RU2737727C2 - Versions of pertuzumab and their analytical characteristics - Google Patents

Versions of pertuzumab and their analytical characteristics Download PDF

Info

Publication number
RU2737727C2
RU2737727C2 RU2015141520A RU2015141520A RU2737727C2 RU 2737727 C2 RU2737727 C2 RU 2737727C2 RU 2015141520 A RU2015141520 A RU 2015141520A RU 2015141520 A RU2015141520 A RU 2015141520A RU 2737727 C2 RU2737727 C2 RU 2737727C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
variant
pertuzumab
ser
composition
val
Prior art date
Application number
RU2015141520A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2015141520A (en
Inventor
Линн А. Геннаро
Юн-Сян Као
Юнхуа Чзан
Original Assignee
Дженентек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50694078&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2737727(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Дженентек, Инк. filed Critical Дженентек, Инк.
Publication of RU2015141520A publication Critical patent/RU2015141520A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2737727C2 publication Critical patent/RU2737727C2/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44747—Composition of gel or of carrier mixture
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: group of inventions refers to treatment of malignant disease. Composition for treating a malignant disease comprises an effective amount of pertuzumab and a variant thereof with unpaired cysteines, wherein said version with unpaired cysteines contains Cys23 and Cys88 in both variable domains of light chain of pertuzumab and Cys23/Cys88 unpaired cysteines in one or both variable domains of its light chain. Also disclosed are a pharmaceutical composition for treating a malignant disease, an article for treating a malignant disease, an isolated version of pertuzumab for treating a malignant disease and another version of the composition for treating a malignant disease.
EFFECT: group of inventions widens range of means for certain purposes.
15 cl, 45 dwg, 19 tbl, 6 ex

Description

По данной заявке, поданной в соответствии с 37 CFR §1.53(b), испрашивается приоритет в соответствии с 35 USC §119(e) предварительной заявки США с серийным номером 61/812603, поданной 16 апреля 2013 года, которая включена посредством ссылки в полном объеме.This application, filed under 37 CFR §1.53 (b), claims priority under 35 USC §119 (e) U.S. Provisional Application Serial No. 61/812603, filed April 16, 2013, which is incorporated by reference in its entirety. volume.

Перечень последовательностейSequence listing

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, представленный через EFS-Web, и, таким образом, включенный посредством ссылки в полном объеме. Указанная ASCII копия, созданная 8 апреля 2014, названа P5584Rl-WO_SeqList.txt, и размер которой составляет 31363 байт.The present application contains a sequence listing provided via the EFS-Web and is hereby incorporated by reference in its entirety. The specified ASCII copy created on April 8, 2014 is named P5584Rl-WO_SeqList.txt and is 31363 bytes in size.

Область техникиTechnology area

Настоящее изобретение относится к вариантам пертузумаба. В частности, настоящее изобретение относится к вариантам с неспаренными цистеинами, содержащим Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба, к лишенному фукозы варианту пертузумаба, разновидностям пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и разновидностям пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS). Настоящее изобретение дополнительно относится к выделенным вариантам, композициям, фармацевтическим композициям и изделиям, содержащим указанные варианты, а также к способам получения и характеристики таких вариантов и их композиций.The present invention relates to variants of pertuzumab. In particular, the present invention relates to unpaired cysteine variants containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both of the variable domains of the light chain of pertuzumab, a fucose-free variant of pertuzumab, low molecular weight (LMWS) species of pertuzumab, and pertuzumab high molecular weight (HMWS). The present invention further relates to isolated variants, compositions, pharmaceutical compositions, and articles of manufacture containing said variants, as well as to methods for preparing and characterizing such variants and their compositions.

Уровень техникиState of the art

Пертузумаб (PERJETA®) (также называемый rhuMAb 2С4) представляет собой моноклональное антитело (MAb), которое является первым в своем классе в линии средств, называемых «ингибиторами димеризации HER». Связываясь с HER2, пертузумаб ингибирует димеризацию HER2 с другими рецепторами HER и, таким образом, ингибирует опухолевый рост. Пертузумаб получил разрешение Управления по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств США (US FDA) на использование для лечения HER2-позитивного метастатического рака молочной железы 8 июня 2012 года.Pertuzumab (PERJETA®) (also called rhuMAb 2C4) is a monoclonal antibody (MAb) that is the first of its class in a line of agents called "HER dimerization inhibitors". By binding to HER2, pertuzumab inhibits the dimerization of HER2 with other HER receptors and thus inhibits tumor growth. Pertuzumab was approved by the US Food and Drug Administration (US FDA) for the treatment of HER2-positive metastatic breast cancer on June 8, 2012.

В патенте США 7862817 (Adams et al.) описывается гуманизированный вариант антитела 2С4, названный гуманизированной 2С4 версией 574 или рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом 2С4 (rhuMAb 2С4). Это антитело связывало субдомен II во внеклеточном домене (ECD) рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2). Антитело rhuMAb 2С4 было получено в лабораторном масштабе и было показано, что оно связывается с HER2 и ингибирует рост клеток MDA-175 (которые экспрессируют HER2 на уровне 1+) и ксенотрансплантатов MCF7, имплантированных мышам. Смотри, также, Adams et al. Cancer Immunol. Immunother. 55(6):717-727 (2006).US Pat. No. 7,862,817 (Adams et al.) Describes a humanized version of the 2C4 antibody called humanized 2C4 version 574 or recombinant humanized monoclonal antibody 2C4 (rhuMAb 2C4). This antibody bound subdomain II in the extracellular domain (ECD) of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). The rhuMAb 2C4 antibody was obtained on a laboratory scale and was shown to bind to HER2 and inhibit the growth of MDA-175 cells (which express HER2 at a 1+ level) and MCF7 xenografts implanted in mice. See also Adams et al. Cancer Immunol. Immunother. 55 (6): 717-727 (2006).

В патенте США 6339142 (Blank and Basey) описывается композиция антитела к HER2, содержащая смесь анти-HER2 антитела и один или более его кислых вариантов, где количество кислого варианта (вариантов) составляет примерно менее 25%. Гуманизированное моноклональное антитело 4D5 вариант 8 (humMAb4D5-8 или трастузумаб) является примером антитела к HER2.US Pat. No. 6,339,142 (Blank and Basey) describes an anti-HER2 antibody composition comprising a mixture of an anti-HER2 antibody and one or more acidic variants thereof, wherein the amount of acidic variant (s) is less than about 25%. Humanized monoclonal antibody 4D5 variant 8 (humMAb4D5-8 or trastuzumab) is an example of an anti-HER2 antibody.

В патенте США 7560111, в патенте США 7879325 и в патенте США 8241630 (Као et al.) описывается вариант пертузумаба (rhuMAb 2С4), содержащий аминоконцевое лидерное удлинение (VHS-) на одной или обеих легких цепях антитела, так называемый «VHS-вариант». В тех случаях, когда эталонное вещество (Фаза I), Lot S9802A (Фаза II) и вещество технологической разработки в масштабе 400 л тестировали на свободные тиолы, используя анализ Эллмана в нативных условиях, уровень свободных тиолов был ниже предела обнаружения во всех тестируемых веществах. От 1-2% пертузумаба в тестируемых композициях были лишены фукозы (G0-F) по данным капиллярного электрофореза (СЕ) Смотри таблицу 5 патента США 7560111 (Као et al.).US Pat. No. 7,560,111, US Pat. No. 7,879,325 and US Pat. No. 8,241,630 (Kao et al.) Describe a variant of pertuzumab (rhuMAb 2C4) containing an amino-terminal leader extension (VHS-) on one or both light chains of an antibody, the so-called "VHS variant ". When the reference substance (Phase I), Lot S9802A (Phase II), and the development substance at 400 L scale were tested for free thiols using Ellman's native assay, the free thiol level was below the detection limit in all substances tested. Between 1-2% of pertuzumab in the tested compositions were devoid of fucose (G0-F) by capillary electrophoresis (CE). See Table 5 of US Pat. No. 7,560,111 (Kao et al.).

В WO 2009/099829 (Harris et al.) описываются варианты пертузумаба, включающие дезамидированный вариант, гликозилированный вариант, вариант с восстановленными дисульфидами, невосстанавливаемый вариант и сиалилированный вариант. Эти варианты были охарактеризованы, как описано следующим образом:WO 2009/099829 (Harris et al.) Describes pertuzumab variants including a deamidated variant, a glycosylated variant, a reduced disulfide variant, a non-reducible variant and a sialylated variant. These options have been characterized as described as follows:

Figure 00000001
Figure 00000001

Экспериментальный способ, используемый для характеристики варианта с восстановленным дисульфидом в WO 2009/099829 (Harris et al.), невосстановленного CE-SDS интактного антитела, определял восстановленные межцепочечные дисульфидные связи, а не внутрицепочечные дисульфидные связи.The experimental method used to characterize the reduced disulfide variant in WO 2009/099829 (Harris et al.), An unreduced CE-SDS intact antibody, identified reduced interchain disulfide bonds rather than intrachain disulfide bonds.

Zhang et al. Anal. Chem. 84(16):7112-7123 (2012) описывают рекомбинантное антитело (mAb А), имеющее неспаренные цистеины (Cys22 и Cys96) в его вариабельном домене тяжелой цепи (VH домене). Было обнаружено, что неспаренные цистеины не оказывают существенного воздействия на связывание антитела с CD20, a mAb А с неспаренными цистеинами было полностью активным в анализе специфической активности (комплемент-зависимая цитотоксичность, CDC, анализ).Zhang et al. Anal. Chem. 84 (16): 7112-7123 (2012) describe a recombinant antibody (mAb A) having unpaired cysteines (Cys22 and Cys96) in its heavy chain variable domain (VH domain). Unpaired cysteines were found to have no significant effect on antibody binding to CD20, and mAb A with unpaired cysteines was fully active in the specific activity assay (complement dependent cytotoxicity, CDC, assay).

WO 2009/009523 (Као et al.) раскрывает предотвращение восстановления межцепочечных дисульфидных связей во время рекомбинантной продукции окрелизумаба (rhuMAb 2Н7), антитела, которое связывается с CD20.WO 2009/009523 (Kao et al.) Discloses the prevention of interchain disulfide bond repair during recombinant production of ocrelizumab (rhuMAb 2H7), an antibody that binds to CD20.

Harris, R. Dev. Biol. (Basel, Switzerland) 122: 117-127 (2005) описали неспаренные цистеины (Cys22 и Cys96) в вариабельном домене тяжелой цепи (VH) омализумаба, гуманизированного антитела к IgE. Формы с неспаренными цистеинами имели значительно меньшую специфическую активность.Harris, R. Dev. Biol. (Basel, Switzerland) 122: 117-127 (2005) describe unpaired cysteines (Cys22 and Cys96) in the heavy chain variable domain (VH) of omalizumab, a humanized anti-IgE antibody. The forms with unpaired cysteines had a significantly lower specific activity.

Сущность изобретенияThe essence of the invention

Экспериментальные данные в настоящем описании относятся к формам вариантов пертузумаба, включающих вариант с неспаренными цистеинами, вариант, лишенный фукозы, разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS) и разновидности с высокой молекулярной массой (HMWS). Средства для идентификации, характеристики и количественной оценки этих вариантов являются чрезвычайно полезными при производстве и в способах контроля качества для лекарственной композиции пертузумаба.Experimental data herein refer to forms of pertuzumab variants, including unpaired cysteine variant, fucose-free variant, low molecular weight species (LMWS), and high molecular weight species (HMWS). Means for identifying, characterizing and quantifying these variants are extremely useful in the manufacture and quality control methods for a pertuzumab drug composition.

Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и его вариант с неспаренными цистеинами, где вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба. Вариант с неспаренными цистеинами включает гетеродимерный вариант (содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба) и/или гомодимерный вариант (содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба).Thus, in a first aspect, the present invention relates to a composition comprising pertuzumab and an unpaired cysteine variant thereof, wherein the unpaired cysteine variant contains Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both of the variable domains of the pertuzumab light chain. The unpaired cysteine variant includes a heterodimeric variant (containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in only one variable domain of the light chain of pertuzumab) and / or a homodimeric variant (containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in both variable domains of the light chain of pertuzumab).

Композиция необязательно дополнительно содержит один или более дополнительных вариантов пертузумаба, например, вариант, лишенный фукозы, вариант разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS), вариант разновидности с высокой молекулярной массой (HMWS), гликозилированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, невосстанавливаемый вариант, дезамидированный вариант, сиалилированный вариант, VHS-вариант, вариант с С-концевым лизином, вариант с окисленным метионином, вариант гликозилирования G1, вариант гликозилирования G2 и вариант с негликозилированной тяжелой цепью.The composition optionally further comprises one or more additional pertuzumab variants, e.g., a fucose-free variant, a low molecular weight variant (LMWS), a high molecular weight variant (HMWS), a glycosylated variant, a reduced disulfide variant, a non-reducible variant, deamidated variant, sialylated variant, VHS variant, C-terminal lysine variant, oxidized methionine variant, G1 glycosylation variant, G2 glycosylation variant and non-glycosylated heavy chain variant.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы составляет от 0,9 до 4,1% композиции. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, составляет более 2% композиции. В соответствии с этим вариантом осуществления количество варианта, лишенного фукозы, превышает количество, описанное в патенте США 7560111, в патенте США 7879325 и в патенте США 8241630 (Као et al.).The present invention also relates to a composition comprising pertuzumab and a fucose-free variant of pertuzumab, wherein the amount of the fucose-free variant is from 0.9 to 4.1% of the composition. In one embodiment, the present invention relates to a composition comprising pertuzumab and a fucose-free variant of pertuzumab, wherein the amount of the fucose-free variant is greater than 2% of the composition. According to this embodiment, the amount of the variant lacking fucose exceeds the amount described in US Pat. No. 7,560,111, US Pat. No. 7,879,325, and US Pat. No. 8,241,630 (Kao et al.).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей смесь пертузумаба, разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и пертузумаба разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS), где количество LMWS составляет ≤1,6%, а количество HMWS составляет ≤1,7%.In a further aspect, the present invention relates to a composition comprising a mixture of pertuzumab, low molecular weight varieties of pertuzumab (LMWS), and pertuzumab varieties of high molecular weight (HMWS), wherein the amount of LMWS is ≤1.6% and the amount of HMWS is ≤1 , 7%.

Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей смесь пертузумаба, Пик 1 и Пик 2, где количество Пика 1 составляет ≤0,5%, а количество Пика 2 составляет ≤1,0% по данным анализа капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в редуцирующих условиях (R-CE-SDS).The present invention also relates to a composition comprising a mixture of pertuzumab, Peak 1 and Peak 2, wherein the amount of Peak 1 is ≤0.5% and the amount of Peak 2 is ≤1.0% as determined by capillary electrophoresis analysis in the presence of sodium dodecyl sulfate under reducing conditions. (R-CE-SDS).

Дополнительные аспекты настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям, изделиям и способам лечения пациента, страдающего злокачественным заболеванием, использующих или содержащих композиции по настоящему изобретению.Additional aspects of the present invention relate to pharmaceutical compositions, articles of manufacture and methods for treating a patient suffering from malignant disease using or containing compositions of the present invention.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки композиции пертузумаба, включающему: (1) количественное определение содержания варианта с неспаренными цистеинами в композиции, где вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах тяжелой цепи пертузумаба; и/или (2) количественное определение содержания лишенного фукозы пертузумаба в композиции; и/или (3) количественное определение содержания разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS) или разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS) в композиции.In a further aspect, the present invention provides a method for evaluating a pertuzumab composition, comprising: (1) quantifying the unpaired cysteine variant in the composition, wherein the unpaired cysteine variant comprises Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both of the variable domains of the pertuzumab heavy chain; and / or (2) quantifying the content of fucose-free pertuzumab in the composition; and / or (3) quantifying the content of low molecular weight species of pertuzumab (LMWS) or high molecular weight species (HMWS) in the composition.

Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки биологической активности композиции пертузумаба, включающему определение количества варианта пертузумаба, лишенного фукозы, в композиции для определения активности антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) композиции, и подтверждение того, что количество пертузумаба, лишенного фукозы, находится в диапазоне примерно от 0,9 примерно до 4,1%.In yet another additional aspect, the present invention relates to a method for assessing the biological activity of a pertuzumab composition, comprising determining the amount of a fucose-free pertuzumab variant in the composition to determine the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity of the composition, and confirming that the amount of fucose-free pertuzumab is present. in the range from about 0.9 to about 4.1%.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, включающему: (1) получение композиции, содержащей пертузумаб и один или более его вариантов, и (2) и проведение аналитического исследования полученной таким образом композиции для оценки в ней количества вариантов, где варинат(ы) включают: (i) вариант с неспаренными цистеинами, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба; и/или (ii) вариант пертузумаба, лишенный фукозы; и/или (iii) разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS); и/или (iv) разновидности пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и/или (v) Пик 1 фрагмент(ы) пертузумаба, и/или (vi) Пик 2 фрагмент(ы) пертузумаба.In another aspect, the present invention relates to a method for preparing a composition, comprising: (1) preparing a composition containing pertuzumab and one or more variants thereof, and (2) and conducting an analytical study of the composition thus obtained to evaluate the number of variants therein, where varinate ( s) include: (i) a variant with unpaired cysteines, containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both variable domains of the light chain of pertuzumab; and / or (ii) a fucose-free variant of pertuzumab; and / or (iii) high molecular weight species of pertuzumab (HMWS); and / or (iv) a low molecular weight (LMWS) species of pertuzumab, and / or (v) Peak 1 pertuzumab fragment (s), and / or (vi) Peak 2 pertuzumab fragment (s).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному варианту пертузумаба, где выделенный вариант содержит: (а) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гетеродимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба; и/или (b) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гомодимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба; и/или (с) вариант пертузумаба, лишенный фукозы; и/или (d) разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS); и/или (е) разновидности пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS); и/или (f) Пик 1 фрагмент(ы) пертузумаба, и/или (g) Пик 2 фрагмент(ы) пертузумаба.In another aspect, the present invention relates to an isolated variant of pertuzumab, where the isolated variant comprises: (a) a variant of pertuzumab with unpaired cysteines, where the variant is a heterodimeric variant containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in only one variable domain of the light chain of pertuzumab; and / or (b) a variant of pertuzumab with unpaired cysteines, where the variant is a homodimeric variant containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in both variable domains of the light chain of pertuzumab; and / or (c) a fucose-free variant of pertuzumab; and / or (d) high molecular weight species of pertuzumab (HMWS); and / or (e) a low molecular weight species of pertuzumab (LMWS); and / or (f) Peak 1 pertuzumab fragment (s), and / or (g) Peak 2 pertuzumab fragment (s).

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки, фрагментации композиции пертузумаба, включающему определение количества Пика 1 и Пика 2 в композиции с помощью капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в редуцирующих условиях (R-CE-SDS) и подтверждение того, что количество Пика 1 составляет ≤5%, а количество Пика 2 составляет ≤1,0%.In an additional aspect, the present invention relates to a method for evaluating fragmentation of a pertuzumab composition, comprising determining the amount of Peak 1 and Peak 2 in the composition by capillary electrophoresis with sodium dodecyl sulfate under reducing conditions (R-CE-SDS) and confirming that the amount of Peak 1 is ≤5%, and the amount of Peak 2 is ≤1.0%.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

На фиг. 1 представлена схематичная структура белка HER2 и аминокислотные последовательности для субдоменов I-IV (SEQ ID Nos. 1-4, соответственно) его внеклеточного домена.FIG. 1 shows a schematic structure of the HER2 protein and amino acid sequences for subdomains I-IV (SEQ ID Nos. 1-4, respectively) of its extracellular domain.

На фиг. 2А и 2В представлены выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных доменов легкой цепи (VL) (Фиг. 2А) и вариабельных доменов тяжелой цепи (VH) (Фиг. 2В) мышиного моноклонального антитела 2С4 (SEQ ID Nos. 5 и 6, соответственно); Домены VL и VH варианта 574/пертузумаб (SEQ ID Nos. 7 и 8, соответственно), и консенсусные каркасные области VL и VH (hum κ1, легкая каппа цепь подгруппа I; humIII, тяжелая подгруппа III) (SEQ ID Nos. 9 и 10, соответственно). Звездочки показывают различия между вариабельными доменами пертузумаба и мышиного моноклонального антитела 2С4 или между вариабельными доменами пертузумаба и каркасной областью антитела человека. Области, определяющие комплементарность (CDR), показаны в скобках.FIG. 2A and 2B show amino acid sequence alignments of the light chain variable domains (VL) (FIG. 2A) and heavy chain variable domains (VH) (FIG. 2B) of the mouse monoclonal antibody 2C4 (SEQ ID Nos. 5 and 6, respectively); VL and VH domains of variant 574 / pertuzumab (SEQ ID Nos. 7 and 8, respectively), and consensus framework regions VL and VH (hum κ1, kappa light chain subgroup I; humIII, heavy subgroup III) (SEQ ID Nos. 9 and 10, respectively). The asterisks indicate differences between the variable domains of pertuzumab and the murine monoclonal antibody 2C4, or between the variable domains of pertuzumab and the human antibody framework. Complementarity determining regions (CDRs) are shown in parentheses.

На фиг. 3А и 3В показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (Фиг. 3А; SEQ ID NO. 11) и тяжелой цепи (Фиг. 3В; SEQ ID No. 12) пертузумаба. CDR показаны жирным шрифтом. Вычисленная молекулярная масса легкой цепи и тяжелой цепи составляет 23526,22 Да и 49216,56 Да (цистеины в восстановленной форме). Углеводная часть молекулы присоединена к Asn 299 тяжелой цепи.FIG. 3A and 3B show the amino acid sequences of the light chain (FIG. 3A; SEQ ID NO. 11) and heavy chain (FIG. 3B; SEQ ID No. 12) of pertuzumab. CDRs are shown in bold. The calculated molecular weights of the light chain and heavy chain are 23526.22 Da and 49216.56 Da (cysteines in reduced form). The carbohydrate moiety is attached to the Asn 299 heavy chain.

На фиг. 4А и 4В показаны аминокислотные последовательности легкой цепи (Фиг. 4А; SEQ ID NO. 13) и тяжелой цепи (Фиг. 4В; SEQ ID NO. 14) трастузумаба, соответственно. Границы вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи показаны стрелками.FIG. 4A and 4B show the amino acid sequences of the light chain (FIG. 4A; SEQ ID NO. 13) and heavy chain (FIG. 4B; SEQ ID NO. 14) of trastuzumab, respectively. The boundaries of the variable domains of the light and heavy chains are indicated by arrows.

На фиг. 5А и 5В показана последовательность легкой цепи варианта пертузумаба (Фиг. 5А; SEQ ID NO. 15) и последовательность тяжелой цепи варианта пертузумаба (Фиг. 5В; SEQ ID NO. 16), соответственно.FIG. 5A and 5B show the light chain sequence of the pertuzumab variant (FIG. 5A; SEQ ID NO. 15) and the heavy chain sequence of the pertuzumab variant (FIG. 5B; SEQ ID NO. 16), respectively.

На фиг. 6 изображена структура (основных видов) пертузумаба, включающая его 4 межцепочечные и 12 внутрицепочечные дисульфидные связи, в том числе, Cys23/Cys88 внутрицепочечные дисульфидные связи в каждом из вариабельных доменов легкой цепи (VL). Изображенные домены представляют собой: VL = вариабельный домен легкой цепи; VH = вариабельный домен тяжелой цепи; CL = константный домен легкой цепи; СН1 = константный домен 1 тяжелой цепи 1; СН2 = константный домен 2 тяжелой цепи; СН3 = константный домен 3 тяжелой цепи.FIG. 6 depicts the structure (main species) of pertuzumab, including its 4 interchain and 12 intrachain disulfide bonds, including Cys23 / Cys88 intrachain disulfide bonds in each of the variable domains of the light chain (VL). Domains depicted are: VL = light chain variable domain; VH = heavy chain variable domain; CL = light chain constant domain; CH1 = heavy chain constant domain 1 1; CH2 = heavy chain constant domain 2; CH3 = heavy chain constant domain 3.

На фиг. 7 показаны невосстановленные (нативные) трипсиновые пептидные карты пертузумаба.FIG. 7 shows unreduced (native) trypsin peptide maps of pertuzumab.

На фиг. 8 изображены трипсиновые пептидные карты восстановленного и невосстановленного пертузумаба (полноразмерные).FIG. 8 depicts trypsin peptide maps of reduced and unreduced pertuzumab (full size).

На фиг. 9 изображены трипсиновые пептидные карты восстановленного и невосстановленного пертузумаба (0-120 минут).FIG. 9 depicts trypsin peptide maps of reduced and unreduced pertuzumab (0-120 minutes).

На фиг. 10 изображены трипсиновые пептидные карты восстановленного и невосстановленного пертузумаба (120-204 минут).FIG. 10 depicts trypsin peptide maps of reduced and unreduced pertuzumab (120-204 minutes).

На фиг. 11 изображен хроматографический анализ с гидрофобным взаимодействием (HIC) пертузумаба, расщепленного папаином.FIG. 11 depicts hydrophobic interaction chromatography (HIC) analysis of papain digested pertuzumab.

На фиг. 12 изображен HIC анализ пертузумаба, расщепленного папаином (развернутый вид).FIG. 12 depicts the HIC analysis of papain digested pertuzumab (expanded view).

На фиг. 13 изображен HIC анализ интактного пертузумаба. Показаны пики, содержащие: гомодимер, обогащенный свободным тиолом (свободные тиолы на обеих легких цепях), гетеродимер со свободными тиолами (свободный тиол на одной легкой цепи), и гомодимер дикого типа (основные виды антитела).FIG. 13 depicts HIC analysis of intact pertuzumab. Peaks are shown containing: a free thiol-rich homodimer (free thiols on both light chains), a free thiol heterodimer (a free thiol on one light chain), and a wild-type homodimer (main antibody species).

На фиг. 14 изображена активность пертузумаба (партия анти2С4907-2) в анализе антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).FIG. 14 depicts the activity of pertuzumab (lot anti2C4907-2) in an antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) assay.

На фиг. 15 изображено влияние уровня G0-F на ADCC активность. Тестируемые образцы представляли собой пертузумаб фазы III (G0-F=2,2%) и пертузумаб фазы I (G0-F=0,8%).FIG. 15 depicts the effect of G0-F levels on ADCC activity. The samples tested were phase III pertuzumab (G0-F = 2.2%) and phase I pertuzumab (G0-F = 0.8%).

На фиг. 16 изображен капиллярный электрофоретический анализ N-связанных олигосахаридов, выделенных из пертузумаба.FIG. 16 depicts a capillary electrophoretic analysis of N-linked oligosaccharides isolated from pertuzumab.

На фиг. 17 изображен капиллярный электрофоретический анализ N-связанных олигосахаридов, выделенных из пертузумаба (развернутый вид). Примечание: олигосахарид G1 имеет две изомерные формы (меченый G1 и G1'), где концевой остаток галактозы присоединен либо к ветви α1-6, либо к ветви α1-3.FIG. 17 depicts a capillary electrophoretic analysis of N-linked oligosaccharides isolated from pertuzumab (expanded view). Note: Oligosaccharide G1 has two isomeric forms (labeled G1 and G1 '), where the terminal galactose residue is attached to either the α1-6 branch or the α1-3 branch.

На фиг. 18 изображена высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (HP-HPLC) для разделения Fab и Fc пертузумаба (ограниченное Lys-C расщепление). Показан пертузумаб с ограниченным Lys-C расщеплением и пертузумаб с ограниченным Lys-C расщеплением, затем обработанные N-этилмалеимидом (NEM).FIG. 18 depicts reverse phase high performance liquid chromatography (HP-HPLC) for the separation of Fab and Fc pertuzumab (limited Lys-C cleavage). Shown is pertuzumab with limited Lys-C degradation and pertuzumab with limited Lys-C degradation, then treated with N-ethylmaleimide (NEM).

На фиг. 19 изображено пептидное картирование, подтверждающее, что Fab пертузумаба со свободным тиолом содержит свободные Cys23 и Cys88 в своей легкой цепи. L2 пептид из Fab, содержащего свободные тиолы, был помечен с использованием NEM, и, таким образом, сдвинут в анализе пептидного картирования.FIG. 19 depicts peptide mapping confirming that the free thiol pertuzumab Fab contains free Cys23 and Cys88 in its light chain. The L2 peptide from a Fab containing free thiols was labeled using NEM and thus shifted in the peptide mapping assay.

На фиг. 20 схематически изображены: основные виды IgG1 дикого типа (Фиг. 20А), гетеродимерный вариант Cys23/Cys88 (Фиг. 20В) и гомодимерный вариант Cys23/Cys88 (Фиг. 20С).FIG. 20 schematically depicts: the main species of wild-type IgG1 (Fig. 20A), the heterodimeric variant Cys23 / Cys88 (Fig. 20B) and the homodimeric variant Cys23 / Cys88 (Fig. 20C).

На фиг. 21 изображен % G0-F как функция активности ADCC для партий пертузумаба с использованием исследования из примера 4 настоящего описания.FIG. 21 depicts% G0-F as a function of ADCC activity for batches of pertuzumab using the assay of Example 4 herein.

На фиг. 22 схематически изображено связывание пертузумаба в гетеродимерном сайте связывания HER2, таким образом, препятствующее гетеродимеризации с активированным EGFR или HER3.FIG. 22 schematically depicts the binding of pertuzumab to the heterodimeric binding site of HER2, thus preventing heterodimerization with activated EGFR or HER3.

На фиг. 23 представлено сравнение активностей трастузумаба (который связывается с субдоменом IV рядом с околомембранным доменом HER2 ECD) и пертузумаба (который связывается с субдоменом II HER2 ECD).FIG. 23 shows a comparison of the activities of trastuzumab (which binds to subdomain IV adjacent to the perimembrane domain of HER2 ECD) and pertuzumab (which binds to subdomain II of HER2 ECD).

На фиг. 24А и 24В изображены структуры олигосахаридов, присоединенных к антителу IgG.FIG. 24A and 24B depict the structures of oligosaccharides attached to an IgG antibody.

На фиг. 25 изображен гель-хроматографический (SEC) анализ пертузумаба (в натуральную величину).FIG. 25 depicts size exclusion chromatography (SEC) analysis of pertuzumab.

На фиг. 26 изображен SEC анализ пертузумаба (увеличенный масштаб). Пики включают основной пик (основные виды антитела), разновидности с высокой молекулярной массой (HMWS) и разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS).FIG. 26 depicts SEC analysis of pertuzumab (enlarged scale). Peaks include major peak (major antibody species), high molecular weight species (HMWS), and low molecular weight species (LMWS).

На фиг. 27 изображен эксклюзионной высокоэффективный жидкостной хроматографический анализ (SE-HPLC) образцов пертузумаба. Образец А представляет собой репрезентативную партию лекарственного средства пертузумаб. Образец В представляет собой партию пертузумаба, подверженную воздействию света при 1,2 млюкс-час. Образец С представляет собой партию пертузумаба, подверженную воздействию света при 3,6 млюкс часов. Образец D представляет собой партию пертузумаба, подверженную обработке кислотой при рН 3,2. Образец Ε представляет собой очищенные основные варианты в результате ионобменной HPLC (IE-HPLC).FIG. 27 depicts size exclusion high performance liquid chromatographic (SE-HPLC) analysis of pertuzumab samples. Sample A is a representative batch of the drug pertuzumab. Sample B is a batch of pertuzumab exposed to light at 1.2 μlx-hour. Sample C is a batch of pertuzumab exposed to light at 3.6 μlx hours. Sample D is a batch of pertuzumab subjected to acid treatment at pH 3.2. Sample Ε represents purified base variants by ion exchange HPLC (IE-HPLC).

На фиг. 28 изображен график соответствия аналитического ультрацентрифугирования (AUC) для определения скорости седиментации и SE-HPLC анализа. Планки погрешностей представляют два стандартных отклонения от n=3 определения. Все другие точки данные обозначают однократное определение. Кружочки обозначают образцы, которые имеют уровни HMWS ниже уровня обнаружения с помощью AUC.FIG. 28 is a plot of the correspondence between analytical ultracentrifugation (AUC) for sedimentation rate and SE-HPLC analysis. Error bars represent two standard deviations from the n = 3 definition. All other data points represent a single determination. The circles represent samples that have HMWS levels below the AUC detection level.

На фиг. 29 изображен капиллярный электрофоретический анализ с додецилсульфатом натрия (CE-SDS) с индуцированной лазером флуоресцентным обнаружением (LIF) невосстановленного пертузумаба.FIG. 29 depicts a capillary electrophoretic assay with sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) with laser-induced fluorescence detection (LIF) of unreduced pertuzumab.

На фиг. 30 изображен CE-SDS-LIF невосстановленного (NR) пертузумаба (развернутый вид).FIG. 30 depicts the CE-SDS-LIF of unreduced (NR) pertuzumab (expanded view).

На фиг. 31А и 31В изображены SE-HPLC хроматограммы для примера 6: в натуральную величину (Фиг 31А) и увеличенный масштаб (Фиг. 31В).FIG. 31A and 31B depict SE-HPLC chromatograms for example 6: full size (FIG. 31A) and enlarged (FIG. 31B).

На фиг. 32А и 32В изображены электрофореграммы CE-SDS (NR-CE-SDS) в нередуцирующих условиях для примера 6: в натуральную величину (Фиг. 32А) и увеличенный масштаб (Фиг. 32В).FIG. 32A and 32B depict electrophoretic patterns CE-SDS (NR-CE-SDS) in non-reducing conditions for example 6: full size (Fig. 32A) and an enlarged scale (Fig. 32B).

На фиг. 33А и 33В изображены электрофореграммы CE-SDS (R-CE-SDS) в редуцирующих условиях для примера 6: в натуральную величину (Фиг. 33А), и увеличенный масштаб (Фиг. 33В).FIG. 33A and 33B depict electrophoretic patterns CE-SDS (R-CE-SDS) in reducing conditions for example 6: full size (Fig. 33A), and an enlarged scale (Fig. 33B).

На фиг. 34 представлено сравнение электрофореграмм NR-CE-SDS и R-CE-SDS для образца, обработанного кислотой (увеличенный масштаб).FIG. 34 shows a comparison of NR-CE-SDS and R-CE-SDS electrophoregrams for an acid treated sample (enlarged scale).

На фиг. 35 изображена корреляция количественной оценки Fab между NR-CE-SDS и SE-HPLC.FIG. 35 depicts the correlation of Fab quantification between NR-CE-SDS and SE-HPLC.

