RU2778786C9 - Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы - Google Patents
Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778786C9 RU2778786C9 RU2019142512A RU2019142512A RU2778786C9 RU 2778786 C9 RU2778786 C9 RU 2778786C9 RU 2019142512 A RU2019142512 A RU 2019142512A RU 2019142512 A RU2019142512 A RU 2019142512A RU 2778786 C9 RU2778786 C9 RU 2778786C9
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- formula
- mrna
- group
- nucleic acid
- peptide nucleic
- Prior art date
Links
- 108060008724 EC 1.14.18.1 Proteins 0.000 title claims abstract description 135
- 102000003425 EC 1.14.18.1 Human genes 0.000 title claims abstract description 135
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 title description 105
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 title description 83
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 title description 83
- 229920002224 Peptide nucleic acid Polymers 0.000 claims abstract description 108
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims abstract description 44
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 23
- 208000000069 Hyperpigmentation Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 230000003810 hyperpigmentation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 231100001006 hyperpigmentation Toxicity 0.000 claims abstract description 15
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 47
- 125000004435 hydrogen atoms Chemical group [H]* 0.000 claims description 30
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 27
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N Cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229940104302 Cytosine Drugs 0.000 claims description 13
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 claims description 13
- 229940113082 Thymine Drugs 0.000 claims description 12
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 12
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 229960000643 Adenine Drugs 0.000 claims description 11
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Natural products NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000004430 oxygen atoms Chemical group O* 0.000 claims description 6
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 claims description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 abstract description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 51
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 32
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 26
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N ARBUTIN Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 24
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 description 20
- 229920001985 Small interfering RNA Polymers 0.000 description 20
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 20
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 19
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 16
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 description 14
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N benzohydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 12
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 229960000271 Arbutin Drugs 0.000 description 11
- 210000002752 Melanocytes Anatomy 0.000 description 11
- 230000000692 anti-sense Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 11
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 10
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N Kojic acid Chemical compound OCC1=CC(=O)C(O)=CO1 BEJNERDRQOWKJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 8
- 125000005257 alkyl acyl group Chemical group 0.000 description 8
- -1 eumelanin Chemical compound 0.000 description 8
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000036564 melanin content Effects 0.000 description 7
- 230000003061 melanogenesis Effects 0.000 description 7
- 230000000699 topical Effects 0.000 description 7
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 6
- 125000005100 aryl amino carbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940100611 Topical Cream Drugs 0.000 description 5
- 229940035893 Uracil Drugs 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- YFTGOBNOJKXZJC-UHFFFAOYSA-N DHICA Chemical compound OC1=C(O)C=C2NC(C(=O)O)=CC2=C1 YFTGOBNOJKXZJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 4
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 4
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N Stearic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000005251 aryl acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005161 aryl oxy carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 4
- 125000004431 deuterium atoms Chemical group 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229960004705 kojic acid Drugs 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N methylene dichloride Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- GFBCWCDNXDKFRH-UHFFFAOYSA-N 4-(oxan-2-yloxy)phenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OC1OCCCC1 GFBCWCDNXDKFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M NaHCO3 Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010062080 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 102000002278 Ribosomal Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060003195 glnE Proteins 0.000 description 3
- 230000002440 hepatic Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N (3β)-Cholest-5-en-3-ol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 206010008570 Chloasma Diseases 0.000 description 2
- VJNCICVKUHKIIV-LURJTMIESA-M L-dopachromate Chemical compound O=C1C(=O)C=C2N[C@H](C(=O)[O-])CC2=C1 VJNCICVKUHKIIV-LURJTMIESA-M 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- TZRFSLHOCZEXCC-HIVFKXHNSA-A Mipomersen Chemical compound N1([C@H]2C[C@@H]([C@H](O2)COP([O-])(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP([O-])(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP([O-])(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)COP([O-])(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP([O-])(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP([O-])(=O)S[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP([O-])(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP([O-])(=O)S[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2CO)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)SP([O-])(=O)OC[C@H]2O[C@H](C[C@@H]2SP([O-])(=O)OC[C@H]2O[C@H](C[C@@H]2SP([O-])(=O)OC[C@H]2O[C@H](C[C@@H]2SP([O-])(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H]([C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OCCOC)SP([O-])(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)SP([O-])(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OCCOC)SP([O-])(=O)OC[C@H]2[C@@H]([C@@H]([C@H](O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)SP([O-])(=O)OC[C@H]2[C@H](O)[C@@H]([C@H](O2)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)OCCOC)N2C(N=C(N)C(C)=C2)=O)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)C=C(C)C(N)=NC1=O TZRFSLHOCZEXCC-HIVFKXHNSA-A 0.000 description 2
- 229960004778 Mipomersen Drugs 0.000 description 2
- 101700080605 NUC1 Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 101700000513 TYRP1 Proteins 0.000 description 2
- 235000018936 Vitellaria paradoxa Nutrition 0.000 description 2
- 241001135917 Vitellaria paradoxa Species 0.000 description 2
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004457 alkyl amino carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004682 aminothiocarbonyl group Chemical group NC(=S)* 0.000 description 2
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 125000004391 aryl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 2
- 229920002784 mipomersen Polymers 0.000 description 2
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 2
- 101700006494 nucA Proteins 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004434 sulfur atoms Chemical group 0.000 description 2
- 238000001196 time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 150000005208 1,4-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- PGNRLPTYNKQQDY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxyindole Chemical compound C1=CC=C2C(O)=C(O)NC2=C1 PGNRLPTYNKQQDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAJVDDFSOMFLSO-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethyl prop-2-enoate;sodium Chemical compound [Na].OCCOC(=O)C=C AAJVDDFSOMFLSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 3-O-methyl-D-glucose Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)CO RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 0.000 description 1
- ANZUDYZHSVGBRF-UHFFFAOYSA-N 3-ethylnonane-1,2,3-triol Chemical compound CCCCCCC(O)(CC)C(O)CO ANZUDYZHSVGBRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGNZYJXNUURYCH-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydroxyindole Chemical compound C1=C(O)C(O)=CC2=C1NC=C2 SGNZYJXNUURYCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LJSAJMXWXGSVNA-UHFFFAOYSA-N A805044 Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.OC1=CC=C(O)C=C1 LJSAJMXWXGSVNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N Bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- VLFIBROLAXKPQK-UHFFFAOYSA-N Catechin 7-glucoside Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC(O)=C(CC(O)C(O2)C=3C=C(O)C(O)=CC=3)C2=C1 VLFIBROLAXKPQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093528 Cetearyl Ethylhexanoate Drugs 0.000 description 1
- 229940107161 Cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 206010009802 Coagulopathy Diseases 0.000 description 1
- 108009000280 Complement Activation Proteins 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000010247 Contact Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 101710004105 DCT Proteins 0.000 description 1
- 101700011961 DPOM Proteins 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N Deoxyribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- SZXQTJUDPRGNJN-UHFFFAOYSA-N Dipropylene glycol Chemical compound OCCCOCCCO SZXQTJUDPRGNJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N Docosanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO NOPFSRXAKWQILS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 206010048653 Enzyme inhibition Diseases 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 206010064503 Excessive skin Diseases 0.000 description 1
- 241000272184 Falconiformes Species 0.000 description 1
- IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)Cl)C3=CC=CC=C3C2=C1 IRXSLJNXXZKURP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940049294 GLYCERYL STEARATE SE Drugs 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N Glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 Glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- UQEAIHBTYFGYIE-UHFFFAOYSA-N Hexamethyldisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C UQEAIHBTYFGYIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020718 Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 206010021425 Immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000001083 Kidney Disease Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010024217 Lentigo Diseases 0.000 description 1
- 241000408529 Libra Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710029649 MDV043 Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 208000008466 Metabolic Disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036650 Metabolic stability Effects 0.000 description 1
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029149 Nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 206010029151 Nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 235000005043 Oryza sativa Japonica Group Nutrition 0.000 description 1
- 101700061424 POLB Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N Phenoxyethanol Chemical compound OCCOC1=CC=CC=C1 QCDWFXQBSFUVSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005323 Phenoxyethanol Drugs 0.000 description 1
- RZKYEQDPDZUERB-UHFFFAOYSA-N Pindone Chemical group C1=CC=C2C(=O)C(C(=O)C(C)(C)C)C(=O)C2=C1 RZKYEQDPDZUERB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108020000494 Protein Tyrosine Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101700054624 RF1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 1
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 1
- 210000001525 Retina Anatomy 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229940057910 Shea butter Drugs 0.000 description 1
- 206010064127 Solar lentigo Diseases 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 102100007096 TYRP1 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N Taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036335 Tissue distribution Effects 0.000 description 1
- 229940100617 Topical Lotion Drugs 0.000 description 1
- 240000008529 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 208000001072 Type 2 Diabetes Mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108009000112 Type II diabetes mellitus Proteins 0.000 description 1
- 240000000985 Vaccinium erythrocarpum Species 0.000 description 1
- UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;hexafluorophosphate Chemical compound F[P-](F)(F)(F)(F)F.C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 UQYZFNUUOSSNKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004670 alkyl amino thio carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000001769 aryl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 201000001320 atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229940081733 cetearyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008278 cosmetic cream Substances 0.000 description 1
- 239000008341 cosmetic lotion Substances 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000001808 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000080 dermatitis contact Toxicity 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940008099 dimethicone Drugs 0.000 description 1
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L disodium;2-[2-[carboxylatomethyl(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229960000735 docosanol Drugs 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000000039 epithelial melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- UBHWBODXJBSFLH-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol;octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO.CCCCCCCCCCCCCCCCCCO UBHWBODXJBSFLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008172 hydrogenated vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113083 morpholine Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 231100000175 potential carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 229910052904 quartz Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001603 reducing Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 229960001367 tartaric acid Drugs 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940104261 taurate Drugs 0.000 description 1
- 238000003419 tautomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000021307 wheat Nutrition 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты, фармацевтическую композицию для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающую эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты, фармацевтическую композицию лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающую эффективное количество производного пептидной, способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты, способ лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты, применение производного пептидной нуклеиновой кислоты при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, и применение производного пептидной нуклеиновой кислоты при получении медикамента для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека. Изобретение расширяет арсенал средств комплементарно целенаправленно воздействующих на пре-мРНК тирозиназы человека. 7 н. и 2 з.п. ф-лы, 22 ил., 3 табл., 6 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к производным пептидных нуклеиновых кислот, комплементарно целенаправленно воздействующим на пре-мРНК тирозиназы человека, для улучшения опосредованной тирозиназой пигментации кожи.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Меланин обобщенно относится к темным природным и полимерным пигментам, вырабатываемым в живых организмах. Существует три типа меланина, т.е. эумеланин, феомеланин и нейромеланин. Эумеланин и феомеланин синтезируются в коже. Одновременно нейромеланин является меланином, найденным в головном мозге, и его физиологические функции до сих пор не выяснены.
