10 ^-6 M, less than 1×10 ^-7 M, less than 1×10 ^-8 M, less than 1×10 ^-9 M, or less than 1×10 ^-10 M. In some embodiments, the implementation KD is less than 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, or 1 nM. In some embodiments, the KD is greater than ^{1x10 -7} M, greater than ^{1x10 -8} M, greater than ^{1x10 -9} M, greater than ^{1x10 -10} M, greater than ^{1x10 -11} M or greater than 1×10 ^-12 M. In some embodiments, the antibody binds to human OX40 with a KD less than or equal to about 1.5 nM.

Основные способы определения аффинности антитела в отношении антигена включают, например, ELISA, RIA и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с OX40 человека (SEQ ID NO: 49), OX40 обезьяны (например, OX40 макака резус, SEQ ID NO: 51), химерным OX40 (SEQ ID NO: 52) и/или OX40 мыши (SEQ ID NO: 50). В некоторых вариантах осуществления антитело не связывается с OX40 человека (SEQ ID NO: 49), OX40 обезьяны (например, OX40 макака резус, SEQ ID NO: 51; OX40 яванского макака), химерным OX40 (SEQ ID NO: 52) и/или OX40 мыши (SEQ ID NO: 50).The main methods for determining the affinity of an antibody for an antigen include, for example, ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR). In some embodiments, the antibody binds to human OX40 (SEQ ID NO: 49), monkey OX40 (e.g., rhesus monkey OX40, SEQ ID NO: 51), chimeric OX40 (SEQ ID NO: 52), and/or mouse OX40 (SEQ ID NO: 52). NO: 50). In some embodiments, the antibody does not bind to human OX40 (SEQ ID NO: 49), monkey OX40 (e.g., rhesus monkey OX40, SEQ ID NO: 51; cynomolgus monkey OX40), chimeric OX40 (SEQ ID NO: 52), and/or Mouse OX40 (SEQ ID NO: 50).

В некоторых вариантах осуществления определяют термическую стабильность. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, могут иметь ™ более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C. Поскольку IgG может быть описан как мультидоменный белок, кривая плавления иногда демонстрирует два перехода с первой температурой денатурации ™ D1 и второй температурой денатурации ™ D2. Присутствие этих двух пиков часто указывает на денатурацию Fc-доменов (™ D1) и Fab-доменов (™ D2), соответственно. Когда существует два пика ™ обычно относится к ™ D2.In some embodiments, thermal stability is determined. Antibodies or antigen-binding fragments as described herein may have ™ greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95°C. Because IgG can be described as a multi-domain protein, the melt curve sometimes shows two transitions with a first denaturation temperature ™ D1 and a second denaturation temperature ™ D2. The presence of these two peaks often indicates denaturation of Fc domains (™ D1) and Fab domains (™ D2), respectively. When there are two peaks ™ usually refers to ™ D2.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, имеют ™ D1 более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, имеют ™ D2 более 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C.Thus, in some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments as described herein have ™ D1 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95°C. In some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments as described herein have ™ D2 greater than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95°C.

В некоторых вариантах осуществления ™, ™ D1, ™ D2 составляют менее 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 или 95°C.In some embodiments, ™, ™ D1, ™ D2 are less than 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 or 95°C.

В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процентное ингибирование роста опухоли (TGI%), превышающее 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процентное ингибирование роста опухоли, которое составляет менее 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. TGI% можно определять, например, через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 суток после начала лечения или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев после начала лечения. Как используют в рамках изобретения процентное ингибирование роста опухоли (TGI%) вычисляют с использованием следующей формулы:In some embodiments, the antibody has a percent tumor growth inhibition (TGI%) greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120 %, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200%. In some embodiments, the antibody has a percentage tumor growth inhibition that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200%. TGI% can be determined, for example, through 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 days after the start of treatment or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 or 12 months after the start of treatment. As used within the scope of the invention, percent tumor growth inhibition (TGI%) is calculated using the following formula:

TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100

Ti представляет собой средний объем опухоли в группе лечения на сутки i. T0 представляет собой средний объем опухоли в группе лечения на нулевые сутки. Vi представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе на сутки i. V0 представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе на нулевые сутки.Ti is the mean tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the mean tumor volume in the treatment group at day zero. Vi is the mean tumor volume in the control group on day i. V0 is the mean tumor volume in the control group at day zero.

В некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, как описано в настоящем описании, являются агонистами OX40. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты усиливают передачу сигнала OX40 в клетке-мишени, которая экспрессирует OX40. В некоторых вариантах осуществления передачу сигнала OX40 выявляют посредством мониторинга нижеследующей передачи сигнала NFκB.In some embodiments, the antibodies, or antigen-binding fragments thereof, as described herein, are OX40 agonists. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments enhance OX40 signaling in a target cell that expresses OX40. In some embodiments, OX40 signaling is detected by monitoring downstream NFκB signaling.

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты усиливают функцию CD4+ эффекторных T-клеток, например, посредством увеличения пролиферации CD4+ эффекторных T-клеток и/или увеличения продукции гамма-интерферона CD4+ эффекторной T-клеткой (например, по сравнению с пролиферацией и/или продукцией цитокинов до лечения антителами или антигенсвязывающими фрагментами). В некоторых вариантах осуществления цитокин представляет собой гамма-интерферон. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты увеличивают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD4+ эффекторных T-клеток (например, общее количество CD4+ эффекторных T-клеток, или например, процент CD4+ клеток в CD45+ клетках), например, по сравнению с количеством противоопухолевых (инфильтрирующих) CD4+ T-клеток до лечения антителами или антигенсвязывающими фрагментами. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты увеличивают количество противоопухолевых (инфильтрирующих) CD4+ эффекторных T-клеток, которые экспрессируют гамма-интерферон (например, общие CD4+ клетки, экспрессирующие гамма-интерферон, или, например, процент CD4+ клеток, экспрессирующих гамма-интерферон в общих CD4+ клетках), например, по сравнению с количеством внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD4+ T-клеток, которые экспрессируют гамма-интерферон, до лечения.In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments enhance the function of CD4+ effector T cells, for example, by increasing the proliferation of CD4+ effector T cells and/or increasing the production of interferon gamma by a CD4+ effector T cell (for example, compared to proliferation and/or production of cytokines prior to treatment with antibodies or antigen-binding fragments). In some embodiments, the cytokine is interferon gamma. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments increase the number of intratumoral (infiltrating) CD4+ effector T cells (e.g., total number of CD4+ effector T cells, or, e.g., percentage of CD4+ cells in CD45+ cells), e.g. ) CD4+ T cells before treatment with antibodies or antigen-binding fragments. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments increase the number of antitumor (infiltrating) CD4+ effector T cells that express interferon gamma (e.g., total CD4+ cells expressing interferon gamma, or, for example, the percentage of CD4+ cells expressing interferon gamma in total CD4+ cells), for example, compared with the number of intratumoral (infiltrating) CD4+ T cells that express interferon-gamma before treatment.

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты увеличивают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8+ эффекторных T-клеток (например, общее количество CD8+ эффекторных T-клеток или, например, процент CD8+ в CD45+ клетках), например, по сравнению с количеством внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8+ эффекторных T-клеток до лечения. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты увеличивают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) CD8+ эффекторных T-клеток, которые экспрессируют гамма-интерферон (например, процент CD8+ клеток, которые экспрессируют гамма-интерферон, общих CD8+ клетках), например, по сравнению с количеством противоопухолевых (инфильтрирующих) CD8+ T-клеток, которые экспрессируют гамма-интерферон, до лечения антителом против OX40 человека.In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments increase the number of intratumoral (infiltrating) CD8+ effector T cells (e.g., the total number of CD8+ effector T cells, or, e.g., the percentage of CD8+ in CD45+ cells), for example, compared to the number of intratumoral (infiltrating) CD8+ effector T cells before treatment. In some embodiments, antibodies or antigen-binding fragments increase the number of intratumoral (infiltrating) CD8+ effector T cells that express interferon gamma (e.g., the percentage of CD8+ cells that express interferon gamma in total CD8+ cells), for example, compared to the number of antitumor (infiltrating) CD8+ T cells that express interferon gamma prior to treatment with anti-human OX40 antibody.

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты усиливают функцию T-клеток памяти, например, путем усиления пролиферации T-клеток памяти и/или увеличения продуцирования цитокинов (например, гамма-интерферона) клетками памяти.In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments enhance memory T cell function, for example, by enhancing memory T cell proliferation and/or increasing cytokine (eg, interferon gamma) production by memory cells.

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты ингибируют функцию Treg, например, путем снижения подавления посредством Treg функции эффекторных T-клеток (например, пролиферация эффекторных T-клеток и/или секреция T-клеточных цитокинов). В некоторых вариантах осуществления эффекторная T-клетка представляет собой CD4+ эффекторную T-клетку. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты уменьшают количество внутриопухолевых (инфильтрирующих) Treg (например, общее количество Treg или, например, процент Fox3p+ клеток в CD4+ клетках).In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments inhibit Treg function, for example, by reducing Treg suppression of effector T cell function (eg, effector T cell proliferation and/or secretion of T cell cytokines). In some embodiments, the effector T cell is a CD4+ effector T cell. In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments reduce the number of intratumoral (infiltrating) Tregs (eg, the total number of Tregs or, for example, the percentage of Fox3p+ cells in CD4+ cells).

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой истощающее антитело против hOX40 (например, истощает клетки, которые экспрессируют OX40 человека). В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты истощают клетки, которые экспрессируют OX40 человека in vitro. В некоторых вариантах осуществления клетки, экспрессирующие OX40 человека, представляют собой CD4+ эффекторные T-клетки или клетки Treg. В некоторых вариантах осуществления истощение осуществляется посредством ADCC и/или фагоцитоза.In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment is a depleting hOX40 antibody (eg, depletes cells that express human OX40). In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments deplete cells that express human OX40 in vitro . In some embodiments, cells expressing human OX40 are CD4+ effector T cells or Treg cells. In some embodiments, the implementation of the depletion is carried out through ADCC and/or phagocytosis.

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты имеют функциональную Fc-область. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной Fc-области представляет собой антителозависимую клеточно-опосредуемую цитотоксичность (ADCC). В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной Fc-области представляет собой фагоцитоз. В некоторых вариантах осуществления эффекторная функция функциональной Fc-области представляет собой ADCC и фагоцитоз. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область IgG1 человека, IgG2 человека, IgG3 человека или IgG4 человека.In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments have a functional Fc region. In some embodiments, the effector function of the functional Fc region is antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC). In some embodiments, the effector function of the functional Fc region is phagocytosis. In some embodiments, the effector function of the functional Fc region is ADCC and phagocytosis. In some embodiments, the Fc region is a human IgG1, human IgG2, human IgG3, or human IgG4 Fc region.

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты не индуцируют апоптоз в клетках, экспрессирующих OX40 (например, Treg).In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments do not induce apoptosis in cells expressing OX40 (eg, Treg).

В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты не имеют функциональной Fc-области. Например, антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой Fab, Fab’, F(ab’)2 и Fv-фрагменты.In some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments do not have a functional Fc region. For example, antibodies or antigen binding fragments are Fab, Fab', F(ab')2 and Fv fragments.

Способы получения антител против OX40Methods for obtaining antibodies against OX40

Выделенный фрагмент OX40 человека можно использовать в качестве иммуногена для получения антител с использованием стандартных способов получения поликлональных и моноклональных антител. Поликлональные антитела могут быть индуцированы у животных посредством многократных инъекций (например, подкожных или внутрибрюшинных инъекций) антигенного пептида или белка. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок инъецируют по меньшей мере с одним адъювантом. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок может быть конъюгирован со средством, которое является иммуногенным у вида, подлежащего иммунизации. Животным можно инъецировать антигенный пептид или белок более одного раза (например, два раза, три раза или четыре раза).An isolated fragment of human OX40 can be used as an immunogen to generate antibodies using standard methods for producing polyclonal and monoclonal antibodies. Polyclonal antibodies can be induced in animals by multiple injections (eg, subcutaneous or intraperitoneal injections) of the antigenic peptide or protein. In some embodiments, the antigenic peptide or protein is injected with at least one adjuvant. In some embodiments, the antigenic peptide or protein may be conjugated to an agent that is immunogenic in the species to be immunized. Animals can be injected with the antigenic peptide or protein more than once (eg, two times, three times, or four times).

В качестве иммуногенов можно использовать полноразмерный полипептид или белок или альтернативно можно использовать их антигенные пептидные фрагменты. Антигенный пептид белка содержит по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 10, 15, 20 или 30) аминокислотных остатков аминокислотной последовательности OX40 и охватывает эпитоп белка, так чтобы антитело, индуцированное против пептида, образовывало специфический иммунный комплекс с белком. Как описано выше, полноразмерная последовательность OX40 человека известна в данной области (SEQ ID NO: 49).As immunogens, a full-length polypeptide or protein can be used, or alternatively, antigenic peptide fragments thereof can be used. An antigenic peptide of a protein contains at least 8 (e.g., at least 10, 15, 20, or 30) amino acid residues of the OX40 amino acid sequence and spans an epitope of the protein such that an antibody raised against the peptide forms a specific immune complex with the protein. As described above, the full length sequence of human OX40 is known in the art (SEQ ID NO: 49).

Иммуноген, как правило, используют для получения антител посредством иммунизации подходящего индивидуума (например, человека или трансгенного животного, экспрессирующего по меньшей мере один локус иммуноглобулина человека). Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессированный или химически синтезированный полипептид (например, фрагмент OX40 человека). Кроме того, препарат может включать адъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда, или сходный иммуностимулирующий агент.An immunogen is typically used to generate antibodies by immunizing a suitable individual (eg, a human or a transgenic animal expressing at least one human immunoglobulin locus). A suitable immunogenic preparation may comprise, for example, a recombinantly expressed or chemically synthesized polypeptide (eg, a human OX40 fragment). In addition, the formulation may include an adjuvant such as complete or incomplete Freund's adjuvant, or a similar immunostimulatory agent.

Поликлональные антитела можно получать, как описано выше, посредством иммунизации подходящего индивидуума полипептидом OX40, или его антигенным пептидом (например, часть OX40) в качестве иммуногена. Мониторинг титра антител у иммунизированного индивидуума с течением времени можно проводить стандартными способами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), с использованием иммобилизованного полипептида или пептида OX40. Если желательно, молекулы антител можно выделять из млекопитающего (например, из крови) и далее очищать хорошо известными способами, такими как хроматография с белком A или с белком G, с получением фракции IgG. В соответствующий момент времени после иммунизации, например, когда титры специфических антител являются наиболее высокими, можно получать продуцирующие антитела клетки от индивидуума и использовать их для получения моноклональных антител стандартными способами, такими как способ гибридом, первоначально описанный Kohler et al. (Nature 256:495-497, 1975), способ гибридом из B-клеток человека (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), способ EBV-гибридом (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) или способы триом. Технология получения гибридом хорошо известна (см., главным образом, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Гибридомные клетки, продуцирующие моноклональное антитело, выявляют посредством скрининга культуральных супернатантов гибридом в отношении антител, которые связывают представляющий интерес полипептид или эпитоп, например, с использованием стандартного анализа ELISA.Polyclonal antibodies can be obtained as described above by immunizing a suitable individual with an OX40 polypeptide, or antigenic peptide (eg, part of OX40) as an immunogen. Monitoring of antibody titer in an immunized individual over time can be done by standard methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an immobilized polypeptide or OX40 peptide. If desired, antibody molecules can be isolated from a mammal (eg, blood) and further purified by well-known methods such as protein A or protein G chromatography to obtain an IgG fraction. At an appropriate point in time after immunization, such as when specific antibody titers are highest, antibody-producing cells can be obtained from the individual and used to generate monoclonal antibodies by standard methods, such as the hybridoma method originally described by Kohler et al. ( Nature 256:495-497, 1975), human B cell hybridoma method (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), EBV hybridoma method (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) or triome methods. The technology for producing hybridomas is well known (see especially Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Hybridoma cells producing a monoclonal antibody are detected by screening hybridoma culture supernatants for antibodies that bind a polypeptide or epitope of interest, for example, using a standard ELISA assay.

Варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, можно получать путем внесения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую антитело человека, гуманизированное или химерное, или их антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящем описании, или посредством пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, инсерции или замены остатков в аминокислотных последовательностях, которые составляют антигенсвязывающий центр антитела или антигенсвязывающий домен. В совокупности таких вариантов некоторые антитела или антигенсвязывающие фрагменты имеют увеличенную аффинность в отношении белка-мишени, например, OX40. Любую комбинацию делеций, инсерций и/или комбинаций можно вносить для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые обладают увеличенной аффинностью связывания в отношении мишени. Аминокислотные изменения, внесенные в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, также могут изменять или вносить новые посттрансляционные модификации в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, такие как изменение (например, увеличение или уменьшение) количества участков гликозилирования, изменение типа участка гликозилирования (например, изменение аминокислотной последовательности, так чтобы другой сахар присоединялся ферментами, присутствующими в клетке), или внесение новых участков гликозилирования.Variants of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be obtained by making appropriate nucleotide changes in the DNA encoding the human, humanized or chimeric antibody or antigen-binding fragment described herein, or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues in amino acid sequences that constitute an antibody antigen-binding center or antigen-binding domain. In the aggregate of such variants, certain antibodies or antigen-binding fragments have increased affinity for the target protein, for example, OX40. Any combination of deletions, insertions and/or combinations can be made to produce an antibody or antigen-binding fragment thereof that has increased binding affinity for the target. Amino acid changes made to an antibody or antigen binding fragment may also change or introduce new post-translational modifications to the antibody or antigen binding fragment, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence, so for another sugar to be attached by enzymes present in the cell), or the introduction of new glycosylation sites.

Антитела, описанные в настоящем описании, могут происходить из любого вида животных, включая млекопитающих. Неограничивающие примеры нативных антител включают антитела, происходящие из человека, приматов, например, низших обезьян и высших обезьян, коров, свиней, лошадей, овец, животных семейства верблюжьих (например, верблюдов и лам), кур, коз и грызунов (например, крыс, мышей, хомячков и кроликов), включая трансгенных грызунов, модифицированных способами генной инженерии для продуцирования антител человека.The antibodies described herein may be from any animal species, including mammals. Non-limiting examples of native antibodies include those derived from humans, primates, e.g., monkeys and apes, cows, pigs, horses, sheep, camelids (e.g., camels and llamas), chickens, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits), including transgenic rodents modified by genetic engineering to produce human antibodies.

Антитела человека и гуманизированные антитела включают антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из (или имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и вариабельные и константные области, происходящие из) последовательностей иммуноглобулинов эмбрионального типа человека. Антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человека эмбрионального типа (например, мутации, внесенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например, в CDR.Human and humanized antibodies include antibodies having variable and constant regions derived from (or having the same amino acid sequence as variable and constant regions derived from) human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (eg, mutations introduced by in vitro random or site-directed mutagenesis or by in vivo somatic mutation), for example, in CDRs.

Гуманизированное антитело, как правило, имеет каркасную область человека (FR), в которую трансплантирована CDR не человека. Таким образом, гуманизированное антитело имеет одну или несколько аминокислотных последовательностей, встроенных в него из источника, который не является человеческим. Эти не являющиеся человеческими аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортного" вариабельного домена. Гуманизацию по существу можно проводить, например, посредством замены CDR или последовательностями CDR соответствующих последовательностей антитела человека. Эти способы описаны, например, в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); все из которых включены в настоящем описании в качестве ссылки в полном объеме. Таким образом, "гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела, где по существу менее чем интактный V-домен человека заменен соответствующей последовательностью из вида, не являющегося человеком. На практике, гуманизированные антитела, как правило, представляют собой антитела мыши, в которых некоторые остатки CDR и некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных областей антител человека.A humanized antibody typically has a human framework region (FR) into which a non-human CDR is grafted. Thus, a humanized antibody has one or more amino acid sequences inserted into it from a source that is not human. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are typically taken from an "import" variable domain. Essentially humanization can be carried out, for example, by replacing the CDR or CDR sequences of the corresponding human antibody sequences. These methods are described, for example, in Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988); all of which are incorporated herein by reference in their entirety. Thus, "humanized" antibodies are chimeric antibodies where a substantially less than intact human V domain is replaced with a corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically murine antibodies in which some CDR residues and some FR residues are replaced with residues from analogous regions of human antibodies.

Выбор доменов VH и VL человека для применения при получении гуманизированных антител является очень важным для снижения иммуногенности. В соответствии с так называемым способом "наилучшего соответствия" последовательность V-домена антитела мыши подвергают скринингу против целой библиотеки известных последовательностей доменов человека. Затем последовательность человека, которая является наиболее близкой к последовательности мыши, берут в качестве FR человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).The choice of human VH and VL domains for use in making humanized antibodies is very important to reduce immunogenicity. According to the so-called "best fit" method, the V domain sequence of a mouse antibody is screened against the entire library of known human domain sequences. The human sequence that is closest to the mouse sequence is then taken as the human FR for the humanized antibody (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

Кроме того, является важным, чтобы антитела гуманизировали с сохранением высокой специфичности и аффинности в отношении антигена и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела можно получать способом анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов широко доступны и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и выводят вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов, являющихся кандидатами. Исследование этих выделенных данных позволяет анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина, являющейся кандидатом, т.е. анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина, являющегося кандидатом, связывать его антиген. Таким образом, остатки FR можно выбирать и комбинировать из реципиентных и импортных последовательностей так, чтобы достигать желаемой характеристики антител, такой как увеличенная аффинность в отношении антигена(ов)-мишени.In addition, it is important that the antibodies be humanized while retaining high specificity and affinity for the antigen and other favorable biological properties. To achieve this goal, humanized antibodies can be obtained by analyzing the original sequences and various conceptual humanized products using three-dimensional models of the original and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are widely available and known to those skilled in the art. Computer programs are available that illustrate and derive probable three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. Examination of these isolated data allows an analysis of the likely role of the residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequence, i.e. analysis of residues that affect the ability of a candidate immunoglobulin to bind its antigen. Thus, FR residues can be selected and combined from recipient and import sequences so as to achieve the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen(s).

