RU2723624C1 - Nano-amorphous form (rs)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2h-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione (versions), a method for production thereof and use for treating immunological or oncological diseases - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to a nanoamorphous form of (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione, a method for production thereof and use in pharmaceutical compositions, which can be used for treating immunological and/or oncological diseases. Amorphous form of (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione is characterized by average particle size of 63.85±10 nm, glass transition temperature of 122.9±7 °C, crystallisation at temperature of 172.6±5 °C with specific thermal effect of 85.77±9 J/g and melting at temperature of 267.5±5 °C with specific heat effect of 149.8±15 J/g under conditions of differential scanning calorimetry at heating rate of 10 °C/min. Method of producing amorphous form of (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione involves the following steps: loading (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione into a melt consisting of 40 or 20 g of D-fructose, 15 or 7.5 glactose monohydrate and 40 or 20 g urea at 55 °C; stirring at temperature of 55 °C; adding the obtained melt into water cooled to +7 °C; mixing; filtering the precipitate; preparation of suspension in water; stirring at temperature of 20 °C for about 1 hour; filtration; washing the precipitate with water on filter; drying to constant weight under vacuum at temperature of + 40 °C. Used at stage of loading into melt (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione is obtained by reduction of 3-(4-nitro-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione with gray cast iron in the form of a chipped fraction in 50 % aqueous ethanol in the presence of hydrochloric acid.

EFFECT: amorphous form of (RS)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione is intended for treating immunological or oncological diseases.

6 cl, 10 dwg, 11 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Заявленная группа изобретений относится к наноаморфной форме (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона (международное непатентованное название - леналидомид), способу ее получения и применению в фармацевтических композициях, которые могут быть использованы для лечения иммунологических и/или онкологических заболеваний.The claimed group of inventions relates to the nano-amorphous form of (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidine-2,6-dione (international non-proprietary name is lenalidomide) , a method for its preparation and use in pharmaceutical compositions that can be used to treat immunological and / or oncological diseases.

Уровень техникиState of the art

Аморфное состояние вещества отличается от кристаллического отсутствием дальнего порядка взаимного расположения молекул, более высокой внутренней энергией и межмолекулярным расстоянием. Способность химических соединений существовать в нескольких аморфных формах называют полиаморфизмом. В термодинамически строгом смысле под этим следует понимать возможное существование двух аморфных фаз, между которыми имеется четкий фазовый переход. Однако зачастую аморфное вещество не подходит под это определение. Так, стекловидные материалы находятся в термодинамически неравновесном состоянии, но при этом могут оставаться стабильными в течение длительного времени при температурах ниже точки стеклования. Хэнкок и др. предложили для таких случаев термин «псевдополиаморфизм» [J. Pharm. Pharmacol. 2002, 54 (8), 1151-2], который не прижился глубоко в научной литературе. Чтобы избежать путаницы в терминологии, далее по тексту мы будем считать аморфные формы одного вещества разными, если эти формы отличаются своими признаками.The amorphous state of a substance differs from the crystalline state in the absence of a long-range order of mutual arrangement of molecules, higher internal energy, and intermolecular distance. The ability of chemical compounds to exist in several amorphous forms is called polyamorphism. In a thermodynamically strict sense, this should be understood as the possible existence of two amorphous phases, between which there is a clear phase transition. However, often an amorphous substance does not fit this definition. So, glassy materials are in a thermodynamically nonequilibrium state, but they can remain stable for a long time at temperatures below the glass transition point. Hancock et al. Proposed for such cases the term “pseudo-polyamorphism” [J. Pharm. Pharmacol 2002, 54 (8), 1151-2], which did not take root deeply in the scientific literature. To avoid confusion in terminology, hereinafter, we will consider amorphous forms of one substance different if these forms differ in their characteristics.

Аморфные вещества широко используются в фармацевтике. При этом истинный полиаморфизм описан лишь для немногих лекарственных веществ, таких как О-ацетилсалициловая кислота [CrystEngComm, 2015, 17, 9029-9036], и вспомогательных фармацевтических ингредиентов, таких как D-маннит [J. Chem. Pkys., 2017, 146, 244503]. Аморфные формы органических соединений обычно характеризуют такими физическими методами, как рентгеновская дифракция, дифференциальная сканирующая калориметрия, инфракрасная спектроскопия, Рамановская спектроскопия, терагерцовая спектроскопия, спектроскопия твердофазного ядерного магнитного резонанса и другими. Первые четыре метода используются наиболее часто ввиду широкой доступности соответствующего аналитического оборудования. Спектральные свойства кристаллических и аморфных форм органических соединений могут заметно отличаться. Например, в работе [Mol. Pharmaceutics, 2008, 56, 937-945] приведено сравнительное описание инфракрасных спектров кристаллических и аморфных форм фармацевтических субстанций целикоксиба, валдекоксиба, рофекоксиба и эторикоксиба. Эти данные демонстрируют значительные изменения отдельных сигналов в инфракрасном спектре аморфных субстанций. Эти изменения касаются как положения отдельных сигналов, так их интенсивности и, в первую очередь, характерны для атомов, участвующих в образовании водородных связей.Amorphous substances are widely used in pharmaceuticals. However, true polyamorphism is described only for a few medicinal substances, such as O-acetylsalicylic acid [CrystEngComm, 2015, 17, 9029-9036], and auxiliary pharmaceutical ingredients, such as D-mannitol [J. Chem. Pkys., 2017, 146, 244503]. Amorphous forms of organic compounds are usually characterized by physical methods such as x-ray diffraction, differential scanning calorimetry, infrared spectroscopy, Raman spectroscopy, terahertz spectroscopy, solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy, and others. The first four methods are used most often due to the wide availability of appropriate analytical equipment. The spectral properties of crystalline and amorphous forms of organic compounds can differ markedly. For example, in [Mol. Pharmaceutics, 2008, 56, 937-945] provides a comparative description of the infrared spectra of crystalline and amorphous forms of the pharmaceutical substances celicoxib, valdecoxib, rofecoxib and etoricoxib. These data demonstrate significant changes in individual signals in the infrared spectrum of amorphous substances. These changes relate to both the position of individual signals, their intensity and, first of all, are characteristic of atoms involved in the formation of hydrogen bonds.

Хорошо известно, что свойства аморфного вещества могут зависеть от способа, которым оно было получено. Так, аморфный симвастатин, полученный методом криоизмельчения, обладает более низкой стабильностью, чем аморфный симвастатин, приготовленный путем переохлаждения расплава [K.A. Graeser, С.J. Strachan, J.Е. Patterson, K.С. Gordon and Т. Rades, Physicochemical properties and stability of two differently prepared amorphous forms of simvastatin, Cryst. Growth Des. 8, 2008, 128-135]. Аморфный цефамандола нафат, полученный методом распылительной сушки, отличается от полученного методом лиофилизации наличием узкого рефлекса на фоне обычного широкого «гало» в спектре рентгеновской дифракции. Это позволяет предположить большую степень молекулярной упорядоченности для аморфного цефамандола нафата, полученного методом распылительной сушки. [E.Y. Shalaev, G. Zogra. The concept of "structure" in amorphous solids from the perspectives of the pharmaceutical sciences. Progress in Amorphous Food and Pharmaceutical Systems, Publisher: The Royal Society of Chemistry, Editors: H Levine, 2002, pp. 11-30].It is well known that the properties of an amorphous substance may depend on the method by which it was obtained. So, amorphous simvastatin obtained by cryo-grinding has lower stability than amorphous simvastatin prepared by melt supercooling [K.A. Graeser, C.J. Strachan, J.E. Patterson, K.S. Gordon and T. Rades, Physicochemical properties and stability of two differently prepared amorphous forms of simvastatin, Cryst. Growth Des. 8, 2008, 128-135]. The amorphous cefamandol nafate obtained by spray drying differs from that obtained by lyophilization by the presence of a narrow reflex against the background of the usual wide “halo” in the X-ray diffraction spectrum. This suggests a high degree of molecular ordering for amorphous cefamandole nafate obtained by spray drying. [E.Y. Shalaev, G. Zogra. The concept of "structure" in amorphous solids from the perspectives of the pharmaceutical sciences. Progress in Amorphous Food and Pharmaceutical Systems, Publisher: The Royal Society of Chemistry, Editors: H Levine, 2002, pp. 11-30].

Таким образом, для описания разных аморфных форм химических соединений возможно использовать как признаки, относящиеся непосредственно к формам, так и признаки способа их получения, включающие последовательность технологических стадий и режимов их проведения.Thus, to describe the various amorphous forms of chemical compounds, it is possible to use both features that relate directly to the forms and features of the method for their preparation, including a sequence of technological stages and modes of their implementation.

Изучение полиаморфизма органических соединений является актуальной задачей современной науки, а создание новых аморфных форм для известных веществ, обладающих улучшенными технологическими, фармакологическими или иными свойствами, представляет собой важное техническое достижение.The study of the polyamorphism of organic compounds is an urgent task of modern science, and the creation of new amorphous forms for known substances with improved technological, pharmacological or other properties is an important technical achievement.

Настоящая группа изобретений относится к наноаморфной форме известного соединения леналидомид, которое характеризуется следующей структурной формулой:The present group of inventions relates to a nano-amorphous form of the known compound lenalidomide, which is characterized by the following structural formula:

Брутто-формулой: C₁₃H₁₃N₃O₃;Gross formula: C ₁₃ H ₁₃ N ₃ O ₃ ;

Молекулярной массой: 259,25.Molecular mass: 259.25.

Леналидомид относится к классу противоопухолевых иммуномодуляторов, оказывает иммуномодулирующее и антиангиогенное действие. Леналидомид ингибирует пролиферацию клеток различных линий гемопоэтических опухолей, главным образом тех, которые имеют цитогенетические дефекты хромосомы 5, усиливает опосредованный Т-лимфоцитами и клетками - естественными киллерами (ЕК) иммунитет, увеличивает число ЕК Т-клеток, подавляет ангиогенез, блокируя миграцию и адгезию эндотелиальных клеток и образование микрососудов, повышает продукцию фетального гемоглобина CD 34+ стволовыми гемопоэтическими клетками, и ингибирует продукцию про-воспалительных цитокинов, включая ФНО-альфа и интерлейкин-6.Lenalidomide belongs to the class of antitumor immunomodulators, it has immunomodulating and antiangiogenic effects. Lenalidomide inhibits the proliferation of cells of various lines of hematopoietic tumors, mainly those that have cytogenetic defects of chromosome 5, strengthens T cell-mediated (natural) killer (EC) immunity, increases the number of T cell ECs, and inhibits angiogenesis, blocking the migration and adhesion of endothelial cells and the formation of microvessels, increases the production of fetal hemoglobin CD 34+ by hematopoietic stem cells, and inhibits the production of pro-inflammatory cytokines, including TNF-alpha and interleukin-6.