Меланин в коже эффективно поглощает УФ (ультрафиолетовое) излучение и защищает животных от УФ (ультрафиолетового) облучения при естественном солнечном свете. Таким образом, загар является естественным процессом, которым животные защищают себя от УФ облучения на солнце.
Аминокислота тирозин полимеризуется до эумеланина после ряда сложных реакций в присутствии тирозиназы. Эумеланин относится к полимерам 5,6-дигидроксииндола (dihydroxyindole, DHI) и 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновой кислоты (5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid, DHICA). Феомеланин образуется при полимеризации тирозина с помощью тирозиназы в присутствии цистеина или глутатиона.
В схеме 1 обобщены реакции, включающие TYR (тирозиназа), TYRP-1 (тирозиназа-зависимый белок 1, т.е. DHICA оксидаза) и TYRP-2 (тирозиназа-зависимый белок 2, т.е. DОРАхром (допахром) таутомераза) во время биосинтеза эумеланина и феомеланина. [Int. J. Mol. Sci. vol 10,4066-4087 (2009)].
Схема 1
Принимая во внимание, что тирозиназа (TYR) играет центральные роли в биосинтезе меланина в коже, были использованы или разработаны ингибиторы TYR в качестве косметических ингредиентов для уменьшения чрезмерной пигментации кожи, т.е. гиперпигментации. В нескольких публикациях [Int. J. Cosmetic Sci. vol 33, 210-221 (2011); Int. J. Mol. Sci. vol 10, 2440-2475 (2009)] ингибиторы TYR были проверены на предмет их воздействия на меланогенез.
Гидрохинон (1,4-дигидроксибензол) был использован для местного лечения гиперпигментации в течение десятилетий. [JAMA vol 194(9), 965-967 (1965)] Гидрохинон, как известно, подавляет активность TYR путем связывания с активным центром тирозиназы. В 2006 году US FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) отозвало предыдущую регистрацию всех безрецептурных (ОТС over-the-counter) продуктов, содержащих гидрохинон, из-за проблем с безопасностью, включая потенциальную канцерогенность. Гидрохинон индуцирует активные формы кислорода (reactive oxygen species, ROS), повреждая мембранные липиды и белки, включая тирозиназу. Окислительное повреждение мембранных липидов необратимо лишает меланоцитов.
Арбутин (гидрохинон-О-β-D-глюкопиранозид) представляет собой гликозилированный гидрохинон, извлеченный из растения толокнянки. Арбутин также содержится в шелухе пшеницы и кожице груши. Как и гидрохинон, арбутин ингибирует меланогенез путем конкурентного связывая с активным центром TYR. [J. Pharmacol. Exp. Ther. vol 276(2), 765-769 (1996)]. Арбутин менее цитотоксичен к меланоцитам, чем гидрохинон.
Дезоксиарбутин является синтетическим производным арбутина и сравним с гидрохиноном и арбутином по ингибирующей активности TYR. Дезоксиарбутин менее цитотоксичен к меланоцитам, чем арбутин, а также и гидрохинон. [J. Dermatol. Sci. vol 55(3), 179-184 (2009)]. Дезоксиарбутин значительно улучшил светлый цвет кожи человека при наружной обработке в течение 12 недель. [Exp. Dermatol, vol 14(8), 601-608 (2005)].
Койевая кислота является хелатирующим агентом, полученным во время грибкового брожения в производстве соевого соуса и саке, т.е. японского рисового вина. Койевая кислота была использована для сохранения или изменения цвета в пищевых и косметических продуктах. Койевая кислота связывается в хелатный комплекс к ионами меди в активном центре TYR для ингибирования меланогенеза. Также подавляется таутомеризация DОРАхрома в 5,6-дигидроксииндол-2-карбоновую кислоту. [J. Pharm. Pharmacol, vol 46(12), 982-985 (1994)]. Койевая кислота была широко использована для лечения мелазмы, хотя она может вызвать контактный дерматит, сенсибилизацию и эритему. [J. Drugs Dermatol, vol 6(1), 32-39 (2007)].
Хотя существуют целый ряд ингибиторов TYR, их величины IC50 по сравнению с TYR в большинстве случаев являются микромолярными (мкМ). [J. Enzyme Inhibition Med. Chem. vol 32(1), 403-425 (2017)]. Считается, что такие величины IC50 являются плохими, принимая во внимание их молекулярные размеры, и повышают вероятность перекрестной реактивности с другой(ими) молекулярной(ыми) мишенью(ями). Поскольку плохая ингибирующая активность транслируется в большую трансдермальную дозу, ингибирующую активность необходимо заметно улучшить, чтобы удовлетворить желаемую трансдермальную активность против пигментации кожи, а также безопасности.
Пре-мРНК: Генетическая информация осуществляется на ДНК (2-дезоксирибонуклеиновая кислота). ДНК транскрибируется для продуцирования пре-мРНК (пре-информационная (матричная) рибонуклеиновая кислота) в ядре. Пре-мРНК млекопитающих обычно состоит из экзонов и интронов, а экзон и интрон взаимосвязаны друг с другом, как схематично приведено ниже. Экзоны и интроны пронумерованы, как проиллюстрировано на рисунке ниже.
Схематическое описание структуры пре-мРНК
Сплайсинг пре-мРНК: Пре-мРНК подвергается процессингу в мРНК после удаления интронов серией сложных реакций в совокупности называемых "сплайсингом", который схематически обобщен ниже на диаграмме. [Ann. Rev. Biochem. 72(1), 291-336 (2003); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 6(5), 386-398 (2005); Nature Rev. Mol. Cell Biol. 15(2), 108-121 (2014)].
Сплайсинг инициируется образованием "сплайсомного Е комплекса" (т.е. ранний сплайсомный комплекс) между пре-мРНК и адапторными факторами сплайсинга. В "сплайсомном Е комплексе", U1 связывается с областью соединения экзона N и интрона N, и U2AF35 связывает область соединения интрона N и экзона (N+1). Таким образом, области соединения экзон/интрон или интрон/экзон являются критическими для образования раннего сплайсомного комплекса. "Сплайсомный Е комплекс" превращается в "сплайсомный А комплекс " при дополнительном комплексообразовании с U2. "Сплайсомный А комплекс" претерпевает серию сложных реакций для удаления или сплайсирования интрона, чтобы присоединить соседние экзоны.
Синтез рибосомного белка: Белки кодируются ДНК (2-дезоксирибонуклеиновая кислота). В ответ на клеточную стимуляцию или спонтанно ДНК транскрибируется для продуцирования пре-мРНК (пре-матричная рибонуклеиновая кислота) в ядре. Интроны пре-мРНК ферментативным путем сплайсируются для получения мРНК (матричная рибонуклеиновая кислота), которая затем транслоцируется в цитоплазму. В цитоплазме комплекс трансляционного механизма, вызванный рибосомой, связывается с мРНК и осуществляется синтез белка, поскольку он сканирует генетическую информацию, кодируемую по мРНК. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Cancer Res. vol 48, 2659-2668 (1988)].
Антисмысловой олигонуклеотид (Antisense Oligonucleotide, ASO): Связывание олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой, включая ДНК, мРНК и пре-мРНК, в сиквенс-специфичном методе (т.е. комплементарно) называется антисмысловым олигонуклеотидом (ASO).
Если ASO прочно связывается с мРНК в цитоплазме, например, ASO может ингибировать синтез рибосомного белка по мРНК. Необходимо, чтобы ASO присутствовал внутри цитоплазмы для того, чтобы ингибировать синтез рибосомного белка его белка-мишени.
Антисмысловое ингибирование сплайсинга: Если ASO прочно связывается с пре-мРНК в ядре, ASO сможет ингибировать или модулировать сплайсинг пре-мРНК в мРНК. Необходимо, чтобы ASO присутствовал внутри ядра для того, чтобы ингибировать или модулировать сплайсинг пре-мРНК в мРНК. Такое антисмысловое ингибирование сплайсинга продуцирует мРНК или мРНКы, не содержащие экзона, нацеленного с помощью ASO. Такая(ие) мРНК(ы) называется(ются) "сплайс-вариантом(ами)", и кодирует(ют) белок(и) меньший(ие), чем белок, кодируемый полноразмерной мРНК.
В принципе, сплайсинг может быть нарушен при ингибировании образования «сплайсомного Е комплекса». Если ASO прочно связывается с областью соединения (5'→3') экзон-интрон, т.е. "5' сайт сплайсинга», то ASO блокирует образование комплекса между пре-мРНК и фактором U1, и, следовательно, образование «сплайсомного Е комплекса». Аналогичным образом, «сплайсомный Е комплекс» не может образоваться, если ASO прочно связывается с областью соединения (5'→3') интрон-экзон, т.е. «3' сайт сплайсинга».
3' сайт сплайсинга и 5' сайт сплайсинга схематически проиллюстрированы на рисунке, приведенном ниже.
Олигонуклеотиды не природного происхождения: ДНК- или РНК-олигонуклеотиды подвержены деградации эндогенными нуклеазами, ограничивая их терапевтическую ценность. В настоящее время были разработаны и интенсивно исследованы многие виды олигонуклеотидов не природного происхождения (не встречающиеся в природе). [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)]. Некоторые из них показывают длительную метаболическую стабильность по сравнению с ДНК и РНК. Ниже приведены химические структуры для нескольких типичных олигонуклеотидов не природного происхождения. Такие олигонуклеотиды предсказуемо связываются с комплементарной нуклеиновой кислотой, как это делает ДНК или РНК.
В: Нуклеиновое основание
Фосфоротиоатный олигонуклеотид: Фосфоротиоатный олигонуклеотид (ФТО) (Phosphorothioate oligonucleotide, РТО) является аналогом ДНК с одним остовом атомов фосфатного кислорода, замещенных атомом серы в мономере. Такое небольшое структурное изменение сделало ФТО сравнительно устойчивым к деградации нуклеазами. [Ann. Rev. Biochem. vol 54, 367-402 (1985)].
Отражая структурное сходство в остове ФТО и ДНК, они оба плохо проникают в клеточную мембрану в большинстве типов клеток млекопитающих. При этом, для некоторых типов клеток, чрезмерно экспрессирующих транспортер(ы) ДНК, ДНК и ФТО показывают хорошее проникновение в клетки. Известно, что системно вводимые ФТО(ы) легко распределяются в печени и почках. [Nucleic Acids Res. vol 25, 3290-3296 (1997)].
Для того, чтобы облегчить проникновение в клетки ФТО in vitro, обычно на практике применяют липофекцию. Однако, липофекция физически изменяет клеточную мембрану, вызывает цитотоксичность, и поэтому не будет идеальным для долгосрочного терапевтического применения in vivo.