Подробное описание изобретенияDetailed description of the invention

I. ОпределенияI. Definitions

«Спаренные цистеины» в настоящем описании относятся к двум остаткам цистеина, которые образуют дисульфидную связь в белке, таком как антитело. Такая дисульфидная связь может представлять собой межцепочечную дисульфидную связь (например, дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепями антитела, или между двумя тяжелыми цепями антитела), или внутрицепочечную дисульфидную связь (например, в пределах легкой цепи антитела или в пределах тяжелой цепи антитела). Большинство IgG1 антител содержит четыре межцепочечные дисульфидные связи и двенадцать внутрицепочечных дисульфидных связей. Смотри Фиг. 6."Paired cysteines" as used herein refer to two cysteine residues that form a disulfide bond in a protein, such as an antibody. Such a disulfide bond can be an interchain disulfide bond (e.g., a disulfide bond between the heavy and light chains of an antibody, or between two heavy chains of an antibody), or an intrachain disulfide bond (e.g., within an antibody light chain or within an antibody heavy chain). Most IgG1 antibodies contain four interchain disulfide bonds and twelve intrachain disulfide bonds. See FIG. 6.

«Вариант с неспаренными цистеинами» представляет собой вариант белка (например, антитела, такого как пертузумаб), в котором один или более спаренных цистеинов не находятся в дисульфид-связанном состоянии. Такие неспаренные цистеины могли быть неспаренными для образования дисульфидной связи (например, когда белок первоначально укладывается в третичную структуру) или могли сформировать дисульфидную связь, но которая позже была разорвана (например, во время производства или при хранении). Неспаренные цистеины зачастую называют свободными тиолами или свободными сульфгидрилами. В одном варианте осуществления неспаренные цистеины образуют внутрицепочечную дисульфидную связь. В одном варианте осуществления неспаренные цистеины находятся в легкой цепи, например, вариабельном домене легкой цепи анитела. В одном варианте осуществления вариант с неспаренными цистеинами представляет собой Cys23/Cys88 вариант.A "unpaired cysteine variant" is a protein variant (eg, an antibody such as pertuzumab) in which one or more paired cysteines are not disulfide-bound. Such unpaired cysteines could be unpaired to form a disulfide bond (for example, when the protein initially folds into a tertiary structure) or could form a disulfide bond, but which was later broken (for example, during production or during storage). Unpaired cysteines are often referred to as free thiols or free sulfhydryls. In one embodiment, the unpaired cysteines form an intrachain disulfide bond. In one embodiment, the unpaired cysteines are in a light chain, eg, an antibody light chain variable domain. In one embodiment, the unpaired cysteine variant is a Cys23 / Cys88 variant.

«Cys23/Cys88» вариант с неспаренными цистеинами лишен внутримолекулярной дисульфидной связи у остатков цистеина 23 и 88 в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи антитела. Смотри Фиг. 20(b) и (с) в настоящем описании.The "Cys23 / Cys88" variant with unpaired cysteines lacks the intramolecular disulfide bond at cysteine residues 23 and 88 in one or both of the variable domains of the antibody light chain. See FIG. 20 (b) and (c) in the present description.

«Гомодимерный вариант» лишен дисульфидных связей Cys23/Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи антитела. Смотри Фиг. 20(c) в настоящем описании.The "homodimeric variant" lacks the Cys23 / Cys88 disulfide bonds in both variable domains of the antibody light chain. See FIG. 20 (c) herein.

«Гетеродимерный вариант» лишен только одной дисульфидной связи Cys23/Cys88 в вариабельном домене легкой цепи антитела. Смотри Фиг. 20(b) в настоящем описании.The "heterodimeric variant" lacks only one Cys23 / Cys88 disulfide bond in the variable domain of an antibody light chain. See FIG. 20 (b) in the present description.

«Вариант, лишенный фукозы» представляет собой гликозилированный вариант антитела, в котором одна или обе олигосахаридные структуры присоединенные к остатку Asn299 одной или обеих тяжелых цепей, лишены фукозы, например, лишены Fucα(1->6), в ядре олигосахаридной структуры.A "fucose-free variant" is a glycosylated antibody variant in which one or both of the oligosaccharide structures attached to the Asn299 residue of one or both heavy chains are devoid of fucose, for example, are devoid of Fucα (1-> 6), in the core of the oligosaccharide structure.

«Разновидности с низкой молекулярной массой» или «LMWS» пертузумаба включают фрагмент пертузумаба, молекулярная масса которого ниже молекулярной массы основных видов или интактного пертузумаба (например, где интактный пертузумаб имеет молекулярную массу примерно 145197 Да, измеряя только его пептидные цепи). LMWS могут быть обнаружены с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) и/или капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в нередуцирующих условиях (CE-SDS), например, как в примере 5. В одном варианте осуществления LMWS содержит или состоит из «Пика 6» по данным CE-SDS (смотри, например, пример 5).The “low molecular weight species” or “LMWS” of pertuzumab include a fragment of pertuzumab whose molecular weight is below the molecular weight of the main species or intact pertuzumab (eg, where intact pertuzumab has a molecular weight of about 145197 Da, measuring only its peptide chains). LMWS can be detected by size exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) and / or capillary electrophoresis with sodium dodecyl sulfate under non-reducing conditions (CE-SDS), for example, as in example 5. In one embodiment, the LMWS contains or consists of "Peak 6 "according to CE-SDS (see, for example, example 5).

«Разновидности с высокой молекулярной массой » или «HMWS» включают препарат пертузумаба, имеющий молекулярную массу, которая превышает молекулярную массу основных видов или интактного пертузумаба (например, где интактный пертузумаб имеет молекулярную массу примерно 145197 Да, измеряя только его пептидные цепи). HMWS можно обнаружить с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC) и/или капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в нередуцирующлх условиях (CE-SDS), например, как в примере 5."High molecular weight species" or "HMWS" include a formulation of pertuzumab having a molecular weight that exceeds that of the main species or intact pertuzumab (eg, where intact pertuzumab has a molecular weight of about 145197 Da, measuring only its peptide chains). HMWS can be detected by size exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) and / or capillary electrophoresis with sodium dodecyl sulfate under non-reducing conditions (CE-SDS), for example, as in example 5.

«Пик 1» в настоящем описании относится к фрагменту (фрагментам) пертузумаба, размер которых меньше размера легкой цепи пертузумаба (LC). Фрагменты) Пика 1 могут быть отделены от основных видов пертузумаба с помощью CE-SDS, предпочтительно с помощью CE-SDS (R-CE-SDS) в редуцирующих условиях. Смотри, например, фиг. 33В, таблицу 16 и таблицу 18 в настоящем описании. Предпочтительно, величина пика 1 в композиции пертузумаба составляет ≤0,5%. Необязательно, R-CE-SDS анализ проводят, как описано в примере 6, и соответствующая площадь пика (CPA) дает % пика 1 в композиции."Peak 1" as used herein refers to the fragment (s) of pertuzumab that are smaller than the light chain of pertuzumab (LC). Fragments) Peak 1 can be separated from the main species of pertuzumab using CE-SDS, preferably using CE-SDS (R-CE-SDS) under reducing conditions. See, for example, FIG. 33B, table 16 and table 18 in the present description. Preferably, the peak 1 value in the pertuzumab composition is 0.5%. Optionally, R-CE-SDS analysis is performed as described in example 6 and the corresponding peak area (CPA) gives the% peak 1 in the composition.

«Пик 2» в настоящем изобретении относится к фрагменту (фрагментам) пертузумаба, размер которых больше легкой цепи пертузумаба (LC) и меньше негликозилированной тяжелой цепи пертузумаба (NGHC). Пик 2 можно отделить от основных видов пертузумаба с помощью CE-SDS, предпочтительно, с помощью анализа в редуцирующих условиях (R-CE-SDS). Пик 2 исключает пик 3, который может появиться во время анализа R-CE-SDS, как объясняется в примере 6 в настоящем описании. Смотри, например, фиг. 33В, таблицу 16 и таблицу 18 в настоящем описании. Предпочтительно, величина пика 2 в композиции пертузумаба составляет ≤1,0%. Необязательно, анализ R-CE-SDS проводят, как описано в примере 6, и скорректированная площадь пика (CPA) дает % пика 2 в композиции."Peak 2" in the present invention refers to a fragment (s) of pertuzumab that are larger than the light chain of pertuzumab (LC) and smaller than the non-glycosylated heavy chain of pertuzumab (NGHC). Peak 2 can be separated from the main species of pertuzumab by CE-SDS, preferably by analysis under reducing conditions (R-CE-SDS). Peak 2 excludes peak 3, which may appear during the R-CE-SDS analysis, as explained in Example 6 herein. See, for example, FIG. 33B, table 16 and table 18 in the present description. Preferably, the peak 2 value in the pertuzumab composition is 1.0%. Optionally, R-CE-SDS analysis is performed as described in Example 6, and the corrected peak area (CPA) gives% peak 2 in the composition.

«Фрагментация» относится к расщеплению полипептидной цепи, например, к расщеплению легкой цепи и/или тяжелой цепи пертузумаба. Фрагментация не включает диссоциацию нековалентно соединенных полипептидных цепей, например, во время NR CE-SDS анализа."Fragmentation" refers to cleavage of a polypeptide chain, for example, cleavage of the light chain and / or heavy chain of pertuzumab. Fragmentation does not involve the dissociation of non-covalently linked polypeptide chains, for example, during NR CE-SDS analysis.

«Аналитическое исследование» представляет собой исследование, в котором количественно оценивают и/или количественно измеряют присутствие или количество аналита (например, варианта антитела) в композиции. Композиция, подвергающаяся такому исследованию, может быть очищенной композицией, в том числе, фармацевтической композицией.An "analytic study" is a study that quantifies and / or quantifies the presence or amount of an analyte (eg, antibody variant) in a composition. The composition undergoing such testing can be a purified composition, including a pharmaceutical composition.

«Хроматографический анализ Fab гидрофобного взаимодействия» или «анализ Fab HIC» включает получение фрагментов (например, Fab фрагментов) антител в композиции (например, используя фермент папаин) и проведение HIC полученных таким образом фрагментов антител для отделения вариантов с неспаренными цистеинами от основных видов пертузумаба. В качестве примера такой анализ раскрыт в примере 1 в настоящем описании."Chromatographic analysis of Fab hydrophobic interaction" or "Fab HIC analysis" involves obtaining fragments (eg, Fab fragments) of antibodies in a composition (eg using the enzyme papain) and conducting HIC of the thus obtained antibody fragments to separate variants with unpaired cysteines from the main species of pertuzumab ... As an example, such an analysis is disclosed in example 1 in the present description.

«Рецептор HER» представляет собой рецепторную протеинтирозинкиназу, которая принадлежит семейству рецепторов HER, и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 Рецептор HER в основном будет включать внеклеточный домен, который может связываться с лигандом HER и/или димеризоваться с другой рецепторной молекулой HER; липофильным трансмембранным доменом; консервативным внутриклеточным тирозинкиназным доменом; и карбоксил-концевым сигнальным доменом, содержащим несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы.The “HER receptor” is a receptor protein tyrosine kinase that belongs to the HER family of receptors and includes the EGFR, HER2, HER3 and HER4 receptors. The HER receptor will generally comprise an extracellular domain that can bind to a HER ligand and / or dimerize with another HER receptor molecule; lipophilic transmembrane domain; conservative intracellular tyrosine kinase domain; and a carboxyl-terminal signaling domain containing several tyrosine residues that can be phosphorylated.

Выражение «HER2» относится к белку HER2 человека, описанному, например, у Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) и Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Genebank accession number X03363).The expression "HER2" refers to the human HER2 protein as described, for example, in Semba et al., PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) and Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (Genebank accession number X03363).

В настоящем описании «внеклеточный домен HER2» или «HER2 ECD» относится к домену HER2, который находится вне клетки, либо заякорен в клеточной мембране, либо находится в кровотоке, включая его фрагменты. Аминокислотная последовательность HER2 показана на Фиг. 1. В одном варианте осуществления внеклеточный домен HER2 может содержать четыре домена: «субдомен I» (аминокислотные остатки примерно от 1-195; SEQ ID ΝΟ:1), «субдомен II» (аминокислотные остатки примерно от 196-319; SEQ ID NO: 2), «субдомен III» (аминокислотные остатки примерно от 320-488: SEQ ID NO: 3) и «субдомен IV» (аминокислотные остатки примерно от 489-630; SEQ ID NO: 4) (нумерация остатков без сигнального пептида). Смотри Garrett et al. Mol Cell 11: 495-505 (2003), Cho et al Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004), и Plowman et al. Proc. Natl Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993), а также Фиг. 1 в настоящем описании.As used herein, “extracellular domain of HER2” or “HER2 ECD” refers to the HER2 domain that is outside the cell, either anchored in the cell membrane, or in the bloodstream, including fragments thereof. The amino acid sequence of HER2 is shown in FIG. 1. In one embodiment, the extracellular domain of HER2 may contain four domains: "subdomain I" (amino acid residues from about 1-195; SEQ ID ΝΟ: 1), "subdomain II" (amino acid residues from about 196-319; SEQ ID NO : 2), "subdomain III" (amino acid residues from about 320-488: SEQ ID NO: 3) and "subdomain IV" (amino acid residues from about 489-630; SEQ ID NO: 4) (numbering of residues without signal peptide) ... See Garrett et al. Mol Cell 11: 495-505 (2003), Cho et al Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004), and Plowman et al. Proc. Natl Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993) as well as Fig. 1 in the present description.

«Димер HER» в настоящем описании представляет собой нековалентно связанный димер, содержащий по меньшей мере два рецептора HER. Такие комплексы могут образовываться в тех случаях, когда клетка, экспрессирующая два или более рецепторов HER, подвергается воздействию лиганда HER, и может быть выделен с помощью иммунопреципитации и проанализирован с помощью SDS-PAGE, как описано, например, у Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Другие белки, такие как субъединица цитокинового рецептора (например, gp130) могут быть ассоциированы с димером. Предпочтительно, димер HER содержит HER2.A "HER dimer" as used herein is a non-covalently linked dimer containing at least two HER receptors. Such complexes can form when a cell expressing two or more HER receptors is exposed to a HER ligand and can be isolated by immunoprecipitation and analyzed by SDS-PAGE, as described, for example, in Sliwkowski et al., J Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994). Other proteins, such as the cytokine receptor subunit (eg, gp130), can be associated with the dimer. Preferably, the HER dimer contains HER2.

«Гетеродимер HER» в настоящем описании представляет собой нековалентно связанный гетеродимер, содержащий по меньшей мере два различных рецептора HER, например, гетеродимеры EGFR-HER2, HER2-HER3 или HER2-HER4.A “HER heterodimer” as used herein is a non-covalently linked heterodimer containing at least two different HER receptors, eg, EGFR-HER2, HER2-HER3, or HER2-HER4 heterodimers.

«Активация HER» относится к активации или фосфорилированию любого одного или более рецепторов HER. В основном, активация HER в результате приводит к трансдукции сигнала (например, вызванной внутриклеточным киназным доменом рецептора HER, фосфорилирующего остатки тирозина в рецепторе HER или полипептиде субстрата). Активация HER может быть опосредована лигандом HER, связывающимся с димером HER, содержащим представляющий интерес рецептор HER. Лиганд HER, связывающийся с димером HER, может активировать киназный домен одного или более рецепторов HER в димере и, следовательно, в результате приводит к фосфорилированию остатков тирозина в одном или более рецепторах HER и/или к фосфорилированию остатков тирозина в дополнительных полипептидах субстрата, например, Akt или МАРК внутриклеточных киназах."HER activation" refers to the activation or phosphorylation of any one or more HER receptors. Basically, HER activation results in signal transduction (eg, caused by the intracellular kinase domain of the HER receptor phosphorylating tyrosine residues in the HER receptor or substrate polypeptide). HER activation can be mediated by a HER ligand binding to a HER dimer containing the HER receptor of interest. A HER ligand that binds to a HER dimer can activate the kinase domain of one or more HER receptors in the dimer and therefore result in phosphorylation of tyrosine residues in one or more HER receptors and / or phosphorylation of tyrosine residues in additional substrate polypeptides, for example, Akt or MAPK intracellular kinases.

«Гуманизированные» формы антител, не являющихся антителами человека (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента замещены остатками из гипервариабельной области видов, не являющихся человеком (донорное антитело), например, мыши, крысы, кролика или нечеловекообразного примата, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека замещены соответствующими остатками иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет в реципиентном антителе или в донорском антителе. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения активности антител. В основном, гуманизированное антитело будет содержать по существу все по меньшей мере из одного и, обычно, двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, и все или по существу все FR представляют собой каркасные области последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно, константной области иммуноглобулина человека. Дополнительные подробные сведения смотри у Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Гуманизированные антитела к HER2, в частности, включают трастузумаб и гуманизированные антитела 2С4, такие как пертузумаб, как описано и определено в настоящем описании.“Humanized” forms of non-human (eg, rodent) antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin. In general, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibody) in which residues from the recipient's hypervariable region are replaced by residues from the hypervariable region of a non-human species (donor antibody), for example, a mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the desired specificity , affinity and capacity. In some cases, framework region (FR) residues of a human immunoglobulin are replaced by corresponding residues of a non-human immunoglobulin. Moreover, humanized antibodies may contain residues that are not present in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to further improve antibody activity. Basically, a humanized antibody will contain substantially all of at least one, and usually two, variable domains in which all or substantially all of the hypervariable loops correspond to loops of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FRs are are the framework regions of a human immunoglobulin sequence. A humanized antibody will optionally contain at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a human immunoglobulin constant region. For further details see Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Humanized anti-HER2 antibodies specifically include trastuzumab and humanized 2C4 antibodies such as pertuzumab, as described and defined herein.

«Интактное антитело» в настоящем описании представляет собой антитело, которое содержит две антигенсвязывающие области и область Fc. Предпочтительно, интактное антитело имеет функционально активную область Fc. В одном варианте осуществления «интактный пертузумаб» имеет молекулярную массу примерно 145197 Да, измеряя только его пептидные цепи.An "intact antibody" as used herein is an antibody that contains two antigen-binding regions and an Fc region. Preferably, the intact antibody has a functionally active Fc region. In one embodiment, "intact pertuzumab" has a molecular weight of about 145197 Da, as measured only by its peptide chains.

Термин «гипервариабельная область» в контексте настоящего изобретения относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельная область в основном содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Остатки «каркасной области» или «FR» представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в настоящем описании.The term "hypervariable region" in the context of the present invention refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for binding to an antigen. The hypervariable region mainly contains amino acid residues from the "complementarity determining region" or "CDR" (for example, residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) in the variable domain of the light chain and 31- 35 (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3) in the heavy chain variable domain; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda. MD. (1991)) and / or residues from the "hypervariable loop" (for example, residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) in the variable domain of the light chain and 26-32 (H1 ), 53-55 (H2) and 96-101 (H3) in the variable domain of the heavy chain; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). "Framework" or "FR" residues are variable domain residues other than hypervariable region residues as defined herein.

Термин «Fc область» в контексте настоящего изобретения используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая Fc области нативной последовательности и Fc области варианта. Хотя границы Fc области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc область тяжелой цепи IgG человека обычно определяется для фрагмента от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Рго230, до его карбоксильного конца. С-концевой лизин (остаток 449 в соответствии с системой нумерации EU) области Fc, может быть удален, например, во время продукции или очистки антитела, или путем рекомбинантной инженерии нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител со всеми удаленными остатками К449, популяции антител без удаленных остатков К449 и популяции антител, имеющих смесь антител с остатком К449 и без него.The term "Fc region" in the context of the present invention is used to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including the Fc region of the native sequence and the Fc region of a variant. Although the boundaries of the Fc region of an immunoglobulin heavy chain may vary, the Fc region of a human IgG heavy chain is usually defined for a fragment from the amino acid residue at position Cys226, or from Pro230, to its carboxyl terminus. The C-terminal lysine (residue 449 of the EU numbering system) of the Fc region can be removed, for example, during antibody production or purification, or by recombinant engineering of the nucleic acid encoding the antibody heavy chain. Accordingly, an intact antibody composition may contain antibody populations with all K449 residues removed, antibody populations without K449 residues removed, and antibody populations having a mixture of antibodies with and without a K449 residue.

Если не указано иное, в настоящем описании нумерация остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой нумерацию EU индекса как у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), специально включено в настоящее описание в качестве ссылки. «EU индекс как у Kabat» относится к нумерации остатков антитела человека IgG1 EU.Unless otherwise indicated, as used herein, the numbering of residues in the heavy chain of an immunoglobulin is the EU index numbering as in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), expressly incorporated herein by reference. "EU index like Kabat" refers to the numbering of the residues of the human IgG1 EU antibody.

«Функционально активная Fc область» обладает «эффекторной функцией» нативной последовательности области Fc. Приводимые в качестве примера «эффекторные функции» включают связывание с C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с Fc рецептором; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора; BCR), и так далее. Для таких эффекторных функций в основном требуется, объединение Fc области со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела) и их можно оценить с использованием различных анализов.A “functionally active Fc region” has an “effector function” of a native Fc region sequence. Exemplary "effector functions" include binding to C1q; complement dependent cytotoxicity; binding to the Fc receptor; antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; down-regulation of cell surface receptors (eg, B-cell receptor; BCR), and so on. Such effector functions generally require the association of the Fc region with a binding domain (eg, an antibody variable domain) and can be assessed using a variety of assays.

«Нативная последовательность области Fc» включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности природной области Fc. Нативная последовательность Fc областей антитела человека включает нативную последовательность Fc области IgG1 человека (не-А и А аллотипы); нативную последовательность Fc области IgG2 человека; нативную последовательность Fc области IgG3 человека; и нативную последовательность Fc области IgG4 человека, а также их природные варианты.A "native Fc region sequence" includes an amino acid sequence identical to that of a naturally occurring Fc region. The native sequence of the Fc regions of a human antibody includes the native sequence of the Fc region of human IgG1 (non-A and A allotypes); a native human IgG2 Fc region sequence; a native human IgG3 Fc region sequence; and the native human IgG4 Fc region sequence, as well as natural variants thereof.

«Оголенное антитело» представляет собой антитело, которое не конъюгировано с гетерологичной молекулой, такой как цитотоксическая группа или радиоактивная метка."Naked antibody" is an antibody that is not conjugated to a heterologous molecule, such as a cytotoxic group or radioactive label.

Термин «основные виды антитела» или «антитело дикого типа» в настоящем списании относится к структуре аминокислотной последовательности антитела в композиции, которая представляет собой количественно преобладающую молекулу антитела в композиции. Предпочтительно, основными видами антитела является антитело к HER2, например, антитело, которое связывается с субдоменом II HER2, антитело, которое ингибирует димеризацию HER более эффективно, чем трастузумаб, и/или связывается с гетеродимерным сайтом связывания на HER2. В одном варианте осуществления основными видами антитела является антитело, содержащее CDR-H1 (SEQ ID NO: 17 или 23), CDR-H2 (SEQ ID NO: 18), и CDR-H3 (SEQ ID NO: 19), CDR-L1 (SEQ ID NO: 20), CDR-L2 (SEQ ID NO: 21 или 24) и CDR-L3 (SEQ ID NO: 22), аминокислотные последовательности VL и VH в последовательностях SEQ ID NO, 7 и 8, соответственно (смотри фиг. 2А-2В), и, необязательно, аминокислотные последовательности легкой цепи в последовательностях SEQ ID NO. 11 или 15 и аминокислотные последовательности тяжелой цепи в последовательностях SEQ ID NO. 12 или 16 (смотри фиг. 3А-3В и 5А-5В). В одном варианте осуществления основными видами антитела является пертузумаб.The term "main antibody species" or "wild-type antibody" as used herein refers to the structure of the amino acid sequence of an antibody in a composition, which is the quantitatively predominant antibody molecule in the composition. Preferably, the primary antibody is an anti-HER2 antibody, eg, an antibody that binds to subdomain II of HER2, an antibody that inhibits HER dimerization more efficiently than trastuzumab, and / or binds to a heterodimeric binding site on HER2. In one embodiment, the main antibody species is an antibody comprising CDR-H1 (SEQ ID NO: 17 or 23), CDR-H2 (SEQ ID NO: 18), and CDR-H3 (SEQ ID NO: 19), CDR-L1 (SEQ ID NO: 20), CDR-L2 (SEQ ID NO: 21 or 24) and CDR-L3 (SEQ ID NO: 22), the VL and VH amino acid sequences in SEQ ID NOs, 7 and 8, respectively (see Fig. 2A-2B), and, optionally, amino acid sequences of the light chain in the sequences of SEQ ID NO. 11 or 15 and the heavy chain amino acid sequences in SEQ ID NO. 12 or 16 (see FIGS. 3A-3B and 5A-5B). In one embodiment, the primary antibody species is pertuzumab.

Антитело, которое «ингибирует димеризацию HER», представляет собой антитело, которое ингибирует или препятствует образованию димера или гетеродимера HER. В одном варианте осуществления такое антитело связывается с HER2 в его гетеродимерном сайте связывания. Наиболее предпочтительным антителом, ингибирующим димеризацию, в настоящем описании является пертузумаб.An antibody that "inhibits dimerization of HER" is an antibody that inhibits or prevents the formation of a dimer or heterodimer of HER. In one embodiment, such an antibody binds to HER2 at its heterodimeric binding site. The most preferred dimerization inhibiting antibody herein is pertuzumab.

«Гетеродимерный сайт связывания» на HER2, относится к области во внеклеточном домене HER2, которая контактирует или взаимодействует с областью во внеклеточном домене EGFR, HER3 или HER4 при образовании димера с помощью него. Эта область находится в субдомене II HER2 (SEQ ID NO: 2). Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)."Heterodimeric binding site" on HER2 refers to a region in the extracellular domain of HER2 that contacts or interacts with a region in the extracellular domain of EGFR, HER3, or HER4 to form a dimer with it. This region is located in subdomain II of HER2 (SEQ ID NO: 2). Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004).

Антитело к HER2, которое «связывается с гетеродимерным сайтом связывания» HER2, связывается с остатками в субдомене II (SEQ ID NO: 2) и, необязательно, также связывается с другими остатками во внеклеточном домене HER2, например, субдомены I и III (SEQ ID NO: 1 и 3), и может пространственно затруднять, по меньшей мере до некоторой степени, образование гетеродимера HER2-EGFR, HER2-HER3 или HER2-HER4. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004) характеризуют кристаллическую структуру HER2-пертузумаб, депонируемого в RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78), иллюстрирующую приводимое в качестве примера антитело, которое связывается с гетеродимерным сайтом связывания HER2.An anti-HER2 antibody that "binds to the heterodimeric binding site" of HER2 binds to residues in subdomain II (SEQ ID NO: 2) and optionally also binds to other residues in the extracellular domain of HER2, for example subdomains I and III (SEQ ID NO: 1 and 3), and may spatially hinder, at least to some extent, the formation of a HER2-EGFR, HER2-HER3, or HER2-HER4 heterodimer. Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004) characterizes the crystal structure of HER2-pertuzumab deposited with the RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78) illustrating an exemplary antibody that binds to the heterodimeric binding site of HER2.

Антитело, которое «связывается с субдоменом II» HER2, связывается с остатками в субдомене II (SEQ ID NO: 2) и, необязательно, остатками в другом субдомен(ах) HER2, например, субдоменах I и III (SEQ ID NO: 1 и 3, соответственно).An antibody that “binds to subdomain II” of HER2 binds to residues in subdomain II (SEQ ID NO: 2) and optionally residues in other subdomain (s) of HER2, such as subdomains I and III (SEQ ID NO: 1 and 3, respectively).

Для целей настоящего описания «пертузумаб» и «rhuMAb 2С4», которые используются взаимозаменяемо, относятся к антителу, содержащему аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи (VH) в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно, фиг. 22 и 23 в настоящем описании иллюстрируют приводимые в качестве примера биологические функции пертузумаба. В тех случаях, когда пертузумаб представляет собой интактное антитело, он, предпочтительно, включает антитело IgG1; в одном варианте осуществления, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи в SEQ ID NO: 11 или 15, и аминокислотную последовательность тяжелой цепи в SEQ ID NO: 12 или 16. Это антитело необязательно продуцируется рекомбинантными ооцитами китайского хомячка (СНО). Термины «пертузумаб» и «rhuMAb 2С4» в настоящем изобретении охватывают биологически сходные или предполагаемые копии лекарственного средства с наименованием по Справочнику национальных непатентованных названий США (USAN) или международным непатентованным наименованием (IΝΝ): пертузумаб.For the purposes of this specification, "pertuzumab" and "rhuMAb 2C4", which are used interchangeably, refer to an antibody comprising the amino acid sequences of a light chain variable domain (VL) and a heavy chain variable domain (VH) in SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively, fig. 22 and 23 herein illustrate exemplary biological functions of pertuzumab. In cases where pertuzumab is an intact antibody, it preferably comprises an IgG1 antibody; in one embodiment, comprising the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or 15 and the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or 16. This antibody is optionally produced by recombinant Chinese hamster oocytes (CHO). The terms "pertuzumab" and "rhuMAb 2C4" in the present invention encompass biologically similar or putative copies of a drug with a USAN or International Nonproprietary Name (IΝΝ): pertuzumab.

Для целей настоящего изобретения «трастузумаб» и «rhuMAb4D5», которые используются взаимозаменяемо, относятся к антителу, включающему аминокислотные последовательности вариабельного домена легкой цепи (VL) и тяжелой цепи (VH) из SEQ ГО No: 13 и 14, соответственно (смотри фиг. 4А-4В). В тех случаях, когда трастузумаб представляет собой интактное антитело, он предпочтительно включает антитело lgG1; в одном варианте осуществления, включающий аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 13 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 14. Это антитело необязательно продуцируется ооцитами китайского хомячка (СНО). Термины «трастузумаб» и «rhuMAb4D5» в настоящем описании охватывают биологически сходные или предполагаемые копии лекарственного средства с наименованием по Справочнику национальных непатентованных названий США (USAN) или международным непатентованным наименованием (INN): трастузумаб.For the purposes of the present invention, "trastuzumab" and "rhuMAb4D5", which are used interchangeably, refer to an antibody comprising the light chain variable domain (VL) and heavy chain (VH) amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively (see FIG. 4A-4B). Where trastuzumab is an intact antibody, it preferably comprises an IgG1 antibody; in one embodiment, comprising the light chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and the heavy chain amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. This antibody is optionally produced by Chinese hamster oocytes (CHO). The terms "trastuzumab" and "rhuMAb4D5" as used herein encompass biologically similar or inferred copies of a drug with the United States Directory of National Nonproprietary Names (USAN) or International Nonproprietary Name (INN): trastuzumab.

«Вариант аминокислотной последовательности» антитела в настоящем описании представляет собой антитело с аминокислотной последовательностью, которая отличается от основных видов антитела. Обычно варианты аминокислотной последовательности будут обладать по меньшей мере примерно 70% гомологией с основными видами антитела, и, предпочтительно, они будут по меньшей мере примерно на 80%, и более предпочтительно, по меньшей мере примерно на 90% гомологичны основным видам антитела. Варианты аминокислотной последовательности имеют замены, делеции и/или добавления в определенных положениях внутри аминокислотной последовательности или смежно с аминокислотной последовательностью основных видов антитела. Примеры вариантов аминокислотной последовательности в настоящем описании включают дезамидированный вариант антитела, антитело с аминоконцевым лидерным удлинением (например, VHS-) на одном или двух его легких цепях, антитело с С-концевым остатком лизина на одном или двух его тяжелых цепях, и так далее, и включает сочетания изменений аминокислотных последовательностей тяжелой и/или легкой цепей.An “amino acid sequence variant” of an antibody as used herein is an antibody with an amino acid sequence that differs from the main antibody species. Typically, amino acid sequence variants will have at least about 70% homology to the main antibody species, and preferably they will be at least about 80%, and more preferably, at least about 90% homology to the main antibody species. Amino acid sequence variants have substitutions, deletions, and / or additions at specific positions within the amino acid sequence or adjacent to the amino acid sequence of the main antibody species. Examples of amino acid sequence variants herein include a deamidated antibody variant, an antibody with an amino-terminal leader extension (e.g., VHS-) on one or two of its light chains, an antibody with a C-terminal lysine residue on one or two of its heavy chains, and so on, and includes combinations of heavy and / or light chain amino acid sequence changes.

«Кислый вариант» представляет собой вариант основных видов антитела, который является более кислым, чем основные виды антитела. Кислый вариант приобрел отрицательный заряд или утратил положительный заряд по сравнению с основными видами антитела. Такие кислые варианты можно разделить с использованием методики разделения, такой как ионообменная хроматография, которая разделяет белки в соответствии с зарядом. Кислые варианты основных видов антитела элюируют раньше основного пика при разделении с помощью катионообменной хроматографии.An "acidic variant" is a variant of the base antibody that is more acidic than the base antibody. The acidic variant acquired a negative charge or lost a positive charge compared to the main types of antibodies. Such acidic variants can be separated using separation techniques such as ion exchange chromatography, which separates proteins according to charge. Acidic variants of the main types of antibodies elute before the main peak when separated by cation exchange chromatography.

«Вариант с восстановленным дисульфидом» имеет один или более межцепочечных дисульфид-связанных цистеинов, химически восстановленных до формы свободного тиола. Этот вариант можно подвергать мониторингу с помощью капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в нередуцирующих условиях (CE-SDS), например, как описано в WO 2009/099829 (Harris et al.).The “reduced disulfide version” has one or more interchain disulfide-linked cysteines chemically reduced to the free thiol form. This variant can be monitored by capillary electrophoresis with sodium dodecyl sulfate under non-reducing conditions (CE-SDS), for example, as described in WO 2009/099829 (Harris et al.).

В настоящем описании «невосстанавливаемый вариант» или «неполностью восстановленный вариант» представляет собой вариант основных видов антитела, который не может быть химически восстановлен до тяжелой цепи и легкой цепи обработкой восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол. Такие варианты можно определить с помощью обработки композиции восстанавливающим агентом и оценки полученной в результате композиции, используя методику, которая оценивает размер белка, например, капиллярным электрофорезом с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), например, используя способы, описанные в WO 2009/099829 (Harris et al.).As used herein, a “non-reducible variant” or “incompletely reduced variant” is a variant of the main antibody species that cannot be chemically reduced to the heavy chain and light chain by treatment with a reducing agent such as dithiothreitol. Such variations can be determined by treating the composition with a reducing agent and evaluating the resulting composition using a technique that estimates protein size, for example sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis (CE-SDS), for example, using the methods described in WO 2009/099829 ( Harris et al.).

