RU2779312C2

RU2779312C2 - Antibodies against ctla4 and their use

Info

Publication number: RU2779312C2
Application number: RU2020111428A
Authority: RU
Inventors: И Ян; Янань ГО; Сяодун ЧЭН; Юньюнь ЧЭНЬ; Цзиншу СЕ; Чуньянь ДУН; Фан ЯН; Чэнюань ЛУ; Юэлэй ШЭНЬ; Цзянь НИ
Original assignee: Юкьюр (Бэйцзин) Байофарма Ко., Лтд
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2022-09-06

Abstract

FIELD: biochemistry.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biochemistry, in particular to an antibody or its antigen-binding fragment, which specifically bind to CTLA4, its production method, as well as to a composition and a conjugate containing it. Nucleic acid encoding the above-mentioned antibody or its fragment is also presented, as well as a vector and a cell containing it. The invention also relates to the use of the above-mentioned antibody or its fragment for the production of a bispecific antibody.

EFFECT: invention is effective for the treatment of a malignant neoplasm.

60 cl, 27 dwg, 6 tbl, 9 ex

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИFIELD OF TECHNOLOGY

Настоящее раскрытие относится к антителам против белка 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4 или CTLA-4), и к их применениям.The present disclosure relates to antibodies against cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4 or CTLA-4) and their uses.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Онкологическое заболевание в настоящее время является одним из заболеваний, которые имеют самую высокую смертность среди людей. Согласно статистическим данным Всемирной организации здравоохранения в 2012 году число случаев заболеваемости онкологическими заболеваниями и смертности в мире достигло 14 миллионов и 8,2 миллиона, соответственно. В Китае впервые диагностированных случаев онкологических заболеваний составило 3,07 миллионов, а число погибших - 2,2 миллиона.Cancer is currently one of the diseases that have the highest mortality among humans. According to statistics from the World Health Organization in 2012, the number of cases of cancer incidence and mortality in the world reached 14 million and 8.2 million, respectively. In China, there were 3.07 million newly diagnosed cases of cancer and 2.2 million deaths.

Недавний клинический и коммерческий успех противоопухолевых антител вызвал большой интерес к терапии на основе антител. Существует необходимость в разработке противоопухолевых антител для использования в различных терапевтических средствах на основе антител для лечения онкологических заболеваний.The recent clinical and commercial success of anti-tumor antibodies has generated a great deal of interest in antibody-based therapies. There is a need to develop anti-tumor antibodies for use in various antibody-based therapeutics for the treatment of cancer.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее раскрытие относится к антителам против CTLA4, их антигенсвязывающему фрагменту и их применению.The present disclosure relates to anti-CTLA4 antibodies, their antigen-binding fragment, and their use.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с белком 4, ассоциированным с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA4), содержащим: вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, где область VH CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область VH CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, а область VH CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область VL CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область VL CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR2, и область VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3,In one aspect, the disclosure relates to an antibody, or antigen-binding fragment thereof, that binds to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4) comprising: heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3, where the CDR1 VH region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 VH region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected VH CDR2 amino acid sequence, and the region VH CDR3 contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected amino acid sequence of VH CDR3; and a light chain variable region (VL) containing CDRs 1, 2 and 3, where the VL CDR1 region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected amino acid sequence of the VL CDR1, the VL CDR2 region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected VL CDR2 amino acid sequence, and the VL CDR3 region contains an amino acid sequence that is at least 80% identical to the selected VL CDR3 amino acid sequence,

где выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2 и 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2 и 3 представляют собой одну из следующих: where the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2 and 3 and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2 and 3 are one of the following:

(1) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 1, 2, 3, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 4, 5, 6, соответственно;(1) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 4, 5, 6, respectively;

(2) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 10,11, 12, соответственно;(2) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 7, 8, 9, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 10,11, 12, respectively;

(3) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 45, 46, 47, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 48, 49, 50, соответственно;(3) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 45, 46, 47, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 48, 49, 50, respectively;

(4) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 51, 52, 53, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 54, 55, 56, соответственно.(4) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 51, 52, 53, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 54, 55, 56, respectively.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.In some embodiments, the VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively, and the VL contains CDR 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4 , 5 and 6, respectively.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно.In some embodiments, the VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7, 8 and 9, respectively, and the VL contains CDR 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10 , 11 and 12, respectively.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CTLA4. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).In some embodiments, the antibody, or antigen-binding fragment thereof, specifically binds to human CTLA4. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a humanized antibody or antigen-binding fragment thereof. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is a single chain variable fragment (scFV).

В одном аспекте раскрытие относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий:In one aspect, the disclosure relates to a nucleic acid containing a polynucleotide encoding a polypeptide containing:

(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, и 3, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70, связывается с CTLA4;(1) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 , respectively, and where VH, pairing with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, 19, 20 or 70, binds to CTLA4;

(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, связывается с CTLA4;(2) an immunoglobulin light chain or fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively, and where the VL is paired with a VH containing the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 or 69 binds to CTLA4;

(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72, связывается с CTLA4; или(3) an immunoglobulin heavy chain, or fragment thereof, comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively, and where VH, mating with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 or 72, binds to CTLA4; or

(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 10,11 и 12, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, связывается с CTLA4;(4) an immunoglobulin light chain or fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10,11 and 12, respectively, and where the VL is paired with a VH containing the amino acid sequence presented in SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 or 71 binds to CTLA4;

(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 45, 46 и 47, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, связывается с CTLA4;(5) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 45, 46, and 47, respectively, and where VH, mating with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 74, binds to CTLA4;

(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 73, связывается с CTLA4;(6) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2, and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 48, 49, and 50, respectively, and where VL, pairing with a VH, containing the amino acid sequence , shown in SEQ ID NO: 73, binds to CTLA4;

(7) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 51, 52 и 53, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, связывается с CTLA4;(7) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 51, 52, and 53, respectively, and where VH, mating with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, binds to CTLA4;

(8) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 54, 55 и 56, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 75, связывается с CTLA4.(8) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2, and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 54, 55, and 56, respectively, and where VL, pairing with a VH, containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 75 binds to CTLA4.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2, и 3, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding an immunoglobulin heavy chain-containing polypeptide or fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2, and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, respectively.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5, и 6, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin light chain or a fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащий VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7, 8, и 9, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 10,11, и 12, соответственно.In some embodiments, the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an immunoglobulin light chain or fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2, and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10,11, and 12, respectively.

В некоторых вариантах осуществления VH, спариваясь с VL, специфически связывается с человеческим CTLA4. В некоторых вариантах осуществления VL, спариваясь с VH, специфически связывается с человеческим CTLA4.In some embodiments, the VH, by mating with the VL, specifically binds to human CTLA4. In some embodiments, the VL, by mating with the VH, specifically binds to human CTLA4.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, и легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляет собой гуманизированную легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент.In some embodiments, the immunoglobulin heavy chain, or fragment thereof, is a humanized immunoglobulin heavy chain, or fragment thereof, and the immunoglobulin light chain, or fragment thereof, is a humanized immunoglobulin light chain, or fragment thereof.

В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой кДНК.In some embodiments, the nucleic acid encodes a single chain variable fragment (scFv). In some embodiments, the nucleic acid is cDNA.

В другом аспекте раскрытие также относится к вектору, содержащему одну или более нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления вектор кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CTLA4.In another aspect, the disclosure also relates to a vector containing one or more nucleic acids as described herein. In some embodiments, the vector encodes a VL region and a VH region that together bind to CTLA4.

В одном аспекте раскрытие относится к паре векторов, где каждый вектор содержит одну из нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе, где вместе пара векторов кодирует область VL и область VH, которые вместе связываются с CTLA4.In one aspect, the disclosure relates to a pair of vectors, where each vector contains one of the nucleic acids as described herein, where together the pair of vectors encode a VL region and a VH region, which together bind to CTLA4.

В одном аспекте раскрытие относится к клетке, содержащей вектор, как описано в настоящем документе, или пару векторов, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку CHO.In one aspect, the disclosure relates to a cell containing a vector as described herein or a pair of vectors as described herein. In some embodiments, the cell is a CHO cell.

В другом аспекте раскрытие относится к клетке, содержащей одну или более нуклеиновых кислот, как описано в настоящем документе.In another aspect, the disclosure relates to a cell containing one or more nucleic acids, as described herein.

В одном аспекте раскрытие относится к клетке, содержащей две нуклеиновые кислоты, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты вместе кодируют область VL и область VH, которые вместе связываются с CTLA4.In one aspect, the disclosure relates to a cell containing two nucleic acids, as described herein. In some embodiments, the two nucleic acids together encode a VL region and a VH region that together bind to CTLA4.

В одном аспекте раскрытие также относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Способ включает стадии культивирования клетки, как описано в настоящем документе, в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент; и сбор антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцируемых клеткой.In one aspect, the disclosure also relates to a method for producing an antibody or antigen-binding fragment. The method includes the steps of culturing the cell, as described herein, under conditions sufficient for the cell to produce an antibody or antigen-binding fragment; and collecting an antibody or antigen-binding fragment produced by the cell.

В одном аспекте раскрытие относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с CTLA4, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одну из следующих:In one aspect, the disclosure relates to an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to CTLA4 containing a heavy chain variable region (VH) containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to a selected VH sequence and a light chain variable region (VL) , containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the selected VL sequence, where the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

(1) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70; (1) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, or 69, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 18, 19, 20, or 70;

(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72;(2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, or 71 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, or 72;

(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 74;(3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 73 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 74;

(4) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 75, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76.(4) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 75, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 76.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 13, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 14, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 19.In some embodiments, the VH contains the sequence SEQ ID NO: 13 and the VL contains the sequence SEQ ID NO: 19. In some embodiments, the VH contains the sequence SEQ ID NO: 14 and the VL contains the sequence SEQ ID NO: 19.

В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 21, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления VH содержит последовательность SEQ ID NO: 22, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25.In some embodiments, the VH contains the sequence SEQ ID NO: 21 and the VL contains the sequence SEQ ID NO: 25. In some embodiments, the VH contains the sequence SEQ ID NO: 22 and the VL contains the sequence SEQ ID NO: 25.

В одном аспекте изобретение также относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно или нековалентно связанные с терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления терапевтический агент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент (например, цитохалазин B, грамицидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацин, майтансиноиды, такие как DM-1 и DM-4, дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, пуромицин, эпирубицин и циклофосфамид и их аналоги).In one aspect, the invention also relates to an antibody-drug conjugate comprising an antibody, or antigen-binding fragment thereof, covalently or non-covalently linked to a therapeutic agent. In some embodiments, the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent (e.g., cytochalasin B, gramicidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracine, maytansinoids such as DM- 1 and DM-4, dione, mitoxantrone, mithramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin and cyclophosphamide and their analogs).

В одном аспекте раскрытие относится к способу лечения пациента, имеющего злокачественное новообразование. Способ включает стадии введения пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.In one aspect, the disclosure relates to a method of treating a patient having cancer. The method includes the steps of administering to a patient a therapeutically effective amount of a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment, as described herein, or an antibody-drug conjugate, as described herein.

В некоторых вариантах осуществления злокачественным новообразованием является меланома. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой неоперабельную меланому или метастатическую меланому.In some embodiments, the implementation of the malignant neoplasm is melanoma. In some embodiments, the cancer is inoperable melanoma or metastatic melanoma.

В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастатический гормонально рефрактерный рак предстательной железы.In some embodiments, the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC), small cell lung cancer (SCLC), bladder cancer, or metastatic hormone refractory prostate cancer.

В одном аспекте раскрытие также относится к способу уменьшения скорости роста опухоли. Способ включает стадии контакта опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе.In one aspect, the disclosure also relates to a method for reducing the rate of tumor growth. The method includes the steps of contacting the tumor cell with an effective amount of a composition containing an antibody or antigen-binding fragment as described herein.

В другом аспекте раскрытие относится к способу уничтожения опухолевой клетки, причем способ включает стадии контакта опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, или конъюгат антитело-лекарственное средство, как описано в настоящем документе.In another aspect, the disclosure relates to a method for killing a tumor cell, the method comprising the steps of contacting the tumor cell with an effective amount of a composition comprising an antibody or antigen-binding fragment as described herein or an antibody-drug conjugate as described herein.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.In one aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an antibody, or antigen-binding fragment thereof, as described herein, and a pharmaceutically acceptable carrier.

В другом аспекте раскрытие относится к фармацевтической композиции, содержащей конъюгат лекарственное средство-антитело, как описано в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.In another aspect, the disclosure relates to a pharmaceutical composition comprising a drug-antibody conjugate as described herein and a pharmaceutically acceptable carrier.

Используемый в настоящем описании термин «злокачественное новообразование» относится к клеткам, обладающим способностью к автономному росту. Примеры таких клеток включают клетки, имеющие аномальное состояние или состояние, характеризующееся быстро пролиферирующим ростом клеток. Термин должен включать злокачественные образования, например, опухоли; онкогенные процессы, метастатические ткани и злокачественно трансформированные клетки, ткани или органы, независимо от гистопатологического типа или стадии инвазивности. Также включены злокачественные новообразования различных систем органов, таких как дыхательная, сердечно-сосудистая, почечная, репродуктивная, гематологическая, неврологическая, печеночная, желудочно-кишечная и эндокринная системы; а также аденокарциномы, которые включают злокачественные новообразования, такие как большинство видов рака толстой кишки, почечно-клеточный рак, рак предстательной железы и/или тестикулярные опухоли, немелкоклеточный рак легкого и рак тонкой кишки. Злокачественное новообразование, которое «возникает естественным путем», включает любое злокачественное новообразование, которое не индуцируется экспериментально имплантацией раковых клеток индивидууму, и включает, например, самопроизвольно возникающее злокачественное новообразование, злокачественное новообразование, вызванное воздействием на пациента канцерогена(канцерогенов), злокачественное новообразование, возникающее в результате вставки трансгенного онкогена или нокаута гена-супрессора опухоли, и злокачественное новообразование, вызванное инфекциями, например, вирусными инфекциями. Термин «карцинома» известен в данной области и относится к злокачественным новообразованиям эпителиальных или эндокринных тканей. Термин также включает карциносаркомы, которые включают злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. «Аденокарцинома» относится к карциноме, происходящей из железистой ткани или в которой опухолевые клетки образуют узнаваемые железистые структуры. Термин «саркома» известен в данной области и относится к злокачественным опухолям мезенхимального происхождения. Термин «гематопоэтические неопластические расстройства» включает заболевания, связанные с гиперпластическими/неопластическими клетками гематопоэтического происхождения. Гематопоэтическое неопластическое расстройство может развиваться из миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий или их клеток-предшественников.Used in the present description, the term "malignant neoplasm" refers to cells with the ability to autonomous growth. Examples of such cells include cells having an abnormal condition or a condition characterized by rapidly proliferating cell growth. The term should include malignancies, such as tumors; oncogenic processes, metastatic tissues and malignantly transformed cells, tissues or organs, regardless of the histopathological type or stage of invasiveness. Also included are malignant neoplasms of various organ systems such as the respiratory, cardiovascular, renal, reproductive, hematological, neurological, hepatic, gastrointestinal, and endocrine systems; as well as adenocarcinomas, which include malignancies such as most colon cancers, renal cell carcinoma, prostate and/or testicular tumors, non-small cell lung cancer, and small intestine cancer. A malignancy that "occurs naturally" includes any malignancy that is not induced experimentally by implantation of cancer cells into an individual, and includes, for example, spontaneously occurring malignancy, malignancy induced by exposure of a patient to a carcinogen(s), malignancy arising as a result of the insertion of a transgenic oncogene or knockout of a tumor suppressor gene, and malignancy caused by infections, such as viral infections. The term "carcinoma" is known in the art and refers to malignant neoplasms of epithelial or endocrine tissues. The term also includes carcinosarcomas, which include malignant tumors composed of carcinomatous and sarcomatous tissues. "Adenocarcinoma" refers to a carcinoma derived from glandular tissue or in which tumor cells form recognizable glandular structures. The term "sarcoma" is known in the art and refers to malignant tumors of mesenchymal origin. The term "hematopoietic neoplastic disorders" includes diseases associated with hyperplastic/neoplastic cells of hematopoietic origin. Hematopoietic neoplastic disorder may develop from myeloid, lymphoid, or erythroid lines or their precursor cells.

Используемый в настоящем описании термин «антитело» относится к любой антигенсвязывающей молекуле, которая содержит по меньшей мере одну (например, одну, две, три, четыре, пять или шесть) область, определяющую комплементарность, (CDR), (например, любую из трех CDR из легкой цепи иммуноглобулина или любую из трех CDR из тяжелой цепи иммуноглобулина), и которая способна специфически связываться с эпитопом. Неограничивающие примеры антител включают: моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), одноцепочечные антитела, химерные антитела, человеческие антитела и гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело может содержать Fc-область человеческого антитела. Термин антитело также включает производные, например, биспецифичные антитела, одноцепочечные антитела, диатела, линейные антитела и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.As used herein, the term "antibody" refers to any antigen-binding molecule that contains at least one (e.g., one, two, three, four, five, or six) complementarity determining region (CDR) (e.g., any of the three an immunoglobulin light chain CDR or any of the three immunoglobulin heavy chain CDRs), and which is capable of specifically binding to an epitope. Non-limiting examples of antibodies include: monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, polyspecific antibodies (eg, bispecific antibodies), single chain antibodies, chimeric antibodies, human antibodies, and humanized antibodies. In some embodiments, the implementation of the antibody may contain the Fc region of a human antibody. The term antibody also includes derivatives such as bispecific antibodies, single chain antibodies, diabodies, linear antibodies, and polyspecific antibodies formed from antibody fragments.

Используемый в настоящем описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к части полноразмерного антитела, где часть антитела способна специфически связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере один вариабельный домен (например, вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи). Неограничивающие примеры фрагментов антител включают, например, Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv фрагменты.As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a portion of a full length antibody, where the portion of the antibody is capable of specifically binding to an antigen. In some embodiments, the antigen-binding fragment contains at least one variable domain (eg, a heavy chain variable domain or a light chain variable domain). Non-limiting examples of antibody fragments include, for example, Fab, Fab', F(ab') ₂ and Fv fragments.

Используемый в настоящем описании термин «человеческое антитело» относится к антителу, которое кодируется эндогенной нуклеиновой кислотой (например, перегруппированный человеческий локус тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина), присутствующий у человека. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело выделяют из тканей человека или продуцируют в культуре человеческих клеток (например, в гибридомных клетках человека). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в клетке, не являющейся человеческой (например, в клеточной линии мыши или хомяка). В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется в бактериальной или дрожжевой клетке. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело продуцируется у трансгенного животного, не являющегося человеком (например, крупного рогатого скота), содержащего неперегруппированный или перегруппированный локус иммуноглобулина человека (например, локус тяжелой или легкой цепи человеческого иммуноглобулина).As used herein, the term "human antibody" refers to an antibody that is encoded by an endogenous nucleic acid (eg, a rearranged human immunoglobulin heavy or light chain locus) present in a human. In some embodiments, the human antibody is isolated from human tissues or produced in human cell culture (eg, human hybridoma cells). In some embodiments, the human antibody is produced in a non-human cell (eg, a mouse or hamster cell line). In some embodiments, the human antibody is produced in a bacterial or yeast cell. In some embodiments, a human antibody is produced from a transgenic non-human animal (eg, bovine) containing an unrearranged or rearranged human immunoglobulin locus (eg, a human immunoglobulin heavy or light chain locus).

Используемый в настоящем описании термин «химерное антитело» относится к антителу, которое содержит последовательность, присутствующую по меньшей мере в двух разных антителах (например, антителах от двух разных видов млекопитающих, таких как антитело человека и мыши). Неограничивающим примером химерного антитела является антитело, содержащее последовательности вариабельного домена (например, полные или частичные последовательности вариабельного домена легкой цепи и/или тяжелой цепи) антитела, не являющегося человеческим (например, мышиного антитела, и константные домены человеческого антитела. Дополнительные примеры химерных антител описаны в настоящем документе и известны в данной области.As used herein, the term "chimeric antibody" refers to an antibody that contains a sequence present in at least two different antibodies (eg, antibodies from two different mammalian species, such as a human and a mouse antibody). A non-limiting example of a chimeric antibody is an antibody comprising the variable domain sequences (e.g., complete or partial light chain and/or heavy chain variable domain sequences) of a non-human antibody (e.g., a mouse antibody, and the constant domains of a human antibody. Additional examples of chimeric antibodies are described herein and are known in the art.

Используемый в настоящем описании термин «гуманизированное антитело» относится к антителу, не являющемуся человеческим, которое содержит минимальную последовательность, полученную из антитела, не являющегося человеческим (например, мыши) иммуноглобулина, и содержит последовательности, полученные из человеческого иммуноглобулина. В неограничивающих примерах гуманизированные антитела представляют собой антитела человека (антитело-реципиент), в которых остатки гипервариабельной (CDR) области антитела-реципиента заменены остатками гипервариабельной (CDR) области из антитела, не являющегося человеческим (например, донорного антитела), например, антитела мыши, крысы или кролика, имеющее желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых вариантах осуществления каркасные остатки Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками иммуноглобулина (например, мышиного), не являющегося человеческим. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации могут быть сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит по существу все, по меньшей мере, один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли (CDR) соответствуют доменам иммуноглобулина, не являющегося человеческим, (например, мышиного), и все или по существу все каркасные области являются каркасными областями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека. Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием методов молекулярной биологии, известных в данной области. Неограничивающие примеры способов получения гуманизированных антител описаны в настоящем документе.As used herein, the term "humanized antibody" refers to a non-human antibody that contains a minimal sequence derived from a non-human (eg, mouse) immunoglobulin antibody and contains sequences derived from human immunoglobulin. In non-limiting examples, humanized antibodies are human antibodies (recipient antibody) in which hypervariable region (CDR) residues of the recipient antibody are replaced with hypervariable region (CDR) residues from a non-human antibody (e.g., a donor antibody), e.g., a mouse antibody. , rat or rabbit having the desired specificity, affinity and ability. In some embodiments, human immunoglobulin Fv framework residues are replaced with corresponding non-human immunoglobulin (eg, murine) residues. In some embodiments, humanized antibodies may contain residues that are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications can be made to further improve antibody performance. In some embodiments, the humanized antibody contains substantially all of at least one, and typically two, variable domains, wherein all or substantially all of the hypervariable loops (CDRs) correspond to non-human (e.g., murine) immunoglobulin domains and all or substantially all of the framework regions are human immunoglobulin framework regions. The humanized antibody may also comprise at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a human immunoglobulin. Humanized antibodies can be obtained using molecular biology techniques known in the art. Non-limiting examples of methods for producing humanized antibodies are described herein.

Используемый в настоящем описании термин «одноцепочечное антитело» относится к одному полипептиду, который содержит по меньшей мере два вариабельных домена иммуноглобулина (например, вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина млекопитающего), который способен специфически связываться с антигеном. Неограничивающие примеры одноцепочечных антител описаны в настоящем документе.As used herein, the term "single chain antibody" refers to a single polypeptide that contains at least two immunoglobulin variable domains (e.g., a mammalian immunoglobulin heavy chain or light chain variable domain) that is capable of specifically binding to an antigen. Non-limiting examples of single chain antibodies are described herein.

Используемый в настоящем описании термин «мультимерное антитело» относится к антителу, которое содержит четыре или более (например, шесть, восемь или десять) вариабельных доменов иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления мультимерное антитело способно к перекрестному связыванию с одной молекулой-мишенью (например, CTLA4), по меньшей мере с одной второй молекулой-мишенью (например, PD1) на поверхности клетки млекопитающего (например, Т-клетки человека).As used herein, the term "multimeric antibody" refers to an antibody that contains four or more (eg, six, eight, or ten) immunoglobulin variable domains. In some embodiments, the multimeric antibody is capable of cross-linking with one target molecule (eg, CTLA4), at least one second target molecule (eg, PD1) on the surface of a mammalian cell (eg, human T cells).

Используемые в настоящем описании термины «субъект» и «пациент» используются взаимозаменяемо по всему описанию и описывают животное, человека или не человека, которому предоставляется лечение в соответствии со способами по настоящему изобретению. Ветеринарные и не ветеринарные применения предусмотрены настоящим изобретением. Пациенты-люди могут быть взрослыми людьми или подростками (например, люди моложе 18 лет). Помимо людей, пациенты включают, но не ограничиваются ими, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов, хорьков, кошек, собак и приматов. Включены, например, приматы, отличные от человека (например, обезьяны, шимпанзе, гориллы и тому подобное), грызуны (например, крысы, мыши, песчанки, хомяки, хорьки, кролики), лагоморфы, свиньи (например, свинья, миниатюрная свинья), лошади, собаки, кошки, крупный рогатый скот и другие домашние, сельскохозяйственные животные и животные зоопарков.As used herein, the terms "subject" and "patient" are used interchangeably throughout the specification and describe an animal, human or non-human, that is being treated according to the methods of the present invention. Veterinary and non-veterinary uses are contemplated by the present invention. Human patients may be adults or adolescents (eg, people under 18 years of age). In addition to humans, patients include, but are not limited to, mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, ferrets, cats, dogs, and primates. Included are, for example, non-human primates (e.g. monkeys, chimpanzees, gorillas, and the like), rodents (e.g., rats, mice, gerbils, hamsters, ferrets, rabbits), lagomorphs, pigs (e.g., pig, miniature pig) , horses, dogs, cats, cattle and other domestic, farm and zoo animals.