Известно лекарственное средство, содержащее леналидомид, «Ревлимид», выпускаемое в форме твердых желатиновых капсул с дозировкой 2,5 мг; 7,5 мг; 20 мг; 5 мг; 10 мг; 15 мг; 25 мг. Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Ревлимид 20 мг содержит следующие компоненты:Known drug containing lenalidomide, "Revlimid", available in the form of hard gelatin capsules with a dosage of 2.5 mg; 7.5 mg; 20 mg; 5 mg; 10 mg; 15 mg; 25 mg According to the instructions for medical use, Revlimid 20 mg contains the following components:

- Леналидомид - 20 мг;- Lenalidomide - 20 mg;

- Лактоза - 244,5 мг;- Lactose - 244.5 mg;

- Целлюлоза микрокристаллическая - 120,5 мг;- Microcrystalline cellulose - 120.5 mg;

- Кроскармеллоза натрия - 12,0 мг;- Croscarmellose sodium - 12.0 mg;

- Магния стеарат - 3,0 мг.- Magnesium stearate - 3.0 mg.

Состав оболочки капсул: титана диоксид, желатин, чернила черные TekPrint™SW-9008, краситель индигокармин FD&C синий №2. Состав чернил: шеллак; этанол; изопропанол; бутанол; пропиленгликоль; вода; аммиак водный; калия гидроксид; краситель железа оксид черный.The composition of the capsule shell: titanium dioxide, gelatin, black ink TekPrint ™ SW-9008, dye indigo carmine FD&C blue No. 2. Ink composition: shellac; ethanol; isopropanol; butanol; propylene glycol; water; aqueous ammonia; potassium hydroxide; dye iron oxide black.

Согласно инструкции по медицинскому применению, Ревлимид применяется для лечения взрослых пациентов с ранее не леченной множественной миеломой, которым не показана трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. В комбинации с дексаметазоном для лечения взрослых пациентов с множественной миеломой, которые получили, по крайней мере, одну линию терапии.According to the instructions for medical use, Revlimid is used to treat adult patients with previously untreated multiple myeloma who are not indicated for hematopoietic stem cell transplantation. In combination with dexamethasone for the treatment of adult patients with multiple myeloma who have received at least one line of therapy.

После приема внутрь здоровыми добровольцами леналидомид быстро всасывается; при этом максимальная концентрация достигается через 1,5-2 часа после однократного приема. Фармакокинетическое распределение имеет линейный характер. Максимальная концентрация (C_max) и площадь под кривой «концентрация-время» (AUC) возрастают пропорционально увеличению дозы. Леналидомид можно принимать вне зависимости от приема пищи.After oral administration by healthy volunteers, lenalidomide is rapidly absorbed; while the maximum concentration is achieved after 1.5-2 hours after a single dose. The pharmacokinetic distribution is linear. The maximum concentration (C _max ) and the area under the concentration-time curve (AUC) increase in proportion to the dose increase. Lenalidomide can be taken regardless of the meal.

Леналидомид практически не метаболизируется в организме, так как 82% его дозы выделяется почками в неизменном виде.Lenalidomide is practically not metabolized in the body, since 82% of its dose is excreted by the kidneys unchanged.

Известно, что леналидомид обладает низкой растворимостью при рН, близком к 7. Существует несколько вариантов для ее увеличения: образование твердых дисперсий, со-кристаллов или аморфных форм веществ. Применение твердых дисперсий и со-кристаллов в готовых лекарственных формах имеет ряд недостатков, среди которых можно, в первую очередь, упомянуть увеличение объема таблетки или капсулы. Получение твердых дисперсий и со-кристаллов усложняется выбором органических растворителей для синтеза. В работе [Journal of Molecular Structure, 2019, 1175, 852-857] приведен пример получения со-кристаллов леналидомида с ацесульфаном в присутствии хлороформа в качестве растворителя. Используемый хлороформ относится ко 2-му классу токсичности в соответствии с классификацией ICH Q3C. Требованиями ЮН и государственных (региональных) фармакопей устанавливаются определенные допустимые уровни остаточного содержания органических растворителей в фармацевтических продуктах. Правила ЮН нормируют содержание в лекарственных средствах исходя из допустимого ежедневного воздействия (PDE) или предельно допустимого остаточного содержания, выражаемого в миллионных долях (м.д.). Так, для хлороформа PDE=0,6 мг/сут, а предельно допустимое остаточное содержание - 60 м.д. (0,006%). Исходя из этого, получение аморфной формы леналидомида становится важной технической задачей, позволяющей увеличить его растворимость.Lenalidomide is known to have low solubility at pH close to 7. There are several options for increasing it: the formation of solid dispersions, co-crystals, or amorphous forms of substances. The use of solid dispersions and co-crystals in finished dosage forms has a number of disadvantages, among which, first of all, an increase in the volume of a tablet or capsule can be mentioned. The preparation of solid dispersions and co-crystals is complicated by the choice of organic solvents for synthesis. [Journal of Molecular Structure, 2019, 1175, 852-857] gives an example of the preparation of co-crystals of lenalidomide with acesulfan in the presence of chloroform as a solvent. Used chloroform belongs to the 2nd class of toxicity in accordance with the classification of ICH Q3C. The requirements of the UN and state (regional) pharmacopeias establish certain acceptable levels of residual organic solvents in pharmaceutical products. UN regulations regulate drug content based on daily allowable exposure (PDE) or maximum residual content expressed in parts per million (ppm). So, for chloroform PDE = 0.6 mg / day, and the maximum permissible residual content is 60 ppm. (0.006%). Proceeding from this, obtaining an amorphous form of lenalidomide becomes an important technical task, allowing to increase its solubility.

Актуальной задачей изобретения является разработка наноаморфной формы леналидомида, обладающей повышенной растворимостью, и, как следствие, улучшенными фармакокинетическими параметрами.An urgent objective of the invention is the development of a nano-amorphous form of lenalidomide with increased solubility, and, as a result, improved pharmacokinetic parameters.

В патенте Канады СА2717326С раскрывается аморфная форма леналидомида и твердые дисперсии, содержащие аморфный леналидомид и фармацевтически приемлемый носитель. Аморфная форма леналидомида охарактеризована при помощи спектра порошковой рентгеновской дифракции и термоаналитических методов, таких как дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТГА). Раскрываются способы получения аморфного леналидомида, связанные с удалением растворителя из раствора леналидомида, включая распылительную сушку, отгонку растворителя с использованием ротационного испарителя, сублимационную сушку.Canadian Patent CA2717326C discloses an amorphous form of lenalidomide and solid dispersions containing amorphous lenalidomide and a pharmaceutically acceptable carrier. The amorphous form of lenalidomide was characterized using a powder X-ray diffraction spectrum and thermoanalytical methods such as differential scanning calorimetry (DSC) and thermogravimetric analysis (TGA). Disclosed are methods of producing amorphous lenalidomide associated with the removal of solvent from a solution of lenalidomide, including spray drying, distillation of the solvent using a rotary evaporator, freeze-drying.

Также описывается способ получения твердой дисперсии, содержащей леналидомид. Он включает в себя удаление растворителя из раствора леналидомида в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Полученный таким образом, леналидомид имеет чистоту около 99% масс.A method for preparing a solid dispersion containing lenalidomide is also described. It involves the removal of a solvent from a solution of lenalidomide in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. Thus obtained, lenalidomide has a purity of about 99% of the mass.

Способ получения чистого леналидомида включает взаимодействие метил-2-галогенметил-3-нитробензоата с гидрохлоридом α-аминоглутаримида в присутствии триэтиламина с образованием 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пиперидин-2,6-диона, который далее подвергают каталитическому гидрированию в растворителе в присутствии кислоты. В качестве катализатора гидрирования заявлен палладий на угле. Добавление кислоты уменьшает количество органического растворителя, а также сокращает длительность времени реакции и обеспечивает большие выход и чистоту леналидомида. Результатом реакции является кислотно-аддитивная соль леналидомида, которая может быть выделена и затем превращена в леналидомид при взаимодействии с основанием в присутствии растворителя.A method of obtaining pure lenalidomide involves the interaction of methyl 2-halogenomethyl-3-nitrobenzoate with α-aminoglutarimide hydrochloride in the presence of triethylamine to form 3- (4-nitro-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl) -piperidin-2 , 6-dione, which is then subjected to catalytic hydrogenation in a solvent in the presence of acid. Palladium on charcoal is claimed as a hydrogenation catalyst. The addition of acid reduces the amount of organic solvent, and also shortens the reaction time and provides a large yield and purity of lenalidomide. The result of the reaction is the acid addition salt of lenalidomide, which can be isolated and then converted to lenalidomide by reacting with a base in the presence of a solvent.

В патенте США №10328028 (опубл. 25.06.2019, МПК: A61K 31/454; A61K 9/16; А61Р 35/00) раскрываются фармацевтические композиции, содержащие аморфный леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль. Также раскрывается способ получения аморфного леналидомида, который включает следующие стадии:US Pat. No. 10,328,028 (publ. 06/25/2019, IPC: A61K 31/454; A61K 9/16; A61P 35/00) discloses pharmaceutical compositions containing amorphous lenalidomide or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Also disclosed is a method for producing amorphous lenalidomide, which comprises the following steps:

- растворение леналидомида с полимером и синтетическим антиоксидантом;- dissolution of lenalidomide with a polymer and synthetic antioxidant;

- распыление или распылительная сушка раствора на носителе для получения гранул;- spraying or spray drying the solution on a carrier to obtain granules;

- смешивание гранул с дополнительными наполнителями.- mixing granules with additional fillers.

Также описывается способ получения композиций аморфного леналидомида с синтетическими антиоксидантами. Предпочтительными являются монофенольные антиоксиданты. Также раскрывается способ получения фармацевтических композиций, содержащих аморфный леналидомид, синтетический антиоксидант, полимер и фармацевтически приемлемые наполнители.A method for preparing amorphous lenalidomide compositions with synthetic antioxidants is also described. Monophenol antioxidants are preferred. Also disclosed is a method for producing pharmaceutical compositions comprising amorphous lenalidomide, a synthetic antioxidant, a polymer and pharmaceutically acceptable excipients.

В патенте Латвии №14985 (опубл. 20.06.2015; МПК: C07D 401/04) раскрывается способ получения кристаллического леналидомида из 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона. Восстановление происходит в водном растворе аммония хлорида в присутствии порошка железа. Затем осадок промывают и кипятят в водно-спиртовом растворе в присутствии активированного угля, получая кристаллический продукт высокой чистоты.Latvian Patent No. 14985 (publ. 06/20/2015; IPC: C07D 401/04) discloses a method for producing crystalline lenalidomide from 3- (4-nitro-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione. Recovery occurs in an aqueous solution of ammonium chloride in the presence of iron powder. Then the precipitate is washed and boiled in a water-alcohol solution in the presence of activated carbon, obtaining a crystalline product of high purity.