Обычно варианты аминокислотной последовательности антитела против OX40 человека, гуманизированного или химерного антитела против OX40 содержат аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% процентной идентичностью с последовательностью, присутствующей в легкой или тяжелой цепи исходного антитела.Typically, amino acid sequence variants of a human anti-OX40 antibody, humanized or chimeric anti-OX40 antibody comprise an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% percent identity with the sequence present in the light or heavy chain of the parent antibody.

Идентичность или гомология в отношении исходной последовательности обычно представляет собой процент аминокислотных остатков, присутствующих в последовательности-кандидате, которые идентичны последовательности, присутствующей в антителе против OX40 или фрагменте человека, гуманизированном или химерном антителе против OX40 или фрагменте, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не учитывая какие-либо консервативные замены в качестве части идентичности последовательностей.Identity or homology to parental sequence is generally the percentage of amino acid residues present in a candidate sequence that are identical to the sequence present in a human anti-OX40 antibody or fragment, humanized or chimeric anti-OX40 antibody or fragment, after sequence alignment and gaps have been inserted if necessary, to achieve maximum percent sequence identity, and without considering any conservative substitutions as part of sequence identity.

Можно вносить дополнительные модификации в антитела против OX40 или антигенсвязывающие фрагменты. Например, в Fc-область можно вносить остаток(и) цистеина, тем самым позволяя образование межцепочечных дисульфидных связей в этой области. Гомодимерное антитело, полученное таким образом, может иметь увеличенное время полужизни in vitro и/или in vivo. Гомодимерные антитела с увеличенным временем полужизни in vitro и/или in vivo также можно получать с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов, как описано, например, в Wolff et al. (Cancer Res. 53:2560-2565, 1993). Альтернативно можно конструировать антитело, которое имеет двойные Fc-области (см., например, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989).Additional modifications can be made to the anti-OX40 antibodies or antigen-binding fragments. For example, a cysteine residue(s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing the formation of interchain disulfide bonds in the region. A homodimeric antibody thus obtained may have an extended in vitro and/or in vivo half-life. Homodimeric antibodies with extended in vitro and/or in vivo half-life can also be made using heterobifunctional crosslinkers, as described, for example, in Wolff et al. ( Cancer Res. 53:2560-2565, 1993). Alternatively, an antibody can be designed that has dual Fc regions (see, for example, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230, 1989).

В некоторых вариантах осуществления можно вносить ковалентную модификацию в антитело против OX40 или его антигенсвязывающий фрагмент. Эти ковалентные модификации можно вносить посредством химического или ферментативного синтеза, или посредством ферментативного или химического расщепления. Другие типы ковалентных модификаций антитела или фрагмента антитела вносят в молекулу посредством реакции заданных аминокислотных остатков антитела или фрагмента с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с отдельными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.In some embodiments, a covalent modification can be made to an anti-OX40 antibody or antigen-binding fragment thereof. These covalent modifications can be made by chemical or enzymatic synthesis, or by enzymatic or chemical cleavage. Other types of covalent modifications to an antibody or antibody fragment are introduced into the molecule by reacting specified amino acid residues of the antibody or fragment with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with separate side chains or N- or C-terminal residues.

В некоторых вариантах осуществления антитела предусматриваются варианты, имеющие углеводную структуру, которая лишена присоединенной к ее Fc-области фукозы (прямо или непрямо). Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем вычисления среднего количества фукозы в сахарном цепи на Asn297, относительно суммы всех гликоструктур, связанных с Asn 297 (например, комплексные гибридные структуры и структуры с высоким содержанием маннозы) при определении посредством масс-спектрометрии MALDI-TOF, как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному приблизительно в положении 297 Fc-области (нумерация Eu остатков Fc-области; или положение 314 при нумерации согласно Kabat); однако Asn297 также может находиться приблизительно на ±3 аминокислоты выше или ниже положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, вследствие небольшой вариации последовательности в антителах. Такие варианты по фукозилированию могут иметь усиленную функцию ADCC. В некоторых вариантах осуществления для снижения гетерогенности гликанов, Fc-область антитела можно далее модифицировать способами инженерии для замены аспарагина в положении 297 на аланин (N297A).In some embodiments of an antibody, variants are provided that have a carbohydrate structure that lacks fucose attached to its Fc region (either directly or indirectly). For example, the amount of fucose in such an antibody may be 1% to 80%, 1% to 65%, 5% to 65%, or 20% to 40%. The amount of fucose is determined by calculating the average amount of fucose in the sugar chain per Asn297, relative to the sum of all glycostructures associated with Asn 297 (for example, complex hybrid structures and structures with a high mannose content) as determined by MALDI-TOF mass spectrometry, as described, for example , in WO 2008/077546. Asn297 refers to an asparagine residue located approximately at position 297 of the Fc region (Eu numbering of Fc region residues; or position 314 when numbered according to Kabat); however, Asn297 can also be approximately ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, ie. between positions 294 and 300 due to slight sequence variation in antibodies. Such fucosylation variants may have enhanced ADCC function. In some embodiments, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of an antibody can be further engineered to replace the asparagine at position 297 with alanine (N297A).

Рекомбинантные векторыRecombinant vectors

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам (например, экспрессирующие векторы), которые включают выделенный полинуклеотид, описанный в настоящем описании (например, полинуклеотид, который кодирует полипептид, описанный в настоящем описании), клеткам-хозяевам, в которые рекомбинантные векторы введены (т.е., так что клетки-хозяева содержат полинуклеотид и/или вектор, содержащий полинуклеотид), и к продуцированию полипептидов рекомбинантных антител или их фрагментов рекомбинантными способами.The present invention also provides recombinant vectors (e.g., expression vectors) that include an isolated polynucleotide as described herein (e.g., a polynucleotide that encodes for a polypeptide as described herein) to host cells into which the recombinant vectors are introduced (i.e., e., so that the host cells contain the polynucleotide and/or the vector containing the polynucleotide), and to the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof by recombinant methods.

Как используют в рамках изобретения, "вектор" представляет собой любую конструкцию, способную доставлять один или несколько представляющий интерес полинуклеотид(ов) в клетку-хозяина, когда вектор вводят в клетку-хозяина. "Экспрессирующий вектор" способен доставлять и экспрессировать один или несколько представляющий интерес полинуклеотид(ов) в качестве кодируемого полипептида в клетке-хозяине, в которую экспрессирующий вектор введен. Таким образом, в экспрессирующем векторе представляющий интерес полинуклеотид помещают для экспрессии посредством функционального связывания с регуляторными элементами, такими как промотор, энхансер и/или поли-A-хвостовая часть, либо в векторе, либо в геноме клетки-хозяина в, или вблизи, или посредством фланкирования участка встраивания представляющего интерес полинуклеотида, так чтобы представляющий интерес полинуклеотид транслировался в клетке-хозяине, в которую введен экспрессирующий вектор.As used herein, a "vector" is any construct capable of delivering one or more polynucleotide(s) of interest to a host cell when the vector is introduced into the host cell. An "expression vector" is capable of delivering and expressing one or more polynucleotide(s) of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector is introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is placed for expression by operably linking to regulatory elements, such as a promoter, enhancer, and/or poly-A tail, either in the vector or in the host cell genome at, or near, or by flanking the insertion site of the polynucleotide of interest such that the polynucleotide of interest is translated in the host cell into which the expression vector is introduced.

Вектор можно вводить в клетку-хозяина способами, известными в данной области, например, посредством электропорации, химической трансфекции (например, DEAE-декстран), трансформации, трансфекции, и инфицирования и/или трансдукции (например, рекомбинантным вирусом). Таким образом, неограничивающие примеры векторов включают вирусные векторы (которые можно использовать для получения рекомбинантного вируса), голую ДНК или РНК, плазмиды, космиды, фаговые векторы, и векторы, экспрессирующие ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами.The vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, eg, by electroporation, chemical transfection (eg, DEAE-dextran), transformation, transfection, and infection and/or transduction (eg, with a recombinant virus). Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus), naked DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and vectors expressing DNA or RNA associated with cationic condensing agents.

В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, описанный в настоящем описании (например, полинуклеотид, который кодирует полипептид, описанный в настоящем описании), вводят с использованием вирусной экспрессирующей системы (например, вирус коровьей оспы или другой вирус оспы, ретровирус или аденовирус), что может вовлекать использование непатогенного (дефектного) репликационно-компетентного вируса или может вовлекать использование вируса с дефектной репликацией. В последнем случае увеличение вируса в количестве обычно происходит только в комплементирующих упаковывающих вирус клетках. Подходящие системы описаны, например, в Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine, 8:17-21; патентах США № 4603112, 4769330 и 5017487; WO 89/01973; патенте США № 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848; и Guzman et al., 1993, Cir. Res., 73:1202-1207. Способы включения ДНК в такие экспрессирующие системы хорошо известны средним специалистам в данной области. ДНК также может быть "голой", как описано, например, в Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749, и Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692. Захват голой ДНК может быть увеличен посредством нанесения ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки.In some embodiments, a polynucleotide described herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide described herein) is administered using a viral expression system (e.g., vaccinia or other poxvirus, retrovirus, or adenovirus), which may involve the use of a non-pathogenic (defective) replication-competent virus or may involve the use of a replication-defective virus. In the latter case, the increase in virus usually occurs only in complementary virus-packaging cells. Suitable systems are described, for example, in Fisher-Hoch et al., 1989, Proc. Natl. Acad. sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N.Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine 8:17-21; US patents No. 4603112, 4769330 and 5017487; WO 89/01973; US Pat. No. 4,777,127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., 1991, Science, 252:431-434; Kolls et al., 1994, Proc. Natl. Acad. sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler et al., 1993, Proc. Natl. Acad. sci. USA 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88:2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73:1202-1207. Methods for incorporating DNA into such expression systems are well known to those of ordinary skill in the art. DNA can also be "naked", as described, for example, in Ulmer et al., 1993, Science, 259:1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259:1691-1692. Naked DNA uptake can be increased by applying the DNA to biodegradable beads that are efficiently transported into cells.

Для экспрессии ДНК-вставка, содержащая кодирующий антитело или кодирующий полипептид полинуклеотид, описанный в настоящем описании, может быть функционально связана с соответствующим промотором (например, гетерологичный промотор), таким как промотор PL фага лямбда, промоторы lac, trp и tac E. coli, ранние и поздние промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR, чтобы перечислить некоторые из них. Другие подходящие промоторы известны квалифицированному специалисту. Экспрессирующие конструкции, кроме того, могут содержать участки для инициации транскрипции, терминации траскрипции и в транскрибируемой области участок связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых конструкциями, может включать кодон инициации трансляции в начале и кодон терминации (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом находящийся на конце транслируемого полипептида.For expression, a DNA insert containing an antibody-encoding or polypeptide-encoding polynucleotide described herein can be operably linked to an appropriate promoter (e.g., a heterologous promoter), such as the lambda phage PL promoter, E. coli lac, trp, and tac promoters. SV40 early and late promoters and retroviral LTR promoters, to name a few. Other suitable promoters are known to the skilled person. Expression constructs may also contain sites for transcription initiation, transcription termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of the mature transcripts expressed by the constructs may include a translation initiation codon at the beginning and a termination codon (UAA, UGA or UAG) appropriately located at the end of the translated polypeptide.

Как указано, экспрессирующие векторы могут включать по меньшей мере один селективный маркер. Такие маркеры включают гены резистентности к дигидрофолатредуктазе или неомицину для культуры эукариотических клеток и гены резистентности к тетрациклину или ампициллину для культивирования в E. coli и других бактериях. Репрезентативные примеры соответствующих хозяев включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как клетки E. coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; клетки грибов, такие как клетки дрожжей; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; клетки животных, такие как CHO, COS, клетки меланомы Bowes и клетки HK 293; и клетки растений. Подходящие культуральные среды и условия для клеток-хозяев, описанных в настоящем описании, известны в данной области.As indicated, expression vectors may include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance genes for eukaryotic cell culture, and tetracycline or ampicillin resistance genes for culture in E. coli and other bacteria. Representative examples of suitable hosts include, but are not limited to, bacterial cells such as E. coli , Streptomyces , and Salmonella typhimurium cells; fungal cells such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma cells and HK 293 cells; and plant cells. Suitable culture media and conditions for the host cells described herein are known in the art.

Неограничивающие векторы для применения в бактериях включают pQE70, pQE60 и pQE-9, доступные от Qiagen; векторы pBS, векторы Phagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. Неограничивающие эукариотические векторы включают pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы известны специалисту в данной области.Non-limiting vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9 available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors are known to the person skilled in the art.

Неограничивающие бактериальные промоторы, пригодные для применения, включают промоторы lacI и lacZ E. coli, промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы PR и PL лямбда и промотор trp. Подходящие эукариотические промоторы включают предранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранние и поздние промоторы SV40, промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV) и промоторы металлотеонеинов, такие как промотор металлотеонеина-I мыши.Useful non-limiting bacterial promoters include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the lambda PR and PL promoters, and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, SV40 early and late promoters, retroviral LTR promoters such as Rous sarcoma virus (RSV) promoters, and metallotothonein promoters such as the mouse metallotothonein-I promoter.

В дрожжах Saccharomyces cerevisiae можно использовать ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH. Для обзора см. Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, и Grant et al., Methods Enzymol., 153: 516-544 (1997).in yeastSaccharomyces cerevisiae you can use a number of vectors containing constitutive or inducible promoters, such as promoters of alpha factor, alcohol oxidase and PGH. For an overview, see Ausubelet al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, and Grantet al., Methods Enzymol., 153:516-544 (1997).

Введение конструкции в клетку-хозяина может быть осуществлено посредством трансфекции с фосфатом кальция, опосредуемой DEAE-декстраном трансфекции, опосредуемой катионными липидами трансфекции, электропорации, трансдукции, инфицирования или другими способами. Такие способы описаны во многих стандартных лабораторных практикумах, таких как Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).Introduction of the construct into the host cell may be by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection, or other methods. Such methods are described in many standard laboratory practices such as Davis et al ., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Транскрипция ДНК, кодирующей антитела по настоящему изобретению, высшими эукариотами может быть усилена путем встраивания последовательности энхансера в вектор. Энхансеры представляют собой цис-регуляторные элементы ДНК, обычно размером от 10 до 300 п.н., которые действуют, увеличивая транскрипционную активность промотора в данном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают промотор SV40, который расположен на поздней стороне ориджина репликации в положении пар оснований 100-270, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне ориджина репликации, и энхансеры аденовируса.Transcription of the DNA encoding the antibodies of the present invention by higher eukaryotes can be enhanced by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-regulatory DNA elements, typically 10 to 300 bp in size, that act to increase the transcriptional activity of a promoter in a given host cell type. Examples of enhancers include the SV40 promoter, which is located on the late side of the origin of replication at base pair position 100-270, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer on the late side of the origin of replication, and adenovirus enhancers.

Для секреции транслируемого белка в просвет эндоплазматической сети, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду, в экспрессированный полипептид могут быть включены подходящие секреторные сигналы. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут представлять собой гетерологичные сигналы.For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, the periplasmic space, or the extracellular environment, appropriate secretory signals can be included in the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

Полипептид (например, антитело) может экспрессироваться в модифицированной форме, такой как слитый белок (например, слитая конструкция с GST) или с гистидиновой меткой, и может включать не только секреторные сигналы, но также дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, область из дополнительных аминокислот, в частности, заряженных аминокислот, можно присоединять к N-концу полипептида для повышения стабильности и персистенции в клетке-хозяине, в ходе очистки или в ходе последующей обработки и хранения. Также к полипептиду можно присоединять пептидные части для облегчения очистки. Такие области могут быть удалены перед конечным получением полипептида. Добавление пептидных частей к полипептиду для обеспечения секреции или экскреции, для повышения стабильности и для облегчения очистки, среди прочих, является известными и стандартными способами в данной области.The polypeptide (eg, antibody) may be expressed in a modified form, such as a fusion protein (eg, a GST fusion construct) or with a histidine tag, and may include not only secretory signals but also additional heterologous functional regions. For example, a region of additional amino acids, particularly charged amino acids, can be added to the N-terminus of a polypeptide to enhance stability and persistence in the host cell, during purification, or during subsequent processing and storage. Peptide moieties may also be attached to the polypeptide to facilitate purification. Such regions may be removed prior to final production of the polypeptide. The addition of peptide moieties to a polypeptide to promote secretion or excretion, to improve stability, and to facilitate purification, among others, are known and standard methods in the art.

Способы леченияMethods of treatment

Антитела или антитело или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению можно использовать для различных терапевтических целей. В одном аспекте изобретение относится к способам лечения злокачественной опухоли у индивидуума, к способам снижения скорости увеличения объема опухоли у индивидуума с течением времени, к способам снижения риска развития метастазов или к способам снижения риска развития дополнительных метастазов у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления лечение может останавливать, замедлять, отсрочивать или ингибировать прогрессирование злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к снижению количества, тяжести и/или длительности одного или нескольких симптомов злокачественной опухоли у индивидуума.Antibodies or antibody or antigennegative fragments of the present invention can be used for various therapeutic purposes. In one aspect, the invention relates to methods for treating cancer in an individual, to methods for reducing the rate of tumor expansion in an individual over time, to methods for reducing the risk of developing metastases, or to methods for reducing the risk of developing additional metastases in an individual. In some embodiments, the implementation of the treatment can stop, slow down, delay or inhibit the progression of a malignant tumor. In some embodiments, the implementation of the treatment can lead to a decrease in the number, severity and/or duration of one or more symptoms of a malignant tumor in an individual.

В одном аспекте изобретение относится к способам, которые включают введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем описании, индивидууму, нуждающемуся в этом (например, индивидууму, который имеет, или который идентифицирован или диагностирован как имеющий, злокачественную опухоль, например, рак молочной железы (например, тройной отрицательный рак молочной железы), карциноидную опухоль, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, лимфому, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак уретры или гематологическую злокачественную опухоль). В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой нерезектабельную меланому или метастазирующую меланому, немелкоклеточную карциному легких (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастазирующий рефрактерный к гормонам рак предстательной железы). В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет солидную опухоль. В некоторых вариантах осуществления злокачественная опухоль представляет собой плоскоклеточную карциному головы и шеи (SCCHN), почечноклеточный рак (RCC), тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) или карциному ободочной и прямой кишки.In one aspect, the invention relates to methods that include administering a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment described herein to an individual in need thereof (e.g., an individual who has, or who is identified or diagnosed as having, a cancer, e.g. , breast cancer (eg, triple negative breast cancer), carcinoid tumor, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer cancer, prostate cancer, kidney cancer, colon cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hematologic malignancy). In some embodiments, the cancer is unresectable or metastatic melanoma, non-small cell lung carcinoma (NSCLC), small cell lung cancer (SCLC), bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer). In some embodiments, the individual has a solid tumor. In some embodiments, the cancer is head and neck squamous cell carcinoma (SCCHN), renal cell carcinoma (RCC), triple negative breast cancer (TNBC), or colorectal carcinoma.

В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, описанные в настоящем описании, можно использовать для лечения пациентов, имеющих риск злокачественной опухоли. Пациентов со злокачественной опухолью можно идентифицировать различными способами, известными в данной области.In some embodiments, the compositions and methods described herein can be used to treat patients at risk for cancer. Cancer patients can be identified by various methods known in the art.

Как используют в рамках изобретения, под "эффективным количеством" подразумевают количество или дозировку, эффективные для достижения благоприятных или желательных результатов, включая остановку, замедление, отсрочивание или ингибирование заболевания, например, злокачественной опухоли. Эффективное количество может варьироваться в зависимости, например, от возраста и массы тела индивидуума, которому вводят антитело, антигенсвязывающий фрагмент, кодирующий антитело полинуклеотид, вектор, содержащий полинуклеотид, и/или их композиции, подлежащей введению, тяжести симптомов и пути введения и, таким образом, введение может определяться на индивидуальной основе.As used herein, by "effective amount" is meant an amount or dosage effective to achieve beneficial or desirable results, including halting, slowing, delaying, or inhibiting a disease, such as cancer. The effective amount may vary depending on, for example, the age and body weight of the individual to whom the antibody is administered, the antigen-binding fragment encoding the antibody polynucleotide, the vector containing the polynucleotide, and/or their composition to be administered, the severity of the symptoms, and the route of administration, and thus , administration may be determined on an individual basis.

Эффективное количество можно вводить посредством одного или нескольких введений. В качестве примера, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента представляет собой количество, достаточное для смягчения, остановки, стабилизации, обращения вспять, ингибирования, замедления и/или отсрочивания прогрессирования злокачественной опухоли у пациента, или представляет собой количество, достаточное для смягчения, остановки, стабилизации, обращения вспять, замедления и/или отсрочивания пролиферации клетки (например, полученной посредством биопсии клетки, любой из злокачественных клеток, описанных в настоящем описании, или клеточной линии (например, злокачественной клеточной линии)) in vitro. Как понятно в данной области, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента может варьироваться, в зависимости, среди прочих, от анамнеза пациента, а также от других факторов, таких как тип (и/или дозировка) используемого антитела.An effective amount can be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody or antigen binding fragment is an amount sufficient to mitigate, halt, stabilize, reverse, inhibit, slow and/or delay the progression of cancer in a patient, or is an amount sufficient to mitigate, halt, stabilize , reversing, slowing down and/or delaying the proliferation of a cell (eg, a biopsy-derived cell, any of the cancer cells described herein, or a cell line (eg, a cancer cell line)) in vitro . As is understood in the art, the effective amount of an antibody or antigen-binding fragment may vary, depending on, among other things, the patient's history, as well as other factors such as the type (and/or dosage) of the antibody used.