За прошедшие 30 лет антисмысловые ФТО(ы) и варианты ФТО(ов) были клинически оценены для лечения рака, иммунологических расстройств, метаболических заболеваний и так далее. [Biochemistry vol 41, 4503-4510 (2002); Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)]. Многие из таких кандидатов антисенс-препаратов не были успешно разработаны отчасти из-за плохого проникновения в клетки ФТО. Для того, чтобы преодолеть плохое проникновение в клетки, ФТО необходимо вводить в высокой дозе для терапевтической активности.
Однако, известно, что ФТО(ы) связаны с дозолимитирующей токсичностью, включающей увеличенное время свертывания, активацию комплемента, тубулярную нефропатию, активацию купферовых клеток и иммунную стимуляцию, включая спленомегалию, лимфоидную гиперплазию, мононуклеарную клеточную инфильтрацию. [Clin. Exp. Pharmacol. Physiol, vol 33, 533-540 (2006)].
Было найдено, что многие антисмысловые ФТО(ы) показывают надлежащую клиническую активность при заболеваниях со значительной ролью печени или почек. Мипомерсен является аналогом ФТО, который ингибирует синтез ароВ-100, белка, вовлеченного в транспорт холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL). Мипомерсен проявлял надлежащую клиническую активность у больных атеросклерозом, скорее всего, из-за его избирательного распределения в печени. [Circulation vol 118(7), 743-753 (2008)]. ISIS-113715 является антисмысловым аналогом ФТО, ингибирующего синтез протеинтирозинфосфатазы IB (РТР1В), и было установлено, что показывает терапевтическую активность у больных сахарным диабетом II типа. [Curr. Opin. Mol. Ther. vol 6, 331-336 (2004)].
Запертая нуклеиновая кислота: В запертой нуклеиновой кислоте (ЗНК) (locked nucleic acid, LNA) рибозное кольцо остова РНК структурно затрудняет увеличить связывающую способность для РНК или ДНК. Таким образом, ЗНК можно рассматривать как аналог ДНК или РНК высокой аффинности. [Biochemistry vol 45, 7347-7355 (2006)].
Фосфородиамидат морфолино олигонуклеотид: В фосфородиамидат морфолино олигонуклеотиде (ФМО) (phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide, PMO) фосфатный остов и 2-дезоксирибоза ДНК заменяются фосфорамидатом и морфолином, соответственно. [Appl. Microbiol. Biotechnol. vol 71, 575-586 (2006)]. При этом остов ДНК отрицательно заряжен, ФМО остов не заряжен. Таким образом, связывание между ФМО и мРНК не имеет электростатического отталкивания между остовами и, как правило, сильнее, чем таковое между ДНК и мРНК. Так как ФМО структурно очень сильно отличается от ДНК, ФМО не будет распознаваться печеночным(и) транспортером(ами), распознающим(ими) ДНК или РНК. При этом ФМО не легко проникает в клеточную мембрану.
Пептидная нуклеиновая кислота: Пептидная нуклеиновая кислота (ПНК) (Peptide nucleic acid, PNA) является полипептидом с N-(2-аминоэтил)глицином в качестве остовного звена и была открыта Dr. Nielsen и коллегами. [Science vol 254, 1497-1500 (1991)]. Химическая структура и сокращенная номенклатура ПНК иллюстрируются на представленном ниже рисунке. Подобно ДНК и РНК, ПНК также селективно связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой. [Nature (London) vol 365, 566-568 (1992)]. При связывании с комплементарной нуклеиновой кислотой N-конец ПНК рассматривается как эквивалент «5'-конца» ДНК или РНК и С-конец ПНК как эквивалент «3'-конца» ДНК или РНК.
Подобно ФМО, остов ПНК не заряжен. Таким образом, связывание между ПНК и РНК, как правило, сильнее, чем связывание между ДНК и РНК. Так как ПНК заметно отличается от ДНК по химической структуре, ПНК не будет распознаваться печеночным(ми) транспортером(ами), распознающим(ими) ДНК, и будет показывать профиль распределения в тканях, отличный от такого для ДНК или ФТО. Однако, ПНК также плохо проникает в мембрану клеток млекопитающих. (Adv. Drug Delivery Rev. vol 55, 267-280,2003).
Модифицированные нуклеиновые основания для улучшения мембранной проницаемости ПНК: ПНК была получена высоко проницаемой для мембраны клеток млекопитающих путем введения модифицированных нуклеиновых оснований с катионным липидом или его эквивалентном ковалентно к нему присоединенным. Химические структуры таких модифицированных нуклеиновых оснований приведены ниже. Было найдено, что такие модифицированные нуклеиновые основания цитозина, аденина и гуанина предсказуемо и комплементарно гибридизируются с гуанином, тимином и цитозином, соответственно. [РСТ Appl. No. PCT/KR2009/001256; ЕР2268607; US8680253].
Включение таких модифицированных нуклеиновых оснований в ПНК имеет сходство с ситуациями липофекции. При липофекции молекулы олигонуклеотида с фосфатным остовом скрыты катионными липидными молекулами, такими как липофектамин, и такие липофектамин/олигонуклеотидные комплексы склонны проникать в мембрану довольно легко по сравнению с оголенными молекулами олигонуклеотида.
Было найдено, что в дополнение к хорошей мембранной проницаемости, эти производные ПНК обладают ультра-сильным сродством к комплементарной нуклеиновой кислоте. Например, введение от 4 до 5 модифицированных нуклеиновых оснований в 11-13-мерные производные ПНК легко дало прирост Tm в 20°С или выше при дуплексном образовании с комплементарной ДНК. Такие производные ПНК очень чувствительны к ошибочному спариванию пары оснований. Ошибочное спаривание пары оснований привело к потере Tm от 11 до 22°С в зависимости от типа модифицированного основания, а также последовательности ПНК.
Малая интерферирующая РНК (siPHК) (small Interfering RNA, siRNA): Малая интерферирующая РНК (siPHК) относится к двухцепочечной РНК из 20-25 пар оснований. [Microbiol. Mol. Biol. Rev. vol 67(4), 657-685 (2003)]. Антисмысловая цепь siPHK каким-то образом взаимодействует с белками, образуя «индуцированный РНК комплекс сайленсинга» (RNA-induced Silencing Complex, RISC). Затем RISC связывается с определенной частью мРНК, комплементарной к антисмысловой цепи siPHК. мРНК, образовавшая комплекс с RISC, подвергается расщеплению. Таким образом, siPHК каталитически индуцирует расщепление своей мишени(целевой) мРНК, и, следовательно, подавляет экспрессию белка с помощью мРНК. RISC не всегда связывается с полной комплементарной последовательностью в пределах целевой мРНК, что вызывает опасения, связанные с ненаправленными действиями лекарственного действия siPHК. Как и другие классы олигонуклеотида с остовом ДНК или РНК, siPHК обладает плохой клеточной проницаемостью и, следовательно, имеет тенденцию показывать плохую терапевтическую активность in vitro или in vivo, если должным образом не подготовлена или химически не модифицирована для получения хорошей мембранной проницаемости.
siPHК(ы) тирозиназы: Было найдено, что siPHК TYR, направленная на 19-мерную РНК последовательность в мРНК TYR человека, ингибирует экспрессию мРНК TYR и белка в эпидермальных меланоцитах человека (human epidermal melanocytes, HEMs) после липофекции при 20 нМ. siPHК подавляла мРНК TYR и белок, но не влияла на экспрессию тирозиназа-зависимых белков 1 и 2. siPHК ингибировала меланогенез, индуцированный ультрафиолетовым излучением. [ВМВ Reports, vol 42(3), 178-183 (2009)].
siPHК(ы), направленные на мишень мРНК TYR мыши, подвергли скринингу на их способность подавлять экспрессию мРНК TYR и белка, и меланогенез в клетках В16 меланомы мыши после липофекции при 40 нМ. Наиболее эффективную siPHК вводили в глазное яблоко мыши C57BL/6 и было установлено ингибирование мРНК TYR в сетчатке на примерно 60%. [Mol. Biol. International, vol 2010, Article ID 240472 (2010)].
Описание изобретения
Решаемая проблема
Имеются другие общедоступные примеры для siPHК TYR. Например, в известном уровне техники раскрыты siPHК(ы), направленные на мРНК TYR человека для лечения гиперпигментации. [US 7504385]. Тем не менее, применимость таких siPHК(т) сомнительна для использования против гиперпигментации. siPHК(ы) слишком дороги для производства, и их косметическая полезность, как правило, ограничена. Также они должны быть доставлены в кожу с помощью трансдермального введения при надлежащем соблюдении пользователем. Следует предусмотреть, что трансдермальная доставка является огромной технической проблемой в области олигонуклеотида.
Решение проблемы
Данное изобретение предлагает производное пептидной нуклеиновой кислоты, представленное формулой I, или ее фармацевтически приемлемую соль:
[Формула I]
где
n - целое число от 10 до 21;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека или частично комплементарно пре-мРНК TYR человека с одним или двумя ошибочными спариваниями от всего соединения формулы I;
S1, S2, , Sn-1, Sn, Т1, T2, , Tn-1 и Tn независимо обозначают атом дейтерия, атом водорода, замещенную или незамещенную алкилгруппу или замещенную или незамещенную арилгруппу;
X и Y независимо обозначают атом дейтерия, атом водорода [Н], формилгруппу [Н-С(=O)-], аминокарбонилгруппу [NH2-C(=O)-], аминотиокарбонилгруппу [NH2-C(=S)-], замещенную или незамещенную алкилгруппу, замещенную или незамещенную арилгруппу, замещенную или незамещенную алкилацилгруппу, замещенную или незамещенную арилацилгруппу, замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную арилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилфосфонилгруппу или замещенную или незамещенную арилфосфонилгруппу;
Z обозначает атом водорода, гидроксигруппу, замещенную или незамещенную алкилоксигруппу, замещенную или незамещенную арилоксигруппу, замещенную или незамещенную аминогруппу, замещенную или незамещенную алкилгруппу или замещенную или незамещенную арилгруппу;
B1, B2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения; и
по меньшей мере четыре из B1, B2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения с замещенной или незамещенной аминогруппой, ковалентно связанной с остатком нуклеинового основания.
Соединение формулы I индуцирует пропуск «экзона 2» в пре-мРНК TYR человека, дает сплайс-вариант(ы) мРНК TYR человека, не содержащий(ие) «экзона 2», и, следовательно, пригодно для ингибирования функциональной активности гена, считывающего пре-мРНК TYR человека.
Условие, что «п представляет собой целое число от 10 до 21» буквально означает, что п является целым числом, выбираемым из группы целых чисел 11, 12, 13, 14,15, 16, 17,18, 19 и 20.