Также раскрывается способ получения исходных соединений для леналидомида. Раскрыты способы получения метилового эфира 2-(бромметил)-3-нитробензойной кислоты из метилового эфира 2-метил-3-нитробензойной кислоты.Also disclosed is a method of obtaining the starting compounds for lenalidomide. Methods for producing 2- (bromomethyl) -3-nitrobenzoic acid methyl ester from 2-methyl-3-nitrobenzoic acid methyl ester are disclosed.

Одной из важных задач заявленной группы изобретений является расширение арсенала технических средств определенного назначения путем разработки новой, неизвестной ранее стабильной наноаморфной формы леналидомида, отличающейся повышенной биологической доступностью и терапевтической эффективностью, а также способов ее получения, свободных от использования оборудования с высоким энергопотреблением, а также органических растворителей 1-го и 2-го классов токсичности в соответствии с классификацией ICH Q3C.One of the important tasks of the claimed group of inventions is to expand the arsenal of technical means for a certain purpose by developing a new, previously unknown stable nano-amorphous form of lenalidomide, characterized by increased bioavailability and therapeutic effectiveness, as well as methods for its preparation, free from the use of high-energy equipment, as well as organic solvents of the 1st and 2nd classes of toxicity according to classification of ICH Q3C.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Заявленная группа изобретений относится к стабильной наноаморфной форме (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона (международное непатентованное название - леналидомид), способу ее получения и применения в фармацевтических композициях, которые могут быть использованы для лечения иммунологических и онкологических заболеваний.The claimed group of inventions relates to the stable nano-amorphous form (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione (international non-proprietary name is lenalidomide ), the method for its preparation and use in pharmaceutical compositions that can be used to treat immunological and oncological diseases.

Основной технический результат заявленной группы изобретений заключается в решении актуальной задачи расширения арсенала технических средств определенного назначения. Данная задача решается путем создания новой, не известной ранее, стабильной слабо гигроскопичной наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, которая может применяться для получения фармацевтических композиций, которые могут быть использованы для лечения иммунологических и онкологических заболеваний. При этом под наноаморфной формой понимается аморфная форма вещества, состоящая из частиц с размером от 1×10^-9 до 1×10^-7 м (от 1 до 100 нм) в соответствии с определением понятия «наночастица» IUPAC [Pure Appl. Chem., 84 (2), 377-410, 2012].The main technical result of the claimed group of inventions is to solve the urgent task of expanding the arsenal of technical means for a specific purpose. This problem is solved by creating a new, previously unknown, stable weakly hygroscopic nanoamorphic form (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6 -dione, which can be used to obtain pharmaceutical compositions that can be used to treat immunological and oncological diseases. Moreover, the nano-amorphous form refers to the amorphous form of a substance consisting of particles with a size of 1 × 10 ^-9 to 1 × 10 ^-7 m (1 to 100 nm) in accordance with the definition of the term “nanoparticle” IUPAC [Pure Appl. Chem., 84 (2), 377-410, 2012].

Дополнительным техническим результатом заявленной группы изобретений является получение стабильной и слабо гигроскопичной наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, обладающей улучшенной биодоступностью и терапевтической эффективностью.An additional technical result of the claimed group of inventions is to obtain a stable and slightly hygroscopic nano-amorphous form (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione having improved bioavailability and therapeutic efficacy.

Наноаморфная форма леналидомида по изобретению характеризуется широким гало в спектре порошковой рентгеновской дифракции, средним размером частиц 63,85±10,0 нм. В предпочтительном варианте наноаморфная форма характеризуется температурой стеклования 122,9°С±7°С, кристаллизацией при температуре 172,6±5°С с удельным тепловым эффектом 85,77±9 Дж/г и плавлением при температуре 267,5±5°С с удельным тепловым эффектом 149,8±15 Дж/г в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°С/мин.The nano-amorphous form of lenalidomide according to the invention is characterized by a wide halo in the spectrum of powder x-ray diffraction, an average particle size of 63.85 ± 10.0 nm. In a preferred embodiment, the nano-amorphous form is characterized by a glass transition temperature of 122.9 ° C ± 7 ° C, crystallization at a temperature of 172.6 ± 5 ° C with a specific thermal effect of 85.77 ± 9 J / g and melting at a temperature of 267.5 ± 5 ° C with a specific thermal effect of 149.8 ± 15 J / g under differential scanning calorimetry at a heating rate of 10 ° C / min.

В соответствии с другим аспектом группа изобретений относится к способу получения наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, в соответствии с которым леналидомид растворяют в расплаве D-фруктозы, лактозы моногидрата и мочевины. Горячий сироп выливают в очищенную, охлажденную до +5°С воду и интенсивно перемешивают. Выделившийся осадок леналидомида фильтруют, повторно суспендируют в очищенной воде и перемешивают при температуре 20°С. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой очищенной и высушивают под вакуумом до постоянной массы. В одном из вариантов осуществления изобретения вместо готового сырьевого кристаллического леналидомида используют 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион, который восстанавливают серым чугуном в форме колотой дроби в среде водного этанола, а затем продукт реакции без выделения в чистом виде растворяют в расплаве D-фруктозы, лактозы моногидрата и мочевины. Горячий сироп выливают в очищенную, охлажденную до +5°С воду и интенсивно перемешивают. Выделившийся осадок леналидомида фильтруют, повторно суспендируют в очищенной воде и перемешивают при температуре 30°С. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой очищенной и высушивают под вакуумом до постоянной массы. Указанный вариант способа синтеза наноаморфного леналидомида отличается от известных способов из уровня техники тем, что в нем не используются катализаторы драгоценных металлов, таких как палладий, а в качестве эффективного восстановителя применяется серый чугун в форме колотой дроби. Колотая дробь серого чугуна является дешевым и доступным сырьем. При использовании в качестве восстановителя существенно более дорогого порошка восстановленного железа, 97%, <0,044 мм (325 mesh) достигается меньший выход целевого продукта.In accordance with another aspect, a group of inventions relates to a method for producing a nano-amorphous form of (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione, whereby lenalidomide is dissolved in a melt of D-fructose, lactose monohydrate and urea. Hot syrup is poured into purified water cooled to + 5 ° C and mixed vigorously. The precipitated lenalidomide precipitate is filtered, resuspended in purified water and stirred at a temperature of 20 ° C. The precipitate is filtered off, washed on the filter with purified water and dried under vacuum to constant weight. In one embodiment, 3- (4-nitro-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione, which is reduced with gray cast iron, is used in place of the finished crystalline lenalidomide raw material in the form of a split fraction in aqueous ethanol, and then the reaction product without isolation in pure form is dissolved in the melt of D-fructose, lactose monohydrate and urea. Hot syrup is poured into purified water cooled to + 5 ° C and mixed vigorously. The precipitated lenalidomide precipitate is filtered, resuspended in purified water and stirred at a temperature of 30 ° C. The precipitate is filtered off, washed on the filter with purified water and dried under vacuum to constant weight. The indicated variant of the method for the synthesis of nano-amorphous lenalidomide differs from the known methods of the prior art in that it does not use precious metal catalysts such as palladium, and gray cast iron in the form of a split fraction is used as an effective reducing agent. Chipped gray iron is a cheap and affordable raw material. When using a much more expensive reduced iron powder as a reducing agent, 97%, <0.044 mm (325 mesh), a lower yield of the target product is achieved.

В предпочтительном варианте способ получения наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона включает следующие стадии:In a preferred embodiment, the method for producing the nano-amorphous form of (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione comprises the following steps:

загрузка (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в расплав, состоящий из 40 г D-фруктозы, 15 г лактозы моногидрата и 40 г мочевины при температуре 55°С;loading (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione into the melt, consisting of 40 g of D-fructose, 15 g lactose monohydrate and 40 g of urea at a temperature of 55 ° C;

перемешивание при температуре 55°С;stirring at a temperature of 55 ° C;

внесение полученного расплава в воду, охлажденную до +7°С;introducing the obtained melt into water cooled to + 7 ° C;

перемешивание;mixing;

фильтрование осадка;sediment filtration;

приготовление суспензии осадка в воде;preparation of a suspension of sediment in water;

перемешивание при температуре 20°С в течение около 1 часа;stirring at a temperature of 20 ° C for about 1 hour;

фильтрование;filtration;

промывание осадка водой на фильтре;washing the precipitate with water on the filter;

высушивание до постоянной массы под вакуумом при температуре +40°Сdrying to constant weight under vacuum at a temperature of + 40 ° C

Предложенные способы получения указанной аморфной формы леналидомида отличаются тем, что в них не используется оборудование с высоким энергопотреблением, такое как шариковые мельницы, лиофильные сушилки, или установки для распылительной сушки; а также тем, что в них либо совсем не используются органические растворители, либо используются растворители первого класса токсичности, причем обеспечивается их остаточное содержание ниже предельно допустимых уровней.The proposed methods for producing said amorphous form of lenalidomide are distinguished by the fact that they do not use high energy consumption equipment, such as ball mills, freeze dryers, or spray drying plants; as well as the fact that they either do not use organic solvents at all, or use solvents of the first toxicity class, and their residual content is ensured below the maximum permissible levels.

Одним из аспектов изобретения является также наноаморфная форма (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, полученная вышеуказанным способом.One aspect of the invention is also a nano-amorphous form of (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione obtained by the above method.

Заявленная группа изобретений относится также к применению наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона для приготовления фармацевтической композиции для лечения иммунологических или онкологических заболеваний.The claimed group of inventions also relates to the use of the nano-amorphous form (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione for the preparation of a pharmaceutical composition for treatment of immunological or oncological diseases.

В еще одном варианте осуществления заявленная группа изобретений относится к фармацевтической композиции для лечения иммунологических или онкологических заболеваний, которая содержит наноаморфную форму наноаморфную форму (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в сочетании с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.In another embodiment, the claimed group of inventions relates to a pharmaceutical composition for the treatment of immunological or oncological diseases, which contains a nano-amorphous form, nano-amorphous form (RS) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindole- 2-yl) piperidin-2,6-dione in combination with pharmaceutically acceptable excipients.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены Фигуры 1-8:To clarify the essence of the claimed technical solution to the description attached Figures 1-8:

На Фиг. 1 приведен спектр порошковой рентгеновской дифракции сырьевого леналидомида кристаллической формы А.In FIG. 1 shows a spectrum of powder x-ray diffraction of raw Lenalidomide crystalline form A.

На Фиг. 2 приведен спектр порошковой рентгеновской дифракции образцов наноаморфного леналидомида по примеру 1 до испытания на стабильность (график а) и после испытаний (график b).In FIG. 2 shows a spectrum of powder x-ray diffraction of samples of nano-amorphous lenalidomide according to example 1 before the stability test (graph a) and after the tests (graph b).

На Фиг. 3 приведен спектр порошковой рентгеновской дифракции аморфного леналидомида по примеру 2b.In FIG. 3 shows a powder X-ray diffraction spectrum of amorphous lenalidomide according to Example 2b.

