RU2722266C1 - Lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material and method for production thereof - Google Patents
Lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2722266C1 RU2722266C1 RU2019129034A RU2019129034A RU2722266C1 RU 2722266 C1 RU2722266 C1 RU 2722266C1 RU 2019129034 A RU2019129034 A RU 2019129034A RU 2019129034 A RU2019129034 A RU 2019129034A RU 2722266 C1 RU2722266 C1 RU 2722266C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone
- minutes
- mineralized
- solution
- cycle
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/28—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к биотехнологии, и может быть использовано для изготовления лиофилизированного биологического биодеградируемого минерализованного костнопластического материала на основе головок бедренной кости человека для применения в стоматологии, травматологии-ортопедии, онкологии, челюстно-лицевой хирургии для замещения дефектов костной ткани, в том числе в условиях инфекционного процесса, для пролонгированной локальной антибактериальной терапии, матрицы для импрегнации биологически активным веществом и/или заселения культурой клеток.The invention relates to medicine, namely to biotechnology, and can be used for the manufacture of a lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material based on human femoral heads for use in dentistry, traumatology, orthopedics, oncology, maxillofacial surgery to replace bone defects, including under the conditions of the infectious process, for prolonged local antibacterial therapy, a matrix for impregnation with a biologically active substance and / or populating a cell culture.
Постоянный рост количества высокотехнологичных травматолого-ортопедических операций ведет к увеличению количества больных с повторными операциями, что повышает потребность и создает острый дефицит в остеозамещающих материалах. Одним из наиболее широко применяемых для замещения костных дефектов является аллогенная кость, объемы которой весьма ограничены, и чаще всего для заготовки применяют трупную кость. При этом в ходе эндопротезирования тазобедренного сустава, одной из наиболее распространенных ортопедических операций во всем мире, выполняется удаление головки бедренной кости, как правило, с последующей ее утилизацией. Однако, головка бедренной кости представляет собой сферическое образование, состоящее из 25-50 см губчатой кости, что позволяет рассматривать ее для изготовления остеопластического биологического материала.A constant increase in the number of high-tech traumatologic and orthopedic surgeries leads to an increase in the number of patients with repeated surgeries, which increases the need and creates an acute shortage of osteo-substituting materials. One of the most widely used to replace bone defects is allogeneic bone, the volumes of which are very limited, and most often cadaveric bone is used for harvesting. At the same time, during hip replacement, one of the most common orthopedic surgeries in the world, the femoral head is removed, usually with its subsequent disposal. However, the femoral head is a spherical formation, consisting of 25-50 cm of trabecular bone, which allows it to be considered for the manufacture of osteoplastic biological material.
Процесс заготовки костного материала предполагает очистку нативной костной ткани до костного матрикса и последующую стерилизацию [Lomas R, Drummond О, Kearney JN. Processing of whole femoral head allografts: A method for improving clinical efficacy and safety. Cell Tissue Bank. 2000; 1 (3): 193-200. DOI: 10.1023/A:1026512312385. PMID: 15256945]. Известно, что на остеокондуктивные и остеокондуктивные свойства костного материала существенное влияние оказывают методики, применяемые для его очистки и стерилизации: химический состав растворов для экспозиции и промывания, характер физического воздействия, время и температура воздействия [Beebe KS, Benevenia J, Tuy BE, DePaula CA, Harten RD, Enneking WF. Effects of a new allograft processing procedure on graft healing in a canine model: a preliminary study. Clin Orthop Relat Res. 2009; 467 (1): 273-80. DOI: 10.1007/s 11999-008-0444-8. PMID: 18712453.]. Также показано, что наличие даже остаточных концентраций некоторых веществ, может приводить к воспалительным реакциям в окружающих тканях и инкапсуляции материала [Hernigou Р., Pariat J., Queinnec S., Homma Y., Flouzat Lachaniette C.H., Chevallier N., Rouard H. Supercharging irradiated allografts with mesenchymal stem cells improves acetabular bone grafting in revision arthroplasty. Int Orthop.2014 Sep; 38(9): 1913-21. DOI: 10.1007/s00264-014-2285-2. PMID: 24509980].The process of harvesting bone material involves cleaning the native bone tissue to the bone matrix and subsequent sterilization [Lomas R, Drummond O, Kearney JN. Processing of whole femoral head allografts: A method for improving clinical efficacy and safety. Cell Tissue Bank. 2000; 1 (3): 193-200. DOI: 10.1023 / A: 1026512312385. PMID: 15256945]. It is known that the osteoconductive and osteoconductive properties of bone material are significantly affected by the methods used to clean and sterilize it: the chemical composition of the solutions for exposure and washing, the nature of the physical effect, the time and temperature of exposure [Beebe KS, Benevenia J, Tuy BE, DePaula CA , Harten RD, Enneking WF. Effects of a new allograft processing procedure on graft healing in a canine model: a preliminary study. Clin Orthop Relat Res. 2009; 467 (1): 273-80. DOI: 10.1007 / s 11999-008-0444-8. PMID: 18712453.]. It is also shown that the presence of even residual concentrations of certain substances can lead to inflammatory reactions in surrounding tissues and encapsulation of the material [Hernigou P., Pariat J., Queinnec S., Homma Y., Flouzat Lachaniette CH, Chevallier N., Rouard H. Supercharging irradiated allografts with mesenchymal stem cells improves acetabular bone grafting in revision arthroplasty. Int Orthop. 2014 Sep; 38 (9): 1913-21. DOI: 10.1007 / s00264-014-2285-2. PMID: 24509980].