Используемый в настоящем описании термин «специфически связывающий» и «специфически связывается» применительно к антителу означает, что антитело взаимодействует со своей молекулой-мишенью (например, CTLA4) предпочтительно относительно других молекул, поскольку взаимодействие зависит от наличия конкретной структуры (т.е. антигенной детерминанты или эпитопа) на молекуле-мишени; другими словами, реагент распознает и связывается с молекулами, которые включают специфическую структуру, а не со всеми молекулами в целом. Антитело, которое специфически связывается с молекулой-мишенью, может называться антителом-мишенью. Например, антитело, которое специфически связывается с молекулой CTLA4, может упоминаться как CTLA4-специфичное антитело, или антитело против CTLA4.As used herein, the terms "specifically binding" and "specifically binding" in relation to an antibody means that the antibody interacts with its target molecule (for example, CTLA4) preferentially over other molecules, since the interaction depends on the presence of a particular structure (i.e., antigenic determinant or epitope) on the target molecule; in other words, the reagent recognizes and binds to molecules that include a specific structure, and not to all molecules in general. An antibody that specifically binds to a target molecule may be referred to as a target antibody. For example, an antibody that specifically binds to a CTLA4 molecule may be referred to as a CTLA4-specific antibody, or an anti-CTLA4 antibody.

Используемые в настоящем описании термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины, по меньшей мере, из двух аминокислот.Used in the present description, the terms "polypeptide", "peptide" and "protein" are used interchangeably to refer to polymers of amino acids of any length, at least two amino acids.

Используемые в настоящем описании термины «полинуклеотид», «молекула нуклеиновой кислоты» и «последовательность нуклеиновой кислоты» используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимеров нуклеотидов любой длины, по меньшей мере, из двух нуклеотидов и включают, без ограничения, ДНК, РНК, ДНК/РНК-гибриды и их модификации.As used herein, the terms "polynucleotide", "nucleic acid molecule", and "nucleic acid sequence" are used interchangeably herein to refer to polymers of nucleotides of any length of at least two nucleotides, and include, without limitation, DNA, RNA, DNA /RNA hybrids and their modifications.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится данное изобретение. Способы и материалы описаны в настоящем документе для использования в настоящем изобретении; другие подходящие способы и материалы, известные в данной области, также могут быть использованы. Материалы, методы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, заявки на патенты, патенты, последовательности, записи в базе данных и другие ссылки, упомянутые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as generally understood by those skilled in the art to which this invention pertains. Methods and materials are described herein for use in the present invention; other suitable methods and materials known in the art may also be used. The materials, methods, and examples are illustrative only and are not intended to be limiting. All publications, patent applications, patents, sequences, database entries and other references mentioned herein are incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict, the present description, including definitions, will govern.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и фигур, а также из формулы изобретения.Other features and advantages of the invention will be apparent from the following detailed description and figures, as well as from the claims.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙDESCRIPTION OF THE DRAWINGS

ФИГ. 1 представляет собой блок-схему, показывающую первую часть иллюстративного протокола получения антител против CTLA4.FIG. 1 is a block diagram showing the first part of an exemplary protocol for generating anti-CTLA4 antibodies.

ФИГ. 2 представляет собой блок-схему, показывающую вторую часть иллюстративного протокола получения антител против CTLA4.FIG. 2 is a block diagram showing the second part of an exemplary protocol for generating anti-CTLA4 antibodies.

ФИГ. 3 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против CTLA4 блокируют связывание между CTLA4 и CD80.FIG. 3 is a set of flow cytometry plots showing that anti-CTLA4 antibodies block binding between CTLA4 and CD80.

ФИГ. 4 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против CTLA4 блокируют связывание между CTLA4 и CD86.FIG. 4 is a set of flow cytometry plots showing that anti-CTLA4 antibodies block binding between CTLA4 and CD86.

ФИГ. 5 представляет собой набор графиков, показывающих результаты проточной цитометрии перекрестной реактивности антител против CTLA4 против CTLA4 обезьяны (rmCTLA4), мыши (mCTLA4) и химерного CTLA4 человека и мыши (chiCTLA4).FIG. 5 is a set of graphs showing cross-reactivity flow cytometry results of anti-CTLA4 antibodies against monkey CTLA4 (rmCTLA4), mouse (mCTLA4) and human-mouse chimeric CTLA4 (chiCTLA4).

ФИГ. 6 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных антителами против CTLA4 13A4 и 4G12.FIG. 6 is a graph showing body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with anti-CTLA4 antibodies 13A4 and 4G12.

ФИГ. 7 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных антителами против CTLA4, 13A4 и 4G12.FIG. 7 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with anti-CTLA4, 13A4 and 4G12 antibodies.

ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных антителами против CTLA4, 13A4 и 4G12.FIG. 8 is a graph showing tumor size over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with anti-CTLA4, 13A4 and 4G12 antibodies.

ФИГ. 9 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy и 13A4. FIG. 9 is a graph showing body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy and 13A4.

ФИГ. 10 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy и 13A4.FIG. 10 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy and 13A4.

ФИГ. 11 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy и 13A4.FIG. 11 is a graph showing tumor size over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy and 13A4.

ФИГ. 12 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1.FIG. 12 is a graph showing body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy, humanized anti-hCTLA4 antibodies, 4G12-H1K1-IgG1 and 4G12-H2K1-IgG1.

ФИГ. 13 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1.FIG. 13 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy, humanized anti-hCTLA4 antibodies, 4G12-H1K1-IgG1 and 4G12-H2K1-IgG1.

ФИГ. 14 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1.FIG. 14 is a graph showing tumor size over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy, humanized anti-hCTLA4 antibodies, 4G12-H1K1-IgG1 and 4G12-H2K1-IgG1.

ФИГ. 15 представляет собой график, показывающий массу тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A.FIG. 15 is a graph showing body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy humanized anti-hCTLA4 antibodies, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 and 13A4-H1K2-IgG1-N297A.

ФИГ. 16 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2- IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A.FIG. 16 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy, humanized anti-hCTLA4 antibodies, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2 - IgG4 and 13A4-H1K2-IgG1-N297A.

ФИГ. 17 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных Yervoy, гуманизированными антителами против hCTLA4, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A.FIG. 17 is a graph showing tumor size over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with Yervoy humanized anti-hCTLA4 antibodies, 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 and 13A4-H1K2-IgG1-N297A.

ФИГ. 18 представляет собой набор графиков проточной цитометрии, показывающих, что антитела против CTLA4 блокируют связывание между CTLA4 и CD86 человека.FIG. 18 is a set of flow cytometry plots showing that anti-CTLA4 antibodies block binding between CTLA4 and human CD86.

ФИГ. 19 представляет собой набор графиков, показывающих результаты проточной цитометрии перекрестной реактивности антител против CTLA4 против CTLA4 обезьяны, мыши и против химерного CTLA4 человека-мыши.FIG. 19 is a set of graphs showing cross-reactivity flow cytometry results of anti-CTLA4 anti-monkey, mouse CTLA4, and anti-human-mouse chimeric CTLA4 antibodies.

ФИГ. 20 представляет собой график, показывающий массу тела во времени гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных CT4-04-13A4, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.FIG. 20 is a graph showing body weight over time of humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with CT4-04-13A4, CT4-20-6D2, and CT4-20-7E12.

ФИГ. 21 представляет собой график, показывающий процентное изменение массы тела с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных CT4-04-13A4, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.FIG. 21 is a graph showing the percentage change in body weight over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with CT4-04-13A4, CT4-20-6D2, and CT4-20-7E12.

ФИГ. 22 представляет собой график, показывающий размер опухоли с течением времени у гуманизированных мышей B-hCTLA-4 с опухолью MC-38, обработанных CT4-04-13A4, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.FIG. 22 is a graph showing tumor size over time in humanized B-hCTLA-4 mice with MC-38 tumor treated with CT4-04-13A4, CT4-20-6D2, and CT4-20-7E12.

На ФИГ. 23 перечислены последовательности CDR антител против CTLA4 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 и их гуманизированных антител, как определено нумерацией по Kabat.FIG. 23 lists the CDR sequences of anti-CTLA4 antibodies 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 and their humanized antibodies, as determined by Kabat numbering.

На ФИГ. 24 перечислены последовательности CDR антител против CTLA4 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 и их гуманизированных антител, как определено по нумерации Chothia.FIG. 24 lists the CDR sequences of anti-CTLA4 antibodies 13A4, 4G12, 6D2, 7E12 and their humanized antibodies, as determined by Chothia numbering.

На ФИГ. 25 перечислены аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи гуманизированных антител против CTLA4. FIG. 25 lists the amino acid sequences of the heavy chain variable regions and the light chain variable regions of humanized anti-CTLA4 antibodies.

На ФИГ. 26 перечислены аминокислотные последовательности CTLA4 человека, CTLA4 мыши, CTLA4 обезьяны и химерного CTLA4.FIG. 26 lists the amino acid sequences of human CTLA4, mouse CTLA4, monkey CTLA4, and chimeric CTLA4.

ФИГ. 27 показывает аминокислотную последовательность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи нескольких мышиных антител против hCTLA4.FIG. 27 shows the amino acid sequence of the heavy chain and light chain variable regions of several mouse anti-hCTLA4 antibodies.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕDETAILED DESCRIPTION

Настоящее раскрытие предоставляет примеры антител, их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с белком 4, ассоциированным с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA-4, CTLA4, также известный как CD152).The present disclosure provides examples of antibodies, antigen-binding fragments thereof, that bind to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4, CTLA4, also known as CD152).

CTLA4 является членом суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется активированными Т-клетками и передает ингибирующий сигнал Т-клеткам. Это иммунная контрольная точка, которая действует как выключатель при связывании с CD80 или CD86, подавляя иммунные реакции.CTLA4 is a member of the immunoglobulin superfamily that is expressed by activated T cells and transmits an inhibitory signal to T cells. It is an immune checkpoint that acts as a switch when bound to CD80 or CD86, suppressing immune responses.

Это раскрытие также предоставляет последовательности гуманизированных антител против CTLA4 и способы получения и использования антител.This disclosure also provides humanized anti-CTLA4 antibody sequences and methods for making and using the antibodies.

CTLA4 и злокачественные новообразованияCTLA4 and malignancies

Иммунная система может различать нормальные клетки в организме и те, которые она считает «чужеродными», что позволяет иммунной системе атаковать чужеродные клетки, оставляя нормальные клетки в покое. Этот механизм иногда включает белки, называемые иммунными контрольными точками. Иммунные контрольные точки - это молекулы в иммунной системе, которые либо увеличивают сигнал (костимулирующие молекулы), либо понижают сигнал.The immune system can distinguish between normal cells in the body and those it considers "foreign", allowing the immune system to attack the foreign cells while leaving the normal cells alone. This mechanism sometimes involves proteins called immune checkpoints. Immune checkpoints are molecules in the immune system that either increase the signal (costimulatory molecules) or decrease the signal.

Ингибиторы контрольных точек могут предотвращать атаку иммунной системы на нормальные ткани и тем самым предотвращать аутоиммунные заболевания. Многие опухолевые клетки также экспрессируют ингибиторы контрольных точек. Эти опухолевые клетки избегают иммунного надзора, кооптируя определенные пути иммунных контрольных точек, особенно в Т-клетках, которые специфичны для опухолевых антигенов (Creelan, Benjamin C. «Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer.». Cancer Control 21. 1 (2014): 80-89). Поскольку многие иммунные контрольные точки инициируются взаимодействиями лиганд-рецептор, они могут быть легко заблокированы антителами против лигандов и/или их рецепторов.Checkpoint inhibitors can prevent the immune system from attacking normal tissues and thus prevent autoimmune diseases. Many tumor cells also express checkpoint inhibitors. These tumor cells escape immune surveillance by co-opting certain immune checkpoint pathways, especially in T cells that are specific for tumor antigens (Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer." Cancer Control 21. 1 (2014 ): 80-89). Because many immune checkpoints are initiated by ligand-receptor interactions, they can be easily blocked by antibodies against the ligands and/or their receptors.

Путь иммунной контрольной точки включает сложную серию клеточных взаимодействий, которые предотвращают чрезмерную эффекторную активность с помощью Т-клеток в нормальных условиях. Одной из частей этого пути является рецептор клеточной поверхности, называемый антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4, CD152). CTLA4 является членом суперсемейства иммуноглобулинов, который экспрессируется исключительно на Т-клетках. CTLA4 действует, ингибируя активацию Т-клеток, и, как сообщается, ингибирует активность хелперных Т-клеток и усиливает иммуносупрессивную активность регуляторных Т-клеток. Таким образом, CTLA-4 действует как выключатель и снижает иммунный ответ. Как только цитотоксическая Т-клетка становится активной, она экспрессирует CTLA-4 на своей клеточной поверхности, который затем конкурирует с костимулирующей молекулой CD28 за их общие лиганды, B7-1 (CD80) или B7-2 (CD86) на APC. Этот баланс «инь-янь» сдерживает цитотоксическую активность, в то же время позволяя функции Т-клеток действовать самостоятельно (Creelan, Benjamin C. «Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer.» Cancer Control 21. 1 (2014): 80-89).The immune checkpoint pathway involves a complex series of cellular interactions that prevent excessive effector activity by T cells under normal conditions. One part of this pathway is a cell surface receptor called cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA4, CD152). CTLA4 is a member of the immunoglobulin superfamily that is exclusively expressed on T cells. CTLA4 acts by inhibiting T cell activation and has been reported to inhibit helper T cell activity and enhance the immunosuppressive activity of regulatory T cells. Thus, CTLA-4 acts as a switch and reduces the immune response. Once a cytotoxic T cell becomes active, it expresses CTLA-4 on its cell surface, which then competes with the costimulatory molecule CD28 for their common ligands, B7-1 (CD80) or B7-2 (CD86) on APC. This yin-yang balance restrains cytotoxic activity while allowing T-cell function to act on its own (Creelan, Benjamin C. "Update on immune checkpoint inhibitors in lung cancer." Cancer Control 21. 1 (2014): 80- 89).

Многие опухолевые клетки могут стимулировать аномальную экспрессию CTLA-4 в Т-клетках, и эти Т-клетки с аберрантным CTLA-4 проявляют анергический фенотип. Таким образом, опухолевые клетки могут привлекать путь CTLA-4, чтобы избежать надзора Т-клеток. Введение моноклональных антител, которые ингибируют CTLA-4, может достигать согласованных и длительных противоопухолевых ответов при некоторых видах злокачественных новообразований, таких как меланома. Эти антитела против CTLA4 (например, тремелимумаб и ипилимумаб (Yervoy)) связываются с CTLA4, блокируя ингибирующий сигнал, который позволяет цитотоксическому Т-лимфоциту разрушать опухолевые клетки. Следовательно, антитела против CTLA4 можно использовать для лечения злокачественных новообразований.Many tumor cells can stimulate abnormal expression of CTLA-4 in T cells, and these aberrant CTLA-4 T cells exhibit an anergic phenotype. Thus, tumor cells may recruit the CTLA-4 pathway to avoid T cell surveillance. Administration of monoclonal antibodies that inhibit CTLA-4 can achieve consistent and sustained antitumor responses in certain types of cancer such as melanoma. These anti-CTLA4 antibodies (eg, tremelimumab and ipilimumab (Yervoy)) bind to CTLA4, blocking an inhibitory signal that allows the cytotoxic T-lymphocyte to destroy tumor cells. Therefore, anti-CTLA4 antibodies can be used to treat malignancies.

Настоящее раскрытие относится к нескольким антителам против CTLA4, их антигенсвязывающим фрагментам и к способам применения этих антител против CTLA4 и антигенсвязывающих фрагментов для лечения злокачественных новообразований.The present disclosure relates to several anti-CTLA4 antibodies, antigen-binding fragments thereof, and methods of using these anti-CTLA4 antibodies and antigen-binding fragments for the treatment of malignancies.

Антитела и антигенсвязывающие фрагментыAntibodies and antigen-binding fragments

Настоящее раскрытие относится к антителам против CTLA4 и их антигенсвязывающим фрагментам. Как правило, антитела (также называемые иммуноглобулинами) состоят из двух классов полипептидных цепей, легких цепей и тяжелых цепей. Неограничивающее антитело по настоящему изобретению может представлять собой интактное антитело с четырьмя иммуноглобулиновыми цепями, содержащее две тяжелые цепи и две легкие цепи. Тяжелая цепь антитела может иметь любой изотип, включая IgM, IgG, IgE, IgA или IgD, или субизотип, включая IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2 и т. д. Легкая цепь может быть легкой цепью каппа или легкой цепью лямбда. Антитело может содержать две идентичные копии легкой цепи и две идентичные копии тяжелой цепи. Тяжелые цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, VH) и множество константных доменов (или константных областей), связываются друг с другом посредством дисульфидной связи в своих константных доменах, образуя «ствол» антитела. Легкие цепи, каждая из которых содержит один вариабельный домен (или вариабельную область, VL) и один константный домен (или константную область), каждая связывается с одной тяжелой цепью посредством дисульфидного связывания. Вариабельная область каждой легкой цепи выровнена с вариабельной областью тяжелой цепи, с которой она связана. Вариабельные области как легких цепей, так и тяжелых цепей содержат три гипервариабельные области, расположенные между более консервативными каркасными областями (FR).The present disclosure relates to anti-CTLA4 antibodies and antigen-binding fragments thereof. Typically, antibodies (also called immunoglobulins) are composed of two classes of polypeptide chains, light chains and heavy chains. A non-limiting antibody of the present invention may be an intact four immunoglobulin chain antibody containing two heavy chains and two light chains. The heavy chain of an antibody may be of any isotype, including IgM, IgG, IgE, IgA, or IgD, or a subisotype, including IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgE1, IgE2, etc. The light chain may be a kappa light chain or a lambda light chain. The antibody may contain two identical copies of the light chain and two identical copies of the heavy chain. The heavy chains, each containing a single variable domain (or variable region, VH) and a plurality of constant domains (or constant regions), are linked to each other via a disulfide bond in their constant domains to form an antibody "stem". Light chains, each containing one variable domain (or variable region, VL) and one constant domain (or constant region), each associated with one heavy chain via disulfide linkage. The variable region of each light chain is aligned with the variable region of the heavy chain to which it is linked. The variable regions of both light chains and heavy chains contain three hypervariable regions located between the more conserved framework regions (FRs).

Эти гипервариабельные области, известные как области, определяющие комплементарность, (CDR), образуют петли, которые включают основную антигенсвязывающую поверхность антитела. Четыре каркасных области в основном принимают конформацию бета-листа, а CDR образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие часть структуры бета-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости от каркасных областей и, вместе с CDR из другой цепи, способствуют образованию антигенсвязывающей области.These hypervariable regions, known as complementarity determining regions (CDRs), form loops that comprise the main antigen-binding surface of an antibody. The four framework regions generally adopt the beta sheet conformation, and the CDRs form loops that connect, and in some cases form part of, the beta sheet structure. The CDRs in each strand are held in close proximity to the framework regions and, together with the CDRs from the other strand, contribute to the formation of an antigen-binding region.

Способы идентификации областей CDR антитела путем анализа аминокислотной последовательности антитела хорошо известны, и обычно используется ряд определений CDR. Определение Kabat основано на вариабельности последовательности, а определение Chothia основано на расположении структурных петлевых областей. Эти методы и определения описаны, например, в Martin, «Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,» Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. «Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains» Molecular immunology 45. 14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132: 211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203: 121-53 (1991); Morea et al. Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan. 1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объемеMethods for identifying CDR regions of an antibody by analyzing the amino acid sequence of an antibody are well known, and a number of CDR definitions are commonly used. The definition of Kabat is based on sequence variability and the definition of Chothia is based on the location of the structural loop regions. These methods and definitions are described, for example, in Martin, "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," Antibody engineering, Springer Berlin Heidelberg, 2001. 422-439; Abhinandan, et al. "Analysis and improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibody variable domains" Molecular immunology 45. 14 (2008): 3832-3839; Wu, T.T. and Kabat, E.A. (1970) J. Exp. Med. 132:211-250; Martin et al., Methods Enzymol. 203:121-53 (1991); Morea et al. Biophys Chem. 68(1-3):9-16 (Oct. 1997); Morea et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (Jan. 1998); Chothia et al., Nature 342(6252):877-83 (Dec. 1989); Ponomarenko and Bourne, BMC Structural Biology 7:64 (2007); each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

CDR важны для распознавания эпитопа антигена. Используемый в настоящем описании термин «эпитоп» представляет собой наименьшую часть молекулы-мишени, способную специфически связываться с антигенсвязывающим доменом антитела. Минимальный размер эпитопа может составлять примерно три, четыре, пять, шесть или семь аминокислот, но эти аминокислоты не обязательно должны быть в последовательной линейной последовательности первичной структуры антигена, поскольку эпитоп может зависеть от трехмерной конфигурации на основе вторичной и третичной структуры антигена.CDRs are important for antigen epitope recognition. As used herein, the term "epitope" is the smallest portion of a target molecule capable of specifically binding to the antigen-binding domain of an antibody. The minimum size of an epitope may be about three, four, five, six, or seven amino acids, but these amino acids need not be in a sequential linear sequence of the antigen's primary structure, since the epitope may depend on a three-dimensional configuration based on the secondary and tertiary structure of the antigen.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой интактную молекулу иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). Подклассы IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) высоко консервативны, различаются по своей константной области, особенно по своим шарнирам и верхним доменам CH2. Последовательности и различия подклассов IgG известны в данной области и описаны, например, в Vidarsson, Gestur, Gillian Dekkers, and Theo Rispens. «IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions» Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, Vashti, et al. «Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases.» Molecular immunology 67. 2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.In some embodiments, the antibody is an intact immunoglobulin molecule (eg, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA). The IgG subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) are highly conserved, differing in their constant region, especially in their hinges and upper CH2 domains. IgG subclass sequences and differences are known in the art and are described in, for example, Vidarsson, Gestur, Gillian Dekkers, and Theo Rispens. "IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions" Frontiers in immunology 5 (2014); Irani, Vashti, et al. "Molecular properties of human IgG subclasses and their implications for designing therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases." Molecular immunology 67. 2 (2015): 171-182; Shakib, Farouk, ed. The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Elsevier, 2016; each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

Антитело также может представлять собой молекулу иммуноглобулина, полученную из любых видов (например, человека, грызуна, мыши, верблюда). Антитела, раскрытые в настоящем описании, также включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, моноспецифичные, полиспецифичные антитела и химерные антитела, которые включают связывающий домен иммуноглобулина, слитый с другим полипептидом. Термин «антигенсвязывающий домен» или «антигенсвязывающий фрагмент» представляет собой часть антитела, которая сохраняет специфическую активность связывания интактного антитела, т. е. любой части антитела, которая способна специфически связываться с эпитопом молекулы-мишени интактного антитела. Включает в себя, например, Fab, Fab', F(ab')₂ и варианты этих фрагментов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой, например, scFv, Fv, Fd, dAb, биспецифичное антитело, биспецифичный scFv, диатело, линейное антитело, одноцепочечную молекулу антитела, полиспецифичное антитело, образованное из фрагментов антитела, и любой полипептид, который включает связывающий домен, который представляет собой или гомологичен связывающему домену антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающих доменов включают например, CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи интактного антитела, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи интактного антитела, полноразмерные тяжелые или легкие цепи интактного антитела или индивидуальную CDR из тяжелой цепи или легкой цепи интактного антитела.The antibody may also be an immunoglobulin molecule derived from any species (eg, human, rodent, mouse, camel). The antibodies disclosed herein also include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, monospecific, polyspecific antibodies, and chimeric antibodies that include an immunoglobulin binding domain fused to another polypeptide. The term "antigen-binding domain" or "antigen-binding fragment" is the portion of an antibody that retains the specific binding activity of an intact antibody, i.e., any portion of an antibody that is capable of specifically binding to an epitope of an intact antibody's target molecule. Includes, for example, Fab, Fab', F(ab') ₂ and variants of these fragments. Thus, in some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof can be, for example, a scFv, Fv, Fd, dAb, a bispecific antibody, a bispecific scFv, a diabody, a linear antibody, a single chain antibody molecule, a polyspecific antibody formed from antibody fragments, and any polypeptide that includes a binding domain that is or is homologous to the binding domain of an antibody. Non-limiting examples of antigen binding domains include, for example, an intact antibody heavy chain and/or light chain CDR, an intact antibody heavy and/or light chain variable region, an intact antibody full-length heavy or light chain, or an individual CDR from an intact antibody heavy chain or light chain.

В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент может образовывать часть химерного антигенного рецептора (CAR). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой слияния одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), как описано в настоящем документе, слитых с трансмембранным доменом CD3-дзета и эндодоменом. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор также содержит внутриклеточные сигнальные домены из различных костимулирующих рецепторов белков (например, CD28, 41BB, ICOS). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит несколько сигнальных доменов, например, CD3z-CD28-41BB или CD3z-CD28-OX40, для увеличения эффективности. Таким образом, в одном аспекте раскрытие дополнительно относится к клеткам (например, T-клеткам), которые экспрессируют химерные антигенные рецепторы, как описано в настоящем документе.In some embodiments, the antigen-binding fragment may form part of a chimeric antigen receptor (CAR). In some embodiments, the chimeric antigen receptor is a fusion of single chain variable fragments (scFv), as described herein, fused to the CD3 zeta transmembrane domain and an endodomain. In some embodiments, the chimeric antigen receptor also contains intracellular signaling domains from various co-stimulatory protein receptors (eg, CD28, 41BB, ICOS). In some embodiments, the implementation of the chimeric antigen receptor contains several signaling domains, such as CD3z-CD28-41BB or CD3z-CD28-OX40, to increase efficiency. Thus, in one aspect, the disclosure further relates to cells (eg, T cells) that express chimeric antigen receptors as described herein.