На Фиг. 4 приведена дериватограмма наноаморфного леналидомида по примеру 1 (кривая А) и известной кристаллической формы А (кривая В, адаптировано из описания к патенту США №7465800 В2).In FIG. 4 is a derivatogram of nano-amorphous lenalidomide of Example 1 (curve A) and a known crystalline form A (curve B, adapted from US Pat. No. 7,465,800 B2).

На Фиг. 3 приведена дериватограмма наноаморфного леналидомида по примеру 2а.In FIG. 3 shows a derivatogram of nano-amorphous lenalidomide according to example 2a.

На Фиг. 6 приведено распределение по размеру частиц наноаморфного леналидомида, полученного по примерам 1, 2а, b, и 3а, b.In FIG. Figure 6 shows the particle size distribution of nano-amorphous lenalidomide obtained in Examples 1, 2a, b, and 3a, b.

На Фиг. 7 приведен спектр ¹Н ЯМР раствора аморфного леналидомида по примеру 1 (ДМСО-D₆, 400, 13 МГц).In FIG. 7 shows a ¹ H NMR spectrum of an amorphous lenalidomide solution in Example 1 (DMSO-D ₆ , 400, 13 MHz).

На Фиг. 8 приведен спектр ¹Н ЯМР раствора аморфного леналидомида по примеру 2а (ДМСО-D₆, 400, 13 МГц).In FIG. Figure 8 shows a ¹ H NMR spectrum of an amorphous lenalidomide solution according to Example 2a (DMSO-D ₆ , 400, 13 MHz).

На Фиг. 9 приведен график сравнительной оценки терапевтической эффективности наноаморфного, аморфного и кристаллического леналидомида в эксперименте при начале медикаментозного лечения на следующий день после прививания опухолевых клеток.In FIG. Figure 9 shows a graph of a comparative evaluation of the therapeutic efficacy of nanoamorphic, amorphous, and crystalline lenalidomide in an experiment at the start of drug treatment the day after inoculation of tumor cells.

На Фиг. 10 приведен график сравнительной оценки терапевтической эффективности наноаморфного, аморфного и кристаллического леналидомида в эксперименте по влиянию леналидомида на уже имеющуюся опухоль.In FIG. Figure 10 shows a graph of a comparative assessment of the therapeutic efficacy of nanoamorphic, amorphous, and crystalline lenalidomide in an experiment on the effect of lenalidomide on an existing tumor.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Для образца наноаморфного леналидомида, полученного по примеру 1, в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°С/мин, наблюдаются следующие тепловые эффекты: температура стеклования (Tg) 127,5°С, кристаллизация 172,7°С (экзотермический, удельный тепловой эффект 91,03 Дж/г), плавление 266,4°С (эндотермический удельный тепловой эффект 147,6 Дж/г). Для образца наноаморфного леналидомида, полученного по примеру 2а, в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°С/мин, наблюдаются следующие тепловые эффекты: температура стеклования (Tg) 118,32°С, кристаллизация 172,6°С (экзотермический, удельный тепловой эффект 80,51 Дж/г), плавление 267,5°С (эндотермический, удельный тепловой эффект 147,6 Дж/г). Учитывая близкие значения температур и величин тепловых эффектов на графиках ДСК, зарегистрированных при одинаковых условиях, можно считать, что оба образца относятся к одной и той же наноаморфной форме леналидомида. На Фиг. 4 представлена дериватограмма наноаморфного леналидомида по примеру 1 (кривая А) и известной кристаллической формы А (кривая В, адаптировано из описания к патенту США №7465800, (опубл. 16.12.2008; МПК: A61K 31/445; A61K 31/454; C07D 401/04; A61K), которая характеризуется только одним эндотермическим эффектом, соответствующим плавлению при температуре 266,4°С. Сравнение двух дериватограмм позволяет предположить, что наноаморфный леналидомид по настоящему изобретению кристаллизуется именно в форму А при температуре 172,7°С, которая затем плавится при 266,4°С (для образца по примеру 1).For a sample of nano-amorphous lenalidomide obtained in Example 1, under the conditions of differential scanning calorimetry at a heating rate of 10 ° C / min, the following thermal effects are observed: glass transition temperature (Tg) 127.5 ° C, crystallization 172.7 ° C (exothermic, specific thermal effect 91.03 J / g), melting 266.4 ° C (endothermic specific thermal effect 147.6 J / g). For a sample of nano-amorphous lenalidomide obtained in Example 2a, under differential scanning calorimetry at a heating rate of 10 ° C / min, the following thermal effects are observed: glass transition temperature (Tg) 118.32 ° C, crystallization 172.6 ° C (exothermic, specific thermal effect 80.51 J / g), melting 267.5 ° C (endothermic, specific thermal effect 147.6 J / g). Considering the close temperatures and thermal effects on the DSC plots recorded under the same conditions, we can assume that both samples belong to the same nano-amorphous form of lenalidomide. In FIG. 4 is a derivatogram of nano-amorphous lenalidomide according to Example 1 (curve A) and a known crystalline form A (curve B, adapted from the description of US Pat. No. 7,465,800, (published on December 16, 2008; IPC: A61K 31/445; A61K 31/454; C07D 401/04; A61K), which is characterized by only one endothermic effect, corresponding to melting at a temperature of 266.4 ° C. A comparison of the two derivatograms suggests that the nano-amorphous lenalidomide of the present invention crystallizes precisely in Form A at a temperature of 172.7 ° C, which then melts at 266.4 ° C (for the sample in example 1).

Поскольку координаты экстремума на кривой ДСК существенно зависят от конструкции прибора и условий проведения эксперимента, во всех случаях в качестве температуры фазового перехода принималась температура, соответствующая точке пересечения экстраполированной в область пика базовой линии графика с касательной к точке перегиба на левом плече кривой (Tonset). Температуру стеклования (расстекловывания) Tg определяли, как точку S-образного перегиба кривой ДСК в области, где теплоемкость системы резко изменялась. Высокая чистота полученных образцов наноаморфного леналидомида исключает возможность проявления примесями и остаточными органическими растворителями «пластифицирующего» эффекта на полученную наноаморфную форму леналидомида. Это обеспечивает достоверность определенного значения температуры стеклования для веществ по изобретению. Принято считать, что статистический разброс результатов для Tg может варьироваться в зависимости от природы материала в пределах 2-5% (внутрилабораторный тест) и 2-7% (межлабораторный тест).Since the coordinates of the extremum on the DSC curve substantially depend on the design of the device and the conditions of the experiment, in all cases the temperature corresponding to the point of intersection of the baseline of the graph extrapolated to the peak region with the tangent to the inflection point on the left shoulder of the curve (Tonset) was taken as the phase transition temperature. The glass transition temperature (devitrification) Tg was determined as the point of the S-shaped inflection of the DSC curve in the region where the heat capacity of the system changed sharply. The high purity of the obtained samples of nano-amorphous lenalidomide eliminates the possibility of impurities and residual organic solvents exhibiting a “plasticizing” effect on the obtained nano-amorphous form of lenalidomide. This ensures the reliability of a certain value of the glass transition temperature for substances according to the invention. It is generally accepted that the statistical scatter of the results for Tg can vary, depending on the nature of the material, within 2-5% (intralaboratory test) and 2-7% (interlaboratory test).

Стабильность и низкая гигроскопичность наноаморфной формы леналидомида по изобретению по сравнению с известными аморфными формами леналидомида подтверждена соответствующими исследованиями (примеры №5 и 6).The stability and low hygroscopicity of the nano-amorphous form of lenalidomide according to the invention compared with the known amorphous forms of lenalidomide is confirmed by appropriate studies (examples No. 5 and 6).

Испытания на животных показывают, что наноаморфная форма леналидомида по изобретению, характеризующаяся указанными выше параметрами и полученная предложенными в настоящем изобретении способами, обладает улучшенной биологической доступностью и терапевтической эффективностью при лечении опухолевых заболеваний, чем известные аморфные формы, полученные по примерам 3а, b и кристаллическая форма леналидомида.Animal tests show that the nano-amorphous form of lenalidomide according to the invention, characterized by the above parameters and obtained by the methods proposed in the present invention, has improved bioavailability and therapeutic efficacy in the treatment of tumor diseases than the known amorphous forms obtained in examples 3a, b and crystalline form lenalidomide.

Физико-химический анализ леналидомида был осуществлен методами ядерной магнитной спектроскопии ¹Н ЯМР, масс-спектрометрии, ВЭЖХ, ГЖХ и порошковой рентгеновской дифракции. Спектры ¹Н ЯМР были зарегистрированы в насыщенном растворе дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-D6) на ЯМР-спектрометре высокого разрешения VXR-400 фирмы "VAPJAN" (США) на рабочей частоте 400,13 МГц для протонного спектра и 100,61 МГц для углеродного. Рентгенофазовый анализ (РФА) проводили на дифрактометре Rigaku D/MAX-2500 (Rigaku, Япония) на Си Ка излучении (λ=1,54056

). Содержание воды анализировалось на автоматическом титраторе C20D, Mettler Toledo (Швейцария). Размер частиц определяли при помощи анализатора Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments). Условия проведения анализа методом ВЭЖХ см. в примере №9.Physico-chemical analysis of lenalidomide was carried out by methods of nuclear magnetic spectroscopy ¹ H NMR, mass spectrometry, HPLC, GLC and powder x-ray diffraction. ¹ H NMR spectra were recorded in a saturated solution of deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-D6) on a VXR-400 high resolution NMR spectrometer (VAPJAN, USA) at an operating frequency of 400.13 MHz for the proton spectrum and 100.61 MHz for the carbon one. X-ray phase analysis (XRD) was carried out on a Rigaku D / MAX-2500 diffractometer (Rigaku, Japan) on Cu Ka radiation (λ = 1.54056

) Water content was analyzed on a C20D automatic titrator, Mettler Toledo (Switzerland). Particle size was determined using a Zetasizer Nano ZS90 analyzer (Malvern Instruments). The conditions for the analysis by HPLC, see example No. 9.

Возможность осуществления заявленной группы изобретений иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается только ими.The possibility of implementing the claimed group of inventions is illustrated by the following examples, but is not limited to only them.

Пример №1. Получение наноаморфного леналидомида из кристаллического леналидомида.Example No. 1. Obtaining nanoamorphic lenalidomide from crystalline lenalidomide.