Химические структуры природных нуклеиновых оснований или нуклеиновых оснований не природного происхождения в производном ПНК формулы I подтверждаются примерами на Фиг. 1а-1с. Природные (т.е. встречающиеся в природе) нуклеиновые основания или нуклеиновые основания не природного происхождения (т.е. не встречающиеся в природе), описанные в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются нуклеиновыми основаниями, представленными на Фиг. 1а-1с. Обеспечение таких нуклеиновых оснований не природного происхождения является иллюстрацией разнообразия приемлемых нуклеиновых оснований, и поэтому не должно быть истолковано для ограничения объема настоящего изобретения.
Заместители, выбранные для описания производного ПНК формулы I, приведены на фиг. 2а-2е. Фиг. 2а приводит примеры для замещенных или незамещенных алкилгрупп. Замещенные или незамещенные алкилацилгруппы и замещенные или незамещенные арилацилгруппы приведены на фиг. 2b. Фиг. 2с иллюстрирует примеры для замещенной или незамещенной алкиламиногруппы, замещенной или незамещенной ариламиногруппы, замещенной или незамещенной арилгруппы, замещенной или незамещенной алкилсульфонилгруппы или арилсульфонилгруппы. Фиг. 2d приводит примеры для замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы или арилоксикарбонилгруппы, замещенной или незамещенной алкиламинокарбонилгруппы или ариламинокарбонилгруппы. На фиг. 2е приведены примеры для замещенной или незамещенной алкиламинотиокарбонилгруппы, замещенной или незамещенной ариламинотиокарбонилгруппы, замещенной или незамещенной алкилокситиокарбонилгруппы и замещенной или незамещенной арилокситиокарбонилгруппы. Обеспечение таких типичных заместителей является иллюстрацией разнообразия приемлемых заместителей, и поэтому не должно быть истолковано для ограничения объема настоящего изобретения. Специалист в данной области может легко додумать, что олигонуклеотидная последовательность является ключевым фактором для сиквенс-специфичного связывания олигонуклеотида с целевой последовательностью пре-мРНК по сравнению с заместителями в N-конце или С-конце.
Соединение формулы 1 прочно связывается с комплементарной ДНК, пример которой приведен в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256]. Дуплекс между производным ПНК формулы I и его полноразмерной комплементарной ДНК или РНК обладает значением Tm слишком высоким, чтобы достоверно определить в водном буфере. Соединение ПНК формулы I дает высокие значения Tm с комплементарными ДНКами более короткой длины.
Соединение формулы I комплементарно связывается с 3' сайтом сплайсинга "экзона 2" пре-мРНК TYR человека. [NCBI Reference Sequence: NG_0008748]. 14-мерная последовательность [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] охватывает область соединения «интрона 1» и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека, и состоит из 7-мерной от "интрона 1" и 7-мерной от "экзона 2". Таким образом, 14-мерная последовательность пре-мРНК может обычно обозначаться как [(5'→3') uguacag AUUGUCU], где последовательность интрона и экзона определяется соответственно "строчными" и "заглавными" буквами и область соединения интрона-экзона выражается "". Традиционное обозначение для пре-мРНК дополнительно иллюстрируется 30-мерной последовательностью [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. Кроме того, 30-мерная последовательность пре-мРНК однозначно определяет 3' сайт сплайсинга, направленный соединением формулы I в пре-мРНК TYR человека, хотя нумерация экзонов TYR может описываться иным образом.
Соединение формулы I прочно связывается с целевым 3' сайтом сплайсинга пре-мРНК TYR человека, считанного из гена TYR человека, и препятствует образованию «раннего сплайсомного комплекса», включающего целевой экзон соединения. Так как соединение, описанное в настоящем изобретении, стерически тормозит образование «раннего сплайсомного комплекса», "экзон 2" TYR сплайсируется для получения сплайс-варианта(ов) мРНК TYR, не содержащего(их) "экзона 2". Следовательно, соединение настоящего изобретения индуцирует пропуск "экзона 2" TYR.
Сильное сродство РНК позволяет соединению формулы I вызвать пропуск "экзона 2" TYR, даже если производное ПНК имеет одно или два ошибочных спаривания с целевым 3' сайтом сплайсинга в пре-мРНК TYR. Подобным образом производное ПНК формулы I все еще может индуцировать пропуск "экзона 2" TYR в мутантной пре-мРНК TYR, обладающей одним или двумя однонуклеотидными полиморфизмами (single nucleotide polymorphism, SNPs) в целевом сайте сплайсинга.
Соединение формулы I обладает хорошей клеточной проницаемостью и может быть легко доставлено в клетку как «оголенный» олигонуклеотид, примером чего является предшествующий уровень техники [PCT/KR2009/001256]. Таким образом, соединение, описанное в настоящем изобретении, индуцирует пропуск "экзона 2" в пре-мРНК TYR и дает сплайс-вариант(ы) мРНК TYR, не содержащий(ие) "экзона 2" TYR в клетках, обработанных соединением формулы I как «оголенным» олигонуклеотидом. Соединение формулы I не требует каких-либо средств или составов для доставки в клетку, чтобы мощно индуцировать пропуск целевого экзона в клетках. Соединение формулы I легко индуцирует пропуск "экзона 2" TYR в клетках, обработанных соединением, описанным в настоящем изобретении, как «оголенным» олигонуклеотидом при субфемтомолярной концентрации.
Вследствие хорошей клеточной или мембранной проницаемости, производное ПНК формулы I может местно вводиться как «оголенный» олигонуклеотид для индуцирования пропуска "экзона 2" TYR в коже. Соединению формулы I не требуется лекарственная форма для увеличения трансдермальной доставки в ткань-мишень с точки зрения надлежащей терапевтической или биологической активности. Обычно соединение формулы I растворяют в воде и сорастворителе и наружно или трансдермально вводят при субпикомолярной концентрации, чтобы вызвать желаемую терапевтическую или биологическую активность в коже-мишени. Соединение, описанное в настоящем изобретении, не обязательно должно быть интенсивно или агрессивно вводиться, чтобы вызвать топическую терапевтическую активность. Тем не менее, производное ПНК формулы I может входить в состав с косметическими ингредиентами или адъювантами в качестве наружного крема или лосьона. Такой наружный косметический крем или лосьон может быть пригоден для лечения гиперпигментации лица.
Соединение формулы I может использоваться в сочетании с фармацевтически приемлемой кислотой или основанием, включая, но не ограничиваясь, гидроксид натрия, гидроксид калия, соляную кислоту, метансульфоновую кислоту, лимонную кислоту, трифторуксусную кислоту и другие.
Производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль может вводиться субъекту вместе с фармацевтически приемлемым адъювантом, включая, но не ограничиваясь, лимонную кислоту, соляную кислоту, винную кислоту, стеариновую кислоту, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этанол, изопропанол, бикарбонат натрия, дистиллированную воду, консервант(ы) и другие.
Соединение, описанное в настоящем изобретении, может вводиться местно субъекту при терапевтически или биологически эффективной концентрации в диапазоне от 1 аМ до более чем 1 нМ, которая будет варьироваться в зависимости от схемы приема препарата, состояний или ситуаций субъекта, и так далее.
Предпочтительным является производное ПНК формулы I или ее фармацевтически премлемая соль:
где
n - целое число от 10 до 21;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека или частично комплементарно пре-мРНК TYR человека с одним или двумя ошибочными спариваниями от всего соединения формулы I;
X и Y независимо обозначают атом дейтерия, атом водорода, формилгруппу, аминокарбонилгруппу, аминотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилгруппу, замещенную или незамещенную арилгруппу, замещенную или незамещенную алкилацилгруппу, замещенную или незамещенную арилацилгруппу, замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилоксикарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкиламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную ариламинотиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную арилокситиокарбонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную арилсульфонилгруппу, замещенную или незамещенную алкилфосфонилгруппу или замещенную или незамещенную арилфосфонилгруппу;
Z обозначает атом водорода, гидроксигруппу, замещенную или незамещенную алкилоксигруппу, замещенную или незамещенную арилоксигруппу или замещенную или незамещенную аминогруппу;
B1, B2, , Bn-1, Bn независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере четыре из B1, B2, , Bn-1, Bn, независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV:
где
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 независимо выбраны из атома водорода и замещенной или незамещенной алкилгруппы;
L1, L2 и L3 являются ковалентным линкером, представленным формулой V, ковалентно соединяющий основную аминогруппу с остатком нуклеинового основания:
где
Q1 и Qm представляют собой замещенную или незамещенную метиленгруппу (-СН2-) и Qm непосредственно связывается с основной аминогруппой;
Q2, Q3, , Qm-1, независимо выбраны из замещенной или незамещенной метиленгруппы, атома кислорода (-O-), атома серы (-S-) и замещенной или незамещенной аминогруппы [-N(H)- или -N(заместитель)-]; и
m - целое число от 1 до 15.
Представляет интерес олигомер ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n - целое число от 11 до 18;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;
X и Y независимо обозначают атом водорода, замещенную или незамещенную алкилгруппу, замещенную или незамещенную арилруппу, замещенную или незамещенную алкилацилгруппу, замещенную или незамещенную арилацилгруппу,замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу или замещенную или незамещенную арилоксикарбонилгруппу;
Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;
B1, B2, , Bn-1, Bn независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере четыре из B1, B2, , Bn-1, Bn независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 независимо выбраны из атома водорода и замещенной или незамещенной алкилгруппы;
Q1 и Qm представляют собой замещенную или незамещенную метиленгруппу и Qm непосредственно связывается с основной аминогруппой;
Q2, Q3, и Qm-1 независимо выбраны из замещенной или незамещенной метиленгруппы, атома кислорода и аминогруппы; и
m - целое число от 1 до 11.
Представляет интерес производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль:
где
n - целое число от 11 до 16;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;
X и Y независимо выбраны из атома водорода, замещенной или незамещенной алкилацилгруппы или замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы;
Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;
B1, B2, , Bn-1, Bn, независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере четыре из B1, B2, , Bn-1, Bn, независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 независимо выбраны из атома водорода и замещенной или незамещенной алкилгруппы;
Q1 и Qm представляет собой метиленгруппу и Qm непосредственно связана с основной аминогруппой;
m - целое число от 1 до 9.
Представляет интерес олигомер ПНК формулы I или его фармацевтически приемлемая соль:
где
n - целое число от 11 до 16;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно TYR пре-мРНК человека;
X и Y независимо выбраны из атома водорода, замещенной или незамещенной алкилацилгруппы или замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы;
Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;
B1, В2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере четыре из B1, В2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;
R1, R3 и R5 представляют собой атом водорода и R2, R4 и R6 независимо обозначают атом водорода или замещенную или незамещенную алкилгруппу;
Q1 and Qm представляют собой метиленгруппу и Qm непосредственно связана с основной аминогруппой;
m - целое число от 1 до 9.