Различают минерализованные и деминерализованные костные трансплантаты, которые отличаются химическим составом отмытого костного матрикса, что определяет их жесткость и другие прочностные свойства, которые влияют на особенности применения этих материалов в клинической практике. Кроме того в последние годы все больше внимания уделяют приданию остеопластическим материалам дополнительных свойств, путем заселения костного матрикса культурой клеток, импрегнацией биологически-активными веществами [Yi Н., Rehman F., Zhao Ch., Liu В., He N. Recent advances in nano scaffolds for bone repair Bone Research 2016 (4), 16050; doi:10.1038/boneres.2016.50] или антибиотиками [Winkler H., Haiden P. Allograft Bone as Antibiotic Carrier. J. Bone Joint Infect. 2017; 2(1): 52-62. doi: 10.7150/jbji. 17466].There are mineralized and demineralized bone grafts, which differ in the chemical composition of the washed bone matrix, which determines their rigidity and other strength properties that affect the features of the use of these materials in clinical practice. In addition, in recent years, more and more attention has been paid to giving osteoplastic materials additional properties by populating the bone matrix with cell culture, impregnation with biologically active substances [Yi N., Rehman F., Zhao Ch., Liu B., He N. Recent advances in nano scaffolds for bone repair Bone Research 2016 (4), 16050; doi: 10.1038 / boneres.2016.50] or antibiotics [Winkler H., Haiden P. Allograft Bone as Antibiotic Carrier. J. Bone Joint Infect. 2017; 2 (1): 52-62. doi: 10.7150 / jbji. 17466].
Проведенный патентный поиск позволил выявить группу методов получения костнопластических костных материалов, в которых основой очистки являются длительные экспозиции костной ткани в растворах агрессивных химических веществ большой концентрации: 6% раствор перекиси водорода и смесь этанола с хлороформом (Способ изготовления имплантов из губчатой костной ткани, Патент РФ №2172104), 10% раствор перекиси водорода (Способ получения костного трансплантата, Патент РФ №2223104; Способ изготовления аллотрансплантата вертлужной впадины, Патент РФ №2377959). Недостатками данных методов является длительное воздействие концентрированного раствора перекиси водорода, что приводит к разрушению костного коллагена и снижению прочностных и остеоиндуктивных свойств аллокости [DePaula СА, Truncale KG, Gertzman АА, Sunwoo МН, Dunn MG. Effects of hydrogen peroxide cleaning procedures on bone graft osteoinductivity and mechanical properties. Cell Tissue Bank. 2005; 6 (4): 287-98. DOI: 10.1007/s10561-005-3148-2. PMID: 16308768]. Кроме того, длительная экспозиция костной ткани в этанол-содержащих растворах также снижает остеоиндуктивный потенциал, а хлороформ, как токсическое вещество, запрещен к применению при заготовке тканей с 2012 года [Dock NL, Osborne JC, Brubaker SA. Standards for Tissue Banking. 13th ed. American Association of Tissue Banks: March 1, 2012. 349]. способные оказывать негативное влияние на свойства конечного продукта, в ряде случаев требующие специализированного оборудования.A patent search revealed a group of methods for obtaining osteoplastic bone materials, in which the cleaning is based on long-term exposure of bone tissue in solutions of aggressive chemicals of high concentration: 6% hydrogen peroxide solution and a mixture of ethanol with chloroform (Method for manufacturing implants from spongy bone tissue, RF Patent No. 2172104), 10% hydrogen peroxide solution (Method for producing a bone graft, RF Patent No. 2223104; Method for the manufacture of an acetabulum allograft, RF Patent No. 2377959). The disadvantages of these methods is the prolonged exposure to a concentrated solution of hydrogen peroxide, which leads to the destruction of bone collagen and a decrease in the strength and osteoinductive properties of allosty [DePaula CA, Truncale KG, Gertzman AA, Sunwoo MN, Dunn MG. Effects of hydrogen peroxide cleaning procedures on bone graft osteoinductivity and mechanical properties. Cell Tissue Bank. 2005; 6 (4): 287-98. DOI: 10.1007 / s10561-005-3148-2. PMID: 16308768]. In addition, prolonged exposure of bone tissue in ethanol-containing solutions also reduces osteoinductive potential, and chloroform, as a toxic substance, has been banned for use in tissue harvesting since 2012 [Dock NL, Osborne JC, Brubaker SA. Standards for Tissue Banking. 13th ed. American Association of Tissue Banks: March 1, 2012.349]. able to adversely affect the properties of the final product, in some cases requiring specialized equipment.
К другой группе можно отнести методы, комбинирующие химическое и физическое воздействие для очистки и стерилизации остеопластических материалов.Another group includes methods that combine chemical and physical effects to clean and sterilize osteoplastic materials.
Из предшествующего уровня техники известен способ (Способ удаления костного мозга из губчатых костных трансплантатов, Патент РФ №2166252), где применяют комбинацию обработки химическими веществами, отмывки проточной водой и воздействие 1 минуту низкочастотными ультразвуковыми колебаниями с частотой 24,5-28,5 кГц для удаления костного мозга из губчатых костных трансплантатов. В процессе отмывки предлагается использовать липосистемы, перекись водорода и спиртоэфирный раствор. Недостатком данного способа является применение для обезжиривания спиртоэфирного раствора, что требует тщательной последующей отмывки спиртом и дистиллированной водой, поскольку остатки спиртоэфирной смеси обладают провоспалительным и цитотоксическим действием, что может привести к нарушению ремоделирования костной ткани в области замещенного дефекта. Кроме того, данный способ не предлагает возможного метода стерилизации полученных материалов.A method is known from the prior art (Method for removing bone marrow from cancellous bone grafts, RF Patent No. 2166252), where a combination of chemical treatment, washing with running water and exposure for 1 minute to low-frequency ultrasonic vibrations with a frequency of 24.5-28.5 kHz are used for removal of bone marrow from spongy bone grafts. In the process of washing, it is proposed to use liposystems, hydrogen peroxide and an alcohol-ether solution. The disadvantage of this method is the use of an alcohol-ether solution for degreasing, which requires careful subsequent washing with alcohol and distilled water, since the remains of the alcohol-ether mixture have a pro-inflammatory and cytotoxic effect, which can lead to a violation of bone remodeling in the area of the substituted defect. In addition, this method does not offer a possible method of sterilization of the obtained materials.