«Вариант гликозилирования» антитела в настоящем описании представляет собой антитело с одной или более углеводными группами, присоединенными к нему, которые отличаются от одной или более углеводных групп, присоединенных к основным видам антитела. В одном варианте осуществления вариант гликозилирования имеет олигосахаридные структуры, присоединенные к одной или обеим тяжелым цепям антитела, например, у остатка 299 тяжелой цепи. В одном варианте осуществления основные виды антитела (например, пертузумаб) содержат олигосахарид G0 в качестве заданного олигосахарида, присоединенного к его Fc области. Приводимые в качестве примера олигосахаридные структуры, присоединенные к IgG1, изображены на фиг. 24А-24В. Примеры вариантов гликозилирования в настоящем изобретении включают вариант, лишенный фукозы, антитело с олигосахарид ной структурой G1 или G2, вместо олигосахаридной структуры G0, присоединенной к его Fc области («вариант гликозилирования G1» или «вариант гликозилирования G2»), антитело без углевода, присоединенного к одной или обеим тяжелым цепям антитела («вариант с негликозилированной тяжелой цепью»), сиалилированный вариант, и так далее, а также сочетания таких модификаций гликозилирования. Смотри, например, патент США 7560111 (Као et al.).An "glycosylation variant" of an antibody as used herein is an antibody with one or more carbohydrate groups attached thereto, which are different from one or more carbohydrate groups attached to the main antibody species. In one embodiment, the glycosylation variant has oligosaccharide structures attached to one or both of the heavy chains of the antibody, for example, at residue 299 of the heavy chain. In one embodiment, the basic antibody species (eg, pertuzumab) comprise a G0 oligosaccharide as the target oligosaccharide attached to its Fc region. Exemplary oligosaccharide structures attached to IgG1 are depicted in FIG. 24A-24B. Examples of glycosylation variants in the present invention include a variant lacking fucose, an antibody with an oligosaccharide structure G1 or G2, instead of an oligosaccharide structure G0 attached to its Fc region ("glycosylation variant G1" or "glycosylation variant G2"), an antibody without a carbohydrate attached to one or both of the heavy chains of an antibody ("non-glycosylated heavy chain variant"), sialylated variant, and so on, and combinations of such glycosylation modifications. See, for example, U.S. Patent 7,560,111 (Kao et al.).

В тех случаях, когда антитело имеет Fc область, олигосахаридная структура может быть присоединена к одной или обеим тяжелым цепям антитела, например, у остатка 299. В одном варианте осуществления GO является преобладающей олигосахаридной структурой, с другими олигосахаридными структурами, такими как G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) и G2 обнаруживаемыми в меньшем количестве в композиции.Where the antibody has an Fc region, the oligosaccharide structure can be attached to one or both of the heavy chains of the antibody, for example, at residue 299. In one embodiment, GO is the predominant oligosaccharide structure, with other oligosaccharide structures such as G0-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1 (1-6), G1 (1-3) and G2 are found in lesser amounts in the composition.

Если не указано иное, «олигосахаридная структура G1» в настоящем описании включает структуры G1(1-6) и G1(1-3).Unless otherwise indicated, the “oligosaccharide structure G1” as used herein includes structures G1 (1-6) and G1 (1-3).

Для целей настоящего описания «сиалилированный вариант» представляет собой вариант основных видов антитела, содержащий одну или более сиалилированных углеводных групп, присоединенных к одной или двум его тяжелым цепям. Сиалилированный вариант может быть идентифицирован путем анализа композиции (например, с помощью ионобменной хроматографии) с обработкой сиалидазой или без нее, например, как описано в WO 2009/099829.For the purposes of the present description, a "sialylated variant" is a variant of the main types of antibodies containing one or more sialylated carbohydrate groups attached to one or two of its heavy chains. The sialylated variant can be identified by analysis of the composition (eg, using ion exchange chromatography) with or without sialidase treatment, eg, as described in WO 2009/099829.

«Гликозилированный вариант» представляет собой антитело, к которому был ковалентно присоединен сахар, такой как глюкоза, например, к одной или обеим легким цепям антитела. Это добавление может возникать посредством взаимодействия глюкозы с остатком лизина на белке (например, в культуральной клеточной среде). Гликозилированный вариант может быть идентифицирован с помощью масс-спектрометрического анализа восстановленного антитела, определяя увеличение массы тяжелой или легкой цепи. Гликозилированный вариант также может быть определен количественно с помощью боронатной хроматографии, как описано в WO 2009/099829 (Harris et al.).A "glycosylated variant" is an antibody to which a sugar such as glucose has been covalently attached, for example, to one or both of the light chains of the antibody. This addition can occur through the interaction of glucose with a lysine residue on the protein (eg, in a cell culture medium). The glycosylated variant can be identified by mass spectrometric analysis of the reduced antibody, determining the increase in the mass of the heavy or light chain. The glycosylated variant can also be quantified by boronate chromatography as described in WO 2009/099829 (Harris et al.).

«Дезамидированное» антитело представляет собой антитело, в котором один или более остатков аспарагина образовывали производные, например, аспарагиновую кислоту, сукцинимид или изо-аспарагиновую кислоту. Примером дезамидированного антитела является вариант пертузумаба, в котором Asn-386 и/или Asn-391 на одной или двух тяжелых цепях пертузумаба являются дезамидированными. Смотри, например, WO 2009/099829 (Harris et al.).An "deamidated" antibody is an antibody in which one or more asparagine residues are derivatized, for example, aspartic acid, succinimide, or iso-aspartic acid. An example of a deamidated antibody is a variant of pertuzumab in which Asn-386 and / or Asn-391 on one or two heavy chains of pertuzumab are deamidated. See, for example, WO 2009/099829 (Harris et al.).

«Вариант с аминоконцевым лидерным удлинением» в настоящем описании относится к основным видам антитела с одним или более аминокислотными остатками аминоконцевок лидерной последовательности на аминоконце любой одной или более тяжелой или легкой цепей антитела основных видов. Приводимое в качестве примера аминоконцевое лидерное удлинение содержит или состоит из трех аминокислотных остатков, VHS-, присутствующих на одной или обеих легких цепях варианта антитела, обозначенного в настоящем описании «VHS-вариант». Смотри патент США 7560111 (Као et al.).An “amino-terminal leader extension variant” as used herein refers to a basic antibody species with one or more amino acid residues of the amino-terminal leader sequence at the amino terminus of any one or more heavy or light chains of a basic antibody species. An exemplary amino-terminal leader extension contains or consists of three amino acid residues, VHS-, present on one or both of the light chains of an antibody variant referred to herein as a “VHS variant”. See U.S. Patent 7,560,111 (Kao et al.).

«Вариант с С-концевым лизином» относится к варианту, содержащему остаток лизина (К) на С-конце его тяжелой цепи. Смотри патент США 7560111 (Као et al.).A "C-terminal lysine variant" refers to a variant having a lysine (K) residue at the C-terminal end of its heavy chain. See U.S. Patent 7,560,111 (Kao et al.).

«Вариант с окисленным метионином» относится к варианту, содержащему один или более окисленных остатков метионина, например, окисленный Met-254. Смотри патент США 7560111 (Као et al.).An "oxidized methionine variant" refers to a variant containing one or more oxidized methionine residues, for example, oxidized Met-254. See U.S. Patent 7,560,111 (Kao et al.).

Термин «злокачественное заболевание» относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественного заболевания в настоящем описании включают рак молочной железы (например, метастатический рак молочной железы), рак желудка (или живота), рак яичников, первичный перитонеальный рак и рак фаллопиевых труб. Примеры злокачественных заболеваний в настоящем описании включают HER2-позитивное злокачественное заболевание и злокачественное заболевание с низким уровнем HER3.The term "malignant disease" refers to a physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of malignant disease herein include breast cancer (eg, metastatic breast cancer), stomach (or abdominal) cancer, ovarian cancer, primary peritoneal cancer, and fallopian tube cancer. Examples of malignant diseases herein include HER2-positive malignant disease and malignant disease with low HER3 levels.

Злокачественная опухоль или биологический образец, который «демонстрирует экспрессию, амплификацию или активацию HER» представляет собой опухоль или образец, который в диагностическом тесте экспрессирует (в том числе, гиперэкспрессирует) рецептор HER, имеет амплифицированный ген HER и/или иным образом демонстрирует активацию или фосфорилирование рецептора HER.A malignant tumor or biological specimen that “demonstrates the expression, amplification or activation of HER” is a tumor or specimen that, in a diagnostic test, expresses (including overexpresses) the HER receptor, has an amplified HER gene, and / or otherwise demonstrates activation or phosphorylation the HER receptor.

«HER2-позитивная» злокачественная опухоль содержит злокачественные клетки, которые имеют более высокий уровень HER2 по сравнению с нормальными уровнями. Примеры HER2-позитивный злокачественной опухоли включают HER2-позитивный рак молочной железы и HER2-позитивный рак желудка. Способы идентификации HER2-позитивной злокачественной опухоли включают: исследования, в которых измеряют белок HER2, например, иммуногистохимический анализ (IHC), исследования, в которых определяют HER2-кодирующую нуклеиновую кислоту, например, гибридизация in situ (ISH), включая флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH; смотри WO 98/45479 опубликовано в октябре 1998) и хромогенную гибридизацию in situ (CISH; смотри, например, Tanner et al., Am. J. Pathol. 157(5): 1467-1472 (2000); Bella et al., J. Clin. Oncol. 26: (May 20 suppl; abstr 22147) (2008)), саузерн блоттинг или методики полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как количественная ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR); анализы слущивающегося антигена (например, HER2 ECD) (смотри, например, патент США 4933294, выданный 12 июня 1990; и патент США 5401638, выданный 28 марта 1995); и анализы in vivo. Необязательно, HER2-позитивная злокачественная опухоль имеет иммуногистохимический балл (IHC) 2+ или 3+ и/или амплификационное соотношение in situ гибридизации (ISH)≥2,0.A "HER2-positive" cancer contains cancer cells that have higher HER2 levels than normal levels. Examples of HER2-positive cancers include HER2-positive breast cancers and HER2-positive gastric cancers. Methods for identifying HER2-positive cancers include: assays that measure the HER2 protein, e.g. immunohistochemistry (IHC), studies that detect HER2-encoding nucleic acid, e.g., in situ hybridization (ISH), including fluorescent in situ hybridization (FISH; see WO 98/45479 published October 1998) and chromogenic in situ hybridization (CISH; see, for example, Tanner et al., Am. J. Pathol. 157 (5): 1467-1472 (2000); Bella et al., J. Clin. Oncol. 26: (May 20 suppl; abstr 22147) (2008)), Southern blotting, or polymerase chain reaction (PCR) techniques such as quantitative real-time PCR (qRT-PCR); exfoliating antigen assays (eg, HER2 ECD) (see, eg, US Pat. No. 4,933,294, issued June 12, 1990; and US Pat. No. 5,401,638, issued March 28, 1995); and in vivo assays. Optionally, the HER2-positive cancer has an immunohistochemical score (IHC) of 2+ or 3+ and / or an in situ hybridization amplification ratio (ISH) of ≥2.0.

Злокачественная опухоль с «низким уровнем HER3» содержит злокачественные клетки, которые имеют более низкие уровни HER3 по сравнению с нормальными уровнями. Примеры злокачественных опухолей с низким уровнем НЕR3 включают рак яичников, первичный перитонеальный рак и карциному фаллопиевых труб. Смотри, например, патент США 7981418 (Amler et al.). В одном варианте осуществления низкий уровень HER3 определяется на основании уровней экспрессии мРНК HER3 (соотношение концентраций равно или ниже 2,81, по данным qRT-PCR на приборе COBAS z480®).A “low HER3” malignant tumor contains malignant cells that have lower HER3 levels than normal levels. Examples of malignant tumors with low HER3 levels include ovarian cancer, primary peritoneal cancer, and fallopian tube carcinoma. See, for example, U.S. Patent 7,981,418 (Amler et al.). In one embodiment, a low HER3 level is determined based on HER3 mRNA expression levels (concentration ratio equal to or below 2.81 as measured by qRT-PCR on a COBAS z480® instrument).

«Эпитоп 2С4» представляет собой область во внеклеточном домене HER2, с которой связывается антитело 2С4. Для скрининга антител, которые связываются по существу с эпитопом 2С4, можно провести рутинное исследование перекрестного связывания, например, описанное в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Предпочтительно, антитело блокирует связывание 2С4 с HER2 примерно на 50% или более. Альтернативно, можно провести картирование эпитопа, чтобы оценить, связывается ли антитело преимущественно с 2С4 эпитопом HER2. Эпитоп 2С4 содержит остатки из субдомена II (SEQ ID NO: 2) во внеклеточном домене HER2. 2С4 и пертузумаб связываются с внеклеточным доменом HER2 в сочетании с субдоменами I, II и III (SEQ ID NOs: 1, 2 и 3, соответственно). Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)."Epitope 2C4" is the region in the extracellular domain of HER2 to which the 2C4 antibody binds. To screen for antibodies that bind substantially to the 2C4 epitope, a routine cross-linking assay can be performed, for example, as described in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Preferably, the antibody blocks the binding of 2C4 to HER2 by about 50% or more. Alternatively, epitope mapping can be performed to assess whether the antibody binds preferentially to the 2C4 epitope of HER2. Epitope 2C4 contains residues from subdomain II (SEQ ID NO: 2) in the extracellular domain of HER2. 2C4 and pertuzumab bind to the extracellular domain of HER2 in combination with subdomains I, II and III (SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively). Franklin et al. Cancer Cell 5: 317-328 (2004).

«Лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическому лечению и профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в лечении включают тех, кто уже страдает злокачественным заболеванием, а так же тех, у кого следует предотвратить злокачественное заболевание. Следовательно, у пациента, подлежащего лечению, в настоящем описании может быть диагностировано наличие злокачественного заболевания или пациент может быть предрасположен к злокачественному заболевании) или восприимчив к нему."Treatment" refers to both therapeutic treatment and prophylactic treatment and prophylactic or preventative measures. Those in need of treatment include those already suffering from cancer as well as those in whom cancer should be prevented. Therefore, the patient to be treated in the present description may be diagnosed as having a malignant disease, or the patient may be susceptible to or susceptible to malignant disease.

Термин «эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения злокачественного заболевания у пациента. Эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число злокачественных клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, останавливать) инфильтрацию злокачественных клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и, предпочтительно, останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, опухолевой рост; и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных со злокачественным заболеванием. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие злокачественные клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Эффективное количество может продлевать выживание без прогрессирования заболевания (например, по данным Критерия оценки ответа при солидных опухолях, RECIST, или изменения СА-125), в результате приводя к объективному ответу (включая частичный ответ, PR, или полный ответ, CR), увеличению времени общей выживаемости и/или облегчения одного или более симптомов злокачественного заболевания (например, по оценке FOSI).The term "effective amount" refers to the amount of a drug effective to treat cancer in a patient. An effective amount of a drug can reduce the number of malignant cells; reduce the size of the tumor; inhibit (i.e. slow down to some extent and preferably stop) the infiltration of malignant cells into peripheral organs; inhibit (i.e., slow to some extent and preferably stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and / or alleviate to some extent one or more symptoms associated with cancer. To the extent that the drug can prevent the growth and / or kill existing cancer cells, it can be cytostatic and / or cytotoxic. An effective amount may prolong progression-free survival (eg, as measured by the Solid Tumor Response Criteria, RECIST, or CA-125 change), resulting in an objective response (including partial response, PR, or complete response, CR), increased overall survival time and / or relief of one or more symptoms of the malignant disease (eg, as assessed by FOSI).

«Фиксированная» или «постоянная» доза терапевтического средства в настоящем описании относится к дозе, которую вводят человеку пациенту независимо от массы тела (WT) или площади поверхности тела (BSA) пациента. Фиксированную или постоянную дозу, следовательно, не представляют в виде дозы мг/кг или дозы мг/м2, а в виде абсолютного количества терапевтического средства.A "fixed" or "constant" dose of a therapeutic agent as used herein refers to a dose that is administered to a human patient regardless of the patient's body weight (WT) or body surface area (BSA). A fixed or constant dose is therefore not presented as a mg / kg dose or a mg / m 2 dose, but as an absolute amount of a therapeutic agent.

«Контейнер» относится к изделию, которое может быть использовано для хранения или содержания фармацевтической композиции или композиции. Примеры контейнеров в настоящем описании включают флакон, шприц, внутривенный мешок и так далее."Container" refers to an article that can be used to store or contain a pharmaceutical composition or composition. Examples of containers herein include vial, syringe, intravenous bag, and so on.

«Внутривенный мешок» или «ВВ мешок» представляет собой мешок, который может содержать раствор, который можно вводить через вену пациента. В одном варианте осуществления раствор представляет собой физиологический раствор (например, примерно 0,9% или примерно 0,45% NaCl). Необязательно, ВВ мешок получают из полиолефина или поливинилхлорида.An "intravenous bag" or "IV bag" is a bag that may contain a solution that can be administered through a vein in a patient. In one embodiment, the solution is saline (eg, about 0.9% or about 0.45% NaCl). Optionally, the BB bag is made from polyolefin or polyvinyl chloride.

«Флакон» представляет собой контейнер, подходящий для хранения жидкого или лиофилизированного препарата. В одном варианте осуществления флакон представляет собой одноразовый флакон, например, 20-сс одноразовый флакон с пробкой.A "vial" is a container suitable for storing a liquid or lyophilized preparation. In one embodiment, the vial is a disposable vial, for example a 20-cc single-use vial with a stopper.

«Лист-вкладыш» представляет собой информационный листок, который по требованию Управления по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств (FDA) или другого регулирующего органа, должен быть размещен внутри упаковки каждого лекарственного средства рецептурного отпуска. Информационный листок обычно включает товарный знак лекарственного средства, его непатентованное название и механизм действия; указывает показания, противопоказания, предупреждения, предостережения, побочные эффекты и лекарственные формы, и содержит инструкции в отношении рекомендованной дозы, времени и пути введения.A package insert is a leaflet that the Food and Drug Administration (FDA) or other regulatory agency requires to be placed inside the package of every prescription drug. The fact sheet usually includes the drug's trademark, generic name and mechanism of action; indicates indications, contraindications, warnings, warnings, side effects and dosage forms, and contains instructions regarding the recommended dose, time and route of administration.

«Фармацевтическая композиция» представляет собой композицию, содержащую фармацевтически активное лекарственное средство (например, пертузумаб и формы вариантов, например, те, которые описаны в настоящем изобретении) и один или более «фармацевтически активных эксципиентов» (например, буфер, стабилизатор, модификатор тоничности, консервант, поверхностно-активное вещество и так далее), которую можно безопасно вводить человеку пациенту. Такие композиции могут быть, например, жидкими или лиофилизированными.A "pharmaceutical composition" is a composition comprising a pharmaceutically active drug (e.g., pertuzumab and variant forms, e.g., those described in the present invention) and one or more "pharmaceutically active excipients" (e.g., buffer, stabilizer, tonicity modifier, preservative, surfactant, etc.) that can be safely administered to a human patient. Such compositions can be, for example, liquid or lyophilized.

«Рекомбинантный» белок представляет собой белок, который был продуцирован генетически модифицированной клеткой-хозяином, например, такой клеткой-хозяином, как ооцит китайского хомячка (СНО).A "recombinant" protein is a protein that has been produced by a genetically modified host cell, for example, a host cell such as Chinese hamster oocyte (CHO).

«Промышленный масштаб» относится к продукции белкового лекарственного средства (например, антитела) в коммерческом масштабе, например, 12000 литров (L) или более ç использованием промышленного способа, одобренного FDA или другим регулирующим органом."Industrial scale" refers to the production of a proteinaceous drug (eg, antibody) on a commercial scale, eg 12,000 liters (L) or more, using an industrial process approved by the FDA or other regulatory body.

«Очищение» относится к одной или более стадиям очистки, таким как хроматография с белком А, ионообменная хроматография, и так далее."Purification" refers to one or more purification steps such as protein A chromatography, ion exchange chromatography, and so on.

«Выделенный» вариант относится к варианту, который был отделен от антитела основных видов или антитела дикого типа с помощью одной или более методик очистки или аналитических способов. Такой выделенный вариант можно оценить на его биологическую активность и/или эффективность.An "isolated" variant refers to a variant that has been separated from a major species antibody or wild-type antibody by one or more purification or analytical methods. Such an isolated variant can be evaluated for its biological activity and / or effectiveness.

II. Композиции антителII. Antibody compositions

(i) Основные виды антител(i) Main types of antibodies

Антительные композиции в настоящем описании содержат антитело, которое связывается с HER2 (антитело к HER2), необязательно гуманизированное антитело к HER2. Гуманизированные антитела в настоящем описании, например, могут содержать остатки гипервариабельной области, не являющейся гипервариабельной областью антитела человека, встроенные в вариабельный домен тяжелой цепи анитела человека и могут дополнительно содержать замену в каркасной области (FR) в положении, выбранном из группы, состоящей из 69Н, 71H и 73Н, используя систему нумерации вариабельного домена, изложенную у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). В одном варианте осуществления гуманизированное антитело содержит замены FR в двух или во всех положениях 69Н, 71H и 73Н.The antibody compositions herein comprise an antibody that binds to HER2 (anti-HER2 antibody), optionally a humanized anti-HER2 antibody. Humanized antibodies herein, for example, may contain non-hypervariable region hypervariable region residues of a human antibody inserted into the variable domain of the heavy chain of a human antibody and may further comprise a framework region (FR) substitution at a position selected from the group consisting of 69H , 71H and 73H, using the variable domain numbering system set out in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). In one embodiment, the humanized antibody comprises FR substitutions at two or all of positions 69H, 71H, and 73H.

Приводимое в качестве примера гуманизированное антитело, представляющее интерес, в настоящем изобретении содержит остатки VH CDR:An exemplary humanized antibody of interest in the present invention contains VH CDR residues:

- GFTFTDYTMX (SEQ ID NO: 17), где X предпочтительно представляет собой D или S, например, GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 23) для CDR-H1;- GFTFTDYTMX (SEQ ID NO: 17), where X is preferably D or S, for example GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 23) for CDR-H1;

- DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 18) для CDR-H2; и/или- DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 18) for CDR-H2; and / or

- NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 19) для CDR-H3, необязательно содержащие аминокислотные модификации тех остатков CDR, например, в тех случаях, когда модификации по существу сохраняют или улучшают аффинность антитела. Например, вариант антитела для использования в способах по настоящему изобретению, может иметь примерно от одной примерно до семи или примерно пяти аминокислотных замен в указанных выше последовательностях CDR вариабельной области тяжелой цепи. Такие варианты антитела могут быть получены путем созревания аффинности, например, как описано ниже.- NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 19) for CDR-H3, optionally containing amino acid modifications of those CDR residues, for example, in cases where the modifications substantially retain or improve the affinity of the antibody. For example, a variant antibody for use in the methods of the present invention may have from about one to about seven or about five amino acid substitutions in the aforementioned heavy chain variable region CDR sequences. Such antibody variants can be obtained by affinity maturation, for example, as described below.

Гуманизированное антитело может содержать остатки VL CDR:A humanized antibody may contain VL CDR residues:

- KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 20) для CDR-L1;- KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 20) for CDR-L1;

- SASYX1X2X3, где X1 предпочтительно представляет собой R или L, X2 предпочтительно представляет собой Y или Е, и X3 предпочтительно представляет собой Τ или S (SEQ ID NO: 21), например, SASYRYT (SEQ ID NO: 24) для CDR-L2; и/или- SASYX 1 X 2 X 3 , where X 1 is preferably R or L, X 2 is preferably Y or E, and X 3 is preferably Τ or S (SEQ ID NO: 21), for example SASYRYT (SEQ ID NO: 24) for CDR-L2; and / or

- QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 22) для CDR-L3,- QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 22) for CDR-L3,

например, например, при добавлении к этим остаткам CDR вариабельного домена тяжелой цепи в предыдущем абзаце.for example, by adding to these residues the CDRs of the variable domain of the heavy chain in the previous paragraph.

Такие гуманизированные антитела необязательно содержат аминокислотные модификации указанных выше остатков CDR, например, в тех случаях, когда модификации по существу сохраняют или улучшают аффинность антитела. Например, вариант антитела, представляющий интерес, может иметь примерно от одной примерно до семи или примерно до пяти аминокислотных замен в указанных выше последовательностях CDR вариабельного домена легкой цепи. Такие варианты антитела могут быть получены путем созревания аффинности.Such humanized antibodies optionally contain amino acid modifications of the aforementioned CDR residues, for example, in cases where the modifications substantially preserve or improve the affinity of the antibody. For example, the antibody variant of interest may have from about one to about seven or about five amino acid substitutions in the above CDR sequences of the light chain variable domain. Such antibody variants can be obtained by affinity maturation.

В настоящей заявке также рассматриваются аффинно зрелые антитела, которые связываются с HER2. Исходное антитело может представлять собой антитело человека или гуманизированное антитело, например, антитело, содержащее последовательности SEQ ID NO. 7 и 8 вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи, соответственно (то есть, содержащее VL и/или VH пертузумаба). Аффинно зрелый вариант пертузумаба предпочтительно связывается с рецептором HER2 с аффинностью, превышающей аффинность мышиного 2С4 или пертузумаба (например, примерно от двух или примерно от четырех раз примерно до 100 раз или примерно до 1000 раз улучшенной аффинностью, например, по оценке с использованием HER2 ECD ELISA). Приводимые в качестве примера остатки CDR вариабельной области тяжелой цепи для замещения включают Н28, Н30, Н34, Н35, Н64, Н96, Н99 или сочетания двух или более (например, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи этих остатков). Примеры остатков CDR вариабельной области легкой цепи включают L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 или сочетания двух или более (например, от двух до трех, четырех, пяти или примерно вплоть до десяти таких остатков).This application also contemplates affinity matured antibodies that bind to HER2. The parent antibody can be a human antibody or a humanized antibody, for example, an antibody comprising the sequences of SEQ ID NO. 7 and 8 of the light chain variable region and / or the heavy chain variable region, respectively (i.e., containing the VL and / or VH of pertuzumab). The affinity matured variant of pertuzumab preferentially binds to the HER2 receptor with an affinity greater than that of murine 2C4 or pertuzumab (e.g., from about two or about four times to about 100 times or up to about 1000 times with improved affinity, for example, as evaluated using the HER2 ECD ELISA ). Exemplary heavy chain variable region CDRs for substitution include H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99, or combinations of two or more (eg, two, three, four, five, six or seven of these residues). Examples of light chain variable region CDR residues include L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97, or a combination of two or more (e.g., two to three, four, five, or up to about ten such residues ).

Рассматриваются различные формы гуманизированного антитела или аффинно зрелого антитела. Например, гуманизированное антитело или аффинно зрелое антитело. Альтернативно, гуманизированное антитело или аффинно зрелое антитело может представлять собой интактное антитело, такое как интактное антитело IgG1.Various forms of a humanized antibody or an affinity matured antibody are contemplated. For example, a humanized antibody or an affinity matured antibody. Alternatively, the humanized antibody or affinity matured antibody can be an intact antibody, such as an intact IgG1 antibody.

Предпочтительно, антитело к HER2 (любое из двух или оба антитела основных видов к HER2 и вариант антитела) представляет собой антитело, которое связывается с субдоменом II HER2, ингибирует димеризацию HER более эффективно, чем трастузумаб и/или связывается с гетеродимерным сайтом связывания HER2. Предпочтительный вариант осуществления основных видов антитела в настоящем описании представляет собой вариант, содержащий аминокислотные последовательности в SEQ ID No. 3 и 4 вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, и, наиболее предпочтительно, содержащее аминокислотную последовательность в SEQ ID No. 11 или 15 легкой цепи и аминокислотную последовательность в SEQ ID No. 12 или 16 тяжелой цепи.Preferably, an anti-HER2 antibody (either or both of the major anti-HER2 antibodies and an antibody variant) is an antibody that binds to subdomain II of HER2, inhibits HER dimerization more effectively than trastuzumab, and / or binds to the heterodimeric HER2 binding site. A preferred embodiment of the basic types of antibodies herein is a variant comprising the amino acid sequences in SEQ ID No. 3 and 4 of the light chain variable region and the heavy chain variable region, and most preferably comprising the amino acid sequence in SEQ ID No. 11 or 15 light chain and the amino acid sequence of SEQ ID No. 12 or 16 heavy chain.

(ii) Варианты с неспаренными цистеинами(ii) Variants with unpaired cysteines

В настоящем описании в примерах 1 и 3 описаны варианты пертузумаба с неспаренными цистеинами. Аналитические исследования по выделению, характеристике и количественной оценке таких вариантов включают исследования, в которых специфически определяют внутрицепочечные дисульфидные связи (как отличные от межцепочечных дисульфидных связей), например, хроматографический анализ гидрофобных взаимодействий (HIC) фрагментов антитела (например, Fab фрагмента) как в примере 1, HIC интактного антитела как в примере 1, анализ пептидного картирования дифференциально меченых антител как в примере 3, и/или высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (RP-HPLC) как в примере 3 в настоящем описании и у Zhang et al. Anal. Chem. 84(16):7112-7123 (2012).In the present description, examples 1 and 3 describe variants of pertuzumab with unpaired cysteines. Analytical studies to isolate, characterize and quantify such variants include studies that specifically identify intrachain disulfide bonds (as distinct from interchain disulfide bonds), for example, hydrophobic interaction chromatographic analysis (HIC) of antibody fragments (e.g. Fab fragment) as in Example 1, HIC of an intact antibody as in example 1, peptide mapping analysis of differentially labeled antibodies as in example 3, and / or reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) as in example 3 herein and in Zhang et al. Anal. Chem. 84 (16): 7112-7123 (2012).

В основном, преобладающая форма пертузумаба содержит дисульфидную связь между Cys23 и Cys88 в обоих VL доменах двух его доменов Fab. Смотри фиг. 6.Basically, the predominant form of pertuzumab contains a disulfide bond between Cys23 and Cys88 in both VL domains of its two Fab domains. See FIG. 6.

Один вариант с неспаренными цистеинами в настоящем описании, гетеродимерный вариант, лишен дисульфидной связи Cys23/Cys88 в вариабельном домене легкой цепи (VL) только одной из двух его областей Fab. Смотри Фиг. 20(b). Было определено, что это является преобладающим вариантом с неспаренными цистеинами.One variant with unpaired cysteines herein, a heterodimeric variant, lacks the Cys23 / Cys88 disulfide bond in the variable light chain (VL) domain of only one of its two Fab regions. See FIG. 20 (b). This was determined to be the predominant variant with unpaired cysteines.

В настоящем описании дополнительный вариант с неспаренными цистеинами, гомодимерный вариант, лишен дисульфидных связей Cys23/Cys88 в обеих областях Fab. Смотри Фиг. 20(c).In the present description, an additional variant with unpaired cysteines, a homodimeric variant, lacks the Cys23 / Cys88 disulfide bonds in both regions of the Fab. See FIG. 20 (c).

В одном варианте осуществления содержание варианта с неспаренными цистеинами в композиции (включая гомодимерный и гетеродимерный вариант) составляет ≤ примерно 25%, например, по данным хроматографии Fab с гидрофобным взаимодействием (HIC).In one embodiment, the content of the unpaired cysteine variant in the composition (including the homodimeric and heterodimeric variant) is ≤ about 25%, for example, as determined by hydrophobic interaction Fab chromatography (HIC).

В одном варианте осуществления содержание гомодимерного варианта в композиции составляет ≤4,9%) по данным HIC интактного антитела.In one embodiment, the content of the homodimeric variant in the composition is <4.9%) as determined by the HIC of the intact antibody.

В одном варианте осуществления содержание гетеродимерного варианта в композиции составляет примерно от 13% примерно до 18%, например, по данным HIC интактного антитела.In one embodiment, the content of the heterodimeric variant in the composition is from about 13% to about 18%, for example, as measured by the HIC of an intact antibody.

Композиция необязательно дополнительно содержит один или более дополнительных вариантов, как описано ниже.The composition optionally further comprises one or more additional options, as described below.

Настоящее изобретение также относится к выделенному варианту с неспаренными цистеинами пертузумаба, где вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба. Такой выделенный вариант с неспаренными цистеинами может содержать или состоять из гетеродимерного варианта и/или гомодимерного варианта. Такие варианты могут быть выделены с использованием HIC или других способов очистки, и могут подвергаться биологическому анализу, такому как анализ эффективности (используя HER2-позитивные клетки злокачественной опухоли молочной железы) как в примере 1, приведенном ниже.The present invention also provides an isolated unpaired cysteine variant of pertuzumab, wherein the unpaired cysteine variant comprises Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both of the variable domains of the pertuzumab light chain. Such an isolated variant with unpaired cysteines may comprise or consist of a heterodimeric variant and / or a homodimeric variant. Such variants can be isolated using HIC or other purification methods, and can be subjected to biological analysis, such as efficacy analysis (using HER2-positive breast cancer cells) as in Example 1 below.

(iii) Вариант, лишенный фукозы(iii) Fucose-free variant

В настоящем описании в примерах 2 и 4 описаны варианты пертузумаба, лишенные фукозы, и продемонстрировано, как определить ADCC активность, исходя из процента пертузумаба, лишенного фукозы, в композиции.In the present description, examples 2 and 4 describe variants of pertuzumab lacking fucose, and demonstrate how to determine ADCC activity based on the percentage of pertuzumab lacking fucose in the composition.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, составляет более 2% композиции. Смотри, например, анти2С4907-2, и Серию 1 в таблице 9, приведенной ниже.In one embodiment, the present invention relates to a composition comprising pertuzumab and a fucose-free variant of pertuzumab, wherein the amount of the fucose-free variant is greater than 2% of the composition. See, for example, anti2C4907-2, and Series 1 in Table 9 below.

В альтернативном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей пертузумаб и вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, составляет от 0,9 до 4,1% композиции. Это количество варианта, лишенного фукозы, может, например, быть определено количественно, используя утвержденный анализ CE-LIF в примере 4.In an alternative embodiment, the present invention relates to a composition comprising pertuzumab and a fucose-free variant of pertuzumab, wherein the amount of the fucose-free variant is from 0.9 to 4.1% of the composition. This amount of a variant lacking fucose can, for example, be quantified using the validated CE-LIF assay in Example 4.

Необязательно, композиция дополнительно содержит варианты с неспаренными цистеинами (гетеродимер и/или гомодимер, как описано в предыдущем разделе) и/или дополнительные варианты, описанные ниже.Optionally, the composition further comprises unpaired cysteine variants (heterodimer and / or homodimer as described in the previous section) and / or additional variants described below.