В некоторых вариантах осуществления scFV имеет один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи.In some embodiments, the scFV has one heavy chain variable domain and one light chain variable domain.

Антитела против CTLA4 и антигенсвязывающие фрагментыAnti-CTLA4 antibodies and antigen-binding fragments

Настоящее раскрытие относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются с CTLA4. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, способны связываться с CTLA4 и могут ингибировать путь ингибирования CTLA4, таким образом, повышая иммунный ответ. Раскрытие относится к мышиным антителам против CTLA4, CT4-04-13A4 («13A4»), CT4-03-4G12 («4G12»), CT4-20-6D2 («6D2») и CT4-20-7E12 («7E12») и к их гуманизированным антителам.The present disclosure relates to antibodies and antigen-binding fragments thereof that specifically bind to CTLA4. The antibodies and antigen-binding fragments described herein are capable of binding to CTLA4 and can inhibit the CTLA4 inhibition pathway, thus enhancing the immune response. The disclosure relates to mouse anti-CTLA4 antibodies, CT4-04-13A4 ("13A4"), CT4-03-4G12 ("4G12"), CT4-20-6D2 ("6D2") and CT4-20-7E12 ("7E12" ) and to their humanized antibodies.

Последовательности CDR для антител, полученных из 13А4 и 13А4 (например, гуманизированных антител), включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 1-3 и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 4-6, как определено нумерацией по Kabat. CDR также могут быть определены системой Chothia. Под нумерацией Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 29-31, а последовательности CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 32-34.The CDR sequences for antibodies derived from 13A4 and 13A4 (e.g., humanized antibodies) include the heavy chain variable CDRs, SEQ ID NOs: 1-3 and the light chain variable CDRs, SEQ ID NOs: 4-6, as defined by numbering according to Kabat. CDRs can also be determined by the Chothia system. Under Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 29-31 and the light chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 32-34.

Подобным образом, последовательности CDR для антител, полученных из 4G12 и 4G12, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 7-9, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 10-12, как определено нумерацией Kabat. При нумерации Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 35-37, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 38-40.Similarly, the CDR sequences for antibodies derived from 4G12 and 4G12 include the heavy chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 7-9, and the light chain variable domain CDRs, SEQ ID NOs: 10-12, as defined by Kabat numbering. In Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 35-37 and the light chain variable CDRs are shown in SEQ ID NOs: 38-40.

Последовательности CDR для антител, полученных из 6D2 и 6D2, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 45-47, и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 48-50, как определено нумерацией Kabat. При нумерации Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 57-59, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 60-62.The CDR sequences for antibodies derived from 6D2 and 6D2 include the heavy chain variable CDRs, SEQ ID NOs: 45-47, and the light chain variable CDRs, SEQ ID NOs: 48-50, as defined by Kabat numbering. In Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 57-59 and the light chain variable CDRs are shown in SEQ ID NOs: 60-62.

Последовательности CDR для антител, полученных из 7E12 и 7E12, включают CDR вариабельного домена тяжелой цепи, SEQ ID NO: 51-53 и CDR вариабельного домена легкой цепи, SEQ ID NO: 54-56, как определено нумерацией Kabat. При нумерации Chothia последовательности CDR вариабельного домена тяжелой цепи представлены в SEQ ID NO: 63-65, а CDR вариабельного домена легкой цепи представлены в SEQ ID NO: 66-68.The CDR sequences for antibodies derived from 7E12 and 7E12 include the heavy chain variable CDRs, SEQ ID NOs: 51-53 and the light chain variable CDRs, SEQ ID NOs: 54-56, as defined by Kabat numbering. In Chothia numbering, the heavy chain variable CDR sequences are shown in SEQ ID NOs: 63-65 and the light chain variable CDRs are shown in SEQ ID NOs: 66-68.

Также предложены аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи гуманизированных антител. Поскольку существуют разные способы гуманизации мышиных антител (например, последовательность может быть замещена другими аминокислотами), тяжелая цепь и легкая цепь антитела могут иметь более одной версии гуманизированных последовательностей. Аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 13А4 представлены в SEQ ID NO: 13-17. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 13А4 представлены в SEQ ID NO: 18-20. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13-17) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 18-20).Also provided are amino acid sequences for the heavy chain variable region and the light chain variable region of humanized antibodies. Because there are different ways to humanize mouse antibodies (for example, the sequence can be replaced with other amino acids), the heavy chain and light chain of an antibody can have more than one version of the humanized sequences. The amino acid sequences for the heavy chain variable region of the humanized 13A4 antibody are shown in SEQ ID NOS: 13-17. The amino acid sequences for the light chain variable region of the humanized 13A4 antibody are shown in SEQ ID NOS: 18-20. Any of these heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 13-17) can be paired with any of these light chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 18-20).

Аналогично, аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела 4G12 представлены в SEQ ID NO: 21-24. Аминокислотные последовательности для вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела 4G12 представлены в SEQ ID NO: 25-28. Любая из этих последовательностей вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 21-24) может быть спарена с любой из этих последовательностей вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 25-28).Similarly, the amino acid sequences for the heavy chain variable region of the humanized 4G12 antibody are shown in SEQ ID NOs: 21-24. The amino acid sequences for the light chain variable region of the humanized 4G12 antibody are shown in SEQ ID NOS: 25-28. Any of these heavy chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 21-24) can be paired with any of these light chain variable region sequences (SEQ ID NOs: 25-28).

Как показано на ФИГ. 25, процент гуманизации означает процент идентичности последовательности вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи по сравнению с последовательностями антител человека в базе данных Международной иммуногенетической информационной системы (IMGT). Лучший вариант означает, что последовательность вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи ближе к конкретному виду, чем к другим видам. Например, лучший вариант относительно человека означает, что последовательность ближе к человеку, чем к другим видам. Лучший вариант относительно человека и Macaca flavicularis означает, что последовательность имеет одинаковую процентную идентичность с человеческой последовательностью и последовательностью Macaca flavicularis, и эти процентные идентичности являются самыми высокими по сравнению с последовательностями других видов. В некоторых вариантах осуществления процент гуманизации составляет более чем 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94% или 95%. Подробное описание, касающееся того, как определять процент гуманизации и как определять лучшие варианты, известно в данной области техники и описано, например, в Jones, Tim D., et al. «The INNs and outs of antibody nonproprietary names.» MAbs. Vol. 8. № 1 Taylor & Francis, 2016, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.As shown in FIG. 25, percent humanization means the percent sequence identity of a heavy chain or light chain variable region compared to human antibody sequences in the International Immunogenetic Information System (IMGT) database. The best case means that the sequence of the heavy chain or light chain variable region is closer to a particular species than to other species. For example, the best case for humans means that the sequence is closer to humans than to other species. The best case for human and Macaca flavicularis means that the sequence has the same percent identity with the human and Macaca flavicularis sequences, and these percent identities are the highest compared to sequences from other species. In some embodiments, the percentage of humanization is greater than 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% 94% or 95%. A detailed description regarding how to determine the percentage of humanization and how to determine the best options is known in the art and is described, for example, in Jones, Tim D., et al. "The INNs and outs of antibody nonproprietary names." MAbs. Vol. 8. No. 1 Taylor & Francis, 2016, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Кроме того, в некоторых вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, также могут содержать одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 7-9, SEQ ID NO: 29-31, SEQ ID NO: 35-37, SEQ ID NO: 45-47, SEQ ID NO: 51-53, SEQ ID NO: 57-59 и SEQ ID NO: 63-65; и/или одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи, выбранные из группы SEQ ID NO: 4-6, SEQ ID NO: 10-12, SEQ ID NO: 32-34, SEQ ID NO: 38-40,SEQ ID NO 48-50,SEQ ID NO 54-56, SEQ ID NO 60-62 и SEQ ID NO 66-68.In addition, in some embodiments, the antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein may also contain one, two, or three heavy chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 1-3, SEQ ID NOs: 7-9 , SEQ ID NO: 29-31, SEQ ID NO: 35-37, SEQ ID NO: 45-47, SEQ ID NO: 51-53, SEQ ID NO: 57-59 and SEQ ID NO: 63-65; and/or one, two or three light chain variable region CDRs selected from the group of SEQ ID NOs: 4-6, SEQ ID NOs: 10-12, SEQ ID NOs: 32-34, SEQ ID NOs: 38-40, SEQ ID NOS 48-50, SEQ ID NOS 54-56, SEQ ID NOS 60-62 and SEQ ID NOS 66-68.

В некоторых вариантах осуществления антитела могут иметь вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность (CDR) 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80,85, 90 или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, и область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80,85, 90 или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3, и вариабельную области легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2, 3, где область CDR1 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область CDR2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности аминокислот VL CDR2, область CDR3 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80,85, 90 или 95% идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3. Выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 показаны на ФИГ. 23 (Kabat CDR) и ФИГ. 24 (Chothia CDR).In some embodiments, the antibodies may have a heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2, 3, where the CDR1 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90% or 95% identical to the selected VH CDR1 amino acid sequence, the CDR2 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80.85, 90, or 95% identical to the selected VH CDR2 amino acid sequence, and the CDR3 region contains or consists of the amino acid sequence , which is at least 80.85, 90 or 95% identical to the selected amino acid sequence of VH CDR3, and a light chain variable region (VL) containing CDR 1, 2, 3, where the CDR1 region contains or consists of an amino acid sequence that at least 80%, 85%, 90% or 95% identical to the selected amino acid sequence of the VL CDR1, the CDR2 region contains or consists from an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95% identical to a selected VL CDR2 amino acid sequence, the CDR3 region contains or consists of an amino acid sequence that is at least 80,85, 90, or 95 % is identical to the selected amino acid sequence of VL CDR3. Selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 and selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in FIG. 23 (Kabat CDR) and FIG. 24 (Chothia CDR).

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 1 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 2 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 3 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 1 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 2 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 3 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 7 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 8 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 9 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 7 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 8 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 9 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 29 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 30 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 31 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 29 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 30 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 31 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 35 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 36 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 37 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 35 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 36 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 37 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 45 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 46 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 47 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 45 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 46 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 47 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 51 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 52 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 53 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 51 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 52 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 53 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 57 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 58 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 59 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 57 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 58 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 59 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 63 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 64 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 65 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may comprise a heavy chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 63 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 64 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 65 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 4 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 5 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 6 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 4 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 5 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 6 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 10 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 11 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 12 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 10 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 11 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 12 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 32 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 33 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 34 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 32 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 33 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 34 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 38 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 39 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 40 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 38 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 39 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 40 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 48 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 49 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 50 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 48 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 49 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 50 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 54 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 55 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 56 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 54 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 55 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 56 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 60 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 61 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 62 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment thereof described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 60 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 61 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 62 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, могут содержать вариабельный домен легкой цепи, содержащий одну, две или три CDR SEQ ID NO: 66 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 67 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами; SEQ ID NO: 68 с нулевой, одной или двумя аминокислотными вставками, делециями или заменами.In some embodiments, an antibody or antigen-binding fragment described herein may comprise a light chain variable domain comprising one, two, or three CDRs of SEQ ID NO: 66 with zero, one, or two amino acid insertions, deletions, or substitutions; SEQ ID NO: 67 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions; SEQ ID NO: 68 with zero, one or two amino acid insertions, deletions or substitutions.

Вставки, делеции и замены могут располагаться внутри последовательности CDR или на одном или обоих концевых участках последовательности CDR.Insertions, deletions and substitutions may be located within the CDR sequence or at one or both ends of the CDR sequence.

Раскрытие также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые связываются с CTLA4. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95% идентична выбранной последовательности VL. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 75, а выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76.The disclosure also relates to antibodies, or antigen-binding fragments thereof, that bind to CTLA4. Antibodies or antigen-binding fragments thereof comprise a heavy chain variable region (VH) containing or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90% or 95% identical to the selected VH sequence and a light chain variable region (VL) containing or consisting of an amino acid sequence that is at least 80%, 85%, 90%, or 95% identical to the selected VL sequence. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, or 69, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 18, 19, 20, or 70. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, or 71, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, or 72. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 73 , and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 74. In some embodiments, the selected VH sequence is SEQ ID NO: 75 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 76.

Чтобы определить процентную идентичность двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, последовательности выравнивают для оптимальных целей сравнения (например, пробелы могут быть введены в одну или обе из первой и второй последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот для оптимального выравнивания, и негомологичные последовательности могут не учитываться для целей сравнения). Длина эталонной последовательности, выровненной для целей сравнения, составляет, по меньшей мере, 80% длины эталонной последовательности, и в некоторых вариантах осуществления составляет, по меньшей мере, 90%, 95% или 100%. Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих аминокислотных положениях или нуклеотидных положениях. Когда положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы в этом положении идентичны. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, совместно используемых последовательностями, с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. В целях настоящего раскрытия сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть выполнено с использованием матрицы оценки Blossum 62 с штрафом за пробел 12, штрафом за расширение пробела 4 и штрафом за сдвиг пробела 5.To determine the percent identity of two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, the sequences are aligned for optimal comparison purposes (e.g., gaps may be inserted in one or both of the first and second amino acid or nucleic acid sequences for optimal alignment, and non-homologous sequences may be ignored for comparison purposes). The length of the reference sequence aligned for comparison purposes is at least 80% of the length of the reference sequence, and in some embodiments is at least 90%, 95%, or 100%. The amino acid residues or nucleotides at the corresponding amino acid positions or nucleotide positions are then compared. When a position in the first sequence is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as the corresponding position in the second sequence, then the molecules at that position are identical. The percent identity between two sequences is a function of the number of identical positions shared by the sequences, taking into account the number of spaces and the length of each space that must be entered to optimally align the two sequences. For purposes of this disclosure, sequence comparisons and determination of percent identity between two sequences can be performed using a Blossum 62 scoring matrix with a gap penalty of 12, a gap widening penalty of 4, and a gap shift penalty of 5.

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или тяжелую цепь иммуноглобулина. Тяжелая цепь иммуноглобулина или легкая цепь иммуноглобулина содержат CDR, как показано на ФИГ. 23 или ФИГ. 24 или имеют последовательности, показанные на ФИГ. 25 или ФИГ. 27. Когда полипептиды спарены с соответствующим полипептидом (например, с соответствующей вариабельной областью тяжелой цепи или соответствующей вариабельной областью легкой цепи), то спаренные полипептиды связываются с CTLA4.The present invention also relates to a nucleic acid containing a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or an immunoglobulin heavy chain. An immunoglobulin heavy chain or immunoglobulin light chain contains CDRs as shown in FIG. 23 or FIG. 24 or have the sequences shown in FIG. 25 or FIG. 27. When the polypeptides are paired with a corresponding polypeptide (eg, the corresponding heavy chain variable region or the corresponding light chain variable region), the paired polypeptides bind to CTLA4.

Антитела против CTLA4 и антигенсвязывающие фрагменты также могут быть вариантами (включая производные и конъюгаты) антител или фрагментов антител и полиспецифичными (например, биспецифичными) антителами или фрагментами антител. Дополнительные антитела, предложенные в настоящем описании, являются поликлональными, моноклональными, полиспецифичными (мультимерными, например, биспецифичными), человеческими антителами, химерными антителами (например, химера человека и мыши), одноцепочечными антителами, антителами, продуцируемыми внутри клетки (т. е. интратела) и их антигенсвязывающими фрагментами. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело IgG или его антигенсвязывающий фрагмент.Anti-CTLA4 antibodies and antigen binding fragments can also be variants (including derivatives and conjugates) of antibodies or antibody fragments and polyspecific (eg, bispecific) antibodies or antibody fragments. Additional antibodies provided herein are polyclonal, monoclonal, multispecific (multimeric, e.g., bispecific), human antibodies, chimeric antibodies (e.g., human-mouse chimera), single chain antibodies, antibodies produced intracellularly (i.e., intrabodies ) and their antigen-binding fragments. Antibodies or antigen-binding fragments thereof can be of any type (eg, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), or subclass. In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof is an IgG antibody or antigen-binding fragment thereof.

Фрагменты антител пригодны для использования в предложенных способах при условии, что они сохраняют желаемую аффинность и специфичность полноразмерного антитела. Таким образом, фрагмент антитела, который связывается с CTLA-4, сохранит способность связываться с CTLA-4. Фрагмент Fv представляет собой фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания антигена. Эта область состоит из димера из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной ассоциации, которая может быть ковалентной по природе, например, в scFv. Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VH-VL. В совокупности шесть CDR или их подгруппа придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащего только три CDR, специфичных для антигена) может обладать способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.Antibody fragments are suitable for use in the proposed methods, provided that they retain the desired affinity and specificity of the full-length antibody. Thus, an antibody fragment that binds to CTLA-4 will retain the ability to bind to CTLA-4. An Fv fragment is an antibody fragment that contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain variable domain and one light chain variable domain in a tight association that may be covalent in nature, such as in scFv. It is in this configuration that the three CDRs of each variable domain interact to define an antigen-binding site on the surface of the VH-VL dimer. Together, the six CDRs, or a subset thereof, confer antigen-binding specificity to the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv containing only three CDRs specific for an antigen) may have the ability to recognize and bind an antigen, although usually at a lower affinity than the entire binding site.

Одноцепочечные фрагменты антител Fv или (scFv) содержат домены (или области) VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена.Single chain Fv or (scFv) antibody fragments contain antibody VH and VL domains (or regions), where these domains are present in the same polypeptide chain. Typically, the Fv polypeptide further comprises a polypeptide linker between the VH and VL domains that allows the scFv to form the desired structure for antigen binding.

Фрагмент Fab содержит вариабельный и константный домен легкой цепи, а также вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Фрагменты антитела F(ab')₂ содержат пару фрагментов Fab, которые обычно ковалентно связаны вблизи своих карбоксиконцов посредством шарнирных цистеинов между ними. Другие химические конденсации фрагментов антител также известны в данной области.The Fab fragment contains the variable and constant domain of the light chain, as well as the variable domain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. F(ab') ₂ antibody fragments contain a pair of Fab fragments that are typically covalently linked near their carboxy ends with hinge cysteines between them. Other chemical condensations of antibody fragments are also known in the art.

Диатела представляют собой небольшие фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые содержат VH, связанную с VL в одной и той же полипептидной цепи (VH и VL). Используя линкер, который является слишком коротким, чтобы разрешить спаривание между двумя доменами в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта.Diabodies are small antibody fragments with two antigen-binding sites that contain a VH linked to a VL in the same polypeptide chain (VH and VL). Using a linker that is too short to allow pairing between two domains on the same strand, the domains are forced to pair with complementary domains on the other strand and create two antigen-binding sites.

Линейные антитела содержат пару тандемных сегментов Fd (VH-CH1-VH-CH1), которые вместе с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифичными или моноспецифичными.Linear antibodies contain a pair of tandem Fd segments (VH-CH1-VH-CH1) which, together with complementary light chain polypeptides, form a pair of antigen-binding regions. Linear antibodies can be bispecific or monospecific.

Антитела и фрагменты антител по настоящему изобретению могут быть модифицированы в области Fc для обеспечения желаемых эффекторных функций или периода полужизни в сыворотке.The antibodies and antibody fragments of the present invention can be modified in the Fc region to provide desired effector functions or serum half-life.

Мультимеризация антител может быть достигнута посредством естественной агрегации антител или с помощью химических или рекомбинантных способов связывания, известных в данной области. Например, некоторый процент очищенных препаратов антител (например, очищенные молекулы IgG1) самопроизвольно образуют белковые агрегаты, содержащие гомодимеры антител и другие мультимеры антител более высокого порядка.Multimerization of antibodies can be achieved by natural antibody aggregation or by chemical or recombinant binding methods known in the art. For example, a certain percentage of purified antibody preparations (eg, purified IgG1 molecules) spontaneously form protein aggregates containing antibody homodimers and other higher order antibody multimers.

Альтернативно, гомодимеры антител могут быть получены с помощью методов химической связи, известных в данной области. Например, гетеробифункциональные сшивающие агенты, включая, но не ограничиваясь ими, SMCC (сукцинимидил-4-(малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат) и SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), можно использовать для образования мультимеров антител. Иллюстративный протокол для образования гомодимеров антител описан в Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 7509-7514, 1997). Гомодимеры антител можно превратить в гомодимеры Fab'₂ путем расщепления пепсином. Другой способ образования гомодимеров антител заключается в использовании аутофильного пептида T15, описанного в Zhao et al. (J. Immunol. 25: 396-404, 2002).Alternatively, antibody homodimers can be prepared using chemical bonding techniques known in the art. For example, heterobifunctional crosslinkers, including but not limited to SMCC (succinimidyl-4-(maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) and SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), can be used to form antibody multimers. An exemplary protocol for the formation of antibody homodimers is described in Ghetie et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 7509-7514, 1997). Antibody homodimers can be converted to Fab' ₂ homodimers by pepsin digestion. Another way to form antibody homodimers is to use the autophilic T15 peptide described in Zhao et al. (J. Immunol. 25: 396-404, 2002).

В некоторых вариантах осуществления полиспецифичное антитело представляет собой биспецифичное антитело. Биспецифичные антитела могут быть получены путем конструирования интерфейса между парой молекул антител, чтобы максимизировать процент гетеродимеров, которые извлекают из культуры рекомбинантных клеток. Например, интерфейс может содержать, по меньшей мере, часть домена СН3 константного домена антитела. В этом способе одну или более небольших боковых цепей аминокислот из интерфейса первой молекулы антитела заменяют более крупными боковыми цепями (например, тирозина или триптофана). Компенсаторные «полости» идентичного или сходного размера с крупной боковой цепью (цепями) создаются в интерфейсе второй молекулы антитела путем замены крупных боковых цепей аминокислот более мелкими (например, аланина или треонина). Это обеспечивает механизм для увеличения выхода гетеродимера по сравнению с другими нежелательными конечными продуктами, такими как гомодимеры. Этот метод описан, например, в WO 96/27011, которая включена в качестве ссылки в полном объеме.In some embodiments, the multispecific antibody is a bispecific antibody. Bispecific antibodies can be generated by designing an interface between a pair of antibody molecules to maximize the percentage of heterodimers that are recovered from the recombinant cell culture. For example, an interface may comprise at least a portion of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg, tyrosine or tryptophan). Compensatory "cavities" of identical or similar size to the large side chain(s) are created at the interface of the second antibody molecule by replacing large amino acid side chains with smaller ones (eg, alanine or threonine). This provides a mechanism to increase the yield of the heterodimer over other undesirable end products such as homodimers. This method is described, for example, in WO 96/27011, which is incorporated by reference in its entirety.

Биспецифичные антитела включают сшитые или «гетероконъюгатные» антитела. Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, а другое с биотином. Гетероконъюгатные антитела также могут быть получены с использованием любых удобных способов сшивки. Подходящие сшивающие агенты и методы сшивки хорошо известны в данной области и раскрыты в патенте США № 4676980, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.Bispecific antibodies include cross-linked or "heteroconjugate" antibodies. For example, one of the antibodies in the heteroconjugate can be linked to avidin and the other to biotin. Heteroconjugate antibodies can also be made using any convenient crosslinking technique. Suitable crosslinkers and crosslinking methods are well known in the art and are disclosed in US Pat. No. 4,676,980, which is incorporated herein by reference in its entirety.

Способы получения биспецифичных антител из фрагментов антител также известны в данной области. Например, биспецифичные антитела могут быть получены с использованием химической связи. Brennan et al. (Science 229: 81, 1985) описывают процедура, при которой интактные антитела протеолитически расщепляются с образованием F(ab')₂-фрагментов. Эти фрагменты восстанавливаются в присутствии комплексообразующего агента дитиола и арсенита натрия для стабилизации вицинальных дитиолов и предотвращения образования межмолекулярных дисульфидов. Полученные фрагменты Fab' затем превращаются в производные тионитробензоата (TNB). Затем одно из производных Fab' TNB превращается в Fab' тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивается с эквимолярным количеством другого производного Fab' TNB с образованием биспецифичного антитела.Methods for producing bispecific antibodies from antibody fragments are also known in the art. For example, bispecific antibodies can be made using a chemical bond. Brennan et al. (Science 229: 81, 1985) describe a procedure in which intact antibodies are proteolytically cleaved to form F(ab') ₂ fragments. These fragments are reduced in the presence of the complexing agent dithiol and sodium arsenite to stabilize the vicinal dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfides. The resulting Fab' fragments are then converted into thionitrobenzoate (TNB) derivatives. One of the Fab' TNB derivatives is then converted to Fab' thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of another Fab' TNB derivative to form a bispecific antibody.

Любое из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, может быть конъюгировано со стабилизирующей молекулой (например, молекулой, которая увеличивает период полужизни антитела или его антигенсвязывающего фрагмента у пациента или в растворе). Неограничивающие примеры стабилизирующих молекул включают: полимер (например, полиэтиленгликоль) или белок (например, сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин). Конъюгация стабилизирующей молекулы может увеличить время полужизни или продлить биологическую активность антитела или антигенсвязывающего фрагмента in vitro (например, в тканевой клеточной культуре или при хранении в виде фармацевтической композиции) или in vivo (например, у человека).Any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may be conjugated to a stabilizing molecule (eg, a molecule that increases the half-life of the antibody or antigen-binding fragment thereof in a patient or in solution). Non-limiting examples of stabilizing molecules include: polymer (eg, polyethylene glycol) or protein (eg, serum albumin, such as human serum albumin). Conjugation of the stabilizing molecule can increase the half-life or extend the biological activity of the antibody or antigen-binding fragment in vitro (eg, in tissue cell culture or when stored as a pharmaceutical composition) or in vivo (eg, in humans).