Известен способ (Fages J, et al. Viral inactivation of human bone tissue using supercritical fluid extraction. ASAIO J 1998,44:289-293) получения стерильного биологического костного матрикса, когда обезжиривание распиленных костей проводят методом сверхкритической флюидной экстракции при 50°С со скоростью потока СO2 - 2 кг/ч, давлением 250 бар в течение 10 минут на 1 г костной ткани. Для депротеинизации выполняют экспозицию костной ткани в 35% растворе перекиси водорода в течение 24 часов при 40°С; удаление остаточных липидов с замачиванием в течение 1 часа в 1 М растворе гидроксида натрия при 20°С, последующую нейтрализацию в водном растворе NaH2PO4 (12 г/л) в течение 30 минут. Далее авторы предлагают выполнить обработку костной ткани при 20°С в течение 3 часов 95% этанолом, затем в течение 2 часов - 100% этанолом, после чего полученный материал сушат на воздухе 12 часов при 40°С. Для стерилизации высушенные образцы упаковывают и обрабатывают гамма-облучением при 25 кГрей. Существенными недостатками данного способа являются использование высококонцентрированного раствора перикиси водорода и 100%) этанола, что вызывает денатурацию коллагена (Yang Н., Shu Z. The extraction of collagen protein from pigskin. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2014, 6(2):683-687). Кроме того, обычная сушка образцов костной ткани перед радиационной стерилизацией не позволяет уменьшить содержание воды в получаемых образцах. При этом известно [Nguyen Н, Morgan DA, Forwood MR. Sterilization of allograft bone: effects of gamma irradiation on allograft biology and biomechanics. Cell Tissue Bank. 2007; 8 (2): 93-105. DOI: 10.1007/s 10561-006-9020-1. PMID: 17063262.], что бактерицидное действие ионизирующего излучения обусловлено двумя основными механизмами - прямое разрушение ДНК клеток и опосредованное разрушение образующимися вследствие радиолиза молекул воды свободными радикалами, которые не только повреждают клетки бактерий и вирусов, но и матрикс костной ткани, что снижает механическую прочность и ухудшает последующий процесс ремоделирования костнопластического материала в организме реципиента.A known method (Fages J, et al. Viral inactivation of human bone tissue using supercritical fluid extraction. ASAIO J 1998,44: 289-293) to obtain a sterile biological bone matrix, when degreasing sawn bones is carried out by supercritical fluid extraction at 50 ° C with the flow rate of CO 2 - 2 kg / h, a pressure of 250 bar for 10 minutes per 1 g of bone tissue. For deproteinization, bone tissue is exposed in a 35% hydrogen peroxide solution for 24 hours at 40 ° C; removal of residual lipids with soaking for 1 hour in a 1 M solution of sodium hydroxide at 20 ° C, subsequent neutralization in an aqueous solution of NaH 2 PO 4 (12 g / l) for 30 minutes. Further, the authors propose to perform the processing of bone tissue at 20 ° C for 3 hours with 95% ethanol, then for 2 hours - 100% ethanol, after which the resulting material is dried in air for 12 hours at 40 ° C. For sterilization, the dried samples are packaged and treated with gamma radiation at 25 kGy. Significant disadvantages of this method are the use of a highly concentrated solution of hydrogen peroxide and 100%) ethanol, which causes denaturation of collagen (Yang N., Shu Z. The extraction of collagen protein from pigskin. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2014, 6 (2): 683-687). In addition, the conventional drying of bone tissue samples before radiation sterilization does not reduce the water content in the resulting samples. It is known [Nguyen H, Morgan DA, Forwood MR. Sterilization of allograft bone: effects of gamma irradiation on allograft biology and biomechanics. Cell Tissue Bank. 2007; 8 (2): 93-105. DOI: 10.1007 / s 10561-006-9020-1. PMID: 17063262.] that the bactericidal effect of ionizing radiation is due to two main mechanisms - direct destruction of cell DNA and indirect destruction of free radicals formed as a result of radiolysis of water molecules, which not only damage bacteria and virus cells, but also bone matrix, which reduces mechanical strength and worsens the subsequent process of remodeling of osteoplastic material in the recipient's body.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения биорезорбируемого биологического матрикса для замещения дефектов костной ткани (Биорезорбируемый биологический матрикс для замещения дефектов костной ткани и способ его плучения, Патент RU 2665962), который позволяет получить материал, обладающий повышенной остео- и биоинтеграцией, высокой биосовместимостью и отсутствием иммунореактивности со стороны реципиента. Однако наличие этапа деминерализации изменяет состав костного матрикса, делает его мягким, что ограничивает его использование, к примеру, при реконструктивных операциях, требующих замещения костей запястья, предплюсны, когда имплантируемый материал должен выдерживать определенную нагрузку. Кроме того, недостатками данного способа являются использование на стадии делипидирования токсических веществ - хлороформа и толуола.Closest to the claimed is a method of obtaining a bioresorbable biological matrix for the replacement of bone defects (Bioresorbable biological matrix for the replacement of bone defects and the method of its weaving, Patent RU 2665962), which allows to obtain material with increased osteo- and bio-integration, high biocompatibility and lack of biocompatibility immunoreactivity from the recipient. However, the presence of the demineralization stage changes the composition of the bone matrix, makes it soft, which limits its use, for example, during reconstructive operations requiring replacement of the wrist bones, tarsi, when the implanted material must withstand a certain load. In addition, the disadvantages of this method are the use at the stage of delipidation of toxic substances - chloroform and toluene.
Задачей настоящего изобретения является изготовление безопасного лиофилизированного биологического биодеградируемого минерализованного костнопластического материала на основе головок бедренной кости человека с отсутствием токсичности, хорошими показателями восстановления естественной структуры кости, биосовместимости с окружающими тканями и возможностью его использования в качестве матрицы для культуры ММСК.The objective of the present invention is the manufacture of a safe lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material based on the heads of the human femur with no toxicity, good restoration of the natural structure of the bone, biocompatibility with surrounding tissues and the possibility of its use as a matrix for MMSC culture.