(iv) LMWS и HMWS(iv) LMWS and HMWS

Настоящее изобретение дополнительно относится к разновидностям пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS) и/или разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS) либо в выделенной форме, либо в композиции, содержащей такой вариант(ы) и основные виды антитела. LMWS и HMWS могут быть выделены, охарактеризованы и количественно проанализированы с использованием различных методик, включающих, без ограничения, эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (SE-HPLC) и/или капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS).The present invention further relates to low molecular weight species of pertuzumab (LMWS) and / or a species of high molecular weight pertuzumab (HMWS), either in isolated form or in a composition containing such variant (s) and major antibody species. LMWS and HMWS can be isolated, characterized and quantified using a variety of techniques including, but not limited to, size exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) and / or sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis (CE-SDS).

Используя SE-HPLC анализ (например, как в примере 5), количество основных видов пертузумаба и HMWS или LMWS в композиции может составлять:Using SE-HPLC analysis (for example, as in example 5), the number of main types of pertuzumab and HMWS or LMWS in the composition can be:

Основной пик: ≥ примерно 96%, например ≥ примерно 96,7%, ≥ примерно 97,3%, например ≥ примерно 97,4%.Main peak: ≥ approximately 96%, eg ≥ approximately 96.7%, ≥ approximately 97.3%, eg ≥ approximately 97.4%.

HMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,7%, например ≤ примерно 1,5%, например ≤ примерно 1,4%, например ≤ примерно 0,8%).HMWS: ≤ approximately 2%, for example ≤ approximately 1.7%, for example ≤ approximately 1.5%, for example ≤ approximately 1.4%, for example ≤ approximately 0.8%).

LMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,6%, например ≤ примерно 1,2%, например ≤ примерно 0,6%.LMWS: ≤ approximately 2%, for example ≤ approximately 1.6%, for example ≤ approximately 1.2%, for example ≤ approximately 0.6%.

Используя NR-CE-SDS анализ (например, как в примере 5), количество основных видов пертузумаба и HMWS или LMWS в композиции может составлять:Using NR-CE-SDS analysis (for example, as in example 5), the number of main types of pertuzumab and HMWS or LMWS in the composition can be:

Основной пик: ≥ примерно 95%, например ≥ примерно 96,0%, например ≥ примерно 97,8%)Major peak: ≥ about 95%, for example, ≥ about 96.0%, for example ≥ about 97.8%)

HMWS: ≤ примерно 1%, например ≤ примерно 0,6%).HMWS: ≤ approximately 1%, for example ≤ approximately 0.6%).

LMWS: ≤ примерно 4%, например ≤ примерно 3,4%.LMWS: ≤ approximately 4%, for example ≤ approximately 3.4%.

Например, величина основного пика или количество основных видов пертузумаба (за исключением LMWS и HMWS) по данным CE-SDS может составлять примерно от 95% примерно до 99%, например, примерно от 96,0% примерно до 97,8%, например, примерно от 95,3% примерно до 97,3% основного пика.For example, the magnitude of the main peak or the number of major species of pertuzumab (excluding LMWS and HMWS) according to CE-SDS can be from about 95% to about 99%, for example, from about 96.0% to about 97.8%, for example, from about 95.3% to about 97.3% of the main peak.

Необязательно, LMWS содержит или состоит из «Пика 6», полученного с использованием NR-CE-SDS (смотри, например, пример 5). Определено, что такой Пик 6 может составлять примерно от 0,9% примерно до 2,3%, например, примерно от 2% примерно до 2,3% композиции.Optionally, the LMWS contains or consists of "Peak 6" obtained using NR-CE-SDS (see, for example, example 5). It has been determined that such Peak 6 may comprise from about 0.9% to about 2.3%, for example, from about 2% to about 2.3% of the composition.

(v) Фрагменты пертузумаба Пик 1 и Пик 2(v) Pertuzumab fragments Peak 1 and Peak 2

Настоящее изобретение дополнительно относится к фрагменту (фрагментам) пертузумаба Пик 1 и/или фрагментам пертузумаба Пик 2 либо в отдельной, либо выделенной форме или в композициях, содержащих эти фрагмент(ы) и основные виды антитела. Пик 1 и Пик 2 могут быть выделены, охарактеризованы и количественно проанализированы с использованием различных способов, включающих, без ограничения, эксклюзионную высокоэффективную жидкостную хроматографию (SE-HPLC) и/или капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS), включая R-CE-SDS и NR-CE-SDS. В одном варианте осуществления Пик 1 и Пик 2 разделены и/или проанализированы с использованием R-CE-SDS, например, как описано в примерах 5 и 6 и скорректированная площадь пика (CPA) дает % Пика 1 или Пика 2 в композиции.The present invention further relates to the fragment (s) of pertuzumab Peak 1 and / or fragments of pertuzumab Peak 2, either in a single or isolated form or in compositions containing these fragment (s) and the main types of antibodies. Peak 1 and Peak 2 can be isolated, characterized and quantified using a variety of techniques including, but not limited to, size exclusion high performance liquid chromatography (SE-HPLC) and / or sodium dodecyl sulfate capillary electrophoresis (CE-SDS), including R-CE -SDS and NR-CE-SDS. In one embodiment, Peak 1 and Peak 2 are separated and / or analyzed using R-CE-SDS, for example, as described in examples 5 and 6, and the corrected peak area (CPA) gives the% Peak 1 or Peak 2 in the composition.

Используя R-CE-SDS анализ (например, как в примерах 5 и 6), количество Пика 1 в композиции составляет ≤5% (например, от 0,13% до 0,41%) CPA), а количество Пика 2 в композиции составляет ≤1,0% (например, от 0,47% до 0,74% CPA).Using R-CE-SDS analysis (for example, as in examples 5 and 6), the amount of Peak 1 in the composition is ≤5% (for example, from 0.13% to 0.41%) CPA), and the amount of Peak 2 in the composition is ≤1.0% (for example, from 0.47% to 0.74% CPA).

(vi) Дополнительные варианты(vi) Additional options

Композиции по настоящему изобретению необязательно содержат дополнительные варианты пертузумаба, например, описанные в патенте США 7560111 (Као et al.) и/или в WO 2009/099829 (Harris et al.).The compositions of the present invention optionally contain additional variants of pertuzumab, such as those described in US Pat. No. 7,560,111 (Kao et al.) And / or WO 2009/099829 (Harris et al.).

Примеры таких дополнительных вариантов включают, без ограничения, любой один вариант или более: гликозилированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, невосстанавливаемый вариант, дезамидированный вариант, сиалилированный вариант, VHS-вариант, вариант с С-концевым лизином, вариант с окисленным метионином, вариант, лишенный фукозы, вариант гликозилирования G1, вариант гликозилирования G2 и вариант с негликозилированной тяжелой цепью.Examples of such additional variants include, but are not limited to, any one or more of: glycosylated variant, reduced disulfide variant, non-reducible variant, deamidated variant, sialylated variant, VHS variant, C-terminal lysine variant, oxidized methionine variant, variant, lacking fucose, G1 glycosylation variant, G2 glycosylation variant and non-glycosylated heavy chain variant.

Например, композиция может содержать кислые варианты (смотри WO 2009/099829, Harris et al.), где кислые варианты в композиции могут включать один, два, три, четыре или пять из следующего: гликозилированный вариант, дезамидированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, сиалилированный вариант и невосстанавливаемый вариант. Предпочтительно, общее количество всех кислых вариантов в композиции составляет примерно менее 25%. В одном варианте осуществления гликозилированный вариант, дезамидированный вариант, вариант с восстановленным дисульфидом, сиалилированный вариант и невосстанавливаемый вариант составляют по меньшей мере примерно 75-80% кислых вариантов в композиции.For example, the composition can contain acidic variants (see WO 2009/099829, Harris et al.), Where acidic variants in the composition can include one, two, three, four or five of the following: glycosylated variant, deamidated variant, reduced disulfide variant, sialylated variant and non-recoverable variant. Preferably, the total amount of all acidic variants in the composition is less than about 25%. In one embodiment, the glycosylated variant, deamidated variant, reduced disulfide variant, sialylated variant, and non-reducible variant comprise at least about 75-80% of the acidic variants in the composition.

Кислые варианты могут быть исследованы целым рядом способов, но. предпочтительно, такие способы включают один, два, три, четыре или пять из следующего: ионообменную хроматографию (IEC), при которой композицию обрабатывают сиалидазой до, после и/или во время EEC (например, для определения сиалилированного варианта), CE-SDS в редуцирующих условиях (например, для определения варианта с восстановленным дисульфидом), CE-SDS в нередуцирующих условиях (например, для определения невосстанавливаемого варианта), боронатную хроматографию (например, для определения гликозилированного варианта) и пептидное картирование (например, для определения дезамидированного варианта).Sour options can be explored in a number of ways, but. preferably, such methods include one, two, three, four, or five of the following: ion exchange chromatography (IEC), in which the composition is treated with sialidase before, after and / or during EEC (for example, to determine the sialylated variant), CE-SDS in reducing conditions (for example, to determine the variant with reduced disulfide), CE-SDS under non-reducing conditions (for example, to determine the non-reducible variant), boronate chromatography (for example, to determine the glycosylated variant) and peptide mapping (for example, to determine the deamidated variant).

Композиция необязательно включает вариант с аминоконцевым лидерным удлинением. Предпочтительно, аминоконцевое лидерное удлинение представляет собой вариант легкой цепи антитела (например, на одной или двух легких цепях варианта антитела). Вариант антитела по настоящему изобретению может содержать аминоконцевое лидерное удлинение на любой одной или более его тяжелой или легкой цепи. Предпочтительно, аминоконцевое лидерное удлинение находится на одной или двух легких цепях антитела. Аминоконцевое лидерное удлинение, предпочтительно, содержит или состоит из VHS- (то есть VHS-вариант). Присутствие аминоконцевого лидерного удлинения в композиции можно обнаружить с помощью различных аналитических способов, включающих, но не ограничивающихся указанными, анализ N-концевой последовательности, анализ неоднородности заряда (например, катионообменная хроматография или капиллярно-зональный электрофорез), масс-спектрометрию, и так далее. Количество варианта антитела в композиции в основном находится в интервале от количества, которое составляет нижний предел обнаружения любого анализа (предпочтительно, катионообменного анализа), используемого для обнаружения этого варианта, до количества, меньшего, чем количество основных видов антитела. В основном, примерно 20% или менее (например, примерно от 1% примерно до 15%), например, от 5% примерно до 15%, и, предпочтительно, примерно от 8% примерно до 12%) молекул антитела в композиции содержат аминоконцевое лидерное удлинение. Такие процентные значения предпочтительно определяют, используя катионообменный анализ.The composition optionally includes a variant with an amino-terminal leader extension. Preferably, the amino-terminal leader extension is an antibody light chain variant (eg, on one or two light chains of an antibody variant). An antibody variant of the present invention may contain an amino-terminal leader extension on any one or more of its heavy or light chains. Preferably, the amino-terminal leader extension is on one or two light chains of the antibody. The amino-terminal leader extension preferably comprises or consists of VHS (i.e., VHS variant). The presence of an amino-terminal leader extension in a composition can be detected by various analytical methods including, but not limited to, N-terminal sequence analysis, charge heterogeneity analysis (e.g., cation exchange chromatography or capillary zone electrophoresis), mass spectrometry, and so on. The amount of an antibody variant in the composition generally ranges from an amount that is the lower limit of detection of any assay (preferably a cation exchange assay) used to detect that variant to less than the basic antibody species. Generally, about 20% or less (e.g., about 1% to about 15%), e.g., 5% to about 15%, and preferably about 8% to about 12%), of the antibody molecules in the composition comprise an amino terminal leader lengthening. Such percentages are preferably determined using cation exchange analysis.

Рассматриваются дополнительные изменения аминокислотной последовательности основных видов антитела и/или варианта, в том числе, но не только, антитело, содержащее С-концевой остаток лизина на одной или обеих тяжелых цепях (например, такой вариант антитела может находиться в количестве примерно от 1% примерно до 20%), антитело с одним или более окисленными остатками метионина (например, пертузумаб, содержащий окисленный Met-254), и так далее.Additional alterations in the amino acid sequence of the main antibody species and / or variant are contemplated, including, but not limited to, an antibody containing a C-terminal lysine residue on one or both heavy chains (for example, such an antibody variant may be in an amount of about 1% up to 20%), an antibody with one or more oxidized methionine residues (for example, pertuzumab containing oxidized Met-254), and so on.

Кроме того, помимо варианта, лишенного фукозы, и сиалилированного варианта, рассмотренного выше, основные виды антитела или вариант могут содержать дополнительные варианты гликозилирования, неограничивающие примеры которых включают антитело, содержащее G1 или G2 олигосахаридную структуру, присоединенную к его Fc области, антитело, содержащее одну или две негликозилированные тяжелые цепи, и так далее.In addition, in addition to the variant lacking fucose and the sialylated variant discussed above, the main types of antibodies or the variant may contain additional variants of glycosylation, non-limiting examples of which include an antibody containing a G1 or G2 oligosaccharide structure attached to its Fc region, an antibody containing one or two non-glycosylated heavy chains, and so on.

III. Способы получения и анализаIII. Methods of obtaining and analysis

В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения предложен способ оценки композиции пертузумаба, который включает одно, два, три или четыре из следующего: (1) измерение количества варианта с неспаренными цистеинами в композиции, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба, и/или (2) измерение количества пертузумаба, лишенного фукозы, в композиции, и/или (3) измерение количества разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS) в композиции, и/или (4) измерение количества разновидностей пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS) в композиции. Необязательно, все четыре аналитических исследования проводят в отношении композиции, содержащей пертузумаб и его варианты.In accordance with one embodiment of the present invention, there is provided a method for evaluating a pertuzumab composition that comprises one, two, three, or four of the following: (1) measuring the amount of an unpaired cysteine variant in a composition, wherein said unpaired cysteine variant comprises Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both of the light chain variable domains of pertuzumab, and / or (2) measuring the amount of fucose-free pertuzumab in the composition, and / or (3) measuring the amount of low molecular weight species of pertuzumab (LMWS) in the composition, and / or ( 4) measuring the number of high molecular weight species of pertuzumab (HMWS) in the composition. Optionally, all four analyzes are performed on a composition containing pertuzumab and variants thereof.

Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, включающему: (1) получение композиции, содержащей пертузумаб и один или более его вариантов и (2) проведение одного или более аналитических исследований полученной таким образом композиции для определения в ней количества вариантов. В аналитическом исследовании (исследованиях) можно определить и измерить количество одного, или более из следующего: (i) варианта с неспаренными цистеинами, содержащего Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и/или (ii) гетеродимерного варианта, содержащего Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба и/или (iii) гомодимерного варианта, содержащего Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и/или (iv) варианта пертузумаба, лишенного фукозы и/или (v) разновидностей пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS) и/или (vi) разновидностей пертузумаба с низкой молекулярной массой (LMWS), и/или (vii) фрагмента(ов) пертузумаба Пика 1 и/или (viii) фрагмента(ов) пертузумаба Пика 2. Таким образом, можно проанализировать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь таких вариантов.The present invention also relates to a method for preparing a composition comprising: (1) preparing a composition containing pertuzumab and one or more variants thereof, and (2) conducting one or more analytical studies of the composition thus obtained to determine the number of variants therein. In analytical study (s), one or more of the following can be determined and quantified: (i) an unpaired cysteine variant containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both of the variable domains of the light chain of pertuzumab and / or (ii) a heterodimeric variant, containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in only one variable domain of the light chain of pertuzumab and / or (iii) a homodimeric variant containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in both variable domains of the light chain of pertuzumab and / or (iv) a variant of pertuzumab lacking fucose and / or (v) high molecular weight pertuzumab species (HMWS) and / or (vi) low molecular weight pertuzumab species (LMWS), and / or (vii) pertuzumab Peak 1 fragment (s) and / or (viii) fragment (s) ) pertuzumab Pick 2. Thus, one, two, three, four, five, six, seven, or eight of these options can be analyzed.

Необязательно, в аналитическом исследовании оценивается, определяется количество или выделяется вариант с неспаренными цистеинами, в том числе, гетеродимерные и/или гомодимерные варианты. Например, аналитическое исследование может включать хроматографию гидрофобных взаимодействий (HIC) фрагмента антитела (например, Fab фрагмента) или интактного антитела (смотри, например, пример 1), пептидное картирование (смотри, например, пример 3), или высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (HPLC) (смотри, например, пример 3).Optionally, an analytical study evaluates, quantifies, or isolates a variant with unpaired cysteines, including heterodimeric and / or homodimeric variants. For example, an analytical study can include hydrophobic interaction chromatography (HIC) of an antibody fragment (e.g., Fab fragment) or intact antibody (see, e.g., Example 1), peptide mapping (see, e.g., Example 3), or reverse phase high performance liquid chromatography. (HPLC) (see, for example, example 3).

В одном варианте осуществления количество варианта с неспаренными цистеинами (гетеродимерный и/или гомодимерный вариант) в композиции составляет ≤ примерно 25% по данным хроматографии Fab с гидрофобным взаимодействием (HIC).In one embodiment, the amount of unpaired cysteine variant (heterodimeric and / or homodimeric variant) in the composition is ≤ about 25% as determined by hydrophobic interaction Fab chromatography (HIC).

В одном варианте осуществления количество гомодимерного варианта в композиции составляет ≤4,9% по данным хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.In one embodiment, the amount of homodimeric variant in the composition is 4.9% as determined by hydrophobic interaction chromatography (HIC) of an intact antibody.

В одном варианте осуществления количество гетеродимерного варианта в композиции составляет примерно от 13% примерно до 18% по данным хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.In one embodiment, the amount of heterodimeric variant in the composition is from about 13% to about 18% as determined by hydrophobic interaction chromatography (HIC) of an intact antibody.

Необязательно, в аналитическом исследовании оценивается, определяется количество или выделяется вариант, лишенный фукозы. Величина дефукозилирования может быть использована для определения или количественной оценки биологической активности композиции, например ADCC.Optionally, the scoping study evaluates, quantifies, or highlights a fucose-free variant. The amount of defucosylation can be used to determine or quantify the biological activity of a composition, for example ADCC.

Кроме того, этот способ включает оценку биологической активности композиции пертузумаба, включающую измерение в композиции количества варианта пертузумаба, лишенного фукозы, для определения антителозависимой клеточной цитотоксичной (ADCC) активности композиции, и подтверждение того, что количество пертузумаба, лишенного фукозы, находится в диапазоне примерно от 0,9% примерно до 4,1%. Например, этот способ включает измерение количества пертузумаба, лишенного фукозы, используя капиллярный электрофорез с лазерно-индуцированной флуоресценцией (CE-LIF).In addition, this method includes evaluating the biological activity of the pertuzumab composition, comprising measuring the amount of the fucose-free pertuzumab variant in the composition to determine the antibody-dependent cellular cytotoxic (ADCC) activity of the composition, and confirming that the amount of fucose-free pertuzumab is in the range of about 0.9% to about 4.1%. For example, the method includes measuring the amount of pertuzumab lacking fucose using laser-induced fluorescence capillary electrophoresis (CE-LIF).

Необязательно, аналитическим исследованием для оценки величины дефукозилирования является капиллярный электрофорез (СЕ), в том числе, капиллярный электрофорез с лазерно-индуцированной флуоресценцией (CE-LIF), смотри, примеры 2 и 4, представленные ниже. Количество варианта, лишенного фукозы, необязательно составляет примерно от 0,9 примерно до 4,1% композиции (например, по данным CE-LIF в примере 4). В одном варианте осуществления количество варианта, лишенного фукозы, превышает 2% композиции (например, по данным CE-LIF в примере 4).Optionally, an analytical study to evaluate the amount of defucosylation is capillary electrophoresis (CE), including laser-induced fluorescence capillary electrophoresis (CE-LIF), see examples 2 and 4 below. Optionally, the amount of variant lacking fucose is from about 0.9 to about 4.1% of the composition (eg, as measured by CE-LIF in Example 4). In one embodiment, the amount of the variant lacking fucose is greater than 2% of the composition (eg, as measured by CE-LIF in Example 4).

Необязательно, в аналитическом исследовании оценивается, определяется количество или выделяются разновидности с низкой молекулярной массой (LMWS) и/или разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS). Приводимые в качестве примерз исследования включают SE-HPLC и/или CE-SDS (смотри, например, пример 5, приведенный ниже).Optionally, an analytical study evaluates, quantifies, or isolates low molecular weight species (LMWS) and / or high molecular weight species pertuzumab (HMWS). Examples of studies include SE-HPLC and / or CE-SDS (see, for example, Example 5 below).

В одном варианте осуществления аналитическое исследование включает SE-HPLC (например, как в примере 5), и количество основных видов пертузумаба, HMWS или LMWS в композиции, проанализированной таким образом, составляет:In one embodiment, the assay comprises SE-HPLC (e.g., as in Example 5) and the number of major pertuzumab, HMWS, or LMWS species in the composition so assayed is:

Основной пик: ≥ примерно 96%, например ≥ примерно 96,7%, ≥ примерно 97,3%, например ≥ примерно 97,4%Main peak: ≥ approximately 96%, eg ≥ approximately 96.7%, ≥ approximately 97.3%, eg ≥ approximately 97.4%

HMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,7%), например, ≤ примерно 1,5%, например ≤ примерно 1,4%, например ≤ примерно 0,8%.HMWS: ≤ approximately 2%, for example ≤ approximately 1.7%), for example, ≤ approximately 1.5%, for example ≤ approximately 1.4%, for example ≤ approximately 0.8%.

LMWS: ≤ примерно 2%, например ≤ примерно 1,6%, например ≤ примерно 1,2%, например ≤ примерно 0,6%.LMWS: ≤ approximately 2%, for example ≤ approximately 1.6%, for example ≤ approximately 1.2%, for example ≤ approximately 0.6%.

В одном варианте осуществления аналитическое исследование включает CE-SDS (например, как в примере 5), и количество основных видов пертузумаба и HMWS или LMWS пертузумаба в композиции проанализированной таким образом, составляет: In one embodiment, the assay comprises CE-SDS (e.g., as in Example 5), and the number of major pertuzumab species and HMWS or LMWS pertuzumab in the composition so assayed is:

Основной пик: ≥ примерно 95%, например ≥ примерно 96,0%, например ≥ примерно 97,8%Main peak: ≥ about 95%, for example, ≥ about 96.0%, for example, ≥ about 97.8%

HMWS: ≤ примерно 1%, например ≤ примерно 0,6%. HMWS: ≤ about 1%, for example ≤ about 0.6%.

LMWS: ≤ примерно 4%, например ≤ примерно 3,4%.LMWS: ≤ approximately 4%, for example ≤ approximately 3.4%.

В одном варианте осуществления композицию анализируют, используя NR-CE-SDS, и величина основного пика или количество основных видов пертузумаба (за исключением LMWS и HMWS) составляет примерно от 95% примерно до 99%, например, примерно от 96,0% примерно до 97,8%, например примерно от 95,3% примерно до 97,3%) композиции, проанализированной таким образом.In one embodiment, the composition is analyzed using NR-CE-SDS and the main peak or major species of pertuzumab (excluding LMWS and HMWS) is from about 95% to about 99%, such as from about 96.0% to about 97.8%, for example from about 95.3% to about 97.3%) of the composition analyzed in this way.

В одном варианте осуществления величина «Пика 6» в композиции определяется с помощью CE-SDS (смотри, например, пример 5), и величина Пика 6 LMWS составляет примерно от 0,9% примерно до 2,3%, например, примерно от 2% примерно до 2,3% композиции, проанализированной таким образом.In one embodiment, the Peak 6 value in the composition is determined by the CE-SDS (see, for example, Example 5) and the LMWS Peak 6 value is from about 0.9% to about 2.3%, for example from about 2 % to about 2.3% of the composition analyzed in this way.

В одном варианте осуществления величину Пика 1 и/или Пика 2 в композиции определяют с помощью R-CE-SDS (смотри, например, примеры 5 и 6), и количество Пика 1 составляет ≤5% (например, от 0,13%) до 0,41%) CPA) и количество Пика 2 составляет ≤1,0% (например, от 0,47% до 0,74% CPA).In one embodiment, the Peak 1 and / or Peak 2 value in the composition is determined using R-CE-SDS (see, for example, examples 5 and 6), and the amount of Peak 1 is 5% (for example, from 0.13%) up to 0.41%) CPA) and the amount of Peak 2 is ≤1.0% (for example, from 0.47% to 0.74% CPA).

Эти способы необязательно дополнительно включают объединение очищенной композиции с одним или более фармацевтически приемлемыми эксципиентами для получения фармацевтической композиции. Кроме того, фармацевтическая композиция может быть помещена в контейнер, который упакован вместе с листком-вкладышем (например, с инструкциями по медицинскому применению препарата, информирующими пользователя о применении данной фармацевтической композиции для лечения злокачественного заболевания), таким образом, чтобы получить изделие.These methods optionally further comprise combining the purified composition with one or more pharmaceutically acceptable excipients to prepare a pharmaceutical composition. In addition, the pharmaceutical composition can be placed in a container that is packaged together with a package insert (for example, with instructions for medical use of the preparation informing the user about the use of this pharmaceutical composition for the treatment of cancer), so as to obtain a product.

IV. Фармацевтические композицииIV. Pharmaceutical compositions

Фармацевтические композиции, содержащие пертузумаб и его варианты, получают для хранения путем смешивания этой композиции, имеющей желаемую степень чистоты, с произвольными фармацевтически приемлемыми эксципиентами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в основном в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Также рассматриваются кристаллы антител (смотри патентную заявку США 2002/0136719). Фармацевтически приемлемые эксципиенты являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают буферы, такие как гистидинацетат; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; полипептиды с низкой молекулярной массой (примерно менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе, глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества такие как полисорбаты (например, полисорбат 20 или 80), PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).Pharmaceutical compositions containing pertuzumab and its variants are prepared for storage by mixing this composition having the desired degree of purity with arbitrary pharmaceutically acceptable excipients (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), generally in the form of lyophilized formulations or aqueous solutions. Antibody crystals are also contemplated (see US patent application 2002/0136719). Pharmaceutically acceptable excipients are non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed, and include buffers such as histidine acetate; antioxidants including ascorbic acid and methionine; low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues); proteins such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose, or sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg Zn-protein complexes); and / or nonionic surfactants such as polysorbates (eg polysorbate 20 or 80), PLURONICS ™ or polyethylene glycol (PEG).

Лиофилизированные составы антител описаны в патенте США 6267958, в патенте США 6685940 и в патенте США 6821515, специально включенных в настоящее описание посредством ссылки. Приводимая в качестве примера фармацевтическая композиция трастузумаба представляет собой стерильный лиофилизированный порошок без консервантов, от белого до бледно-желтого цвета, для внутривенного (ВВ) введения, содержащий 440 мг трастузумаба, 400 мг дегидрата α,α-трегалозы, 9,9 мг L-гистидин-HCl, 6,4 мг L-гистидина и 1,8 мг полисорбата 20. Разведение 20 мл бактериостатической воды для инъекции (BWH). содержащей 1,1% бензилового спирта в качестве консерванта, дает в результате раствор многократных доз, содержащий 21 мг/мл трастузумаба с рН приблизительно 6,0.Lyophilized antibody formulations are described in US Pat. No. 6,267,958, US Pat. No. 6,685,940 and US Pat. No. 6,821,515, which are specifically incorporated by reference herein. An exemplary pharmaceutical composition of trastuzumab is a sterile, preservative-free, lyophilized powder, white to pale yellow, for intravenous (IV) administration, containing 440 mg of trastuzumab, 400 mg of α, α-trehalose dehydrate, 9.9 mg of L- histidine-HCl, 6.4 mg L-histidine and 1.8 mg polysorbate 20. Dilution with 20 ml of bacteriostatic water for injection (BWH). containing 1.1% benzyl alcohol as a preservative, results in a multiple dose solution containing 21 mg / ml trastuzumab with a pH of about 6.0.

Приводимая в качестве примера фармацевтическая композиция пертузумаба для терапевтического применения содержит 30 мг/мл пертузумаба в 20 мМ гистидинацетате, 120 мМ сахарозы, 0,02% полисорбата 20, с рН 6,0. Альтернативный состав пертузумаба содержит 25 мг/мл пертузумаба, 10 мМ гистидин-HCl буфера, 240 мМ сахарозы, 0,02% полисорбата 20, рН 6,0.An exemplary pharmaceutical composition of pertuzumab for therapeutic use contains 30 mg / ml pertuzumab in 20 mM histidine acetate, 120 mM sucrose, 0.02% polysorbate 20, pH 6.0. An alternative formulation of pertuzumab contains 25 mg / ml pertuzumab, 10 mM histidine-HCl buffer, 240 mM sucrose, 0.02% polysorbate 20, pH 6.0.

Фармацевтические композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется фильтрованием через стерильные фильтровальные мембраны.Pharmaceutical compositions used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through sterile filter membranes.

V. Применение в терапевтических целях и использованиеV. Therapeutic Uses and Uses

Композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения злокачественного заболевания, например, HER2-позитивного рака молочной железы, например, метастазирующего или местно рецидивирующего, неоперабельного рака молочной железы или IV стадии заболевания de novo, определяемого гистохимически (IHC) как 3+ и/или амплификационным соотношением флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) ≥2,0. Необязательно, пациенты в популяции ранее не получали лечения или имеют рецидив после адъювантной терапии, у которых фракция выброса левого желудочка (LVEF) ≥50% от исходного уровня, и/или имеют показатель общего состояния по шкале Восточной объединенной онкологической группы (ECOG PS) 0 или 1.The compositions of the present invention can be used to treat a malignant disease, for example, HER2-positive breast cancer, for example, metastatic or locally recurrent, inoperable breast cancer, or stage IV de novo disease defined by histochemistry (IHC) as 3+ and / or an amplification ratio of fluorescent in situ hybridization (FISH) ≥2.0. Optionally, patients in the population have not previously received treatment or have relapsed after adjuvant therapy who have left ventricular ejection fraction (LVEF) ≥50% of baseline and / or have an Eastern Pooled Oncology Group (ECOG PS) general condition score 0 or 1.

В альтернативном варианте осуществления композиция может быть использована для лечения ранней стадии HER2-позитивного рака молочной железы, например, в комбинации с трастузумабом и химиотерапией, где химиотерапия включает химиотерапию на основе антрациклина или химиотерапию на основе карбоплатина. В одном варианте осуществления химиотерапия включает химиотерапию на основе антрациклина, например, содержащего 5-FU, эпирубицин и циклофосфамид (FEC). В альтернативном варианте осуществления химиотерапия включает химиотерапию на основе карбоплатина, например, содержащую таксан (например, доцетаксел), карбоплатин в дополнение к HERCEPTIN®/Трастузумаб (например, режим ТСН). В одном варианте осуществления композицию вводят одновременно с химиотерапией на основе антрациклина или с химиотерапией на основе карбоплатина, например, где пертузумаб, трастузумаб и химиотерапию вводят в 3 недельных циклах с пертузумабом, трастузумабом и химиотерапию вводят в 1 день каждого цикла. Лечение ранней стадии HER2-позитивного рака молочной железы, рассматриваемое в настоящем описании, включает неоадъювантную и адъювантную терапию.In an alternative embodiment, the composition can be used to treat early stage HER2-positive breast cancer, for example, in combination with trastuzumab and chemotherapy, where the chemotherapy comprises anthracycline chemotherapy or carboplatin based chemotherapy. In one embodiment, the chemotherapy comprises anthracycline chemotherapy, eg, containing 5-FU, epirubicin, and cyclophosphamide (FEC). In an alternative embodiment, the chemotherapy includes carboplatin based chemotherapy, eg, containing a taxane (eg, docetaxel), carboplatin, in addition to HERCEPTIN® / Trastuzumab (eg, TSN regimen). In one embodiment, the composition is administered concurrently with anthracycline chemotherapy or carboplatin chemotherapy, for example, wherein pertuzumab, trastuzumab, and chemotherapy are administered in 3 week cycles with pertuzumab, trastuzumab and chemotherapy is administered on day 1 of each cycle. The treatment of early stage HER2-positive breast cancer discussed herein includes neoadjuvant and adjuvant therapies.

Еще в одном варианте осуществления композиция может быть использована для лечения HER2-позитивного рака желудка, необязательно в комбинации с трастузумабом и химиотерапией, такой как платин (например, цисплатин) и/или а фторпуримидин (например, капецитабин и/или 5-фторурацил (5-FU)).In yet another embodiment, the composition can be used to treat HER2-positive gastric cancer, optionally in combination with trastuzumab and chemotherapy such as platinum (e.g., cisplatin) and / or a fluoropurimidine (e.g., capecitabine and / or 5-fluorouracil (5 -FU)).

В альтернативном варианте осуществления композиция может быть использована для лечения HER2-позитивного рака молочной железы, необязательно в комбинации ç трастузумабом и винорелбином. Рак молочной железы в соответствии с этим вариантом осуществления необязательно является метастатическим или местно распространенным. Необязательно, пациент ранее не получал системного негормонального противоопухолевого лечения в режиме лечения метастатических форм.In an alternative embodiment, the composition can be used to treat HER2-positive breast cancer, optionally in a combination of ç trastuzumab and vinorelbine. Breast cancer in accordance with this embodiment is not necessarily metastatic or locally advanced. Optionally, the patient has not previously received systemic non-hormonal anticancer treatment in a metastatic regimen.

В другом аспекте композицию используют для лечения HER2-позитивного рака молочной железы у пациента, включающего введение пациенту этой композиции, трастузумаба и ингибитора ароматазы (например, анастразола или летрозола). В соответствии с этим вариантом осуществления рак молочной железы представляет собой распространенный рак молочной железы, рак молочной железы с позитивным гормональным рецептором, например, позитивный по рецептору эстрогена (ER) и/или позитивный по рецептору прогестерона (PgR) рак молочной железы. Необязательно, пациент ранее не получал системного негормонального противоопухолевого лечения в режиме лечения метастатических форм. Этот способ лечения необязательно дополнительно включает применение у пациента индукционной химиотерапии (например, содержащей таксан).In another aspect, the composition is used to treat HER2-positive breast cancer in a patient, comprising administering to the patient the composition, trastuzumab, and an aromatase inhibitor (eg, anastrazole or letrozole). In accordance with this embodiment, the breast cancer is advanced breast cancer, hormone receptor positive breast cancer, for example estrogen receptor (ER) positive and / or progesterone receptor positive (PgR) breast cancer. Optionally, the patient has not previously received systemic non-hormonal anticancer treatment in a metastatic regimen. This method of treatment optionally further comprises administering induction chemotherapy (eg, containing a taxane) to the patient.