Характеристики антител Characteristics of antibodies

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в настоящем документе, могут блокировать связывание между CTLA4 и CD80 и/или связывание между CTLA4 и CD86. Блокируя связывание между CTLA4 и CD80 и/или связывание между CTLA4 и CD86, антитела против CTLA4 нарушают путь ингибирования CTLA4 и активируют иммунный ответ. The antibodies or antigen-binding fragments thereof described herein can block binding between CTLA4 and CD80 and/or binding between CTLA4 and CD86. By blocking binding between CTLA4 and CD80 and/or binding between CTLA4 and CD86, anti-CTLA4 antibodies disrupt the CTLA4 inhibition pathway and activate the immune response.

В некоторых осуществлениях антитело (или его антигенсвязывающие фрагменты) специфически связывается с CTLA4 (например, CTLA4 человека, CTLA4 обезьяны, CTLA4 мыши и/или с химерным CTLA4) с константой диссоциации (Kd) менее чем 1×10^-6 М, менее чем 1×10^-7 М, менее чем 1×10^-8 М, менее чем 1×10^-9 М или менее чем 1×10^-10 М. В некоторых вариантах осуществления Kd составляет менее чем 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 9 нМ, 8 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ или 1 нМ. In some embodiments, the antibody (or antigen-binding fragments thereof) specifically binds to CTLA4 (e.g., human CTLA4, monkey CTLA4, mouse CTLA4, and/or chimeric CTLA4) with a dissociation constant (Kd) of less than 1 x 10 ⁻⁶ M, less than 1 x10 ^- 7 M, less than 1 x 10 ^- 8 M, less than 1 x 10 ^- 9 M, or less than 1 x 10 ^- 10 M. In some embodiments, the Kd is less than 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM or 1 nM.

В некоторых вариантах осуществления Kd составляет более чем 1×10^-7 М, более чем 1×10^-8 М, более чем 1×10^-9 М, более чем 1×10^-10 М, более чем 1×10^-11 М или более чем 1×10^-12 М.In some embodiments, the Kd is greater than 1x10 ^- 7 M, greater than 1x10 ^- 8 M, greater than 1x10 ^- 9 M, greater than 1x10 ^- 10 M, greater than 1x10 ^- 11 M or more than 1×10 ^- 12 M.

Общие методики измерения аффинности антитела к антигену включают, например, ИФА, RIA и поверхностный плазмонный резонанс (SPR). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с человеческим CTLA4 (SEQ ID NO: 41), CTLA4 обезьяны (например, CTLA4 макаки-резус, SEQ ID NO: 43), с химерным CTLA4 (SEQ ID NO: 44) и/или с мышиным CTLA4 (SEQ ID NO: 42). В некоторых вариантах осуществления антитело не связывается с человеческим CTLA4 (SEQ ID NO: 41), CTLA4 обезьяны (например, CTLA4 макаки-резус, SEQ ID NO: 43), с химерным CTLA4 (SEQ ID NO: 44) и/или с мышиным CTLA4 (SEQ ID NO: 42).Common techniques for measuring the affinity of an antibody for an antigen include, for example, ELISA, RIA, and surface plasmon resonance (SPR). In some embodiments, the antibody binds to human CTLA4 (SEQ ID NO: 41), monkey CTLA4 (e.g., rhesus monkey CTLA4, SEQ ID NO: 43), chimeric CTLA4 (SEQ ID NO: 44), and/or mouse CTLA4 (SEQ ID NO: 42). In some embodiments, the antibody does not bind to human CTLA4 (SEQ ID NO: 41), monkey CTLA4 (e.g., rhesus monkey CTLA4, SEQ ID NO: 43), chimeric CTLA4 (SEQ ID NO: 44), and/or mouse CTLA4 (SEQ ID NO: 42).

В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли (TGI%), который составляет более чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет процент ингибирования роста опухоли, который составляет менее чем 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200%. % TGI можно определить, например, через 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или через 30 дней после начала лечения или через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 или 12 месяцев после начала обработки. Используемый в настоящем описании процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывается по следующей формуле:In some embodiments, the antibody has a percentage tumor growth inhibition (TGI%) that is greater than 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110 %, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% or 200%. In some embodiments, the antibody has a tumor growth inhibition percentage that is less than 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170% , 180%, 190% or 200%. % TGI can be determined, for example, through 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20.21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 or 30 days after the start of treatment or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 or 12 months after the start of treatment. Used in the present description, the percentage of tumor growth inhibition (TGI%) is calculated by the following formula:

TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100

Ti - средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 - средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi - средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 - средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the mean tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero.

Способы получения антител против CTLA4Methods for obtaining antibodies against CTLA4

Выделенный фрагмент человеческого CTLA4 может быть использован в качестве иммуногена для генерирования антител с использованием стандартных методов получения поликлональных и моноклональных антител. Поликлональные антитела могут быть получены у животных путем многократных инъекций (например, подкожных или внутрибрюшинных инъекций) антигенного пептида или белка. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок инъецируют по меньшей мере с одним адъювантом. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид или белок можно конъюгировать с агентом, который является иммуногенным для видов, которые должны быть иммунизированы. Животным можно вводить антигенный пептид или белок более чем один раз (например, дважды, трижды или четыре раза).The isolated fragment of human CTLA4 can be used as an immunogen to generate antibodies using standard methods for obtaining polyclonal and monoclonal antibodies. Polyclonal antibodies can be obtained from animals by multiple injections (eg, subcutaneous or intraperitoneal injections) of the antigenic peptide or protein. In some embodiments, the antigenic peptide or protein is injected with at least one adjuvant. In some embodiments, the antigenic peptide or protein can be conjugated to an agent that is immunogenic to the species to be immunized. Animals can be administered the antigenic peptide or protein more than once (eg twice, thrice or four times).

Можно использовать полноразмерный полипептид или белок или, в качестве альтернативы, можно использовать их антигенные пептидные фрагменты в качестве иммуногенов. Антигенный пептид белка содержит по меньшей мере 8 (например, по меньшей мере 10,15, 20 или 30) аминокислотных остатков аминокислотной последовательности CTLA4 и включает эпитоп белка, так что антитело, образованное против пептида, образует специфический иммунный комплекс с белком. Как описано выше, полноразмерная последовательность человеческого CTLA4 известна в данной области (SEQ ID NO: 41).The full-length polypeptide or protein can be used, or alternatively, antigenic peptide fragments thereof can be used as immunogens. An antigenic peptide of a protein contains at least 8 (eg, at least 10,15, 20, or 30) amino acid residues of the CTLA4 amino acid sequence and includes an epitope of the protein such that an antibody raised against the peptide forms a specific immune complex with the protein. As described above, the full length sequence of human CTLA4 is known in the art (SEQ ID NO: 41).

Иммуноген обычно используется для получения антител путем иммунизации подходящего субъекта (например, человека или трансгенного животного, экспрессирующего по меньшей мере один локус иммуноглобулина человека). Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессируемый или химически синтезированный полипептид (например, фрагмент человеческого CTLA4). Препарат может дополнительно включать адъювант, такой как полный или неполный адъювант Фрейнда, или подобный иммуностимулирующий агент.An immunogen is typically used to generate antibodies by immunizing a suitable subject (eg, a human or a transgenic animal expressing at least one human immunoglobulin locus). A suitable immunogenic preparation may contain, for example, a recombinantly expressed or chemically synthesized polypeptide (eg, a fragment of human CTLA4). The formulation may further include an adjuvant such as complete or incomplete Freund's adjuvant, or a similar immunostimulatory agent.

Поликлональные антитела могут быть получены, как описано выше, путем иммунизации подходящего субъекта полипептидом CTLA4 или его антигенным пептидом (например, частью CTLA4) в качестве иммуногена. Титр антител у иммунизированного субъекта можно контролировать с течением времени стандартными методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием иммобилизованного полипептида или пептида CTLA4. При желании молекулы антитела могут быть выделены из тканей млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищены известными методами, такими как хроматография с протеином А или с протеином G, для получения фракции IgG. В надлежащее время после иммунизации, например, когда титры специфических антител самые высокие, у субъекта могут быть получены клетки, продуцирующие антитела, и использованы для получения моноклональных антител стандартными методами, такими как метод гибридомы, первоначально описанный Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975), метод B-клеточной гибридомы человека (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), метод EBV-гибридомы (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985), или метод триомы. Технология получения гибридом хорошо известна (см., как правило, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело, детектируют путем скрининга супернатантов гибридомной культуры на наличие антител, которые связывают интересующий полипептид или эпитоп, например, с использованием стандартного анализа ИФА.Polyclonal antibodies can be prepared as described above by immunizing a suitable subject with a CTLA4 polypeptide or antigenic peptide (eg, part of CTLA4) as an immunogen. The antibody titer in an immunized subject can be monitored over time by standard methods such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an immobilized polypeptide or CTLA4 peptide. If desired, antibody molecules can be isolated from mammalian tissues (eg, blood) and further purified by known methods such as protein A or protein G chromatography to obtain an IgG fraction. At an appropriate time after immunization, such as when specific antibody titers are highest, antibody-producing cells can be obtained from the subject and used to generate monoclonal antibodies by standard methods, such as the hybridoma method originally described by Kohler et al. (Nature 256: 495-497, 1975), human B-cell hybridoma method (Kozbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983), EBV hybridoma method (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985), or the trioma method. The technology for producing hybridomas is well known (see, in general, Current Protocols in Immunology, 1994, Coligan et al. (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). Monoclonal antibody-producing hybridoma cells are detected by screening hybridoma culture supernatants for antibodies that bind the polypeptide or epitope of interest, for example, using a standard ELISA assay.

Варианты антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут быть получены путем введения соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую человеческое, гуманизированное или химерное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, или путем пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в аминокислотных последовательностях, которые составляют антигенсвязывающий сайт антитела или антигенсвязывающий домен. В популяции таких вариантов некоторые антитела или антигенсвязывающие фрагменты будут иметь повышенную аффинность к белку-мишени, например, CTLA4. Любая комбинация делеций, вставок и/или комбинаций может быть сделана для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который обладает повышенной аффинностью связывания с мишенью. Аминокислотные изменения, введенные в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, также могут изменять или вводить новые посттрансляционные модификации в антитело или антигенсвязывающий фрагмент, такие как изменение (например, увеличение или уменьшение) количества сайтов гликозилирования, изменение типа сайта гликозилирования (например, изменение аминокислотной последовательности так, что ферменты, присутствующие в клетке, присоединяют другой сахар), или введение новых сайтов гликозилирования.Variants of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be obtained by introducing appropriate nucleotide changes into the DNA encoding the human, humanized or chimeric antibody or antigen-binding fragment described herein, or by peptide synthesis. Such variants include, for example, deletions, insertions, or substitutions of residues in amino acid sequences that constitute an antibody antigen-binding site or antigen-binding domain. In a population of such variants, some antibodies or antigen-binding fragments will have increased affinity for the target protein, such as CTLA4. Any combination of deletions, insertions and/or combinations can be made to produce an antibody or antigen-binding fragment thereof that has increased binding affinity for the target. Amino acid changes introduced into an antibody or antigen binding fragment may also change or introduce new post-translational modifications into the antibody or antigen binding fragment, such as changing (e.g., increasing or decreasing) the number of glycosylation sites, changing the type of glycosylation site (e.g., changing the amino acid sequence so that enzymes present in the cell attach another sugar), or the introduction of new glycosylation sites.

Антитела, раскрытые в настоящем описании, могут быть получены из любых видов животных, включая млекопитающих. Неограничивающие примеры нативных антител включают антитела, полученные с использованием людей, приматов, например, обезьян и человекообразных обезьян, коров, свиней, лошадей, овец, верблюдов (например, верблюдов и лам), куриц, коз и грызунов (например, крыс, мышей, хомяков и кроликов), включая трансгенных грызунов, генетически сконструированных для прдуцирования антител человека.The antibodies disclosed in the present description can be obtained from any animal species, including mammals. Non-limiting examples of native antibodies include antibodies made using humans, primates, such as monkeys and great apes, cows, pigs, horses, sheep, camels (e.g., camels and llamas), chickens, goats, and rodents (e.g., rats, mice, hamsters and rabbits), including transgenic rodents genetically engineered to produce human antibodies.

Человеческие и гуманизированные антитела включают антитела, имеющие вариабельные и константные области, полученные из (или имеющие ту же аминокислотную последовательность, что и у полученной последовательности) последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например в CDR.Human and humanized antibodies include antibodies having variable and constant regions derived from (or having the same amino acid sequence as the derived sequence from) human germline immunoglobulin sequences. Human antibodies may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (eg, mutations introduced by in vitro random or site-specific mutagenesis or in vivo somatic mutation), such as in the CDR.

Гуманизированное антитело, как правило, имеет человеческий каркас (FR), трансплантированные CDR, не являющиеся человеческими. Таким образом, гуманизированное антитело имеет одну или более аминокислотных последовательностей, введенных в него из источника, который не является человеческим. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся человеческими, часто называют «импортными» остатками, которые обычно берут из «импортного» вариабельного домена. Гуманизация может быть по существу выполнена с помощью, например, замены CDR грызунов или последовательностей CDR соответствующими последовательностями человеческого антитела. Эти методы описаны, например, в Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536 (1988); каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Соответственно, «гуманизированные» антитела представляют собой химерные антитела, в которых по существу менее чем интактный человеческий V-домен, заменен соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой антитела мыши, в которых некоторые остатки CDR и некоторые остатки FR замещены остатками из аналогичных сайтов в антителах человека.A humanized antibody typically has a human backbone (FR) transplanted with non-human CDRs. Thus, a humanized antibody has one or more amino acid sequences introduced into it from a source that is not human. These non-human amino acid residues are often referred to as "import" residues, which are usually taken from an "import" variable domain. Humanization can be substantially accomplished by, for example, replacing rodent CDRs or CDR sequences with corresponding human antibody sequences. These methods are described, for example, in Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536 (1988); each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Accordingly, "humanized" antibodies are chimeric antibodies in which a substantially less than intact human V-domain has been replaced with a corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically murine antibodies in which some of the CDR residues and some of the FR residues are replaced by residues from analogous sites in human antibodies.

Выбор человеческих доменов VH и VL для использования при создании гуманизированных антител очень важен для снижения иммуногенности. В соответствии с так называемым методом «наилучшего соответствия» последовательность V-домена мышиного антитела подвергается скринингу против всей библиотеки известных последовательностей человеческого домена. Человеческая последовательность, которая наиболее близка к последовательности мыши, затем принимается в качестве FR человека для гуманизированного антитела (Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al. J. Mol. Biol. 196: 901 (1987).The choice of human VH and VL domains to use in generating humanized antibodies is very important to reduce immunogenicity. According to the so-called "best fit" method, the V domain sequence of a mouse antibody is screened against the entire library of known human domain sequences. The human sequence that is closest to that of the mouse is then adopted as the human FR for the humanized antibody (Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al. J. Mol. Biol. 196: 901 (1987 ).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой специфичности и аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела могут быть получены путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и знакомы специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Изучение этих дисплеев позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т. е. анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с его антигеном. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны и объединены из реципиентных и импортных последовательностей так, что достигается желаемая характеристика антитела, такая как повышенная аффинность к целевому антигену (антигенам). In addition, it is important that antibodies be humanized while maintaining high specificity and affinity for the antigen and other favorable biological properties. To achieve this goal, humanized antibodies can be generated by analyzing parental sequences and various conceptual humanized products using 3D models of parental and humanized sequences. Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and familiar to those skilled in the art. Computer programs are available that illustrate and display possible three-dimensional conformational structures of selected candidate immunoglobulin sequences. The study of these displays allows the analysis of the likely role of the residues in the functioning of the candidate immunoglobulin sequence, ie, the analysis of residues that affect the ability of the candidate immunoglobulin to bind to its antigen. Thus, FR residues can be selected and combined from recipient and import sequences such that the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen(s), is achieved.

Обычно варианты аминокислотной последовательности человеческого, гуманизированного или химерного антитела против CTLA4 будут содержать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью, присутствующей в легкой или тяжелой цепи исходного антитела.Typically, amino acid sequence variants of a human, humanized, or chimeric anti-CTLA4 antibody will comprise an amino acid sequence having at least 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity. with the sequence present in the light or heavy chain of the parent antibody.

Идентичность или гомология в отношении исходной последовательности обычно представляет собой процент аминокислотных остатков, присутствующих в последовательности-кандидате, которые идентичны последовательности, присутствующей в человеческом, гуманизированном или химерном антителе против CTLA4 или в его фрагменте, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности, и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, С-концевых или внутренних расширений, делеций или вставок в последовательности антитела не должно рассматриваться как влияющее на идентичность или гомологию последовательности.Parental sequence identity or homology is typically the percentage of amino acid residues present in a candidate sequence that are identical to the sequence present in a human, humanized, or chimeric anti-CTLA4 antibody, or fragment thereof, after sequence alignment and gaps, if necessary, to achieving maximum percent sequence identity, and without considering any conservative substitutions as part of sequence identity. None of the N-terminal, C-terminal or internal extensions, deletions or insertions in the sequence of an antibody should be considered as affecting sequence identity or homology.

Могут быть сделаны дополнительные модификации антител против CTLA4 или антигенсвязывающих фрагментов. Например, остаток(и) цистеина может быть введен в Fc-область, тем самым обеспечивая образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь любое увеличенное время полужизни in vitro и/или in vivo. Гомодимерные антитела с увеличенным периодом полужизни in vitro и/или in vivo также могут быть получены с использованием гетеробифункциональных сшивающих агентов, как описано, например, в Wolff et al. (Cancer Res. 53: 2560-2565, 1993). Альтернативно, может быть сконструировано антитело, которое имеет двойные области Fc (см., например, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230,1989).Additional modifications to the anti-CTLA4 antibodies or antigen-binding fragments can be made. For example, cysteine residue(s) can be introduced into the Fc region, thereby allowing the formation of an interchain disulfide bond in that region. The homodimeric antibody thus obtained may have any increased in vitro and/or in vivo half-life. Homodimeric antibodies with extended in vitro and/or in vivo half-life can also be prepared using heterobifunctional crosslinkers, as described, for example, in Wolff et al. (Cancer Res. 53: 2560-2565, 1993). Alternatively, an antibody can be engineered that has dual Fc regions (see, for example, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230, 1989).

В некоторых вариантах осуществления ковалентная модификация может быть выполнена для антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента. Эти ковалентные модификации могут быть сделаны химическим или ферментативным синтезом или ферментативным или химическим расщеплением. Другие типы ковалентных модификаций антитела или фрагмента антитела вводятся в молекулу путем взаимодействия целевых аминокислотных остатков антитела или фрагмента с органическим дериватизирующим агентом, который способен реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.In some embodiments, a covalent modification may be performed on an anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment thereof. These covalent modifications can be made by chemical or enzymatic synthesis or by enzymatic or chemical cleavage. Other types of covalent modifications of an antibody or antibody fragment are introduced into the molecule by reacting the target amino acid residues of the antibody or fragment with an organic derivatizing agent that is capable of reacting with selected side chains or N- or C-terminal residues.

Рекомбинантные векторыRecombinant vectors

Настоящее раскрытие также относится к рекомбинантным векторам (например, к экспрессирующим векторам), которые включают выделенный полинуклеотид, раскрытый в настоящем описании (например, полинуклеотид, который кодирует полипептид, раскрытый в настоящем описании), к клеткам-хозяевам, в которые вводятся рекомбинантные векторы (т.е. так, что клетки-хозяева содержат полинуклеотид и/или вектор, содержащий полинуклеотид), и к продуцированию полипептидов рекомбинантных антител или их фрагментов рекомбинантными способами.The present disclosure also relates to recombinant vectors (e.g., expression vectors) that include an isolated polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide disclosed herein), to host cells into which recombinant vectors are introduced ( ie, such that the host cells contain the polynucleotide and/or the vector containing the polynucleotide), and to the production of recombinant antibody polypeptides or fragments thereof by recombinant methods.

Используемый в настоящем описании термин «вектор» представляет собой любую конструкцию, способную доставлять один или более представляющих интерес полинуклеотидов в клетку-хозяин, когда вектор вводится в клетку-хозяин. «Экспрессирующий вектор» способен доставлять и экспрессировать один или более представляющих интерес полинуклеотидов в виде кодируемого полипептида в клетке-хозяин, в которую был введен экспрессирующий вектор. Таким образом, в экспрессирующем векторе интересующий полинуклеотид располагается для экспрессии в векторе, будучи функционально связанным с регуляторными элементами, такими как промотор, энхансер и/или поли-А-хвост, либо внутри вектора, либо в геноме клетки-хозяина в области сайта интеграции интересующего полинуклеотида или около нее или фланкируя ее, так что интересующий полинуклеотид будет транслироваться в клетке-хозяине, в которую введен экспрессирующий вектор.As used herein, the term "vector" is any construct capable of delivering one or more polynucleotides of interest to a host cell when the vector is introduced into the host cell. An "expression vector" is capable of delivering and expressing one or more polynucleotides of interest as an encoded polypeptide in a host cell into which the expression vector has been introduced. Thus, in an expression vector, the polynucleotide of interest is located for expression in the vector, being operably linked to regulatory elements such as a promoter, enhancer and/or poly-A tail, either within the vector or in the host cell genome in the region of the integration site of interest. polynucleotide at or near or flanking it such that the polynucleotide of interest will be translated in the host cell into which the expression vector is introduced.

Вектор может быть введен в клетку-хозяина способами, известными в данной области техники, например, электропорацией, химической трансфекцией (например, с использованием DEAE-декстрана), трансформацией, трансфекцией и инфекцией и/или трансдукцией (например, с использованием рекомбинантного вируса). Таким образом, неограничивающие примеры векторов включают вирусные векторы (которые можно использовать для генерирования рекомбинантного вируса), депротеинизированную ДНК или РНК, плазмиды, космиды, фаговые векторы и экспрессирующие векторы ДНК или РНК, связанные с катионными конденсирующими агентами.The vector can be introduced into the host cell by methods known in the art, such as electroporation, chemical transfection (eg using DEAE-dextran), transformation, transfection and infection and/or transduction (eg using a recombinant virus). Thus, non-limiting examples of vectors include viral vectors (which can be used to generate recombinant virus), deproteinized DNA or RNA, plasmids, cosmids, phage vectors, and DNA or RNA expression vectors coupled to cationic condensing agents.

В некоторых осуществлениях полинуклеотид, раскрытый в настоящем описании (например, полинуклеотид, который кодирует полипептид, описанный в настоящем документе), вводят с использованием вирусной системы экспрессии (например, осповакцины или другого вируса оспы, ретровируса или аденовируса), которые могут включать использование непатогенного (дефектного), реплекативно-компетентного вируса или могут использовать реплекативно-дефектный вирус. В последнем случае размножение вируса обычно происходит только в дополняющих клетках, упаковывающих вирус. Подходящие системы раскрыты, например, в Fisher-Hoch et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N. Y. Acad Sci. 569: 86-103; Flexner et al., 1990,Vaccine, 8:17-21; U. S. Pat. No 4603112, 4769330 и 5017487; WO 89/01973; Патент США No. 4777127; GB 2200651; ЕР 0,345,242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al. 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:215-219; Kass-Eisler et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; и Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73: 1202-1207. Методы включения ДНК в такие системы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области. ДНК также может быть «депротеинизированной», как описано, например, в Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, и Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. Поглощение депротеинизированной ДНК может быть увеличено путем нанесения ДНК на биодеградируемые гранулы, которые эффективно транспортируются в клетки.In some embodiments, a polynucleotide disclosed herein (e.g., a polynucleotide that encodes a polypeptide described herein) is administered using a viral expression system (e.g., vaccinia or other vaccinia virus, retrovirus, or adenovirus), which may include the use of a non-pathogenic ( defective), replicative-competent virus, or may use a replicative-defective virus. In the latter case, virus replication usually occurs only in complementary cells that package the virus. Suitable systems are disclosed, for example, in Fisher-Hoch et al. 1989 Proc. Natl. Acad. sci. USA 86:317-321; Flexner et al., 1989, Ann. N. Y. Acad Sci. 569:86-103; Flexner et al., 1990, Vaccine 8:17-21; U. S. Pat. Nos. 4603112, 4769330 and 5017487; WO 89/01973; US Patent No. 4777127; GB 2200651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner-Biotechniques, 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al. 1991, Science, 252: 431-434; Kolls et al. 1994 Proc. Natl. Acad. sci. USA 91:215-219; Kass-Eisler et al. 1993 Proc. Natl. Acad. sci. USA 90:11498-11502; Guzman et al., 1993, Circulation, 88: 2838-2848; and Guzman et al., 1993, Cir. Res. 73:1202-1207. Methods for incorporating DNA into such expression systems are well known to those skilled in the art. The DNA can also be "deproteinized" as described, for example, in Ulmer et al., 1993, Science, 259: 1745-1749, and Cohen, 1993, Science, 259: 1691-1692. The uptake of deproteinized DNA can be increased by depositing the DNA on biodegradable beads that are efficiently transported into cells.