Технический результат состоит в получении биологического биодеградируемого материала, обладающего хорошей механической прочностью за счет сохраненного минерализованного костного матрикса, высокой безопасностью в отношении угрозы заражения вирусными инфекциями, биосовместимостью с тканями человека и возможностями использования в качестве матрикса для импрегнации антимикробными и/или биологически активными веществами, обладающего хорошей способностью элюции импрегнированных растворов, а также в виде скаффолда для заселения культурами клеток человека с целью создания биоинженерных конструкций.The technical result consists in obtaining a biodegradable biological material with good mechanical strength due to the preserved mineralized bone matrix, high safety against the threat of viral infections, biocompatibility with human tissues and the possibility of using antimicrobial and / or biologically active substances as a matrix for impregnation, possessing good ability to elute impregnated solutions, as well as a scaffold for populating human cell cultures with the goal of creating bioengineered structures.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, а именно сбор и хранение головок бедренной кости от прижизненных доноров, прошедших контроль на инфицирование вирусными гепатитами В и С и ВИЧ, применение циклической очистки фрагментов кости от клеточных элементов, миелоидно-жирового костного мозга и растворимых белков до минерально-коллагенового матрикса основанной на комбинации физических факторов: покачивающих движений, ультразвуковой кавитации, орбитального вращения и центробежной силы без применения агрессивных химических веществ в условиях нагревания до температуры, не превышающей пороговую для деградации белков внеклеточного матрикса кости с возможной импрегнацией антибиотиком и/или биологически активным веществом, последующей лиофилизацией упаковкой, и стерилизацией.The invention consists in a combination of essential features, namely the collection and storage of femoral heads from intravital donors that have passed the control for infection with viral hepatitis B and C and HIV, the use of cyclic cleaning of bone fragments from cellular elements, myeloid-fat bone marrow and soluble proteins to mineral-collagen matrix based on a combination of physical factors: swaying movements, ultrasonic cavitation, orbital rotation and centrifugal force without the use of aggressive chemicals under conditions of heating to a temperature not exceeding the threshold for degradation of extracellular bone matrix proteins with possible impregnation with an antibiotic and / or biologically active substance, subsequent lyophilization packaging, and sterilization.
Предлагаемый способ изготовления биологического биодеградируемого минерализованного костнопластического материала на основе головок бедренной кости человека состоит из последовательных этапов: 1. Сбор и хранение головок бедренной кости от прижизненных доноров, 2. Механическая очистка с фракционированием и первичной экспозицией, 3. Циклическая физико-химическая очистка фрагментированного материала, с дополнительной импрегнацией антибиотиком и/или биологически активным веществом, 4. Лиофилизация и упаковка, 5. Стерилизация.The proposed method of manufacturing a biodegradable biodegradable mineralized osteoplastic material based on the human femur heads consists of the following steps: 1. Collection and storage of the femoral heads from intravital donors, 2. Mechanical cleaning with fractionation and primary exposure, 3. Cyclic physico-chemical cleaning of the fragmented material , with additional impregnation with an antibiotic and / or biologically active substance, 4. Lyophilization and packaging, 5. Sterilization.
1. Сбор и хранение головок бедренной кости от прижизненных доноров включает помещение в условиях операционной удаленной головки бедренной кости в трехслойную стерильную упаковку с обязательной маркировкой, позволяющей идентифицировать донора для последующего контроля результатов исследования его крови на вирусные гепатиты В, С и ВИЧ. При получении положительного результата любого исследования -головка бедренной кости подлежит утилизации. Промаркированная упаковка с донорской головкой бедренной кости помещается и хранится в условиях холодильной камеры при -80°С - -85°С с одним циклом замораживания.1. The collection and storage of femoral heads from intravital donors includes placement in an operating remote femoral head in a three-layer sterile package with mandatory marking, which allows the donor to be identified for subsequent monitoring of the results of his blood test for viral hepatitis B, C and HIV. Upon receipt of a positive result of any study, the femoral head must be disposed of. A labeled package with a donor head of the femur is placed and stored in a refrigerator at -80 ° C - -85 ° C with one freezing cycle.
2. Механическая очистка с макроскопической оценкой костной структуры и выбором фрагментов условно-здоровой губчатой кости, фракционированием и первичной экспозицией включает в себя разморозку нативных головок бедренной кости при комнатной температуре, механическую очистку кости от мягких тканей и хряща, визуальную оценку состояния головки и ее фракционирование.2. Mechanical cleaning with a macroscopic assessment of the bone structure and selection of fragments of a conditionally healthy cancellous bone, fractionation and primary exposure includes defrosting of the native femoral heads at room temperature, mechanical cleaning of the bone from soft tissues and cartilage, visual assessment of the condition of the head and its fractionation .
В одном из вариантов на крошку с фракцией 0,5-10 мм.In one of the options for crumbs with a fraction of 0.5-10 mm.
В одном из вариантов на пластины толщиной 3-5 мм.In one embodiment, the plates are 3-5 mm thick.
В одном из вариантов на блоки с длиной одной из сторон 5-20 мм.In one of the options for blocks with a length of one of the sides of 5-20 mm.
В одном из вариантов головку распиливают на 2 половины.In one embodiment, the head is cut into 2 halves.
Далее проводят экспозицию полученных фрагментов в 3% растворе перекиси водорода в течение 24-48 часов при комнатной температуре (соотношение ткани к раствору не менее 1:4) со сменой раствора через 24 часа.Next, the resulting fragments are exposed in a 3% hydrogen peroxide solution for 24-48 hours at room temperature (tissue to solution ratio of at least 1: 4) with a change of solution after 24 hours.