Представляет интерес производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль:
где
n - целое число от 11 до 16;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;
X и Y независимо выбраны из атома водорода, замещенной или незамещенной алкилацилгруппы или замещенной или незамещенной алкилоксикарбонилгруппы;
Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;
B1, В2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере пять из B1, В2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 являются атомами водорода;
Q1 and Qm представляют собой метиленгруппу и Qm непосредственно связана с основной аминогруппой;
m - целое число от 1 до 9.
Представляет интерес производное ПНК формулы I или ее фармацевтически приемлемая соль:
где
n - целое число от 11 до 16;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК TYR человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК TYR человека;
X является атомом водорода;
Y обозначает замещенную или незамещенную алкилацилгруппу или замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу;
Z обозначает замещенную или незамещенную аминогруппу;
B1, B2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере пять из B1, B2, , Bn-1 и Bn независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 являются атомами водорода;
L1 обозначает -(СН2)2-O-(СН2)2-группу, -СН2-O-(СН2)2-группу, -СН2-O-(СН2)3-группу, -СН2-O-(СН2)4-группу или -СН2-O-(СН2)5-группу с правым концом, непосредственно связанным с основной аминогруппой; и
L2 и L3 независимо выбраны из -(СН2)2-O-(СН2)2-группы, -(СН2)3-O-(СН2)2-группы, -(СН2)2-O-(СН2)3-группы, -(СН2)2-группы, -(СН2)3-группы, -(СН2)4-группы, -(СН2)5-группы, -(СН2)6-группы, -(СН2)7-группы и -(СН2)8-группы с правым концом, непосредственно связанным с основной аминогруппой.
Представляет интерес производное ПНК формулы I, которое выбрано из группы соединений, представленных ниже, или ее фармацевтически приемлемая соль:
(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-AC(1/2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1/2)C-NH2;
(N→C) Ac-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Benzoyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Piv-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Methyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) n-Propyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fmoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) p-Toluenesulfonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) H-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-Lys-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Lys-NH2;
(N→C) Fethoc-Val-Gly-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Ac-Arg-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Benzyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Phenyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) [N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Benzoyl-Leu-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Piv-Lys-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-Val-NH2;
(N→C) Fethoc -CA(7)G-AC(2O2)A-A(4)TC(1O2)-TG(6)T-A-NH2;
(N→C) Fethoc -CTG(6)-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc -CA(5)G-ATA(5)-ATC(1O2)-TG(5)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc -TA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2;
(N→C) Fethoc -TCA(3)-GAC(1O5)-A(5)AT-C(1O2)TG(5)-TA(5)-NH2;
(N→C) Fethoc -CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)C-NH2;
(N→C) Fethoc -AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(6)TA(5)-C-NH2;
(N→C) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(lO2)T-G(6)TA(5)-CA(2O2)A-NH2;
(N→C) Fethoc -AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
(N→C) Fethoc -AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2;
(N→C) Fethoc-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C(1O2)-AA(6)-NH2;
(N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O2)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-AC(1O2)A-GA(6)C-AA(6)T-CTG(6)-TA(6)C-A(5)AA(2O3)-A-NH2;
(N→C) Fethoc-GC(1O4)T-AC(1O2)A-GA(4)C-AAT-CTG(6)-TA(6)C-NH2;
(N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-AAT-C(1O2)TG-NH2;
(N→C) Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-G(2O2)AC-A(5)AT-C(1O2)TG-NH2; и
(N→C)Fethoc-GC(1O2)T-A(3)CA-GA(4)C-A(2O2)AT-C(1O2)TG-NH2:
где
A, G, T и С представляют собой мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием аденином, гуанином, тимином и цитозином, соответственно;
C(pOq), А(р), A(pOq), G(p) и G(pOq) представляют собой мономеры ПНК с нуклеиновым основанием не природного происхождения, представленным формулой VI, формулой VII, формулой VIII, формулой IX и формулой X, соответственно;
где
р и q - целые числа; и
сокращения N- и С-концевых заместителей конкретно описаны как указано далее: "Fmoc-" представляет собой сокращение для "[(9-фторенил)метилокси]карбонилгруппы"; "Fethoc-" для "[2-(9-фторенил)этил-1-окси]карбонилгруппы"; "Ас-" для "ацетилгруппы"; "Benzoyl-" для "бензолкарбонилгруппы"; "Piv-" для "пивалилгруппы"; "Methyl-" для "метилгруппы"; "n-Propyl-" для "1-(н-пропил)группы"; "Н-" для " атома водорода"; "p-Toluenesulfonyl" для "(4-метилбензол)-1-сульфонилгруппы"; "-Lys-" для аминокислотного остатка "лизин"; "-Val-" для аминокислотного остатка "валин"; "-Leu-" для аминокислотного остатка "лейцин"; "-Arg-" для аминокислотного остатка "аргинин"; "-Gly-" для аминокислотного остатка "глицин"; "[N-(2-Phenylethyl)amino]carbonyl-" для "[N-1-(2-фенилэтил)амино]карбонилгруппы"; "Benzyl-" для "1-(фенил)метилгруппы"; "Phenyl-" для "фенилгруппы"; "Ме-"для "метилгруппы"; и "-NH2" для незамещенной "аминогруппы".
Фиг. 3 в совокупности и недвусмысленно представляет химические структуры для мономеров ПНК, сокращенных как A, G, Т, С, C(pOq), А(р), A(pOq), G(p) и G(pOq). Как обсуждалось в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256], C(pOq) рассматривается как мономер ПНК с "модифицированным цитозином" вследствие его гибридизации в "гуанин". А(р) и A(pOq) принимаются за мономеры ПНК с "модифицированным аденином" при их гибридизации в "тимин". Таким же образом G(p) и G(pOq) рассматриваются как мономеры ПНК с "модифицированным гуанином" при спаривания оснований их с "цитозином".
Фиг. 4 однозначно иллюстрирует химические структуры для различных сокращений для заместителей, используемых для разнообразия N-конца или С-конца производного ПНК формулы I в данном изобретении.
Для того, чтобы проиллюстрировать сокращения, применяемые для таких производных ПНК, химическая структура для 13-мерного производного ПНК, сокращенного как "(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2", приведена на фиг.5 а. В качестве еще одной иллюстрации, химическая структура для 15-мерного производного ПНК, сокращенного как "(N→С)
Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2", приведена на фиг. 5b.
13-мерная последовательность ПНК "(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2", указанная на фиг. 5а, эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') CAG-ACA-ATC-TGT-A" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 13-мерная ПНК имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA1. охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека.
15-мерная последовательность ПНК "(N→С) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2", указанная на фиг. 5b, эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') AGA-CAA-TCT-GTA-CAA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 15-мерная ПНК имеет 15-мерное комплементарное перекрывание с 15-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека.
17-мерная последовательность ПНК "(N→С) Fethoc-AC(1O3)T-GA(6)C-TA(6)T-CTG(6)-TAC(1O5)-A(4)A-NH2" эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') ACT-GAC-TAT-CTG-TAC-AA" для комплементарного связывания с пре-мРНК. 17-мерная ПНК имеет 15-мерное комплементарное перекрывание с 15-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AU"U"GUC"U"GUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. Два ошибочных спаривания отмечены символом, заключенным в кавычки, т.е."".
Одним из аспектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
Одним из аспектов настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для лечения гиперпигментации, включающая производное пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Примеры гиперпигментации, вызванной сверхсинтезом меланина, включают меланодермию, послеугревые рубцы, печеночные пятна, лентиго, возрастные пятна и актиническое повреждение.
Одним из аспектов настоящего изобретения является способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Путь введения может быть, например, местным применением.
Одним из аспектов настоящего изобретения является способ лечения гиперпигментации, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением. Путь введения может быть, например, местным применением.
Одним из аспектов настоящего изобретения является применение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека.
Одним из аспектов настоящего изобретения является применение производного пептидной нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением при получении медикамента для лечения гиперпигментации. Краткая расшифровка фигур
Фиг. 1а-1с. Примеры природных нуклеиновых оснований или нуклеиновых оснований не природного происхождения (модифицированных), выбираемых для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.
Фиг. 2а-2е. Примеры заместителей, выбираемых для производного пептидной нуклеиновой кислоты формулы I.
Фиг. 3. Химические структуры мономеров ПНК с природным или модифицированным нуклеиновым основанием.
Фиг. 4. Химические структуры для сокращений N- или С-концевых заместителей.
Фиг. 5а. Химическая структура 13-мерного производного ПНК "(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2".
Фиг. 5b. Химические структуры 15-мерного производного ПНК "(N→С) Fethoc-AG(6)A-CA(5)A-TC(1O2)T-G(3O2)TA(5)-CA(2O2)A-NH2".
Фиг. 6. Химические структуры мономеров Fmoc-ПНК, применяемых для синтеза производных ПНК данного изобретения.
Фиг. 7а-7b. С18-обращенно-фазовые ВЭЖХ хроматограммы"ASO 1" до и после ВЭЖХ очистки, соответственно.
Фиг. 8. ESI-TOF масс-спектр "ASO 1", очищенного C18-RP препаративной ВЭЖХ.
Фиг. 9а. Электрофоретический анализ продуктов вложенной ПЦР в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных 0 (негативный контроль), 1,10 или 1000 аМ "ASO 1М".
Фиг. 9b. Данные секвенирования по Сенгеру для продукта ПЦР, приписанного пропуску экзонов (2-3).
Фиг. 10а. Изменения в полноразмерном уровне мРНК TYR с помощью кПЦР в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных "ASO 1М" при 0 (негативный контроль), 1, 10, 100 или 1000 аМ (величина ошибки по стандартной погрешности).
Фиг. 10b. Данные вестерн-блота TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных в течение 24 часов "ASO 1М" при 0 zM (негативный контроль), 10 zM, 100 zM, 1 аМ или 10 аМ (т.е. 10000 zM).
Фиг. 11. Изменения содержания меланина в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных или "ASO 1М" при 1, 10, 100 или 1000 аМ, или 10 мкг/мл, или 100 мкг/мл арбутина (величина ошибки по стандартной погрешности).
Фиг. 12. Изменения в полноразмерном уровне мРНК TYR с помощью кПЦР в первичных эпителиальных меланоцитах человека, обработанных "ASO 1" при 0 zM (негативный контроль), 1 zM, 100 zM или 10 аМ. (величина ошибки по стандартной погрешности).
Лучший вариант осуществления изобретения
Общие методики приготовления олигомеров ПНК
Олигомеры ПНК синтезировали с помощью твердофазного пептидного синтеза (solid phase peptide synthesis, SPPS), основанного на Fmoc-химии в соответствии со способом, раскрытым в предшествующем уровне техники [US6,133,444; WO96/40685] с незначительными, но требуемыми изменениями. Твердая подложка, применяемая в данном исследовании, представляла собой амидную смолу H-Rink Amide-ChemMatrix, закупленную в PCAS BioMatrix Inc. (Квебек, Канада). Мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием синтезировали, как описано в предшествующем уровне техники [PCT/KR 2009/001256] или с незначительными изменениями. Для синтеза производных ПНК настоящего изобретения использовались такие мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием и мономеры Fmoc-ПНК с нуклеиновым основанием природного происхождения. Олигомеры ПНК очищали с помощью С^-обращенно-фазовой ВЭЖХ (вода/ацетонитрил или вода/метанол с 0,1% TFA) и характеризовали масс-спектрометрией, включая ESI/TOF/MS.