В трехгорлую круглодонную колбу объемом 500 мл, оснащенную механической якорной мешалкой, загрузили 40,0 г D-фруктозы, 15,0 г лактозы моногидрата и 40,0 г мочевины. Смесь нагрели до температуры 55°С при медленном перемешивании, при этом происходило сплавление компонентов. В полученный полупрозрачный сироп вносили тремя равными порциями с интервалом 5 минут 10,0 г кристаллической формы леналидомида (производства Henrikang, Китай). Спектр порошковой рентгеновской дифракции сырьевого кристаллического леналидомида приведен на Фиг. 1. Перемешивание продолжали в течение 15 минут до получения вязкой однородной массы при температуре 55°С. Горячий сироп вылили в 500 мл очищенной, охлажденной до +7°С воды при интенсивном перемешивании в течение 20 мин. Выделившийся осадок леналидомида отфильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), повторно суспендировали в 500 мл очищенной воды и перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Осадок отфильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), промыли на фильтре 3×100 мл воды очищенной и высушили под вакуумом до постоянной массы при температуре +40°С. Получили 9,79 г леналидомида. Выход 98%. Содержание основного вещества - 99,89%) по данным ВЭЖХ. ESI-MS: m/z=260,33 (M+H⁺). Образец полученного вещества полностью рентгеноаморфен (Фиг. 3). Средний размер частиц составил 58,6 нм (Фиг. 6А). Исследование полученного вещества методом дифференциальной сканирующей калориметрии показало следующие термические эффекты: эндотермический при 127,5°С (температура стеклования), экзотермический 172,7°С (кристаллизация) и эндотермический 266,4°С (плавление). Сохранность молекулярной структуры леналидомида, отсутствие продуктов деградации и других органических примесей, включая значимые уровни остаточных органических растворителей, подтверждается спектром ¹Н ЯМР полученного продукта (Фиг. 7).A 500 ml three-necked round-bottom flask equipped with a mechanical anchor stirrer was charged with 40.0 g of D-fructose, 15.0 g of lactose monohydrate and 40.0 g of urea. The mixture was heated to a temperature of 55 ° C with slow stirring, with the fusion of the components. 10.0 g of the crystalline form of lenalidomide (manufactured by Henrikang, China) was added to the obtained translucent syrup in three equal portions with an interval of 5 minutes. The X-ray powder diffraction spectrum of raw crystalline lenalidomide is shown in FIG. 1. Stirring was continued for 15 minutes until a viscous homogeneous mass was obtained at a temperature of 55 ° C. Hot syrup was poured into 500 ml of purified water cooled to + 7 ° С with vigorous stirring for 20 minutes. The precipitated lenalidomide precipitate was filtered off on a Schott glass porous filter (S3), resuspended in 500 ml of purified water and stirred for 1 hour at a temperature of 20 ° C. The precipitate was filtered on a glass porous Schott filter (S3), washed on the filter with 3 × 100 ml of purified water and dried under vacuum to constant weight at a temperature of + 40 ° C. Received 9.79 g of lenalidomide. Yield 98%. The content of the main substance is 99.89%) according to HPLC. ESI-MS: m / z = 260.33 (M + H ⁺ ). A sample of the obtained substance is completely X-ray amorphous (Fig. 3). The average particle size was 58.6 nm (Fig. 6A). The study of the obtained substance by differential scanning calorimetry showed the following thermal effects: endothermic at 127.5 ° C (glass transition temperature), exothermic 172.7 ° C (crystallization) and endothermic 266.4 ° C (melting). The preservation of the molecular structure of lenalidomide, the absence of degradation products and other organic impurities, including significant levels of residual organic solvents, is confirmed by a ¹ H NMR spectrum of the obtained product (Fig. 7).

Пример №2а. Синтез наноаморфного леналидомида.Example No. 2a. Synthesis of nano-amorphous lenalidomide.

К кипящей, хорошо перемешиваемой взвеси серого чугуна в виде дроби колотой с размером частиц 0,3 мм (15,30 г) в 50%-м водном этаноле (300 мл) постепенно добавляли 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион (10,00 г, 0,038 моль). В реакционную смесь прикапывали небольшое количество соляной кислоты (5 мл). Реакцию проводили в трехгорлой круглодонной колбе, снабженной механической мешалкой и обратным холодильником.3- (4-nitro-1-oxo-1) was gradually added to boiling, well-mixed suspension of gray cast iron in the form of a fraction crushed with a particle size of 0.3 mm (15.30 g) in 50% aqueous ethanol (300 ml) , 3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione (10.00 g, 0.038 mol). A small amount of hydrochloric acid (5 ml) was added dropwise to the reaction mixture. The reaction was carried out in a three-necked round bottom flask equipped with a mechanical stirrer and reflux condenser.

По окончании восстановления реакционную смесь нейтрализовали 7% раствором бикарбоната натрия до рН 7,0 и фильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3). Из полученного осадка продукт экстрагировали диметилсульфоксидом, при этом оставалось небольшое количество нерастворимого шлама. Раствор пропускали через слой диатомита (Celite 545). Осветленный раствор нагревали до 40°С и постепенно добавляли к охлажденной до 5-10°С воде при перемешивании (700 об/мин). Полученный осадок отфильтровывали на фильтре Шотта (S3), промывали очищенной водой 3×100 мл.Upon completion of the reduction, the reaction mixture was neutralized with a 7% sodium bicarbonate solution to pH 7.0 and filtered on a glass Schott filter (S3). From the precipitate obtained, the product was extracted with dimethyl sulfoxide, with a small amount of insoluble sludge remaining. The solution was passed through a layer of diatomite (Celite 545). The clarified solution was heated to 40 ° C and gradually added to the water cooled to 5-10 ° C with stirring (700 rpm). The resulting precipitate was filtered on a Schott filter (S3), washed with purified water 3 × 100 ml.

Полученный осадок вносили при медленном перемешивании в трехгорлую кругло донную колбу объемом 250 мл, оснащенную механической якорной мешалкой, содержащий расплав 20,0 г D-фруктозы, 7,5 г лактозы моногидрата и 20,0 г мочевины, нагретый до температуры 55°С, Перемешивание продолжали в течение 15 минут до получения вязкой однородной массы при температуре 55°С. Горячий сироп выливали в 300 мл очищенной, охлажденной до +7°С воды и интенсивно перемешивали в течение 20 мин. Выделившийся осадок леналидомида фильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), повторно суспендировали в 300 мл очищенной воды и перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Осадок отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), промывали на фильтре 3×70 мл воды очищенной и высушивали под вакуумом до постоянной массы при температуре +40°С. Получали 8,05 г рентгеноаморфного 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона. Содержание основного вещества - 99,80% по данным ВЭЖХ. Средний размер частиц составил 69,1 нм (Фиг. 6В). Выход 82%). Сохранность молекулярной структуры леналидомида, отсутствие продуктов деградации и других органических примесей, включая значимые уровни остаточных органических растворителей, подтверждается спектром ¹Н ЯМР полученного продукта (Фиг. 8).The resulting precipitate was introduced with slow stirring into a 250 ml three-neck round bottom flask equipped with a mechanical anchor mixer containing a melt of 20.0 g of D-fructose, 7.5 g of lactose monohydrate and 20.0 g of urea, heated to a temperature of 55 ° C. Stirring was continued for 15 minutes until a viscous homogeneous mass was obtained at a temperature of 55 ° C. Hot syrup was poured into 300 ml of purified water cooled to + 7 ° C and stirred vigorously for 20 minutes. The precipitated lenalidomide precipitate was filtered on a Schott glass porous filter (S3), resuspended in 300 ml of purified water and stirred for 1 hour at a temperature of 20 ° C. The precipitate was filtered on a Schott glass porous filter (S3), washed on the filter with 3 × 70 ml of purified water and dried under vacuum to constant weight at a temperature of + 40 ° С. Received 8.05 g of X-ray amorphous 3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione. The content of the main substance is 99.80% according to HPLC. The average particle size was 69.1 nm (Fig. 6B). Yield 82%). Preservation of the molecular structure of lenalidomide, the absence of degradation products and other organic impurities, including significant levels of residual organic solvents, is confirmed by a ¹ H NMR spectrum of the obtained product (Fig. 8).

Пример №2b. Синтез наноаморфного леналидомида.Example No. 2b. Synthesis of nano-amorphous lenalidomide.

Синтез проводили аналогично Примеру 2а на загрузке исходного 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион (1,00 г, 0,0038 моль), с отличием в том, что в качестве восстановителя вместо колотой дроби серого чугуна использовали восстановленное железо, 97%, порошок <0,044 мм (325 mesh) (209309, Sigma-Aldrich). Выход продукта составил 77%. Спектр 1H ЯМР (ДМСО-d6, δ, м.д.): 11,01 (с, 1H, NH); 7,20 (т, J=7,6 Гц, 1H, Н-6); 6,93 (д, J=7,4 Гц, 1H, Н-7); 6,81 (д, J=7,9 Гц, 1H, Н-5); 5,43 (с, 2Н, NH₂); 5,12 (дд, J=13,3, 5,1 Гц, 1H, NCH); 4,19 (д, J=16,9 Гц, 1H, NCH₂); 4,13 (д, J=16,9 Гц, 1H, NCH₂), 2.92 (ддд, J=18,1, 13,6, 5,4 Гц, 1H, СОСН₂); 2.64 (дт, J=17,2, 3,2 Гц, 1H, СОСН₂); 2,32 (кв д, J=13,2, 4,4 Гц, 1Н, СН₂); 2.06-2.01 (м, 1H, СН₂).The synthesis was carried out analogously to Example 2A on the loading of the original 3- (4-nitro-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione (1.00 g, 0.0038 mol ), with the difference that instead of the crushed gray iron fraction, reduced iron was used as a reducing agent: reduced iron, 97%, powder <0.044 mm (325 mesh) (209309, Sigma-Aldrich). The product yield was 77%. 1 H NMR Spectrum (DMSO-d6, δ, ppm): 11.01 (s, 1H, NH); 7.20 (t, J = 7.6 Hz, 1H, H-6); 6.93 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-7); 6.81 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-5); 5.43 (s, 2H, NH ₂ ); 5.12 (dd, J = 13.3, 5.1 Hz, 1H, NCH); 4.19 (d, J = 16.9 Hz, 1H, NCH ₂ ); 4.13 (d, J = 16.9 Hz, 1H, NCH ₂ ), 2.92 (ddd, J = 18.1, 13.6, 5.4 Hz, 1H, COSH ₂ ); 2.64 (dt, J = 17.2, 3.2 Hz, 1H, COCH ₂ ); 2.32 (q d, J = 13.2, 4.4 Hz, 1H, CH ₂ ); 2.06-2.01 (m, 1H, CH ₂ ).

Пример №3а. Получение аморфного леналидомида (пример сравнения).Example No. 3a. Obtaining amorphous lenalidomide (comparison example).

Аморфный леналидомид получали по способу, раскрытому в патенте Канады СА2717326С, примеру 8. Леналидомид (2,00 г) растворяли при перемешивании в смеси метанола (25 мл) и диметилформамида (25 мл) при 34°С. Прозрачный раствор нагревали до 60°С в течение 2 минут и упаривали на распылительной сушильной установке Buchi В290 в условиях, соответствующих примеру 8. Получали 1,02 г рентгеноаморфного леналидомида. Выход 51%. Средний размер частиц составил 482,6 нм (Фиг. 6С). Образец хранили при температуре не выше +5°С в полиэтиленовой банке с крышкой, заполненной азотом в течение не более 5 дней.Amorphous lenalidomide was obtained according to the method disclosed in Canadian patent CA2717326C, example 8. Lenalidomide (2.00 g) was dissolved with stirring in a mixture of methanol (25 ml) and dimethylformamide (25 ml) at 34 ° C. The clear solution was heated to 60 ° C for 2 minutes and evaporated on a Buchi B290 spray dryer under the conditions of Example 8. 1.02 g of X-ray amorphous lenalidomide was obtained. Yield 51%. The average particle size was 482.6 nm (Fig. 6C). The sample was stored at a temperature not exceeding + 5 ° C in a plastic jar with a lid filled with nitrogen for no more than 5 days.