Эффективные количества и схемы введения антител, кодирующих антитела полинуклеотидов и/или композиций, описанных в настоящем описании, можно определять эмпирически, и проведение таких определений входит в пределы способностей специалистов в данной области. Специалистам в данной области будет понятно, что дозировка, которую необходимо вводить, может варьироваться, в зависимости, например, от млекопитающего, которому вводят антитела, кодирующих антитела полинуклеотидов, и/или композиций, описанных в настоящем описании, пути введения, конкретного типа антител, кодирующих антитела полинуклеотидов, антигенсвязывающих фрагментов и/или используемых композиций, описанных в настоящем описании, и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору надлежащих доз антитела или антигенсвязывающего фрагмента может быть найдено в литературе по терапевтическим применениям антител и антигенсвязывающих фрагментов, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.Effective amounts and administration schedules for the antibodies, antibody-encoding polynucleotides and/or compositions described herein can be empirically determined and such determinations are within the ability of those skilled in the art to make. Those skilled in the art will appreciate that the dosage to be administered may vary, depending on, for example, the mammal being administered the antibodies, antibody-encoding polynucleotides and/or compositions described herein, the route of administration, the particular type of antibody, antibody-encoding polynucleotides, antigen-binding fragments and/or compositions used herein, and other drugs administered to a mammal. Guidance on the selection of appropriate doses of antibody or antigen binding fragment can be found in the literature on therapeutic applications of antibodies and antigen binding fragments, for example, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.

Типичная суточная дозировка эффективного количества антитела составляет от 0,01 мг/кг до 100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять менее 100 мг/кг, 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять более 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,05 мг/кг или 0,01 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет приблизительно 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,2 мг/кг или 0,1 мг/кг.A typical daily dosage of an effective amount of antibody is from 0.01 mg/kg to 100 mg/kg. In some embodiments, the dosage may be less than 100 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg /kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg or 0.1 mg/kg. In some embodiments, the dosage may be greater than 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg /kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.05 mg/kg or 0.01 mg/kg. In some embodiments, the dosage is approximately 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg. kg, 1 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0 .3 mg/kg, 0.2 mg/kg or 0.1 mg/kg.

В любом из способов, описанных в настоящем описании, по меньшей мере одно антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов или фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании) и необязательно по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство можно вводить индивидууму по меньшей мере один раз в неделю (например, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, один раз в сутки, два раза в сутки или три раза в сутки). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два различных антитела и/или антигенсвязывающих фрагмента вводят в одной композиции (например, жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в одной композиции (например, в жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в двух различных композициях (например, жидкая композиция, содержащая по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и твердая пероральная композиция, содержащая по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в качестве пилюли, таблетки или капсулы. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство вводят в пероральном составе с замедленным высвобождением.In any of the methods described herein, at least one antibody, an antigen-binding fragment thereof, or a pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) and optionally at least one additional therapeutic agent can be administered to an individual at least once a week (eg, once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day, or three times a day). In some embodiments, at least two different antibodies and/or antigen-binding fragments are administered in a single composition (eg, liquid composition). In some embodiments, at least one antibody or antigen-binding fragment and at least one additional therapeutic agent are administered in a single composition (eg, in a liquid composition). In some embodiments, at least one antibody or antigen binding fragment and at least one additional therapeutic agent are administered in two different compositions (e.g., a liquid composition containing at least one antibody or antigen binding fragment and a solid oral composition containing at least one additional therapeutic agent). In some embodiments, at least one additional therapeutic agent is administered as a pill, tablet, or capsule. In some embodiments, at least one additional therapeutic agent is administered in a sustained release oral formulation.

В некоторых вариантах осуществления одно или несколько дополнительных терапевтических средств можно вводить индивидууму до или после введения по меньшей мере одного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела или фармацевтической композиции (например, любого из антител, антигенсвязывающих фрагментов или фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления одно или несколько дополнительных терапевтических средств и по меньшей мере одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании) вводят индивидууму так, чтобы существовало перекрывание в биологически активном периоде одного или нескольких дополнительных терапевтических средств и по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании) у индивидуума.In some embodiments, one or more additional therapeutic agents can be administered to the individual before or after administration of at least one antibody, antibody antigen-binding fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein). In some embodiments, one or more additional therapeutic agents and at least one antibody, antibody antigen-binding fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antibody antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) is administered to an individual such that there is an overlap in the biologically active period of one or more additional therapeutic agents and at least one antibody or antigennegative fragment (eg, any of the antibodies or antigennegative fragments described herein) in an individual.

В некоторых вариантах осуществления индивидууму можно вводить по меньшей мере одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании) на протяжении длительного периода времени (например, на протяжении периода, составляющего по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет). Квалифицированный медицинский специалист может определить длительность периода лечения с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании, для диагностики или наблюдения за эффективностью лечения (например, наблюдение по меньшей мере одного симптома злокачественной опухоли). Как описано в настоящем описании, квалифицированный медицинский специалист также может изменить тип и количество (например, увеличить или снизить) антител или антигенсвязывающих фрагментов антител (и/или одного или нескольких дополнительных терапевтических средств), вводимых индивидууму, и также может скорректировать (например, увеличить или снизить) дозировку или частоту введения по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела (и/или одного или нескольких дополнительных терапевтических средств) индивидууму на основе оценки эффективности лечения (например, с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании и известных).In some embodiments, an individual may be administered at least one antibody, antibody antigen-binding fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antibody antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) over an extended period of time (e.g., over a period at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years or 5 years). A qualified medical specialist can determine the duration of the treatment period using any of the methods described in the present description, to diagnose or monitor the effectiveness of treatment (for example, the observation of at least one symptom of a malignant tumor). As described herein, a skilled medical professional can also change the type and amount (e.g., increase or decrease) of antibodies or antigen-binding fragments of antibodies (and/or one or more additional therapeutic agents) administered to an individual, and can also adjust (e.g., increase or reduce) the dosage or frequency of administration of at least one antibody or antigen-binding antibody fragment (and/or one or more additional therapeutic agents) to an individual based on an assessment of the effectiveness of treatment (for example, using any of the methods described herein and known).

В некоторых вариантах осуществления индивидууму можно вводить одно или несколько дополнительных терапевтических средств. Дополнительное терапевтическое средство может включать один или несколько ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из ингибитора B-Raf, ингибитора EGFR, ингибитора MEK, ингибитора ERK, ингибитора K-Ras, ингибитора c-Met, ингибитора киназы анапластической лимфомы (ALK), ингибитора фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K), ингибитора Akt, ингибитора mTOR, двойного ингибитора PI3K/mTOR, ингибитора тирозинкиназы Брутона (BTK) и ингибитора изоцитратдегидрогеназы 1 (IDH1) и/или изоцитратдегидрогеназы 2 (IDH2).In some embodiments, one or more additional therapeutic agents may be administered to the individual. The additional therapeutic agent may include one or more inhibitors selected from the group consisting of B-Raf inhibitor, EGFR inhibitor, MEK inhibitor, ERK inhibitor, K-Ras inhibitor, c-Met inhibitor, anaplastic lymphoma kinase (ALK) inhibitor, phosphatidylinositol inhibitor 3-kinase (PI3K), an Akt inhibitor, an mTOR inhibitor, a dual PI3K/mTOR inhibitor, a Bruton's tyrosine kinase (BTK) inhibitor, and an inhibitor of isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) and/or isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2).

В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может включать один или несколько ингибиторов, выбранных из группы, состоящей из ингибитора HER3, ингибитора LSD1, ингибитора MDM2, ингибитора BCL2, ингибитора CHK1, ингибитора активированного каскада передачи сигнала hedgehog и средства, которое вызывает селективную деградацию рецепторов эстрогена.In some embodiments, the additional therapeutic agent may include one or more inhibitors selected from the group consisting of a HER3 inhibitor, an LSD1 inhibitor, an MDM2 inhibitor, a BCL2 inhibitor, a CHK1 inhibitor, an inhibitor of the activated hedgehog signaling cascade, and an agent that causes selective degradation of estrogen receptors. .

В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может включать одно или несколько терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из Трабектедина, наб-паклитаксела, Требананиба, Пазопаниба, Цедираниба, Пальбоциклиба, эверолимуса, фторпиримидина, IFL, регорафениба, Реолизина, Алимты, Зикадии, Сутента, темсиролимуса, акситиниба, эверолимуса, сорафениба, Вотриента, Пазопаниба, IMA-901, AGS-003, кабозантиниба, Винфлунина, ингибитора Hsp90, Ad-GM-CSF, Темазоломида, IL-2, IFNa, винбластина, Таломида, дакарбазина, циклофосфамида, леналидомида, азацитидина, леналидомида, бортезомида, амрубицина, карфилзомиба, пралатрексата и энзастаурина.In some embodiments, the additional therapeutic agent may include one or more therapeutic agents selected from the group consisting of Trabectedin, Nab-Paclitaxel, Trebananib, Pazopanib, Cediranib, Palbociclib, Everolimus, Fluoropyrimidine, IFL, Regorafenib, Reolizin, Alimta, Zykadia, Sutenta , temsirolimus, axitinib, everolimus, sorafenib, Votrient, Pazopanib, IMA-901, AGS-003, cabozantinib, Vinflunine, Hsp90 inhibitor, Ad-GM-CSF, Temazolomide, IL-2, IFNa, vinblastine, Talomid, dacarbazine, cyclophosphamide, lenalidomide, azacitidine, lenalidomide, bortezomide, amrubicin, carfilzomib, pralatrexate, and enzastaurine.

В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство может включать одно или несколько терапевтических средств, выбранных из группы, состоящей из адъюванта, агониста TLR, фактора некроза опухоли (TNF) альфа, IL-1, HMGB1, антагониста IL-10, антагониста IL-4, антагониста IL-13, антагониста IL-17, антагониста HVEM, агониста ICOS, терапевтического средства, нацеленного на CX3CL1, терапевтического средства, нацеленного на CXCL9, терапевтического средства, нацеленного на CXCL10, терапевтического средства, нацеленного на CCL5, агониста LFA-1, агониста ICAM1 и агониста селектина.In some embodiments, the additional therapeutic agent may include one or more therapeutic agents selected from the group consisting of adjuvant, TLR agonist, tumor necrosis factor (TNF) alpha, IL-1, HMGB1, IL-10 antagonist, IL-4 antagonist, IL-13 antagonist, IL-17 antagonist, HVEM antagonist, ICOS agonist, CX3CL1-targeting therapeutic, CXCL9-targeting therapeutic, CXCL10-targeting therapeutic, CCL5-targeting therapeutic, LFA-1 agonist, agonist ICAM1 and selectin agonist.

В некоторых вариантах осуществления индивидууму вводят карбоплатин, наб-паклитаксел, паклитаксел, цисплатин, пеметрексед, гемцитабин, FOLFOX или FOLFIRI.In some embodiments, the individual is administered carboplatin, nab-paclitaxel, paclitaxel, cisplatin, pemetrexed, gemcitabine, FOLFOX, or FOLFIRI.

В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой антитело против PD1, антитело против PD-L1, антитело против LAG-3, антитело против TIGIT, антитело против BTLA, антитело против CTLA-4 или антитело против GITR.In some embodiments, the additional therapeutic agent is an anti-PD1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-LAG-3 antibody, an anti-TIGIT antibody, an anti-BTLA antibody, an anti-CTLA-4 antibody, or an anti-GITR antibody.

Способы модификации и применения антител против OX40 описаны, например, в US 20150307617, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.Methods for modifying and using antibodies against OX40 are described, for example, in US 20150307617, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Фармацевтические композиции и пути введенияPharmaceutical compositions and routes of administration

Также в рамках настоящего изобретения предусматриваются фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере одно (например, одно, два, три или четыре) из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании. Два или более (например, два, три или четыре) из любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, могут присутствовать в фармацевтической композиции в любой комбинации. Фармацевтические композиции можно составлять любым способом, известным в данной области.Also provided within the scope of the present invention are pharmaceutical compositions that contain at least one (eg, one, two, three, or four) of the antibodies or antigen-binding fragments described herein. Two or more (eg, two, three or four) of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may be present in a pharmaceutical composition in any combination. Pharmaceutical compositions can be formulated by any method known in the art.

Фармацевтические композиции составляют так, чтобы они были совместимыми с их предполагаемым путем введения (например, внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, внутрикожный, подкожный или внутрибрюшинный). Композиции могут включать стерильный разбавитель (например, стерильную воду или солевой раствор), жирное масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные или противогрибковые средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал и т.п., антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для обеспечения изотоничности, такие как сахара (например, декстроза), полиспирты (например, маннит или сорбит) или соли (например, хлорид натрия), или любую их комбинацию. Также в качестве фармацевтически приемлемых носителей можно использовать липосомальные суспензии (см., например, патент США № 4522811). Препараты композиций можно составлять и заключать в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы. Когда это необходимо (например, в инъекционных составах), надлежащую текучесть можно поддерживать, например, с использованием покрытия, такого как лецитин или поверхностно-активное вещество. Всасывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно продлевать путем включения средства, которое замедляет всасывание (например, моностеарат алюминия и желатин). Альтернативно, контролируемого высвобождения можно достигать посредством имплантатов и микроинкапсулированных систем доставки, которые могут включать биодеградируемые, биосовместимые полимеры (например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc.).Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (eg intravenous, intra-arterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous or intraperitoneal). Compositions may include a sterile diluent (eg, sterile water or saline), fatty oil, polyethylene glycol, glycerin, propylene glycol or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, etc. .p., antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers such as acetates, citrates or phosphates and isotonicity agents such as sugars (e.g. dextrose), polyalcohols (e.g. , mannitol or sorbitol) or salts (eg sodium chloride), or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, for example, US Pat. No. 4,522,811). The formulations of the compositions can be formulated and enclosed in ampoules, disposable syringes or multi-dose vials. When necessary (eg, in injectable formulations), proper fluidity can be maintained, for example, using a coating such as lecithin or a surfactant. Absorption of an antibody or antigen-binding fragment thereof can be prolonged by the inclusion of an agent that delays absorption (eg, aluminum monostearate and gelatin). Alternatively, controlled release can be achieved through implants and microencapsulated delivery systems, which may include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc.).

Композиции, содержащие одно или несколько из любых из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, можно составлять для парентерального (например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, подкожного или внутрибрюшинного) введения в единичной дозированной форме (т.е. физически дискретных единицах, содержащих заданное количество активного соединения для простоты введения и единообразия дозировок).Compositions containing one or more of any of the antibodies or antigen-binding moieties described herein can be formulated for parenteral (e.g., intravenous, intra-arterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) administration in unit dosage form (i.e., physically discrete units containing a predetermined amount of active compound for ease of administration and dosage uniformity).

Токсичность и терапевтическую эффективность композиций можно определять с использованием стандартных фармацевтических методик в клеточных культурах или у экспериментальных животных (например, обезьян). Например, можно определять LD50 (доза, летальная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции): где терапевтический индекс представляет собой соотношение LD50:ED50. Предпочтительными являются средства, демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Когда средство демонстрирует нежелательный побочный эффект, следует позаботиться о минимизации потенциального повреждения (т.е. уменьшения нежелательных побочных эффектов). Токсичность и терапевтическую эффективность можно определять с использованием других стандартных фармацевтических методик.The toxicity and therapeutic efficacy of the compositions can be determined using standard pharmaceutical techniques in cell cultures or in experimental animals (eg, monkeys). For example, LD50 (dose lethal in 50% of the population) and ED50 (dose therapeutically effective in 50% of the population) can be determined: where the therapeutic index is the ratio of LD50:ED50. Agents showing high therapeutic indexes are preferred. When an agent exhibits an unwanted side effect, care should be taken to minimize the potential damage (i.e., reduce unwanted side effects). Toxicity and therapeutic efficacy can be determined using other standard pharmaceutical techniques.

При составлении дозировок любого данного средства, подходящих для применения у индивидуума (например, у человека) можно использовать данные, полученные для анализов клеточных культур и исследований на животных. Терапевтически эффективное количество одного или нескольких (например, одного, двух, трех или четырех) антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, любого из антител или фрагментов антител, описанных в настоящем описании) представляет собой количество, которое лечит заболевание (например, уничтожает злокачественные клетки) у индивидуума (например, у человека, идентифицированного как имеющего злокачественную опухоль), или у индивидуума, идентифицированного как имеющего риск развития заболевания (например, индивидуума, у которого ранее развилась злокачественная опухоль, но который был вылечен), снижает тяжесть, частоту и/или длительность одного или нескольких симптомов заболевания у индивидуума (например, человека). Эффективность и дозировку любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, может определять работник здравоохранения или ветеринарный специалист с использованием способов, известных в данной области, а также посредством наблюдения одного или нескольких симптомов заболевания у индивидуума (например, человека). Определенные факторы могут влиять на дозировку или время, требуемого для эффективного лечения индивидуума (например, тяжесть заболевания или нарушения, предшествующие способы лечения, общее состояние здоровья и/или возраст индивидуума, и наличие других заболеваний).In formulating dosages of any given agent suitable for use in an individual (eg, a human), data obtained from cell culture assays and animal studies can be used. A therapeutically effective amount of one or more (e.g., one, two, three, or four) antibodies or antigen-binding fragments thereof (e.g., any of the antibodies or antibody fragments described herein) is an amount that treats a disease (e.g., kills malignant cells ) in an individual (e.g., a person identified as having cancer) or an individual identified as being at risk of developing a disease (e.g., an individual who has previously developed cancer but has been treated) reduces the severity, frequency, and/ or the duration of one or more symptoms of a disease in an individual (eg, human). The efficacy and dosage of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be determined by a healthcare professional or veterinarian using methods known in the art, as well as by observing one or more symptoms of a disease in an individual (e.g., human). Certain factors may influence the dosage or time required to effectively treat an individual (eg, the severity of the disease or disorder, prior treatments, the general health and/or age of the individual, and the presence of other diseases).

Иллюстративные дозы включают количества в миллиграммах или микрограммах любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем описании, на килограмм массы тела индивидуума (например, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 500 мг/кг; от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 500 мг/кг; от приблизительно 100 мкг/кг до приблизительно 50 мг/кг; от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 5 мг/кг; от приблизительно 10 мкг/кг до приблизительно 0,5 мг/кг; или от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 50 мкг/кг). В то время как эти дозы охватывают широкий диапазон, специалисту в данной области будет понятно, что терапевтические средства, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, варьируют в отношении их эффективности, и эффективные количества можно определять способами, известными в данной области. Как правило, сначала вводят относительно низкие дозы, а затем лечащий работник здравоохранения или ветеринарный специалист (в случае терапевтического применения) или исследователь (когда он все еще работает на стадии разработки) может последовательно и постепенно увеличивать дозу до тех пор, пока не будет достигнут надлежащий ответ. Кроме того, понятно, что конкретный уровень дозы для любого конкретного индивидуума может зависеть от ряда факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания индивидуума, время введения, путь введения, скорость экскреции и время полужизни антитела или фрагмента антитела in vivo.Exemplary dosages include milligram or microgram amounts of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein per kilogram of body weight of an individual (e.g., from about 1 µg/kg to about 500 mg/kg; from about 100 µg/kg to about 500 mg/kg, about 100 µg/kg to about 50 mg/kg, about 10 µg/kg to about 5 mg/kg, about 10 µg/kg to about 0.5 mg/kg, or about 1 µg /kg to about 50 µg/kg). While these doses cover a wide range, one of skill in the art will appreciate that therapeutic agents, including antibodies and antigen-binding fragments thereof, vary in their potency, and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered first, and then the healthcare professional or veterinarian (in the case of therapeutic use) or the researcher (when still in development) can then increase the dose sequentially and gradually until the appropriate dose is reached. answer. In addition, it is understood that the specific dosage level for any particular individual may depend on a number of factors, including the activity of the particular compound used, age, body weight, general health, sex and diet of the individual, time of administration, route of administration, rate of excretion, and time half-life of an antibody or antibody fragment in vivo .

Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями по введению. Также изобретение относится к способам производства антител или их антигенсвязывающих фрагментов для различных применений, как описано в настоящем описании.Pharmaceutical compositions may be included in a container, pack or dispenser along with instructions for administration. The invention also relates to methods for the production of antibodies or antigen-binding fragments for various applications, as described in the present description.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Кроме того, изобретение описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.In addition, the invention is described in the following examples, which do not limit the scope of the invention described in the claims.

Пример 1. Получение антител мыши против hOX40Example 1 Obtaining Mouse Anti-hOX40 Antibodies

Для получения антител мыши против OX40 человека (hOX40; SEQ ID NO: 49), самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали OX40 человека. Антитела против hOX40 собирали способами, описанными в настоящем описании (фиг. 1 и фиг. 2).To generate mouse antibodies against human OX40 (hOX40; SEQ ID NO: 49), 6-8 week old female BALB/c mice were immunized with human OX40. Anti-hOX40 antibodies were collected by the methods described in the present description ( Fig. 1 and Fig. 2 ).