В дополнительном аспекте композицию используют для лечения злокачественного заболевания с низким уровнем HER3, например, рака яичников, первичного перитонеального рака или рака фаллопиевых труб. Смотри, например, патент США 7981418 (Amler et al.) и патентную публикацию США US-2006-0013819-A1 (Kelsey, S.).In a further aspect, the composition is used to treat a malignant disease with low HER3 levels, such as ovarian cancer, primary peritoneal cancer, or fallopian tube cancer. See, for example, US patent 7981418 (Amler et al.) And US patent publication US-2006-0013819-A1 (Kelsey, S.).

Антитела и химиотерапевтическое лечение назначают человеку пациенту в соответствии с известными способами. Конкретные схемы лечения и составы описаны в примерах в настоящем описании.Antibodies and chemotherapeutic treatment are administered to a human patient in accordance with known methods. Specific treatment regimens and formulations are described in the examples herein.

В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения вводят приблизительно 840 мг (насыщающая доза) пертузумаба с последующим введением одной или более доз приблизительно 420 мг (поддерживающая доза (дозы) пертузумаба. Поддерживающие дозы предпочтительно вводят примерно каждые 3 недели, всего по меньшей мере две дозы, до клинического прогрессирования заболевания или трудноконтролируемой токсичности, например, от 6 до 20 доз. Также рассматриваются более длительные периоды лечения, включающие больше циклов лечения.In accordance with one specific embodiment of the present invention, about 840 mg (loading dose) of pertuzumab is administered, followed by one or more doses of about 420 mg (maintenance dose (s) of pertuzumab. Maintenance doses are preferably administered about every 3 weeks, for a total of at least two doses, until clinical progression of disease or difficult to control toxicity, eg 6 to 20. Longer treatment periods involving more treatment cycles are also contemplated.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления, в котором злокачественное заболевание представляет собой рак желудка, пертузумаб вводят в дозе 840 мг для всех циклов лечения.In accordance with another specific embodiment, in which the cancer is gastric cancer, pertuzumab is administered at a dose of 840 mg for all treatment cycles.

VI. ИзделияVi. Products

В одном варианте осуществления изделие в настоящем изобретении содержит контейнер, такой как флакон, шприц или внутривенный (ВВ) мешок, содержащий композицию или фармацевтическую композицию. Необязательно, изделие дополнительно содержит лист-вкладыш с указаниями по применению препарата, описывающими как применять композицию в соответствии с предыдущим разделом настоящего описания.In one embodiment, an article of manufacture in the present invention comprises a container, such as a vial, syringe, or intravenous (IV) bag, containing the composition or pharmaceutical composition. Optionally, the article of manufacture further contains a package insert with directions for use of the formulation describing how to apply the composition in accordance with the previous section of the present description.

VII. Депонирование биологических материаловVii. Deposit of biological materials

Следующие гибридомные клеточные линии были депонированы Американской коллекцией типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):The following hybridoma cell lines were deposited by the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

Обозначение антителаAntibody designation АТСС No.ATCC No. Дата депонированияDeposit date 4D54D5 АТСС CRL 10463ATCC CRL 10463 24 мая 1990May 24, 1990 2С42C4 АТСС НВ-12697ATCC NV-12697 8 апреля 1999April 8, 1999

Дополнительные подробные сведения об изобретении проиллюстрированы следующими неограничивающими примерами. Раскрытие всех ссылочных материалов в описании специально включено в настоящую заявку посредством ссылки.Additional details of the invention are illustrated by the following non-limiting examples. The disclosure of all referenced materials in the description is expressly incorporated into this application by reference.

Пример 1Example 1

Вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами Cys23/Cys88 и его характеристикаPertuzumab variant with unpaired cysteines Cys23 / Cys88 and its characteristics

Пертузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело (MAb) на основе каркасной области IgG1(κ) человека. Рекомбинантное антитело продуцируется ооцитами китайского хомячка (СНО) и содержит две тяжелые цепи (449 аминокислотных остатков) и две легкие цепи (214 аминокислотных остатков каждая) с межцепочечными и внутрицепочечными дисульфидными связями. Последовательности легкой цепи и последовательности тяжелой цепи пертузумаба показаны на фиг. 3А и 3В, соответственно. Рассчитанная молекулярная масса интактного пертузумаба составляет 145197 Да (только пептидные цепи без С-концевого остатка лизина в тяжелой цепи).Pertuzumab is a humanized monoclonal antibody (MAb) based on a human IgG1 (κ) framework. The recombinant antibody is produced by Chinese hamster oocytes (CHO) and contains two heavy chains (449 amino acid residues) and two light chains (214 amino acid residues each) with interchain and intrachain disulfide bonds. The light chain and heavy chain sequences of pertuzumab are shown in FIG. 3A and 3B, respectively. The calculated molecular weight of intact pertuzumab is 145197 Da (only peptide chains without the C-terminal lysine residue in the heavy chain).

СН2 домен каждой тяжелой цепи также имеет один консервативный сайт гликозилирования в положении Asn299.The CH2 domain of each heavy chain also has one conserved glycosylation site at position Asn299.

Пертузумаб отличается от трастузумаба (HERCEPTIN®) областями, определяющими комплементарность (CDR) легкой цепи (12 аминокислотных отличий) и тяжелой цепи (29 аминокислотных отличий), и тем, что он связывается с другим эпитопом рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (p185HER2). Связывание пертузумаба с рецептором HER2 на эпителиальных клетках человека препятствует образованию комплексов HER2 с другими представителями семейства HER рецепторов (в том числе EGFR, HER3, HER4) и образование гомодимеров HER2. Блокируя образование комплекса, пертузумаб ингибирует инициируемую лигандом передачу сигнала по двум основным сигнальным путям, митоген-активированной протеинкиназы (MAP) и фосфоинозитид 3-киназы (PI3K), приводя в результате к ингибированию пролиферации и выживания клетки, соответственно.Pertuzumab differs from trastuzumab (HERCEPTIN ®) complementarity determining regions (CDR) of the light chain (12 amino acid differences) and the heavy chain (29 amino acid differences), and in that it binds to another receptor epitope 2 human epidermal growth factor (p185 HER2) ... The binding of pertuzumab to the HER2 receptor on human epithelial cells prevents the formation of complexes of HER2 with other members of the HER receptor family (including EGFR, HER3, HER4) and the formation of HER2 homodimers. By blocking complex formation, pertuzumab inhibits ligand-initiated signaling through two major signaling pathways, mitogen-activated protein kinase (MAP) and phosphoinositide 3-kinase (PI3K), resulting in inhibition of cell proliferation and survival, respectively.

Этот пример относится к идентификации и характеристике варианта пертузумаба с неспаренными цистеинами: Cys23/Cys88 варианта с неспаренными цистеинами, содержащего неспаренные цистеины в одной или обеих легких цепях антитела.This example relates to the identification and characterization of the unpaired cysteine variant of pertuzumab: the Cys23 / Cys88 unpaired cysteine variant containing unpaired cysteines in one or both light chains of an antibody.

Свободные сульфгидрилы определяли, используя реактив Эллмана, и было показано, что содержание реакционноспособных свободных сульфгидрильных групп составляет 0,1-0,3 моль на моль белка. Хроматографический анализ гидрофобных взаимодействий (HIC) и пептидное картирование выявил неспаренные остатки цистеина у Cys23 и Cys88 на одной или обеих легких цепях. Используя папаиновую HIC, было обнаружено, что уровни варианта Fab, содержащего свободные сульфгидрилы в этих участках, составляют 12,7%-13,5% в веществе пертузумаба, полученного с использованием коммерческих процессов производства. HIC анализ интактного антитела показал, что две основные формы составляют 78%-85% пертузумаба дикого типа и 13,4%-18,4% гетеродимерного пертузумаба (неспаренная цистеиновая пара на одном плече).Free sulfhydryls were determined using Ellman's reagent, and the content of reactive free sulfhydryl groups was shown to be 0.1-0.3 mol per mole of protein. Hydrophobic interaction chromatographic analysis (HIC) and peptide mapping revealed unpaired cysteine residues at Cys23 and Cys88 on one or both light chains. Using papain HIC, levels of the free sulfhydryl-containing Fab variant at these sites were found to be 12.7% -13.5% in the pertuzumab substance obtained using commercial manufacturing processes. HIC analysis of the intact antibody showed that the two major forms account for 78% -85% of wild-type pertuzumab and 13.4% -18.4% of heterodimeric pertuzumab (unpaired cysteine pair on one arm).

Материалы и методыMaterials and methods

Тестируемые композиции: в этом примере описывается характеристика действующей партии стандартного образца пертузумаба анти2С4907-2 и Серия 1, представляющей клинический материал Фазы III, и пять Фаза III/коммерческие партии (Серии 3-7), все получены в масштабе 12000 литров (L), используя промышленный способ. Сравнение также проводят с предыдущей партией стандартного образца анти2С4-900-1, который является репрезентативным клиническим материалов Фазы Ι/II.Test Compositions: This example describes the characterization of a running batch of pertuzumab anti2C4907-2 and Batch 1 representing Phase III clinical material and five Phase III / commercial batches (Batch 3-7), all produced at a 12000 liter scale (L). using an industrial method. Comparison is also made with the previous batch of anti2C4-900-1 reference material, which is representative of Phase Ι / II clinical materials.

Тестируемые композиции представляли собой партии лекарственного вещества, полученного в виде коммерческого препарата с концентрацией 30 мг/мл в 20 мМ L-гистидинацетате, 120 мМ сахарозы и 0,02% (масс/об) полисорбата 20 с рН 6,0. Партия анти2С4-900-1 была получена ранее в клиническом испытании с концентрацией 25 мг/мл в 10 мМ L-гистидинхлорида, 240 мМ сахарозы и 0,02% (масс/об) полисорбата 20 с рН 6,0.The compositions tested were batches of a commercial drug at a concentration of 30 mg / ml in 20 mM L-histidine acetate, 120 mM sucrose and 0.02% (w / v) polysorbate 20 with pH 6.0. The anti2C4-900-1 batch was previously obtained in a clinical trial at a concentration of 25 mg / ml in 10 mM L-histidine chloride, 240 mM sucrose and 0.02% (w / v) polysorbate 20 with pH 6.0.

Анализ дисульфидной связи с использованием анализа пептидной карты в нередуцирующих условиях и масс-спектрометрии: для денатурации пертузумаба в нередуцирующих условиях и алкилирования любых замаскированных свободных сульфгидрильных групп, приблизительно 0,5 мг пертузумаба в рецептурном буфере перемешивали с денатурирующим буфером (состоящем из 8 M GdHCl, 10 мМ Ν-этилмалеимида (ΝΕΜ), 0,1 M ацетата натрия, рН 5,0), а затем инкубировали при 37°С в течение 3 часов. В этом растворе меняли буфер на 600 мкл 0,1 M Трис, 1 мМ CaCl2, рН 7,0 используя колонки NAP-5. К каждому образцу добавляли ацетонитрил (ACN) до достижения концентрации 10%. Расщепление трипсином проводили при соотношении фермента к субстрату 1:10 (об/об) при 37°С в течение 16 часов. Полученные в результате пептиды разделяли с помощью RP-HPLC, используя способы, описанные ниже для сульфитолиза трипсиновых карт.Disulfide bond analysis using peptide map analysis under non-reducing conditions and mass spectrometry: to denature pertuzumab under non-reducing conditions and alkylate any masked free sulfhydryl groups, approximately 0.5 mg of pertuzumab in prescription buffer was mixed with denaturing buffer (consisting of 8 M GdHCl, 10 mM Ν-ethylmaleimide (), 0.1 M sodium acetate, pH 5.0), and then incubated at 37 ° C for 3 hours. In this solution, the buffer was changed to 600 μl of 0.1 M Tris, 1 mM CaCl 2 , pH 7.0 using NAP-5 columns. Acetonitrile (ACN) was added to each sample to achieve a concentration of 10%. Trypsin digestion was performed at a ratio of enzyme to substrate of 1:10 (v / v) at 37 ° C for 16 hours. The resulting peptides were resolved by RP-HPLC using the methods described below for sulfitolysis of trypsin maps.

Сульфитолиз карт трипсиновых пептидов: для получения пептидных карт пертузумаба, белок расщепляли трипсином после восстановления и сульфитолиза остатков цистеина. Аликвоты (1 мг) пертузумаба добавляли к 360 мМ Трис-HCl рН 8,6, 6 M гуанидингидрохлорида (GdHCl), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), 13 мМ сульфата натрия и 38 мМ тетратионата натрия для восстановления и сульфитолиза остатков цистеина. Образцы инкубировали при 37°С в течение 20 минут. Сульфитолизированные образцы загружали на колонки PD-10 и элюировали с использованием 10 мМ Триса, 0,1 мМ CaCl2, рН 8,3. После замены буферов добавляли 20 мкл 10% раствора октил-В-глюкозида и 20 мкл 1 мг/мл трипсина. Образцы инкубировали при 37°С в течение 5 часов. Реакцию расщепления гасили 25 мкл 10% трифторуксусной кислоты (TFA). Полученные в результате пептиды разделяли с помощью RP-HPLC, используя колонку Zorbax 300SB-C8 (4,6 мм × 150 мм). Пептиды разделяли после 5 минутного выдерживания в начальных условиях с линейным градиентом от 0% до 17% растворителя В за 57 минут, до 32% растворителя В в 149 минут, до 45% растворителя В в 162 минуты и до 95% растворителя В в 173 минуты. В 179 минут колонку регенерировали при 100% растворителя А в течение 25 минут, в течение всего времени хроматографирования 204 минуты. Растворитель А состоял из 0,1% TFA в воде, а растворитель В состоял из 0,08% TFA в ацетонитриле. Колонку поддерживали при 37°С и элюировали со скоростью потока 0,5 мл/мин. Профиль элюции подвергали мониторингу при 214 нм и 280 нм. Массу трипсиновых пептидов определяли с помощью жидкостной хроматографии - масс спектрометрического (LC-MS) анализа отделенной расщепленной смеси, используя масс-спектрометр LTQ ORBITRAP™.Sulfitolysis of trypsin peptide maps: to obtain peptide maps of pertuzumab, the protein was cleaved with trypsin after reduction and sulfitolysis of cysteine residues. Aliquots (1 mg) of pertuzumab were added to 360 mM Tris-HCl pH 8.6, 6 M guanidine hydrochloride (GdHCl), 2 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 13 mM sodium sulfate, and 38 mM sodium tetrathionate to reduce and sulfitolize cysteine residues. Samples were incubated at 37 ° C for 20 minutes. Sulfitolized samples were loaded onto PD-10 columns and eluted using 10 mM Tris, 0.1 mM CaCl 2 , pH 8.3. After changing the buffers, 20 μl of 10% octyl-B-glucoside solution and 20 μl of 1 mg / ml trypsin were added. Samples were incubated at 37 ° C for 5 hours. The cleavage reaction was quenched with 25 μl of 10% trifluoroacetic acid (TFA). The resulting peptides were separated by RP-HPLC using a Zorbax 300SB-C8 column (4.6 mm x 150 mm). Peptides were separated after 5 minutes at initial conditions with a linear gradient from 0% to 17% Solvent B in 57 minutes, to 32% Solvent B in 149 minutes, to 45% Solvent B in 162 minutes, and to 95% Solvent B in 173 minutes. ... At 179 minutes, the column was regenerated at 100% solvent A for 25 minutes, for a total chromatography time of 204 minutes. Solvent A consisted of 0.1% TFA in water and solvent B consisted of 0.08% TFA in acetonitrile. The column was maintained at 37 ° C and eluted at a flow rate of 0.5 ml / min. The elution profile was monitored at 214 nm and 280 nm. The mass of trypsin peptides was determined by liquid chromatography-mass spectrometric (LC-MS) analysis of the separated digested mixture using an LTQ ORBITRAP ™ mass spectrometer.

Содержание свободных сульфгидрильных групп по анализу Эллмана: в образцах пертузумаба меняли буфер на рабочий буферный раствор (100 мМ фосфата калия, 1 мМ EDTA, 8 M мочевины, рН 8) и доводили до концентрации, которая в результате давала концентрации свободного тиола в пределах диапазона стандартной кривой. Готовили раствор дитионитробензола (DTNB) (10 мМ) и стандартные растворы цистеина (восемь точек между 0 и 100 мкМ) в рабочем буферном растворе. В 96-луночный планшет добавляли 165 мкл образца или стандарта для лунок в трех повторах. Реакцию инициировали добавлением 10 мкл DTNB, а затем инкубировали в течение 30 минут. После инкубирования измеряли поглощение при 412 нм, используя планшетный ридер SPECTRAMAX М2®. Концентрацию свободных тислов вычисляли, используя линейное уравнение, полученное из стандартной кривой. Концентрацию белка определяли, используя поглощение при 280 нм, полученное на спектрофотометре. Свободный тиол отражали в виде молей свободного тиола на моль пертузумаба.The content of free sulfhydryl groups according to Ellman's analysis: in the pertuzumab samples, the buffer was changed to a working buffer solution (100 mM potassium phosphate, 1 mM EDTA, 8 M urea, pH 8) and adjusted to a concentration that resulted in a concentration of free thiol within the standard range crooked. A solution of dithionitrobenzene (DTNB) (10 mM) and standard solutions of cysteine (eight points between 0 and 100 μM) were prepared in working buffer solution. To a 96-well plate, 165 μl of sample or well standard was added in triplicate. The reaction was initiated by the addition of 10 μl of DTNB and then incubated for 30 minutes. After incubation, the absorbance at 412 nm using a plate reader SPECTRAMAX M 2 ®. The concentration of free thistles was calculated using a linear equation derived from a standard curve. Protein concentration was determined using absorbance at 280 nm obtained on a spectrophotometer. Free thiol was reflected as moles of free thiol per mole of pertuzumab.

Папаиновая HIC: для получения образцов пертузумаба, расщепленных папаином, образцы расщепляли папаином после удаления С-концевого лизина карбоксипептидазой В (СрВ). Домены Fab и Fc разделяли с помощью HIC, используя полипропиласпартамидную колонку (4,6 мм × 100 мм, 1500 Å, 3 мкм). Растворитель А состоял из 1,6 M сульфата аммония, 20 мМ фосфата калия, рН 6,05, а растворитель В состоял из 20 мМ фосфата калия рН 6,05. Аналиты разделяли градиентом от 0% до 18%) растворителя В от 3 до 6 минут, до 24%) растворителя В на 21 минуте. Колонку поддерживали при 25°С со скоростью потока 0,8 мл/мин. Профиль элюции подвергали мониторингу при 280 нм.Papain HIC: To obtain papain-digested pertuzumab samples, samples were digested with papain after removal of the C-terminal lysine with carboxypeptidase B (CpB). The Fab and Fc domains were separated by HIC using a polypropyl aspartamide column (4.6 mm x 100 mm, 1500 Å, 3 μm). Solvent A consisted of 1.6 M ammonium sulfate, 20 mM potassium phosphate, pH 6.05, and solvent B consisted of 20 mM potassium phosphate, pH 6.05. Analytes were separated by a gradient from 0% to 18%) solvent B from 3 to 6 minutes, to 24%) solvent B at 21 minutes. The column was maintained at 25 ° C with a flow rate of 0.8 ml / min. The elution profile was monitored at 280 nm.

HIC интактного антитела: образцы интактного пертузумаба разделяли с помощью HIC, используя полипропиласпартамидную колонку (9,4 мм × 100 мм, 1500 Å, 3 мкм). Растворитель А состоял из 1,0 M сульфата аммония, 20 мМ фосфата калия, рН 6,05, а растворитель В состоял из 20 мМ фосфата калия, рН 6,05. Аналиты разделяли изократически, используя 12% растворитель В в течение 25 минут. Колонку поддерживали при 30°С со скоростью потока 2 мл/мин. Профиль элюции подвергали мониторингу при 280 нм.Intact antibody HIC: Intact pertuzumab samples were separated by HIC using a polypropylaspartamide column (9.4 mm x 100 mm, 1500 A, 3 μm). Solvent A consisted of 1.0 M ammonium sulfate, 20 mM potassium phosphate, pH 6.05, and solvent B consisted of 20 mM potassium phosphate, pH 6.05. Analytes were separated isocratically using 12% Solvent B over 25 minutes. The column was maintained at 30 ° C with a flow rate of 2 ml / min. The elution profile was monitored at 280 nm.

SDS-PAGE с идентификацией белков по «отпечаткам пептидных масс»: образцы пертузумаба, как восстановленного, так и невосстановленного, анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Образцы (5 мкг) денатурировали нагреванием в присутствии SDS-PAGE буфера для образца в течение 5-10 минут при 60±2°С с йодацетамидом для невосстановленных образцов. Образцы восстанавливали в течение 15-20 минут при 60°С±2°С в присутствии 80 мМ дитиотреитола (DTT). Денатурированные образцы разделяли в 4%-20% полиакриламидных градиентных гелях и окрашивали красителем SYPRO™ Ruby для получения профиля исчерченности белка. Наряду с образцами пертузумаба, в гели были включены стандарты молекулярных масс и стандарты чувствительности окрашивания SYPRO™ Ruby (2 нг/дорожка и 8 нг/дорожка сывороточного альбумина (BSA)).SDS-PAGE with identification of proteins by "peptide mass prints": samples of pertuzumab, both reduced and unreduced, were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). Samples (5 μg) were denatured by heating in the presence of SDS-PAGE sample buffer for 5-10 minutes at 60 ± 2 ° C with iodoacetamide for unreduced samples. Samples were reconstituted for 15-20 minutes at 60 ° C ± 2 ° C in the presence of 80 mM dithiothreitol (DTT). Denatured samples were separated on 4% -20% polyacrylamide gradient gels and stained with SYPRO ™ Ruby to obtain a protein streak profile. Along with the pertuzumab samples, SYPRO ™ Ruby molecular weight and sensitivity standards (2 ng / lane and 8 ng / lane serum albumin (BSA)) were included in the gels.

Отпечатки пептидных масс представляет собой аналитическую методику для идентификации белка. Гели загружали 10 мкг коммерчески доступной партией стандартного образца анти2С4907-2 и Серией 5. Все полосы, разделенные с помощью SDS-PAGE, были расщеплены на пептиды под действием трипсина. Абсолютные массы пептидов точно измеряют с помощью BRUKER™ времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF MS). Перечни пептидных масс были использованы для идентификации белков путем исследования последовательностей белков. Все наблюдаемые полосы как невосстановленного, так и восстановленного пертузумаба, были идентифицированы по отпечаткам пептидных масс.Peptide mass imprints are an analytical technique for protein identification. The gels were loaded with 10 μg of a commercially available batch of anti2C4907-2 standard sample and Series 5. All bands separated by SDS-PAGE were peptide digested with trypsin. Absolute peptide masses are accurately measured by BRUKER ™ Time-of-Flight Laser Ionization Liquid Matrix Desorption Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Lists of peptide masses were used to identify proteins by examining protein sequences. All bands observed for both unreduced and reduced pertuzumab were identified by peptide mass prints.

Эффективность по данным биоанализа: способ оценки эффективности пертузумаба оценивает эффективность пертузумаба путем определения его способности ингибировать пролиферацию клеточной линии рака молочной железы человека, экспрессирующей HER2. В характерном исследовании 96-лучночный планшет(ы) засевали клетками злокачественной опухоли молочной железы и инкубировали во влажной камере. После инкубирования среду удаляли и добавляли различные концентрации стандартного образца пертузумаба, аналитического контроля и образец (образцы). Затем планшет(ы) инкубировали к относительное число жизнеспособных клеток опосредовано количественно анализировали, используя окислительно-восстановительный краситель ALAMARBLUE®. Флуоресценцию измеряли, используя возбуждение при 530 нм и эмиссию при 590 нм. ALAMARBLUE® имеет синий цвет и не является флуоресцирующим в окисленном состоянии, но восстанавливается под действием внутриклеточной среды клетки до розовой формы, которая является сильно флуоресцирующей (Page et al. Int. J. Oncol. 3: 473-476 (1993)). Изменения цвета и флуоресценции пропорциональны числу жизнеспособных клеток. Результаты, выраженные в относительных единицах флуоресценции (RFU), наносили на график в зависимости от концентраций пертузумаба и программа параллельных линий была использована для оценки антипролиферативной активности образцов пертузумаба относительно стандартного образца.Bioassay efficacy: A method for evaluating the efficacy of pertuzumab evaluates the efficacy of pertuzumab by determining its ability to inhibit the proliferation of a human breast cancer cell line expressing HER2. In a representative study, 96-well plate (s) were seeded with breast cancer cells and incubated in a humid chamber. After incubation, the medium was removed and various concentrations of pertuzumab standard sample, analytical control and sample (s) were added. The plate (s) were then incubated and the relative number of viable cells was indirectly quantified using the redox dye ALAMARBLUE®. Fluorescence was measured using excitation at 530 nm and emission at 590 nm. ALAMARBLUE® is blue and non-fluorescent when oxidized, but is reduced by the intracellular environment of the cell to a pink form that is highly fluorescent (Page et al. Int. J. Oncol. 3: 473-476 (1993)). Changes in color and fluorescence are proportional to the number of viable cells. The results, expressed in relative fluorescence units (RFU), were plotted against the concentrations of pertuzumab and a parallel line program was used to assess the antiproliferative activity of the pertuzumab samples relative to the standard sample.

Результатыresults

Распределение дисульфидных связей: в пертузумабе находятся 32 цистеина, образующие 16 дисульфидных связей, из которых четыре являются межцепочечными, а 12 являются внутрицепочечными связями. Однако, вследствие мультимерной природы молекулы, существует только девять различимых дисульфидных связей. Нативный белок расщепляли трипсином для достижения высвобождения всех дисульфид-связанных пептидов. Хроматографические профили для партий пертузумаба показаны на Фиг. 7. LC-MS анализ с обращенной фазой расщепленной коммерчески доступной партии стандартного образца анти2С4907-2 предоставлял все ожидаемые дисульфид-связанные пептидные пары (таблица 2).Disulfide bond distribution: Pertuzumab contains 32 cysteines, forming 16 disulfide bonds, of which four are interchain and 12 are intrachain bonds. However, due to the multimeric nature of the molecule, there are only nine distinguishable disulfide bonds. The native protein was trypsinized to achieve release of all disulfide-linked peptides. Chromatographic profiles for batches of pertuzumab are shown in FIG. 7. Reverse phase LC-MS analysis of a split commercially available batch of anti2C4907-2 standard sample provided all the expected disulfide-linked peptide pairs (Table 2).

Figure 00000002
Figure 00000002

Идентифицированные пептиды дополнительно подтверждали путем идентификации ожидаемых пептидов из пептидных пар при восстановлении дисульфидов (Фиг. 8 с развернутыми видами на фиг. 9 и 10). Димер пептида тяжелой цепи Т19Н (Т19Н=Т19Н) был идентифицирован как содержащий две дисульфидные связи; предполагалась идентификация Cys228=Cys228 и Cys231=Cys231 пар. Одна дисульфидная пара T18H=T20L, была обнаружена с помощью LC-MS, но элюировала близко к исключенному объему и была неидентифицируемой в виде различимого пика на ультрафиолетовых (UV) хроматограммах. Присутствие этой дисульфидной пары дополнительно подтверждалось LC-MS анализом расщепления Lys-C, где наблюдался пептид T18H=T19L-T20L. Неожидаемых связей обнаружено не было. Одна дисульфидная связь является частично непарной, как рассмотрено ниже.The identified peptides were further confirmed by identifying the expected peptides from the peptide pairs upon disulfide reduction (FIG. 8 with expanded views in FIGS. 9 and 10). A dimer of the heavy chain peptide T19H (T19H = T19H) was identified as containing two disulfide bonds; the identification of Cys228 = Cys228 and Cys231 = Cys231 pairs was assumed. One disulfide pair, T18H = T20L, was detected by LC-MS but eluted close to the exclusion volume and was unidentifiable as a discernible peak on ultraviolet (UV) chromatograms. The presence of this disulfide pair was further confirmed by LC-MS analysis of Lys-C cleavage, where the peptide T18H = T19L-T20L was observed. No unexpected connections were found. One disulfide bond is partially unpaired, as discussed below.

Анализ свободных сульфгидрильных групп: все остатки цистеина в пертузумабе с правильной укладкой молекулы должны быть вовлечены в дисульфидные связи. Анализ по Эллману (Ellman, G. Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959)), способ определения содержания свободных сульфгидрильных групп пептидов и белков, использовали для определения присутствия в пертузумабе реакционноспособных немодифицированных (свободных) тиолов. Все вещества оценивали на содержание свободных тиолов (неспаренных остатков цистеина), и результаты суммированы в таблице 3.Analysis of free sulfhydryl groups: all cysteine residues in pertuzumab with the correct molecule folding should be involved in disulfide bonds. Ellman's assay (Ellman, G. Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77 (1959)), a method for determining the free sulfhydryl group content of peptides and proteins, was used to determine the presence of reactive unmodified (free) thiols in pertuzumab. All substances were evaluated for the content of free thiols (unpaired cysteine residues), and the results are summarized in Table 3.

Figure 00000003
Figure 00000003

Приблизительно 0,1-0,3 моля свободных тиолов на моль пертузумаба наблюдалось во всех анализируемых партиях. В отсутствие 8 М мочевины уровни свободных тиолов были ниже предела количественного обнаружения (QL; приблизительно 0,1 моль свободного тиола на молекулу белка) во всех тестируемых веществах, указывая на то, что свободные тиолы (то есть, неспаренные цистеины), присутствующие в молекуле пертузумаба, были скрыты и недоступны для реактива Эллмана в неденатурирующих условиях.Approximately 0.1-0.3 moles of free thiols per mole of pertuzumab were observed in all batches analyzed. In the absence of 8 M urea, levels of free thiols were below the quantitative limit (QL; approximately 0.1 mol free thiol per protein molecule) in all test substances, indicating that free thiols (i.e., unpaired cysteines) present in the molecule pertuzumab were hidden and inaccessible to Ellman's reagent in non-denaturing conditions.

Анализ веществ пертузумаба с помощью HIC после СрВ и папаинового расщепления, обнаружил дополнительный пик между пиками Fc и Fab, который был идентифицирован как вариант Fab, содержащий неспаренные остатки цистеина в положениях Cys23 и Cys88 (фиг. 11 и 12, отмеченные как Fab со свободными тиолами). Эта идентификация была подтверждена LC-MS картированием триптического пептида, где образец подвергали денатурации в присутствии NEM до восстановления и расщепления трипсином. Была измерена степень свободного тиола варианта Fab с использованием способа папаиновой HIC всех партий пертузумаба и было обнаружено, что она соответствует таковой с использованием текущего способа (таблица 4).HIC analysis of pertuzumab compounds after CpB and papain digestion revealed an additional peak between the Fc and Fab peaks, which was identified as a Fab variant containing unpaired cysteine residues at positions Cys23 and Cys88 (Figures 11 and 12, labeled as Fabs with free thiols ). This identification was confirmed by LC-MS mapping of tryptic peptide, where the sample was denatured in the presence of NEM prior to reconstitution and trypsin digestion. The degree of free thiol of the Fab variant was measured using the papain HIC method of all batches of pertuzumab and was found to correspond to that using the current method (Table 4).

Figure 00000004
Figure 00000004

По данным HIC анализа с папаином значения для веществ, полученных с использованием промышленного способа, находятся в интервале от 12,7% до 13,5%, тогда как величина для партии стандартного образца 2С4-900-1 (Phase 1/II) была несколько ниже на уровне 9,4%.According to HIC analysis with papain, the values for substances obtained using the industrial method are in the range from 12.7% to 13.5%, while the value for the batch of standard sample 2C4-900-1 (Phase 1 / II) was somewhat lower at 9.4%.

Преобразование % Fab варианта по результатам HIC с папаином в расчетный % варианта интактного антитела: относительное количество Fab фрагментов, содержащих неспаренные цистеины, может быть использовано для вычисления относительного распределения гетеродимерных или гомодимерных форм вариантов с неспаренными цистеинами. В тех случаях, когда HIC анализ с папаином показывает, что 10% (или х%) Fab фрагментов пертузумаба содержат неспаренные цистеины в положениях Cys23/Cys88, то должно быть 10 Fab фрагментов, содержащих неспаренные цистеины, высвобожденных из каждых 50 молекул пертузумаба, поскольку расщепление 50 антител папаином должно давать 100 фрагментов Fab. Принимая во внимание тот факт, что эти 10 фрагментов Fab получены из 10 разных молекул пертузумаба, относительное количество пертузумаба, содержащего один Fab Cys23/Cys88 неспаренными цистеинами составляет приблизительно 20%, то есть 10 из 50 молекул пертузумаба, (или 2х%). Более точно, если возможность того, что пертузумаб с двумя Fab, содержащими Cys23/Cys88 неспаренные цистеины, принять во внимание, то относительно количество гетеродимерные варианты пертузумаба с неспаренными цистеинами должны составлять 2×10%×90%=18% (или 2×х%×[100-х]%). Кроме того, относительное количество гомодимерных вариантов пертузумаба с неспаренными цистеинами должно составлять 10%×10%=1% (или х%×х%). В этом случае, относительное число пертузумаба, содержащего 2 Fab без неспаренных цистеинов на любом из Fab, должно составлять 90%×90%=81% (или [100-х]%×[100-х]%).Conversion of% Fab variant from HIC with papain to calculated% variant of intact antibody: the relative number of Fab fragments containing unpaired cysteines can be used to calculate the relative distribution of heterodimeric or homodimeric forms of variants with unpaired cysteines. Where HIC analysis with papain shows that 10% (or x%) Fab fragments of pertuzumab contain unpaired cysteines at positions Cys23 / Cys88, then there should be 10 Fab fragments containing unpaired cysteines released from every 50 molecules of pertuzumab, since papain digestion of 50 antibodies should yield 100 Fab fragments. Considering the fact that these 10 Fab fragments are derived from 10 different pertuzumab molecules, the relative amount of pertuzumab containing one Fab Cys23 / Cys88 unpaired cysteines is approximately 20%, i.e. 10 out of 50 pertuzumab molecules (or 2x%). More specifically, if the possibility that pertuzumab with two Fabs containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines is taken into account, then the relative number of heterodimeric variants of pertuzumab with unpaired cysteines should be 2 x 10% x 90% = 18% (or 2 x x % × [100's]%). In addition, the relative amount of homodimeric variants of pertuzumab with unpaired cysteines should be 10% x 10% = 1% (or x% x x%). In this case, the relative number of pertuzumab containing 2 Fabs without mismatched cysteines on any of the Fabs should be 90% x 90% = 81% (or [100-x]% x [100-x]%).