Пример №3b. Получение аморфного леналидомида (пример сравнения).Example No. 3b. Obtaining amorphous lenalidomide (comparison example).

Аморфный леналидомид получали аналогично способу, раскрытому в патенте Канады СА2717326С, примеру 9. Леналидомид (1,00 г) измельчали на планетарной шаровой мельнице с мелющими шарами из карбида вольфрама в течение 2 часов на скорости 450 об/мин с реверсивным движением каждые 10 минут. Получали 0,91 г рентгеноаморфного леналидомида. Выход 91%. Содержание основного вещества 99,29% по данным ВЭЖХ. Средний размер частиц составил 523,3 нм (Фиг. 6D). Образец хранили при температуре не выше +5°С в полиэтиленовой банке с крышкой, заполненной азотом в течение не более 5 дней.Amorphous lenalidomide was obtained similarly to the method disclosed in Canadian patent CA2717326C, example 9. Lenalidomide (1.00 g) was ground in a planetary ball mill with grinding balls of tungsten carbide for 2 hours at a speed of 450 rpm with a reverse movement every 10 minutes. 0.91 g of X-ray amorphous lenalidomide was obtained. Yield 91%. The basic substance content of 99.29% according to HPLC. The average particle size was 523.3 nm (Fig. 6D). The sample was stored at a temperature not exceeding + 5 ° C in a plastic jar with a lid filled with nitrogen for no more than 5 days.

Пример №4. Определение остаточных органических растворителей.Example No. 4. Determination of residual organic solvents.

Для образцов аморфного леналидомида по изобретению остаточные органические растворители определяли методом газовой хроматографии в соответствии с ГФ РФ (ОФС.1.1.0008.15 «Остаточные органические растворители», ОФС.1.2.1.2.0004.15 «Газовая хроматография», ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография») на газовом хроматографе с программированием температуры, снабженном пламенно-ионизационным детектором GC-2010 Plus, Shimadzu (Япония) и автоматическим устройством для анализа равновесной паровой фазы типа «Headspace», АОС-5000 Plus, Shimadzu (Швейцария).For samples of amorphous lenalidomide according to the invention, the residual organic solvents were determined by gas chromatography in accordance with the RF GF (OFS.1.1.0008.15 "Residual organic solvents", OFS.1.2.1.2.0004.15 "Gas chromatography", OFS.1.2.1.2.0001.15 " Chromatography ”) on a gas chromatograph with temperature programming, equipped with a flame-ionization detector GC-2010 Plus, Shimadzu (Japan) and an automatic device for analyzing the equilibrium vapor phase of the“ Headspace ”type, AOC-5000 Plus, Shimadzu (Switzerland).

Хроматографические условия:Chromatographic conditions:

- капиллярная кварцевая колонка размером 30 м × 0,32 мм, заполненная сорбентом (6%-цианопропилфенил)-диметилполисилоксан, толщина неподвижной фазы 1,8 мкм (типа ZB-624, кат. №: 7HM-G005-31, «Phenomenex», США);- a capillary quartz column measuring 30 m × 0.32 mm filled with a sorbent (6% cyanopropylphenyl) dimethylpolysiloxane, the thickness of the stationary phase is 1.8 μm (type ZB-624, cat. No: 7HM-G005-31, "Phenomenex" , USA);

- температура колонки - градиент: 110°С (3 мин) → 15°С/мин 190°С (3 мин);- column temperature - gradient: 110 ° С (3 min) → 15 ° С / min 190 ° С (3 min);

- температура инжектора 200°С;- temperature of the injector 200 ° C;

- детектор - пламенно-ионизационный (ПИД);- detector - flame ionization (PID);

- скорость подачи воздуха для ПИД - 450 мл/мин;- air flow rate for PID - 450 ml / min;

- скорость подачи водорода для ПИД - 45 мл/мин;- hydrogen feed rate for PID - 45 ml / min;

- температура детектора - 250°С;- detector temperature - 250 ° C;

- газ-носитель - азот;- carrier gas is nitrogen;

- скорость газа-носителя - 1 мл/мин;- carrier gas velocity - 1 ml / min;

- расщепление потока - 20:1;- flow splitting - 20: 1;

- время регистрации - 11,33 мин.- registration time - 11.33 minutes.

Пример №5. Исследование растворимости аморфного леналидомида.Example No. 5. Study of the solubility of amorphous lenalidomide.

Сравнение растворимости кристаллической и аморфных форм леналидомида проводится в 0,2 М фосфатном буфере при рН 6,8. Навеску образца леналидомида (300 мг) добавляют к 10,0 мл фосфатного буфера в колбу и оставляют на 48 часов на орбитальном шейкере KS 130 Basic IKA. Отбирают 5,0 мл содержимого колбы, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут, а затем пропускают надосадочную жидкость через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм типа Millex HN «Merck Millipore», отбрасывая первые порции фильтрата. Результат оценивают по данным ВЭЖХ. В качестве стандартного раствора леналидомида используют раствор с известной концентрацией 10 мг/мл. Исходя из этого, осуществляется пересчет для всех исследуемых растворов.A comparison of the solubility of crystalline and amorphous forms of lenalidomide is carried out in 0.2 M phosphate buffer at pH 6.8. A sample of lenalidomide (300 mg) is added to 10.0 ml of phosphate buffer in a flask and left for 48 hours on an orbital shaker KS 130 Basic IKA. 5.0 ml of flask contents were taken, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was passed through a 0.45 μm Millex HN Merck Millipore membrane filter, discarding the first portions of the filtrate. The result is evaluated by HPLC. As a standard solution of lenalidomide, a solution with a known concentration of 10 mg / ml is used. Based on this, a recount is performed for all the studied solutions.

Наноаморфный леналидомид по примеру 1 - 0,625±0,005 мг/мл;Nano-amorphous lenalidomide according to example 1 - 0.625 ± 0.005 mg / ml;

Наноаморфный леналидомид по примеру 2а 0,623±0,005 мг/мл;Nano-amorphous lenalidomide according to example 2a 0.623 ± 0.005 mg / ml;

Аморфный леналидомид по примеру 3а - 0,597±0,005 мг/мл;Amorphous lenalidomide according to example 3a - 0.597 ± 0.005 mg / ml;

Кристаллический леналидомид, форма А - 0,540±0,005 мг/мл.Crystalline lenalidomide Form A 0.540 ± 0.005 mg / ml.

Пример №6. Исследование стабильности аморфного леналидомида.Example No. 6. Study of the stability of amorphous lenalidomide.

Стабильность образцов наноаморфного леналидомида, полученных по примерам 1 и 2 была подтверждена отсутствием пиков в спектре порошковой рентгеновской дифракции после двух месяцев хранения при температуре 25±2°С и относительной влажности 60±5%. На Фиг. 2 представлены дифрактограммы образцов наноаморфного леналидомида до испытания на стабильность (график а) и после испытаний (график b). Для образца аморфного леналидомида, полученного известным способом по примерам 3а, b (примеры сравнения) в спектрах порошковой рентгеновской дифракции наблюдались заметные рефлексы кристаллической формы на фоне широкого гало спустя 1 месяц хранения при вышеуказанных условиях.The stability of the samples of nano-amorphous lenalidomide obtained in examples 1 and 2 was confirmed by the absence of peaks in the spectrum of powder x-ray diffraction after two months of storage at a temperature of 25 ± 2 ° C and a relative humidity of 60 ± 5%. In FIG. Figure 2 shows the diffraction patterns of samples of nano-amorphous lenalidomide before stability testing (graph a) and after testing (graph b). For a sample of amorphous lenalidomide obtained in a known manner according to examples 3a, b (comparison examples), noticeable crystalline reflections were observed in the powder X-ray diffraction spectra against a broad halo after 1 month of storage under the above conditions.

Пример №7. Исследование гигроскопичности аморфного леналидомида по примерам la, 2а, b и 3а, b и кристаллической формы леналидомида.Example No. 7. The study of the hygroscopicity of amorphous lenalidomide according to examples la, 2a, b and 3a, b and the crystalline form of lenalidomide.

Оценка гигроскопичности образцов аморфного леналидомида, полученных по примерам 1a, 2a, b, 3а, b и кристаллической формы леналидомида производилась в соответствии с Европейской Фармакопеей [Characters section in monographs. European Pharmacopoeia 6, version 6.8, Section 5.11 ed.2010] в условиях относительной влажности 80±2% при 25°С в течение 24 ч.The hygroscopicity of the samples of amorphous lenalidomide obtained according to examples 1a, 2a, b, 3a, b and the crystalline form of lenalidomide was evaluated in accordance with the European Pharmacopoeia [Characters section in monographs. European Pharmacopoeia 6, version 6.8, Section 5.11 ed.2010] under conditions of relative humidity 80 ± 2% at 25 ° С for 24 hours

В соответствии с критериями Европейской Фармакопеи - прибавка в массе образца < 2% и > 0,2%, все исследованные образцы леналидомида следует классифицировать как слабо гигроскопичные.In accordance with the criteria of the European Pharmacopoeia - an increase in the sample mass of <2% and> 0.2%, all studied samples of lenalidomide should be classified as slightly hygroscopic.

Пример №8. Получение готового лекарственного средства в форме твердых желатиновых капсул, содержащих наноаморфный и аморфный леналидомид, 10 мг.Example No. 8. Obtaining the finished drug in the form of hard gelatin capsules containing nanoamorphic and amorphous lenalidomide, 10 mg.

Отвешивают на весах и просеивают в индивидуальные маркированные контейнеры следующие компоненты:The following components are weighed on a balance and sieved into individual labeled containers:

- Леналидомид наноаморфный, полученный по примерам №1, 2а, b или аморфный по примерам 3а, b - 1000,0±1,0 г;- Lenalidomide nanoamorphic obtained according to examples No. 1, 2a, b or amorphous according to examples 3a, b - 1000.0 ± 1.0 g;

- Лактоза микрокристаллическая (DFE pharma, Германия) - 29400±1,0 г;- Microcrystalline lactose (DFE pharma, Germany) - 29400 ± 1.0 g;

- Целлюлоза микрокристаллическая (VIVAPUR® 102, производства JRS PHARMA, Германия) - 8000±1,0 г;- Microcrystalline cellulose (VIVAPUR® 102, manufactured by JRS PHARMA, Germany) - 8000 ± 1.0 g;

- Кроскармеллоза натрия (Blanver, Бразилия) 1200±1,0 г;- Croscarmellose sodium (Blanver, Brazil) 1200 ± 1.0 g;

- Магния стеарат (NutriMag STv, Galmags GmbH, Германия) - 400±1,0 г Просев сырья осуществляется на автоматической просеивающей- Magnesium stearate (NutriMag STv, Galmags GmbH, Germany) - 400 ± 1.0 g. Sifting of raw materials is carried out on an automatic sieving

машине через сито с размером отверстий 0,200±0,0083 мм для стеарата магния, 0,400±0,015 мм для остальных компонентов.machine through a sieve with a hole size of 0.200 ± 0.0083 mm for magnesium stearate, 0.400 ± 0.015 mm for the remaining components.