3. Циклическая физико-химическая очистка фрагментированного материала от клеточных элементов, миелоидно-жирового костного мозга и растворимых белков до минерально-коллагенового матрикса заключается в отмывании полученных фрагментов в водяной шейкерной бане в течение 1 часа в дистиллированной воде, предварительно разогретой до 40-57°С, с последующим промыванием в течение 15 минут проточной водой под давлением и дальнейшим отмыванием, включающим комбинацию физических методов очистки в шейкерной бане, ультразвуковом кавитаторе, орбитальном шейкере при экспозиции в растворе гидрокарбоната натрия (цикл А), дистиллированной воде (цикл Б), 3% растворе перекиси водорода (цикл В), 70% этаноле (цикл Г):3. The cyclic physico-chemical purification of the fragmented material from cellular elements, myeloid-fat bone marrow and soluble proteins to the mineral-collagen matrix consists in washing the obtained fragments in a water shaker bath for 1 hour in distilled water, previously heated to 40-57 ° C, followed by washing for 15 minutes with running water under pressure and further washing, including a combination of physical cleaning methods in a shaker bath, ultrasonic cavitator, orbital shaker when exposed to sodium hydrogen carbonate solution (cycle A), distilled water (cycle B), 3 % hydrogen peroxide solution (cycle B), 70% ethanol (cycle D):
- цикл А - промывание фрагментов материала водным 10% раствором гидрокарбоната натрия (соотношение материал:раствор не менее 1:2) для эмульгации жиров с параллельным воздействием различных физических факторов а) в водяной шейкерной бане 20 минут при температуре 40-57°С, с последующим промыванием проточной водой под давлением в течение 10-15 минут, далее б) экспозиция фрагментов в 10%) водном растворе гидрокарбоната натрия в ультразвуковом кавитаторе 10-20 минут при температуре 40-57°С с последующей промывкой проточной водой под давлением в течение 10-15 минут, далее в) экспозиция фрагментов в 10% водном растворе гидрокарбоната натрия в орбитальном шейкере 220 об/минуту в течение 10-20 минут с последующей промывкой проточной водой под давлением в течение 10-15 минут.- cycle A - washing fragments of the material with an aqueous 10% solution of sodium bicarbonate (ratio of material: solution of at least 1: 2) for emulsification of fats with parallel exposure to various physical factors a) in a water shaker bath for 20 minutes at a temperature of 40-57 ° C, s subsequent washing with running water under pressure for 10-15 minutes, then b) exposure of the fragments in 10%) an aqueous solution of sodium bicarbonate in an ultrasonic cavitator for 10-20 minutes at a temperature of 40-57 ° C, followed by washing with running water under pressure for 10 -15 minutes, then c) the exposure of the fragments in a 10% aqueous solution of sodium bicarbonate in an orbital shaker 220 rpm for 10-20 minutes, followed by washing with running water under pressure for 10-15 minutes.
- цикл Б - промывание фрагментов материала дистиллированной водой (соотношение материал/раствор не менее 1/2) с параллельным воздействием различных физических факторов при условиях описанных выше в цикле А а), б), в), далее г) центрифугирование при 1850g 15 минут. Цикл Б повторяют до отсутствия видимого осадка после центрифугирования, но не менее 3-х раз. В среднем требуется 3-5 циклов, а зависимости от размера фрагментов материала.- cycle B - washing fragments of the material with distilled water (material / solution ratio of at least 1/2) with parallel exposure to various physical factors under the conditions described above in cycle A a), b), c), then d) centrifugation at 1850g for 15 minutes . Cycle B is repeated until there is no visible precipitate after centrifugation, but at least 3 times. On average, 3-5 cycles are required, and depending on the size of the fragments of the material.
- цикл В - промывание фрагментов материала 3% раствором перекиси водорода, предварительно разогретой до 40-57°С с параллельным воздействием различных физических факторов при условиях описанных выше в цикле А а), б), в) и однократной отмывкой дистиллированной водой при температуре 40-57°С в орбитальном шейкере 15 минут (соотношение материал: раствор не менее 1:2).- cycle B - washing fragments of the material with a 3% solution of hydrogen peroxide preheated to 40-57 ° C with parallel exposure to various physical factors under the conditions described above in cycle A a), b), c) and a single washing with distilled water at a temperature of 40 -57 ° C in an orbital shaker for 15 minutes (material: solution ratio of at least 1: 2).
- цикл Г блоки промывают раствором этанола 70% при температуре 40-57°С с параллельным воздействием различных физических факторов при условиях описанных выше в цикле А а), б), в).- cycle G blocks are washed with a solution of ethanol 70% at a temperature of 40-57 ° C with parallel exposure to various physical factors under the conditions described above in cycle A a), b), c).
В заключение этапа материал 3-х кратно промывают дистиллированной водой при температуре 40-57°С в орбитальном шейкере по 15 минут (соотношение материал:раствор не менее 1:2). Блоки высушивают в течение 4-24 часов в термостате при температуре 45°С, после чего выполняют заморозку при температуре -80°С.At the end of the stage, the material is washed 3 times with distilled water at a temperature of 40-57 ° C in an orbital shaker for 15 minutes (material: solution ratio of at least 1: 2). The blocks are dried for 4-24 hours in a thermostat at a temperature of 45 ° C, after which they are frozen at a temperature of -80 ° C.
В одном из вариантов осуществления способа полученный на предыдущем этапе материал до лиофилизации может быть импрегнирован любым водорастворимым антибиотиком и/или биологически активным веществом, включая морфогенетические белки и другие факторы роста и дифференцировки клеток, причем раствор антибиотика и/или биологически активного вещества может быть приготовлен на основе дистиллированной воды, физиологического раствора, с добавлением природного полимера, в том числе коллагена или его производных, или желатина, или целлюлозы, или поливинилпирролидона, в одном из способов с добавлением раствора диметилсульфоксида. Раствор должен полностью покрывать импрегнируемый костный материал.In one embodiment of the method, the material obtained in the previous step prior to lyophilization can be impregnated with any water-soluble antibiotic and / or biologically active substance, including morphogenetic proteins and other cell growth and differentiation factors, and a solution of the antibiotic and / or biologically active substance can be prepared on based on distilled water, physiological saline, with the addition of a natural polymer, including collagen or its derivatives, or gelatin, or cellulose, or polyvinylpyrrolidone, in one of the methods with the addition of a solution of dimethyl sulfoxide. The solution should completely cover the impregnated bone material.
В одном из вариантов осуществления способа проводят экспозицию заготовленного материала в приготовленном растворе антибиотика и/или биологически активного вещества в орбитальном шейкере 160 об/минуту при температуре 20-37°С в течение 3-24 часов.In one embodiment of the method, the prepared material is exposed in a prepared solution of an antibiotic and / or biologically active substance in an orbital shaker of 160 rpm at a temperature of 20-37 ° C for 3-24 hours.
В одном из вариантов осуществления способа проводят экспозицию заготовленного материала в приготовленном растворе антибиотика и/или биологически активного вещества в ультразвуковом кавитаторе при температуре 20-37°С в течение 10-20 мин.In one embodiment of the method, the prepared material is exposed in a prepared solution of an antibiotic and / or biologically active substance in an ultrasonic cavitator at a temperature of 20-37 ° C for 10-20 minutes.