Иммунизация мышейImmunization of mice

Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали His-меченными белками OX40 в количестве 20 мкг/мышь в концентрации 100 мкг/мл. His-меченные белки OX40 человека эмульгировали адъювантом и инъецировали в четыре положения на спине мышей. Для первой подкожной (п/к) инъекции разбавленный антиген эмульгировали в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в равном объеме. При следующих подкожных инъекциях белок эмульгировали в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) в равном объеме. Через трое суток после третьей инъекции или вспомогательной иммунизации, проводили взятие крови (сыворотки) и анализировали титр антител с использованием ELISA.Female BALB/c mice aged 6-8 weeks were immunized with His-tagged OX40 proteins at 20 μg/mouse at a concentration of 100 μg/ml. His-tagged human OX40 proteins were emulsified with adjuvant and injected at four positions on the back of mice. For the first subcutaneous (SC) injection, the diluted antigen was emulsified in equal volumes of Freund's Complete Adjuvant (CFA). In subsequent subcutaneous injections, the protein was emulsified in equal volumes of Incomplete Freund's Adjuvant (IFA). Three days after the third injection or booster immunization, blood (serum) was taken and the antibody titer was analyzed using ELISA.

В другом эксперименте самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали посредством инъекции мышам экспрессирующей плазмиды, кодирующей OX40 человека. Плазмиды, кодирующие антиген, инъецировали в переднюю большеберцовую мышцу (внутримышечная инъекция; в/м инъекция) мышей с использованием генных пушек в концентрации 1000 мкг/мкл в дозе 60 мкг на мышь. Проводили по меньшей мере четыре инъекции с интервалом по меньшей мере 14 суток между инъекциями. Взятие крови (сыворотки) проводили через семь суток после последней иммунизации и сыворотку тестировали в отношении титра антител посредством ELISA.In another experiment, 6-8 week old female BALB/c mice were immunized by injection into mice of an expression plasmid encoding human OX40. Plasmids encoding the antigen were injected into the tibialis anterior muscle (IM injection; IM injection) of mice using gene guns at a concentration of 1000 μg/μl at a dose of 60 μg per mouse. Spent at least four injections with an interval of at least 14 days between injections. Blood (serum) was taken seven days after the last immunization and the serum was tested for antibody titer by ELISA.

Методики усиления иммунизации также проводили по меньшей мере через четырнадцать суток после предшествующей иммунизации (посредством инъекции либо плазмиды, либо белков). Клетки CHO, которые экспрессируют антиген OX40 на поверхности, внутривенно инъецировали мышам через хвостовые вены. Селезенки извлекали через четырнадцать суток после инъекции.Boosted immunization techniques were also performed at least fourteen days after prior immunization (via either plasmid or protein injection). CHO cells that express the OX40 antigen on the surface were intravenously injected into mice via the tail veins. The spleens were removed fourteen days after injection.

Слияние клеток SP2/0 и клеток селезенкиFusion of SP2/0 cells and spleen cells

Клетки селезенки растирали. Сначала проводили селекцию клеток селезенки с использованием микрогранул с CD3ε и микрогранул с антителом против IgM мыши, а затем подвергали слиянию с клетками SP2/0. Затем клетки высевали в 96-луночные планшеты со средой с гипоксантином-аминоптерином-тимидином (HAT).The spleen cells were triturated. First, spleen cells were selected using CD3ε microbeads and anti-mouse IgM microbeads, and then fused with SP2/0 cells. The cells were then seeded in 96-well plates with hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium.

Первичный скрининг гибридомPrimary screening for hybridomas

Первичный скрининг супернатантов гибридом в 96-луночных планшетах проводили с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) в соответствии со стандартными методиками. Перед скринингом в 96-луночные планшеты добавляли клетки яичника китайского хомячка (CHO) (2×10⁴ клеток на лунку). Использовали 50 мкл супернатанта. Антитела, которые использовали в экспериментах, представляли собойPrimary screening of hybridoma supernatants in 96-well plates was performed using fluorescence-activated cell sorting (FACS) according to standard procedures. Before screening, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells were added to 96-well plates (2×10 ⁴ cells per well). 50 μl of supernatant was used. The antibodies used in the experiments were

(1) Конъюгированный с флуоресцеином (FITC) F(ab)₂-фрагмент козы против IgG мыши, специфичный к Fcγ-фрагменту, и(1) Fluorescein-conjugated (FITC) F(ab) ₂ fragment of goat anti-mouse IgG specific for Fcγ fragment, and

(2) Конъюгированный с Alexa Fluor® 647 F(ab)₂-фрагмент козы против IgG человека, специфичный к Fcγ-фрагменту.(2) Alexa Fluor® 647 F(ab) ₂ -fragment goat anti-human IgG specific for Fcγ fragment.

Субклонированиеsubcloning

Субклонирование проводили с использованием ClonePix2. В кратком изложении, содержимое положительных лунок, идентифицированных в ходе первичного скрининга, переносили в полутвердую среду и IgG-положительные клоны идентифицировали и тестировали. Использовали антитело Fc IgG мыши с FITC.Subcloning was performed using ClonePix2. Briefly, the contents of the positive wells identified during the primary screen were transferred to semi-solid medium and IgG-positive clones were identified and tested. A mouse IgG Fc antibody with FITC was used.

Антитела асцитной жидкостиAscitic fluid antibodies

1×10⁶ положительных гибридомных клеток инъецировали внутрибрюшинно мышам B-NDG^® (Beijing Biocytogen, Пекин, Китай). Моноклональные антитела продуцировали путем выращивания гибридомных клеток в брюшной полости мыши. Гибридомные клетки увеличивались в количестве и продуцировали асцитную жидкость в брюшной полости мышей. Жидкость содержала высокую концентрацию антител, которые можно было собирать для последующего применения.1x10 ⁶ positive hybridoma cells were injected intraperitoneally into B- ^NDG® mice (Beijing Biocytogen, Beijing, China). Monoclonal antibodies were produced by growing hybridoma cells in the abdominal cavity of a mouse. Hybridoma cells increased in number and produced ascitic fluid in the abdominal cavity of mice. The fluid contained a high concentration of antibodies that could be collected for later use.

Очистка антителPurification of antibodies

Антитела в асцитной жидкости очищали с использованием хроматографии AKTA GE с белком (GE Healthcare, Chicago, Illinois, США). Антитела, продуцированные способами, описанными выше, включали 07-9H3 ("9H3"), 07-9A4 ("9A4"), 11-5C1 ("5C1"), 17-5D10 ("5D10"), 08-6A11 ("6A11") и 14-7F11 ("7F11").Antibodies in ascitic fluid were purified using AKTA GE protein chromatography (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA). Antibodies produced by the methods described above included 07-9H3 ("9H3"), 07-9A4 ("9A4"), 11-5C1 ("5C1"), 17-5D10 ("5D10"), 08-6A11 (" 6A11") and 14-7F11 ("7F11").

Определяли области VH, VL и CDR для некоторых из антител. Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи для 9H3 представлены в SEQ ID NO: 1-6 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 25-30 (нумерация Chothia).The VH, VL and CDR regions were determined for some of the antibodies. The amino acid sequences of the heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 for 9H3 are shown in SEQ ID NOs: 1-6 (Kabat numbering) or SEQ ID NOs: 25-30 (Chothia numbering).

Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи для 9A4 представлены в SEQ ID NO: 7-12 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 31-36 (нумерация Chothia).The amino acid sequences of the heavy chain and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 for 9A4 are shown in SEQ ID NOs: 7-12 (Kabat numbering) or SEQ ID NOs: 31-36 (Chothia numbering).

Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи для 5C1 представлены в SEQ ID NO: 13-18 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 37-42 (нумерация Chothia).The amino acid sequences of the heavy chain and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 for 5C1 are shown in SEQ ID NOs: 13-18 (Kabat numbering) or SEQ ID NOs: 37-42 (Chothia numbering).

Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и легкой цепи для 5D10 представлены в SEQ ID NO: 19-24 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 43-48 (нумерация Chothia).The amino acid sequences of the heavy chain and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 for 5D10 are shown in SEQ ID NOs: 19-24 (Kabat numbering) or SEQ ID NOs: 43-48 (Chothia numbering).

Пример 2. Гуманизация антител мышиExample 2 Humanization of Mouse Antibodies

Исходной точкой для гуманизации были антитела мыши (например, 9H3, 9A4, 5C1 и 5D10). Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этих антител мыши определяли.The starting point for humanization was mouse antibodies (eg 9H3, 9A4, 5C1 and 5D10). The amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of these mouse antibodies were determined.

Конструировали три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 53-55) и три гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 56-58) для 9H3, содержавших различные перестановки замен.Three humanized heavy chain variable regions (SEQ ID NOs: 53-55) and three humanized light chain variable regions (SEQ ID NOs: 56-58) for 9H3 were constructed containing various permutations of the substitutions.

Конструировали три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 59-61) и четыре гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 62-65) для 9A4, содержавших различные перестановки замен.Three humanized heavy chain variable regions (SEQ ID NOs: 59-61) and four humanized light chain variable regions (SEQ ID NOs: 62-65) were constructed for 9A4 containing various permutations of substitutions.

Конструировали три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 66-68) и четыре гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 69-72) для 5C1, содержавших различные перестановки замен.Three humanized heavy chain variable regions (SEQ ID NOs: 66-68) and four humanized light chain variable regions (SEQ ID NOs: 69-72) were constructed for 5C1 containing various permutations of substitutions.

Конструировали три гуманизированных варианта вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 73-75) и три гуманизированных варианта вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 76-78) для 5D10, содержащие различные перестановки замен.Three humanized variants of the heavy chain variable region (SEQ ID NO: 73-75) and three humanized variants of the light chain variable region (SEQ ID NO: 76-78) for 5D10 were constructed, containing various permutations of the substitutions.

Эти гуманизированные варианты вариабельной области тяжелой цепи комбинировали с любыми из соответствующих гуманизированных вариантов вариабельной области легкой цепи. Например, 9H3-H1 (SEQ ID NO: 53) можно комбинировать с любым гуманизированным вариантом вариабельной области легкой цепи 9H3 (например, 9H3-K2 (SEQ ID NO: 57)), и антитело можно метить соответствующим образом (например, 9H3-H1K2).These humanized heavy chain variable region variants were combined with any of the corresponding humanized light chain variable region variants. For example, 9H3-H1 (SEQ ID NO: 53) can be combined with any humanized 9H3 light chain variable region variant (e.g., 9H3-K2 (SEQ ID NO: 57)), and the antibody can be labeled appropriately (e.g., 9H3-H1K2 ).

Затем эти гуманизированные антитела получали с использованием BioLuminate 1.0 (Schrodinger, Шанхай, Китай).These humanized antibodies were then generated using BioLuminate 1.0 (Schrodinger, Shanghai, China).

Пример 3. Тестирование Example 3: Testing in vitro in vitro антител мыши против hOX40: блокирование связывания OX40 человека (hOX40) и OX40L человека (hOX40L)mouse antibodies against hOX40: blocking the binding of human OX40 (hOX40) and human OX40L (hOX40L)

Проводили анализы блокирования для определения того, могут ли антитела против hOX40 блокировать связывание между hOX40 и hOX40L.Blocking assays were performed to determine if anti-hOX40 antibodies could block binding between hOX40 and hOX40L.

Антитела против hOX40 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали хроматографией. В каждую лунку планшета добавляли 25 мкл клеток CHO, временно трансфицированных OX40 человека. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титрованные антитела добавляли в каждую лукну в количестве 25 мкл на лунку при 4°C и инкубировали в течение 30 минут.Anti-hOX40 antibodies were collected from mouse ascitic fluid and purified by chromatography. 25 μl of CHO cells transiently transfected with human OX40 were added to each well of the plate. Purified antibodies were titrated to final concentrations of 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 µg/ml. Titrated antibodies were added to each onion at 25 μl per well at 4°C and incubated for 30 minutes.

hOX40L-Fc разбавляли 1:200. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора лиганда. Клетки с hOX40L-Fc и антителами инкубировали при 4°C в течение 15 минут.hOX40L-Fc was diluted 1:200. 50 µl of the ligand solution was added to each well. Cells with hOX40L-Fc and antibodies were incubated at 4°C for 15 minutes.

После промывания фосфатно-солевым буфером (PBS) два раза 50 мкл конъюгат антитела против Fc IgG мыши с фикоэритрином (антитело против Fc mIgG-PE) в разведении 1:500 и в каждую лунку добавляли конъюгат антитела против Fc IgG человека с флуоресцеинизотиоцианатом (антитело против Fc hIgG-FITC) в разведении 1:100, инкубировали в течение 30 минут при 4°C, а затем промывали PBS. Сигналы FITC и PE определяли проточной цитометрией.After washing with phosphate buffered saline (PBS), two times 50 μl of anti-mouse Fc IgG phycoerythrin (anti-Fc mIgG-PE) conjugate at a dilution of 1:500 was added to each well. Fc hIgG-FITC) at a 1:100 dilution, incubated for 30 minutes at 4°C and then washed with PBS. FITC and PE signals were determined by flow cytometry.

Как показано на фиг. 3, когда концентрация антитела мыши против hOX40 9H3 ("07-9H3") возрастала, сигнал FITC снижался, что указывает на то, что связывание между OX40 и OX40L блокировалось антителами против hOX40.As shown in FIG. 3 , as the concentration of mouse anti-hOX40 antibody 9H3 ("07-9H3") increased, the FITC signal decreased, indicating that binding between OX40 and OX40L was blocked by anti-hOX40 antibodies.

Пример 4. Активность связывания антител против hOX40 с OX40 человекаExample 4 Anti-hOX40 Antibodies Binding Activity to Human OX40

Антитела против hOX40 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали хроматографией. В каждую лунку планшета добавляли 25 мкл клеток CHO, временно трансфицированных OX40 человека. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титрованные антитела добавляли в каждую лунку в количестве 25 мкл на лунку при 4°C и инкубировали в течение 30 минут.Anti-hOX40 antibodies were collected from mouse ascitic fluid and purified by chromatography. 25 μl of CHO cells transiently transfected with human OX40 were added to each well of the plate. Purified antibodies were titrated to final concentrations of 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 µg/ml. Titrated antibodies were added to each well in an amount of 25 μl per well at 4°C and incubated for 30 minutes.

После промывания фосфатно-солевым буфером (PBS) два раза в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата антитела против Fc IgG мыши с фикоэритрином (антитело против Fc mIgG-PE) в разведении 1:500 и инкубировали в течение 30 минут при 4°C, а затем промывали PBS. Определение сигналов PE проводили посредством проточной цитометрии.After washing with phosphate-buffered saline (PBS), 50 μl of anti-mouse Fc IgG antibody-phycoerythrin conjugate (anti-Fc mIgG-PE antibody) at a 1:500 dilution was added to each well twice and incubated for 30 minutes at 4°C, and then washed with PBS. PE signals were determined by flow cytometry.

Как показано на фиг. 4, когда концентрация антитела мыши против hOX40 9H3 ("07-9H3") возрастала, сигнал PE возрастал, что указывает на то, что 9H3 может связываться с OX40 человека.As shown in FIG. 4 , when the concentration of mouse anti-hOX40 antibody 9H3 ("07-9H3") increased, the PE signal increased, indicating that 9H3 can bind to human OX40.

Пример 5. Перекрестная реактивность антител против hOX40 в отношении OX40 обезьяны, OX40 мыши и химерного OX40 человека-мыши (chiOX40)Example 5 Cross-reactivity of anti-hOX40 antibodies against monkey OX40, mouse OX40 and human-mouse chimeric OX40 (chiOX40)

Клетки CHO трансфицировали OX40 макака-резус (rmOX40, SEQ ID NO: 51), OX40 мыши (mOX40, SEQ ID NO: 50) и химерным (мыши и человека) OX40 (chiOX40, SEQ ID NO: 52).CHO cells were transfected with rhesus monkey OX40 (rmOX40, SEQ ID NO: 51), mouse OX40 (mOX40, SEQ ID NO: 50), and chimeric (mouse and human) OX40 (chiOX40, SEQ ID NO: 52).

В каждую лунку добавляли 25 мкл клеток CHO. В каждую лунку добавляли 25 мкл очищенных антител против hOX40 (1 мкг/мл) (9H3 или "07-9H3") и инкубировали при 4°C в течение 30 минут.25 μl of CHO cells were added to each well. 25 μl of purified anti-hOX40 antibody (1 μg/ml) (9H3 or "07-9H3") was added to each well and incubated at 4°C for 30 minutes.

После промывания PBS (1200 об/мин, 5 мин) два раза в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата антитела против Fc IgG мыши с флуоресцеинизотиоцианатом (антитело против Fc mIgG-FITC) в разведении 1:500 и инкубировали при 4°C в течение 30 минут с последующим промыванием PBS (1200 об/мин, 5 мин). Сигналы FITC определяли проточной цитометрией.After washing with PBS (1200 rpm, 5 min), 50 µl of anti-mouse Fc IgG antibody-fluorescein isothiocyanate conjugate (anti-Fc mIgG-FITC antibody) at a dilution of 1:500 was added to each well twice and incubated at 4°C for 30 minutes followed by washing with PBS (1200 rpm, 5 min). FITC signals were determined by flow cytometry.

Как показано на фиг. 5, 9H3 не реагировало перекрестно с OX40 мыши, а имело выраженную перекрестную реактивность в отношении rmOX40 и химерного OX40. На фиг. 5, NC означает отрицательный контроль.As shown in FIG. 5 , 9H3 did not cross-react with mouse OX40, but had a pronounced cross-reactivity with rmOX40 and chimeric OX40. In FIG. 5 , NC means negative control.

Пример 6. Аффинность связывания антител против hOX40Example 6 Anti-hOX40 Antibodies Binding Affinity

Антитела тестировали в отношении связывания hOX40. Аффинность антител определяли посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore T200 biosensor, Biacore, INC, Piscataway N.J.), оборудованного сенсорными чипами с предварительно иммобилизованным белком A.Antibodies were tested for hOX40 binding. Antibody affinity was determined by surface plasmon resonance (Biacore T200 biosensor, Biacore, INC, Piscataway N.J.) equipped with pre-immobilized protein A sensor chips.

Антитело против hOX40 9H3-mHvKv-IgG1 (1 мкг/мл) инжектировали в биосенсор Biacore T200 со скоростью 10 мкл/мин в течение 25 секунд до достижения желаемой плотности белка (приблизительно 112 единиц ответа (RU)). Затем инжектировали белки OX40 человека (hOX40-His) в концентрации 100，50，25，12,5，6,25，3,125，1,5625 нМ со скоростью 30 мкл/мин в течение 120 секунд. Проводили мониторинг диссоциации в течение 300 секунд. После последнего инжектирования каждого титрования проводили регенерацию чипа глицином (pH 2,0, 30 мкл/мин в течение 12 секунд). Результат для 9H3-mHvKv-IgG1 представлен на фиг. 6.Anti-hOX40 antibody 9H3-mHvKv-IgG1 (1 μg/ml) was injected into the Biacore T200 biosensor at a rate of 10 μl/min for 25 seconds until the desired protein density was reached (approximately 112 response units (RU)). Then, human OX40 proteins (hOX40-His) were injected at a concentration of 100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625nM at a rate of 30μl/min for 120 seconds. Dissociation was monitored for 300 seconds. After the last injection of each titration, the chip was regenerated with glycine (pH 2.0, 30 μl/min for 12 seconds). The result for 9H3-mHvKv-IgG1 is shown in FIG. 6 .

Значения кинетической скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (koff) получали одновременно путем глобальной аппроксимации данных к модели связывания Ленгмюра 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) с использованием программного обеспечения Biacore T200 Evaluation Software 3.0. Аффинность определяли из частного кинетических констант скорости (KD=koff/kon).Association kinetic rate (kon) and dissociation rate (koff) values were obtained simultaneously by global fitting of the data to the 1:1 Langmuir binding model (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. Methods Enzymology 6. 99-110) using Biacore T200 Evaluation Software 3.0. Affinity was determined from the partial kinetic rate constants (KD=koff/kon).

Указанный способ с необходимыми соответствующими поправками параметров (например, концентрации антител) проводили для всех других тестируемых антител. Результаты для протестированных антител против hOX40 обобщенно представлены в таблице ниже.This method, with the necessary appropriate parameter adjustments (eg, antibody concentrations), was performed for all other antibodies tested. The results for the hOX40 antibodies tested are summarized in the table below.