В смеситель-гранулятор загружают аморфный леналидомид и кроскармеллозу натрия и перемешивают массу в течение 7-9 мин со скоростью 1000 об/мин. Затем добавляют целлюлозу микрокристаллическую и перемешивают массу в течение 10-12 мин со скоростью 20 об/мин. По прошествии указанного времени в смеситель загружают лактозы моногидрат и перемешивают еще 10-12 мин на скорости 20 об/мин. Далее загружают магния стеарат и перемешивают 2-5 мин на скорости 20 об/мин. Полученную капсульную смесь вручную выгружают из бункера смесителя в промаркированный тарированный контейнер. Капсульную массу фасуют в твердые желатиновые капсулы №0 производства Capsulgel на автоматической капсулонаполняющей машине. Содержимое капсул - порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета массой 400,0 мг ± 7,5% (от 370 мг до 430 мг).Amorphous lenalidomide and croscarmellose sodium are loaded into a granulator-mixer and the mass is mixed for 7-9 minutes at a speed of 1000 rpm. Microcrystalline cellulose is then added and the mass is mixed for 10-12 minutes at a speed of 20 rpm. After the specified time, lactose monohydrate is loaded into the mixer and mixed for another 10-12 minutes at a speed of 20 rpm. Next, magnesium stearate is charged and mixed for 2-5 minutes at a speed of 20 rpm. The resulting capsule mixture is manually unloaded from the mixer hopper into a labeled calibrated container. The capsule mass is packed in No. 0 hard gelatine capsules manufactured by Capsulgel on an automatic capsule filling machine. The contents of the capsules is a powder of white or white with a yellowish tinge of color weighing 400.0 mg ± 7.5% (from 370 mg to 430 mg).

Пример №9. Ускоренные испытания стабильности капсул, содержащих леналидомид, 10 мг.Example No. 9. Accelerated stability tests of capsules containing lenalidomide, 10 mg.

Ускоренные испытания стабильности препарата проводились в течение 12 месяцев при температуре 40±2°С и относительной влажности 75±5%. На основании результатов изучения стабильности подтвержден срок годности лекарственного препарата в течение 24 месяцев.Accelerated tests of drug stability were carried out for 12 months at a temperature of 40 ± 2 ° C and a relative humidity of 75 ± 5%. Based on the results of the stability study, the shelf life of the drug is confirmed for 24 months.

Данные по стабильности препарата на основе наноаморфного леналидомида по примеру 1.Data on the stability of the drug based on nanoamorphic lenalidomide according to example 1.

Данные по стабильности препарата на основе наноаморфного леналидомида по примеру 2а.Data on the stability of the drug based on nanoamorphic lenalidomide according to example 2a.

Данные по стабильности препарата на основе аморфного леналидомида по примеру 3а.Data on the stability of the drug based on amorphous lenalidomide according to example 3A.

Данные по стабильности препарата на основе аморфного леналидомида по примеру 3b.Data on the stability of the drug based on amorphous lenalidomide in example 3b.

Количественное определение проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе, снабженном ультрафиолетовым детектором, системой построения градиента и системой обработки данных.Quantitative determination was carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) on a liquid chromatograph equipped with an ultraviolet detector, a gradient construction system and a data processing system.

В мерную колбу вместимостью 20 мл помещали 1,0 мл стандартного раствора леналидомида с концентрацией 1 мг/мл, доводили объем раствора до метки 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты и перемешивали. Отбирали 1 мл полученного раствора и переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл. Затем доводили объем раствора до метки 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты и перемешивали. Конечная концентрация в растворе леналидомида составила 0,005 мг/мл.In a 20 ml volumetric flask, 1.0 ml of a standard solution of lenalidomide with a concentration of 1 mg / ml was placed, the volume of the solution was adjusted to the mark with a 0.1 M hydrochloric acid solution and stirred. 1 ml of the resulting solution was taken and transferred to a 10 ml volumetric flask. Then, the volume of the solution was adjusted to the mark with a 0.1 M hydrochloric acid solution and stirred. The final concentration in the solution of lenalidomide was 0.005 mg / ml.

Приготовление испытуемого раствора.Preparation of test solution.

10 капсул с дозировкой 10 мг помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 100 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин. После интенсивно перемешивали на вихревой лабораторной мешалке в течение 1-2 мин, добавляли 50 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин до полного разрушения оболочки капсул. Охлаждали полученный раствор до комнатной температуры, доводили объем раствора до метки растворителем и перемешивали. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (типа Millex HN «Merck Millipore» или аналогичный), отбрасывая первые порции фильтрата. 1 мл полученного раствора (фильтрата) переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки растворителем и перемешивали (раствор леналидомида с концентрацией 0,005 мг/мл).10 capsules with a dosage of 10 mg were placed in a volumetric flask with a capacity of 200 ml, 100 ml of a 0.1 M hydrochloric acid solution was added, then they were sonicated for 20 minutes. After it was intensively mixed on a vortex laboratory mixer for 1-2 minutes, 50 ml of 0.1 M hydrochloric acid solution was added and sonicated for 20 minutes until the capsule shell was completely destroyed. The resulting solution was cooled to room temperature, the volume of the solution was adjusted to the mark with a solvent, and stirred. The resulting solution was filtered through a 0.45 μm membrane filter (Millex HN type Merck Millipore or the like), discarding the first portions of the filtrate. 1 ml of the resulting solution (filtrate) was transferred into a 100 ml volumetric flask, the volume of the solution was adjusted to the mark with a solvent and stirred (lenalidomide solution with a concentration of 0.005 mg / ml).

Хроматографические условия:Chromatographic conditions:

- колонка из нержавеющей стали размером 250×4,6 мм, заполненная сорбентом CN с размером частиц 5 мкм (типа Zorbax SB-CN кат. №880975905 Agilent, США или аналогичная);- a stainless steel column with a size of 250 × 4.6 mm filled with a CN sorbent with a particle size of 5 μm (Zorbax SB-CN type cat. No. 880975905 Agilent, USA or similar);

- подвижная фаза состоит из раствора Э1 и метанола в соотношении 3:1 соответственно;- the mobile phase consists of a solution of E1 and methanol in a ratio of 3: 1, respectively;

- элюирование осуществляли в изократическом режиме;- elution was carried out in isocratic mode;

- скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин;- flow rate of the mobile phase is 1.0 ml / min;

- объем инжекции - 10 мкл;- injection volume - 10 μl;

- промывка внешней стороны иглы растворителем перед каждой инжекцией;- flushing the outside of the needle with a solvent before each injection;

- температура термостата автосемплера - 5°С;- temperature of the autosampler thermostat - 5 ° С;

- температура термостата колонки - 30°С;- column thermostat temperature - 30 ° С;

- детектирование (УФ) - 210 нм ± 4 нм;- detection (UV) - 210 nm ± 4 nm;

- длина волны сравнения - 360 нм ± 100 нм;- comparison wavelength - 360 nm ± 100 nm;

- время хроматографирования - 12 мин.- chromatographic time - 12 minutes

В указанных условиях ожидаемое время удерживания пика леналидомида составляло около 6-7 мин.Under these conditions, the expected retention time of the lenalidomide peak was about 6-7 minutes.

Количество леналидомида, в миллиграммах на капсулу (X), рассчитывали по формуле:The amount of lenalidomide, in milligrams per capsule (X), was calculated by the formula:

где: S₁ - площадь пика леналидомида на хроматограмме испытуемого раствора;where: S ₁ is the peak area of lenalidomide in the chromatogram of the test solution;

S₀ - площадь пика леналидомида на хроматограмме стандартного раствора;S ₀ is the peak area of lenalidomide in the chromatogram of a standard solution;

а₀ - навеска вторичного стандартного образца наноаморфного леналидомида, в миллиграммах;and ₀ is a sample of a secondary standard sample of nanoamorphic lenalidomide, in milligrams;

al_i - аликвота, используемая для приготовления испытуемого раствора, мл (al_i для дозировки 10 мг = 1,0);al _i - aliquot used to prepare the test solution, ml (al _i for a dosage of 10 mg = 1.0);

Р - содержание леналидомида в вторичном стандартном образце, в процентах;P is the content of lenalidomide in the secondary standard sample, in percent;

V_i1 - объем мерной колбы, используемой для приготовления испытуемого раствора, мл (V_i1 для дозировки 10 мг = 200);V _i1 is the volume of the volumetric flask used to prepare the test solution, ml (V _i1 for a dosage of 10 mg = 200);

V_i2 - объем мерной колбы, используемой для приготовления испытуемого раствора, мл (V_i2 для дозировки 10 мг = 100).V _i2 is the volume of the volumetric flask used to prepare the test solution, ml (V _i2 for a dosage of 10 mg = 100).

Пример №10. Исследование фармако кинетики аморфного леналидомида.Example No. 10. Pharmaco kinetics of amorphous lenalidomide.

Крысы - самцы Спрег-Доули (n=4) весом 180-200 г содержались в стандартных лабораторных условиях при температуре 22±2°С и относительной влажности 40±5%. Вода и пища находились в свободном доступе. Животных не кормили накануне приема препарата и 3 часа после полученной дозы. Забор крови проводился через катетер, установленный в яремной вене.Rats - Sprague-Dawley males (n = 4) weighing 180-200 g were kept in standard laboratory conditions at a temperature of 22 ± 2 ° C and a relative humidity of 40 ± 5%. Water and food were freely available. Animals were not fed on the eve of taking the drug and 3 hours after the dose. Blood sampling was carried out through a catheter inserted in the jugular vein.

Субстанция на основе аморфного леналидомида в дозировке 10 мг/кг вводилась через желудочный зонд в виде водной суспензии, содержащей 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 0,25%) Tween®80. Объем вводимой дозы 5 мл/кг. Препарат на основе кристаллического леналидомида в дозировке 10 мг/кг вводился внутривенно через хвостовую вену. Образцы крови (0,2 мл) отбирались через 0,5; 1; 2; 5; 10 и 24 ч и помещались в капилляры с гепарином. Плазма центрифугировалась при комнатной температуре в течение 1,5 мин при 4200 об/мин и хранилась при температуре -80°С.A substance based on amorphous lenalidomide at a dosage of 10 mg / kg was administered through a gastric tube in the form of an aqueous suspension containing 0.5% carboxymethyl cellulose and 0.25%) Tween®80. The volume of the administered dose is 5 ml / kg. A preparation based on crystalline lenalidomide at a dosage of 10 mg / kg was administered intravenously through the tail vein. Blood samples (0.2 ml) were taken after 0.5; 1; 2; five; 10 and 24 hours and were placed in capillaries with heparin. The plasma was centrifuged at room temperature for 1.5 min at 4200 rpm and stored at a temperature of -80 ° C.