Для экспрессии ДНК-вставка, содержащая полинуклеотид, кодирующий антитело или кодирующий полипептид, описанный в настоящем документе, может быть функционально связана с подходящим промотором (например, гетерологичным промотором), таким как промотор фага лямбда PL, промоторами E.coli lac, trp и tac, ранними и поздними промоторами SV40 и промоторами ретровирусных LTR, и со многими другими. Другие подходящие промоторы известны специалисту в данной области. Экспрессирующие конструкции могут дополнительно содержать сайты инициации, терминации транскрипции и, в транскрибируемой области, сайт связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, может включать в себя кодон инициации трансляции в начале и терминирующий кодон (UAA, UGA или UAG), соответствующим образом расположенный на конце полипептида, подлежащего трансляции.For expression, a DNA insert containing a polynucleotide encoding an antibody or encoding a polypeptide described herein may be operably linked to a suitable promoter (e.g., a heterologous promoter) such as the lambda phage PL promoter, the E. coli lac, trp, and tac promoters. , early and late SV40 promoters and retroviral LTR promoters, and many others. Other suitable promoters are known to the person skilled in the art. Expression constructs may further contain sites for transcription initiation, termination, and, in the transcribed region, a ribosome binding site for translation. The coding portion of mature transcripts expressed by these constructs may include a translation initiation codon at the beginning and a termination codon (UAA, UGA or UAG) appropriately located at the end of the polypeptide to be translated.

Как указано, экспрессирующие векторы могут включать по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают гены устойчивости к дигидрофолатредуктазе или неомицину для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину для культивирования в E.coli и других бактериях. Репрезентативные примеры подходящих хозяев включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки, такие как клетки E.coli, Streptomyces и Salmonella typhimurium; грибковые клетки, такие как дрожжевые клетки; клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и Spodoptera Sf9; животные клетки, такие как клетки СНО, COS, меланомы Bowes и клетки HK 293; и растительные клетки. Подходящие культуральные среды и условия для клеток-хозяев, описанные в настоящем документе, известны в данной области.As indicated, expression vectors may include at least one selectable marker. Such markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance genes for eukaryotic cell culture, and tetracycline or ampicillin resistance genes for culture in E. coli and other bacteria. Representative examples of suitable hosts include, but are not limited to, bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium cells; fungal cells such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells such as CHO, COS, Bowes melanoma and HK 293 cells; and plant cells. Suitable culture media and host cell conditions described herein are known in the art.

Неограничивающие примеры векторов для использования в бактериях включают pQE70, pQE60 и pQE-9, доступные от Qiagen; векторы pBS, векторы Phagescript, векторы Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, доступные от Stratagene; и ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, доступные от Pharmacia. Неограничивающие эукариотические векторы включают pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, доступные от Stratagene; и pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL, доступные от Pharmacia. Другие подходящие векторы будут очевидны для специалиста в данной области.Non-limiting examples of vectors for use in bacteria include pQE70, pQE60 and pQE-9 available from Qiagen; pBS vectors, Phagescript vectors, Bluescript vectors, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A available from Stratagene; and ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia. Non-limiting eukaryotic vectors include pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG available from Stratagene; and pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL available from Pharmacia. Other suitable vectors will be apparent to those skilled in the art.

Неограничивающие примеры бактериальных промоторов, подходящих для использования, включают промоторы E.coli lacI и lacZ, промоторы T3 и T7, промотор gpt, промоторы лямбда PR и PL и промотор trp. Подходящие эукариотические промоторы включают немедленный ранний промотор CMV, промотор тимидинкиназы HSV, ранний и поздний промоторы SV40,промоторы ретровирусных LTR, такие как промоторы вируса саркомы Рауса (RSV), и промоторы металлотионеина, такие как промотор металлотионеина-I мыши.Non-limiting examples of bacterial promoters suitable for use include the E. coli lacI and lacZ promoters, the T3 and T7 promoters, the gpt promoter, the PR and PL lambda promoters, and the trp promoter. Suitable eukaryotic promoters include the CMV immediate early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the SV40 early and late promoters, retroviral LTR promoters such as Rous sarcoma virus (RSV) promoters, and metallothionein promoters such as the mouse metallothionein-I promoter.

В дрожжах Saccharomyces cerevisiae может быть использован ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как промоторы альфа-фактора, алкогольоксидазы и PGH. Для обзоров см. Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y, и Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1997). In the yeast Saccharomyces cerevisiae, a number of vectors can be used containing constitutive or inducible promoters such as the alpha factor, alcohol oxidase and PGH promoters. For reviews, see Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y, and Grant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1997).

Введение конструкции в клетку-хозяина может осуществляться кальцийфосфатной трансфекцией, трансфекцией, опосредованной DEAE-декстраном, трансфекцией, опосредованной катионными липидами, электропорацией, трансдукцией, инфекцией или другими методами. Такие методы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).Introduction of the construct into the host cell may be by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, infection, or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals such as Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Транскрипция ДНК, кодирующей антитело по настоящему изобретению, высшими эукариотами может быть увеличена путем введения энхансерной последовательности в вектор. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно приблизительно от 10 до 300 п.н., которые действуют для увеличения транскрипционной активности промотора в данном типе клеток-хозяев. Примеры энхансеров включают энхансер SV40, который расположен в участке позднего начала репликации на расстоянии 100-270 п.н., энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на участке позднего начала репликации и энхансеры аденовируса.Transcription of DNA encoding an antibody of the present invention by higher eukaryotes can be increased by introducing an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting DNA elements, typically about 10 to 300 bp, that act to increase the transcriptional activity of a promoter in a given host cell type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, which is located at the late origin of replication at a distance of 100-270 bp, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polyoma enhancer at the late origin of replication, and adenovirus enhancers.

Для секреции транслированного белка в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду соответствующие сигналы секреции могут быть включены в экспрессированный полипептид. Сигналы могут быть эндогенными для полипептида или они могут быть гетерологичными сигналами.For secretion of the translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space, or into the extracellular environment, appropriate secretion signals can be included in the expressed polypeptide. The signals may be endogenous to the polypeptide or they may be heterologous signals.

Полипептид (например, антитело) может быть экспрессирован в модифицированной форме, такой как слитый белок (например, GST-слитый) или с гистидиновой меткой и может включать не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, область дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, может быть добавлена к N-концу полипептида для улучшения стабильности и устойчивости в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующей обработки и хранения. Также пептидные фрагменты могут быть добавлены к полипептиду для облегчения очистки. Такие области могут быть удалены до окончательного получения полипептида. Добавление пептидных фрагментов к полипептидам, чтобы вызвать секрецию или экскрецию, чтобы улучшить стабильность и облегчить очистку, среди прочего, являются известными и обычными методами в данной области.The polypeptide (eg, antibody) may be expressed in a modified form, such as a fusion protein (eg, GST fusion) or with a histidine tag, and may include not only secretion signals, but also additional heterologous functional regions. For example, a region of additional amino acids, in particular charged amino acids, may be added to the N-terminus of the polypeptide to improve stability and stability in the host cell, during purification, or during subsequent processing and storage. Also, peptide fragments can be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions may be removed prior to the final production of the polypeptide. The addition of peptide fragments to polypeptides to induce secretion or excretion, to improve stability and facilitate purification, among other things, are known and conventional techniques in the art.

Методы леченияTreatment Methods

Антитела или антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть использованы для различных терапевтических целей. В одном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения злокачественного новообразования у пациента, способам снижения скорости увеличения объема опухоли у пациента с течением времени, способам снижения риска развития метастазирования или способам снижения риска развития дополнительного метастазирования у пациента. В некоторых вариантах осуществления лечение может останавливать, замедлять, тормозить или ингибировать прогрессирование злокачественного новообразования. В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к уменьшению количества, тяжести и/или продолжительности одного или более симптомов злокачественного новообразования у пациента.The antibodies or antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention can be used for various therapeutic purposes. In one aspect, the present invention relates to methods for treating cancer in a patient, methods for reducing the rate of tumor expansion in a patient over time, methods for reducing the risk of developing metastasis, or methods for reducing the risk of developing additional metastasis in a patient. In some embodiments, the implementation of the treatment can stop, slow down, slow down or inhibit the progression of a malignant neoplasm. In some embodiments, treatment may result in a reduction in the number, severity, and/or duration of one or more symptoms of cancer in a patient.

В одном аспекте раскрытие относится к способам, которые включают введение терапевтически эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, раскрытого в настоящем описании, пациенту, нуждающемуся в этом (например, пациенту, имеющему или идентифицированному или диагностированному как имеющий злокачественное новообразование), например, рак молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), карциноидный рак, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, мелкоклеточный рак легких, лимфома, меланома, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак почки, колоректальный рак, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак уретры или гемобластоз. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование представляет собой неоперабельную меланому или метастатическую меланому, немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря или метастатический гормонально рефрактерный рак предстательной железы.In one aspect, the disclosure relates to methods that include administering a therapeutically effective amount of an antibody or antigen-binding fragment disclosed herein to a patient in need thereof (e.g., a patient having or identified or diagnosed as having a malignancy), e.g., breast cancer glands (eg, triple-negative breast cancer), carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, lymphoma, melanoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, cancer prostate cancer, kidney cancer, colorectal cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer, bladder cancer, urethral cancer, or hemoblastosis. In some embodiments, the cancer is unresectable melanoma or metastatic melanoma, non-small cell lung cancer (NSCLC), small cell lung cancer (SCLC), bladder cancer, or metastatic hormone-refractory prostate cancer.

В некоторых вариантах осуществления композиции и способы, раскрытые в настоящем описании, можно использовать для лечения пациентов с риском развития злокачественного новообразования. Пациентов, имеющих злокачественные новообразования, можно идентифицировать различными способами, известными в данной области.In some embodiments, the compositions and methods disclosed herein can be used to treat patients at risk of developing cancer. Patients having malignant neoplasms can be identified by various methods known in the art.

Используемый в настоящем описании термин «эффективное количество» означает количество или дозу, достаточные для достижения полезных или желаемых результатов, включая остановку, замедление, торможение или ингибирование прогрессирования заболевания, например, злокачественного новообразования. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости от, например, возраста и массы тела пациента, которому следует вводить антитело, антигенсвязывающий фрагмент, полинуклеотид, кодирующий антитело, вектор, содержащий полинуклеотид, и/или их составов, тяжести симптомов и пути введения, и таким образом введение может быть определено на индивидуальной основе.As used herein, the term "effective amount" means an amount or dose sufficient to achieve beneficial or desired results, including stopping, slowing, inhibiting, or inhibiting the progression of a disease, such as cancer. The effective amount will vary depending on, for example, the age and body weight of the patient to whom the antibody, antigen binding fragment, polynucleotide encoding the antibody, the vector containing the polynucleotide, and/or compositions thereof, the severity of the symptoms, and the route of administration are to be administered, and thus administration can be determined on an individual basis.

Эффективное количество может быть введено за одно или более введений. В качестве примера, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента представляет собой количество, достаточное для ослабления, остановки, стабилизации, реверсии, ингибирования, замедления и/или задержки прогрессирования злокачественного новообразования у пациента, или представляет собой количество, достаточное для ослабления, остановки, стабилизации, реверсии, ингибирования, замедления и/или задержки пролиферации клетки (например, биоптатной клетки, любой из опухолевых клеток, описанных в настоящем документе, или клеточной линии (например, опухолевой клеточной линии)) in vitro. Как понятно в данной области, эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента может варьироваться в зависимости, в частности, от истории болезни пациента, а также от других факторов, таких как тип (и/или дозировка) используемого антитела.An effective amount may be administered in one or more administrations. By way of example, an effective amount of an antibody or antigen binding fragment is an amount sufficient to attenuate, arrest, stabilize, reverse, inhibit, slow and/or delay the progression of cancer in a patient, or is an amount sufficient to attenuate, arrest, stabilize, reversing, inhibiting, slowing and/or delaying the proliferation of a cell (eg, a biopsy cell, any of the tumor cells described herein, or a cell line (eg, a tumor cell line)) in vitro. As is understood in the art, the effective amount of an antibody or antigen-binding fragment may vary depending, in part, on the patient's medical history, as well as other factors such as the type (and/or dosage) of the antibody used.

Эффективные количества и схемы введения антител, полинуклеотидов, кодирующих антитела, и/или композиций, раскрытых в настоящем описании, могут быть определены эмпирически, и такие определения в компетенции специалистов в данной области. Специалистам в данной области будет понятно, что дозировка, которая должна быть введена, будет варьироваться в зависимости, например, от млекопитающего, которое получает антитела, полинуклеотиды, кодирующие антитела, и/или композиции, раскрытые в настоящем описании, от пути введения, конкретного типа используемых антител, полинуклеотидов, кодирующих антитела, антигенсвязывающих фрагментов и/или композиций, раскрытых в настоящем описании, и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору подходящих доз для антитела или антигенсвязывающего фрагмента можно найти в литературе по терапевтическому применению антител и антигенсвязывающих фрагментов, например, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds. Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.Effective amounts and administration schedules for the antibodies, antibody-encoding polynucleotides, and/or compositions disclosed herein may be empirically determined, and such determinations are within the purview of those skilled in the art. Those skilled in the art will appreciate that the dosage to be administered will vary depending on, for example, the mammal receiving the antibodies, antibody-encoding polynucleotides, and/or compositions disclosed herein, the route of administration, the particular type used antibodies, polynucleotides encoding antibodies, antigen-binding fragments and/or compositions disclosed in the present description, and other drugs administered to a mammal. Guidance on the selection of appropriate doses for an antibody or antigen binding fragment can be found in the literature on the therapeutic use of antibodies and antigen binding fragments, for example, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds. Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389.

Типичная суточная доза эффективного количества антитела составляет 0,01 мг/кг - 100 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять менее чем100 мг/кг, 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка может составлять более чем 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,05 мг/кг или 0,01 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления дозировка составляет примерно 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0. 5 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,2 мг/кг или 0,1 мг/кг.A typical daily dose of an effective amount of the antibody is 0.01 mg/kg - 100 mg/kg. In some embodiments, the dosage may be less than 100 mg/kg, 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg /kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg or 0.1 mg/kg. In some embodiments, the dosage may be greater than 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.05 mg/kg or 0.01 mg/kg. In some embodiments, the dosage is about 10 mg/kg, 9 mg/kg, 8 mg/kg, 7 mg/kg, 6 mg/kg, 5 mg/kg, 4 mg/kg, 3 mg/kg, 2 mg/kg. kg, 1mg/kg, 0.9mg/kg, 0.8mg/kg, 0.7mg/kg, 0.6mg/kg, 0.5mg/kg, 0.4mg/kg, 0 .3 mg/kg, 0.2 mg/kg or 0.1 mg/kg.

В любом из способов, описанных в настоящем документе, по меньшей мере одно антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или фармацевтическая композиция (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе), и, необязательно, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент можно вводить пациенту, по меньшей мере, один раз в неделю (например, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два разных антитела и/или антигенсвязывающих фрагмента вводят в одной и той же композиции (например, в жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в одной и той же композиции (например, в жидкой композиции). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в двух разных композициях (например, в жидкой композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и в твердой пероральной композиции, содержащей по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент вводят в виде пилюли, таблетки или капсулы. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один дополнительный терапевтический агент вводят в пероральной композиции с замедленным высвобождением.In any of the methods described herein, at least one antibody, its antigen-binding fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein), and optionally at least one the additional therapeutic agent can be administered to the patient at least once a week (for example, once a week, twice a week, three times a week, four times a week, once a day, twice a day or three times in a day). In some embodiments, at least two different antibodies and/or antigen-binding fragments are administered in the same composition (eg, liquid composition). In some embodiments, at least one antibody or antigen-binding fragment and at least one additional therapeutic agent are administered in the same composition (eg, in a liquid composition). In some embodiments, at least one antibody or antigen binding fragment and at least one additional therapeutic agent are administered in two different compositions (e.g., a liquid composition containing at least one antibody or antigen binding fragment and a solid oral composition containing at least one additional therapeutic agent). In some embodiments, at least one additional therapeutic agent is administered as a pill, tablet, or capsule. In some embodiments, at least one additional therapeutic agent is administered in a sustained release oral composition.

В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов можно вводить пациенту до или после введения по меньшей мере одного антитела, антигенсвязывающего фрагмента антитела или фармацевтической композиции (например, любого из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе). В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных терапевтических агентов и, по меньшей мере, одно антитело, антигенсвязывающий фрагмент антитела или фармацевтическая композиция (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антител или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе), вводится пациенту таким образом, что имеет место перекрывание периода биологической активности одного или более дополнительных терапевтических агентов и по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе) у пациента.In some embodiments, one or more additional therapeutic agents may be administered to a patient before or after administration of at least one antibody, antibody antigen-binding fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antibody antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein). In some embodiments, one or more additional therapeutic agents and at least one antibody, antibody antigen-binding fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antibody antigen-binding fragments, or pharmaceutical compositions described herein) is administered to a patient in a manner that there is an overlap in the biological activity of one or more additional therapeutic agents and at least one antibody or antigen-binding fragment (eg, any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein) in a patient.

В некоторых вариантах осуществления пациенту можно вводить по меньшей мере одно антитело, фрагмент антигенсвязывающего антитела или фармацевтическую композицию (например, любое из антител, антигенсвязывающих фрагментов антитела или фармацевтических композиций, описанных в настоящем документе) в течение продолжительного периода времени (например, в течение периода, составляющего по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев, 12 месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или 5 лет). Квалифицированный медицинский работник может определить продолжительность периода лечения, используя любой из методов, описанных в настоящем документе, для диагностики или отслеживания эффективности лечения (например, наблюдения по меньшей мере одного симптома злокачественного новообразования). Как описано в настоящем документе, квалифицированный медик может также изменить идентичность и количество (например, увеличение или уменьшение) антител или антигенсвязывающих фрагментов антител (и/или одного или более дополнительных терапевтических агентов), вводимых пациенту, и, кроме того, может регулироваться (например, увеличиваться или уменьшаться) дозировка или частота введения по меньшей мере одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела (и/или одного или более дополнительных терапевтических агентов) пациенту на основании оценки эффективности лечения (например, с использованием любого из способов, описанных в настоящем документе и известных в данной области техники).In some embodiments, at least one antibody, antigen-binding antibody fragment, or pharmaceutical composition (e.g., any of the antibodies, antigen-binding antibody fragments, or pharmaceutical compositions described herein) may be administered to a patient for an extended period of time (e.g., for a period at least 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years or 5 years). A qualified medical professional can determine the duration of the treatment period using any of the methods described herein to diagnose or monitor the effectiveness of treatment (eg, observation of at least one symptom of malignancy). As described herein, the identity and amount (e.g., increase or decrease) of antibodies or antibody antigen-binding fragments (and/or one or more additional therapeutic agents) administered to a patient may also be altered by the skilled physician, and may further be adjusted (e.g., , increase or decrease) dosage or frequency of administration of at least one antibody or antigen-binding fragment of an antibody (and/or one or more additional therapeutic agents) to a patient based on an assessment of the effectiveness of treatment (for example, using any of the methods described herein and known in this technical field).

Фармацевтические композиции и пути введенияPharmaceutical compositions and routes of administration

Также в настоящем описании предложены фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере одно (например, одно, два, три или четыре) из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе. Два или более (например, два, три или четыре) любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут присутствовать в фармацевтической композиции в любой комбинации. Фармацевтические композиции могут быть составлены любым способом, известным в данной области.Also provided herein are pharmaceutical compositions that contain at least one (eg, one, two, three, or four) of the antibodies or antigen-binding fragments described herein. Two or more (eg, two, three or four) of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein may be present in a pharmaceutical composition in any combination. Pharmaceutical compositions may be formulated by any method known in the art.

Фармацевтические композиции составлены так, чтобы они были совместимы с их назначенным путем введения (например, внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным или внутрибрюшинным). Композиции могут включать стерильный разбавитель (например, стерильную воду или физиологический раствор), жирное масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители, антибактериальные или противогрибковые агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновая кислота, тимеросал и тому подобное, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота, буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и изотонические агенты, такие как сахара (например, декстроза), полиспирты (например, маннит или сорбит) или соли (например, хлорид натрия) или любую их комбинацию. Липосомные суспензии также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей (см., например, Патент США № 4522811). Препараты композиций могут быть составлены и заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократными дозами. При необходимости (как, например, в инъецируемых составах) надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин или поверхностно-активное вещество. Абсорбция антитела или его антигенсвязывающего фрагмента может быть продлена путем включения агента, который задерживает абсорбцию (например, моностеарата алюминия и желатина). Альтернативно, контролируемое высвобождение может быть достигнуто с помощью имплантатов и микрокапсулированных систем доставки, которые могут включать биодеградируемые, биосовместимые полимеры (например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота; Alza Corporation и Nova Pharmaceutical, Inc.).Pharmaceutical compositions are formulated to be compatible with their intended route of administration (eg, intravenous, intra-arterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal). The compositions may include a sterile diluent (eg, sterile water or saline), a fatty oil, polyethylene glycol, glycerin, propylene glycol, or other synthetic solvents, antibacterial or antifungal agents such as benzyl alcohol or methyl parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like. the like, antioxidants such as ascorbic acid or sodium bisulfite, chelating agents such as ethylenediaminetetraacetic acid, buffers such as acetates, citrates or phosphates, and isotonic agents such as sugars (eg dextrose), polyalcohols (eg mannitol or sorbitol ) or salts (eg sodium chloride) or any combination thereof. Liposomal suspensions can also be used as pharmaceutically acceptable carriers (see, for example, US Patent No. 4522811). The formulations of the compositions may be formulated and enclosed in ampoules, disposable syringes or multiple dose vials. If necessary (as, for example, in injectable formulations), proper fluidity can be maintained, for example, by using a coating such as lecithin or a surfactant. Absorption of an antibody or antigen-binding fragment thereof can be prolonged by the inclusion of an agent that delays absorption (eg, aluminum monostearate and gelatin). Alternatively, controlled release can be achieved with implants and microencapsulated delivery systems that may include biodegradable, biocompatible polymers (e.g., ethylene vinyl acetate, polyanhydrides, polyglycolic acid, collagen, polyorthoesters, and polylactic acid; Alza Corporation and Nova Pharmaceutical, Inc.).

Композиции, содержащие одно или более из любых антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, могут быть составлены для парентерального введения (например, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, подкожного или внутрибрюшинного) в стандартной лекарственной форме (т. е. в физически дискретных единицах, содержащих заранее определенное количество активного соединения для простоты введения и единообразия дозировки).Compositions containing one or more of any of the antibodies or antigen-binding moieties described herein may be formulated for parenteral administration (e.g., intravenous, intra-arterial, intramuscular, intradermal, subcutaneous, or intraperitoneal) in unit dosage form (i.e., in a physically discrete units containing a predetermined amount of the active compound for ease of administration and dosage uniformity).

Токсичность и терапевтическую эффективность композиций можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных (например, обезьянах). Можно, например, определить LD50 (доза, летальная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции): терапевтический индекс представляет собой соотношение LD50:ED50. Агенты, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Если агент проявляет нежелательный побочный эффект, следует позаботиться о том, чтобы минимизировать потенциальный ущерб (т.е. уменьшить нежелательные побочные эффекты). Токсичность и терапевтическая эффективность могут быть определены другими стандартными фармацевтическими процедурами.The toxicity and therapeutic efficacy of the compositions can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell cultures or experimental animals (eg, monkeys). It is possible, for example, to determine LD50 (dose lethal in 50% of the population) and ED50 (dose therapeutically effective in 50% of the population): the therapeutic index is the ratio of LD50:ED50. Agents that exhibit high therapeutic indices are preferred. If an agent exhibits an undesirable side effect, care should be taken to minimize the potential harm (ie, reduce undesired side effects). Toxicity and therapeutic efficacy may be determined by other standard pharmaceutical procedures.

Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при составлении подходящей дозы любого данного агента для применения у пациента (например, у человека). Терапевтически эффективное количество одного или более (например, одного, двух, трех или четырех) из антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, любого из антител или фрагментов антител, описанных в настоящем документе), будет представлять собой количество, которое лечит заболевание у пациента (например, убивает опухолевые клетки) у пациента (например, у пациента-человека, у которого выявлено злокачественное новообразование), или у пациента с риском развития заболевания (например, у пациента, у которого ранее развилось злокачественное новообразование, но теперь оно было излечено), уменьшает тяжесть, частоту и/или продолжительность одного или более симптомов заболевания у пациента (например, у человека). Эффективность и дозировка любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, может быть определена медиком или ветеринарным врачом с использованием способов, известных в данной области, а также путем наблюдения одного или более симптомов заболевания у пациента (например, у человека). Определенные факторы могут влиять на дозировку и сроки, необходимые для эффективного лечения пациента (например, тяжесть заболевания или расстройства, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст пациента и наличие других заболеваний).Data obtained from cell culture assays and animal studies can be used in formulating an appropriate dose of any given agent for use in a patient (eg, a human). A therapeutically effective amount of one or more (e.g., one, two, three, or four) of the antibodies or antigen-binding fragments thereof (e.g., any of the antibodies or antibody fragments described herein) will be the amount that treats the disease in the patient ( kills tumor cells) in a patient (eg, a human patient who has been diagnosed with cancer) or a patient at risk of developing a disease (eg, a patient who previously developed cancer but has now been cured), reduces the severity, frequency, and/or duration of one or more symptoms of a disease in a patient (eg, a human). The potency and dosage of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein can be determined by the physician or veterinarian using methods known in the art and by observing one or more symptoms of a disease in a patient (e.g., a human). Certain factors may influence the dosage and timing required to effectively treat a patient (eg, severity of disease or disorder, prior treatment, general health and/or age of the patient, and presence of other medical conditions).