Таблица 1Table 1

Антитела против hOX40 Antibodies against hOX40 Скорость ассоциации,
kon (1/Мс)association speed,
kon (1/ms) Скорость диссоциации,
koff (1/c)dissociation rate,
koff (1/c) Аффинность,
KD (M)affinity,
KD(M) 9H3-mHvKv-IgG1 9H3-mHvKv-IgG1 2,575E+052.575E+05 5,938E-045.938E-04 2,306E-092.306E-09 9H3-H2K1-IgG1 9H3-H2K1-IgG1 2,230E+052.230E+05 7,483E-047.483E-04 3,355E-093.355E-09 9H3-H2K2-IgG1 9H3-H2K2-IgG1 2,267E+052.267E+05 8,696E-048.696E-04 3,836E-093.836E-09 9H3-H2K3-IgG19H3-H2K3-IgG1 2,543E+052.543E+05 3,931E-043.931E-04 1,546E-091.546E-09 9H3-H3K1-IgG1 9H3-H3K1-IgG1 2,437E+052.437E+05 6,059E-046.059E-04 2,486E-092.486E-09 9H3-H3K2-IgG1 9H3-H3K2-IgG1 1,923E+051.923E+05 6,424E-046.424E-04 3,341E-093.341E-09 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 2,351E+052.351E+05 4,509E-044.509E-04 1,918E-091.918E-09 5C1-mHvKv-IgG15C1-mHvKv-IgG1 5,489E+045.489E+04 1,633E-031.633E-03 2,975E-082.975E-08 5D10-mHvKv-IgG15D10-mHvKv-IgG1 3,171E+053.171E+05 1,474E-021.474E-02 4,649E-084.649E-08 9A4-mHvKv-IgG1 9A4-mHvKv-IgG1 1,210E+051.210E+05 6,693E-036.693E-03 5,534E-085.534E-08 9A4 (антитело мыши)9A4 (mouse antibody) 8,910E+048.910E+04 1,922E-031.922E-03 2,160E-082.160E-08

Среди этих протестированных антител 9A4 представляет собой антитело мыши против hOX40 согласно примеру 1. 9H3-mHvKv-IgG1, 5C1-mHvKv-IgG1, 5D10-mHvKv-IgG1 и 9A4-mHvKv-IgG1 представляют собой химерные антитела против hOX40. Они имеют вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из антител мыши против hOX40, и константные домены IgG1-антител человека (CL, CH1, CH2, CH3).Among these antibodies tested, 9A4 is the mouse anti-hOX40 antibody of Example 1. 9H3-mHvKv-IgG1, 5C1-mHvKv-IgG1, 5D10-mHvKv-IgG1 and 9A4-mHvKv-IgG1 are chimeric anti-hOX40 antibodies. They have a heavy chain variable domain and a light chain variable domain from mouse anti-hOX40 antibodies, and constant domains of human IgG1 antibodies (CL, CH1, CH2, CH3).

9H3-H2K1-IgG1, 9H3-H2K2-IgG1, 9H3-H2K3-IgG1, 9H3-H3K1-IgG1, 9H3-H3K2-IgG1 и 9H3-H3K3-IgG1 представляют собой гуманизированные антитела. Они имеют константные домены IgG1-антител человека (CL, CH1, CH2, CH3). Число в середине указывает на гуманизированные варианты вариабельных доменов (фиг.34). Например, 9H3-H2K1-IgG1 имеет гуманизированный вариабельный домен H2 тяжелой цепи (SEQ ID NO: 54) и гуманизированный вариабельный домен K1 легкой цепи (SEQ ID NO: 56). Аналогично, 9H3-H2K3-IgG1 имеет гуманизированный вариабельный домен H2 тяжелой цепи 9H3 (SEQ ID NO: 54) и гуманизированный вариабельный домен K3 легкой цепи 9H3 (SEQ ID NO: 58).9H3-H2K1-IgG1, 9H3-H2K2-IgG1, 9H3-H2K3-IgG1, 9H3-H3K1-IgG1, 9H3-H3K2-IgG1 and 9H3-H3K3-IgG1 are humanized antibodies. They have constant domains of human IgG1 antibodies (CL, CH1, CH2, CH3). The number in the middle indicates humanized variants of the variable domains (FIG. 34). For example, 9H3-H2K1-IgG1 has a humanized heavy chain H2 variable domain (SEQ ID NO: 54) and a humanized light chain K1 variable domain (SEQ ID NO: 56). Similarly, 9H3-H2K3-IgG1 has a humanized 9H3 heavy chain H2 variable domain (SEQ ID NO: 54) and a humanized 9H3 light chain K3 variable domain (SEQ ID NO: 58).

Пример 7. Термическая стабильность антител против hOX40Example 7 Thermal Stability of Anti-hOX40 Antibodies

Анализ Thermofluor assay проводили с использованием набора Protein Thermal Shift™ Dye Kit (Thermo Fisher Scientific) и систем QuantStudio™ 5 Real Time PCR Systems (Thermo Fisher Scientific). Этот анализ определял термостабильность с использованием флуоресцентного красителя, который связывается с гидрофобными фрагментами, экспонируемыми при разворачивании белка.The Thermofluor assay was performed using the Protein Thermal Shift™ Dye Kit (Thermo Fisher Scientific) and QuantStudio™ 5 Real Time PCR Systems (Thermo Fisher Scientific). This assay determined thermal stability using a fluorescent dye that binds to hydrophobic moieties exposed upon protein unfolding.

Эксперименты проводили в соответствии с протоколом изготовителя. Смешивали 2 мкл антитела, 10,5 мкл воды, 5 мкл буфера Protein Thermal Shift Buffer, и 2,5 мкл разбавленного красителя Protein Thermal Shift Dye. Образцы нагревали до 25°C со скоростью 1,6°C/секунда, а затем нагревали до 99°C со скоростью 0,05°C/секунда.Experiments were performed according to the manufacturer's protocol. 2 µl of antibody, 10.5 µl of water, 5 µl of Protein Thermal Shift Buffer, and 2.5 µl of diluted Protein Thermal Shift Dye were mixed. The samples were heated to 25°C at a rate of 1.6°C/second, and then heated to 99°C at a rate of 0.05°C/second.

Поскольку IgG может быть описан как мультидоменный белок, кривая плавления обычно демонстрирует два перехода с первой температурой денатурации ™ D1 и второй температурой денатурации ™ D2. Наличие этих двух пиков часто указывает на денатурацию доменов Fc и Fab, соответственно. Однако в некоторых случаях можно наблюдать только один пик.Because IgG can be described as a multi-domain protein, the melt curve typically shows two transitions with a first denaturation temperature ™ D1 and a second denaturation temperature ™ D2. The presence of these two peaks often indicates denaturation of the Fc and Fab domains, respectively. However, in some cases only one peak can be observed.

В таблице ниже обобщенно представлена ™ для различных антител против hOX40. Если было два перехода в качестве ™ в таблице ниже указана ™ D2.The table below summarizes ™ for various antibodies against hOX40. If there were two transitions as ™, the table below indicates ™ D2.

Таблица 2table 2

АнтителоAntibody Вариабельные доменыVariable domains Тип
(константные домены)Type of
(constant domains) Термическая стабильность（™）Thermal Stability（™） 9H3 (антитело мыши)9H3 (mouse antibody) mHvKvmHvKv IgG мышиmouse IgG 74,94 74.94 Химерное антитело 9H3 Chimeric 9H3 antibody mHvKvmHvKv IgG1 человекаhuman IgG1 79,1279.12 IgG2 человекаhuman IgG2 79,6879.68 IgG4 человекаhuman IgG4 78,7278.72 IgG1 человека с мутацией N297AHuman IgG1 with N297A mutation 80,3180.31 Гуманизированное антитело 9H3Humanized 9H3 Antibody H2K1H2K1 IgG1 человекаhuman IgG1 73,9373.93 H2K2H2K2 IgG1 человекаhuman IgG1 74,0874.08 H2K3H2K3 IgG1 человекаhuman IgG1 73,4973.49 H3K1H3K1 IgG1 человекаhuman IgG1 81,1881.18 IgG2 человекаhuman IgG2 81,4781.47 IgG4 человекаhuman IgG4 80,5980.59 IgG1 человека-N297AHuman IgG1-N297A 81,9281.92 H3K3H3K3 IgG1 человекаhuman IgG1 81,6281.62 IgG2 человекаhuman IgG2 81,4781.47 IgG4 человекаhuman IgG4 80,2980.29 IgG1 человека-N297AHuman IgG1-N297A 81,6281.62 Химерное антитело 9A4Chimeric antibody 9A4 mHvKvmHvKv IgG1 человекаhuman IgG1 81,78 81.78 Гуманизированное антитело 9A4Humanized antibody 9A4 H1K1H1K1 IgG1 человекаhuman IgG1 85,33 85.33 H1K2H1K2 IgG1 человекаhuman IgG1 84,89 84.89 H2K1H2K1 IgG1 человекаhuman IgG1 84,30 84.30 H2K2H2K2 IgG1 человекаhuman IgG1 83,04 83.04 Химерное антитело 5C1Chimeric antibody 5C1 mHvKvmHvKv IgG1 человекаhuman IgG1 71,21 71.21 Гуманизированное антитело 5C1Humanized 5C1 antibody H1K1H1K1 IgG1 человекаhuman IgG1 82,52 82.52 H1K2H1K2 IgG1 человекаhuman IgG1 82,82 82.82 H1K3H1K3 IgG1 человекаhuman IgG1 82,59 82.59 H1K4H1K4 IgG1 человекаhuman IgG1 83,56 83.56 H2K2H2K2 IgG1 человекаhuman IgG1 83,26 83.26 H2K3H2K3 IgG1 человекаhuman IgG1 82,67 82.67 H2K4H2K4 IgG1 человекаhuman IgG1 83,63 83.63 H3K1H3K1 IgG1 человекаhuman IgG1 79,12 79.12 H3K2H3K2 IgG1 человекаhuman IgG1 79,64 79.64 H3K3H3K3 IgG1 человекаhuman IgG1 79,12 79.12 H3K4H3K4 IgG1 человекаhuman IgG1 79,93 79.93 Химерное антитело 5D10 Chimeric antibody 5D10 mHvKvmHvKv IgG1 человекаhuman IgG1 74,39 74.39 Гуманизированное антитело 5D10Humanized antibody 5D10 H1K1H1K1 IgG1 человекаhuman IgG1 86,51 86.51 H1K2H1K2 IgG1 человекаhuman IgG1 87,10 87.10 H2K1H2K1 IgG1 человекаhuman IgG1 86,59 86.59 H2K2H2K2 IgG1 человекаhuman IgG1 87,10 87.10

В таблице 2, за исключением антитела мыши 9H3, все антитела представляют собой либо химерные антитела, либо гуманизированные антитела. Название и последовательности этих антител приведены ниже. Название указывает на источник, вариабельную область и константную область антитела. Например, гуманизированное антитело 5D10 с гуманизированной вариабельной областью H1 тяжелой цепи и гуманизированной вариабельной областью K1 легкой цепи и константными областями IgG1 человека обозначается как 5D10-H1K1-IgG1 в настоящем описании. Аналогично, химерное антитело 5C1 с VH и VL мыши, и константными областями IgG1 человека обозначается как 5C1-mHvKv-IgG1. Более того, для снижения гетерогенности гликанов Fc-область некоторых антител далее модифицировали способами инженерии для замены аспарагина в положении 297 на аланин (N297A).In Table 2, with the exception of the mouse antibody 9H3, all antibodies are either chimeric antibodies or humanized antibodies. The name and sequence of these antibodies are given below. The name indicates the source, variable region and constant region of the antibody. For example, a humanized 5D10 antibody with a humanized heavy chain H1 variable region and a humanized light chain K1 variable region and human IgG1 constant regions is referred to herein as 5D10-H1K1-IgG1. Similarly, a chimeric 5C1 antibody with mouse VH and VL, and human IgG1 constant regions is referred to as 5C1-mHvKv-IgG1. Moreover, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of some antibodies was further engineered to replace the asparagine at position 297 with alanine (N297A).

Таблица 3Table 3

Тип Type of Название антителаName of the antibody VH SEQ ID NO: VH SEQ ID NO: VL SEQ ID NO: VL SEQ ID NO: Константные области Constant Regions Химерное антитело 9H3 Chimeric 9H3 antibody 9H3-mHvKv-IgG19H3-mHvKv-IgG1 7979 8080 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-mHvKv-IgG29H3-mHvKv-IgG2 7979 8080 IgG2 человекаhuman IgG2 9H3-mHvKv-IgG49H3-mHvKv-IgG4 7979 8080 IgG4 человекаhuman IgG4 9H3-mHvKv-IgG1-N297A9H3-mHvKv-IgG1-N297A 7979 8080 IgG1 человека с мутацией N297A Human IgG1 with N297A mutation Гуманизированное антитело 9H3Humanized 9H3 Antibody 9H3-H2K1-IgG19H3-H2K1-IgG1 5454 5656 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-H2K2-IgG19H3-H2K2-IgG1 5454 5757 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-H2K3-IgG19H3-H2K3-IgG1 5454 5858 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-H3K1-IgG19H3-H3K1-IgG1 5555 5656 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-H3K1-IgG29H3-H3K1-IgG2 5555 5656 IgG2 человекаhuman IgG2 9H3-H3K1-IgG49H3-H3K1-IgG4 5555 5656 IgG4 человекаhuman IgG4 9H3-H3K1-IgG1-N297A9H3-H3K1-IgG1-N297A 5555 5656 IgG1 человека с мутацией N297A Human IgG1 with N297A mutation 9H3-H3K2-IgG19H3-H3K2-IgG1 5555 5757 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 5555 5858 IgG1 человекаhuman IgG1 9H3-H3K3-IgG29H3-H3K3-IgG2 5555 5858 IgG2 человекаhuman IgG2 9H3-H3K3-IgG49H3-H3K3-IgG4 5555 5858 IgG4 человекаhuman IgG4 9H3-H3K3--IgG1-N297A9H3-H3K3--IgG1-N297A 5555 5858 IgG1 человека с мутацией N297A Human IgG1 with N297A mutation Химерное антитело 9A4 Chimeric antibody 9A4 9A4-mHvKv-IgG19A4-mHvKv-IgG1 8181 8282 IgG1 человекаhuman IgG1 Гуманизированное антитело 9A4Humanized antibody 9A4 9A4-H1K1-IgG19A4-H1K1-IgG1 5959 6262 IgG1 человекаhuman IgG1 9A4-H1K2-IgG19A4-H1K2-IgG1 5959 6363 IgG1 человекаhuman IgG1 9A4-H2K1-IgG19A4-H2K1-IgG1 6060 6262 IgG1 человекаhuman IgG1 9A4-H2K2-IgG19A4-H2K2-IgG1 6060 6363 IgG1 человекаhuman IgG1 Химерное антитело 5C1 Chimeric antibody 5C1 5C1-mHvKv-IgG15C1-mHvKv-IgG1 8383 8484 IgG1 человекаhuman IgG1 Гуманизированное антитело 5C1Humanized 5C1 antibody 5C1-H1K1-IgG15C1-H1K1-IgG1 6666 6969 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H1K2-IgG15C1-H1K2-IgG1 6666 7070 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H1K3-IgG15C1-H1K3-IgG1 6666 7171 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H1K4-IgG15C1-H1K4-IgG1 6666 7272 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H2K2-IgG15C1-H2K2-IgG1 6767 7070 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H2K3-IgG15C1-H2K3-IgG1 6767 7171 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H2K4-IgG15C1-H2K4-IgG1 6767 7272 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H3K1-IgG15C1-H3K1-IgG1 6868 6969 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H3K2-IgG15C1-H3K2-IgG1 6868 7070 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H3K3-IgG15C1-H3K3-IgG1 6868 7171 IgG1 человекаhuman IgG1 5C1-H3K4-IgG15C1-H3K4-IgG1 6868 7272 IgG1 человекаhuman IgG1 Химерное антитело 5D10 Chimeric antibody 5D10 5D10-mHvKv-IgG15D10-mHvKv-IgG1 8585 8686 IgG1 человекаhuman IgG1 Гуманизированное антитело 5D10Humanized antibody 5D10 5D10-H1K1-IgG15D10-H1K1-IgG1 7373 7676 IgG1 человекаhuman IgG1 5D10-H1K2-IgG15D10-H1K2-IgG1 7373 7777 IgG1 человекаhuman IgG1 5D10-H2K1-IgG15D10-H2K1-IgG1 7474 7676 IgG1 человекаhuman IgG1 5D10-H2K2-IgG15D10-H2K2-IgG1 7474 7777 IgG1 человекаhuman IgG1

В некоторых из протестированных антител наблюдали два перехода. Результаты ™ D1 и ™ D2 для некоторых из протестированных антител представлены в таблицах ниже.In some of the antibodies tested, two transitions were observed. The results of ™ D1 and ™ D2 for some of the tested antibodies are presented in the tables below.

Таблица 4Table 4

Антитела Antibodies ™ D1™ D1 ™ D2™ D2 9H3-H2K1-IgG19H3-H2K1-IgG1 Нет*Not* 73,93 73.93 9H3-H2K2-IgG19H3-H2K2-IgG1 Нет*Not* 74,08 74.08 9H3-H2K3-IgG19H3-H2K3-IgG1 Нет*Not* 73,49 73.49 9H3-H3K2-IgG19H3-H3K2-IgG1 70,68 70.68 81,18 81.18

*Наблюдали только одну кривую перехода.*Only one transition curve was observed.

Результат показывает, что 9H3-H2K1-IgG1, 9H3-H2K2-IgG1 и 9H3-H2K3-IgG1 имеют значительно более низкую ™ D2, чем некоторые другие антитела (например, 9H3-H3K2-IgG1). Является возможно, что гуманизированная цепь H2 9H3 (SEQ ID NO: 54) не является настолько же стабильной, как другие гуманизированные цепи. Этот результат также согласуется с результатами термической стабильности для супернатанта CHO-S (содержащего экспрессированные антитела) при определении посредством FACS.The result shows that 9H3-H2K1-IgG1, 9H3-H2K2-IgG1 and 9H3-H2K3-IgG1 have a significantly lower ™ D2 than some other antibodies (eg 9H3-H3K2-IgG1). It is possible that the humanized H2 9H3 chain (SEQ ID NO: 54) is not as stable as other humanized chains. This result is also consistent with the thermal stability results for CHO-S supernatant (containing expressed antibodies) as determined by FACS.

Таблица 5Table 5

Антитела Antibodies ™ D1™ D1 ™ D2™ D2 9H3-H3K1-IgG19H3-H3K1-IgG1 70,09 70.09 81,18 81.18 9H3-H3K1-IgG1-N297A9H3-H3K1-IgG1-N297A 61,37 61.37 81,92 81.92 9H3-H3K1-IgG29H3-H3K1-IgG2 69,65 69.65 81,47 81.47 9H3-H3K1-IgG49H3-H3K1-IgG4 65,65 65.65 80,59 80.59

Таблица 6Table 6

Антитела Antibodies ™ D1™ D1 ™ D2™ D2 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 70,09 70.09 81,62 81.62 9H3-H3K3-IgG1-297N/A9H3-H3K3-IgG1-297N/A 61,37 61.37 81,62 81.62 9H3-H3K3-IgG29H3-H3K3-IgG2 69,65 69.65 81,47 81.47 9H3-H3K3-IgG49H3-H3K3-IgG4 66,25 66.25 80,29 80.29

Результаты, приведенные в таблице 5 и таблице 6, показывают, что гуманизированные антитела с константными областями IgG1 и константными областями IgG2 имели сходную ™ D1 и имели сходную ™ D2. Мутация N297A в IgG1 может значительно снижать ™ D1, но не ™ D2. Более того, гуманизированные антитела с константными областями IgG4 имели более низкие ™ D1 и ™ D2.The results shown in Table 5 and Table 6 show that humanized antibodies with IgG1 constant regions and IgG2 constant regions had similar ™ D1 and had similar ™ D2. Mutation N297A in IgG1 can significantly reduce ™ D1, but not ™ D2. Moreover, humanized antibodies with IgG4 constant regions had lower ™ D1 and ™ D2.

Пример 8. Тестирование Example 8 Testing in vivoin vivo антител мыши и химерных антител против hOX40 mouse antibodies and anti-hOX40 chimeric antibodies

Для тестирования антител против hOX40 in vivo и для прогнозирования эффектов этих антител в организме человека использовали модель на мышах с гуманизированным OX40. Модель на мышах с гуманизированным OX40 создавали для экспрессии химерного белка OX40 (SEQ ID NO: 52), где часть внеклеточной области белка OX40 мыши была заменена внеклеточной областью OX40 человека. Аминокислотные остатки 31-195 OX40 мыши (SEQ ID NO: 50) заменяли аминокислотными остатками 35-197 OX40 человека (SEQ ID NO:49). Модель с гуманизированными мышами (гуманизированные мыши B-hOX40) обеспечивает новый инструмент для тестирования новых способов терапевтического лечения в клинических условиях посредством значительного снижения различий между клиническим исходом у человека и у обычных мышей, экспрессирующих OX40 мыши. Подробное описание, касающееся модели на мышах с гуманизированным OX40, может быть найдено в PCT/CN2017/099575, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.A humanized OX40 mouse model was used to test antibodies against hOX40 in vivo and to predict the effects of these antibodies in humans. A humanized OX40 mouse model was created to express the chimeric OX40 protein (SEQ ID NO: 52) where part of the extracellular region of the mouse OX40 protein was replaced with the extracellular region of human OX40. Mouse OX40 amino acid residues 31-195 (SEQ ID NO:50) were replaced with human OX40 amino acid residues 35-197 (SEQ ID NO:49). The humanized mouse model (B-hOX40 humanized mice) provides a novel tool for testing novel therapeutic treatments in the clinical setting by significantly reducing the difference between clinical outcome in humans and normal mice expressing mouse OX40. A detailed description regarding the humanized OX40 mouse model can be found in PCT/CN2017/099575, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Антитела против hOX40 тестировали, чтобы продемонстрировать их эффект на рост опухоли in vivo в модели карциномы толстого кишечника. Клетки злокачественной опухоли MC-38 (клетки аденокарциномы толстого кишечника) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигали объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяли в различные группы, исходя из объема опухоли.Anti-hOX40 antibodies were tested to demonstrate their effect on tumor growth in vivo in a colon carcinoma model. MC-38 cancer cells (colon adenocarcinoma cells) were injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reached a volume of 150±50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups based on tumor volume.

Затем мышам инъецировали физиологический раствор (PS) и антитела против hOX40 посредством внутрибрюшинного введения. Антитело вводили на первые сутки и на четвертые сутки каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций).Mice were then injected with saline (PS) and anti-hOX40 antibodies via intraperitoneal injection. The antibody was administered on the first day and on the fourth day of each week for 3 weeks (6 injections in total).