При внутривенном введении были получены следующие фармакокинетические данные: AUC_в/в=226 мин×нг/мл, C_max=17,8 нг/мл, T_1/2=0,03 ч.When administered intravenously, the following pharmacokinetic results were obtained: AUC _{in /} min = 226 × ng / ml, C _max = 17,8 ng / mL, T _1/2 = 0,03 h.

Фармакокинетические параметры наноаморфных и аморфных форм леналидомида и кристаллической после перорального и внутривенного введения крысам.Pharmacokinetic parameters of nano-amorphous and amorphous forms of lenalidomide and crystalline after oral and intravenous administration to rats.

Биодоступность рассчитывали по следующей формуле:Bioavailability was calculated by the following formula:

*Различия можно считать статистически достоверными (p≤0.05).* Differences can be considered statistically significant (p≤0.05).

Пример №11. Сравнительная оценка терапевтической эффективности аморфного леналидомида.Example No. 11. Comparative evaluation of the therapeutic efficacy of amorphous lenalidomide.

Для эксперимента использовались мыши-самки в возрасте 8 недель. Животные содержались в стандартных лабораторных условиях при температуре 22±2°С и относительной влажности 40±5%. Вода и пища находились в свободном доступе.For the experiment, female mice were used at the age of 8 weeks. Animals were kept in standard laboratory conditions at a temperature of 22 ± 2 ° C and a relative humidity of 40 ± 5%. Water and food were freely available.

Субстанция на основе леналидомида в дозировке 50 мг/кг вводилась через желудочный зонд в виде водной суспензии, содержащей 0,5% карбоксиметилцеллюлозы. Объем вводимой дозы 0,1 мл ежедневно 1 раз в день. Контрольная группа получала 0,1 мл раствора 0,5% карбоксиметилцеллюлозы.A substance based on lenalidomide in a dosage of 50 mg / kg was administered through a gastric tube in the form of an aqueous suspension containing 0.5% carboxymethyl cellulose. The volume of the administered dose of 0.1 ml daily 1 time per day. The control group received 0.1 ml of a solution of 0.5% carboxymethyl cellulose.

Для определения противоопухолевой активности препаратов на основе леналидомида мышам прививались 3×10⁷ клеток HS Sultan Burkitt в 100 мкл RPMI-1640 среды совместно с 100 мкл Матригель. В первом эксперименте лечение начиналось на следующий день после прививки опухолевых клеток, во втором эксперименте медикаментозная терапия начиналась на следующий день после развития видимой опухоли. Препарат вводился перорально ежедневно. Для определения объема опухоли использовалась следующая формула (D_к)²×(D_д)×0,5, где D_к - наименьший диаметр, D_д - наибольший диаметр опухоли. Измерения диаметров проводились штангенциркулем.To determine the antitumor activity of lenalidomide-based preparations, 3 × 10 ⁷ HS Sultan Burkitt HS cells were inoculated into mice in 100 μl of RPMI-1640 medium together with 100 μl of Matrigel. In the first experiment, treatment began on the day after the inoculation of tumor cells, in the second experiment, drug therapy began on the day after the development of the visible tumor. The drug was administered orally daily. To determine the tumor volume, the following formula was used: (D _k ) ² × (D _d ) × 0.5, where D _k is the smallest diameter, D _d is the largest diameter of the tumor. Diameters were measured with a caliper.

Мыши были разделены на 4 группы по 6 особей в каждой. Первая группа (контрольная) получала только раствор карбоксиметилцеллюлозы, вторая группа получала лечение препаратом на основе кристаллического леналидомида формы А, третья группа получала лечение препаратом на основе аморфного леналидомида по примеру 3а, четвертая группа получала лечение препаратом на основе наноаморфного леналидомида по примеру 1.The mice were divided into 4 groups of 6 animals each. The first group (control) received only a carboxymethyl cellulose solution, the second group received treatment with a preparation based on crystalline lenalidomide Form A, the third group received treatment with a drug based on amorphous lenalidomide in Example 3a, the fourth group received treatment with a drug based on nanoamorphic lenalidomide in Example 1.

В эксперименте начиналось медикаментозное лечение на следующий день после прививания опухолевых клеток. У животных в контрольной группе разрастание опухоли происходило в среднем на 15 день (диапазон 7-18). Животных умерщвляли в среднем на 26 день (диапазон 21-32) из-за большого объема опухоли (более 2000 мм³). После 18 дня лечения в третьей и в четвертой группе наблюдалось значительное подавление опухолевого роста, по сравнению со второй группой, получавшей лечение препаратом на основе кристаллического леналидомида (см. Фиг. 9).In the experiment, drug treatment began the day after the inoculation of tumor cells. In animals in the control group, tumor growth occurred on average on day 15 (range 7-18). Animals were euthanized on average on day 26 (range 21-32) due to the large tumor volume (more than 2000 mm ³ ). After 18 days of treatment, a significant suppression of tumor growth was observed in the third and fourth groups, compared with the second group treated with the drug based on crystalline lenalidomide (see Fig. 9).

В другом эксперименте изучалось влияние леналидомида на уже имеющуюся опухоль. Медикаментозное лечение начиналось, когда опухоль определялась при пальпации (объем больше 177 мм³), в среднем на 6-ой день (диапазон 4-15) после прививки опухолевых клеток. Все животные, получавшие лечение, показывали увеличение выживаемости. Все животные из четвертой группы были живы на 45-й день эксперимента. Кроме того, рост опухоли замедлялся у всех животных, получавших лечение. Важно, что лечение препаратом на основе наноаморфного леналидомида по примеру 1 привело к полной регрессии опухоли у 4 мышей из 12. Эти 4 животных с полной ремиссией опухоли дополнительно получали ежедневные инъекции препарата в течение 10 дней: у двух из этих животных опухоль рецидивировала через 16 и 27 дней после прекращения лечения; у остальных мышей наблюдалась стойкая полная ремиссия опухоли до 102 дней (см. Фиг. 10).In another experiment, the effect of lenalidomide on an existing tumor was studied. Drug treatment began when the tumor was determined by palpation (volume greater than 177 mm ³ ), on average, on the 6th day (range 4-15) after inoculation of tumor cells. All treated animals showed an increase in survival. All animals from the fourth group were alive on the 45th day of the experiment. In addition, tumor growth was slowed in all animals treated. It is important that treatment with a nanoamorphic lenalidomide-based preparation of Example 1 led to complete tumor regression in 4 of 12 mice. These 4 animals with complete tumor remission received additional daily injections of the drug for 10 days: in two of these animals, the tumor recurred after 16 and 27 days after discontinuation of treatment; in the remaining mice, persistent complete remission of the tumor was observed up to 102 days (see Fig. 10).

Во всех экспериментах у животных не наблюдалось признаков токсичности или потери веса.In all experiments, no signs of toxicity or weight loss were observed in animals.

Claims (16)

1. Аморфная форма (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, отличающаяся тем, что она характеризуется средним размером частиц 63,85±10 нм, температурой стеклования 122,9°C ±7°C, кристаллизацией при температуре 172,6±5°C с удельным тепловым эффектом 85,77±9 Дж/г и плавлением при температуре 267,5±5°C с удельным тепловым эффектом 149,8±15 Дж/г в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°C/мин.1. The amorphous form of ( RS ) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2 H- isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione, characterized in that it is characterized by an average size particles 63.85 ± 10 nm, a glass transition temperature of 122.9 ° C ± 7 ° C, crystallization at a temperature of 172.6 ± 5 ° C with a specific thermal effect of 85.77 ± 9 J / g and melting at a temperature of 267.5 ± 5 ° C with a specific thermal effect of 149.8 ± 15 J / g under differential scanning calorimetry at a heating rate of 10 ° C / min. 2. Способ получения аморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона по п.1, отличающийся тем, что он включает следующие стадии:2. The method of obtaining the amorphous form of ( RS ) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2 H- isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione according to claim 1, characterized in that it includes the following stages: a. загрузка (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в расплав, состоящий из 40  или 20 г D-фруктозы, 15 или 7,5 глактозы моногидрата и 40 или 20 г мочевины при температуре 55°C;a. loading ( RS ) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2 H -isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione into a melt consisting of 40 or 20 g of D-fructose 15 or 7.5 glactose monohydrate and 40 or 20 g of urea at a temperature of 55 ° C; b. перемешивание при температуре 55°С;b. stirring at a temperature of 55 ° C; c. внесение полученного расплава в воду, охлажденную до +7°C;c. introducing the obtained melt into water cooled to + 7 ° C; d. перемешивание;d. mixing; e. фильтрование осадка;e. sediment filtration; f. приготовление суспензии осадка в воде;f. preparation of a suspension of sediment in water; g. перемешивание при температуре 20°С в течение около 1 часа;g. stirring at a temperature of 20 ° C for about 1 hour; h. фильтрование;h. filtration; i. промывание осадка водой на фильтре;i. washing the precipitate with water on the filter; j. высушивание до постоянной массы под вакуумом при температуре +40°C.j. drying to constant weight under vacuum at a temperature of + 40 ° C. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используемый на стадии а) (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион получают восстановлением 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона серым чугуном в виде колотой дроби в 50%-ном водном этаноле в присутствии соляной кислоты.3. The method according to claim 2, characterized in that used in stage a) ( RS ) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2 H- isoindol-2-yl) piperidin-2 , 6-dione is obtained by reduction of 3- (4-nitro-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione with gray cast iron in the form of a crushed fraction in 50% aqueous ethanol in the presence of hydrochloric acid. 4. Аморфная форма (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, отличающаяся тем, что она получена способом по любому из пп. 2, 3.4. Amorphous form of ( RS ) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2 H- isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione, characterized in that it is obtained by the method according to any of paragraphs. 2, 3. 5. Применение аморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона по п. 1 или 4 для приготовления фармацевтической композиции для лечения иммунологических или онкологических заболеваний.5. The use of the amorphous form of ( RS ) -3- (4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2 H- isoindol-2-yl) piperidin-2,6-dione according to claim 1 or 4 for the preparation pharmaceutical compositions for the treatment of immunological or oncological diseases. 6. Фармацевтическая композиция для лечения иммунологических или онкологических заболеваний, содержащая аморфную форму по п. 1 или аморфную форму, полученную способом по любому из пп. 2, 3, в сочетании с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.6. A pharmaceutical composition for the treatment of immunological or oncological diseases, containing an amorphous form according to claim 1 or an amorphous form obtained by the method according to any one of claims. 2, 3, in combination with pharmaceutically acceptable excipients.

Images