Схема 2 иллюстрирует типичный цикл удлинения мономеров, принятый в SPPS данного исследования, и синтетические детали (тонкости) приведены ниже. Однако, для специалиста в данной области имеется много незначительных изменений, очевидно, возможных при эффективном проведении таких реакций SPPS на автоматическом пептидном синтезаторе или неавтоматическом пептидном синтезаторе. Каждая стадия реакции в схеме 2 кратко представлена, как изложено ниже.
Схема 2
[Активация смолы H-Rink-ChemMatrix] 0,01 ммоль (примерно 20 мг смолы) смолы ChemMatrix в 1,5 мл 20% пиперидина/DMF встряхивали в «libra» пробирке в течение 20 мин, и DeFmoc раствор отфильтровывали. Смолу промывали в течение 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл хлористого метилена (methylene chloride, МС), 1,5 мл диметилформамида (dimethylformamide, DMF), 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС. Полученные свободные амины на твердой подложке подвергали взаимодействию или с мономером Fmoc-ПНК, или с производным Fmoc-защищенной аминокислоты.
[DeFmoc] Смолу встряхивали в 1,5 мл 20% пиперидина/DMF в течение 7 мин, и DeFmoc раствор отфильтровывали. Смолу промывали в течение 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF, 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС. Полученные свободные амины на твердой подложке тотчас подвергали взаимодействию с мономером Fmoc-ПНК.
[Взаимодействие с мономером Fmoc-ПНК] Свободные амины на твердой подложке взаимодействовали с мономером Fmoc-ПНК следующим образом. 0,04 ммолей мономера ПНК, 0,05 ммолей HBTU и 10 ммолей DIEA инкубировали в течение 2 мин в 1 мл безводного DMF и прибавляли к смоле со свободными аминами. Раствор смолы встряхивали в течение 1 часа и реакционную смесь фильтровали. Затем смолу промывали 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС. Химические структуры мономеров Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием, используемом в данном изобретении, представлены на фиг. 6. Мономеры Fmoc-ПНК с модифицированным нуклеиновым основанием, представленные на фиг. 6, должны быть приняты в качестве примеров и, следовательно, не должны рассматриваться для ограничения объема данного изобретения. Специалист в данной области может легко догадаться о целом ряде изменений в мономерах Fmoc-ПНК для синтеза производного ПНК формулы I.
[Кэпирование] После реакции связывания непрореагированные свободные амины кэпированы при встряхивании в течение 5 минут в 1,5 мл кэпированного раствора (5% уксусный ангидрид и 6% 2,6-лейтидин в DMF). Затем кэпированный раствор отфильтровывали и промывали в течение 30 сек последовательно каждый раз 1,5 мл МС, 1,5 мл DMF и 1,5 мл МС.
[Введение группы "Fethoc-" в N-конец] Группу "Fethoc-" вводили в N-конец при взаимодействии свободного амина на смоле с "Fethoc-OSu" при основных условиях связывания. Химическая структура "Fethoc-OSu" [CAS No. 179337-69-0, C20H17NO5, М.В.351,36] приведена, как указано ниже.
[Отщепление смолы] Олигомеры ПНК, связанные со смолой, отщепляли от смолы встряхиванием в течение 3 часов в 1,5 мл отщепляющего раствора (2,5% три-изопропилсилана и 2,5% воды в трифторуксусной кислоте). Смолу отфильтровывали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток растирали в порошок с помощью диэтилового эфира и полученный осадок собирали с помощью фильтрации для очистки обращенно-фазовой ВЭЖХ.
[Анализ ВЭЖХ и очистка] После отщепления смолы технический продукт производного ПНК очищали с помощью C18-обращенно-фазовой ВЭЖХ, элюируя водой/ацетонитрилом или водой/метанолом (градиентный метод), содержащих 0,1% TFA. Фиг. 7а и 7b представляют типичные хроматограммы ВЭЖХ для "ASO 1" до и после очистки ВЭЖХ, соответственно. Последовательность олигомера "ASO 1" является такой, как представлено в таблице 1.
Синтетические примеры для производного ПНК формулы I
Для того, чтобы комплементарно целенаправленно воздействовать на 3' сайт сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека, производное ПНК данного изобретения получали согласно методам синтеза, приведенным выше, или с незначительными изменениями. Предоставление таких производных ПНК, целенаправленно воздействующих на пре-мРНК TYR человека, является примером производных ПНК формулы I, и не должно быть истолковано для ограничения объема данного изобретения.
Таблица 1 приводит производные ПНК, комплементарно целенаправленно воздействующие на 3' сайт сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека, считанной с гена TYR человека [Стандартная/эталонная последовательность NCBI (Национального центра биотехнологической информации): NG_0008748], а также данные по структурному исследованию с помощью масс-спектрометрии. Предоставление ASOs TYR в таблице 1 является примером производных ПНК формулы I, и не должно быть истолковано для ограничения объема данного изобретения.
"ASO 1" имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGU-CUGUAGCCGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. Таким образом, "ASO 1" имеет 5-мерное перекрывание с "интроном 1" и 8-мерное перекрывание с "экзоном 2" в пределах пре-мРНК TYR человека.
Таблица 2 приводит "ASO 1М", комплементарно целенаправленно воздействующий на 3' сайт сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR мыши, считанной с геномной ДНК мыши [обеспеченный доступ к Стандартной/эталонной последовательности NCBI: NC_000073], а также данные по структурному исследованию с помощью масс-спектрометрии. Предоставление "ASO 1М" состоит в том, чтобы оценить антисмысловую активность в клетках мышиного происхождения.
30-мерную последовательность РНК [(5'→3') aauuguuuuucacag AUCAUUUGUAGCAGA], охватывающую область соединения интрона 1 и экзона 2 в пре-мРНК TYR мыши, считывали с гена TYR мыши. [Номер доступа гена NCBI: NC_000073].
"ASO 1М" эквивалентна последовательности ДНК "(5'→3') CAA-ATG-ATC-TGT-G" для комплементарного связывания с пре-мРНК. "ASO 1М" имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') aauuguuuuucacag AUCAUUUGUAGCAGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR мыши.
Подобно "ASO 1" против пре-мРНК TYR человека, "ASO 1М" обладает 5-мерным перекрыванием с "интроном 1" и 8-мерным перекрыванием с "экзоном 2" в пределах пре-мРНК TYR мыши. "ASO 1М" может служить в качестве хорошего заместительного (имитирующего) соединения для антисмысловой активности "ASO 1" в клетках человеческого происхождения.
Фиг. 7а представляет собой ВЭЖХ хроматограмму, полученную для технического (неочищенного) продукта "ASO 1". Неочищенный продукт очищали C18-RP препаративной ВЭЖХ. Фиг. 7b представляет собой хроматограмму ВЭЖХ для очищенного продукта "ASO 1". Чистота "ASO 1" заметно улучшилась после очистки препаративной ВЭЖХ. Фиг. 8 приводит масс-спектр ESI-TOF, полученный для очищенного продукта "ASO 1". Предоставление аналитических данных для "ASO 1" состоит в том, чтобы проиллюстрировать как производные ПНК формулы I были очищены и идентифицированы в настоящем изобретении, и не должно быть истолковано для ограничения объема данного изобретения.
Связывающая аффинность типичных производных ПНК для комплементарной ДНК
Производные ПНК в таблицах 1 и 2 оценивали по их связывающей аффинности для 10-мерных ДНК(т), комплементарно целенаправленно воздействующих или на N-конец или С-конец. Связывающую аффинность оценивали с помощью величины Tm для дуплекса между ПНК и 10-мерной комплементарной ДНК. Дуплекс между производными ПНК и полностью комплементарными ДНК(тами) показывают величины Tm слишком высокими, чтобы можно было надежно определить в водном буферном растворе, так как буферный раствор склонен кипеть во время измерения Tm.
Величины Tm определяли на спектрометре с УФ и видимой областями спектра следующим образом. Смешанный раствор 4 мкмоль олигомера ПНК и 4 мкмоль комплементарной 10-мерной ДНК в 4 мл водного буфера (рН 7, 16, 10 ммоль фосфата натрия, 100 ммоль NaCl) в 15 мл полипропиленовой пробирке фирмы Falcon инкубировали при 90°С в течение минуты и медленно охлаждали до обычной температуры. Затем раствор переносили в 3 мл кварцевую UV кювету, снабженную герметичной крышкой, и подвергали измерению Tm при 260 нм на спектрофотометре с УФ и видимой областями спектра, как описано в предшествующем уровне техники [PCT/KR2009/001256] или с незначительными изменениями. 10-мерные комплементарные ДНК(ы) для измерения Tm приобретали от Bioneer (www.bioneer.com, Dajeon, Республика Корея) и использовали без дополнительной очистки.
Наблюдаемые величины Tm производных ПНК формулы I очень высоки для комплементарного связывания с 10-мерной ДНК и приведены в таблице 3. Например, "ASO 1" показал значение Tm, равную 78,0°С, для дуплекса с 10-мерной комплементарной ДНК, целенаправленно воздействующей на 10-мерный N-конец в ПНК, обозначенный "жирным шрифтом" и "подчеркнутый" в [(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2]. Одновременно, "ASO 1" показал Tm, равную 73,0°C, для дуплекса с 10-мерной комплементарной ДНК, целенаправленно воздействующей на 10-мерный С-конец в ПНК, обозначенный "жирным шрифтом" и "подчеркнутый" в [(N→С) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2].
Примеры биологических активностей производных ПНК формулы I
Производные ПНК в данном изобретении оценивали in vitro на антисмысловые активности TYR в клетках B16F10 меланомы мыши и меланоцитах человека. Биологические примеры предусмотрены в качестве примеров для иллюстрации биологических профилей производных ПНК формулы I, и поэтому не должны быть истолкованы для ограничения объема нынешнего изобретения.
Пример 1. Пропуск экзона, индуцируемый "ASO 1М".
"ASO 1М", точно определенный в таблице 2, имеет 13-мерное комплементарное перекрывание с 13-мерной последовательностью, обозначенной "жирным шрифтом" и "подчеркнутой" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') aauuguuuuucacag AUCAUUUGUAGCAGA], охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR мыши. Одновременно, "ASO 1М" обладает 9-мерной комплементарностью наряду с 4 ошибочными спариваниями, обозначенными "жирным шрифтом" и "подчеркнутых" в пределах 30-мерной последовательности РНК [(5'→3') ggguguuuug"u"acag AU"UG"U"C"UGUAGCCGA1. охватывающей область соединения "интрона 1" и "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. 4 ошибочные спаривания отмечены кавычками (" ").