Далее материал извлекают из раствора, охлаждают в течение 1 часа до 4-6°С с последующей заморозкой 1 час в морозильной камере -18-25°С, затем при температуре -80°С не менее 1 часа.Next, the material is removed from the solution, cooled for 1 hour to 4-6 ° C, followed by freezing for 1 hour in the freezer -18-25 ° C, then at a temperature of -80 ° C for at least 1 hour.
4. Лиофилизация и упаковка проводится следующим образом: замороженный фрагментированный материал лиофилизируют 40 часов в сублимационной установке при отрицательном давлении с постепенным нагревом от -40°С до +40°С, нагреванием на +20°С каждые 8 часов, с достижением остаточной влажности 3-5%. Далее материал пакуют в двойную полиэтиленовую упаковку.4. Lyophilization and packaging are carried out as follows: frozen fragmented material is lyophilized for 40 hours in a sublimation apparatus at negative pressure with gradual heating from -40 ° С to + 40 ° С, heating by + 20 ° С every 8 hours, with achievement of residual moisture 3 -5%. Further, the material is packaged in a double plastic bag.
5. Конечную стерилизацию выполняют ионизирующим излучением - потоком быстрых электронов на радиационно-технологической установке с линейным ускорителем электронов УЭЛР-10-10-С2 дозой излучения 20±5 кГр.5. The final sterilization is performed by ionizing radiation — a stream of fast electrons in a radiation-technological installation with a linear electron accelerator UELR-10-10-C2 with a radiation dose of 20 ± 5 kGy.
Применение разных физических методов в совокупности обеспечивает разнонаправленное действие при отмывке минерально-коллагенового матрикса. Ультразвуковые колебания низкой частоты, воздействуя через жидкую среду на биосистемы, вызывают возникновение переменного звукового давления, акустических течений, микротоков, капиллярных волн, что ведет к разрыву к разрыву клеточных мембран, разрушению коллоидов, белковых комплексов и макромолекул. За счет того, что ультразвуковая волна способна распространятся на весь фрагмент ткани, разрушение происходит и в труднодоступных местах. Центрифугирование позволяет использовать эффект центробежной силу, что способствует отторжению органических компонентов минерально-коллагенового матрикса губчатого вещества кости и осаждению их на дне сосуда.The use of different physical methods in combination provides a multidirectional effect when washing the mineral-collagen matrix. Low frequency ultrasonic vibrations, acting through a liquid medium on biosystems, cause the appearance of alternating sound pressure, acoustic currents, microcurrents, capillary waves, which leads to rupture to rupture of cell membranes, destruction of colloids, protein complexes and macromolecules. Due to the fact that the ultrasonic wave is able to spread to the entire tissue fragment, destruction also occurs in hard-to-reach places. Centrifugation allows using the centrifugal effect, which contributes to the rejection of the organic components of the mineral-collagen matrix of the spongy bone and their deposition on the bottom of the vessel.
Водяная шейкерная баня за счет орбитального движения позволяет выполнять механическую очистку -вымывание фрагментов костно-жирового комплекса, частиц клеток, продуктов деградации белков, жиров в жидкую среду при нагревании 40-57°С при сохранении волокон костного коллагена, а продольные колебания шейкера с частотой 220 об/мин обеспечивают достаточное вымывание разрушенных органических компонентов клеток и содержимого костного мозга из межтрабекулярных пространств костного матрикса.Due to the orbital movement, a water shaker bath allows mechanical cleaning - washing out fragments of the bone-fat complex, cell particles, protein degradation products, fats into a liquid medium when heated at 40-57 ° C while maintaining bone collagen fibers, and longitudinal shaker vibrations with a frequency of 220 rpm provide sufficient leaching of the destroyed organic components of the cells and the contents of the bone marrow from the intertrabular spaces of the bone matrix.
Для эмульгации жиров и деградации клеточных белков в технологическом процессе применяют 10% раствор гидрокарбоната натрия, 3% раствор перекиси водорода и 70% этиловый спирт, эффект которых усиливается за счет нагревания раствора до 40-57°С.For emulsification of fats and degradation of cellular proteins in the technological process, a 10% sodium hydrogen carbonate solution, 3% hydrogen peroxide solution and 70% ethyl alcohol are used, the effect of which is enhanced by heating the solution to 40-57 ° C.
Импрегнация антибиотиком и/или биологически активным веществом позволяет придать материалу антимикробные свойства для применения его в условиях инфицированных дефектов костей и суставов в составе комплексной терапии и/или повысить его регенеративные свойства, за счет импрегнацией костного материала факторами роста и дифференцировки клеток. Для импрегнации полученного биологического биодеградируемого минерализованного костнопластического материала могут быть импользованы, к примеру, ванкомицин, гентамицин, тобрамицин, фосфомицин и любые другие водорастворимые антибиотики, устойчивые к ионизирующему излучению 20±5 кГр. Аналогичные характеристики требуются для биологически активных веществ.Impregnation with an antibiotic and / or biologically active substance makes it possible to impart antimicrobial properties to the material for use in conditions of infected bone and joint defects as part of complex therapy and / or to increase its regenerative properties due to the impregnation of bone material with cell growth and differentiation factors. For impregnation of the obtained biodegradable biodegradable mineralized osteoplastic material, for example, vancomycin, gentamicin, tobramycin, phosphomycin and any other water-soluble antibiotics resistant to ionizing radiation of 20 ± 5 kGy can be used. Similar characteristics are required for biologically active substances.