Кроме того, гомодимер дикого типа (без неспаренных цистеинов) и гетеродимер (с неспаренными цистеинами на одном Fab) могут быть количественно проанализированы непосредственно с помощью HIC. HIC интактного антитела разделяет пертузумаб на два основных пика (Фиг. 13), которые были идентифицированы как гомодимер дикого типа (без свободных тиолов) и гетеродимер (со свободной тиольной парой на одном Fab) с помощью LC-MS картирования триптического пептида. Плечо минорного фронтального пика также собирали и характеризовали с помощью HIC с папаином, преимущественно в виде гомодимера (свободная тиольная пара на обоих Fab, приблизительно 40%) и пертузумаб с окислением Fe. Используя HIC интактного антитела, было определено, что пертузумаб содержит приблизительно 17%-18% гетеродимера для веществ, полученных с использованием текущего процесса, и 13% с использованием процесса Фаза I/II (таблица 5). Не связываясь какой-нибудь одной теорией, возможно, что повышенное количество варианта с неспаренными цистеинами, полученного промышленным способом (по сравнению с процессом фазы I/II) может являться результатом скорости укладки белка (то есть VL домена) нарастающей быстрее, чем скорость окисления тиола (образование дисульфида), таким образом, удерживая свободные цистеины в этом варианте.In addition, the wild type homodimer (no unpaired cysteines) and heterodimer (with unpaired cysteines on the same Fab) can be quantitated directly by HIC. The HIC of the intact antibody separates pertuzumab into two major peaks (Fig. 13), which were identified as a wild-type homodimer (no free thiols) and a heterodimer (with a free thiol pair on one Fab) by LC-MS mapping of tryptic peptide. The shoulder of the minor frontal peak was also collected and characterized by HIC with papain, predominantly as a homodimer (free thiol pair on both Fabs, approximately 40%) and pertuzumab with Fe oxidation. Using the HIC of the intact antibody, pertuzumab was determined to contain approximately 17% -18% heterodimer for materials prepared using the current process and 13% using the Phase I / II process (Table 5). Without being bound by any one theory, it is possible that the increased amount of unpaired cysteine variant produced industrially (compared to the phase I / II process) may be the result of the protein folding rate (i.e. the VL domain) increasing faster than the rate of thiol oxidation (disulfide formation), thus keeping free cysteines in this variant.

Figure 00000005
Figure 00000005

Поскольку пары неспаренных цистеинов в положениях Cys23/Cys88 на легкой цепи пертузумаба наблюдали с помощью HIC, очищенные фракции каждого варианта с неспаренными цистеинами были протестированы в антипролиферативном исследовании. Fab, содержащие неспаренные цистеины, очищали и анализировали на наличие сниженной эффективности (оцениваемая эффективность ~50% по сравнению с нативным Fab) (таблица 6).Since the pairs of unpaired cysteines at positions Cys23 / Cys88 on the light chain of pertuzumab were observed by HIC, the purified fractions of each variant with unpaired cysteines were tested in an antiproliferative assay. Fabs containing unpaired cysteines were purified and analyzed for reduced potency (estimated potency ~ 50% versus native Fab) (Table 6).

Figure 00000006
Figure 00000006

Кроме того, три интактные формы (гомодимер дикого типа, гетеродимер, содержащий свободные тиолы и гомодимер, содержащий неспаренные цистеины) были выделены с помощью HIC и протестированы в анализе антипролиферативной эффективности. Смотри таблицу 7.In addition, three intact forms (wild type homodimer, heterodimer containing free thiols and homodimer containing unpaired cysteines) were isolated by HIC and tested in an antiproliferative efficacy assay. See table 7.

Figure 00000007
Figure 00000007

Эти данные демонстрируют, что вариант пертузумаба с неспаренными цистеинамк присутствует в композиции, полученной в коммерческом масштабе. Способы HIC (определяющие Fab фрагмент или интактное антитело) в этом примере или пептидное картирование в примере 3, приведенном ниже, представляют собой исследования, которые могут быть использованы для оценки присутствия и количественного определения варианта с неспаренными цистеинами в композиции пертузумаба.These data demonstrate that a variant of pertuzumab with unpaired cysteines is present in a commercially available formulation. The HIC methods (detecting Fab fragment or intact antibody) in this example or peptide mapping in example 3 below are assays that can be used to assess the presence and quantification of the unpaired cysteine variant in a pertuzumab composition.

Пример 2Example 2

Композиция пертузумаба, лишенного фукозы, и ее характеристикаThe composition of fucose-free pertuzumab and its characteristics

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) является аспектом клеточного иммунитета, посредством которого эффекторная клетка активно лизирует клетку-мишень, которая связалась с антиген-специфичными антителами. Пертузумаб демонстрировал ADCC активность при тестировании с клетками HER2 3+, но очень небольшая активность наблюдалась с клетками HER2 1+ (Фиг. 14).Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an aspect of cellular immunity whereby an effector cell actively lyses a target cell that has bound antigen-specific antibodies. Pertuzumab exhibited ADCC activity when tested with HER2 3+ cells, but very little activity was observed with HER2 1+ cells (Figure 14).

Уровни дефукозилирования в стандартных образцах пертузумаба Фазы I и Фазы III измеряли, используя капиллярный электрофорез. Более высокий уровень дефукозилированного вещества (G0-F=2,2%) в стандартном образце пертузумаба Фазы III коррелирует с более высокой ADCC активностью, наблюдаемой по сравнению со стандартным образцом Фазы I (Фиг. 15), который имел более низкий G0-F (0,8%). Также был получен и протестирован ферментативно дегликозилированный пертузумаб, и было показано отсутствие связывания с FcγRIIIa и отсутствие ADCC активности (таблица 8).Defucosylation levels in Phase I and Phase III pertuzumab standard samples were measured using capillary electrophoresis. The higher level of defucosylated substance (G0-F = 2.2%) in the Phase III pertuzumab standard correlates with the higher ADCC activity observed compared to the Phase I standard (Fig. 15), which had a lower G0-F ( 0.8%). Also, enzymatically deglycosylated pertuzumab was prepared and tested, and showed no binding to FcγRIIIa and no ADCC activity (Table 8).

Figure 00000008
Figure 00000008

Эти данные показывают, что измерение G0-F (дефукозилированного) пертузумаба является эффективным средством для количественной оценки ADCC активности пертузумаба. Эксперименты для количественного анализа дефукозилирования представляют собой следующее.These data indicate that the measurement of G0-F (defucosylated) pertuzumab is an effective tool for quantifying the ADCC activity of pertuzumab. Experiments for quantitative analysis of defucosylation are as follows.

Анализ олигосахаридов с использованием капиллярного электрофореза (СЕ): образцы пертузумаба (250-500 мкг) очищали, используя аффинные наконечники для твердофазной экстракции с Белком A (PHYTIPS™) и автоматизированную рабочую станцию дозирования жидкостей. Образцы пертузумаба элюировали со смолы на основе белка А, используя 12 мМ соляную кислоту, рН 2,0 и нейтрализовали, используя 10 мкл 50 мМ сукцината натрия. Полученный в результате образец инкубировали с 2,5 Ед/мл oPNGaзы F в течение 15 часов при 37°С. Белок осаждали нагреванием раствора при 95°С в течение 5 минут и удаляли центрифугированием. Растворы супернатанта, содержащие высвобожденные олигосахариды, сушили под вакуумом. Получали производные высвобожденных гликанов с использованием 8-аминопирен-1,2,6-трисульфоновой кислоты (APTS) в 15% растворе уксусной кислоты, содержащем цианоборгидрид натрия при 55°С в течение двух часов. Анализы производных гликанов проводили с помощью системы капиллярного электрофореза (СЕ), снабженной модулем для флуоресцентной детекции, используя аргон-ионный лазер (488 нм возбуждение, 520 нм эмиссия) и капилляры, покрытые N-CHO (50 мк × 50 см). Подвижный буфер представлял собой 40 мМ ε-амино-н-капроновую кислоту/уксусную кислоту, рН 4,5, 0,2% гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС). Образцы вводили в капилляр под давлением 0,5 фунтов на квадратный дюйм. Разделение проводили при 20 кВ, и температуру капилляра поддерживали при 20°С.Oligosaccharide analysis using capillary electrophoresis (CE): Pertuzumab samples (250-500 μg) were purified using Protein A Affinity Solid Phase Extraction Tips (PHYTIPS ™) and an automated liquid dispensing workstation. Pertuzumab samples were eluted from the Protein A resin using 12 mM hydrochloric acid, pH 2.0 and neutralized using 10 μl of 50 mM sodium succinate. The resulting sample was incubated with 2.5 U / ml oPNGase F for 15 hours at 37 ° C. The protein was precipitated by heating the solution at 95 ° C for 5 minutes and removed by centrifugation. The supernatant solutions containing the released oligosaccharides were dried under vacuum. Derivatives of the released glycans were prepared using 8-aminopyrene-1,2,6-trisulfonic acid (APTS) in 15% acetic acid solution containing sodium cyanoborohydride at 55 ° C for two hours. Analyzes of glycan derivatives were performed using a capillary electrophoresis (CE) system equipped with a fluorescence detection module using an argon ion laser (488 nm excitation, 520 nm emission) and N-CHO coated capillaries (50 μ × 50 cm). The rolling buffer was 40 mM ε-amino-n-caproic acid / acetic acid, pH 4.5, 0.2% hydroxypropyl methylcellulose (HPMC). The samples were injected into a capillary at a pressure of 0.5 psi. The separation was carried out at 20 kV, and the capillary temperature was maintained at 20 ° C.

Пертузумаб содержит N-связанный олигосахаридный сайт в CH2 домене Fc части молекулы в положении Asn299. Относительное распределение нейтральных олигосахаридов, обнаруженное в этом сайте для каждой партии определяли, используя СЕ после обработки PNGaзой F и мечения APTS.Pertuzumab contains an N-linked oligosaccharide site in the C H 2 domain of the Fc moiety at position Asn299. The relative distribution of neutral oligosaccharides found at this site for each batch was determined using CE after PNGase F treatment and APTS labeling.

Электрофореграммы, полученные в результате СЕ анализа высвобожденных производных олигосахаридов показаны на Фиг. 16 с профилями в развернутом виде на Фиг. 17. Относительные количества олигосахаридов в пертузумабе для анализируемых веществ изложены в таблице 9.Electropherograms obtained from the CE analysis of the released oligosaccharide derivatives are shown in FIG. 16 with the unfolded profiles in FIG. 17. The relative amounts of oligosaccharides in pertuzumab for the analytes are set out in Table 9.

Figure 00000009
Figure 00000009

Олигосахарид со структурой GO является преобладающим видом во всех веществах (62%-75%). Гликоформа G0 была несколько более распространенной в Сериях 3-7 и предыдущей партии стандартного образца 2С4-900-1 (70%-75%) по сравнению с текущей партией стандартного образца анти2С4907-2 и Серией 1 (62%-64%). Гликоформа G1 наблюдалась в виде двух пиков, соответствующих двум изомерам с концевой галактозой любой из ветвей двух-антенарной структуры. Площади этих двух пиков объединяли для определения относительного количества гликоформы G1. Гликоформы G1 и G2 насчитывают приблизительно 18%-29% и 1%-3%, соответственно высвобожденных олигосахаридов для всех веществ. Пики, возникающие вследствие других олигосахаридных структур, также наблюдались на электрофореграммах (все присутствуют на уровне 3% или менее). Эти структуры включают G0-F (G0, лишенный коровой фукозы), G0-GlcNAc (G0, лишенный одного GlcNAc), Man5, и другие второстепенные гликоформы (Ma and Nashabeh Anal Chem 71:5185-92 (1999)). Олигосахаридные структуры на пертузумабе согласуются со структурами, обнаруженными в СНО-полученных MAb (Ma and Nashabeh, supra) и природных иммуноглобулинах человека (Flynn et al. Mol Immunol 47:2074-82 (2010)).Oligosaccharide with a GO structure is the predominant species in all substances (62% -75%). Glycoform G0 was slightly more common in Series 3-7 and the previous batch of 2C4-900-1 (70% -75%) compared to the current batch of anti2C4907-2 and Series 1 (62% -64%). Glycoform G1 was observed as two peaks corresponding to two isomers with terminal galactose of either of the branches of the two-antenna structure. The areas of these two peaks were pooled to determine the relative amount of glycoform G1. Glycoforms G1 and G2 account for approximately 18% -29% and 1% -3%, respectively, of the released oligosaccharides for all substances. Peaks arising from other oligosaccharide structures were also observed on electropherograms (all present at 3% or less). These structures include G0-F (G0 devoid of core fucose), G0-GlcNAc (G0 devoid of one GlcNAc), Man5, and other minor glycoforms (Ma and Nashabeh Anal Chem 71: 5185-92 (1999)). The oligosaccharide structures on pertuzumab are consistent with those found in CHO-derived MAbs (Ma and Nashabeh, supra) and natural human immunoglobulins (Flynn et al. Mol Immunol 47: 2074-82 (2010)).

Пример 3Example 3

Пептидное картирование и RP-HPLC для характеристики варианта с неспаренными цистеинамиPeptide mapping and RP-HPLC for characterization of unpaired cysteine variant

Материалы: Материалы и устройства, используемые в этих экспериментах, включают: 3-[N-морфолино]пропансульфоновую кислоту (MOPS; Sigma-Aldrich), N-этилмалеимид (d0-NEM; Thermo Scientific, Rockford, II), N-этилмалеимид (d5-NEM; Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA), L-цистеин (Sigma-Aldrich), трипсин (Promega, Madison, WI), трифторуксусную кислоту (TFA; Fisher, Fair Lawn, NJ), ацетонитрил (ACN, Burdick & Jackson, Muskegon, MI). Все химические вещества и реактивы были использованы в том виде, в котором получены, без дополнительной очистки.Materials: Materials and devices used in these experiments include: 3- [N-morpholino] propanesulfonic acid (MOPS; Sigma-Aldrich), N-ethylmaleimide (d0-NEM; Thermo Scientific, Rockford, II), N-ethylmaleimide ( d5-NEM; Cambridge Isotope Laboratories, Andover, MA), L-cysteine (Sigma-Aldrich), trypsin (Promega, Madison, WI), trifluoroacetic acid (TFA; Fisher, Fair Lawn, NJ), acetonitrile (ACN, Burdick & Jackson, Muskegon, MI). All chemicals and reagents were used as received without additional purification.

Дифференциальное мечение антител N-этилмалеим идом (NEM): способ дифференциального NEM мечения дает возможность метить свободные тиолы, уже присутствующие в антителах, с использованием d0-NEM, и сохранять дисульфидные мостики восстановленными и мечеными d5-NEM. Для начального мечения d0-NEM, 100 мкл антитела (3 мг/мл) осторожно перемешивали с 400 мкл денатурирующего буфера (7,5 M GdnHCl, рН 5) содержащего 6,25 мМ d0-NEM, и инкубировали 37°С в течение 2 ч. К образцу добавляли 20 мкл цистеина (125 мМ) и инкубировали 37°С в течение 15 минут для инактивации оставшегося d0-NEM. Для восстановления оставшихся дисульфидных мостиков в антителе к образцу добавляли 10 мкл ТСЕР (0,5 М) и инкубировали 37°С в течение 30 минут. Затем к образцу добавляли 70 мкл d5-NEM (171 мМ) и инкубировали 37°С в течение 2 ч, чтобы пометить свободные тиолы, образовавшиеся путем восстановления дисульфидных мостиков. В 0,5 мл образца, дифференциально меченого NEM, меняли буфер, используя колонки NAP-5, и элюировали 0,6 мл буфера MOPS (20 мМ MOPS, 0,5 мМ ТСЕР, рН 7).Differential labeling of antibodies with N-ethylmaleimide (NEM): The differential NEM labeling method makes it possible to label free thiols already present in antibodies using d0-NEM and keep the disulfide bridges recovered and labeled with d5-NEM. For initial labeling of d0-NEM, 100 μl of antibody (3 mg / ml) was gently mixed with 400 μl of denaturing buffer (7.5 M GdnHCl, pH 5) containing 6.25 mM d0-NEM, and incubated at 37 ° C for 2 h. To the sample was added 20 μl of cysteine (125 mm) and incubated at 37 ° C for 15 minutes to inactivate the remaining d0-NEM. To restore the remaining disulfide bridges in the antibody, 10 μl of TCEP (0.5 M) was added to the sample and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Then, 70 μl of d5-NEM (171 mM) was added to the sample and incubated at 37 ° C for 2 h to mark the free thiols formed by reduction of disulfide bridges. 0.5 ml of sample differentially labeled with NEM was buffered using NAP-5 columns and eluted with 0.6 ml MOPS buffer (20 mM MOPS, 0.5 mM TCEP, pH 7).

Пептидное картирование антител: образцы, дифференциально меченые NEM, расщепляли трипсином в соотношении 1:50 (об/об) трипсин: антитело при 37°С в течение 2 ч. Реакции расщепления гасили 10% TFA. Расщепленные трипсином, дифференциально меченые NEM образцы разделяли, используя систему Agilent 1200 HPLC (Agilent, Palo Alto, С А)..Для хроматографического разделения образцов использовали колонку Jupiter C18 (250×2 мм, 5 мкм) (Phenomenex, Torrance, СА) с размером пор 300 Å. Объем введенной пробы составлял 95 мкл, а температура колонки составляла 55°С. Подвижная фаза А представляла собой 0,1% TFA в воде, а подвижная фаза В представляла собой 0,08% TFA в 90% ACN (об/об). Начальные условия были установлены при 100% подвижной фазы А и поддерживались в течение первых 3 минут после введения образца. Подвижная фаза В повышалась до 10% на протяжении следующих 20 минут, а затем дополнительно повышалась до 40% до 160 минуты и 100% до 162 минуты, везде линейные градиенты. Подвижную фазу В удерживали при 100% до 170 минуты. Колонку снова уравновешивали при 100% подвижной фазы А до 195 минуты. Скорость потока поддерживали при 0,28 мл/мин.Antibody Peptide Mapping: Samples differentially labeled with NEM were trypsinized at a 1:50 (v / v) trypsin: antibody ratio at 37 ° C. for 2 hours. The digestion reactions were quenched with 10% TFA. Trypsin digested, differentially labeled NEM samples were separated using an Agilent 1200 HPLC system (Agilent, Palo Alto, CA). For chromatographic separation of samples, a Jupiter C18 column (250 × 2 mm, 5 μm) (Phenomenex, Torrance, CA) was used with pore size 300 Å. The volume of the injected sample was 95 μL, and the column temperature was 55 ° C. Mobile phase A was 0.1% TFA in water and mobile phase B was 0.08% TFA in 90% ACN (v / v). Initial conditions were set at 100% mobile phase A and maintained for the first 3 minutes after sample injection. Mobile phase B increased to 10% over the next 20 minutes, and then increased further to 40% to 160 minutes and 100% to 162 minutes, linear gradients everywhere. Mobile phase B was held at 100% for up to 170 minutes. The column was equilibrated again at 100% Mobile Phase A for up to 195 minutes. The flow rate was maintained at 0.28 ml / min.

Компонент, элюируемый в результате HPLC, напрямую соединяли с источником ионизации электрораспылением LTQ ORBITRAP™ масс спектрометром, работающим в режиме определения положительных ионов. Напряжение при распылении составляло 4,5 кВ, а температура капилляра составляла 300°С. Масс-спектрометр работал в информационно-зависимом режиме для автоматического переключения между режимами MS и MS/MS. Определение полного сканирования MS спектров получали от m/z 300 до m/z 2000 в FT-Orbitrap с установкой разрешения R=60000 при m/z 400. Пять наиболее интенсивных ионов были фрагментированы в линейной ионной ловушке, используя индуцированную столкновением диссоциацию (CID) при стандартной энергии столкновений 35% со временем активации 30 мсек, и шириной изоляции 2,5 m/z единиц. Функция динамического исключения (DE) была задействована для уменьшения избыточности данных и возможности отбора ионов низкой интенсивности для информационно-зависимых MS/MS сканов. Параметры динамического исключения были следующими: длительность повторов 30 секунд, размер списка исключения 500, длительность исключения 90 секунд, нижняя ширина эксклюзионной массы 0,76,верхняя ширина эксклюзионной массы 1,56, и число повторов 2. Анализ данных проводили, используя программное обеспечение XCALIBUR™.The HPLC eluted component was directly coupled to an LTQ ORBITRAP ™ electrospray ionization source with a mass spectrometer operating in positive mode. The spray voltage was 4.5 kV and the capillary temperature was 300 ° C. The mass spectrometer was operated in an information-dependent mode to automatically switch between MS and MS / MS modes. Full scan MS spectra were acquired from m / z 300 to m / z 2000 in an FT-Orbitrap with a resolution setting of R = 60000 at m / z 400. The five most intense ions were fragmented in a linear ion trap using collision-induced dissociation (CID) at a standard collision energy of 35% with an activation time of 30 ms, and an insulation width of 2.5 m / z units. The dynamic exclusion (DE) feature was used to reduce data redundancy and allow for low ion intensity selection for data-dependent MS / MS scans. The dynamic exclusion parameters were as follows: repeat length 30 seconds, exclusion list size 500, exclusion length 90 seconds, lower exclusion mass width 0.76, upper exclusion mass width 1.56, and number of repetitions 2. Data analysis was performed using XCALIBUR software ™.

Текущую партию стандартного образца пертузумаба анти2С4907-2 анализировали, используя способ, описанный вше. Было обнаружено, что 10,9% T2L пептидов (полученных расщеплением трипсином и содержащие Cys23) и 8,3% T7L пептидов (полученных расщеплением трипсином и содержащие Cys88), были мечены d0-NEM. Поскольку только неспаренные цистеины были мечены d0-NEM в этом эксперименте, эти результаты дают возможность предположить, что приблизительно 10% Cys23 и Cys88 в анти2С49.07-2 не связаны дисульфидной связью (то есть 10% вариантов с неспаренными цистеинами). Используя способ расчета, аналогичный описанному выше, для преобразования процента неспаренных цистеинов Fab варианта в процент неспаренных цистеинов интактного варианта, было определено, что 18% молекул пертузумаба в анти2С4907-2 представляют собой гетеродимерные варианты с неспаренными цистеинами, 1% молекул пертузумаба представляют собой гомодимерные варианты с неспаренными цистеинами, и 81%) представляют собой гомодимерную форму дикого типа (без неспаренных цистеинов). Эти результаты согласуются с результатами анализа HIC либо Fab фрагментов, либо интактного пертузумаба.A current batch of anti2C4907-2 pertuzumab standard sample was analyzed using the method described above. It was found that 10.9% T2L peptides (obtained by digestion with trypsin and containing Cys23) and 8.3% of T7L peptides (obtained by digestion with trypsin and containing Cys88) were labeled with d0-NEM. Since only unpaired cysteines were labeled with d0-NEM in this experiment, these results suggest that approximately 10% of the Cys23 and Cys88 in anti2C49.07-2 are not disulfide-linked (i.e. 10% of the unpaired cysteine variants). Using a calculation method similar to that described above, to convert the percentage of unpaired cysteines of the Fab variant to the percentage of unpaired cysteines of the intact variant, it was determined that 18% of the molecules of pertuzumab in anti2C4907-2 are heterodimeric variants with unpaired cysteines, 1% of molecules of pertuzumab are homodimeric variants with unpaired cysteines, and 81%) represent the wild-type homodimeric form (no unpaired cysteines). These results are consistent with the results of HIC analysis of either Fab fragments or intact pertuzumab.

Ограниченное расщепление эндопротеазой Lys-C для получения Fab: Fab фрагмент MAb А получали путем ограниченного расщепления Lys-C. Вкратце, MAb А (1 мг/мл) перемешивали с ферментом Lys-C в соотношении 1:400 в 100 мМ Трис, рН 7,6, а затем смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут. Реакционную смесь метили NEMin рН 5,5, 350 мМ ацетата натрия и 8 M гуанидин HCl. Продукты расщепления анализировали способом RP-HPLC, описанным ниже.Limited digestion with endoprotease Lys-C to obtain Fab: The Fab fragment of MAb A was prepared by limited digestion with Lys-C. Briefly, MAb A (1 mg / ml) was mixed with Lys-C at a ratio of 1: 400 in 100 mM Tris, pH 7.6, and then the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was labeled with NEMin pH 5.5, 350 mM sodium acetate and 8 M guanidine HCl. Cleavage products were analyzed by RP-HPLC method described below.

Условия проведения RP-HPLC: RP-HPLC анализ проводили на системе AGILENT 1200™ HPLC (Palo Alto, СА, USA), снабженной двухкомпонентным градиентным насосом, автодозатором, колоночным отделением с температурным контролем, и детектором на диодной матрице. Система включала колонку для хроматографии с обращенной фазой Pursuit 3 Dyphenyl (150×4,6 мм, 3 мкм, Varian, Lake Forest, CA, USA), которая хроматографировала при 75°С и со скоростью 1 мл/мин. Разделение подвергали мониторингу, используя поглощение при 280 нм. Подвижная фаза состояла из 0,1% TFA в воде (подвижная фаза А) и 0,09% TFA в ACN (подвижная фаза В). 38-минутный способ начинался с трех минутного градиента от 32% до 36% подвижной фазы В, с последующим 18 минутным линейным градиентом до 42% подвижной фазы В. Колонку промывали при 95% подвижной фазы В в течение 5 минут и уравновешивали при 32% подвижной фазы В в течение 10 минут.RP-HPLC conditions: RP-HPLC analysis was performed on an AGILENT 1200 ™ HPLC system (Palo Alto, CA, USA) equipped with a two-component gradient pump, an autosampler, a temperature controlled column compartment, and a diode array detector. The system included a Pursuit 3 Dyphenyl reversed phase column (150 x 4.6 mm, 3 μm, Varian, Lake Forest, CA, USA), which was chromatographed at 75 ° C. and 1 ml / min. The separation was monitored using absorbance at 280 nm. The mobile phase consisted of 0.1% TFA in water (mobile phase A) and 0.09% TFA in ACN (mobile phase B). The 38 minute run started with a three minute gradient from 32% to 36% mobile phase B, followed by an 18 minute linear gradient to 42% mobile phase B. The column was washed at 95% mobile phase B for 5 minutes and equilibrated at 32% mobile phase B for 10 minutes.

RP-HPLC анализ свободных тиолов Fab, образованных ограниченным расщеплением Lys-C (Фиг. 18) показал, что Fab со свободными тиолами составляет около 13%, что соответствует HIC в примере 1. Fab со свободными тиолами, меченый NEM, становится более гидрофобным, следовательно, элюирует позже по сравнению с Fab со свободными тиолами (Фиг. 18) и дополнительно подтверждение присутствие свободного тиола. Смотри также Фиг. 19, на которой пептидное картирование подтверждает наличие Fab со свободными тиолами.RP-HPLC analysis of free thiol Fabs generated by limited cleavage of Lys-C (Fig. 18) showed that free thiol Fabs are about 13%, which corresponds to the HIC in example 1. Free thiol Fab labeled with NEM becomes more hydrophobic, hence, elutes later than Fabs with free thiols (Fig. 18) and further confirms the presence of free thiols. See also FIG. 19, in which peptide mapping confirms the presence of free thiol Fabs.

Пример 4Example 4

Количественная оценка дефукозилирования с помощью CE-LIFQuantification of defucosylation with CE-LIF

В этом примере описывается полностью утвержденный капиллярный электрофоретический анализ с лазерно-индуцированной флуоресценцией (CE-LIF) для количественной оценки варианта пертузумаба, лишенного фукозы. Модификации способов, описанных в примере 2, приведенном выше, включают: отсутствие автоматизированной подготовки образца, отсутствие стадии очистки с Белком А, обеспечивающее постоянные концентрации белка среди образцов, и изменение электрофоретических параметров (концентрация буферных эксципиентов).This example describes a fully validated capillary electrophoretic assay with laser-induced fluorescence (CE-LIF) to quantify a fucose-free variant of pertuzumab. Modifications to the methods described in Example 2 above include: no automated sample preparation, no purification step with Protein A to ensure constant protein concentrations among samples, and changes in electrophoretic parameters (concentration of buffer excipients).

В этом исследовании образцы пертузумаба разбавляют до 10 мг/мл, используя рецептурный буфер, и буфер меняют на расщепляющий буфер Пептид-N-Гликаназа F (PNGaзa F). Олигосахариды, связанные с аспарагином, затем ферментативно высвобождают, используя PNGазу F. Затем, получают производные высвобожденных гликанов под действием 8-аминопирен-1,3,6-трисульфоновой кислоты (APTS), отрицательно заряженного флуорофора. APTS обеспечивает всем гликанам три отрицательных заряда, что дает возможность провести быстрый электрофоретический анализ. Смесь, содержащая избыток вещества, используемого для получения производных, и конъюгаты APTS-гликан, анализируют посредством СЕ, используя покрытый капилляр, который уменьшает электроосмотический поток. Разделение контролируют с помощью системы индуцированной лазером флуоресценции, используя аргоновый ионный лазер с длиной волны возбуждающего света 488 нм и полосовым фильтром спектра излучения 520 нм.In this study, pertuzumab samples are diluted to 10 mg / ml using prescription buffer and the buffer is exchanged for Peptide-N-Glycanase F (PNGase F) digestion buffer. The oligosaccharides bound to asparagine are then enzymatically released using PNGase F. The released glycans are then derivatized by 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS), a negatively charged fluorophore. APTS provides all glycans with three negative charges, enabling rapid electrophoretic analysis. A mixture containing excess derivatization and APTS-glycan conjugates is analyzed by CE using a coated capillary that reduces the electroosmotic flow. The separation is monitored with a laser-induced fluorescence system using an argon ion laser with an excitation wavelength of 488 nm and a 520 nm bandpass filter.

Используя этот анализ, корреляционный график показан на Фиг. 21. Используя корреляционный график (%ADCC=30,133+12,439х, где x=%G0-F) и диапазон ADCC 40 135%, окончательный вариант описания для пертузумаба соответствует 0,9-4,1% G0-F.Using this analysis, the correlation plot is shown in FIG. 21. Using a correlation plot (% ADCC = 30.133 + 12.439x, where x =% G0-F) and an ADCC range of 40 135%, the final description for pertuzumab is 0.9-4.1% G0-F.

Таким образом, используя этот утвержденный CE-LIF анализ, возможно охарактеризовать композиции пертузумаба для подтверждения, что биологическая активность в значениях ADCC находится в желаемом диапазоне (40-135%) ADCC активности =0,9-4,1% G0-F).Thus, using this CE-LIF validated assay, it is possible to characterize pertuzumab compositions to confirm that the biological activity in ADCC values is within the desired range (40-135%) ADCC activity = 0.9-4.1% G0-F).

Пример 5Example 5

Разновидности пертузумаба с высокой молекулярной массой (HMWS), низкой молекулярной массой (LMWS) и их характеристикаHigh molecular weight (HMWS), low molecular weight (LMWS) varieties of pertuzumab and their characteristics

Пертузумаб анализировали с помощью SE-HPLC и CE-SDS для определения количества разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS), в основном, димера, и разновидностей с низкой молекулярной массой (LMWS). Отсутствовало различие в HMWS при разбавлении, что дает основание предполагать, что агрегаты являются недиссоциирующими. Было хорошее совпадение между результатами аналитического ультрацентрифугирования (AUC) и SE-HPLC в значениях количественной оценки HMWS, показывающее отсутствие доказательств, что эксклюзионная хроматография пропустила или занизила значительные HMWS.Pertuzumab was analyzed by SE-HPLC and CE-SDS to quantify high molecular weight species (HMWS), mainly dimer, and low molecular weight species (LMWS). There was no difference in HMWS upon dilution, suggesting that the aggregates are non-dissociating. There was good agreement between analytical ultracentrifugation (AUC) and SE-HPLC results in HMWS quantification values, showing no evidence that size exclusion chromatography missed or underestimated significant HMWS.

Материалы и методыMaterials and methods

Тестируемые композиции пертузумаба: в этом примере описывается характеристика текущей партии стандартного образца пертузумаба анти2С4907-2 и Серии 1, представляющей клинический материал Фазы III, и пять коммерческих партий Фазы III/ (Серии 3-7), все получены в масштабе 12000 liter (L), используя промышленный способ.Pertuzumab Test Formulations: This example describes the characterization of a current batch of an anti2C4907-2 and Batch 1 pertuzumab standard sample representing Phase III clinical material, and five Phase III / (Batch 3-7) commercial batches, all produced at 12000 liter (L) scale using an industrial method.

Выделенные HMWS: для получения репрезентативных HMWS используемых для биологической характеристики, партию пертузумаба из Серии 3 вводили в систему препаративной HPLC, используя препаративную колонку для SE-HPLC (TSK G3000SW, 21,5 мм × 600 мм) и ту же изократическую подвижную фазу, как описано выше, при скорости 4,5 мл/мин. Разновидности с высокой молекулярной массой фракционно собирали и затем проводили замену буфера на рецептурный буфер. Было показано, что чистота HMWS составляет 70% по данным последующего SE-HPLC анализа с оставшимся преобладающим основным пиком. Основной пик также собирали, и было показано, что чистота составляет 100%.Isolated HMWS: To obtain representative HMWS used for biological characterization, a batch of Pertuzumab from Series 3 was injected into the preparative HPLC system using a preparative SE-HPLC column (TSK G3000SW, 21.5 mm x 600 mm) and the same isocratic mobile phase as described above at a rate of 4.5 ml / min. The high molecular weight species were fractionally harvested and then buffer exchanged with formulation buffer. The HMWS was shown to be 70% pure by subsequent SE-HPLC analysis with a dominant main peak remaining. The main peak was also collected and shown to be 100% pure.

Выделенные LMWS: для получения выделенных LMWS, номер партии из Серии 3 расщепляли папаином и подвергали расщеплению папаином и подвергали сбору фракций, используя препаративную HPLC, как указано выше. Верифицированные преобладающие формы представляли собой Fc и Fab по данным интактного анализа ESI-MS. Было показано, что чистота LMWS составляет be 99% по данным последующей аналитической SE-HPLC. Выделенные варианты Fab также получали, используя обработку папаином, и собирали с помощью препаративной IE-HPLC. Было показано, что чистота варианта Fab составляет 100% по данным последующей аналитической SE-HPLC.Isolated LMWS: To obtain isolated LMWS, batch number from Series 3 was digested with papain and subjected to digestion with papain and fractions were collected using preparative HPLC as above. The predominant forms verified were Fc and Fab as determined by intact ESI-MS analysis. The LMWS was shown to be 99% pure by subsequent analytical SE-HPLC. Isolated Fab variants were also obtained using papain treatment and collected by preparative IE-HPLC. The Fab variant was shown to be 100% pure by subsequent analytical SE-HPLC.