"ASO 1М" оценивали на его способность индуцировать пропуск "экзона 2" TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, несмотря на то, что "ASO 1М" обладает 4 ошибочными спариваниями с 3' сайтом сплайсинга "экзона 2" в пре-мРНК TYR человека. "ASO 1М", который полностью комплементарен пре-мРНК TYR мыши, может служить в качестве хорошего заместительного (имитирующего) соединения для "ASO 1", который полностью комплементарен пре-мРНК TYR человека. [Культура клеток и обработка ASO] Клетки B16F10 меланомы мыши (Cat. Number CRL-6475, АТСС) поддерживали в DMEM (модифицированная по способу Дульбекко минимальная эссенциальная среда Игла), подкрепленная 10% FBS, 1% стрептомицина/пенициллина и 0,01 мг/мл бычьего инсулина. Клетки B16F10, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, инкубировали в течение 5 часов с "ASO 1М" при 0 (негативный контроль), 1, 10, 100 или 1000 аМ.
[Экстракция РНК и синтез кДНК с помощью одностадийной ПЦР] После инкубирования в течение 5 часов, суммарную РНК экстрагировали с помощью "Универсального набора для экстракции РНК" (Cat. Number 9767, Takara) согласно инструкциям производителя. 200 нг матричной РНК использовали для 25 мкл реакции обратной транскрипции с помощью Super Script® Набор одностадийной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией с Platinum® ДНК-полимеразы Taq (Cat. No. 10928-042, Invitrogen) против набора экзон-специфичных праймеров [экзон 1_прямой: (5'→3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; и экзон 4_обратный: (5'→3') AGAGC-GGTATGAAAGGAA] согласно следующим условиям цикла: 50°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин с последующими 15 циклами по 30 сек при 94°С, 30 сек при 52°С и 40 сек при 72°С.
[Вложенная ПЦР-амплификация] 1 мкл кДНК дополнительно амплифицировали в 20 мкл вложенной ПЦР (Cat. No. K2612, Bioneer) против набора праймеров [экзон 1n_прямой: (5'→3') GAGAACTAACTGGGGATGA; и экзон 4n_обратный: (5'→3') CGATAGGTGCATTGGCTT] согласно условиям цикла, точно определенного, как указано ниже: 95°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами по 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С и 40 сек при 72°С.
[Идентификация продуктов пропуска экзона] Продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению на 2% агарозном геле. Полосы необходимого размера собирали и анализировали секвенированием по Сенгеру.
Фиг. 9а приводит электрофоретические данные продуктов ПЦР. Клетки без обработки "ASO 1М" давали две интенсивные ПЦР полосы, одна для полноразмерной мРНК TYR и другая для сплайс-варианта мРНК TYR, не содержащей экзоны 2 и 3. Таким образом, полагают, что пропуск экзонов 2-3 происходит спонтанно. Клетки, обработанные "ASO 1М" при 1 до 1000 аМ, однако, давали только вариант сплайсинга мРНК TYR, не содержащей экзоны 2 и 3. Таким образом, "ASO 1М" повышает склонность к пропуску экзонов 2-3 в клетках B16F10 меланомы. Продукт ПЦР пропуска экзонов секвенировали для пропуска экзонов 2-3, как показано на фиг. 9b.
Пример 2. кПЦР для мРНК TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, обработанных "ASO 1М".
"ASO 1М" оценивали с помощью вложенной кПЦР TYR на его способность индуцировать изменения в уровне мРНК TYR мыши в клетках B16F10, как описано ниже.
[Культура клеток и обработка ASO] Клетки B16F10, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, обрабатывали "ASO 1М" при 0 (негативный контроль), 1, 10,100 или 1000 аМ (2 чашки для культивирования на дозу).
[Экстракция РНК и синтез кДНК с помощью одностадийной ПЦР] После инкубирования с "ASO 1М" в течение 5 часов, суммарную РНК экстрагировали из клеток, используя "Универсальный набор для экстракции РНК " (Cat. No. 9767, Takara) согласно инструкциям производителя. 200 нг матричной РНК использовали для 25 мкл реакции обратной транскрипции с помощью Набора одностадийной RT-PCR (Invitrogen, США) против Набора экзон-специфичных праймеров [экзон 1 прямой: (5'→3') GTAAGTTTGGATTTGGGG; и экзон 4_обратный: (5'→3')
AGAGCGGTATGAAAGGAA] согласно следующим условиям цикла: 50°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин с последующими 15 циклами по 30 сек при 94°С, 30 сек при 52°С и 40 сек при 72°С.
[Вложенная кПЦР-амплификация] Растворы кДНК разбавляли в 100 раз и 1 мкл каждого разбавленного продукта ПЦР подвергали реакции 20 мкл ПЦР в режиме реального времени с набором зондов Taqman, охватывающих область соединения экзона 2 и экзона 3 (Cat. No. Mm00495818_m1, Thermo Fisher Scientific) согласно следующим условиям цикла: 95°С в течение 3 мин с последующими 30 циклами по 10 сек при 95°С и 30 сек при 60°С.
[Статистический анализ] Эксперимент вложенной кПЦР независимо повторяли 4 раза и индивидуальные уровни мДНК от каждого эксперимента нормализовали против уровня мДНК без обработки "ASO 1М". Уровни мДНК, полученные из всех 4 отдельных экспериментов объединяли для статистического анализа с помощью параметрического t-критерия Стьюдента. Таким образом, количество образцов РНК составляет 8 для каждой концентрации.
Фиг. 10а приводит объединенные данные кПЦР, в которых уровень полноразмерный мДНК существенно снизился на 40% в клетках, обработанных "ASO 1М" при от 1 до 1000 аМ.
Пример 3. Ингибирование экспрессии белка TYR в клетках B16F10 меланомы с помощью "ASO 1М".
"ASO 1М" оценивали по его способности подавлять экспрессию белка TYR в клетках B16F10 меланомы мыши, как описано ниже.
Клетки B16F10, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, обрабатывали "ASO 1М" при 0 zM (негативный контроль), 10 zM, 100 zM, 1 аМ или 10 аМ. Через 24 часа клетки промывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буферным раствором (phosphate buffered saline, PBS) и затем подвергали лизису с 200 мкл 1X буфера для лизиса клеток (Cat. No. 9803, Cell Signaling Tech), дополненного смесью ингибиторов 1X протеаз (Cat. No. Р8340, Sigma). 200 мкл каждого лизата в 1,5 мл е-трубке смешивали с 100 мкл 5Х буфера для образца и кипятили при 100°С в течение 5 минут. 20 мкл лизата подвергали электрофоретическому разделению на 4-15% градиентном геле TGX (Cat No. 456-1086, Bio-Rad) и белок переносили на 0,45 мкм PVDF мембрану. Мембрану испытывали анти-TYR антителом (Cat. No. 9319, Cell Signaling Tech) и анти-β-актиновым антителом (Cat. No. a3845, Sigma).
Фиг. 10b приводит данные вестерн-блота для экспрессии белка TYR в клетках B16F10. Интенсивность полосы экспрессии TYR была существенно слабее в лизатах с обработкой "ASO 1М", чем в лизатах без обработки "ASO 1М", т.е. негативный контроль. Белок TYR и уровень мРНК уменьшались соизмеримо при обработке ASO. (срав. "Пример 2").
Пример 4. Ингибирование меланогенеза в клетках B16F10 меланомы с помощью "ASO 1М"
"ASO 1М" оценивали на его способность ингибировать меланогенез в клетках B16F10 меланомы мыши, как описано ниже.
Клетки B16F10, субкультивированные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл DMEM, ничем не обработали (негативный контроль), и обработали "ASO 1М" при 1 до 1000 аМ или с 10 или 100 мкг/мл арбутина в качестве положительного контроля (2 чашки для культивирования на дозу). Через 24 часа клетки промывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буферным раствором и подвергали лизису с 200 мкл 1N NaOH. Каждый лизат собирали в 1,5 мл е-трубку и выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Содержание меланина в каждом лизате определяли абсорбцией при 475 нм на ELISA ридере. Такой же эксперимент повторили четыре раза, используя клетки при различном пассировании. Четыре набора данных содержания меланина объединили для статистического анализа с помощью параметрического t-критерия Стьюдента против содержания меланина без обработки (негативный контроль).
Фиг. 11 обобщает изменения содержания меланина в клетках B16F10 после 24 часов инкубирования или с "ASO 1М", или с арбутином. Содержание меланина существенно уменьшилось на около 15% и 25%в клетках, обработанных 10 мкг/мл и 100 мкг/мл арбутина, соответственно. В случае клеток, обработанных "ASO 1М", содержание меланина значительно снизилось на около 15% без заметной зависимости от дозировки. Ингибирующая активность "ASO 1М" была сравнима с таковой для 10 мкг/мл арбутина.
Пример 5. Получение крема для топического применения, содержащего соединение формулы I
Соединение формулы I, например "ASO 2", входил в состав крема для топического применения субъектами. Крем для топического применения получали как описано ниже. Принимая во внимание то, что имеется немереное количество возможных вариантов кремов для топического применения, данный препарат должен быть принят в качестве примера и не должен быть истолкован для ограничения объема нынешнего изобретения.
[Получение раствора А] В химическом стакане смешивали дистиллированную воду (196 г), динатриевую EDTA (0,06 г), глицерин (15 г), дипропиленгликоль (30 г), феноксиэтанол (0,9 г), этилгексилглицерин (0,9 г), сополимер
гидроксиэтилакрилата/акрилоилдиметилтаурата натрия (2,4 г) и 1 нМ водный раствор "ASO 2" (0,3 мл). Смесь подвергают гомогенизации при 70 ~ 75°С, используя смеситель-гомогенизатор.
[Получение раствора В] В другом химическом стакане смешивали при 70 ~ 75°С цетеарил этилгексаноат (12 г), диметикон (6 г), стеариновую кислоту/ гидрогенизированное растительное масло/бегениловый спирт/цетеариловый спирт (15 г), масло каритэ (Shea) (9 г) и полиглицерил-3-метилглюкозы дистеарат/глицерил стеарат SE/сесквистеарат метилглюкозы (6 г).
[Получение крема для топического применения] "Раствор А" и "Раствор В" смешивали, подвергая гомогенизации при 7200 об/мин и 70 ~ 75°С в течение 3 мин с помощью смесителя-гомогенизатора. Смесь медленно охлаждали до комнатной температуры с получением крема для топического применения, содержащего 1 пМ "ASO 2".
Пример 6. кПЦР для мРНК TYR в меланоцитах человека, обработанных "ASO 1".