Изготовленный данным способом аллогенный биологический биодеградируемый минерализованный материал может быть представлен в различных формах. Изготовление материала в виде крошки фракцией 0,5-10 мм позволяет применять его для импакционной пластики малых костных дефектов в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, онкологии, в виде пластин толщиной 3-5 мм - для импакционной пластики дефектов трубчатых костей в травматологии-ортопедии, онкологии, в виде блоков с одной из сторон 2-30 мм - для замещения дефектов при ортопедических операциях на кисти, стопе, в виде полусферы - для реконструктивных операциях на позвоночнике и голеностопном суставе. Помимо восстановления дефектов костной ткани материал также можно применять в качестве матрицы для импрегнации антибиотиком и/или биологически активным веществом или заселения культурой клеток. Длительная элюция антибиотика позволяет использовать материал для локальной антибактериальной терапии при замещении костных дефектов в условиях инфекции.The allogeneic biodegradable biodegradable mineralized material made by this method can be presented in various forms. The production of material in the form of crumbs with a fraction of 0.5-10 mm allows it to be used for impact plastics of small bone defects in dentistry, maxillofacial surgery, oncology, in the form of plates 3-5 mm thick - for impact plastics of defects of tubular bones in traumatology orthopedics , oncology, in the form of blocks on one of the sides 2-30 mm - for the replacement of defects during orthopedic operations on the hand, foot, in the form of a hemisphere - for reconstructive operations on the spine and ankle joint. In addition to repairing bone defects, the material can also be used as a matrix for impregnation with an antibiotic and / or biologically active substance or for populating a cell culture. Long-term elution of the antibiotic allows the use of the material for local antibiotic therapy in the replacement of bone defects in conditions of infection.
Изобретение позволяет получить биологический биодеградируемый минерализованный костнопластический материал на основе головок бедренной кости человека, который характеризуется высокой безопасностью, так как для его получения используют нативные головки бедренных костей от прижизненных доноров с отрицательными результатами исследования на вирусные гепатиты В и С, ВИЧ, неповрежденной минерализованной трехмерной структурой, очищенной от костно-жирового компонента кости, липидов, белков клеток, клеточного дебриса, хорошими показателями восстановления естественной структуры кости, биосовместимости с окружающими тканями, отсутствием цитотоксичности и возможностью его использования в качестве матрицы для импрегнации антибиотиком и/или биологически активным веществом или заселения культурой клеток.EFFECT: invention makes it possible to obtain biological biodegradable mineralized osteoplastic material based on human femoral heads, which is characterized by high safety, since native femoral heads from intravital donors with negative test results for viral hepatitis B and C, HIV, intact mineralized three-dimensional structure are used to obtain it. purified from the bone-fat component of bone, lipids, cell proteins, cell debris, good indicators of the restoration of the natural structure of the bone, biocompatibility with surrounding tissues, lack of cytotoxicity and the possibility of its use as a matrix for impregnation with an antibiotic and / or biologically active substance or populating the culture cells.
На фигурах изображены:The figures depict:
Фигура 1. Микрофотографии лиофилизированного биологического биодеградируемого минерализованного костнопластического материала, изготовленного заявляемым способом. СЭМ. Напыление золото-палладий. Контрольный штрих указан на рисунке. (А - общий вид блока с сохранением архитектоники губчатой кости и отсутствием инородных включений и клеточных элементов в межтрабекулярном пространстве, Б -визуализируется четкая направленность и плотность коллагеновых волокон костно-минерального матрикса).Figure 1. Microphotographs of a lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material made by the claimed method. SAM. Gold palladium sputtering. The control stroke is shown in the figure. (A - a general view of the block with preservation of the architectonics of the cancellous bone and the absence of foreign inclusions and cellular elements in the intertrabular space, B - a clear directivity and density of collagen fibers of the bone-mineral matrix are visualized).
Фигура 2. Результаты МСКТ проксимального отдела большеберцовой кости в области дефекта на 90-е сутки после замещения дефекта (А, Б, В - экспериментальная группа с замещением дефекта лиофилизированным биологическим биодеградируемым минерализованным костнопластическим материалом, изготовленным заявляемым способом; Г, Д, Е - контрольная группа с замещением дефекта остеопластическим материалом, заготовленным методом термической стерилизации).Figure 2. The results of MSCT of the proximal tibia in the area of the defect on the 90th day after the defect is replaced (A, B, C - experimental group with defect replacement by lyophilized biological biodegradable mineralized bone-plastic material made by the claimed method; G, D, E - control group with defect replacement by osteoplastic material prepared by thermal sterilization).
Результаты оценки свойств полученного материала приведены для раскрытия характеристик настоящего изобретения, в связи с чем, их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.The results of evaluating the properties of the obtained material are given to disclose the characteristics of the present invention, and therefore, they should not be construed as limiting the scope of the invention.
Из головок бедренной кости был получен вышеуказанным способом материал в виде кубиков с размером стороны 5 мм.From the femoral heads, a material in the form of cubes with a side size of 5 mm was obtained by the above method.
Для определения влияния остаточных биологических компонентов костных трансплантатов на рост ММСК использовали модифицированную среду, которую получали путем инкубации костных кубов в стандартной культуральной среде DMEM без бычьей сыворотки. Определение жизнеспособности ММСК через 72 часа роста в модифицированной среде DMEM проводили методом МТТ. Обнаружили, что при культивировании ММСК в среде, модифицированной костными кубами после обработки гамма-излучением, степень снижения жизнеспособности клеток по сравнению с контролем была значимо ниже, чем после термической стерилизации в приборе Lobator-SD2 (Telos GmbH, Германия) и химической стерилизации (Патент РФ №2235462 Савельев ВИ, Губин АВ. Жидкая среда для низкотемпературной консервации биологических трансплантатов. Патент РФ №2235462. 2004): 1,02±0,02 (Р<0,1), 1,07±0,02 (Р<0,02) и 0,12±0,02(Р<0,0001), соответственно.To determine the effect of the residual biological components of bone grafts on the growth of MMSCs, a modified medium was used, which was obtained by incubating bone cubes in standard DMEM culture medium without bovine serum. Determination of the viability of MMSCs after 72 hours of growth in a modified DMEM medium was carried out by MTT. It was found that when MMSCs were cultured in a medium modified with bone cubes after treatment with gamma radiation, the degree of reduction in cell viability was significantly lower compared to the control than after thermal sterilization in a Lobator-SD2 device (Telos GmbH, Germany) and chemical sterilization (Patent RF No 2235462 Saveliev VI, Gubin AB Liquid medium for low-temperature preservation of biological transplants. RF patent No 2235462. 2004): 1.02 ± 0.02 (P <0.1), 1.07 ± 0.02 (P < 0.02) and 0.12 ± 0.02 (P <0.0001), respectively.