SE-HPLC: Аликвоты пертузумаба разбавляли до 10 мг/мл подвижной фазой (0,2 M фосфата калия, рН 6,2, 0,25 M хлорида калия). Образцы разделяли на колонке TSK G3000SWXL, (7,8 мм × 300 мм), которую элюировали изократически. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин, а температура колонки была при окружающей температуре. Профиль элюции подвергали мониторингу при 280 нм. Для детекции с помощью многоуглового рассеяния света (MALS), образцы пертузумаба разделяли, используя две колонки последовательно соединенные линейно с детектором WYATT DAWN HELEO™ MALS (использующим 658 нм лазер, 17 детекторов) и WYATT OPTILAB™ rex рефрактометрический детектор.SE-HPLC: Aliquots of pertuzumab were diluted to 10 mg / ml with mobile phase (0.2 M potassium phosphate, pH 6.2, 0.25 M potassium chloride). The samples were separated on a TSK G3000SW XL column (7.8 mm x 300 mm), which was eluted isocratically. The flow rate was 0.5 ml / min and the column temperature was at ambient temperature. The elution profile was monitored at 280 nm. For multi-angle light scattering (MALS) detection, pertuzumab samples were separated using two columns in series with a WYATT DAWN HELEO ™ MALS detector (using a 658 nm laser, 17 detectors) and a WYATT OPTILAB ™ rex refractometric detector.

CE-SDS: получали производное каждой партии пертузумаба с использованием 5-карбоксимтетраметилродаминсукцинимидилового сложного эфира, флуоресцентного красителя. После удаления свободного красителя с использованием колонок NAP-5. невосстановленные образцы были получены добавлением 40 мМ йодацетамида и нагреванием при 70°С в течение 5 минут. Для анализа восстановленных образцов производное пертузумаба перемешивали с додецилсульфатом натрия (SDS) и 1 M DTT до конечной концентрации 1% SDS (об/об). Затем образцы нагревали при 70°С в течение 20 минут. Полученные образцы анализировали на системе СЕ, используя капилляр из плавленного кварца 50 мкм внутренний диаметр × 31,2 см, поддерживаемый при 20°С на протяжении всего анализа. Образцы вводили в капилляр путем электрокинетического ввода при 10 кВ в течение 40 секунд. Разделение проводили при постоянном напряжении 15 кВ в режиме обратной полярности (отрицательная к положительной), используя CE-SDS подвижный буфер в качестве фильтрационной среды. Аргоновый ионный лазер, работающий при 488 нм, использовали для возбуждения флуоресценции с получением результирующего сигнала эмиссии, контролируемого при 560 нм.CE-SDS: Received a derivative of each batch of pertuzumab using 5-carboxymethyl rhodamine succinimidyl ester, a fluorescent dye. After removing free dye using NAP-5 columns. unreduced samples were obtained by adding 40 mM iodoacetamide and heating at 70 ° C for 5 minutes. For the analysis of recovered samples, the pertuzumab derivative was mixed with sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1 M DTT to a final concentration of 1% SDS (v / v). Then the samples were heated at 70 ° C for 20 minutes. The resulting samples were analyzed on a CE system using a 50 µm fused silica capillary inner diameter × 31.2 cm, maintained at 20 ° C. throughout the analysis. Samples were introduced into the capillary by electrokinetic injection at 10 kV for 40 seconds. Separation was carried out at a constant voltage of 15 kV in reverse polarity (negative to positive) mode using a CE-SDS moving buffer as a filtration medium. An argon ion laser operating at 488 nm was used to excite the fluorescence to produce a resulting emission signal monitored at 560 nm.

Результаты и обсуждениеResults and discussion

SE-HPLC представляет количественную информацию примерного распределения по размеру молекул нативного белка. Профили SE-HPLC для партий пертузумаба показаны на Фиг. 25, а развернутый вид профилей показан на Фиг. 26. Относительное распределение, по площади пика эксклюзионных пиков приведено в таблице 10.SE-HPLC provides quantitative information on the approximate molecular size distribution of the native protein. SE-HPLC profiles for batches of pertuzumab are shown in FIG. 25, and the expanded view of the profiles is shown in FIG. 26. The relative distribution, over the peak area of the exclusion peaks, is shown in Table 10.

Figure 00000010
Figure 00000010

Доля пертузумаба, элюирующего в основном пике, составляла более 99% для всех веществ. Количество разновидностей в высокой молекулярной массой (HMWS) находилось в интервале от 0,1% до 0,2%, а количество разновидностей с низкой молекулярной массой (LMWS) составляло ≤0,1%. Все партии показали сходные хроматографические профили. Было показано, что очищенная фракция HMWS, включающая димеры и агрегаты более высокой степени, имеет 46% специфическую активность по сравнению с партией стандартного образца анти2С4907-2.The fraction of pertuzumab eluting in the main peak was more than 99% for all substances. The number of high molecular weight species (HMWS) ranged from 0.1% to 0.2%, and the number of low molecular weight species (LMWS) was ≤0.1%. All batches showed similar chromatographic profiles. It was shown that the purified HMWS fraction, including higher dimers and aggregates, has 46% specific activity compared to the anti2C4907-2 standard batch.

SE-HPLC проводили как с чистыми, так и с разбавленными образцами, выдерживаемыми при 30°С для изучения HMWS пертузумаба как в отношении быстро, так и в отношении медленно диссоциирующих агрегатов, которые могли быть результатом разбавления и/или длительного воздействия повышенной комнатной температуры. Отсутствовало снижение содержания HMWS разбавленной и/или нагретой партии стандартного образца анти2С4907-2 по сравнению с контролем.SE-HPLC was performed on both pure and diluted samples held at 30 ° C to study pertuzumab HMWS for both rapidly and slowly dissociating aggregates that could result from dilution and / or prolonged exposure to elevated room temperature. There was no decrease in the HMWS content of the diluted and / or heated batch of the anti2C4907-2 standard as compared to the control.

SE-HPLC разделение, объединенное с MALS, проведенное с партией стандартного образца анти2С4907-2, подтвердило, что основной пик SE-HPLC представляет собой мономер, с молекулярной массой приблизительно 150 кДа.SE-HPLC separation, combined with MALS, carried out with a batch of anti2C4907-2 standard sample, confirmed that the main SE-HPLC peak is a monomer with a molecular weight of approximately 150 kDa.

AUC в режиме скорости седиментации использовали для характеристики HMWS, находящихся в образцах пертузумаба. Скорость седиментации представляет собой методику, не зависимую от эксклюзионной хроматографии, которая измеряет уровни HMWS в образце в отсутствии твердой матрицы колонки. AUC проводили на образцах пертузумаба с повышающимися уровнями HMWS для определения способности SE-HPLC одинаково обнаруживать все основные HMWS пертузумаба, путем сравнения уровней и видов агрегатов, определенных скоростью седиментации, для обнаруженных с помощью SE-HPLC. Пять образцов в интервале от 0,2% до 7,2% всех HMWS (обнаруженных с помощью SE-HPLC) были охарактеризованы скоростью седиментации и обозначены A-Ε в таблице 11 и на Фиг. 27.AUC at sedimentation rate mode was used to characterize the HMWS present in pertuzumab samples. Sedimentation Rate is a SEC independent technique that measures HMWS levels in a sample in the absence of a solid column matrix. AUC was performed on samples of pertuzumab with increasing levels of HMWS to determine the ability of SE-HPLC to equally detect all major HMWS of pertuzumab by comparing the levels and types of aggregates determined by sedimentation rate to those detected by SE-HPLC. Five samples ranging from 0.2% to 7.2% of all HMWS (detected by SE-HPLC) were characterized by sedimentation rate and are designated A-in Table 11 and FIG. 27.

Эти образцы состояли из репрезентативной партии лекарственного препарата пертузумаб (отмечено А) и четырех образцов, обогащенных HMWS. Образцы, обогащенные HMWS, были выбраны как репрезентативные для широкого ряда механизмов разрушения (воздействие света, воздействие кислого рН и очищенные IE-HPLC основные варианты),.These samples consisted of a representative batch of the drug product pertuzumab (labeled A) and four samples fortified with HMWS. Samples enriched in HMWS were selected as representative of a wide range of degradation mechanisms (exposure to light, exposure to acidic pH and purified IE-HPLC basic variants).

SE-HPLC показала один основной пик HMWS для образцов А, В, С и Ε и два пика HMWS для образца D (Фиг. 27). Для образцов А, В, С и Е, AUC показало только один пик HMWS с коэффициентом седиментации примерно 9,1S. В образце D, AUC показало два пика HMWS с коэффициентами седиментации примерно 9,1S и 10,8S. HMWS, обнаруженные с помощью AUC совпадали с результатами SE-HPLC; оба способа показали одни основной продукт разрушения, с минимальными уровнями более крупных HMWS в образце D.SE-HPLC showed one major HMWS peak for samples A, B, C and Ε and two HMWS peaks for sample D (Fig. 27). For samples A, B, C and E, the AUC showed only one HMWS peak with a sedimentation coefficient of approximately 9.1S. In Sample D, the AUC showed two HMWS peaks with sedimentation ratios of approximately 9.1S and 10.8S. HMWS detected by AUC matched SE-HPLC results; both methods showed the same major degradation product, with minimal levels of larger HMWS in Sample D.

Сравнение количественных результатов этих образцов по данным двух способов представлено в таблице 11.Comparison of the quantitative results of these samples according to the two methods is presented in table 11.

Figure 00000011
Figure 00000011

Для образцов С, D и Е существует хорошее соответствие в проценте HMWS, определенном с помощью обеих методик. Низкий уровень HMWS, находящихся в образцах А и В, препятствует точному количественному определению разновидностей с помощью AUC, которое имеет предел оценки количественного определения 3,7% (Gabrielson and Arthur, Methods 54:83-91 (2011)). Это отражается очевидным расхождением в проценте HMWS между SE-HPLC и AUC (таблица 11). Оценивали корреляцию по всему диапазону уровней HMWS Вычисленный коэффициент корреляции (Lin, L, Biometrics 45:255-68 (1989)) составил 0,97 (n=5), указывая на хорошее соответствие между AUC и SE-HPLC для количественного определения HMWS (Фиг. 28).For samples C, D and E, there is good agreement in the percentage of HMWS determined using both methods. The low level of HMWS found in Samples A and B precludes accurate quantification of species by the AUC, which has a quantification limit of 3.7% (Gabrielson and Arthur, Methods 54: 83-91 (2011)). This is reflected by the apparent discrepancy in the percentage of HMWS between SE-HPLC and AUC (Table 11). Correlation was assessed over the entire range of HMWS levels.The calculated correlation coefficient (Lin, L, Biometrics 45: 255-68 (1989)) was 0.97 (n = 5), indicating good agreement between AUC and SE-HPLC for quantifying HMWS ( Fig. 28).

Эти результаты подтверждают, что SE-HPLC является надежным способом измерения HMWS для пертузумаба. SE-HPLC обладает способностью обнаруживать и точно количественно определять все разновидности HMWS, наблюдаемые с помощью AUC.These results confirm that SE-HPLC is a reliable method for measuring HMWS for pertuzumab. SE-HPLC has the ability to detect and accurately quantify all HMWS species observed by AUC.

Гетерогенность, основанная на размере, проанализированная с помощью SE-HPLC, SDS-PAGE и CE-SDS, была сопоставимой среди всех партий. SE-HPLC анализ показал, что сходные уровни HMWS (0,1%-0,2%) и LMWS (0,0%-0,1%) для всех протестированных партий. Профили полос, выявленных с помощью SDS-PAGE анализа для восстановленных и невосстановленных образцов совпадали с электрофоретическими профилями, полученными с помощью CE-SDS.Size-based heterogeneity analyzed by SE-HPLC, SDS-PAGE and CE-SDS was comparable across all batches. SE-HPLC analysis showed similar levels of HMWS (0.1% -0.2%) and LMWS (0.0% -0.1%) for all batches tested. Band profiles detected by SDS-PAGE analysis for recovered and unreduced samples matched the electrophoretic profiles obtained using CE-SDS.

В одном варианте осуществления количества основных видов пертузумаба и варианта HMWS и варианта LMWS, определенных с помощью SE-HPLC представляли собой следующее:In one embodiment, the SE-HPLC numbers of the main species of pertuzumab and HMWS variant and LMWS variant were as follows:

≥96% Основной пик например ≥96,7% Основной пик, например ≥97,3% Основной пик например ≥97,4% Основной пик ≤2% HMWS, например ≤1,7% HMWS, например ≤1,5% HMWS, например ≤1,4% HMWS, например ≤0,8% HMWS.≥96% Main peak e.g. ≥96.7% Main peak e.g. ≥97.3% Main peak e.g. ≥97.4% Main peak ≤2% HMWS e.g. ≤1.7% HMWS e.g. ≤1.5% HMWS e.g. ≤1.4% HMWS, e.g. ≤0.8% HMWS.

≤2% LMWS, например ≤1,6% LMWS, например ≤1,2% LMWS, например ≤0,6% LMWS.≤2% LMWS, for example ≤1.6% LMWS, for example ≤1.2% LMWS, for example ≤0.6% LMWS.

Обе фракции пертузумаба HMWS и LMWS, очищенные с помощью SE-HPLC, демонстрировали сниженную антипролиферативную активность по сравнению с основным пиком и контролем, который был полностью активным. Варианты всех размеров показали сопоставимую активность связывания HER2 и активность связывания FcRn по сравнению с контролем, за исключением LMWS, которые показали более низкое связывание с FcRn. Поскольку образец LMWS содержит 2/3 Fab фрагментов и 1/3 Fc фрагментов, ожидается более низкая антипролиферативная и FcRn связывающая активность. HMWS показали более высокую активность связывания с FcγRIIIa (CD16) VI58, но более низкую ADCC активность. LMWS показали более низкую активность связывания FcγRIIIa (CD 16) V158, a ADCC активность не наблюдалась для этого варианта (таблица 12).Both fractions of pertuzumab HMWS and LMWS purified by SE-HPLC showed reduced antiproliferative activity compared to the main peak and control, which was fully active. Variants of all sizes showed comparable HER2 binding activity and FcRn binding activity compared to control, with the exception of LMWS, which showed lower binding to FcRn. Since the LMWS sample contains 2/3 Fab fragments and 1/3 Fc fragments, lower antiproliferative and FcRn binding activity is expected. HMWS showed higher binding activity to FcγRIIIa (CD16) VI58, but lower ADCC activity. LMWS showed lower binding activity of FcγRIIIa (CD 16) V158, and ADCC activity was not observed for this variant (Table 12).

Figure 00000012
Figure 00000012

Капиллярный электрофорез с додецилсульфатом натрия (CE-SDS): детекторный анализ CE-SDS с индуцированной лазером флуоресценцией (LIF) представляет собой высокочувствительный анализ, который обеспечивает средство количественной оценки распределения белков по размеру молекул в денатурирующих условиях. При CE-SDS анализе невосстановленных образцов (Фиг. 29), пертузумаб перемещался в виде высокого пика, составляющего 96%-98% всей площади пика с меньшими пиками, представляющими LMWS и HMWS. Количество HMWS, определенное с помощью этой методики, составило 0,6% для всех протестированных веществ. Оставшиеся виды перемещаются в виде LMWS, как показано на Фиг. 30 (развернутый вид). Фрагментация образца, индуцированная нагреванием, минимизируется алкилированием (Salas-Solano et al. Anal Chem 78:6583-6594 (2006)). Относительное распределение видов, разделенных с помощью CE-SDS, представлено в таблице 13.Capillary Sodium Dodecyl Sulfate Electrophoresis (CE-SDS): The CE-SDS laser-induced fluorescence (LIF) detector assay is a highly sensitive assay that provides a means of quantifying protein molecular size distribution under denaturing conditions. In CE-SDS analysis of unreduced samples (Fig. 29), pertuzumab moved as a high peak, representing 96% -98% of the total peak area, with smaller peaks representing LMWS and HMWS. The amount of HMWS determined using this method was 0.6% for all substances tested. The remaining views move in the LMWS view as shown in FIG. 30 (expanded view). Heat-induced fragmentation of the sample is minimized by alkylation (Salas-Solano et al. Anal Chem 78: 6583-6594 (2006)). The relative distribution of species separated by CE-SDS is shown in Table 13.

Figure 00000013
Figure 00000013

Наблюдалось незначительное отличие, где Пик 6 увеличивался от 0,9% в партии стандартного образца анти2С4-900-1 (процесс Фазы I/II) до 1,7%-2,3% для партии стандартного образца анти2С4907-2, Серия 1 и Серии 3-7.There was a slight difference where Peak 6 increased from 0.9% in the anti2C4-900-1 standard batch (Phase I / II process) to 1.7% -2.3% for the anti2C4907-2 standard batch, Series 1 and Series 3-7.

В одном варианте осуществления основной пик пертузумаба (за исключением LMWS и HMWS), разделенный или выделенный с помощью NR-CE-SDS, составляет примерно от 95% примерно до 99%, например, примерно от 96,0% примерно до 97,8%. Необязательно, количество HMWS составляет ≤1%, например ≤0,6%, а количество LMWS составляет ≤4%, например ≤3,4% разделенных или выделенных с помощью CE-SDS.In one embodiment, the main peak of pertuzumab (excluding LMWS and HMWS), separated or isolated by NR-CE-SDS, is from about 95% to about 99%, such as from about 96.0% to about 97.8% ... Optionally, the amount of HMWS is ≤1%, for example, ≤0.6%, and the amount of LMWS is ≤4%, for example, ≤3.4% separated or isolated by CE-SDS.

Пример 6Example 6

Обнаружение и количественная оценка фрагментации пертузумабаDetection and quantification of pertuzumab fragmentation

Целью этого примера была оценка способов эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC), капиллярного электрофореза с додецилсульфатом натрия в редуцирующих условиях (R-CE-SDS), и CE-SDS в нередуцирующих условиях (NR-CE-SDS) для обнаружения фрагментов пертузумаба.The purpose of this example was to evaluate the methods of size exclusion chromatography (SE-HPLC), capillary electrophoresis with sodium dodecyl sulfate under reducing conditions (R-CE-SDS), and CE-SDS under non-reducing conditions (NR-CE-SDS) for the detection of fragments of pertuzumab.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫMATERIALS AND METHODS

Образцы, характеризуемые в этом исследовании, суммированы ниже. Они включают образцы пертузумаба, которые подвергались различным стрессовым условиям, которые в результате могли привести к повышенной фрагментации.The samples characterized in this study are summarized below. These include samples of pertuzumab that have been exposed to various stress conditions that could result in increased fragmentation.

- Стандартный образец (2С4907-2)- Standard sample (2S4907-2)

- Подвергнутый термическому воздействию (42 дня, 40°С)- Thermally exposed (42 days, 40 ° C)

- Обработанный кислотой (рН 3,2, 1 день, 40°С)- Acid-treated (pH 3.2, 1 day, 40 ° C)

- Ускоренная стабильность (30 дней при 40°С, затем хранение приблизительно при 5°С)- Accelerated stability (30 days at 40 ° C, then storage at approximately 5 ° C)

- Реальное время стабильности лекарственного препарата (DP) (Т=0 и Т=548 дней и хранение приблизительно при 5°С) и соответствующего лекарственного вещества (DS)- Real time stability of the drug (DP) (T = 0 and T = 548 days and storage at approximately 5 ° C) and the corresponding drug substance (DS)

SE-HPLC проводили как описано в примере 5, приведенном выше, со следующими сообщаемыми величинами: LMWS, Основной пик, HMWS, и все другие значительные пики выше предела количественного определения (LOQ).SE-HPLC was performed as described in Example 5 above, with the following reported values: LMWS, Main peak, HMWS, and all other significant peaks above the limit of quantification (LOQ).

CE-SDS в редуцирующих условиях (R-CE-SDS) проводили в соответствии с примером 5, приведенном выше, с сообщаемыми величинами: Пик 1, LC, Пик 2, Пик 3, NGHC, НС, Пик 5, Неп. восст., и другие значительные пики выше LOQ.CE-SDS under reducing conditions (R-CE-SDS) was performed in accordance with example 5 above, with the reported values: Peak 1, LC, Peak 2, Peak 3, NGHC, HC, Peak 5, Ep. recovery, and other significant peaks above LOQ.

CE-SDS в нередуцирующих условиях (NR-CE-CDS) проводили, как описано в примере 5, приведенном выше, с получением образцов, исключающим стадию восстановления антитела, для возможности проведения анализа в нередуцирующих условиях дитиотреитолом (DTT), отщепляемым в результате стадии комплексообразования SDS.CE-SDS under non-reducing conditions (NR-CE-CDS) was carried out as described in example 5 above, to obtain samples that exclude the step of antibody reduction, to allow analysis under non-reducing conditions with dithiothreitol (DTT), cleaved as a result of the complexation step SDS.

Качественные результаты, полученные с помощью SE-HPLC, NR-CE-SDS и R-CE-SDS, представлены на фиг. 31А-В, фиг. 32А-В и фиг. 33А-В, соответственно, а также в таблицах 14, 15 и 16, соответственно.The qualitative results obtained by SE-HPLC, NR-CE-SDS and R-CE-SDS are shown in FIG. 31A-B, FIG. 32A-B and FIG. 33A-B, respectively, and also in Tables 14, 15 and 16, respectively.

Идентификации пиков основаны на Hunt & Nashabeh Analytical Chemistry 71: 2390-2397 (1999) и Ma & Nashabeh Chromatographia Supplement 53: S75-S89 (2001). Для NR-CE-SDS анализа небольшой пик после Пика 2 обычно включен в виде части Пика 2 во время предоставления данных. Для этого исследования этот небольшой пик представлен отдельно в виде Пика 2а, чтобы отличить этот фрагмент от легкой цепи (LC).Peak identifications are based on Hunt & Nashabeh Analytical Chemistry 71: 2390-2397 (1999) and Ma & Nashabeh Chromatographia Supplement 53: S75-S89 (2001). For NR-CE-SDS analysis, a small peak after Peak 2 is usually included as part of Peak 2 at the time of data submission. For this study, this small peak is presented separately as Peak 2a to distinguish this fragment from the light chain (LC).

Figure 00000014
Figure 00000014

Figure 00000015
Figure 00000015

Figure 00000016
Figure 00000016

Анализ данных: процент площади пика (или процент скорректированной площади пика, %СРА, или CE-SDS) релевантных фрагментов сравнивали для определения, обеспечивает ли какой-либо из CE-SDS способов неизбыточные данные по сравнению с SE-HPLC. Релевантные фрагменты включают пики с неизвестной структурой, или те, которые, как известно, содержат продукты, полученные в результате расщепления полипептидной цепи (цепей). Эти фрагменты отличаются от диссоциируемых фрагментов тяжелой и/или легкой цепи, не связанных дисульфидной связью, которые присутствуют в продуктах антител и обычно наблюдаются с помощью CE-SDS. Пики фрагментов должны быть отделены от других пиков для обеспечения чувствительного обнаружения и точного количественного определения.Data Analysis: The percentage of peak area (or percentage of corrected peak area,% CPA, or CE-SDS) of the relevant fragments was compared to determine if any of the CE-SDS methods provided non-redundant data compared to SE-HPLC. Relevant fragments include peaks of unknown structure, or those known to contain cleavage products of the polypeptide chain (s). These fragments differ from the dissociated fragments of the heavy and / or light chain, not linked by a disulfide bond, which are present in antibody products and are usually observed by CE-SDS. Fragment peaks must be separated from other peaks to provide sensitive detection and accurate quantification.

Способность обнаруживать небольшие фрагменты: небольшие фрагменты могут наблюдаться как в R-CE-SDS, так и в NR-CE-SDS анализе, и они обозначены как Пик 1 в обоих анализах. Эти пики сохраняют одинаковую общую форму и время перемещения, и сходство увеличивается в стрессовых условиях в обоих анализах. Следовательно, предполагается, что Пик 1 содержит одинаковые виды в обоих анализах. Оба CE-SDS анализа способны обнаруживать небольшие фрагменты, как отмечено в таблице 17.Ability to detect small fragments: Small fragments can be observed in both R-CE-SDS and NR-CE-SDS analyzes and are designated as Peak 1 in both analyzes. These peaks retain the same overall shape and travel time, and the similarity increases under stress conditions in both analyzes. Therefore, it is assumed that Peak 1 contains the same species in both analyzes. Both CE-SDS assays are capable of detecting small fragments as noted in Table 17.

Пригодность для обнаружения фрагментов, образованным кислым гидролизом (кислые зажимы): длительное воздействие кислых условий может образовывать фрагменты, в частности, в последовательности Asp-Pro (остатки тяжелой цепи пертузумаба 272-273), как подтверждено масс-спектрометрическим анализом образцов, обработанных кислотой, показывающих массы на уровне 29039 Да (НС 1-272) и 21513Даа (НС 273-448 с G0 гликаном). Теоретические массы этих форм составляют 29031 Да и 21510 Да, соответственно. Исходя из ожидаемого времени перемещения этих форм, соответствующий пик можно ясно увидеть в CE-SDS анализе образца, обработанного кислотой, в редуцирующих условиях (Пик 2, Фиг. 34), но определяется на гораздо более низком уровне (более низкий сигнал) в анализе в нередуцирующих условиях. Можно предположить, что в NR-CE-SDS анализе фрагмент Пика 2, возможно, является дисульфид связанным, и, следовательно, не обнаруживаемым. Поскол(ку уровень Пика 2, детектируемого с помощью R-CE-SDS (5,58%) в образце, обработанном кислотой, превышает суммарные LMWS по данным SE-HPLC (0,26%) для этого образца, можно сделать вывод о том, что SE-HPLC также является недостаточным для детекции этих форм. Следовательно, CE-SDS анализ в редуцирующих условиях является единственным анализом, представленным в настоящей заявке, способный обнаружить фрагментацию, образовавшуюся как результат кислого гидролиза, как отмечено в таблице 17.Suitability for detection of fragments formed by acidic hydrolysis (acidic clamps): prolonged exposure to acidic conditions can form fragments, in particular in the Asp-Pro sequence (residues of the heavy chain of pertuzumab 272-273), as confirmed by mass spectrometric analysis of samples treated with acid. showing masses at the level of 29039 Da (HC 1-272) and 21513 Daa (HC 273-448 with G0 glycan). The theoretical masses of these forms are 29031 Da and 21510 Da, respectively. Based on the expected travel times of these forms, the corresponding peak can be clearly seen in the CE-SDS analysis of the acid treated sample under reducing conditions (Peak 2, Fig. 34), but is determined at a much lower level (lower signal) in the analysis in non-reducing conditions. It can be assumed that, in the NR-CE-SDS analysis, the Peak 2 fragment is possibly disulfide bound, and therefore not detectable. As the level of Peak 2 detected by R-CE-SDS (5.58%) in the acid-treated sample exceeds the total LMWS according to SE-HPLC (0.26%) for this sample, it can be concluded that that SE-HPLC is also insufficient to detect these forms.Therefore, CE-SDS analysis under reducing conditions is the only analysis presented in this application, capable of detecting fragmentation formed as a result of acid hydrolysis, as noted in table 17.

Пригодность для обнаружения фрагментов Fab/DesFab: существует хорошая линейная корреляция (r2=0,97) между LMWS, по данным SE-HPLC, и Пиком 3, полученным в результате CE-SDS анализа в нередуцирующих условиях (Фиг. 35). Было установлено, что LMWS содержат Fab фрагмент во время исследований ко-элюции с ферментативно полученным Fab. Аналогичным образом, Пик 3 и Пик 5 в NR-CE-SDS анализе были идентифицированы в время исследований совместного перемещения с ферментативно полученными Fab и DesFab, соответственно (Ma & Nashabeh, supra). Пик desFab является результатом расщепления тяжелой цепи, которая образует форму Fab, поэтому предполагают, что находится в эквивалентном молярном количестве (соответствует массовому соотношению 2:1) относительно Fab фрагмента, и, следовательно, информация об этой форме также может быть опосредовано получена с помощью SE-HPLC, как отмечено в таблице 17.Suitability for Fab / DesFab Fragment Detection: There is a good linear correlation (r 2 = 0.97) between LMWS as measured by SE-HPLC and Peak 3 from CE-SDS analysis under non-reducing conditions (Fig. 35). LMWS were found to contain the Fab fragment during co-elution studies with enzymatically generated Fabs. Likewise, Peak 3 and Peak 5 in the NR-CE-SDS assay were identified during co-movement studies with enzymatically derived Fab and DesFab, respectively (Ma & Nashabeh, supra). The desFab peak is the result of the cleavage of the heavy chain that forms the Fab form, therefore, it is assumed that it is in an equivalent molar amount (corresponding to a weight ratio of 2: 1) relative to the Fab fragment, and therefore information about this form can also be mediated using SE -HPLC, as noted in Table 17.

Figure 00000017
Figure 00000017

CE-SDS в редуцирующих условиях Пик 3: R-CE-SDS Пик 3 является единственным для пертузумаба и не наблюдался в CE-SDS анализе для других антител. Расширенная характеристика дает подтверждение выводу о том, что Пик 3 не является вариантом продукта или примесью, а скорее обусловленный способом артефакт, специфичный для пертузумаба, состоящего из диссоциируемой формы димера LC-LC. Были использованы многочисленные методики для характеристики Пика 3.CE-SDS under reducing conditions Peak 3: R-CE-SDS Peak 3 is the only one for pertuzumab and was not observed in the CE-SDS assay for other antibodies. Expanded characterization supports the conclusion that Peak 3 is not a product variant or impurity, but rather a process-related artifact specific to pertuzumab consisting of a dissociable form of the LC-LC dimer. Numerous techniques have been used to characterize Peak 3.

Пик 3 наблюдается с помощью R-CE-SDS с UV и LIF детекцией, что дает возможность предположить, что это не меченый красителем артефакт или артефакт получения образца.Peak 3 is observed with R-CE-SDS with UV and LIF detection, suggesting that this is not a dye-labeled artifact or a sample acquisition artifact.

При анализе с помощью R-CE-SDS, фракции легкой цепи очищенного пертузумаба образуют Пик 3, имеющий приблизительно 2-кратную кажущуюся молекулярную массу от теоретического размера LC.When analyzed by R-CE-SDS, the light chain fractions of purified pertuzumab form Peak 3 having approximately 2 times the apparent molecular weight of the theoretical LC size.

Пик 3 не наблюдается в тех случаях, когда электрофоретические условия включают более высокую температуру капилляра, и в этих условиях не наблюдаются другие совместно перемещающиеся фрагменты.Peak 3 is not observed when the electrophoretic conditions include a higher capillary temperature and no other co-moving fragments are observed under these conditions.

Исследования, включающие единичные аминокислотные мутации, идентифицировали три аминокислотных остатка в LC CDR1 и CDR2, коррелирующие с образованием димера LC-LC. В тех случаях, когда любой из этих трех остатков заменяется другой аминокислотой, Пик 3 полностью диссоциирует и больше не наблюдается в CE-SDS в редуцирующих условиях.Studies involving single amino acid mutations identified three amino acid residues in LC CDR1 and CDR2, correlated with the formation of an LC-LC dimer. In cases where any of these three residues are replaced by another amino acid, Peak 3 completely dissociates and is no longer observed in CE-SDS under reducing conditions.

SDS-PAGE анализ в сочетании с MALDI-TOF идентификаций белков по отпечаткам пептидных масс (PMF) подтвердил отсутствие белков клетки-хозяина в пертузумабе, и аналогичных полос, обнаруженных на уровнях, наблюдаемых с помощью CE-SDS.SDS-PAGE analysis in conjunction with MALDI-TOF peptide mass fingerprint (PMF) protein identifications confirmed the absence of host cell proteins in pertuzumab, and similar bands found at levels observed with CE-SDS.

Взятые вместе, эти результаты подтверждают идентификацию Пика 3 как обусловленного способом LC-LC димера, специфичного для пертузумаба.Taken together, these results support the identification of Peak 3 as an LC-LC-mediated dimer specific for pertuzumab.

ОбсуждениеDiscussion

Оценка данных, полученных в результате этого исследования, показывает, что:An assessment of the data obtained from this study shows that:

(1) NR-CE-SDS предоставляет неизбыточную информацию по сравнению с SE-HPLC для обнаружения фрагментов.(1) NR-CE-SDS provides non-redundant information over SE-HPLC for fragment detection.

(2) Неизбыточная информация о фрагментации, полученная с помощью способа NR-CE-SDS (по сравнению с SE-HPLC) также может быть получена с использованием способа R-CE-SDS(2) Non-redundant fragmentation information obtained by the NR-CE-SDS method (compared to SE-HPLC) can also be obtained using the R-CE-SDS method

Как показано в таблице 16, анализ в редуцирующих условиях обнаруживал продукты расщепления в результате воздействия низкого рН, что может иметь место во время производства лекарственного вещества. Таблица 18 содержит значения, полученные для Пика 1 и Пика 2 в CE-SDS в редуцирующих условиях для стандартного образца пертузумаба, вещества фазы III (n=3), и партий, полученных с использованием промышленного процесса производства (n=39). 95/99 допустимые интервалы (TI) были рассчитаны для Пика 1 и Пика 2, используя величину к 3,2, и представлены в таблице 18. Допустимый интервал 95/99 для Пика 1 составляет от 0,0 до 0,4%СРА. Допустимый интервал 95/99 для Пика 2 составляет от 0,3 до 0,9%СРА.As shown in Table 16, the analysis under reducing conditions detected degradation products from exposure to low pH, which can occur during drug manufacture. Table 18 contains the values obtained for Peak 1 and Peak 2 in CE-SDS under reducing conditions for the standard sample of pertuzumab, phase III substance (n = 3), and batches obtained using the industrial process (n = 39). The 95/99 tolerance intervals (TIs) were calculated for Peak 1 and Peak 2 using a value of 3.2 and are presented in Table 18. The 95/99 tolerance interval for Peak 1 is 0.0 to 0.4% CPA. The acceptable 95/99 range for Peak 2 is 0.3 to 0.9% CPA.

Figure 00000018
Figure 00000018

Figure 00000019
Figure 00000019

Figure 00000020
Figure 00000020

Окончательные критерии соответствия Пика 1≤0,5% и Пика 2≤1,0% в отношении высвобождения лекарственного вещества, выбраны в настоящем изобретении.The final matching criteria for Peak 1 0.5% and Peak 2 1.0% for drug release are selected in the present invention.