"ASO 1", указанный в таблице 1, представляет 13-мерный ASO TYR полностью комплементарный 3' сайту сплайсинга, охватывающего область соединения интрона 1 и экзона 2 в TYR человека, обозначенный "жирным шрифтом" и "подчеркнутый" в 30-мерной последовательности пре-мРНК TYR человека [(5'→3') ggguguuuuguacag AUUGUCUGUAGCCGA].
"ASO 1" оценивали с помощью вложенной кПЦР TYR на его способность индуцировать изменения в уровне мРНК TYR в первичных эпидермальных меланоцитах человека, как указано далее.
[Культура клеток и обработка ASO] Первичные клетки эпидермальных меланоцитов (Cat. Number PCS-200-013, АТСС) выдерживали в базальной среде для дермальных клеток (Cat Number PCS-200-030, АТСС), дополненной частью комплекта для роста зрелых меланоцитов (Cat. Number PCS-200-042, АТСС). Меланоциты, выращенные в 60 мм чашке для культивирования, содержащей 5 мл среды для культивирования, обрабатывали "ASO 1" при 0 zM (негативный контроль), 1 zM, 100 zM или 10 аМ. (3 чашки для культивирования для каждой концентрации).
[Экстракция РНК и синтез кДНК с помощью одностадийной ПЦР] После инкубирования с "ASO 1М" в течение 5 часов, суммарную РНК экстрагировали, используя "Мини-набор RNeasy " (Cat. Number 74106, Qiagen) согласно инструкциям производителя. 200 нг матричной РНК подвергали 25 мкл реакции обратной транскрипции с помощью Super Script® Набора одностадийной RT-PCR с Platinum® ДНК-полимеразы Taq (Cat. No. 10928-042, Invitrogen) против набора экзон-специфичных праймеров [экзон 1_прямой(2): (5'→3') CTCTTTGTCTGGATGCATT; и экзон 5_обратный: (5'→3') CTGTGGTAATCCTCTTTCT] согласно следующим указанным условиям цикла: 50°С в течение 30 мин и 94°С в течение 2 мин с последующими 15 циклами по 30 сек при 94°С, 30 сек при 50°С и 1 мин при 72°С.
[Вложенная ПЦР-амплификация] 1 мкл кДНК дополнительно амплифицировали в 20 мкл вложенной ПЦР-реакции (Cat. No. K2612, Bioneer) против набора экзон-специфичных праймеров [экзон 2n_прямой(2): (5'→3') GATAAAGCTGCCAATTTC; и экзон 3n_обратный: (5'→3') TTGTGCATGCTGCTTTGA] против зонда Taqman [(5'→3') 5,6-FAM-CACTGG-ZEN-AAGGATTTGCTAGTCCAC-3IABkFQ]. Условия цикла: 95°С в течение 3 мин с последующими 40 циклами по 10 сек при 95°С и 30 сек при 60°С.
Фиг. 12 приводит данные кПЦР, в которых уровень полноразмерной мДНК TYR снизился на около 30% в меланоцитах человека, обработанных "ASO 1" от 1 zM до 10 аМ. Наблюдаемые снижения были значительными (параметрический t-критерий Стьюдента) в клетках, обработанных "ASO 1" при 1 zM и 10 аМ.
Claims (52)
1. Производное пептидной нуклеиновой кислоты, представленное формулой I:
где
n - целое число от 13 до 17;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК тирозиназы человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК тирозиназы человека или частично комплементарно пре-мРНК тирозиназы человека с одним или двумя ошибочными спариваниями от всего соединения формулы I;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1 и Tn обозначают атом водорода;
X обозначает атом водорода [Н];
Y обозначает замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, в которой замещенная или незамещенная алкилоксикарбонилгруппа выбрана из:
Z обозначает аминогруппу;
B1, В2, …, Bn-1 и Вт независимо выбраны из природных нуклеиновых оснований, включая аденин, тимин, гуанин, цитозин и урацил, и нуклеиновых оснований не природного происхождения; и
по меньшей мере четыре из B1, В2, …, Bn-1 и Вт независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV:
где
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 являются атомами водорода;
L1, L2 и L3 являются ковалентным линкером, представленным формулой V, ковалентно соединяющим основную аминогруппу с остатком нуклеинового основания:
где
Q1 и Qm представляют собой метиленгруппу (-СН2-) и Qm непосредственно связывает основную аминогруппу;
Q2, Q3, …, и Qm-1 представляют собой метиленгруппу, в которой одна из Q2, Q3, … и Qm-1 независимо выбрана из метиленгруппы и атома кислорода (-O-); и
m - целое число от 4 до 6.
2. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1, где
n - целое число от 13 до 15;
соединение формулы I обладает по меньшей мере 10-мерным комплементарным перекрыванием с 14-мерной последовательностью пре-мРНК [(5'→3') UGUACAGAUUGUCU] в пре-мРНК тирозиназы человека;
соединение формулы I полностью комплементарно пре-мРНК тирозиназы человека;
S1, S2, …, Sn-1, Sn, T1, T2, …, Tn-1 и Tn представляют собой атом водорода;
X является атомом водорода;
Y обозначает замещенную или незамещенную алкилоксикарбонилгруппу, в которой замещенная или незамещенная алкилоксикарбонилгруппа выбрана из:
Z обозначает аминогруппу;
B1, В2, …, Bn-1 и Bn независимо выбраны из аденина, тимина, гуанина, цитозина и нуклеиновых оснований не природного происхождения;
по меньшей мере пять из B1, В2, …, Bn-1 и Bn независимо выбраны из нуклеиновых оснований не природного происхождения, представленных формулой II, формулой III или формулой IV;
R1, R2, R3, R4, R5 и R6 являются атомами водорода;
L1 обозначает -(СН2)2-O-(СН2)2-, -СН2-O-(СН2)2-, -СН2-O-(СН2)3-, -СН2-O-(СН2)4- или -СН2-O-(СН2)5- с правым концом непосредственно связывается с основной аминогруппой; и
L2 и L3 независимо выбраны из -(СН2)2-O-(СН2)2-, -(СН2)3-O-(СН2)2-, -(СН2)2-O-(СН2)3-, -(СН2)2-, -(СН2)3-, -(СН2)4-, -(СН2)5-, -(СН2)6-, -(СН2)7- и -(СН2)8- с правым концом непосредственно связывается с основной аминогруппой.
3. Производное пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1, которое выбрано из группы производных пептидной нуклеиновой кислоты, приведенных ниже:
(N→C) Fethoc-CA(5)G-ACA(5)-ATC(1O2)-TG(6)T-A(5)-NH2; и
(N→С) Fethoc-AC(1O2)A(5)-GA(5)C-AA(5)T-CTG(6)-C(1O2)C-NH2;
где
A, G, T и С представляют собой мономеры ПНК с природным нуклеиновым основанием аденином, гуанином, тимином и цитозином, соответственно;
C(pOq), А(р), A(pOq), G(p) и G(pOq) представляют собой мономеры ПНК с нуклеиновым основанием не природного происхождения, представленного формулой VI, формулой VII, формулой VIII, формулой IX и формулой X, соответственно:
где
р и q - целые числа от 1 до 8; и
сокращения N- и С-концевых заместителей конкретно описаны, как указано далее: "Fethoc-" для "[2-(9-фторенил)этил-1-окси]карбонилгруппы"; и "-NH2" для незамещенной "аминогруппы".
4. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающая эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.
5. Фармацевтическая композиция для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающая эффективное количество производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.
6. Способ лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.
7. Способ лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека, включающий введение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1.
8. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 при получении медикамента для лечения заболеваний или состояний, связанных с экспрессией гена тирозиназы человека.
9. Применение производного пептидной нуклеиновой кислоты по п. 1 при получении медикамента для лечения гиперпигментации, связанной с экспрессией гена тирозиназы человека.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20170093605 | 2017-07-24 | ||
KR10-2017-0093605 | 2017-07-24 | ||
KR10-2017-0167558 | 2017-12-07 | ||
KR1020170167558A KR20190011181A (ko) | 2017-07-24 | 2017-12-07 | 티로시나아제 안티센스 올리고뉴클레오티드 |
PCT/KR2018/008143 WO2019022434A1 (en) | 2017-07-24 | 2018-07-19 | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES OF TYROSINASE |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2019142512A RU2019142512A (ru) | 2021-08-24 |
RU2019142512A3 RU2019142512A3 (ru) | 2021-11-08 |
RU2778786C2 RU2778786C2 (ru) | 2022-08-24 |
RU2778786C9 true RU2778786C9 (ru) | 2022-10-14 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040215006A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-10-28 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of tyrosinase expression |
WO2009113828A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Cti Bio | Peptide nucleic acid derivatives with good cell penetration and strong affinity for nucleic acid |
RU2011125776A (ru) * | 2008-12-31 | 2013-02-10 | Реванс Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы лечения гиперпигментации |
WO2013112548A1 (en) * | 2012-01-23 | 2013-08-01 | University Of South Florida | Gamma-aapeptides with potent and broad-spectrum antimicrobial activity |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040215006A1 (en) * | 2003-04-25 | 2004-10-28 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Modulation of tyrosinase expression |
WO2009113828A2 (en) * | 2008-03-14 | 2009-09-17 | Cti Bio | Peptide nucleic acid derivatives with good cell penetration and strong affinity for nucleic acid |
RU2011125776A (ru) * | 2008-12-31 | 2013-02-10 | Реванс Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы лечения гиперпигментации |
WO2013112548A1 (en) * | 2012-01-23 | 2013-08-01 | University Of South Florida | Gamma-aapeptides with potent and broad-spectrum antimicrobial activity |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Seemal R. Desai. Hyperpigmentation Therapy: A Review. J Clin Aesthet Dermatol., 2014, 7(8), p. 13-17. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102236495B1 (ko) | 티로시나아제 안티센스 올리고뉴클레오티드 | |
US20220363720A1 (en) | Melanophilin antisense oligonucleotides | |
RU2753517C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды к hif-1-альфа | |
JP2024038106A (ja) | アセチル-coaカルボキシラーゼ2アンチセンスオリゴヌクレオチド | |
RU2778786C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы | |
RU2778786C9 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды тирозиназы | |
AU2018308224B9 (en) | Tyrosinase antisense oligonucleotides | |
JP7422406B2 (ja) | マトリックスメタロプロテアーゼ-1アンチセンスオリゴヌクレオチド | |
RU2766701C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды для snap25 | |
RU2802418C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды матриксной металлопротеиназы-1 | |
RU2807629C9 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды ацетил-соа-карбоксилазы-2 | |
RU2807629C2 (ru) | Антисмысловые олигонуклеотиды ацетил-соа-карбоксилазы-2 | |
RU2786637C2 (ru) | Пропуск экзонов с помощью производных пептидо-нуклеиновых кислот |