Примерные дозы включают количества миллиграмм или микрограммов любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящем документе, на килограмм массы пациента (например, примерно от 1 мкг/кг примерно до 500 мг/кг; примерно от 100 мкг/кг примерно до 500 мг/кг; примерно от 100 мкг/кг примерно до 50 мг/кг; примерно от 10 мкг/кг примерно до 5 мг/кг; примерно от 10 мкг/кг примерно до 0,5 мг/кг; или примерно от 1 мкг/кг примерно до 50 мкг/кг). Хотя эти дозы охватывают широкий диапазон, специалист в данной области поймет, что терапевтические агенты, включая антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, различаются по своей эффективности, и эффективные количества могут быть определены способами, известными в данной области. Как правило, сначала вводят относительно низкие дозы, а лечащий врач или ветеринарный врач (в случае терапевтического применения) или исследователь (на стадии разработки) могут впоследствии и постепенно увеличивать дозу до соответствующего получаемого ответа. Кроме того, подразумевается, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион питания пациента, время введения, пути введения, скорости выведения и времени полужизни антитела или фрагмента антитела in vivo.Exemplary dosages include milligram or microgram amounts of any of the antibodies or antigen-binding fragments described herein per kilogram of patient weight (e.g., about 1 µg/kg to about 500 mg/kg; about 100 µg/kg to about 500 mg/kg). kg; from about 100 µg/kg to about 50 mg/kg; from about 10 µg/kg to about 5 mg/kg; from about 10 µg/kg to about 0.5 mg/kg; or from about 1 µg/kg up to about 50 µg/kg). While these doses cover a wide range, one of skill in the art will appreciate that therapeutic agents, including antibodies and antigen-binding fragments thereof, vary in potency and effective amounts can be determined by methods known in the art. Typically, relatively low doses are administered initially, and the physician or veterinarian (in the case of therapeutic use) or researcher (under development) can subsequently and gradually increase the dose until the appropriate response is obtained. Furthermore, it is contemplated that the particular dosage level for any particular patient will depend on a variety of factors, including the potency of the particular compound used, age, body weight, general health, sex and diet of the patient, time of administration, route of administration, rate of elimination, and time half-life of the antibody or antibody fragment in vivo.

Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку или дозатор вместе с инструкциями для введения.Pharmaceutical compositions may be included in a container, pack or dispenser along with instructions for administration.

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Изобретение далее описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем изобретения, описанный в формуле изобретения.The invention is further described in the following examples, which do not limit the scope of the invention as described in the claims.

Пример 1 Генерирование мышиных антител против hCTLA4Example 1 Generation of mouse anti-hCTLA4 antibodies

Для создания мышиных антител против человеческого CTLA4 (hCTLA4; SEQ ID NO: 41) мышей BALB/возрастом 6-8 недель иммунизировали человеческим CTLA4. Антитела против hCTLA4 собирали способами, описанными ниже (ФИГ. 1 и ФИГ. 2).To generate mouse antibodies against human CTLA4 (hCTLA4; SEQ ID NO: 41), BALB/6-8 week old mice were immunized with human CTLA4. Anti-hCTLA4 antibodies were collected using the methods described below (FIG. 1 and FIG. 2).

Иммунизация мышейImmunization of mice

Самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель иммунизировали белками CTLA4 человека, содержащими his-маркер, в дозе 20 мкг/мышь в концентрации 100 мкг/мл. Белки CTLA4 человека с маркером his эмульгировали с адъювантом и инъецировали в четыре положения на спине мышей. Для первой подкожной (s. с.) инъекции, разбавленный антиген эмульгировали с использованием полного адъюванта Фрейнда (CFA) в равном объеме. В следующих подкожных инъекциях белок был эмульгирован с неполным адъювантом Фрейнда (IFA) в равном объеме. Через три дня после третьей инъекции или бустерной иммунизации кровь (сыворотку) собирали и анализировали на титр антител с использованием ИФА.Female BALB/c mice aged 6-8 weeks were immunized with human CTLA4 proteins containing his marker at a dose of 20 μg/mouse at a concentration of 100 μg/ml. Human CTLA4 proteins with his marker were emulsified with adjuvant and injected at four positions on the back of mice. For the first subcutaneous (s.c.) injection, the diluted antigen was emulsified using an equal volume of Freund's complete adjuvant (CFA). In the following subcutaneous injections, the protein was emulsified with an equal volume of Incomplete Freund's Adjuvant (IFA). Three days after the third injection or booster immunization, blood (serum) was collected and analyzed for antibody titer using ELISA.

В другом эксперименте иммунизировали самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель путем введения экспрессирующей плазмиды, кодирующей человеческий CTLA4, мышам. Плазмиды, кодирующие антиген, вводили в переднюю мышцу большеберцовой кости (внутримышечная инъекция; т.е. m. инъекция) мышей с использованием генной пушки в концентрации 1000 мкг/мкл при 60 мкг на мышь. По меньшей мере четыре инъекции были выполнены с интервалами по меньшей мере 14 дней между каждой инъекцией. Кровь (сыворотку) собрали через семь дней после последней иммунизации, и сыворотку проверяли на титр антител с помощью ИФА.In another experiment, 6-8 week old female BALB/c mice were immunized by injecting an expression plasmid encoding human CTLA4 into the mice. Plasmids encoding the antigen were injected into the tibialis anterior muscle (IM injection; ie, m. injection) of mice using a gene gun at a concentration of 1000 μg/μl at 60 μg per mouse. At least four injections were performed at intervals of at least 14 days between each injection. Blood (serum) was collected seven days after the last immunization and the serum was checked for antibody titer by ELISA.

Процедуры для усиления иммунизации также проводили по меньшей мере через четырнадцать дней после предыдущей иммунизации (либо путем инъекции плазмиды, либо путем введения белков). Клетки СНО, которые экспрессируют антиген CTLA4 на поверхности, внутривенно инъецировали мышам через хвостовые вены. Затем селезенку собирали через четыре дня после инъекции.Boosted immunization procedures were also performed at least fourteen days after the previous immunization (either by plasmid injection or protein injection). CHO cells that express the CTLA4 antigen on the surface were intravenously injected into mice via the tail veins. The spleen was then harvested four days after injection.

Слияние клеток SP2/0 и клеток селезенкиFusion of SP2/0 cells and spleen cells

Ткани селезенки были измельчены. Клетки селезенки сначала отбирали с помощью микрогранул CD3ε и микрогранул с антителом против мышиного IgM, а затем сливали с клетками SP2/0. Затем клетки высевали в 96-луночные планшеты со средой гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT).The spleen tissues were minced. Spleen cells were first selected with CD3ε microbeads and anti-mouse IgM microbeads and then fused with SP2/0 cells. The cells were then seeded in 96-well plates with hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium.

Первичный скрининг гибридомыPrimary screening for hybridoma

Первичный скрининг супернатанта гибридомы в 96-луночных планшетах проводили с использованием флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) в соответствии со стандартными процедурами. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) добавляли в 96-луночные планшеты (2×10⁴ клеток на лунку) перед скринингом. Использовали 50 мкл супернатанта. Антитела, которые были использованы в экспериментах, представляли собойPrimary screening of hybridoma supernatant in 96-well plates was performed using fluorescent activated cell sorting (FACS) according to standard procedures. Chinese hamster ovary (CHO) cells were added to 96-well plates (2×10 ⁴ cells/well) prior to screening. 50 µl of supernatant was used. The antibodies used in the experiments were

(1) Конъюгированный с флуоресцеином (FITC) AffiniPure козий F(ab)₂-фрагмент против мышиного IgG, специфичный к Fcγ-фрагменту, и(1) AffiniPure fluorescein-conjugated (FITC) goat F(ab) ₂ fragment against mouse IgG specific for the Fcγ fragment, and

(2) Alexa Fluor®-647-конъюгированный AffiniPure козий F(ab)₂-фрагмент против человеческого IgG, специфичный для Fcγ-фрагмента.(2) Alexa Fluor®-647 AffiniPure conjugated goat F(ab) ₂ fragment against human IgG Fcγ fragment specific.

Субклонированиеsubcloning

Субклонирование проводили с использованием ClonePix2. Вкратце, положительные лунки, идентифицированные во время первичного скрининга, переносили в полутвердую среду, и IgG-положительные клоны идентифицировали и тестировали. Использовали FITC-конъюгипрованное Fc-антитело против мышиного IgG.Subcloning was performed using ClonePix2. Briefly, positive wells identified during the primary screen were transferred to semi-solid medium and IgG positive clones were identified and tested. A FITC-conjugated anti-mouse IgG Fc antibody was used.

Асцитная жидкость антителAscitic fluid of antibodies

1×10⁶ положительных клеток гибридомы вводили внутрибрюшинно мышам B-NDG® (Beijing Biocytogen, Пекин, Китай). Моноклональные антитела были получены путем выращивания клеток гибридомы в брюшной полости мыши. Клетки гибридомы размножались и производили асцитную жидкость в брюшной полости мышей. Жидкость содержала высокую концентрацию антител, которые можно собирать для последующего использования.1×10 ⁶ positive hybridoma cells were administered intraperitoneally to B-NDG® mice (Beijing Biocytogen, Beijing, China). Monoclonal antibodies were obtained by growing hybridoma cells in the abdominal cavity of a mouse. Hybridoma cells proliferated and produced ascitic fluid in the abdominal cavity of mice. The fluid contained a high concentration of antibodies that could be collected for later use.

Очистка антителPurification of antibodies

Антитела в асцитной жидкости очищали с использованием белковой хроматографии GE AKTA (GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс, США). CT4-04-13A4 («13A4»), CT4-03-4G12 («4G12»), CT4-20-6D2 («6D2») и CT4-20-7E12 («7E12») были среди мышиных антител, полученных методами, описанными выше. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи этих антител представлены на ФИГ. 27Antibodies in ascitic fluid were purified using GE AKTA protein chromatography (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). CT4-04-13A4 ("13A4"), CT4-03-4G12 ("4G12"), CT4-20-6D2 ("6D2"), and CT4-20-7E12 ("7E12") were among the mouse antibodies generated by the methods described above. The amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable regions of these antibodies are shown in FIG. 27

Пример 2. Гуманизация мышиных антителExample 2 Humanization of Mouse Antibodies

Отправной точкой для гуманизации были мышиные антитела (например, 13A4 и 4G12). Были определены аминокислотные последовательности для вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этих мышиных антител. Пять вариантов вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи (SEQ ID NO: 13-17) и три варианта вариабельной области гуманизированной легкой цепи (SEQ ID NO: 18-20) для 13A4 были сконструированы с различными перестановками замен (ФИГ. 25). Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR3 для гуманизированного 13A4 были показаны в SEQ ID NO: 1-6 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 29-34 (нумерация Chothia).The starting point for humanization was mouse antibodies (eg 13A4 and 4G12). The amino acid sequences for the heavy chain variable region and the light chain variable region of these mouse antibodies were determined. Five humanized heavy chain variable region variants (SEQ ID NOS: 13-17) and three humanized light chain variable region variants (SEQ ID NOS: 18-20) for 13A4 were constructed with various permutations of substitutions (FIG. 25). The amino acid sequences of heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 and CDR3 for humanized 13A4 were shown in SEQ ID NOs: 1-6 (Kabat numbering) or SEQ ID NOs: 29-34 (Chothia numbering).

Были сконструированы четыре варианта вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи (SEQ ID NO: 21-24) и четыре варианта вариабельной области гуманизированной легкой цепи (SEQ ID NO: 25-28) для 4G12, содержащие различные перестановки замен (ФИГ. 25). Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR3 для гуманизированного 4G12 были показаны в SEQ ID NO: 7-12 (нумерация Kabat) или SEQ ID NO: 35-40 (нумерация Chothia).Four variants of the humanized heavy chain variable region (SEQ ID NOS: 21-24) and four variants of the humanized light chain variable region (SEQ ID NOS: 25-28) for 4G12 were constructed containing various permutations of substitutions (FIG. 25). The amino acid sequences of heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 and CDR3 for humanized 4G12 were shown in SEQ ID NOs: 7-12 (Kabat numbering) or SEQ ID NOs: 35-40 (Chothia numbering).

Эти гуманизированные антитела были получены с помощью стандартных процедур и облегчены с использованием BioLuminate 1. 0 (Schrodinger, Шанхай, Китай).These humanized antibodies were generated using standard procedures and lightened using BioLuminate 1.0 (Schrodinger, Shanghai, China).

Пример 3. In vitro тестирование мышиных антител против hCTLA4: блокирование связывания CTLA4 CD80 и CD86.Example 3 In Vitro Testing of Mouse Anti-hCTLA4 Antibodies: Blocking CTLA4 Binding of CD80 and CD86.

Были проведены анализы блокирования, чтобы определить, могут ли антитела против CTLA4 блокировать связывание между CTLA4 и CD80 и связывание между CTLA4 и CD86. Blocking assays were performed to determine if anti-CTLA4 antibodies could block binding between CTLA4 and CD80 and binding between CTLA4 and CD86.

Антитела против CTLA4 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали хроматографией. 25 мкл клеток CHO, транзиторно трансфецированных человеческим CTLA4, добавляли в каждую лунку планшета. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титрованные антитела добавляли в каждую лунку при 25 мкл на лунку при 4°С и инкубировали в течение 30 минут.Anti-CTLA4 antibodies were collected from mouse ascitic fluid and purified by chromatography. 25 μl of CHO cells transiently transfected with human CTLA4 was added to each well of the plate. Purified antibodies were titrated to final concentrations of 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 µg/ml. Titrated antibodies were added to each well at 25 μl per well at 4° C. and incubated for 30 minutes.

Биотин-hCD80 или Биотин-hCD86 титровали до 0,4 мкг/мл. 50 мкл раствора лиганда добавляли в каждую лунку, получая конечную концентрацию биотин-hCD80 или биотин-hCD86 0,2 мкг/мл. Клетки с биотин-hCD80 или биотин-hCD86 инкубировали при 4°С в течение 15 минут.Biotin-hCD80 or Biotin-hCD86 was titrated to 0.4 µg/ml. 50 μl of the ligand solution was added to each well, resulting in a final concentration of 0.2 μg/ml biotin-hCD80 or biotin-hCD86. Cells with biotin-hCD80 or biotin-hCD86 were incubated at 4°C for 15 minutes.

После промывания фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против IgG мыши (IgG Fc-FITC) и стрептавидин-фикоэритрин (стрептавидин-РЕ) с разведением 1:100 при 4°С и инкубировали в течение 15 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC и PE определяли с помощью проточной цитометрии.After washing with phosphate-buffered saline (PBS), 50 µl of fluorescein isothiocyanate-anti-mouse Fc-antibody conjugate (IgG Fc-FITC) and streptavidin-phycoerythrin (streptavidin-PE) was added to each well at a dilution of 1:100 at 4° C and incubated for 15 minutes followed by washing with PBS. Signals for FITC and PE were determined using flow cytometry.

Как показано на ФИГ. 3, когда концентрация мышиного антитела против hCTLA4 (CT4-04-13A4 и CT4-03-4G12) увеличивалась, сигнал для PE снижался, что указывает на то, что связывание между человеческим CTLA4 и биотин-hCD80 было блокировано антителами CT4-04-13A4 и CT4-03-4G12.As shown in FIG. 3, when the concentration of mouse anti-hCTLA4 antibody (CT4-04-13A4 and CT4-03-4G12) increased, the signal for PE decreased, indicating that binding between human CTLA4 and biotin-hCD80 was blocked by CT4-04-13A4 antibodies. and CT4-03-4G12.

Аналогично, на ФИГ. 4, когда концентрация антитела против hCTLA4 (CT4-04-13A4 и CT4-03-4G12) увеличивалась, сигнал для PE снижался, что указывает на то, что связывание между человеческим CTLA4 и биотин-hCD86 было блокировано антителами CT4-04- 13A4 и CT4-03-4G12.Similarly, in FIG. 4, when the concentration of anti-hCTLA4 antibody (CT4-04-13A4 and CT4-03-4G12) increased, the signal for PE decreased, indicating that the binding between human CTLA4 and biotin-hCD86 was blocked by CT4-04-13A4 and CT4-03-4G12.

Пример 4. Перекрестная реактивность химерных антител против hCTLA против химерного CTLA4 обезьяны, мыши и человека-мышиExample 4 Cross-reactivity of chimeric anti-hCTLA antibodies against monkey, mouse and human-mouse chimeric CTLA4

Клетки СНО трансфецировали CTLA4 макаки-резуса (rmCTLA4, SEQ ID NO: 43), CTLA4 мыши (mCTLA4, SEQ ID NO: 42) и химерным (мышь и человек) CTLA4 (chiCTLA4, SEQ ID NO: 44).CHO cells were transfected with rhesus monkey CTLA4 (rmCTLA4, SEQ ID NO: 43), mouse CTLA4 (mCTLA4, SEQ ID NO: 42) and chimeric (mouse and human) CTLA4 (chiCTLA4, SEQ ID NO: 44).

25 мкл клеток СНО добавляли в каждую лунку. 25 мкл очищенных химерных антител против hCTLA (1 мкг/мл) (CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 и CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 и CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 представляют собой химерные антитела против hCTLA. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из мышиного антитела 4G12 и константные домены человеческого IgG1-антитела (CL, CH1, CH2, CH3). Аналогично, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 имеет вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи из мышиного антитела 13A4 и константные домены человеческого IgG1-антитела (CL, CH1, CH2, CH3).25 μl of CHO cells were added to each well. 25 μl of purified anti-hCTLA chimeric antibodies (1 μg/ml) (CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 and CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1) were added to each well and incubated at 4°C for 30 minutes. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 and CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 are chimeric anti-hCTLA antibodies. CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 has a heavy chain variable domain and a light chain variable domain from the mouse 4G12 antibody and human IgG1 antibody constant domains (CL, CH1, CH2, CH3). Similarly, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 has the heavy chain variable domain and the light chain variable domain from the mouse antibody 13A4 and the constant domains of the human IgG1 antibody (CL, CH1, CH2, CH3).

После промывки PBS (1200 об/мин, 5 минут) дважды, 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против человеческого IgG (IgG Fc-FITC) добавляли при разведении 1:100 в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC определяли проточной цитометрией. After washing with PBS (1200 rpm, 5 minutes) twice, 50 µl of fluorescein isothiocyanate-anti-human IgG Fc (IgG Fc-FITC) conjugate was added at a 1:100 dilution to each well and incubated at 4°C for 30 minutes followed by a PBS wash. Signals for FITC were determined by flow cytometry.

Как показано на ФИГ. 5, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 не вступали в перекрестную реакцию с мышиным CTLA4 и имели сильную перекрестную реактивность с rmCTLA4 и химерным CTLA4. Подобным образом CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 не вступали в перекрестную реакцию с мышиным CTLA4 и имели сильную перекрестную реактивность с rmCTLA4 и химерным CTLA4. На ФИГ. 5 NC обозначает отрицательный контроль, а PC обозначает положительный контроль.As shown in FIG. 5, CT4-04-13A4-mHvKv-IgG1 did not cross-react with mouse CTLA4 and had strong cross-reactivity with rmCTLA4 and chimeric CTLA4. Similarly, CT4-03-4G12-mHvKv-IgG1 did not cross-react with mouse CTLA4 and had strong cross-reactivity with rmCTLA4 and chimeric CTLA4. FIG. 5 NC indicates negative control and PC indicates positive control.

Пример 5. In vivo тестирование мышиных антител против hCTLA4Example 5 In Vivo Testing of Mouse Anti-hCTLA4 Antibodies

Чтобы протестировать антитела против hCTLA4 in vivo и предсказать эффекты этих антител на организм человека, была создана гуманизированная мышиная модель CTLA-4. Гуманизированная мышиная модель CTLA4 была сконструирована для экспрессии химерного белка CTLA4 (SEQ ID NO: 44), в котором часть внеклеточной области белка CTLA4 мыши была заменена внеклеточной областью человеческого CTLA4. Аминокислотные остатки из положения 41-143 SEQ ID NO: 44 получены из человеческого CTLA4. Гуманизированная мышиная модель (гуманизированные мыши B-hCTLA-4) может предоставить новый инструмент для тестирования новых терапевтических методов лечения в клинических условиях, значительно уменьшая разницу между клиническим исходом у человека и у обычных мышей, экспрессирующих CTLA4 мыши.In order to test antibodies against hCTLA4 in vivo and predict the effects of these antibodies on the human body, a humanized mouse model of CTLA-4 was created. A humanized mouse model of CTLA4 was constructed to express a chimeric CTLA4 protein (SEQ ID NO: 44) in which part of the extracellular region of the mouse CTLA4 protein was replaced with the extracellular region of human CTLA4. Amino acid residues from position 41-143 of SEQ ID NO: 44 are derived from human CTLA4. A humanized mouse model (B-hCTLA-4 humanized mice) may provide a novel tool for testing novel therapeutic treatments in the clinical setting, significantly reducing the difference between clinical outcome in humans and normal mice expressing mouse CTLA4.

Антитела против hCTLA4 были протестированы, чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo на модели карциномы толстой кишки. Опухолевые клетки МС-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hCTLA-4. Когда объем опухолей у мышей достигал 150 ± 50 мм³, мышей случайным образом распределяли по разным группам в зависимости от объема опухоли. Затем мышам внутривенно вводили PBS и антитела против hCTLA4. Антитело давали каждые три дня в течение 15 дней (всего 6 инъекций). Введенный объем рассчитывали на основе веса мыши при 10 мкл/г. Длина длинной оси и короткой оси опухоли измерялась дважды в неделю, а объем опухоли вычислялся как 0,5х(длинная ось)х(короткая ось)². Массу мышей также измеряли перед инъекцией, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антитела), дважды в неделю в течение периода инъекции антитела и перед эвтаназией.Anti-hCTLA4 antibodies were tested to demonstrate their effect on tumor growth in vivo in a colon carcinoma model. MC-38 tumor cells (colon adenocarcinoma cells) were injected subcutaneously into humanized B-hCTLA-4 mice. When the volume of tumors in mice reached 150 ± 50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups depending on tumor volume. Mice were then injected intravenously with PBS and anti-hCTLA4 antibodies. The antibody was given every three days for 15 days (6 injections in total). The injected volume was calculated based on the weight of the mouse at 10 μl/g. The length of the long axis and short axis of the tumor were measured twice a week, and the volume of the tumor was calculated as 0.5x(long axis)x(short axis) ² . The weight of mice was also measured before injection when the mice were placed in different groups (before the first antibody injection), twice a week during the period of antibody injection and before euthanasia.

Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) рассчитывали по следующей формуле: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]х100. Ti - средний объем опухоли в группе обработки в день i. T0 - средний объем опухоли в группе обработки в нулевой день. Vi - средний объем опухоли в контрольной группе в день i. V0 - средний объем опухоли в контрольной группе в нулевой день.The percentage of tumor growth inhibition (TGI%) was calculated by the following formula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]x100. Ti is the average tumor volume in the treatment group on day i. T0 is the mean tumor volume in the treatment group on day zero. Vi is the average tumor volume in the control group on day i. V0 is the average tumor volume in the control group on day zero.

Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. Р < 0,05 является порогом, указывающим на значимую разницу.A t-test was performed for statistical analysis. A % TGI greater than 60% indicates significant inhibition of tumor growth. P < 0.05 is the threshold indicating a significant difference.

Результаты in vivo для мышиных антител против hCTLA4, 13A4 и 4G12In vivo results for mouse antibodies against hCTLA4, 13A4 and 4G12

Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки. Масса мышей в разных группах увеличивалась (ФИГ. 6 и ФИГ. 7). Не наблюдалось значимой разницы в массе между контрольной группой и группами обработки антителом против hCTLA4. Результаты показали, что антитела против hCTLA4 хорошо переносились и не токсичны для мышей.The weight of mice was monitored throughout the treatment period. The mass of mice in different groups increased (FIG. 6 and FIG. 7). There was no significant difference in weight between the control group and the anti-hCTLA4 antibody treatment groups. The results showed that the anti-hCTLA4 antibodies were well tolerated and non-toxic in mice.

Размер опухоли, однако, показал значимую разницу в группах, получавших антитела 13А4 и 4G12 (ФИГ.8). Как показано на ФИГ. 8, 13A4 и 4G12 ингибировали рост опухоли в зависимости от концентрации. Интересно, что 4G12 в дозе 0,3 мг/кг показали лучшие результаты по сравнению с 4G12 в дозе 1 мг/кг, что указывает на относительно низкую дозу (например, менее 0,5 мг/кг или от 0,1 мг/кг до 0,5 мг/кг 4G12 может достичь лучших результатов.Tumor size, however, showed a significant difference between the 13A4 and 4G12 antibody groups (FIG. 8). As shown in FIG. 8, 13A4 and 4G12 inhibited tumor growth in a concentration dependent manner. Interestingly, 4G12 at 0.3 mg/kg performed better than 4G12 at 1 mg/kg, indicating a relatively low dose (e.g. less than 0.5 mg/kg or from 0.1 mg/kg up to 0.5 mg/kg 4G12 may achieve better results.

% TGI в день 22 для каждой группы обработки также рассчитывали, как показано в таблице ниже.The % TGI on day 22 for each treatment group was also calculated as shown in the table below.