Поскольку лекарственное вещество пертузумаба хранят замороженным, не ожидается изменений в стабильности DS. Кроме того, исходя из данных R-CE-SDS, полученных для лекарственного препарата как при Т=0, так и T548d (таблица 19), значительного изменения не наблюдается для любого из названных видов.Since the pertuzumab drug substance is stored frozen, no change in DS stability is expected. In addition, based on the R-CE-SDS data obtained for the drug at both T = 0 and T548d (Table 19), no significant change was observed for any of the named species.

Figure 00000021
Figure 00000021

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LIST OF SEQUENCES

<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК.<110> JENENTECH, INC.

ГЕННАРО, ЛИНН А. GENNARO, LYNN A.

КАО, ЮН-СЯН KAO, YUN-XIAN

ЧЗАН, ЮНХУА ZANG, YUNHUA

<120> ВАРИАНТЫ ПЕРТУЗУМАБА И ИХ АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА<120> OPTIONS OF PERTUZUMAB AND THEIR ANALYTICAL CHARACTERISTICS

<130> P5584R1-WO<130> P5584R1-WO

<141> 2014-04-15<141> 2014-04-15

<150> US 61/812,603<150> US 61 / 812,603

<151> 2013-04-16<151> 2013-04-16

<160> 24<160> 24

<210> 1<210> 1

<211> 195<211> 195

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 1<400> 1

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala

1 5 10 15 1 5 10 15

Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly

20 25 30 20 25 30

Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr

35 40 45 35 40 45

Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly

50 55 60 50 55 60

Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln

65 70 75 65 70 75

Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

80 85 90 80 85 90

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr

95 100 105 95 100 105

Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu

110 115 120 110 115 120

Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg

125 130 135 125 130 135

Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile

140 145 150 140 145 150

Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn

155 160 165 155 160 165

Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser

170 175 180 170 175 180

Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg

185 190 195 185 190 195

<210> 2<210> 2

<211> 124<211> 124

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 2<400> 2

Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro

20 25 30 20 25 30

Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly

35 40 45 35 40 45

Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp

50 55 60 50 55 60

Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly

65 70 75 65 70 75

Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp

80 85 90 80 85 90

Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val

95 100 105 95 100 105

Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro

110 115 120 110 115 120

Cys Ala Arg Val Cys Ala Arg Val

<210> 3<210> 3

<211> 169<211> 169

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 3<400> 3

Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe

20 25 30 20 25 30

Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala

35 40 45 35 40 45

Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu

50 55 60 50 55 60

Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

65 70 75 65 70 75

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile

80 85 90 80 85 90

Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln

95 100 105 95 100 105

Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu

110 115 120 110 115 120

Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe

125 130 135 125 130 135

Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln

140 145 150 140 145 150

Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly

155 160 165 155 160 165

Glu Gly Leu Ala Glu Gly Leu Ala

<210> 4<210> 4

<211> 142<211> 142

<212> PRT<212> PRT

<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens

<400> 4<400> 4

Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys

20 25 30 20 25 30

Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val

35 40 45 35 40 45

Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln

50 55 60 50 55 60

Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val

65 70 75 65 70 75

Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys

80 85 90 80 85 90

Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys

95 100 105 95 100 105

Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys

110 115 120 110 115 120

Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu

125 130 135 125 130 135

Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr

140 140

<210> 5<210> 5

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 5<400> 5

Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30 20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys

35 40 45 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

50 55 60 50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile

65 70 75 65 70 75

Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90 80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

95 100 105 95 100 105

Ile Lys Ile Lys

<210> 6<210> 6

<211> 119<211> 119

<212> PRT<212> PRT

<213> Mus musculus<213> Mus musculus

<400> 6<400> 6

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30 20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Glu Trp Ile Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60 50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser Asn Gln Arg Phe Lys Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser

65 70 75 65 70 75

Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Arg Ile Val Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Phe Glu Asp

80 85 90 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105 95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

110 115 110 115

<210> 7<210> 7

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 7<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30 20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90 80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105 95 100 105

Ile Lys Ile Lys

<210> 8<210> 8

<211> 119<211> 119

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 8<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30 20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60 50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105 95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 110 115

<210> 9<210> 9

<211> 107<211> 107

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 9<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30 20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90 80 85 90

Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Tyr Asn Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105 95 100 105

Ile Lys Ile Lys

<210> 10<210> 10

<211> 119<211> 119

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 10<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30 20 25 30

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr

50 55 60 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

65 70 75 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Val Gly Tyr Ser Leu

95 100 105 95 100 105

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 110 115

<210> 11<210> 11

<211> 214<211> 214

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 11<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser

20 25 30 20 25 30

Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90 80 85 90

Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105 95 100 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

110 115 120 110 115 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

125 130 135 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

140 145 150 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

155 160 165 155 160 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

170 175 180 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

185 190 195 185 190 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

200 205 210 200 205 210

Arg Gly Glu Cys Arg Gly Glu Cys

<210> 12<210> 12

<211> 448<211> 448

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 12<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30 20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60 50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105 95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

110 115 120 110 115 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

125 130 135 125 130 135

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

140 145 150 140 145 150

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

155 160 165 155 160 165

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

170 175 180 170 175 180

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

185 190 195 185 190 195

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

200 205 210 200 205 210

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

215 220 225 215 220 225

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

230 235 240 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285 275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 305 310 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

320 325 330 320 325 330

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

335 340 345 335 340 345

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

350 355 360 350 355 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

365 370 375 365 370 375

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

380 385 390 380 385 390

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

395 400 405 395 400 405

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

410 415 420 410 415 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

425 430 435 425 430 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

440 445 440 445

<210> 13<210> 13

<211> 214<211> 214

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 13<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn

20 25 30 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90 80 85 90

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105 95 100 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

110 115 120 110 115 120

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

125 130 135 125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

140 145 150 140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

155 160 165 155 160 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

170 175 180 170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

185 190 195 185 190 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

200 205 210 200 205 210

Arg Gly Glu Cys Arg Gly Glu Cys

<210> 14<210> 14

<211> 449<211> 449

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 14<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30 20 25 30

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr

50 55 60 50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr

95 100 105 95 100 105

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 120 110 115 120

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

125 130 135 125 130 135

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

140 145 150 140 145 150

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

155 160 165 155 160 165

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

170 175 180 170 175 180

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

185 190 195 185 190 195

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

200 205 210 200 205 210

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

215 220 225 215 220 225

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

230 235 240 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255 245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270 260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285 275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300 290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 305 310 315

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

320 325 330 320 325 330

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

335 340 345 335 340 345

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

350 355 360 350 355 360

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

365 370 375 365 370 375

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

380 385 390 380 385 390

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

395 400 405 395 400 405

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

410 415 420 410 415 420

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

425 430 435 425 430 435

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

440 445 440 445

<210> 15<210> 15

<211> 217<211> 217

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 15<400> 15

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5 10 15 1 5 10 15

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln

20 25 30 20 25 30

Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45 35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly

50 55 60 50 55 60

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75 65 70 75

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

80 85 90 80 85 90

Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr

95 100 105 95 100 105

Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

110 115 120 110 115 120

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

125 130 135 125 130 135

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

140 145 150 140 145 150

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

155 160 165 155 160 165

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

170 175 180 170 175 180

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

185 190 195 185 190 195

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

200 205 210 200 205 210

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

215 215

<210> 16<210> 16

<211> 449<211> 449

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 16<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15 1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr

20 25 30 20 25 30

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45 35 40 45

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr

50 55 60 50 55 60

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser

65 70 75 65 70 75

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr

95 100 105 95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

110 115 120 110 115 120

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

125 130 135 125 130 135

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

140 145 150 140 145 150

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

155 160 165 155 160 165

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

170 175 180 170 175 180

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

185 190 195 185 190 195

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

200 205 210 200 205 210

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

215 220 225 215 220 225

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

230 235 240 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270 260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285 275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300 290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 305 310 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

320 325 330 320 325 330

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

335 340 345 335 340 345

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

350 355 360 350 355 360

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

365 370 375 365 370 375

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

380 385 390 380 385 390

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

395 400 405 395 400 405

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

410 415 420 410 415 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

425 430 435 425 430 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

440 445 440 445

<210> 17<210> 17

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<220><220>

<221> Xaa<221> Xaa

<222> 10<222> 10

<223> Xaa is preferrably D or S<223> Xaa is preferrably D or S

<400> 17<400> 17

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa

5 10 5 10

<210> 18<210> 18

<211> 17<211> 17

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 18<400> 18

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

1 5 10 15 1 5 10 15

Lys Gly Lys gly

<210> 19<210> 19

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 19<400> 19

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

5 10 5 10

<210> 20<210> 20

<211> 11<211> 11

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 20<400> 20

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala

5 10 5 10

<210> 21<210> 21

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<220><220>

<221> Xaa<221> Xaa

<222> 5<222> 5

<223> Xaa is preferably R or L<223> Xaa is preferably R or L

<220><220>

<221> Xaa<221> Xaa

<222> 6<222> 6

<223> Xaa is preferably Y or E<223> Xaa is preferably Y or E

<220><220>

<221> Xaa<221> Xaa

<222> 7<222> 7

<223> Xaa is preferably T or S<223> Xaa is preferably T or S

<400> 21<400> 21

Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa

5 5

<210> 22<210> 22

<211> 9<211> 9

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 22<400> 22

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

5 5

<210> 23<210> 23

<211> 10<211> 10

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 23<400> 23

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp

5 10 5 10

<210> 24<210> 24

<211> 7<211> 7

<212> PRT<212> PRT

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<220><220>

<223> Sequence is synthesized.<223> Sequence is synthesized.

<400> 24<400> 24

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

5 5

<---<---

Claims (15)

1. Композиция для лечения злокачественного заболевания, содержащая эффективное количество пертузумаба и его варианта с неспаренными цистеинами, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах его легкой цепи.1. Composition for the treatment of malignant disease, containing an effective amount of pertuzumab and its variant with unpaired cysteines, where the specified variant with unpaired cysteines contains Cys23 and Cys88 in both variable domains of the light chain of pertuzumab and Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both variable domains of its light chains. 2. Композиция по п. 1, где указанный вариант с неспаренными цистеинами представляет собой гетеродимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене легкой цепи пертузумаба.2. The composition of claim 1, wherein said unpaired cysteine variant is a heterodimeric variant containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in only one variable domain of the light chain of pertuzumab. 3. Композиция по п. 1, где указанный вариант с неспаренными цистеинами представляет собой гомодимерный вариант, содержащий Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба.3. A composition according to claim 1, wherein said unpaired cysteine variant is a homodimeric variant containing Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in both variable domains of the light chain of pertuzumab. 4. Композиция по п. 1, где пертузумаб и указанный вариант с неспаренными цистеинами каждый содержат вариабельные аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи в SEQ ID No. 7 и 8 соответственно.4. The composition of claim 1, wherein pertuzumab and said unpaired cysteine variant each comprise the light chain and heavy chain variable amino acid sequences in SEQ ID No. 7 and 8 respectively. 5. Композиция по п. 4, где пертузумаб и указанный вариант с неспаренными цистеинами, каждый, содержат аминокислотную последовательность легкой цепи в SEQ ID No. 11 или 15 и аминокислотную последовательность тяжелой цепи в SEQ ID No. 12 или 16.5. The composition of claim 4, wherein pertuzumab and said unpaired cysteine variant each comprise the light chain amino acid sequence in SEQ ID No. 11 or 15 and the heavy chain amino acid sequence in SEQ ID No. 12 or 16. 6. Композиция по п. 1, дополнительно содержащая один или более дополнительных вариантов пертузумаба, где дополнительные варианты выбраны из группы, состоящей из: варианта, лишенного фукозы, разновидностей с низкой молекулярной массой (LMWS), разновидностей с высокой молекулярной массой (HMWS), гликозилированного варианта, варианта с восстановленным дисульфидом, невосстанавливаемого варианта, дезамидированного варианта, сиалилированного варианта,VHS-варианта, варианта с С-концевым лизином, варианта с окисленным метионином, варианта гликозилирования G1, варианта гликозилирования G2 и варианта с негликозилированной тяжелой цепью.6. The composition of claim 1, further comprising one or more additional variants of pertuzumab, wherein the additional variants are selected from the group consisting of: a variant lacking fucose, low molecular weight species (LMWS), high molecular weight species (HMWS), glycosylated variant, reduced disulfide variant, non-reducible variant, deamidated variant, sialylated variant, VHS variant, C-terminal lysine variant, oxidized methionine variant, G1 glycosylation variant, G2 glycosylation variant, and non-glycosylated heavy chain variant. 7. Композиция по п. 1, где количество указанного варианта с неспаренными цистеинами в композиции составляет ≤примерно 25% по данным Fab хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC).7. The composition of claim 1, wherein the amount of said variant with unpaired cysteines in the composition is но about 25% as determined by Fab hydrophobic interaction chromatography (HIC). 8. Композиция по п. 3, где количество гомодимерного варианта в композиции составляет ≤4,9% по данным хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.8. The composition of claim 3, wherein the amount of the homodimeric variant in the composition is 4.9% as determined by hydrophobic interaction chromatography (HIC) of the intact antibody. 9. Композиция по п. 2, где количество гетеродимерного варианта в композиции составляет примерно от 13% до примерно 18% по данным хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC) интактного антитела.9. The composition of claim 2, wherein the amount of heterodimeric variant in the composition is from about 13% to about 18% as determined by hydrophobic interaction chromatography (HIC) of an intact antibody. 10. Композиция по п. 1, которая подвергалась аналитическому анализу для подтверждения того, что количество указанного варианта с неспаренными цистеинами в композиции составляет ≤примерно 25% по данным Fab хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC).10. The composition of claim 1, which has been analyzed to confirm that the amount of said unpaired cysteine variant in the composition is about 25% as determined by Fab hydrophobic interaction chromatography (HIC). 11. Композиция по п. 10, дополнительно содержащая вариант пертузумаба, лишенный фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, превышает 2% и до 4,1% композиции.11. The composition of claim 10, further comprising a fucose-depleted pertuzumab variant, wherein the amount of the fucose-depleted variant exceeds 2% and up to 4.1% of the composition. 12. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественного заболевания, содержащая эффективное количество композиции по п. 1, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.12. A pharmaceutical composition for the treatment of a malignant disease, comprising an effective amount of a composition according to claim 1 and one or more pharmaceutically acceptable excipients. 13. Изделие для лечения злокачественного заболевания, содержащее контейнер с фармацевтической композицией по п. 12 и лист-вкладыш с указаниями по применению препарата, информирующими пользователя о применении фармацевтической композиции для лечения пациента, страдающего злокачественным заболеванием.13. An article for the treatment of a malignant disease comprising a container with a pharmaceutical composition according to claim 12 and an insert with instructions for use of the preparation informing the user about the use of the pharmaceutical composition for the treatment of a patient suffering from a malignant disease. 14. Выделенный вариант пертузумаба для лечения злокачественного заболевания, где выделенный вариант содержит: (а) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гетеродимерный вариант, содержащий Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины только в одном вариабельном домене его легкой цепи; или (b) вариант пертузумаба с неспаренными цистеинами, где вариант представляет собой гомодимерный вариант, содержащий Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в обоих вариабельных доменах его легкой цепи.14. An isolated variant of pertuzumab for the treatment of malignant disease, where the isolated variant contains: (a) a variant of pertuzumab with unpaired cysteines, where the variant is a heterodimeric variant containing Cys23 and Cys88 in both variable domains of the light chain of pertuzumab and Cys23 / Cys88 unpaired cysteines only in one variable domain of its light chain; or (b) a variant of pertuzumab with unpaired cysteines, where the variant is a homodimeric variant containing Cys23 and Cys88 in both variable domains of the light chain of pertuzumab and Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in both variable domains of its light chain. 15. Композиция для лечения злокачественного заболевания, содержащая эффективное количество пертузумаба, и (а) его варианта с неспаренными цистеинами, где указанный вариант с неспаренными цистеинами содержит Cys23 и Cys88 в обоих вариабельных доменах легкой цепи пертузумаба и Cys23/Cys88 неспаренные цистеины в одном или обоих вариабельных доменах его легкой цепи, и (b) варианта пертузумаба, лишенного фукозы, где количество варианта, лишенного фукозы, превышает 2% и до 4,1% композиции.15. A composition for the treatment of malignant disease, containing an effective amount of pertuzumab, and (a) its variant with unpaired cysteines, where the specified variant with unpaired cysteines contains Cys23 and Cys88 in both variable domains of the light chain of pertuzumab and Cys23 / Cys88 unpaired cysteines in one or both variable domains of its light chain, and (b) a variant of pertuzumab lacking fucose, where the amount of the variant lacking fucose exceeds 2% and up to 4.1% of the composition.
RU2015141520A 2013-04-16 2014-04-15 Versions of pertuzumab and their analytical characteristics RU2737727C2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361812603P 2013-04-16 2013-04-16
US61/812,603 2013-04-16
PCT/US2014/034200 WO2014172371A2 (en) 2013-04-16 2014-04-15 Pertuzumab variants and evaluation thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019115089A Division RU2019115089A (en) 2013-04-16 2014-04-15 VARIANTS OF PERTUSUMAB AND THEIR ANALYTICAL CHARACTERISTICS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015141520A RU2015141520A (en) 2017-05-22
RU2737727C2 true RU2737727C2 (en) 2020-12-02

Family

ID=50694078

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019115089A RU2019115089A (en) 2013-04-16 2014-04-15 VARIANTS OF PERTUSUMAB AND THEIR ANALYTICAL CHARACTERISTICS
RU2015141520A RU2737727C2 (en) 2013-04-16 2014-04-15 Versions of pertuzumab and their analytical characteristics

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019115089A RU2019115089A (en) 2013-04-16 2014-04-15 VARIANTS OF PERTUSUMAB AND THEIR ANALYTICAL CHARACTERISTICS

Country Status (25)

Country Link
US (7) US9815904B2 (en)
EP (2) EP3800204A1 (en)
JP (2) JP2016522176A (en)
KR (2) KR20150143649A (en)
CN (1) CN105121471A (en)
AR (1) AR095863A1 (en)
AU (3) AU2014254086B2 (en)
BR (1) BR112015024926A2 (en)
CA (2) CA3071678A1 (en)
CL (3) CL2015003049A1 (en)
CR (1) CR20150576A (en)
EA (1) EA201591643A1 (en)
HK (1) HK1211948A1 (en)
IL (2) IL241103B (en)
MA (1) MA38567A1 (en)
MX (2) MX368259B (en)
MY (1) MY173295A (en)
NZ (2) NZ751877A (en)
PE (2) PE20211214A1 (en)
PH (1) PH12015502382A1 (en)
RU (2) RU2019115089A (en)
SG (3) SG11201508536PA (en)
TW (1) TWI554284B (en)
WO (1) WO2014172371A2 (en)
ZA (1) ZA201506594B (en)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7846724B2 (en) 2006-04-11 2010-12-07 Hoffmann-La Roche Inc. Method for selecting CHO cell for production of glycosylated antibodies
TWI472339B (en) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc Composition comprising antibody that binds to domain ii of her2 and acidic variants thereof
BRPI0812682A2 (en) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc metastatic breast cancer treatment
KR102071834B1 (en) 2009-10-26 2020-01-30 에프. 호프만-라 로슈 아게 Method for the production of a glycosylated immunoglobulin
EP3800204A1 (en) 2013-04-16 2021-04-07 F. Hoffmann-La Roche AG Pertuzumab variants and evaluation thereof
TW201827077A (en) * 2016-12-28 2018-08-01 美商建南德克公司 Treatment of advanced her2 expressing cancer
LT3570884T (en) 2017-01-17 2020-12-10 Genentech, Inc. Subcutaneous her2 antibody formulations
AU2018227788B2 (en) 2017-03-02 2021-04-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Adjuvant treatment of HER2-positive breast cancer
WO2018200505A1 (en) * 2017-04-24 2018-11-01 Genentech, Inc. Erbb2/her2 mutations in the transmbrane or juxtamembrane domain
US20200271663A1 (en) 2017-09-13 2020-08-27 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identification and monitoring of acid hydrolysis products of immunoglobulin heavy chains
JP7259778B2 (en) 2020-01-31 2023-04-18 トヨタ自動車株式会社 Vehicles and automated driving systems
CN113189184B (en) * 2021-04-28 2022-09-09 浙江大学 Capillary gel electrophoresis sample buffer solution containing cysteine
EP4331611A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Hyslink Therapeutics Preparation method and application of antibody drug conjugate
KR102511384B1 (en) 2022-04-14 2023-03-16 지용환 The rice swipper that can reduce grain damage

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
RU2426554C2 (en) * 2004-10-20 2011-08-20 Дженентек, Инк. Compositions of antibodies
RU2505544C2 (en) * 2007-10-19 2014-01-27 Дженентек, Инк. Antibodies against tenb2 constructed with cysteine, and conjugates, antibody-drug

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL74201A0 (en) 1984-01-30 1985-04-30 Icrf Patents Limited Polypeptides for the detection and control of mammalian cell growth
US5401638A (en) 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4968603A (en) 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
US5720937A (en) 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
WO1989006692A1 (en) 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
DK0474727T3 (en) 1989-05-19 1998-01-12 Genentech Inc HER2 extracellular domain
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (en) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab and its variants and immunochemical derivatives including immotoxins
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US6685940B2 (en) 1995-07-27 2004-02-03 Genentech, Inc. Protein formulation
US7371376B1 (en) 1996-10-18 2008-05-13 Genentech, Inc. Anti-ErbB2 antibodies
EP0852951A1 (en) 1996-11-19 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Stable lyophilized monoclonal or polyclonal antibodies containing pharmaceuticals
SI1897890T1 (en) 1996-11-27 2010-03-31 Genentech Inc Affinity purification of polypeptide on protein A matrix
US5994071A (en) 1997-04-04 1999-11-30 Albany Medical College Assessment of prostate cancer
ZA9811162B (en) 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
CA2324494A1 (en) 1998-03-27 1999-09-30 Genentech, Inc. Apo-2 ligand-anti-her-2 antibody synergism
PT1308456E (en) 1998-05-06 2007-12-03 Genentech Inc Antibody purification by ion exchange chromatography
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
SI1187632T1 (en) 1999-05-14 2009-04-30 Genentech Inc TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
US20040013667A1 (en) 1999-06-25 2004-01-22 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
WO2001000238A1 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Genentech, Inc. TREATING PROSTATE CANCER WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
US7041292B1 (en) 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies
US20030086924A1 (en) 1999-06-25 2003-05-08 Genentech, Inc. Treatment with anti-ErbB2 antibodies
NZ517150A (en) 1999-08-27 2005-01-28 Genentech Inc Dosages for treatment with anti-ErbB2 antibodies
US6632979B2 (en) 2000-03-16 2003-10-14 Genentech, Inc. Rodent HER2 tumor model
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
PL400669A1 (en) 2000-05-19 2012-11-05 Genentech, Inc. Genetic probe for detecting a response to ErbB antagonist for improving the likelihood and efficiency of cancer treatment
US6984494B2 (en) 2000-08-15 2006-01-10 Genentech, Inc. Analytical method
JP4731793B2 (en) 2000-12-28 2011-07-27 アルセア テクノロジーズ インコーポレイテッド Crystals of whole antibodies or fragments thereof, and methods for making and using the crystals
AU2003224916B2 (en) 2002-04-10 2009-01-08 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
JP5069843B2 (en) * 2002-07-15 2012-11-07 ジェネンテック， インコーポレイテッド Method for identifying tumors responsive to treatment with anti-ErbB2 antibodies
CA2496060C (en) 2002-09-11 2015-08-04 Genentech, Inc. Protein purification by ion exchange chromatography
JP2006516117A (en) 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド Treatment of non-malignant diseases or disorders using anti-ErbB2 antibodies
JP5068072B2 (en) * 2003-06-27 2012-11-07 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Modified binding molecule comprising a linking peptide
WO2005016968A2 (en) 2003-07-28 2005-02-24 Genentech, Inc. Reducing protein a leaching during protein a affinity chromatography
CA2563341C (en) 2004-04-08 2014-10-21 David B. Agus Erbb antagonists for pain therapy
BRPI0510883B8 (en) 2004-06-01 2021-05-25 Genentech Inc drug-antibody conjugate compound, pharmaceutical composition, method of manufacturing a drug-antibody conjugate compound, and uses of a formulation, a drug-antibody conjugate and a chemotherapeutic agent, and a combination
GT200500155A (en) 2004-06-16 2006-05-15 PLATINUM-RESISTANT CANCER THERAPY
JP2008507520A (en) 2004-07-22 2008-03-13 ジェネンテック・インコーポレーテッド HER2 antibody composition
EP1778728A2 (en) 2004-08-19 2007-05-02 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
AU2005314127A1 (en) 2004-12-07 2006-06-15 Genentech, Inc. Selecting patients for therapy with a HER inhibitor
BRPI0519023A2 (en) 2004-12-13 2008-12-23 Hoffmann La Roche pharmaceutical composition containing at least one dolastatin derivative 10
KR20190110637A (en) 2005-01-21 2019-09-30 제넨테크, 인크. Fixed dosing of her antibodies
RU2404806C2 (en) 2005-02-23 2010-11-27 Дженентек, Инк. Extension of time to progression of disease or lifetime of oncologic patients with application of her dimerisation inhibitors
US20060204505A1 (en) 2005-03-08 2006-09-14 Sliwkowski Mark X Methods for identifying tumors responsive to treatment with HER dimerization inhibitors (HDIs)
US20060212956A1 (en) 2005-03-14 2006-09-21 Genentech, Inc. Animal model of ligand activated HER2 expressing tumors
JP2006316040A (en) 2005-05-13 2006-11-24 Genentech Inc Herceptin(r) adjuvant treatment
US20070009976A1 (en) 2005-07-06 2007-01-11 Helmut Lenz Detection of a target antigen irrespective of the presence or absence of a corresponding therapeutic antibody
PE20070207A1 (en) 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc COMBINED TREATMENT OF TUMORS THAT EXPRESS HER
US7700299B2 (en) 2005-08-12 2010-04-20 Hoffmann-La Roche Inc. Method for predicting the response to a treatment
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
KR20090019890A (en) 2006-06-05 2009-02-25 제넨테크, 인크. Extending survival of cancer patients with elevated levels of egf or tgf-alpha
US8015939B2 (en) 2006-06-30 2011-09-13 Asml Netherlands B.V. Imprintable medium dispenser
NZ574580A (en) 2006-08-21 2011-12-22 Hoffmann La Roche Her2 tumor therapy with an anti-vegf antibody
WO2008031531A1 (en) 2006-09-15 2008-03-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Tumor therapy with a combination of anti-her2 antibodies
PE20090681A1 (en) 2007-03-02 2009-06-10 Genentech Inc PREDICTION OF RESPONSE TO A HER INHIBITOR
BRPI0808291A2 (en) * 2007-03-22 2018-12-11 Genentech Inc anti-ige / m1 antibodies, peptide, compositions, isolated nucleic acid, vector, host cell, process for producing an apoptotic anti-ige / m1 'antibody or functional fragment, article of manufacture, method for specifically depleting b cells ige producers, methods for treating an ige-mediated disease, to prevent allergen-induced ige production, to reduce allergen-induced lge production, murine hybridoma, antibody and transgenic animal
EP1997534A1 (en) 2007-05-31 2008-12-03 Pierre Fabre Medicament Cancer treatment combination therapy comprising vinflunine and trastuzumab
WO2008148546A2 (en) 2007-06-06 2008-12-11 F.Hoffmann-La Roche Ag Composition of a first non-labeled monoclonal antibody binding to a tumor antigen and a non-cross reactive second monoclonal antibody labeled with a nir fluorescence label
WO2008154249A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to her2 inhibitor treatment
US9551033B2 (en) 2007-06-08 2017-01-24 Genentech, Inc. Gene expression markers of tumor resistance to HER2 inhibitor treatment
AU2008275229B2 (en) 2007-07-09 2014-11-06 Genentech, Inc. Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides
MX338504B (en) 2007-09-12 2016-04-20 Genentech Inc Combinations of phosphoinositide 3-kinase inhibitor compounds and chemotherapeutic agents, and methods of use.
CA2703279C (en) 2007-10-30 2014-04-22 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
CA2713342A1 (en) * 2008-01-30 2009-08-13 Abbott Laboratories Compositions and methods for crystallizing antibody fragments
TWI472339B (en) * 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc Composition comprising antibody that binds to domain ii of her2 and acidic variants thereof
JP2011513432A (en) 2008-03-06 2011-04-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド Combination therapy of c-met and HER antagonist
ES2629405T3 (en) 2008-03-18 2017-08-09 Genentech, Inc. Combinations of a drug-antibody anti-HER2 and docetaxel conjugate
BRPI0812682A2 (en) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc metastatic breast cancer treatment
FR2942799B1 (en) * 2009-03-06 2011-02-25 Lfb Biotechnologies ANTI-RHESUS MONOCLONAL ANTIBODY
CA2761280A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Modulators for her2 signaling in her2 expressing patients with gastric cancer
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
HUE029026T2 (en) * 2009-12-22 2017-01-30 Roche Glycart Ag ANTI-HER3 Antibodies and uses thereof
WO2011146568A1 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Genentech, Inc. Predicting response to a her inhibitor
WO2012078771A1 (en) 2010-12-09 2012-06-14 Genentech, Inc. Treatment of her2-positive cancer with paclitaxel and trastuzumab-mcc-dm1
JOP20210044A1 (en) * 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co Anti-cd38 antibodies
EA201391086A1 (en) * 2011-01-28 2014-01-30 Нэшнл Рисеч Каунсил Оф Канада CONSTRUCTION OF IMMUNOGLOBULIN DOMAINS
JP6385060B2 (en) 2011-03-07 2018-09-05 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト In vivo selection of therapeutically active antibodies
CN116271013A (en) 2011-10-14 2023-06-23 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Use of the HER2 dimerization inhibitor pertuzumab and articles of manufacture comprising the HER2 dimerization inhibitor pertuzumab
WO2013083810A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Identification of non-responders to her2 inhibitors
WO2013096812A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Articles of manufacture and methods for co-administration of antibodies
MX2014014831A (en) 2012-06-08 2015-02-12 Hoffmann La Roche Mutant selectivity and combinations of a phosphoinositide 3 kinase inhibitor compound and chemotherapeutic agents for the treatment of cancer.
MX363188B (en) 2012-11-30 2019-03-13 Hoffmann La Roche Identification of patients in need of pd-l1 inhibitor cotherapy.
AR094403A1 (en) 2013-01-11 2015-07-29 Hoffmann La Roche ANTI-HER3 ANTIBODY COMBINATION THERAPY
EP3800204A1 (en) 2013-04-16 2021-04-07 F. Hoffmann-La Roche AG Pertuzumab variants and evaluation thereof
NZ720515A (en) 2013-12-17 2022-12-23 Genentech Inc Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and taxanes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6267958B1 (en) * 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
RU2426554C2 (en) * 2004-10-20 2011-08-20 Дженентек, Инк. Compositions of antibodies
RU2011104955A (en) * 2004-10-20 2012-08-20 Дженентек, Инк. (Us) COMPOSITIONS OF ANTIBODIES
RU2505544C2 (en) * 2007-10-19 2014-01-27 Дженентек, Инк. Antibodies against tenb2 constructed with cysteine, and conjugates, antibody-drug

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG T. et al. Identification and Characterisation of Buried Unpaired Cysteines in Recombinant Monoclonal IgG1 Antibody // Anal. Chem., 2012, 84, 16, p. 7112-7123. JUNTTILA T.T. et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer // Cancer Res, 2010, 70, 11, p. 4481-4489. *

Also Published As

Publication number Publication date
CL2017002445A1 (en) 2018-03-16
CA3071678A1 (en) 2014-10-23
CA2907776A1 (en) 2014-10-23
EP3800204A1 (en) 2021-04-07
CR20150576A (en) 2015-11-20
PE20151769A1 (en) 2015-12-11
MY173295A (en) 2020-01-14
HK1211948A1 (en) 2016-06-03
EA201591643A1 (en) 2016-02-29
KR20150143649A (en) 2015-12-23
WO2014172371A3 (en) 2015-01-08
CL2019002244A1 (en) 2019-11-29
IL241103B (en) 2020-07-30
MX368259B (en) 2019-09-25
AR095863A1 (en) 2015-11-18
US9969811B2 (en) 2018-05-15
US20180037660A1 (en) 2018-02-08
SG11201508536PA (en) 2015-11-27
AU2019253804A1 (en) 2019-11-14
SG10201911353WA (en) 2020-02-27
BR112015024926A2 (en) 2017-10-10
PE20211214A1 (en) 2021-07-05
MX2015013898A (en) 2016-07-08
MA38567A1 (en) 2017-09-29
ZA201506594B (en) 2018-11-28
AU2018241141B2 (en) 2019-11-07
IL275398A (en) 2020-07-30
JP2016522176A (en) 2016-07-28
AU2014254086B2 (en) 2018-07-05
IL241103A0 (en) 2015-11-30
US20230047103A1 (en) 2023-02-16
EP2986643A2 (en) 2016-02-24
US20140308277A1 (en) 2014-10-16
RU2019115089A (en) 2019-06-11
US20180037661A1 (en) 2018-02-08
AU2014254086A1 (en) 2015-10-08
KR20200085942A (en) 2020-07-15
TWI554284B (en) 2016-10-21
US9815904B2 (en) 2017-11-14
SG10201706045RA (en) 2017-08-30
US20190345258A1 (en) 2019-11-14
TW201442725A (en) 2014-11-16
US20200157238A1 (en) 2020-05-21
US20180037662A1 (en) 2018-02-08
NZ712012A (en) 2020-04-24
CA2907776C (en) 2020-04-14
MX2019005151A (en) 2022-06-27
AU2018241141A1 (en) 2018-10-25
JP2020015719A (en) 2020-01-30
CN105121471A (en) 2015-12-02
WO2014172371A2 (en) 2014-10-23
NZ751877A (en) 2020-04-24
CL2015003049A1 (en) 2016-06-10
PH12015502382A1 (en) 2016-02-22
RU2015141520A (en) 2017-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2737727C2 (en) Versions of pertuzumab and their analytical characteristics
EP3794041B1 (en) Anti-muc1 antibody
EP3943509A1 (en) Treatment and prevention of cancer using her3 antigen-binding molecules
KR102593409B1 (en) HER3 antigen binding molecule
WO2023120561A1 (en) Antibody variant with reduced biological activity
WO2023031435A1 (en) Treatment and prevention of cancer using her3 antigen-binding molecules
KR20190126103A (en) Compositions comprising avelumab
JP2023159309A (en) Antibody variant with reduced biological activity