Объем инъекции вычисляли, исходя из массы мыши, с учетом дозы 3 мг/кг. Длину длинной оси и короткой оси опухоли измеряли и объем опухоли вычисляли как 0,5 × (длинная ось) × (короткая ось)². Массу мышей также измеряли до инъекции, когда мышей распределяли на группы (до первой инъекции антитела), два раза в неделю в ходе периода инъекции антитела и перед умерщвлением.The injection volume was calculated based on the weight of the mouse, taking into account the dose of 3 mg/kg. The length of the long axis and short axis of the tumor were measured and the volume of the tumor was calculated as 0.5 × (long axis) × (short axis) ² . Mice were also weighed prior to injection when the mice were divided into groups (before the first antibody injection), twice a week during the antibody injection period, and before sacrifice.

Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) вычисляли с использованием следующей формулы: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100. Ti представляет собой средний объем опухоли в группе лечения на сутки i. T0 представляет собой средний объем опухоли в группе лечения на нулевые сутки. Vi представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе на сутки i. V0 представляет собой средний объем опухоли в контрольной группе на нулевые сутки.Percent tumor growth inhibition (TGI%) was calculated using the following formula: TGI (%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100. Ti is the mean tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the mean tumor volume in the treatment group at day zero. Vi is the mean tumor volume in the control group on day i. V0 is the mean tumor volume in the control group at day zero.

Для статистического анализа использовали T-критерий. TGI% выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. P < 0,05 представляет собой пороговое значение для указания значимых отличий.T-test was used for statistical analysis. A TGI% greater than 60% indicates significant inhibition of tumor growth. P < 0.05 is the cut-off value for indicating significant differences.

Результаты in vivo для антител мыши против hOX40 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 и 14-7F11In vivo results for mouse anti-hOX40 antibodies 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 and 14-7F11

Антитела мыши против hOX40 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 и 14-7F11 вводили гуманизированным мышам B-hOX40 (мыши с гуманизированным OX40). Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения. Масса мышей во всех из различных групп возрастала (фиг. 7 и фиг. 8). Не наблюдалось значимых отличий массы между контрольной группой и группами введения антитела против hOX40. Результаты показали, что антитела против hOX40 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.Mouse anti-hOX40 antibodies 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1, 17-5D10, 08-6A11 and 14-7F11 were administered to humanized B-hOX40 mice (humanized OX40 mice). The weight of the mice was monitored during the entire administration period. The weight of mice in all of the different groups increased ( Fig. 7 and Fig. 8 ). No significant difference in weight was observed between the control group and the anti-hOX40 antibody administration groups. The results showed that the anti-hOX40 antibodies were well tolerated and were not toxic to mice.

Однако размер опухоли продемонстрировал значимое отличие в группах, в которых вводили антитела 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1 и 17-5D10 (фиг. 9).However, tumor size showed a significant difference in the groups that received antibodies 07-9H3, 07-9A4, 11-5C1 and 17-5D10 ( Fig. 9 ).

Также для каждой группы введения вычисляли TGI% на 24 сутки, как показано в таблице ниже.Also, for each administration group, TGI% was calculated on day 24 as shown in the table below.

Таблица 7Table 7

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 24 суткиAverage tumor size at day 24 TGI%TGI% Значение PP value G1G1 PSPS 14411441 -- -- G2G2 08-6A11 (3 мг/кг)08-6A11 (3 mg/kg) 12881288 11,5%11.5% 0,7040.704 G3G3 11-5C1 (3 мг/кг)11-5C1 (3 mg/kg) 248248 90,0%90.0% 0,0050.005 G4G4 14-7F11 (3 мг/кг)14-7F11 (3 mg/kg) 11331133 23,3%23.3% 0,4030.403 G5G5 17-5D10 (3 мг/кг)17-5D10 (3 mg/kg) 311311 85,3%85.3% 0,0100.010 G6G6 07-9H3 (3 мг/кг)07-9H3 (3 mg/kg) 614614 62,4%62.4% 0,0310.031 G7G7 07-9A4 (3 мг/кг)07-9A4 (3 mg/kg) 366366 81,1%81.1% 0,0100.010

Результаты показывают, что 5C1 имело наилучший TGI%. 6A11 и 7F11 не были эффективными в отношении ингибирования роста опухоли.The results show that 5C1 had the best TGI%. 6A11 and 7F11 were not effective in inhibiting tumor growth.

Результаты in vivo для химерных антител против hOX40In vivo results for anti-hOX40 chimeric antibodies

Антитело мыши против hOX40 9H3 и химерные антитела против hOX40 9H3-mHvKv-IgG1, 9H3-mHvKv-IgG2, 9H3-mHvKv-IgG4 и 9H3-mHvKv-IgG1-N297A вводили гуманизированным мышам B-hOX40 (мыши с гуманизированным OX40) посредством внутрибрюшинного введения. Инъецируемое количество вычисляли, исходя из массы мыши, для дозы 3 мг/кг. Антитело вводили на первые сутки и на четвертые сутки каждой недели (всего 5 инъекций).Mouse anti-hOX40 antibody 9H3 and chimeric anti-hOX40 antibodies 9H3-mHvKv-IgG1, 9H3-mHvKv-IgG2, 9H3-mHvKv-IgG4, and 9H3-mHvKv-IgG1-N297A were administered to humanized B-hOX40 mice (humanized OX40 mice) via intraperitoneal injection . The injection amount was calculated based on the weight of the mouse for a dose of 3 mg/kg. The antibody was administered on the first day and on the fourth day of each week (a total of 5 injections).

Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения. Масса мышей во всех из различных групп возрастала (фиг. 10 и фиг. 11). Не наблюдалось значимых отличий массы между контрольной группой и группами введения антитела против hOX40. Результаты показали, что антитела против hOX40 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.The weight of the mice was monitored during the entire administration period. The weight of mice in all of the different groups increased ( Fig. 10 and Fig. 11 ). No significant difference in weight was observed between the control group and the anti-hOX40 antibody administration groups. The results showed that the anti-hOX40 antibodies were well tolerated and were not toxic to mice.

Однако размер опухоли продемонстрировал значимое отличие в группах, в которых вводили антитела 9H3-mHvKv-IgG1, 9H3-mHvKv-IgG2, 9H3-mHvKv-IgG4 и 9H3-mHvKv-IgG1-N297A (фиг. 12).However, tumor size showed a significant difference in the groups injected with 9H3-mHvKv-IgG1, 9H3-mHvKv-IgG2, 9H3-mHvKv-IgG4, and 9H3-mHvKv-IgG1-N297A antibodies ( Fig. 12 ).

Также для каждой группы введения вычисляли TGI% на 21 сутки, как показано в таблице ниже.Also, for each administration group, TGI% was calculated on day 21 as shown in the table below.

Таблица 8Table 8

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 21 суткиAverage tumor size at day 21 TGI%TGI% Значение PP value G1G1 PSPS 19711971 -- -- G2G2 9H3-mHvKv-IgG1
(3 мг/кг; в/б введение; два раза в неделю; всего 5 инъекций)9H3-mHvKv-IgG1
(3 mg/kg; ip administration; twice a week; 5 injections in total) 706706 68,3%68.3% 0,0090.009 G3G3 9H3-mHvKv-IgG2
(3 мг/кг; в/б введение; два раза в неделю; всего 5 инъекций)9H3-mHvKv-IgG2
(3 mg/kg; ip administration; twice a week; 5 injections in total) 11171117 46,1%46.1% 0,0310.031 G4G4 9H3-mHvKv-IgG4
(3 мг/кг; в/б введение; два раза в неделю; всего 5 инъекций)9H3-mHvKv-IgG4
(3 mg/kg; ip administration; twice a week; 5 injections in total) 13231323 35,0%35.0% 0,1170.117 G5G5 9H3-mHvKv-IgG1-N297A
(3 мг/кг; в/б введение; два раза в неделю; всего 5 инъекций)9H3-mHvKv-IgG1-N297A
(3 mg/kg; ip administration; twice a week; 5 injections in total) 17601760 11,4%11.4% 0,5730.573 G6G6 9H3
(3 мг/кг; в/б введение; два раза в неделю; всего 5 инъекций)9H3
(3 mg/kg; ip administration; twice a week; 5 injections in total) 794794 63,5%63.5% 0,0030.003

Результаты демонстрируют, что антитело мыши против hOX40 9H3 и химерное антитело против hOX40 9H3-mHvKv-IgG1 и 9H3-mHvKv-IgG2 может значительно ингибировать рост опухоли. Среди их 9H3-mHvKv-IgG1 имело наиболее высокий TGI%.The results demonstrate that mouse anti-hOX40 antibody 9H3 and chimeric anti-hOX40 antibody 9H3-mHvKv-IgG1 and 9H3-mHvKv-IgG2 can significantly inhibit tumor growth. Among them, 9H3-mHvKv-IgG1 had the highest TGI%.

Пример 9. Тестирование Example 9 Testing in vivoin vivo гуманизированных антител против hOX40 humanized antibodies against hOX40

Гуманизированные антитела против hOX40 тестировали у мышей с гуманизированным OX40, чтобы продемонстрировать их эффект на рост опухоли in vivo. Humanized hOX40 antibodies were tested in humanized OX40 mice to demonstrate their effect on tumor growth in vivo .

Клетки злокачественной опухоли MC-38 (клетки аденокарциномы толстого кишечника) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигали объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяли на различные группы, исходя из объема опухоли (8 мышей в каждой группе). MC-38 cancer cells (colon adenocarcinoma cells) were injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reached a volume of 150±50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups based on tumor volume (8 mice per group).

Затем мышам инъецировали IgG человека (контроль) и антитела против hOX40 посредством внутрибрюшинной инъекции в дозе либо 3 мг/кг, либо 1 мг/кг. Антитело вводили на первые сутки и на четвертые сутки каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций).Mice were then injected with human IgG (control) and anti-hOX40 antibodies via intraperitoneal injection at either 3 mg/kg or 1 mg/kg. The antibody was administered on the first day and on the fourth day of each week for 3 weeks (6 injections in total).

Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения. Масса мышей во всех из различных групп возрастала (фиг. 13 и фиг. 14). Не наблюдалось значимых отличий массы между контрольной группой и группами введения антитела против hOX40. Результаты показали, что антитела против hOX40 хорошо переносились и не были токсичными для мышей.The weight of the mice was monitored during the entire administration period. The weight of mice in all of the different groups increased ( Fig. 13 and Fig. 14 ). No significant difference in weight was observed between the control group and the anti-hOX40 antibody administration groups. The results showed that the anti-hOX40 antibodies were well tolerated and were not toxic to mice.

Размер опухоли продемонстрировал значимое отличие в группах, в которых вводили антитела против hOX40 (фиг. 15).Tumor size showed a significant difference in the groups administered anti-hOX40 antibodies ( Fig. 15 ).

TGI% на 18 сутки (18 суток после распределения на группы) для каждой группы введения также вычисляли, как показано в таблице ниже.TGI% on day 18 (18 days after grouping) for each administration group was also calculated as shown in the table below.

Таблица 9Table 9

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 18 суткиAverage tumor size on day 18 TGI%TGI% Значение P P value G1G1 IgG человека (3 мг/кг)Human IgG (3 mg/kg) 19891989 -- -- G2G2 9H3-H3K1-IgG1 (1 мг/кг)9H3-H3K1-IgG1 (1 mg/kg) 447447 82,7%82.7% 0,0040.004 G3G3 9H3-H3K1-IgG1 (3 мг/кг)9H3-H3K1-IgG1 (3 mg/kg) 514514 79,0%79.0% 0,0050.005 G4G4 9H3-H3K3-IgG1 (1 мг/кг)9H3-H3K3-IgG1 (1 mg/kg) 694694 69,4%69.4% 0,0250.025 G5G5 9H3-H3K3-IgG1 (3 мг/кг)9H3-H3K3-IgG1 (3 mg/kg) 268268 92,3%92.3% 0,0010.001 G6G6 9H3 (1 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) 583583 75,3%75.3% 0,0060.006 G7G7 9H3 (3 мг/кг)9H3 (3 mg/kg) 880880 59,4%59.4% 0,0420.042

Результаты, приведенные выше, демонстрируют, что все антитела против hOX40 могут ингибировать рост опухоли. Среди них 9H3-H3K3-IgG1 (3 мг/кг) имело наиболее высокий процент ингибирования роста опухоли.The results above demonstrate that all anti-hOX40 antibodies can inhibit tumor growth. Among them, 9H3-H3K3-IgG1 (3mg/kg) had the highest percentage of tumor growth inhibition.

Трех мышей в группе G1 и трех мышей в группе G5 отбирали для дальнейшей оценки.Three mice in the G1 group and three mice in the G5 group were selected for further evaluation.

Исследовали ткани печени этих мышей (фиг. 16). Результаты обобщенно представлены в таблицах. Результат показывает, что по сравнению с контрольной группой не наблюдалось значимого повреждения печени.The liver tissues of these mice were examined ( Fig. 16 ). The results are summarized in the tables. The result shows that compared with the control group, no significant liver damage was observed.

Таблица 10Table 10

Мышь номерMouse number ГруппаGroup АнтителоAntibody Доза и введениеDose and Administration Паталогический анализ ткани печени Pathological analysis of liver tissue 2582925829 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура ткани печени в основном была нормальной с мягким печеночно-клеточным отеком и мягкой гиперплазией клеток Купфера. Наблюдалось множество мелких очаговых участков некроза гепатоцитов.The structure of the liver tissue was mostly normal with mild hepatocellular edema and mild Kupffer cell hyperplasia. Many small focal areas of hepatocyte necrosis were observed. 2586125861 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Мягкий печеночно-клеточный отек. Наблюдался один мелкий очаговый участок некроза гепатоцитов.Mild hepatocellular edema. One small focal area of hepatocyte necrosis was observed. 2587825878 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Печеночно-клеточный отек от мягкого до умеренного. Наблюдалось два мелких очаговых участка некроза гепатоцитов.Mild to moderate hepatocellular edema. Two small focal areas of hepatocyte necrosis were observed. 2583225832 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура ткани печени в основном была нормальной с умеренным печеночно-клеточным отеком. Некоторые клетки имели баллонирующую дегенерацию.The structure of the liver tissue was mostly normal with moderate hepatocellular edema. Some cells showed ballooning degeneration. 2586725867 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Мягкий печеночно-клеточный отек.Mild hepatocellular edema. 2587425874 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Мягкий печеночно-клеточный отек.
Наблюдался один мелкий очаговый участок некроза гепатоцитов.Mild hepatocellular edema.
One small focal area of hepatocyte necrosis was observed.

Также исследовали почку этих мышей (фиг. 17). Результаты обобщенно представлены в таблицах ниже. Результат показывает, что по сравнению с контрольной группой 9H3-H3K3-IgG1 не вызывало серьезных повреждений почек.The kidney of these mice was also examined ( Fig. 17 ). The results are summarized in the tables below. The result shows that, compared with the control group, 9H3-H3K3-IgG1 did not cause serious kidney damage.

Таблица 11Table 11

Мышь номерMouse number ГруппаGroup АнтителоAntibody Доза и введениеDose and Administration Паталогический анализ почек Pathological analysis of the kidneys 2582925829 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура почек в основном нормальная с умеренным отеком проксимальных канальцев.The structure of the kidneys is mostly normal with moderate swelling of the proximal tubules. 2586125861 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура почек в основном нормальная с умеренным отеком проксимальных канальцев.The structure of the kidneys is mostly normal with moderate swelling of the proximal tubules. 2587825878 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура почек в основном нормальная с умеренным отеком проксимальных канальцев.The structure of the kidneys is mostly normal with moderate swelling of the proximal tubules. 2583225832 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура почек в основном нормальная с умеренным отеком проксимальных канальцев.The structure of the kidneys is mostly normal with moderate swelling of the proximal tubules. 2586725867 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура почек в основном нормальная с умеренным отеком проксимальных канальцев.The structure of the kidneys is mostly normal with moderate swelling of the proximal tubules. 2587425874 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Структура почек в основном нормальная с умеренным отеком проксимальных канальцев.The structure of the kidneys is mostly normal with moderate swelling of the proximal tubules.

Также исследовали кишечник этих мышей (фиг. 18). Результаты обобщенно представлены в таблицах ниже. Результат демонстрирует, что по сравнению с контрольной группой 9H3-H3K3-IgG1 не вызывает серьезного повреждения кишечника.The intestines of these mice were also examined ( Fig. 18 ). The results are summarized in the tables below. The result demonstrates that, compared with the control group, 9H3-H3K3-IgG1 does not cause serious intestinal damage.

Таблица 12Table 12

Мышь номерMouse number ГруппаGroup АнтителоAntibody Доза и введениеDose and Administration Паталогический анализ кишечника Pathological analysis of the intestine 2582925829 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Слизистая ткань тонкого кишечника с мягким хроническим воспалением.Mucous tissue of the small intestine with mild chronic inflammation. 2586125861 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Слизистая ткань тонкого кишечника с мягким хроническим воспалением.Mucous tissue of the small intestine with mild chronic inflammation. 2586725867 G1G1 IgG человекаhuman IgG 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Слизистая ткань тонкого кишечника с мягким хроническим воспалением.Mucous tissue of the small intestine with mild chronic inflammation. 2583225832 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Не было обнаружено заметных патологических изменений.No significant pathological changes were found. 2587425874 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Слизистая ткань тонкого кишечника с мягким хроническим воспалением.Mucous tissue of the small intestine with mild chronic inflammation. 2587825878 G5G5 9H3-H3K3-IgG19H3-H3K3-IgG1 3 мг/кг, два раза в неделю, всего 6 инъекций3 mg/kg twice a week for a total of 6 injections Слизистая ткань тонкого кишечника с мягким хроническим воспалением.Mucous tissue of the small intestine with mild chronic inflammation.

В целом, результаты указывают на то, что 9H3-H3K3-IgG1 не имеет серьезных побочных эффектов у гуманизированных мышей.Overall, the results indicate that 9H3-H3K3-IgG1 has no serious side effects in humanized mice.

Пример 10. Комбинированная терапия с КитрудойExample 10 Combination Therapy with Keytruda

Для оценки эффективности комбинированной терапии антитела против hOX40 вводили мышам с некоторыми другими терапевтическими средствами.To evaluate the efficacy of combination therapy, anti-hOX40 antibodies were administered to mice with several other therapies.

Результаты in vivo для 9H3 и Китруды для клеток злокачественной опухоли MC-38 у гуманизированных мышейIn Vivo Results for 9H3 and Keytruda for MC-38 Cancer Cells in Humanized Mice

Клетки злокачественной опухоли MC-38 инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигали объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяли на различные группы, исходя из объема опухоли (6 мышей в каждой группе). Затем мышам инъецировали (G1) PS (контроль), (G2) Китруду (0,3 мг/кг) (Merck), (G3) 9H3 (3 мг/кг) и (G4) Китруду (0,3 мг/кг) и 9H3 (3 мг/кг) посредством внутрибрюшинной инъекции. Антитело вводили на первые сутки и четвертые сутки каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций). MC-38 cancer cells were injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reached a volume of 150±50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups based on tumor volume (6 mice per group). Mice were then injected with (G1) PS (control), (G2) Keytrud (0.3 mg/kg) (Merck), (G3) 9H3 (3 mg/kg), and (G4) Keytrud (0.3 mg/kg) and 9H3 (3 mg/kg) via intraperitoneal injection. The antibody was administered on the first day and the fourth day of each week for 3 weeks (6 injections in total).

Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения. Масса мышей во всех из различных групп возрастала (фиг. 19 и фиг. 20). Не наблюдалось значимых отличий массы между контрольной группой и группами введения антитела против hOX40. Результаты показали, что эти антитела хорошо переносились и не были токсичными для мышей.The weight of the mice was monitored during the entire administration period. The weight of mice in all of the different groups increased ( Fig. 19 and Fig. 20 ). No significant difference in weight was observed between the control group and the anti-hOX40 antibody administration groups. The results showed that these antibodies were well tolerated and were not toxic to mice.

Размер опухоли продемонстрировал значимое отличие в группах, в которых вводили антитела против hOX40 (фиг. 21). TGI% на 21 сутки (21 сутки после распределения на группы) для каждой группы введения также вычисляли, как показано в таблице ниже.Tumor size showed a significant difference in the groups administered anti-hOX40 antibodies ( Fig. 21 ). TGI% at day 21 (day 21 after grouping) for each administration group was also calculated as shown in the table below.

Таблица 13Table 13

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 21 суткиAverage tumor size at day 21 TGI%TGI% Значение PP value G1G1 PSPS 22562256 -- -- G2G2 Китруда
(0,3 мг/кг)Keytruda
(0.3 mg/kg) 13801380 41,0%41.0% 0,1270.127 G3G3 9H3
(3 мг/кг)9H3
(3 mg/kg) 662662 74,6%74.6% 0,0030.003 G4G4 9H3 (3 мг/кг) + Китруда (0,3 мг/кг)9H3 (3 mg/kg) + Keytruda (0.3 mg/kg) 187187 96,8%96.8% 0,00030.0003

Результат показывает, что 9H3 в комбинации с Китрудой может усиливать эффекты ингибирования роста опухоли.The result shows that 9H3 in combination with Keytruda can enhance the effects of tumor growth inhibition.