Таблица 1Table 1

ГруппаGroup АнтителаAntibodies TGI%TGI% G2G2 13A4 (3мг/кг)13A4 (3mg/kg) 103%103% G3G3 13A4 (1 мг/кг)13A4 (1 mg/kg) 82,90%82.90% G4G4 13A4 (0.3 мг/кг)13A4 (0.3 mg/kg) 69%69% G5G5 4G12 (3 мг/кг)4G12 (3 mg/kg) 45,20%45.20% G6G6 4G12 (1 мг/кг)4G12 (1 mg/kg) 10,10%10.10% G7G7 4G12 (0,3 мг/кг)4G12 (0.3 mg/kg) 73,60%73.60%

Результаты in vivo для 13A4 и YervoyIn vivo results for 13A4 and Yervoy

Для сравнения эффективности антител к CTLA4 в тех же экспериментах с 13А4 использовали Yervoy. Масса мышей в разных группах у всех увеличивалась в течение периода обработки (ФИГ. 9 и ФИГ. 10). Никакого токсического эффекта не наблюдалось. Yervoy was used to compare the efficacy of anti-CTLA4 antibodies in the same experiments with 13A4. The weight of mice in different groups all increased during the treatment period (FIG. 9 and FIG. 10). No toxic effect was observed.

Обработка 13A4 и Yervoy приводило к значительному уменьшению размера опухоли (ФИГ. 11). Примечательно, что обработка 13A4 приводила по меньшей мере к сопоставимым эффектам по сравнению с Yervoy. % TGI на 28 день для обеих групп обработки показан ниже. Treatment with 13A4 and Yervoy resulted in a significant reduction in tumor size (FIG. 11). Notably, the 13A4 treatment produced at least comparable effects compared to Yervoy. The % TGI at day 28 for both treatment groups is shown below.

Таблица 2table 2

ГруппаGroup АнтителаAntibodies TGI%TGI% G3G3 YervoyYervoy 104,60%104.60% G5G5 13A413A4 104,70%104.70%

Пример 6. Результаты in vivo для гуманизированных антител против hCTLA4.Example 6 In vivo results for humanized anti-hCTLA4 antibodies.

Гуманизированные антитела были получены способами, описанными в Примере 2. Для подтверждения терапевтического действия гуманизированных антител шесть гуманизированных антител против hCTLA4 (4G12-H1K1-IgG1; 4G12-H2K1-IgG1; 13A4-H1K2-IgG1; 13A4-H2K2-IgG1; 13A4-H1K2-IgG4; 13A4-H1K2 -IgG1-N297A) тестировали на гуманизированных мышах B-hCTLA-4, чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo (ФИГ. 12-17). Кроме того, чтобы уменьшить гетерогенность гликана, Fc-область гуманизированного антитела 13A4-H1K2-IgG1 была дополнительно сконструирована для замены аспарагина в положении 297 на аланин (ФИГ. 17). Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи антител показаны в таблице ниже.Humanized antibodies were obtained by the methods described in Example 2. To confirm the therapeutic effect of humanized antibodies, six humanized anti-hCTLA4 antibodies (4G12-H1K1-IgG1; 4G12-H2K1-IgG1; 13A4-H1K2-IgG1; 13A4-H2K2-IgG1; 13A4-H1K2 -IgG4; 13A4-H1K2 -IgG1-N297A) were tested in humanized B-hCTLA-4 mice to demonstrate their effect on tumor growth in vivo (FIGS. 12-17). In addition, to reduce glycan heterogeneity, the Fc region of the humanized 13A4-H1K2-IgG1 antibody was further designed to replace the asparagine at position 297 with alanine (FIG. 17). The variable regions of the light chain and heavy chain of antibodies are shown in the table below.

Таблица 3Table 3

Гуманизированные антитела Humanized antibodies Вариабельная область тяжелой цепиHeavy chain variable region Вариабельная область легкой цепи Light chain variable region ТипType of 4G12-H1K1-IgG14G12-H1K1-IgG1 SEQ ID NO: 21SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 25SEQ ID NO: 25 IgG1IgG1 4G12-H2K1-IgG14G12-H2K1-IgG1 SEQ ID NO: 22SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 25SEQ ID NO: 25 IgG1IgG1 13A4-H1K2-IgG113A4-H1K2-IgG1 SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 19SEQ ID NO: 19 IgG1IgG1 13A4-H2K2-IgG113A4-H2K2-IgG1 SEQ ID NO: 14SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 19SEQ ID NO: 19 IgG1IgG1 13A4-H1K2-IgG4 13A4-H1K2-IgG4 SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 19SEQ ID NO: 19 IgG4IgG4 13A4-H1K2-IgG1-N297A13A4-H1K2-IgG1-N297A SEQ ID NO: 13SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 19SEQ ID NO: 19 IgG1 с мутацией N297A в области Fc.IgG1 with the N297A mutation in the Fc region.

Использовали процедуры, аналогичные описанным в Примере 5. Опухолевые клетки МС-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hCTLA-4. Когда объем опухолей у мышей достигал 150 ± 50 мм³, мышей случайным образом распределяли по разным группам в зависимости от объема опухоли. Затем мышам внутривенно вводили PBS и антитела против CTLA4. Антитело давали два раза в неделю (день 1, 4 каждой недели) в течение 3 недель (всего 6 инъекций). Дозировка рассчитывалась исходя из массы мыши при 10 мг/кг. Длина длинной оси и короткой оси опухоли измерялась дважды в неделю, а объем опухоли вычислялся как 0,5х(длинная ось)х(короткая ось)². Массу мышей также измеряли перед инъекцией и в то время, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антител). Массу также измеряли два раза в неделю в течение периода введения антитела и в момент времени непосредственно перед эвтаназией. Procedures similar to those described in Example 5 were used. MC-38 tumor cells (colon adenocarcinoma cells) were injected subcutaneously into humanized B-hCTLA-4 mice. When the volume of tumors in mice reached 150 ± 50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups depending on tumor volume. The mice were then intravenously injected with PBS and anti-CTLA4 antibodies. The antibody was given twice a week (Day 1, 4 of each week) for 3 weeks (6 injections in total). The dosage was calculated based on the weight of the mouse at 10 mg/kg. The length of the long axis and short axis of the tumor were measured twice a week, and the volume of the tumor was calculated as 0.5x(long axis)x(short axis) ² . The weight of mice was also measured before injection and at the time when the mice were placed in different groups (before the first injection of antibodies). Weight was also measured twice a week during the period of antibody administration and at the time just before euthanasia.

Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. Р < 0,05 считается значимой разницей.A t-test was performed for statistical analysis. A % TGI greater than 60% indicates significant inhibition of tumor growth. P < 0.05 is considered a significant difference.

Результаты in vivo для 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1In vivo results for 4G12-H1K1-IgG1 and 4G12-H2K1-IgG1

Мышей разделили на 4 группы: 1) в G1 в качестве контроля использовали человеческий IgG; 2) В G4 Yervoy вводили мышам для сравнения; 3) В G10 мышам вводили 4G12-H1K1-IgG1; и 4) В G11 мышам вводили 4G12-H2K1-IgG1.Mice were divided into 4 groups: 1) human IgG was used as control in G1; 2) In G4, Yervoy was administered to mice for comparison; 3) In G10 mice were injected with 4G12-H1K1-IgG1; and 4) In G11 mice were injected with 4G12-H2K1-IgG1.

Массу мышей в четырех группах контролировали в течение всего периода обработки (ФИГ.12 и ФИГ.13). Мыши в каждой группе были в целом здоровы, и результаты показали, что антитела против CTLA4 хорошо переносились и не были токсичными для мышей. The weight of mice in four groups was monitored during the entire treatment period (FIG.12 and FIG.13). The mice in each group were generally healthy and the results indicated that the anti-CTLA4 antibodies were well tolerated and were not toxic to the mice.

Размер опухоли, однако, был значительно меньше в группах, получавших Yervoy, 4G12-H1K1-IgG1 и 4G12-H2K1-IgG1 (ФИГ. 14). Как показано на ФИГ. 14, 4G12-H1K1-IgG1 (р=0. 002) и 4G12-H2K1-IgG1 (P=0,002) ингибировал рост опухоли по сравнению с контрольной группой и имел лучшие результаты по сравнению с Yervoy (P=0,007). % TGI в день 21 для каждой группы обработки показан ниже.Tumor size, however, was significantly smaller in the Yervoy, 4G12-H1K1-IgG1 and 4G12-H2K1-IgG1 treated groups (FIG. 14). As shown in FIG. 14, 4G12-H1K1-IgG1 (p=0.002) and 4G12-H2K1-IgG1 (P=0.002) inhibited tumor growth compared to control group and had better results compared to Yervoy (P=0.007). The % TGI on day 21 for each treatment group is shown below.

Таблица 4Table 4

ГруппаGroup АнтителаAntibodies TGI%TGI% G4G4 YervoyYervoy 82,20%82.20% G10G10 4G12-H1K1-IgG14G12-H1K1-IgG1 90,50%90.50% G11G11 4G12-H2K1-IgG14G12-H2K1-IgG1 90,50%90.50%

Результаты in vivo для 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 и 13A4-H1K2-IgG1-N297A In vivo results for 13A4-H1K2-IgG1, 13A4-H2K2-IgG1, 13A4-H1K2-IgG4 and 13A4-H1K2-IgG1-N297A

Мышей разделили на 6 групп: 1) в G1 в качестве контрольной группы использовали человеческий IgG; 2) в G4 Yervoy вводили мышам для сравнения; 3) в G6 мышам вводили 13A4-H1K2-IgG1; 4) в G7 мышам вводили 13A4-H2K2-IgG1; 5) в G8 мышам вводили 13A4-H1K2-IgG4; и 6) в G9 мышам вводили 13A4-H1K2-IgG1-N297A. Mice were divided into 6 groups: 1) in G1, human IgG was used as a control group; 2) in G4, Yervoy was administered to mice for comparison; 3) G6 mice were injected with 13A4-H1K2-IgG1; 4) G7 mice were injected with 13A4-H2K2-IgG1; 5) G8 mice were injected with 13A4-H1K2-IgG4; and 6) G9 mice were injected with 13A4-H1K2-IgG1-N297A.

Массу мышей в шести группах контролировали в течение всего периода обработки (ФИГ. 15 и ФИГ. 16). Результаты показали, что мыши в каждой группе были здоровы, а антитела против CTLA4 не были токсичными для мышей. The weight of mice in the six groups was monitored during the entire treatment period (FIG. 15 and FIG. 16). The results showed that the mice in each group were healthy and the anti-CTLA4 antibodies were not toxic to the mice.

Размеры опухолей, однако, были разными в каждой группе. Как показано на ФИГ. 17, все антитела против CTLA4 могут ингибировать рост опухоли по сравнению с контрольной группой. В частности, 13A4-H1K2-IgG1 и 13A4-H2K2-IgG1 имели лучшие результаты по сравнению с Yervoy. Tumor sizes, however, were different in each group. As shown in FIG. 17, all anti-CTLA4 antibodies can inhibit tumor growth compared to the control group. In particular, 13A4-H1K2-IgG1 and 13A4-H2K2-IgG1 had better results compared to Yervoy.

% TGI в день 21 для каждой группы обработки показан ниже. The % TGI on day 21 for each treatment group is shown below.

Таблица 5Table 5

ГруппаGroup АнтителаAntibodies TGI%TGI% G4G4 YervoyYervoy 82,20%82.20% G6G6 13A4-H1K2-IgG113A4-H1K2-IgG1 99%99% G7G7 13A4-H2K2-IgG113A4-H2K2-IgG1 96,60%96.60% G8G8 13A4-H1K2-IgG413A4-H1K2-IgG4 56,10%56.10% G9G9 13A4-H1K2-IgG1-N297A13A4-H1K2-IgG1-N297A 47,30%47.30%

Пример 7. In vitro тестирование мышиных антител против hCTLA4: CT4-20-6D2 («6D2») и CT4-20-7E12 («7E12»)Example 7 In Vitro Testing of Mouse Anti-hCTLA4 Antibodies: CT4-20-6D2 ("6D2") and CT4-20-7E12 ("7E12")

Антитела против CTLA4 собирали из асцитной жидкости мыши и очищали хроматографией. 25 мкл клеток CHO, транзиторно трансфецированных человеческим CTLA4, добавляли в каждую лунку планшета. Очищенные антитела титровали до конечных концентраций 50, 5, 0,5, 0,05, 0,005 мкг/мл. Титрованные антитела добавляли в каждую лунку при 25 мкл на лунку при 4°С и инкубировали в течение 30 минут. Биотин-hCD86 титровали до 0,4 мкг/мл. 50 мкл раствора лиганда добавляли в каждую лунку, получая конечную концентрацию биотин-hCD86 0,2 мкг/мл. Клетки с биотин-hCD86 инкубировали при 4°С в течение 15 минут. После промывания фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против IgG мыши (IgG Fc-FITC) и стрептавидин-фикоэритрин (стрептавидин-РЕ) с разведением 1:100 при 4°С и инкубировали в течение 15 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC и PE определяли с помощью проточной цитометрии. Anti-CTLA4 antibodies were collected from mouse ascitic fluid and purified by chromatography. 25 μl of CHO cells transiently transfected with human CTLA4 was added to each well of the plate. Purified antibodies were titrated to final concentrations of 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 µg/ml. Titrated antibodies were added to each well at 25 μl per well at 4° C. and incubated for 30 minutes. Biotin-hCD86 was titrated to 0.4 µg/ml. 50 μl of the ligand solution was added to each well, resulting in a final biotin-hCD86 concentration of 0.2 μg/ml. Cells with biotin-hCD86 were incubated at 4°C for 15 minutes. After washing with phosphate-buffered saline (PBS), 50 µl of fluorescein isothiocyanate-anti-mouse Fc-antibody conjugate (IgG Fc-FITC) and streptavidin-phycoerythrin (streptavidin-PE) was added to each well at a dilution of 1:100 at 4° C and incubated for 15 minutes followed by washing with PBS. Signals for FITC and PE were determined using flow cytometry.

Как показано на ФИГ. 18, когда концентрация антитела против hCTLA4 (CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12) увеличивалась, сигнал для PE снижался, что позволяет предположить, что связывание между человеческим CTLA4 и биотин-hCD86 было блокировано антителами CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12.As shown in FIG. 18, when the concentration of anti-hCTLA4 antibody (CT4-20-6D2 and CT4-20-7E12) increased, the signal for PE decreased, suggesting that binding between human CTLA4 and biotin-hCD86 was blocked by CT4-20-6D2 and CT4 antibodies. -20-7E12.

Пример 8. Перекрестная реактивность антител против hCTLA против химерного CTLA4 обезьяны, мыши и человека-мышиExample 8 Cross-reactivity of anti-hCTLA antibodies against monkey, mouse and human-mouse chimeric CTLA4

25 мкл клеток СНО добавляли в каждую лунку. 25 мкл очищенных мышиных антител против hCTLA (1 мкг/мл) (CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут.25 μl of CHO cells were added to each well. 25 μl of purified mouse anti-hCTLA antibodies (1 μg/ml) (CT4-20-6D2 and CT4-20-7E12) were added to each well and incubated at 4°C for 30 minutes.

После промывки PBS (1200 об/мин, 5 минут) дважды, 50 мкл конъюгата флуоресцеин-изотиоцианата и Fc-антитела против человеческого IgG (IgG Fc-FITC) добавляли при разведении 1:100 в каждую лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут с последующей промывкой PBS. Сигналы для FITC определяли проточной цитометрией.After washing with PBS (1200 rpm, 5 minutes) twice, 50 µl of fluorescein isothiocyanate-anti-human IgG Fc (IgG Fc-FITC) conjugate was added at a 1:100 dilution to each well and incubated at 4°C for 30 minutes followed by a PBS wash. Signals for FITC were determined by flow cytometry.

Как показано на ФИГ. 19, CT4-20-6D2 и CT4-20-7E12 не вступали в перекрестную реакцию с CTLA4 мыши, имели слабую перекрестную реактивность с химерным CTLA4 и относительно сильную перекрестную реактивность с rmCTLA4.As shown in FIG. 19, CT4-20-6D2 and CT4-20-7E12 did not cross-react with mouse CTLA4, had weak cross-reactivity with chimeric CTLA4, and relatively strong cross-reactivity with rmCTLA4.

Пример 9. In vivo тестирование мышиных антител против hCTLA4Example 9 In Vivo Testing of Mouse Anti-hCTLA4 Antibodies

Антитела против hCTLA4 были протестированы, чтобы продемонстрировать их влияние на рост опухоли in vivo на модели карциномы толстой кишки. Опухолевые клетки МС-38 (клетки аденокарциномы толстой кишки) инъецировали подкожно гуманизированным мышам B-hCTLA-4. Когда объем опухолей у мышей достигал 150 ± 50 мм³, мышей случайным образом распределяли по разным группам в зависимости от объема опухоли. Затем мышам внутривенно вводили PBS и антитела против hCTLA4. Антитело давали два раза в неделю (всего 6 инъекций). В контрольной группе мышам вводили физиологический раствор. Введенный объем рассчитывали на основе веса мыши при 10 мкл/г. Длина длинной оси и короткой оси опухоли измерялась дважды в неделю, а объем опухоли вычислялся как 0,5х(длинная ось)х(короткая ось)². Массу мышей также измеряли перед инъекцией, когда мышей помещали в разные группы (до первой инъекции антитела), дважды в неделю в течение периода инъекции антитела и перед эвтаназией. Anti-hCTLA4 antibodies were tested to demonstrate their effect on tumor growth in vivo in a colon carcinoma model. MC-38 tumor cells (colon adenocarcinoma cells) were injected subcutaneously into humanized B-hCTLA-4 mice. When the volume of tumors in mice reached 150 ± 50 mm ³ , mice were randomly assigned to different groups depending on tumor volume. Mice were then injected intravenously with PBS and anti-hCTLA4 antibodies. The antibody was given twice a week (6 injections in total). In the control group, mice were injected with saline. The injected volume was calculated based on the weight of the mouse at 10 μl/g. The length of the long axis and short axis of the tumor were measured twice a week, and the volume of the tumor was calculated as 0.5x(long axis)x(short axis) ² . The weight of mice was also measured before injection when the mice were placed in different groups (before the first antibody injection), twice a week during the period of antibody injection and before euthanasia.

Т-тест выполняли для статистического анализа. % TGI выше 60% указывает на значительное подавление роста опухоли. Р < 0,05 считается значимой разницей. A t-test was performed for statistical analysis. A % TGI greater than 60% indicates significant inhibition of tumor growth. P < 0.05 is considered a significant difference.

Массу мышей контролировали в течение всего периода обработки. Масса мышей в разных группах увеличивалась (ФИГ. 20 и ФИГ. 21). Не наблюдалось значимой разницы в массе между контрольной группой и группами обработки антителом против hCTLA4. Результаты показали, что антитела против hCTLA4 не были токсичными для мышей. The weight of the mice was monitored throughout the treatment period. The weight of mice in different groups increased (FIG. 20 and FIG. 21). There was no significant difference in weight between the control group and the anti-hCTLA4 antibody treatment groups. The results showed that the anti-hCTLA4 antibodies were not toxic to mice.

Размер опухоли, однако, показал значимую разницу в группах, получавших антитела 13A4, 6D2 и 7E12 (ФИГ. 22). Как показано на ФИГ. 22, 13A4, 6D2 и 7E12 все ингибировали рост опухоли у мышей. Tumor size, however, showed a significant difference in the groups treated with antibodies 13A4, 6D2 and 7E12 (FIG. 22). As shown in FIG. 22, 13A4, 6D2 and 7E12 all inhibited tumor growth in mice.

Таблица 6Table 6

ГруппаGroup АнтителаAntibodies TGI%TGI% G2G2 13A413A4 109,70%109.70% G3G3 6D26D2 69,80%69.80% G4G4 7E127E12 65,60%65.60%

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯOTHER IMPLEMENTATION OPTIONS

Следует понимать, что, хотя изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.It should be understood that while the invention has been described in conjunction with its detailed description, the foregoing description is intended to be illustrative and not to limit the scope of the invention, which is defined by the scope of the appended claims. Other aspects, advantages and modifications are within the scope of the following claims.

--->--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST

<110> Beijing Biocytogen Co., Ltd<110> Beijing Biocytogen Co., Ltd

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ CTLA4 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ<120> ANTIBODIES AGAINST CTLA4 AND THEIR USES

<130> 20170921<130> 20170921

<160> 76 <160> 76

<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5

<210> 1<210> 1

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence

<400> 1<400> 1

Asp Tyr Glu Met His Asp Tyr Glu Met His

1 5 fifteen

<210> 2<210> 2

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<400> 2<400> 2

Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly gly

<210> 3<210> 3

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 3<400> 3

Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr

1 5 fifteen

<210> 4<210> 4

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 4<400> 4

Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala

1 5 10 1 5 10

<210> 5<210> 5

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 5<400> 5

Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp

1 5 fifteen

<210> 6<210> 6

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 6<400> 6

Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 7<210> 7

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<400> 7<400> 7

Ser Tyr Thr Met Ser Ser Tyr Thr Met Ser

1 5 fifteen

<210> 8<210> 8

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<400> 8<400> 8

Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly gly

<210> 9<210> 9

<211> 13<211> 13

<212> Белок<212> Protein

<400> 9<400> 9

Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 10<210> 10

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 10<400> 10

Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala

1 5 10 1 5 10

<210> 11<210> 11

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 11<400> 11

Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu

1 5 fifteen

<210> 12<210> 12

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 12<400> 12

Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr

1 5 fifteen

<210> 13<210> 13

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<400> 13<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45 35 40 45

Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Gly Val Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Arg Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 14<210> 14

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<400> 14<400> 14

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 15<210> 15

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<400> 15<400> 15

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 16<210> 16

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<400> 16<400> 16

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Glu Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 17<210> 17

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<400> 17<400> 17

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 18<210> 18

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 18<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45 35 40 45

Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 19<210> 19

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 19<400> 19

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 20<210> 20

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 20<400> 20

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 21<210> 21

<211> 122<211> 122

<212> Белок<212> Protein

<400> 21<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val Ala Thr Ile Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120 115 120

<210> 22<210> 22

<211> 122<211> 122

<212> Белок<212> Protein

<400> 22<400> 22

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120 115 120

<210> 23<210> 23

<211> 122<211> 122

<212> Белок<212> Protein

<400> 23<400> 23

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120 115 120

<210> 24<210> 24

<211> 122<211> 122

<212> Белок<212> Protein

<400> 24<400> 24

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120 115 120

<210> 25<210> 25

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 25<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 26<210> 26

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 26<400> 26

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 100 105

<210> 27<210> 27

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 27<400> 27

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 28<210> 28

<211> 108<211> 108

<212> Белок<212> Protein

<400> 28<400> 28

1 5 10 15 1 5 10 15

Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 100 105

<210> 29<210> 29

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<400> 29<400> 29

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His

1 5 10 1 5 10

<210> 30<210> 30

<211> 6<211> 6

<212> Белок<212> Protein

<400> 30<400> 30

Asp Pro Glu Thr Gly Gly Asp Pro Glu Thr Gly Gly

1 5 fifteen

<210> 31<210> 31

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 31<400> 31

Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr Gly Thr Thr Val Val Gly Leu Asp Tyr

1 5 fifteen

<210> 32<210> 32

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 32<400> 32

1 5 10 1 5 10

<210> 33<210> 33

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 33<400> 33

Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp

1 5 fifteen

<210> 34<210> 34

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 34<400> 34

Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 35<210> 35

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<400> 35<400> 35

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Met Ser

1 5 10 1 5 10

<210> 36<210> 36

<211> 6<211> 6

<212> Белок<212> Protein

<400> 36<400> 36

Ser Arg Gly Gly Gly Tyr Ser Arg Gly Gly Gly Tyr

1 5 fifteen

<210> 37<210> 37

<211> 13<211> 13

<212> Белок<212> Protein

<400> 37<400> 37

1 5 10 1 5 10

<210> 38<210> 38

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 38<400> 38

1 5 10 1 5 10

<210> 39<210> 39

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 39<400> 39

Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu Asn Ala Arg Thr Leu Ala Glu

1 5 fifteen

<210> 40<210> 40

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 40<400> 40

Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Thr

1 5 fifteen

<210> 41<210> 41

<211> 223<211> 223

<212> Белок<212> Protein

<213> Человек<213> Human

<400> 41<400> 41

Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro

20 25 30 20 25 30

Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

35 40 45 35 40 45

Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly

50 55 60 50 55 60

Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr

85 90 95 85 90 95

Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val

100 105 110 100 105 110

Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile

115 120 125 115 120 125

Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly

130 135 140 130 135 140

Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe

165 170 175 165 170 175

Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys

180 185 190 180 185 190

Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu

195 200 205 195 200 205

Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn

210 215 220 210 215 220

<210> 42<210> 42

<211> 223<211> 223

<212> Белок<212> Protein

<213> Мышь<213> Mouse

<400> 42<400> 42

Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro

20 25 30 20 25 30

Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala

35 40 45 35 40 45

Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His

50 55 60 50 55 60

Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly

85 90 95 85 90 95

Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val

100 105 110 100 105 110

Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu

115 120 125 115 120 125

Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe

165 170 175 165 170 175

Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 43<210> 43

<211> 223<211> 223

<212> Белок<212> Protein

<213> Обезьяна<213> Monkey

<400> 43<400> 43

Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Arg Leu Asn Leu Ala Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Arg Leu Asn Leu Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Arg Thr Arg Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro Thr Arg Thr Arg Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Leu Phe Ile Pro

20 25 30 20 25 30

Val Phe Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Val Phe Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

35 40 45 35 40 45

Asn Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Asn Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Met Gly Ile Gly Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Met Gly Ile Gly

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 44<210> 44

<211> 223<211> 223

<212> Белок<212> Protein

<400> 44<400> 44

1 5 10 15 1 5 10 15

20 25 30 20 25 30

Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

115 120 125 115 120 125

130 135 140 130 135 140

145 150 155 160 145 150 155 160

165 170 175 165 170 175

180 185 190 180 185 190

195 200 205 195 200 205

210 215 220 210 215 220

<210> 45<210> 45

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<400> 45<400> 45

Asp Tyr Glu Met His Asp Tyr Glu Met His

1 5 fifteen

<210> 46<210> 46

<211> 17<211> 17

<212> Белок<212> Protein

<400> 46<400> 46

Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly gly

<210> 47<210> 47

<211> 13<211> 13

<212> Белок<212> Protein

<400> 47<400> 47

Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Asp Tyr

1 5 10 1 5 10

<210> 48<210> 48

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 48<400> 48

1 5 10 1 5 10

<210> 49<210> 49

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 49<400> 49

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp

1 5 fifteen

<210> 50<210> 50

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 50<400> 50

Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 51<210> 51

<211> 5<211> 5

<212> Белок<212> Protein

<400> 51<400> 51

Asp Tyr Trp Met Asn Asp Tyr Trp Met Asn

1 5 fifteen

<210> 52<210> 52

<211> 19<211> 19

<212> Белок<212> Protein

<400> 52<400> 52

Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His Tyr Ser Asp Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Lys Gly Val Lys Gly

<210> 53<210> 53

<211> 4<211> 4

<212> Белок<212> Protein

<400> 53<400> 53

Thr Phe Ala Tyr Thr Phe Ala Tyr

1 one

<210> 54<210> 54

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 54<400> 54

Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn Gly Thr Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Gly Leu Asn

1 5 10 1 5 10

<210> 55<210> 55

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 55<400> 55

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5 fifteen

<210> 56<210> 56

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 56<400> 56

Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 57<210> 57

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<400> 57<400> 57

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His

1 5 10 1 5 10

<210> 58<210> 58

<211> 6<211> 6

<212> Белок<212> Protein

<400> 58<400> 58

Asp Pro Glu Thr Gly Gly Asp Pro Glu Thr Gly Gly

1 5 fifteen

<210> 59<210> 59

<211> 13<211> 13

<212> Белок<212> Protein

<400> 59<400> 59

1 5 10 1 5 10

<210> 60<210> 60

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 60<400> 60

1 5 10 1 5 10

<210> 61<210> 61

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 61<400> 61

Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp

1 5 fifteen

<210> 62<210> 62

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 62<400> 62

Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Thr

1 5 fifteen

<210> 63<210> 63

<211> 10<211> 10

<212> Белок<212> Protein

<400> 63<400> 63

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Asn

1 5 10 1 5 10

<210> 64<210> 64

<211> 8<211> 8

<212> Белок<212> Protein

<400> 64<400> 64

Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu

1 5 fifteen

<210> 65<210> 65

<211> 4<211> 4

<212> Белок<212> Protein

<400> 65<400> 65

Thr Phe Ala Tyr Thr Phe Ala Tyr

1 one

<210> 66<210> 66

<211> 11<211> 11

<212> Белок<212> Protein

<400> 66<400> 66

1 5 10 1 5 10

<210> 67<210> 67

<211> 7<211> 7

<212> Белок<212> Protein

<400> 67<400> 67

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5 fifteen

<210> 68<210> 68

<211> 9<211> 9

<212> Белок<212> Protein

<400> 68<400> 68

Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5 fifteen

<210> 69<210> 69

<211> 118<211> 118

<212> Белок<212> Protein

<400> 69<400> 69

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30 20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

100 105 110 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 115

<210> 70<210> 70

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<400> 70<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Thr Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Tyr Lys Glu Lys Thr Leu Thr Asp Thr Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Trp

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 71<210> 71

<211> 122<211> 122

<212> Белок<212> Protein

<400> 71<400> 71

Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80 65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Met Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95 85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp Ala Arg Asp Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Val His Trp Phe Ala Tyr Trp

100 105 110 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120 115 120

<210> 72<210> 72

<211> 107<211> 107

<212> Белок<212> Protein

<400> 72<400> 72

1 5 10 15 1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30 20 25 30

35 40 45 35 40 45

50 55 60 50 55 60

65 70 75 80 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ser Pro Arg

85 90 95 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 100 105

<210> 73<210> 73

<211> 141<211> 141

<212> Белок<212> Protein

<400> 73<400> 73

Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Ile Ala Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30 20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45 35 40 45

Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu

50 55 60 50 55 60

Glu Trp Ile Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn

65 70 75 80 65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95 85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110 100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met Tyr Tyr Cys Thr Arg Arg Gly Lys Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Val Met

115 120 125 115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135 140 130 135 140

<210> 74<210> 74

<211> 127<211> 127

<212> Белок<212> Protein

<400> 74<400> 74

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30 20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn

35 40 45 35 40 45

Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro

50 55 60 50 55 60

Gln Leu Leu Val Phe Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Gln Leu Leu Val Phe Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser

65 70 75 80 65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95 85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp

100 105 110 100 105 110

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125 115 120 125

<210> 75<210> 75

<211> 134<211> 134

<212> Белок<212> Protein

<400> 75<400> 75

Met Tyr Leu Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly Met Tyr Leu Gly Leu Ser Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Asp Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30 20 25 30

Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Gly Arg Pro Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45 35 40 45

Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Ser Asp Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60 50 55 60

Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr His

65 70 75 80 65 70 75 80

Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95 85 90 95

Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Gly Glu Asp Met

100 105 110 100 105 110

Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125 115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ala Leu Val Thr Val Ser Ala

130 130

<210> 76<210> 76

<211> 126<211> 126

<212> Белок<212> Protein

<400> 76<400> 76

Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Val Val Val Met Gly Val Pro Thr Gln Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr Val Val Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Val Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala

20 25 30 20 25 30

Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asn Ile

35 40 45 35 40 45

Tyr Gly Gly Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Tyr Gly Gly Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln

50 55 60 50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg

65 70 75 80 65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser

85 90 95 85 90 95

Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Leu His Pro Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser

100 105 110 100 105 110

Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125 115 120 125

<---<---

Claims

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком 4, ассоциированным с цитотоксическими T-лимфоцитами, (CTLA4), содержащие: 1. An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA4), containing:

вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, где область VH CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR1, область VH CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR2, а область VH CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VH CDR3; и a heavy chain variable region (VH) containing complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3, where the VH CDR1 region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the VH CDR1, the VH CDR2 region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid a VH CDR2 sequence, and the VH CDR3 region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the VH CDR3; and

вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1, 2 и 3, где область VL CDR1 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR1, область VL CDR2 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR2, и область VL CDR3 содержит аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной аминокислотной последовательности VL CDR3, a light chain variable region (VL) comprising CDRs 1, 2, and 3, wherein the VL CDR1 region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the VL CDR1, the VL CDR2 region contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of the VL CDR2, and the VL region CDR3 contains an amino acid sequence that is identical to the selected amino acid sequence of VL CDR3,

(2) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 29, 30, 31, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NOs: 32, 33, 34, соответсвенно; (2) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 29, 30, 31, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 32, 33, 34, respectively;

(3) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 7, 8, 9, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 10, 11, 12, соответственно;(3) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 7, 8, 9, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 10, 11, 12, respectively;

(4) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 35, 36, 37, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NOs: 38, 39, 40, соответственно; (4) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 35, 36, 37, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 38, 39, 40, respectively;

(5) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 45, 46, 47, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 48, 49, 50, соответственно;(5) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 45, 46, 47, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 48, 49, 50, respectively;

(6) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 57, 58, 59, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 60, 61, 62, соответственно; (6) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 57, 58, 59, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 60, 61, 62, respectively;

(7) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 51, 52, 53, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 54, 55, 56, соответственно;(7) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 51, 52, 53, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 54, 55, 56, respectively;

(8) выбранные аминокислотные последовательности VH CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NOs: 63, 64, 65, соответственно, и выбранные аминокислотные последовательности VL CDR 1, 2, 3 представлены в SEQ ID NO: 66, 67, 68, соответственно. (8) the selected amino acid sequences of VH CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 63, 64, 65, respectively, and the selected amino acid sequences of VL CDRs 1, 2, 3 are shown in SEQ ID NOs: 66, 67, 68, respectively.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определяют согласно определению Kabat. 2. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively, where VH CDR 1, 2, 3 and VL CDR 1, 2, 3 are determined according to the definition of Kabat.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Kabat.3. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7, 8 and 9, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Kabat.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 45, 46 и 47, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NOs: 48, 49 и 50, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Kabat.4. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 45, 46 and 47, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 48, 49 and 50, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Kabat.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NOs: 51, 52 и 53, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 54, 55 и 56, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Kabat.5. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 51, 52 and 53, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 54, 55 and 56, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Kabat.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 29, 30, и 31, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 32, 33 и 34, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Chothia.6. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29, 30, and 31, respectively, and VL contains CDRs 1, 2 , 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32, 33 and 34, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Chothia.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 35, 36 и 37, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 38, 39 и 40, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Chothia. 7. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 35, 36 and 37, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 38, 39 and 40, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Chothia.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 57, 58 и 59, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 60, 61 и 62, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Chothia.8. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 57, 58 and 59, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 60, 61 and 62, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Chothia.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что VH содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 63, 64 и 65, соответственно, и VL содержит CDR 1, 2, 3 с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 66, 67 и 68, соответственно, где VH CDR 1, 2, 3 и VL CDR 1, 2, 3 определены согласно определению Chothia.9. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, characterized in that VH contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 63, 64 and 65, respectively, and VL contains CDRs 1, 2, 3 with the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 66, 67 and 68, respectively, wherein VH CDRs 1, 2, 3 and VL CDRs 1, 2, 3 are defined as defined by Chothia.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CTLA4. 10. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-9, characterized in that the antibody or its antigen-binding fragment specifically binds to human CTLA4.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. 11. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-10, characterized in that the antibody or antigen-binding fragment is a humanized antibody or antigen-binding fragment.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, отличающиеся тем, что антигенсвязывающий фрагмент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV).12. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-11, characterized in that the antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFV).

13. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-11 для получения биспецифического антитела.13. The use of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-11 to obtain a bispecific antibody.

14. Нуклеиновая кислота для получения антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где нуклеиновая кислота кодирует:14. Nucleic acid for producing an anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment thereof, wherein the nucleic acid encodes:

(1) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую области, определяющие комплементарность, (CDR) 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4; (1) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising complementarity determining regions (CDRs) 1, 2 and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, and where VH, when paired with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, 19, 20, or 70, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or its the antigen-binding fragment can bind to CTLA4;

(2) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4;(2) an immunoglobulin light chain or fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 5 and 6, respectively, and where the VL is paired with a VH containing the amino acid sequence , presented in SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 or 69, forms an antibody or antigennegative fragment containing VH and VL, where the antibody or its antigennegative fragment can bind to CTLA4;

(3) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4; (3) an immunoglobulin heavy chain, or fragment thereof, comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 7, 8, and 9, respectively, and where VH, mating with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, or 72 forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind to CTLA4;

(4) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4;(4) an immunoglobulin light chain or fragment thereof containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3 containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10, 11 and 12, respectively, and where the VL is paired with a VH containing the amino acid sequence , presented in SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 or 71, forms an antibody or its antigennegative fragment containing VH and VL, where the antibody or its antigennegative fragment can bind to CTLA4;

(5) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 45, 46 и 47, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4; (5) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 45, 46, and 47, respectively, and where VH, mating with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 74, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind to CTLA4;

(6) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 73, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4; (6) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2, and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 48, 49, and 50, respectively, and where VL, pairing with a VH, containing the amino acid sequence , presented in SEQ ID NO: 73, forms an antibody or its antigennegative fragment containing VH and VL, where the antibody or its antigennegative fragment can bind to CTLA4;

(7) тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 51, 52 и 53, соответственно, и где VH, спариваясь с вариабельной областью легкой цепи (VL), содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 76, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4; (7) an immunoglobulin heavy chain or fragment thereof comprising a heavy chain variable region (VH) comprising CDRs 1, 2, and 3 comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 51, 52, and 53, respectively, and where VH, mating with a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 76, forms an antibody or antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or antigen-binding fragment can bind to CTLA4;

(8) легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 54, 55 и 56, соответственно, и где VL, спариваясь с VH, содержащей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 75, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4. (8) an immunoglobulin light chain or fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2, and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 54, 55, and 56, respectively, and where VL, pairing with a VH, containing the amino acid sequence , shown in SEQ ID NO: 75, forms an antibody or antigennegative fragment containing VH and VL, where the antibody or its antigennegative fragment can bind to CTLA4.

15. Нуклеиновая кислота по п. 14, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно. 15. Nucleic acid according to claim 14, characterized in that the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1, 2 and 3, respectively.

16. Нуклеиновая кислота по п. 14, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно. 16. Nucleic acid according to claim 14, characterized in that the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 4, 5 and 6, respectively.

17. Нуклеиновая кислота по п. 14, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VH, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9, соответственно. 17. Nucleic acid according to claim 14, characterized in that the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin heavy chain or a fragment thereof, containing a VH containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 7, 8 and 9, respectively.

18. Нуклеиновая кислота по п. 14, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие VL, содержащую CDR 1, 2 и 3, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 10, 11 и 12, соответственно. 18. Nucleic acid according to claim 14, characterized in that the nucleic acid contains a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof, containing a VL containing CDRs 1, 2 and 3, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10, 11 and 12, respectively.

19. Нуклеиновая кислота по п. 14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 45, 46 и 47, соответственно.19. The nucleic acid of claim 14, wherein the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding an immunoglobulin heavy chain-containing polypeptide, or a fragment thereof, comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 45, 46 and 47, respectively.

20. Нуклеиновая кислота по п. 14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно.20. Nucleic acid according to claim 14, wherein the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 48, 49 and 50, respectively.

21. Нуклеиновая кислота по п. 14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 51, 52 и 53, соответственно.21. The nucleic acid of claim 14, wherein the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding an immunoglobulin heavy chain-containing polypeptide or fragment thereof, comprising the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 51, 52 and 53, respectively.

22. Нуклеиновая кислота по п. 14, где нуклеиновая кислота содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NOs: 54, 55 и 56, соответственно.22. Nucleic acid according to claim 14, wherein the nucleic acid comprises a polynucleotide encoding a polypeptide containing an immunoglobulin light chain or a fragment thereof, containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 54, 55 and 56, respectively.

23. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 14-22, отличающаяся тем, что VH, спариваясь с VL, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться с человеческим CTLA4, или VL, спариваясь с VH, образует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие VH и VL, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться с человеческим CTLA4. 23. Nucleic acid according to any one of paragraphs. 14-22, characterized in that VH, pairing with VL, forms an antibody or its antigen-binding fragment containing VH and VL, where the antibody or its antigen-binding fragment can specifically bind to human CTLA4, or VL, pairing with VH, forms an antibody or its antigennegative fragment containing VH and VL, where the antibody or its antigennegative fragment can specifically bind to human CTLA4.

24. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 14-23, отличающаяся тем, что тяжелая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент, а легкая цепь иммуноглобулина или ее фрагмент представляют собой гуманизированную легкую цепь иммуноглобулина или ее фрагмент. 24. Nucleic acid according to any one of paragraphs. 14-23, characterized in that the immunoglobulin heavy chain or its fragment is a humanized immunoglobulin heavy chain or its fragment, and the immunoglobulin light chain or its fragment is a humanized immunoglobulin light chain or its fragment.

25. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 14-24, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота кодирует одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). 25. Nucleic acid according to any one of paragraphs. 14-24, characterized in that the nucleic acid encodes a single-stranded variable fragment (scFv).

26. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 14-25, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой кДНК. 26. Nucleic acid according to any one of paragraphs. 14-25, characterized in that the nucleic acid is cDNA.

27. Экспрессирующий вектор, содержащий одну или более нуклеиновых кислот по любому из пп. 14-26. 27. An expression vector containing one or more nucleic acids according to any one of paragraphs. 14-26.

28. Экспрессирующий вектор, содержащий две нуклеиновые кислоты по любому из пп. 14-26, отличающийся тем, что две нуклеиновые кислоты кодируют область VL и область VH, формирующие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие область VL и область VH, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4. 28. An expression vector containing two nucleic acids according to any one of paragraphs. 14-26, characterized in that two nucleic acids encode a VL region and a VH region, forming an antibody or its antigen-binding fragment, containing a VL region and a VH region, where the antibody or its antigen-binding fragment can bind to CTLA4.

29. Пара экспрессирующих векторов для получения антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента, где каждый экспрессирующий вектор содержит одну из нуклеиновых кислот по любому из пп. 14-26, отличающиеся тем, что нуклеиновые кислоты кодируют область VL и область VH, формирующие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие область VL и область VH, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с CTLA4. 29. A pair of expression vectors for producing an anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment, where each expression vector contains one of the nucleic acids according to any one of paragraphs. 14-26, characterized in that the nucleic acids encode a VL region and a VH region, forming an antibody or its antigen-binding fragment, containing a VL region and a VH region, where the antibody or its antigen-binding fragment can bind to CTLA4.

30. Клетка для экспрессии антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против CTLA4 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12. 30. A cell for expressing an anti-CTLA4 antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising a nucleic acid encoding an anti-CTLA4 antibody or an antigen-binding fragment thereof according to any one of paragraphs. 1-12.

31. Клетка по п. 30, отличающаяся тем, что клетка представляет собой клетку СНО.31. A cell according to claim 30, characterized in that the cell is a CHO cell.

32. Способ получения антитела против CTLA4 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий 32. A method for producing an anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising

(a) культивирование клетки по п. 30 или 31 в условиях, достаточных для того, чтобы клетка продуцировала антитело или антигенсвязывающий фрагмент; и(a) culturing the cell according to claim 30 or 31 under conditions sufficient for the cell to produce an antibody or antigen-binding fragment; and

(b) сбор антитела или антигенсвязывающего фрагмента, продуцируемого клеткой. (b) collecting the antibody or antigen-binding fragment produced by the cell.

33. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с CTLA4, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность, которая идентична выбранной последовательности VH, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична выбранной последовательности VL, где выбранная последовательность VH и выбранная последовательность VL представляют собой одну из следующих: 33. An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CTLA4, containing a heavy chain variable region (VH) containing an amino acid sequence that is identical to the selected VH sequence, and a light chain variable region (VL) containing an amino acid sequence that is at least 90% identical to the selected VL sequence, where the selected VH sequence and the selected VL sequence are one of the following:

(2) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72; (2) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, or 71 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, or 72;

(3) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 73, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 74; и(3) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 73 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 74; and

(4) выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 75, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 76. (4) the selected VH sequence is SEQ ID NO: 75, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 76.

34. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 13, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 19. 34. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 13, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 19.

35. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 14, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 19. 35. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 14, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 19.

36. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 21, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25. 36. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 21, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 25.

37. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающийся тем, что выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 26.37. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that the selected VH sequence is SEQ ID NO: 21, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 26.

38. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающийся тем, что выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 27.38. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that the selected VH sequence is SEQ ID NO: 21 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 27.

39. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающийся тем, что выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 21, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 28.39. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that the selected VH sequence is SEQ ID NO: 21 and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 28.

40. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 22, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25. 40. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 22, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 25.

41. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 23, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25.41. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 23, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 25.

42. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 24, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 25. 42. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 24, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 25.

43. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающиеся тем, что VH содержит последовательность SEQ ID NO: 71, а VL содержит последовательность SEQ ID NO: 72. 43. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that VH contains the sequence of SEQ ID NO: 71, and VL contains the sequence of SEQ ID NO: 72.

44. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающийся тем, что выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 13, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 18. 44. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that the selected VH sequence is SEQ ID NO: 13, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 18.

45. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающийся тем, что выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 14, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 18.45. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that the selected VH sequence is SEQ ID NO: 14, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 18.

46. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 33, отличающийся тем, что выбранная последовательность VH представляет собой SEQ ID NO: 69, и выбранная последовательность VL представляет собой SEQ ID NO: 70.46. An antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 33, characterized in that the selected VH sequence is SEQ ID NO: 69, and the selected VL sequence is SEQ ID NO: 70.

47. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 33-46, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с человеческим CTLA4. 47. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 33-46, characterized in that the antibody or its antigen-binding fragment specifically binds to human CTLA4.

48. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 33-47, отличающиеся тем, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. 48. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 33-47, characterized in that the antibody or antigen-binding fragment is a humanized antibody or antigen-binding fragment.

49. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 33-48, отличающиеся тем, что антигенсвязывающий фрагмент представляют собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFV). 49. An antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 33-48, characterized in that the antigen-binding fragment is a single-chain variable fragment (scFV).

50. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 33-48 для получения биспецифического антитела.50. The use of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 33-48 to obtain a bispecific antibody.

51. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения злокачественного новообразования, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12 и 33-49, ковалентно связанный с терапевтическим агентом. 51. Conjugate antibody-drug for the treatment of malignant neoplasms, containing the antibody or antigennegative fragment according to any one of paragraphs. 1-12 and 33-49 covalently linked to the therapeutic agent.

52. Конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 51, отличающийся тем, что терапевтический агент представляет собой цитотоксический или цитостатический агент. 52. The antibody-drug conjugate of claim 51, wherein the therapeutic agent is a cytotoxic or cytostatic agent.

53. Способ лечения пациента, имеющего злокачественное новообразование, причем способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12 и 33-49, или конъюгата антитело-лекарственное средство по пп. 51 или 52. 53. A method of treating a patient having a malignant neoplasm, and the method includes administering to the patient a therapeutically effective amount of a composition containing an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-12 and 33-49, or the antibody-drug conjugate according to paragraphs. 51 or 52.

54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что злокачественное новообразование представляет собой рак печени или немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). 54. The method of claim 53, wherein the malignancy is liver cancer or non-small cell lung cancer (NSCLC).

55. Способ по п. 53, отличающийся тем, что злокачественное новообразование представляет собой меланому, неоперабельную меланому, метастатическую меланому, мелкоклеточный рак легкого (SCLC), рак мочевого пузыря, гормонально рефрактерный метастатический рак предстательной железы, рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, карциноидный рак, рак шейки матки, рак эндометрия, глиому, рак головы и шеи, рак печени, рак легких, лимфому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак почки, колоректальный рак, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, рак уретры или гемобластоз. 55. The method according to p. 53, characterized in that the malignant neoplasm is melanoma, inoperable melanoma, metastatic melanoma, small cell lung cancer (SCLC), bladder cancer, hormonally refractory metastatic prostate cancer, breast cancer, triple negative breast cancer glands, carcinoid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, glioma, head and neck cancer, liver cancer, lung cancer, lymphoma, ovarian cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, kidney cancer, colorectal cancer, stomach cancer, testicular cancer, cancer thyroid, urethral cancer, or hemoblastosis.

56. Способ уменьшения скорости роста опухоли, причем способ включает контактирование опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12 и 33-49, или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.51 или 52. 56. A method for reducing the rate of tumor growth, the method comprising contacting a tumor cell with an effective amount of a composition containing an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of paragraphs. 1-12 and 33-49, or the antibody-drug conjugate of claim 51 or 52.

57. Способ уничтожения опухолевой клетки, причем способ включает контактирование опухолевой клетки с эффективным количеством композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12 и 33-49, или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.51 или 52. 57. A method for killing a tumor cell, the method comprising contacting the tumor cell with an effective amount of a composition containing an antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of paragraphs. 1-12 and 33-49, or the antibody-drug conjugate of claim 51 or 52.

58. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая в эффективном количестве антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12 и 33-49 и фармацевтически приемлемый носитель. 58. Pharmaceutical composition for the treatment of malignant neoplasms, containing an effective amount of an antibody or antigen-binding fragment according to any one of paragraphs. 1-12 and 33-49 and a pharmaceutically acceptable carrier.

59. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования, содержащая в эффективном количестве конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 51 или 52 и фармацевтически приемлемый носитель.59. A pharmaceutical composition for the treatment of cancer, comprising an effective amount of the antibody-drug conjugate of claim 51 or 52 and a pharmaceutically acceptable carrier.

60. Антитело против CTLA4 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую VH CDR 1, 2, 3, и вариабельную область легкой цепи, содержащую VL CDR 1, 2, 3, где 60. An anti-CTLA4 antibody or antigen-binding fragment thereof, containing a heavy chain variable region containing VH CDR 1, 2, 3, and a light chain variable region containing VL CDR 1, 2, 3, where

(1) VH CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или 69, и VL CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 18, 19, 20 или 70; (1) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to the complementarity determining regions in SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, or 69, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to the complementarity determining regions in SEQ ID NO: 18, 19, 20 or 70;

(2) VH CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 или 71, и VL CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 или 72; (2) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to complementarity determining regions in SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, or 71, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to complementarity determining regions in SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28 or 72;

(3) VH CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 73, и VL CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 74; или (3) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to complementarity-determining regions in SEQ ID NO: 73, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to complementarity-determining regions in SEQ ID NO: 74; or

(4) VH CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 75, и VL CDR 1, 2, 3 являются идентичными областям, определяющим комплементарность, в SEQ ID NO: 76.(4) VH CDRs 1, 2, 3 are identical to complementarity determining regions in SEQ ID NO: 75, and VL CDRs 1, 2, 3 are identical to complementarity determining regions in SEQ ID NO: 76.