Результаты in vivo для 9H3 и Китруды для клеток злокачественной опухоли EL4 у гуманизированных мышейIn Vivo Results for 9H3 and Keytruda for EL4 Cancer Cells in Humanized Mice

Клетки злокачественной опухоли EL4 (линия опухолевых клеток мыши, происходящая из химически индуцированной лимфомы) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигали объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяли на различные группы, исходя из объема опухоли (5 мышей в каждой группе). Затем мышам инъецировали (G1) PS (контроль), (G2) 9H3 (3 мг/кг), (G3) Китруду (3 мг/кг) и (G4) Китруду (3 мг/кг) и 9H3 (3 мг/кг) посредством внутрибрюшинной инъекции. Антитело вводили на первые сутки и четвертые сутки каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций).EL4 cancer cells (a mouse tumor cell line derived from chemically induced lymphoma) were injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reached a volume of 150±50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups based on tumor volume (5 mice per group). Mice were then injected with (G1) PS (control), (G2) 9H3 (3 mg/kg), (G3) Keytrud (3 mg/kg) and (G4) Keytrud (3 mg/kg) and 9H3 (3 mg/kg ) by intraperitoneal injection. The antibody was administered on the first day and the fourth day of each week for 3 weeks (6 injections in total).

Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения. Масса мышей во всех из различных групп возрастала (фиг. 22 и фиг. 23). Результаты показали, что эти хорошо переносились и не были токсичными для мышей.The weight of the mice was monitored during the entire administration period. The weight of mice in all of the different groups increased ( Fig. 22 and Fig. 23 ). The results showed that these were well tolerated and were not toxic to mice.

Размер опухоли продемонстрировал значимое отличие в группах, в которых вводили 9H3 и комбинацию 9H3 и Китруды (фиг. 24). TGI% на 18 сутки (18 суток после распределения на группы) для каждой группы введения представлен в таблице ниже.Tumor size showed a significant difference between the 9H3 and the combination of 9H3 and Keytruda treated groups ( Figure 24 ). TGI% at day 18 (18 days after grouping) for each administration group is presented in the table below.

Таблица 14Table 14

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 18 суткиAverage tumor size on day 18 TGI%TGI% Значение P P value G1G1 PSPS 30753075 -- -- G2G2 9H3
(3 мг/кг)9H3
(3 mg/kg) 16371637 48,7%48.7% 0,0480.048 G3G3 Китруда
(3 мг/кг)Keytruda
(3 mg/kg) 25922592 16,3%16.3% 0,5450.545 G4G4 9H3 (3 мг/кг) + Китруда (3 мг/кг)9H3 (3mg/kg) + Keytruda (3mg/kg) 920920 73,0%73.0% 0,0180.018

Результат показывает, что сама по себе Китруда не может ингибировать рост опухоли. Однако комбинация Китруды и 9H3 имела лучший TGI%, чем использование 9H3 отдельно.The result shows that Keytruda alone cannot inhibit tumor growth. However, the combination of Keytruda and 9H3 had a better TGI% than using 9H3 alone.

Пример 11. Комбинированная терапия антителами против PD1 или против PDL1Example 11 Anti-PD1 or Anti-PDL1 Antibody Combination Therapy

Для оценки эффективности комбинированной терапии антитела против hOX40 вводили мышам с антителами против PD1 или против PDL1.To evaluate the efficacy of combination therapy, anti-hOX40 antibodies were administered to mice with anti-PD1 or anti-PDL1 antibodies.

Клетки злокачественной опухоли MC-38 инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигали объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяли на различные группы, исходя из объема опухоли (5 мышей в каждой группе). Затем мышам инъецировали (G1) PS (контроль); (G2) 9H3 (1 мг/кг); (G3) mPD-1(RMP1-14) (антитело мыши против mPD1; каталожный номер BioXcell BE0146) (1 мг/кг); (G4) 9H3 (1 мг/кг) и mPD-1(RMP1-14) (1 мг/кг); (G5) mPD-L1(10F.9G2) (антитело мыши против mPDL1; каталожный номер BioXcell BE0101) (1 мг/кг); или (G6) 9H3 (1 мг/кг) и mPD-L1(10F.9G2) (1 мг/кг) посредством внутрибрюшинного введения. Антитело вводили два раза в неделю в течение 3 недель (всего 6 инъекций). MC-38 cancer cells were injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reached a volume of 150±50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups based on tumor volume (5 mice per group). Mice were then injected with (G1) PS (control); (G2) 9H3 (1 mg/kg); (G3) mPD-1(RMP1-14) (murine anti-mPD1 antibody; BioXcell catalog number BE0146) (1 mg/kg); (G4) 9H3 (1 mg/kg) and mPD-1(RMP1-14) (1 mg/kg); (G5) mPD-L1(10F.9G2) (murine anti-mPDL1 antibody; BioXcell catalog number BE0101) (1 mg/kg); or (G6) 9H3 (1 mg/kg) and mPD-L1(10F.9G2) (1 mg/kg) via intraperitoneal injection. The antibody was administered twice a week for 3 weeks (6 injections in total).

Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения (фиг. 25 и фиг. 26). Результаты показали, что эти антитела не были токсичными для мышей. Mice weight monitoring was performed during the entire administration period ( FIG. 25 and FIG. 26 ). The results showed that these antibodies were not toxic to mice.

Размер опухоли уменьшался в группах, в которых вводили антитела (фиг. 27). TGI% на 25 сутки (25 суток после распределения на группы) для каждой группы введения представлен в таблице ниже.Tumor size decreased in the antibody treated groups ( Figure 27 ). TGI% at day 25 (25 days after grouping) for each administration group is presented in the table below.

Таблица 15Table 15

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 25 суткиAverage tumor size at day 25 TGI%TGI% Значение PP value G1G1 PSPS 27962796 -- -- G2G2 9H3
(1 мг/кг)9H3
(1 mg/kg) 10131013 66,7%66.7% 0,0800.080 G3G3 mPD-1(RMP1-14) (1 мг/кг)mPD-1(RMP1-14) (1 mg/kg) 18511851 35,4%35.4% 0,3290.329 G4G4 9H3 (1 мг/кг) + mPD-1(RMP1-14) (1 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) + mPD-1(RMP1-14) (1 mg/kg) 516516 85,2%85.2% 0,0320.032 G5G5 mPD-L1(10F.9G2) (1 мг/кг)mPD-L1(10F.9G2) (1 mg/kg) 18011801 37,2%37.2% 0,2960.296 G6G6 9H3 (1 мг/кг) + mPD-L1(10F.9G2) (1 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) + mPD-L1(10F.9G2) (1 mg/kg) 804804 74,5%74.5% 0,0560.056

Результаты показывает, что 9H3 в комбинации с mPD-1(RMP1-14) (антитело против PD-1) имело наилучший показатель ингибирования роста опухоли.The results show that 9H3 in combination with mPD-1(RMP1-14) (an anti-PD-1 antibody) had the best rate of tumor growth inhibition.

Пример 12. Комбинированная терапия антителами против LAG-3, против TIGIT, против BTLA, против CTLA-4 или против GITRExample 12 Combination Therapy with Anti-LAG-3, Anti-TIGIT, Anti-BTLA, Anti-CTLA-4, or Anti-GITR Antibodies

Для оценки эффективности комбинированной терапии антитела против hOX40 вводили мышам с антителами против LAG-3, против TIGIT, против BTLA, против CTLA-4 или против GITR.To evaluate the efficacy of combination therapy, anti-hOX40 antibodies were administered to mice with anti-LAG-3, anti-TIGIT, anti-BTLA, anti-CTLA-4, or anti-GITR antibodies.

Клетки злокачественной опухоли MC-38 инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигали объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяли в различные группы, исходя из объема опухоли (5 мышей в каждой группе). Затем мышам проводили следующие инъекции посредством внутрибрюшинного введения:MC-38 cancer cells were injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reached a volume of 150±50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups based on tumor volume (5 mice per group). Mice were then given the following injections via intraperitoneal injection:

(G1) PS (контроль); (G1) PS (control);

(G2) 9H3 (1 мг/кг); (G2) 9H3 (1 mg/kg);

(G3) mLAG-3(C9B7W) (антитело мыши против LAG-3; BioXcell, каталожный номер №: BE0174) (3 мг/кг); (G3) mLAG-3(C9B7W) (murine anti-LAG-3 antibody; BioXcell, catalog no: BE0174) (3 mg/kg);

(G4) 9H3 (1 мг/кг) и mLAG-3(C9B7W) (3 мг/кг); (G4) 9H3 (1 mg/kg) and mLAG-3(C9B7W) (3 mg/kg);

(G5) mTIGIT(1G9) (антитело мыши против mTIGIT; BioXcell, каталожный номер №: BE0274) (3 мг/кг); (G5) mTIGIT(1G9) (mouse anti-mTIGIT antibody; BioXcell, catalog number: BE0274) (3 mg/kg);

(G6) 9H3 (1 мг/кг) и mTIGIT(1G9) (3 мг/кг); (G6) 9H3 (1 mg/kg) and mTIGIT(1G9) (3 mg/kg);

(G7) mBTLA(PJ196) (антитело мыши против mBTLA; BioXcell, каталожный номер №: BE0196) (10 мг/кг);(G7) mBTLA(PJ196) (mouse anti-mBTLA antibody; BioXcell, catalog no: BE0196) (10 mg/kg);

(G8) 9H3 (1 мг/кг) и mBTLA(PJ196) (10 мг/кг);(G8) 9H3 (1 mg/kg) and mBTLA(PJ196) (10 mg/kg);

(G9) mCTLA-4(9D9) (антитело мыши против mCTLA-4; BioXcell, каталожный номер №: BE0164) (1 мг/кг); (G9) mCTLA-4(9D9) (murine anti-mCTLA-4 antibody; BioXcell, catalog number: BE0164) (1 mg/kg);

(G10) 9H3 (1 мг/кг) и mCTLA-4(9D9) (1 мг/кг); (G10) 9H3 (1 mg/kg) and mCTLA-4(9D9) (1 mg/kg);

(G11) mGITR(DTA-1) (антитело мыши против mGITR; BioXcell, каталожный номер №: BE0063) (0,3 мг/кг); (G11) mGITR(DTA-1) (murine anti-mGITR antibody; BioXcell, catalog number: BE0063) (0.3 mg/kg);

(G12) 9H3 (1 мг/кг) и mGITR(DTA-1) (0,3 мг/кг).(G12) 9H3 (1 mg/kg) and mGITR(DTA-1) (0.3 mg/kg).

Антитело вводили два раза в неделю (всего 3 инъекции).The antibody was administered twice a week (3 injections in total).

Мониторинг массы мышей проводили в ходе всего периода введения (фиг. 28 и фиг. 29). Результаты показали, что эти антитела не были токсичными для мышей.Mice weight monitoring was performed during the entire administration period ( FIG. 28 and FIG. 29 ). The results showed that these antibodies were not toxic to mice.

В группах введения G2, G3, G4, G6, G8, G10, G11 и G12 размер опухоли уменьшался (фиг. 30). TGI% на 25 сутки (25 сутки после распределения на группы) для каждой группы введения представлен в таблице ниже.In the G2, G3, G4, G6, G8, G10, G11 and G12 administration groups, tumor size decreased ( Fig. 30 ). TGI% at day 25 (day 25 after grouping) for each administration group is shown in the table below.

Таблица 16Table 16

ГруппаGroup АнтителаAntibodies Средний размер опухоли на 25 суткиAverage tumor size at day 25 TGI%TGI% Значение P P value G1 G1 PSPS 2166 2166 -- -- G2G2 9H3
(1 мг/кг)9H3
(1 mg/kg) 1586 1586 28,8%28.8% 0,393 0.393 G3G3 mLAG-3(C9B7W)
(3 мг/кг)mLAG-3(C9B7W)
(3 mg/kg) 1654 1654 25,4%25.4% 0,436 0.436 G4G4 9H3 (1 мг/кг) + mLAG-3(C9B7W) (3 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) + mLAG-3(C9B7W) (3 mg/kg) 587 587 78,4%78.4% 0,017 0.017 G5G5 mTIGIT(1G9) (3 мг/кг) mTIGIT(1G9) (3 mg/kg) 2901 2901 -36,5%-36.5% 0,336 0.336 G6G6 9H3 (1 мг/кг) + mTIGIT(1G9) (3 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) + mTIGIT(1G9) (3 mg/kg) 1244 1244 45,7%45.7% 0,142 0.142 G7G7 mBTLA(PJ196) (10 мг/кг)mBTLA(PJ196) (10mg/kg) 2328 2328 -8,0%-8.0% 0,825 0.825 G8G8 9H3 (1 мг/кг) + mBTLA(PJ196) (10 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) + mBTLA(PJ196) (10 mg/kg) 1232 1232 46,3%46.3% 0,149 0.149 G9G9 mCTLA-4(9D9) (1 мг/кг) mCTLA-4(9D9) (1 mg/kg) 2977 2977 -40,2%-40.2% 0,267 0.267 G10G10 9H3 (1 мг/кг) + mCTLA-4(9D9) (1 мг/кг) 9H3 (1 mg/kg) + mCTLA-4(9D9) (1 mg/kg) 397 397 87,8%87.8% 0,026 0.026 G11G11 mGITR(DTA-1) (0,3 мг/кг)mGITR(DTA-1) (0.3 mg/kg) 1924 1924 12,0%12.0% 0,665 0.665 G12G12 9H3 (1 мг/кг) + mGITR(DTA-1) (0,3 мг/кг)9H3 (1 mg/kg) + mGITR(DTA-1) (0.3 mg/kg) 735 735 71,0%71.0% 0,283 0.283

Результат показывает, что 9H3 в комбинации с антителами против LAG-3, против TIGIT, против BTLA, против CTLA-4 или против GITR имело лучшие эффекты ингибирования роста опухоли, чем применение 9H3 отдельно.The result shows that 9H3 in combination with anti-LAG-3, anti-TIGIT, anti-BTLA, anti-CTLA-4 or anti-GITR antibodies had better tumor growth inhibiting effects than 9H3 alone.

Пример 13. Тестирование Example 13 Testing in vivoin vivo гуманизированных антител 9A4, 5C1 и 5D10 humanized antibodies 9A4, 5C1 and 5D10

Гуманизированные антитела 9A4, 5C1 и 5D10 также тестируют у мышей с гуманизированным OX40 для демонстрации их эффекта на рост опухоли in vivo.Humanized antibodies 9A4, 5C1 and 5D10 are also being tested in humanized OX40 mice to demonstrate their effect on tumor growth in vivo .

Клетки злокачественной опухоли MC-38 (клетки аденокарциномы толстого кишечника) инъецируют подкожно гуманизированным мышам B-hOX40. Когда опухоли у мышей достигают объема 150±50 мм³, мышей случайным образом распределяют в различные группы, исходя из объема опухоли. Затем мышам инъецируют IgG человека (контроль) и гуманизированные антитела 9A4, 5C1 и 5D10 посредством внутрибрюшинной инъекции в дозе либо 3 мг/кг, либо 1 мг/кг. Антитело вводят на первые сутки и четвертые сутки каждой недели в течение 3 недель (всего 6 инъекций).MC-38 cancer cells (colon adenocarcinoma cells) are injected subcutaneously into humanized B-hOX40 mice. When tumors in mice reach a volume of 150±50 mm ³ , mice are randomly assigned to different groups based on tumor volume. Mice are then injected with human IgG (control) and humanized antibodies 9A4, 5C1 and 5D10 by intraperitoneal injection at either 3 mg/kg or 1 mg/kg. The antibody is administered on the first day and the fourth day of each week for 3 weeks (6 injections in total).

Мониторинг массы мышей проводят в ходе всего периода введения. Ожидается, что не будет наблюдаться значимых отличий в массе в контрольной группе и группе введения антитела против hOX40, и что гуманизированные антитела 9A4, 5C1 и 5D10 могут ингибировать рост опухоли у мышей.Monitoring of the weight of mice is carried out during the entire period of administration. It is expected that there will be no significant difference in weight between the control group and the anti-hOX40 antibody administration group, and that the humanized antibodies 9A4, 5C1 and 5D10 can inhibit tumor growth in mice.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯOTHER IMPLEMENTATION OPTIONS

Следует понимать, что, хотя изобретение описано применительно к его подробному описанию, приведенное выше описание предназначено для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем прилагаемой ниже формулы изобретения.It should be understood that while the invention has been described with reference to its detailed description, the foregoing description is intended to illustrate, but not to limit, the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages and modifications are within the scope of the following claims.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST

<110> ЮКЬЮР (БЭЙЦЗИН) БАЙОФАРМА КО., ЛТД<110> YUKYUR (BEJING) BIOPHARMA CO., LTD

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ OX40 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ<120> ANTIBODIES AGAINST OX40 AND THEIR USES

<130> 20171124<130> 20171124

<160> 86<160> 86

<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<400> 1<400> 1

Ser Tyr Gly Val Leu Ser Tyr Gly Val Leu

1 5 fifteen

<210> 2<210> 2

<211> 16<211> 16

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 2<400> 2

Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 3<210> 3

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 3<400> 3

Glu Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Phe Gly Tyr

1 5 fifteen

<210> 4<210> 4

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 4<400> 4

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn

1 5 10 1 5 10

<210> 5<210> 5

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 5<400> 5

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5 fifteen

<210> 6<210> 6

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 6<400> 6

Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp Thr Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 7<210> 7

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 7<400> 7

Asp Tyr Asn Met Asp Asp Tyr Asn Met Asp

1 5 fifteen

<210> 8<210> 8

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 8<400> 8

Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly gly

<210> 9<210> 9

<211> 12<211> 12

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 9<400> 9

Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 10<210> 10

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 10<400> 10

Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser

1 5 10 1 5 10

<210> 11<210> 11

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 11<400> 11

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 12<210> 12

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 12<400> 12

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 13<210> 13

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 13<400> 13

Ser Tyr Trp Met His Ser Tyr Trp Met His

1 5 fifteen

<210> 14<210> 14

<211> 17<211> 17

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 14<400> 14

Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Asn Asn Gln Lys Phe Lys Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Asn Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly gly

<210> 15<210> 15

<211> 13<211> 13

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 15<400> 15

Phe Tyr Tyr Arg Tyr Glu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Phe Tyr Tyr Arg Tyr Glu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 16<210> 16

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 16<400> 16

Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10 1 5 10

<210> 17<210> 17

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 17<400> 17

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 18<210> 18

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 18<400> 18

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr

1 5 fifteen

<210> 19<210> 19

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 19<400> 19

Ser Tyr Gly Val His Ser Tyr Gly Val His

1 5 fifteen

<210> 20<210> 20

<211> 16<211> 16

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 20<400> 20

Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

<210> 21<210> 21

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 21<400> 21

Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 22<210> 22

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 22<400> 22

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Leu Asn

1 5 10 1 5 10

<210> 23<210> 23

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 23<400> 23

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5 fifteen

<210> 24<210> 24

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 24<400> 24

Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 25<210> 25

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 25<400> 25

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val Leu Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val Leu

1 5 10 1 5 10

<210> 26<210> 26

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 26<400> 26

Trp Ser Gly Gly Ser Trp Ser Gly Gly Ser

1 5 fifteen

<210> 27<210> 27

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 27<400> 27

Glu Glu Phe Gly Tyr Glu Glu Phe Gly Tyr

1 5 fifteen

<210> 28<210> 28

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 28<400> 28

1 5 10 1 5 10

<210> 29<210> 29

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 29<400> 29

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5 fifteen

<210> 30<210> 30

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 30<400> 30

Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp Thr Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 31<210> 31

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 31<400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp

1 5 10 1 5 10

<210> 32<210> 32

<211> 6<211> 6

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 32<400> 32

Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Asn Pro Asn Tyr Asp Ser

1 5 fifteen

<210> 33<210> 33

<211> 12<211> 12

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 33<400> 33

1 5 10 1 5 10

<210> 34<210> 34

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 34<400> 34

1 5 10 1 5 10

<210> 35<210> 35

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 35<400> 35

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 36<210> 36

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 36<400> 36

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 37<210> 37

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 37<400> 37

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5 10 1 5 10

<210> 38<210> 38

<211> 6<211> 6

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 38<400> 38

Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Tyr Pro Gly Asn Ser Asp

1 5 fifteen

<210> 39<210> 39

<211> 13<211> 13

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 39<400> 39

1 5 10 1 5 10

<210> 40<210> 40

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 40<400> 40

1 5 10 1 5 10

<210> 41<210> 41

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 41<400> 41

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 42<210> 42

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 42<400> 42

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr

1 5 fifteen

<210> 43<210> 43

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 43<400> 43

Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His

1 5 10 1 5 10

<210> 44<210> 44

<211> 5<211> 5

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 44<400> 44

Trp Ala Gly Gly Asn Trp Ala Gly Gly Asn

1 5 fifteen

<210> 45<210> 45

<211> 10<211> 10

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 45<400> 45

Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 46<210> 46

<211> 11<211> 11

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 46<400> 46

1 5 10 1 5 10

<210> 47<210> 47

<211> 7<211> 7

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 47<400> 47

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5 fifteen

<210> 48<210> 48

<211> 9<211> 9

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 48<400> 48

Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 49<210> 49

<211> 277<211> 277

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Человек<213> Human

<400> 49<400> 49

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30 20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45 35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60 50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95 85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110 100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125 115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140 130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175 165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190 180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205 195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220 210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255 245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270 260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile Thr Leu Ala Lys Ile

275 275

<210> 50<210> 50

<211> 272<211> 272

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Мышь<213> Mouse

<400> 50<400> 50

Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu Met Tyr Val Trp Val Gln Gln Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr Thr Leu Gly Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr

20 25 30 20 25 30

Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Pro Ser Gly His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met

35 40 45 35 40 45

Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu Val Ser Arg Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu

50 55 60 50 55 60

Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gly Phe Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys

65 70 75 80 65 70 75 80

Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Thr Gln Cys Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr

85 90 95 85 90 95

Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Pro Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg

100 105 110 100 105 110

Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gln Asp Ser Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro

115 120 125 115 120 125

Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn

130 135 140 130 135 140

Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Asp Ala Val Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu

165 170 175 165 170 175

Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val Thr Gln Arg Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val

180 185 190 180 185 190

Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Trp Pro Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro

195 200 205 195 200 205

Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu Glu Gly Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu

210 215 220 210 215 220

Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp Ala Pro Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp

225 230 235 240 225 230 235 240

Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr Arg Leu Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr

245 250 255 245 250 255

Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile Pro Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile

260 265 270 260 265 270

<210> 51<210> 51

<211> 277<211> 277

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<213> Обезьяна<213> Monkey

<400> 51<400> 51

1 5 10 15 1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val

20 25 30 20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro

35 40 45 35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60 50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95 85 90 95

Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro

165 170 175 165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190 180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205 195 200 205

Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala

210 215 220 210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly

245 250 255 245 250 255

260 265 270 260 265 270

Ala Leu Ala Lys Ile Ala Leu Ala Lys Ile

275 275

<210> 52<210> 52

<211> 270<211> 270

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 52<400> 52

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met

35 40 45 35 40 45

Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly

50 55 60 50 55 60

Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys

65 70 75 80 65 70 75 80

Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr

85 90 95 85 90 95

Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu

100 105 110 100 105 110

Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His

115 120 125 115 120 125

Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr

130 135 140 130 135 140

Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala

145 150 155 160 145 150 155 160

Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln

165 170 175 165 170 175

Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro

180 185 190 180 185 190

Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly Arg Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly

195 200 205 195 200 205

Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu Ala Pro Pro Ala Phe Ala Val Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Leu Ala Pro

210 215 220 210 215 220

Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp Arg Leu Leu Thr Val Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Lys Ala Trp Arg Leu

225 230 235 240 225 230 235 240

Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr Pro Ile Pro Asn Thr Pro Lys Pro Cys Trp Gly Asn Ser Phe Arg Thr Pro Ile

245 250 255 245 250 255

Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile Gln Glu Glu His Thr Asp Ala His Phe Thr Leu Ala Lys Ile

260 265 270 260 265 270

<210> 53<210> 53

<211> 113<211> 113

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 53<400> 53

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Val Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Val Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ala Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Phe Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Phe

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Arg Glu Glu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Glu Glu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110 100 105 110

Ser Ser

<210> 54<210> 54

<211> 113<211> 113

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 54<400> 54

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Phe Ser Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr Phe

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ser Ser

<210> 55<210> 55

<211> 113<211> 113

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 55<400> 55

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Gly Val Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45 35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Gly Val Ile Trp Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ser Ser

<210> 56<210> 56

<211> 108<211> 108

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 56<400> 56

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg

100 105 100 105

<210> 57<210> 57

<211> 108<211> 108

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 57<400> 57

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 58<210> 58

<211> 108<211> 108

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 58<400> 58

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 59<210> 59

<211> 121<211> 121

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 59<400> 59

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 60<210> 60

<211> 121<211> 121

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 60<400> 60

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 61<210> 61

<211> 121<211> 121

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 61<400> 61

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 62<210> 62

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 62<400> 62

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr

20 25 30 20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Glu Asp Phe Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 63<210> 63

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 63<400> 63

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 64<210> 64

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 64<400> 64

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 65<210> 65

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 65<400> 65

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 66<210> 66

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 66<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Trp Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Asn Asn Gln Lys Phe Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Asn Asn Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Val Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Val Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Thr Phe Tyr Tyr Arg Tyr Glu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Thr Thr Phe Tyr Tyr Arg Tyr Glu Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 67<210> 67

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 67<400> 67

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 68<210> 68

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 68<400> 68

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 69<210> 69

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 69<400> 69

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ser Ala

20 25 30 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 70<210> 70

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 70<400> 70

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 71<210> 71

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 71<400> 71

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 72<210> 72

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 72<400> 72

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 73<210> 73

<211> 118<211> 118

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 73<400> 73

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

Ser Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Tyr Asp Gly Tyr Tyr Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Val Leu Val Thr Val Ser Val

115 115

<210> 74<210> 74

<211> 118<211> 118

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 74<400> 74

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Val Leu Val Thr Val Ser Val

115 115

<210> 75<210> 75

<211> 118<211> 118

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 75<400> 75

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Asn Cys Ala Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Asn Cys Ala

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Val Leu Val Thr Val Ser Val

115 115

<210> 76<210> 76

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 76<400> 76

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 77<210> 77

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 77<400> 77

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 78<210> 78

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 78<400> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Trp

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 79<210> 79

<211> 113<211> 113

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 79<400> 79

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Gly Val Leu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Leu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Ala Ala

<210> 80<210> 80

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 80<400> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 81<210> 81

<211> 121<211> 121

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 81<400> 81

Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 82<210> 82

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 82<400> 82

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr

20 25 30 20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 83<210> 83

<211> 122<211> 122

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 83<400> 83

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 115 120

<210> 84<210> 84

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 84<400> 84

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 85<210> 85

<211> 118<211> 118

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 85<400> 85

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80 65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Asn Cys Ala Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Asn Cys Ala

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Val Leu Val Thr Val Ser Val

115 115

<210> 86<210> 86

<211> 107<211> 107

<212> БЕЛОК<212> PROTEIN

<400> 86<400> 86

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Tyr Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<---<---

Claims

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с OX40 (представитель 4 суперсемейства рецепторов TNF), содержащий:1. An antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to OX40 (a member of the 4th TNF receptor superfamily), containing:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1, 2 и 3, где область CDR1 VH содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VH, область CDR2 VH содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VH, и область CDR3 VH содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3; иa heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, and 3, wherein the CDR1 VH region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the CDR1 VH, the CDR2 VH region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of CDR2 VH and CDR3 region The VH contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the VH CDR3; and

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область CDR1 VL содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR1 VL, область CDR2 VL содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR2 VL, и область CDR3 VL содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности CDR3 VL,a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the CDR1 VL region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the CDR1 VL, the CDR2 VL region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the CDR2 VL, and the CDR3 region VL contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of CDR3 VL,

где выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 VH и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2 и 3 VL являются одними из следующих:where the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2 and 3 and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2 and 3 are one of the following:

(1) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:4, 5, 6, соответственно;(1) the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VH are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, respectively, and the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VL are listed in SEQ ID NO: 4, 5, 6, respectively;

(2) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:25, 26, 27, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:28, 29, 30, соответственно;(2) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 25, 26, 27, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 28, 29, 30, respectively;

(3) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:10, 11, 12, соответственно;(3) selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 7, 8, 9, respectively, and selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 10, 11, 12, respectively;

(4) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:31, 32, 33, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:34, 35, 36, соответственно;(4) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 31, 32, 33, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 34, 35, 36, respectively;

(5) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:13, 14, 15, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:16, 17, 18, соответственно;(5) the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VH are shown in SEQ ID NOS: 13, 14, 15, respectively, and the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VL are listed in SEQ ID NOS: 16, 17, 18, respectively;

(6) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:37, 38, 39, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:40, 41, 42, соответственно;(6) the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VH are shown in SEQ ID NOs: 37, 38, 39, respectively, and the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VL are shown in SEQ ID NO: 40, 41, 42, respectively;

(7) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:19, 20, 21, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:22, 23, 24, соответственно; и(7) the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VH are shown in SEQ ID NOS: 19, 20, 21, respectively, and the selected amino acid sequences of CDR 1, 2, 3 VL are listed in SEQ ID NOS: 22, 23, 24, respectively; and

(8) выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VH указаны в SEQ ID NO:43, 44, 45, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности CDR 1, 2, 3 VL указаны в SEQ ID NO:46, 47, 48, соответственно.(8) selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 43, 44, 45, respectively, and selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 46, 47, 48, respectively.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где 2. An antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно, VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively,

где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены в соответствии с нумерацией Kabat.where VH CDR 1, 2, 3 and VL CDR 1, 2, 3 are defined according to Kabat numbering.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где3. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively,

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где4. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively,

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где5. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:19, 20 и 21, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 19, 20 and 21, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:22, 23 и 24, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 23 and 24, respectively,

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где6. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:25, 26 и 27, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 25, 26 and 27, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:28, 29 и 30, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 28, 29 and 30, respectively,

где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены в соответствии с нумерацией Chothia.where VH CDR 1, 2, 3 and VL CDR 1, 2, 3 are defined according to Chothia numbering.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где7. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:31, 32 и 33, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 31, 32 and 33, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:34, 35 и 36, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with amino acid sequences of SEQ ID NOs: 34, 35 and 36, respectively,

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где8. The antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:37, 38 и 39, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 37, 38 and 39, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:40, 41 и 42, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 40, 41 and 42, respectively,

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где9. An antibody or antigen-binding fragment according to claim 1, where

VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:43, 44 и 45, соответственно, иVH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 43, 44 and 45, respectively, and

VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO:46, 47 и 48, соответственно,VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 46, 47 and 48, respectively,

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-9, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с OX40 человека.10. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-9, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human OX40.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-10, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.11. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-11, которое отличается тем, что антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).12. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 11, wherein the antigen-binding fragment is a single chain variable fragment (scFV).

13. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-12 для получения биспецифического антитела.13. The use of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1 to 12 to obtain a bispecific antibody.

14. Нуклеиновая кислота для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где нуклеиновая кислота кодирует:14. Nucleic acid for producing an antibody or its antigen-binding fragment, where the nucleic acid encodes:

(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащую VH CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно, и(1) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising VH CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and

где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:56, 57, 58 или 80, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40;where VH, when paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:56, 57, 58 or 80, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40;

(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно, и(2) an immunoglobulin light chain or fragment thereof comprising a VL comprising CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively, and

где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:53, 54, 55 или 79, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40;where VL, when paired with a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:53, 54, 55 or 79, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40;

(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащую VH CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно, и(3) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising VH CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and

где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:62, 63, 64, 65 или 82, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40; илиwhere VH, when paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:62, 63, 64, 65, or 82, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or its an antigen-binding fragment can bind OX40; or

(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно, и(4) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 10, 11 and 12, respectively, and

где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:59, 60, 61 или 81, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40;where VL, when paired with a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:59, 60, 61 or 81, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40;

(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно, и(5) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively, and

где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:69, 70, 71, 72 или 84, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40;where VH, when paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:69, 70, 71, 72 or 84, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or its an antigen-binding fragment can bind OX40;

(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно, и(6) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 16, 17 and 18, respectively, and

где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:66, 67, 68 или 83, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40;where VL, when paired with a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:66, 67, 68 or 83, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40;

(7) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащую VH CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:19, 20 и 21, соответственно, и(7) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising VH CDRs 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 19, 20 and 21, respectively, and

где VH, когда она находится в паре с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:76, 77, 78 или 86, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40; илиwhere VH, when paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO:76, 77, 78 or 86, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40; or

(8) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:22, 23 и 24, соответственно, и(8) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 22, 23 and 24, respectively, and

где VL, когда она находится в паре с VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:73, 74, 75 или 85, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40.where VL, when paired with a VH containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, 74, 75 or 85, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40.

15. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2 и 3, соответственно.15. The nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively.

16. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, 5 и 6, соответственно.16. Nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively.

17. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9, соответственно.17. Nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively.

18. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12, соответственно.18. The nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively.

19. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14 и 15, соответственно.19. The nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13, 14 and 15, respectively.

20. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18, соответственно.20. Nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16, 17 and 18, respectively.

21. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:19, 20 и 21, соответственно.21. Nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 19, 20 and 21, respectively.

22. Нуклеиновая кислота по п.14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:22, 23 и 24, соответственно.22. Nucleic acid according to claim 14, where the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 23 and 24, respectively.

23. Нуклеиновая кислота по любому из пп.14-22, где23. Nucleic acid according to any one of claims 14-22, where

VH, когда она в паре с VL, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может специфически связывается с OX40 человека, илиVH, when paired with VL, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to human OX40, or

VL, когда она в паре с VH, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может специфически связываться с OX40 человека.VL, when paired with VH, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof can specifically bind to human OX40.

24. Нуклеиновая кислота по любому из пп.14-23, где тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляет собой гуманизированную тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, и легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляет собой гуманизированную легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент.24. The nucleic acid of any one of claims 14 to 23, wherein the immunoglobulin heavy chain or fragment thereof is a humanized antibody heavy chain or fragment thereof and the immunoglobulin light chain or fragment thereof is a humanized immunoglobulin light chain or fragment thereof.

25. Нуклеиновая кислота по любому из пп.14-24, где нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).25. A nucleic acid according to any one of claims 14-24, wherein the nucleic acid encodes a single chain variable fragment (scFv).

26. Нуклеиновая кислота по любому из пп.14-25, где нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.26. A nucleic acid according to any one of claims 14-25, wherein the nucleic acid is cDNA.

27. Вектор экспрессии, содержащий одну или несколько нуклеиновых кислот по любому из пп.14-26.27. An expression vector containing one or more nucleic acids according to any one of claims 14-26.

28. Вектор экспрессии, содержащий две из нуклеиновых кислот по любому из пп.14-26, где две нуклеиновые кислоты кодируют область VL и область VH, образуя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее VH область и VL область, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40.28. An expression vector containing two of the nucleic acids according to any one of claims 14-26, where the two nucleic acids encode a VL region and a VH region, forming an antibody or antigen-binding fragment containing a VH region and a VL region, where the antibody or its antigen-binding fragment can bind OX40.

29. Пара векторов для экспрессии анти-OX40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента,29. A pair of vectors for the expression of an anti-OX40 antibody or its antigen-binding fragment,

где каждый вектор экспрессии содержит одну из нуклеиновых кислот по любому из пп.14-26,where each expression vector contains one of the nucleic acids according to any one of claims 14-26,

где нуклеиновые кислоты кодируют область VL и область VH, образуя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее область VH и область VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40.where nucleic acids encode a VL region and a VH region, forming an antibody or antigen-binding fragment containing a VH region and a VL region, where the antibody or antigen-binding fragment can bind OX40.

30. Клетка для экспрессии анти-OX40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая вектор экспрессии по п.27 или 28 или пару векторов экспрессии по п.29.30. A cell for expressing an anti-OX40 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising an expression vector according to claim 27 or 28 or a pair of expression vectors according to claim 29.

31. Клетка по п.30, где клетка представляет собой клетку CHO.31. The cell of claim 30, wherein the cell is a CHO cell.

32. Клетка для экспрессии анти-ОХ40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая одну или несколько нуклеиновых кислот по любому из пп.14-26.32. A cell for expressing an anti-OX40 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising one or more nucleic acids according to any one of claims 14-26.

33. Клетка для экспрессии анти-ОХ40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая две из нуклеиновых кислот по любому из пп.14-26.33. A cell for expressing an anti-OX40 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising two of the nucleic acids according to any one of claims 14-26.

34. Клетка по п.33, где две нуклеиновые кислоты вместе кодируют область VL и область VH, образуя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее область VH и область VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может связывать OX40.34. The cell of claim 33, wherein the two nucleic acids together encode a VL region and a VH region to form an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a VH region and a VL region, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof can bind OX40.

35. Способ получения анти-OX40 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, где способ включает35. A method for producing an anti-OX40 antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the method includes

(a) культивирование клетки по любому из пп.30-34 в условиях, достаточных для продуцирования клеткой антитела или антигенсвязывающего фрагмента; и(a) culturing the cell according to any one of claims 30 to 34 under conditions sufficient for the cell to produce an antibody or antigen-binding fragment; and

(b) сбор антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцированного клеткой.(b) collecting the antibody or antigen-binding fragment produced by the cell.

36. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с OX40, содержащее36. Antibody or its antigen-binding fragment that binds to OX40, containing

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одну из следующих:a heavy chain variable region (VH) containing an amino acid sequence that is identical to the selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) containing an amino acid sequence that is identical to the selected VL sequence, where the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following :

(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:53, 54, 55 или 79, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:56, 57, 58 или 80;(1) the selected VH sequence is SEQ ID NO:53, 54, 55, or 79 and the selected VL sequence is SEQ ID NO:56, 57, 58, or 80;

(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:59, 60, 61 или 81, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:62, 63, 64, 65 или 82;(2) the selected VH sequence is SEQ ID NO:59, 60, 61 or 81 and the selected VL sequence is SEQ ID NO:62, 63, 64, 65 or 82;

(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:66, 67, 68 или 83, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:69, 70, 71, 72 или 84; и(3) the selected VH sequence is SEQ ID NO:66, 67, 68, or 83 and the selected VL sequence is SEQ ID NO:69, 70, 71, 72, or 84; and

(4) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO:73, 74, 75 или 85, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO:76, 77, 78 или 86.(4) the selected VH sequence is SEQ ID NO:73, 74, 75, or 85, and the selected VL sequence is SEQ ID NO:76, 77, 78, or 86.

37. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:53 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:56.37. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:53 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:56.

38. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:53 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:57.38. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:53 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:57.

39. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:53 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:58.39. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:53 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:58.

40. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:54 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:56.40. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:54 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:56.

41. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:54 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:57.41. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:54 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:57.

42. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:54 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:58.42. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:54 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:58.

43. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:55 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:58.43. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:55 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:58.

44. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:55 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:56.44. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:55 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:56.

45. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:55 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:57.45. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:55 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:57.

46. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:59 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:62.46. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:59 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:62.

47. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:59 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:63.47. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:59 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:63.

48. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:66 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:70.48. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:66 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:70.

49. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:67 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:70.49. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:67 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:70.

50. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:73 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:76.50. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:73 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:76.

51. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.36, где VH содержит последовательность SEQ ID NO:73 и VL содержит последовательность SEQ ID NO:77.51. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 36, wherein VH contains the sequence of SEQ ID NO:73 and VL contains the sequence of SEQ ID NO:77.

52. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.36-51, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с OX40 человека. 52. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 36-51, wherein the antibody or antigen-binding fragment specifically binds to human OX40.

53. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.36-52, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.53. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 36-52, wherein the antibody or antigen-binding fragment is a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof.

54. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.36-53, отличающееся тем, что антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).54. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 36-53, characterized in that the antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFv).

55. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.36-54 для получения биспецифического антитела.55. The use of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 36-54 to obtain a bispecific antibody.

56. Конъюгат антитело-лекарственное средство для повышения иммунного ответа, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-12 и 36-54, ковалентно связанное с терапевтическим средством.56. An antibody-drug conjugate for enhancing an immune response, comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 and 36-54 covalently linked to a therapeutic agent.

57. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п.56, где терапевтическое средство представляет собой цитотоксическое или цитостатическое средство.57. The antibody-drug conjugate of claim 56, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

58. Способ лечения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, где способ включает введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-12 и 36-54 или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.56 или 57, индивидууму.58. A method of treating a subject having cancer, wherein the method comprises administering a therapeutically effective amount of a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 and 36-54 or an antibody-drug conjugate according to claim 56 or 57, individual.

59. Способ по п.58, где индивидуум имеет солидную опухоль, нерезектабельную меланому или метастазирующую меланому, рак молочной железы, карциноидную опухоль, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легкого, лимфому, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак почки, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак уретры, гематологическую злокачественную опухоль, немелкоклеточную карциному легких (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастазирующий рефрактерный к гормонам рак предстательной железы, плоскоклеточную карциному головы и шеи (SCCHN), почечноклеточный рак (RCC), тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC), саркому или карциному ободочной и прямой кишки.59. The method of claim 58, wherein the individual has a solid tumor, unresectable or metastatic melanoma, breast cancer, carcinoid tumor, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, melanoma , ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, kidney cancer, colorectal cancer, gastric cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, hematologic malignancy, non-small cell lung carcinoma (NSCLC), small cell lung cancer (SCLC), bladder cancer or metastatic hormone-refractory prostate cancer, head and neck squamous cell carcinoma (SCCHN), renal cell carcinoma (RCC), triple negative breast cancer (TNBC), sarcoma or carcinoma of the colon and rectum.

60. Способ снижения скорости роста опухоли, где способ включает60. A method for reducing a tumor growth rate, wherein the method comprises

приведение опухолевой клетки в контакт с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-12 и 36-54, или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.56 или 57.contacting the tumor cell with an effective amount of a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 and 36-54, or an antibody-drug conjugate according to claim 56 or 57.

61. Способ уничтожения опухолевой клетки, где способ включает61. A method for killing a tumor cell, wherein the method includes

62. Фармацевтическая композиция для повышения иммунного ответа, содержащая эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-12 и 36-54 и фармацевтически приемлемый носитель.62. A pharmaceutical composition for enhancing an immune response, comprising an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-12 and 36-54 and a pharmaceutically acceptable carrier.

63. Фармацевтическая композиция для повышения иммунного ответа, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по п.56 или 57 и фармацевтически приемлемый носитель.63. A pharmaceutical composition for enhancing an immune response, comprising the antibody-drug conjugate of claim 56 or 57 and a pharmaceutically acceptable carrier.

64. Анти-OX40 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR 1, 2, 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR 1, 2, 3, где64. An anti-OX40 antibody or antigen-binding fragment thereof, containing a heavy chain variable region containing VH CDR 1, 2, 3, and a light chain variable region containing VL CDR 1, 2, 3, where

(1) VH CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:53, 54, 55 или 79, и VL CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:56, 57, 58 или 80;(1) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NOs: 53, 54, 55, or 79, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NOs: 56, 57, 58, or 80;

(2) VH CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:59, 60, 61 или 81, и VL CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:62, 63, 64, 65 или 82;(2) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NOs: 59, 60, 61, or 81, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NOs: 62, 63, 64, 65, or 82;

(3) VH CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:66, 67, 68 или 83, и VL CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:69, 70, 71, 72 или 84; или(3) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NO:66, 67, 68, or 83, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NO:69, 70, 71, 72, or 84; or

(4) VH CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:73, 74, 75 или 85, и VL CDR 1, 2, 3 идентичны CDR в SEQ ID NO:76, 77, 78 или 86.(4) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NOs: 73, 74, 75, or 85, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to the CDRs in SEQ ID NOs: 76, 77, 78, or 86.