Для определения стерильности изготавливаемого материала после конечной стерилизации выполняли бактериологическое исследование полученных образцов с инкубацией в жидких питательных средах. Не менее 3 образцов из 5 партий. Роста микроорганизмов ни в одном из образцов получено не было.To determine the sterility of the manufactured material after the final sterilization, a bacteriological study of the obtained samples was performed with incubation in liquid nutrient media. At least 3 samples from 5 batches. No microorganism growth was obtained in any of the samples.
Далее проводили оценку жизнеспособности ММСК (цитотоксичность), после их заселения в костные блоки. В каждый блок засевали 250000 клеток в стандартной культуральной среде DMEM с 15% бычьей сыворотки и инкубировали в течение 3 и 7 дней. Результаты теста МТТ показали сравнимый уровень жизнеспособности клеток в исследуемых блоках после термической стерилизации в приборе Lobator-SD2 (Telos GmbH, Германия) и при изготовлении образцов заявляемым способом: 0,352±0,022 и 0,363±0,116 через 3 дня, 0,601±0,116 и 0,497±0,207 через 7 дней, соответственно.Next, an assessment was made of the viability of MMSCs (cytotoxicity), after their colonization in bone blocks. Each block was seeded with 250,000 cells in standard DMEM culture medium with 15% bovine serum and incubated for 3 and 7 days. The results of the MTT test showed a comparable level of cell viability in the test blocks after thermal sterilization in a Lobator-SD2 device (Telos GmbH, Germany) and in the manufacture of samples by the claimed method: 0.352 ± 0.022 and 0.363 ± 0.116 after 3 days, 0.601 ± 0.116 and 0.497 ± 0.207 after 7 days, respectively.
Кроме этого, качество очистки определяли визуально при оценке фотоизображений минерально-коллагенового матрикса губчатого вещества полученных образцов материалов, выполненных с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на разных увеличениях кратности 14 до 650 (Фигура 1). Данные фотоизображений СЭМ, подтверждают отсутствие инородных включений в межтрабекулярном пространстве, соответствие трехмерной микроархитектуры нормальному строению губчатого вещества костной ткани, сохранение плотного расположения пучков коллагена.In addition, the quality of cleaning was determined visually when evaluating photo images of the mineral-collagen matrix of the spongy substance of the samples of materials obtained using scanning electron microscopy (SEM) at different magnifications of 14 to 650 (Figure 1). The data of SEM images confirm the absence of foreign inclusions in the intertrabular space, the correspondence of the three-dimensional microarchitecture to the normal structure of the spongy substance of bone tissue, and the preservation of the dense arrangement of collagen bundles.
Для исследования длительности антимикробной активности при импрегнации изготовленного предлагаемым способом материала ванкомицином, готовили чипсы минерально-коллагенового костного матрикса из пластин губчатого вещества головок бедренных костей толщиной 3 мм. После выполнения циклической физико-химической очистки фрагментированного материала от клеточных элементов, миелоидно-жирового костного мозга и растворимых белков до минерально-коллагенового матрикса, полученные пластины помещали в контейнеры и заливали приготовленным раствором ванкомицина в 0,9% растворе NaCl в концентрации 100 мг/мл до полного покрытия материала. Выполняли экспозицию материала в орбитальном шейкере 24 часа при частоте колебаний 160 в мин и температуре 37.0°С. Далее материал извлекали из раствора, охлаждали 1 час до 4-6°С с последующей заморозкой 1 час в морозильной камере -18 - -25°С, затем при температуре -80°С не менее 1 часа, с последующей лиофилизацией и стерилизацией в условиях описанных выше. Из готового импрегнированного ванкомицином костнопластического материала готовили 3 насвески 1,32±0,18 г, которые помещали в бакпечатки, заливали 15 мл 0,9% раствора NaCl, инкубировали в орбитальном шейкере, 24 часа с частотой колебаний 120/мин при температуре 37,0 С.Через сутки инкубационный раствор удаляли и заливали свежий раствор, а в инкубационном определяли концентрацию ванкомицина методом ВЭЖХ. Процедуру повторяли ежедневно до определения концентрации ванкомицина менее 4 мкг/мл (минимальная подавляющая концентрация ванкомицина для большинства штаммов стафилококков). Эксперимент продемонстрировал, что 1,32±0,18 грамм костнопластического материала, полученный предлагаемым способом, поддерживал при ежедневном 15-кратном разведении эффективную концентрацию ванкомицина до 10 суток, включительно, при этом в 1-е сутки концентрация ванкомицина в инкубационном растворе составила 23 353,6±168,3 мкг/мл, на 10-е сутки 5,76±1,12 мкг/млTo study the duration of antimicrobial activity during the impregnation of the material prepared by the proposed method with vancomycin, chips of mineral-collagen bone matrix were prepared from spongy plates of femoral heads with a thickness of 3 mm. After performing cyclic physico-chemical purification of the fragmented material from cellular elements, myeloid-fat bone marrow and soluble proteins to the mineral-collagen matrix, the resulting plates were placed in containers and poured with a prepared solution of vancomycin in 0.9% NaCl solution at a concentration of 100 mg / ml until the material is fully covered. The material was exposed in the orbital shaker for 24 hours at an oscillation frequency of 160 min and a temperature of 37.0 ° С. Then the material was removed from the solution, cooled 1 hour to 4-6 ° C, followed by freezing for 1 hour in the freezer -18 - -25 ° C, then at a temperature of -80 ° C for at least 1 hour, followed by lyophilization and sterilization under conditions described above. From the finished osteoplastic material impregnated with vancomycin, 3 weigheds 1.32 ± 0.18 g were prepared, which were placed in backpacks, filled with 15 ml of a 0.9% NaCl solution, incubated in an orbital shaker, 24 hours with an oscillation frequency of 120 / min at a temperature of 37, 0 C. A day later, the incubation solution was removed and fresh solution was poured, and the concentration of vancomycin was determined in the incubation by HPLC. The procedure was repeated daily until a vancomycin concentration of less than 4 μg / ml was determined (the minimum inhibitory concentration of vancomycin for most staphylococcus strains). The experiment showed that 1.32 ± 0.18 grams of osteoplastic material obtained by the proposed method, with a daily 15-fold dilution, maintained an effective concentration of vancomycin up to 10 days, inclusive, while on the 1st day the concentration of vancomycin in the incubation solution was 23 353 6 ± 168.3 μg / ml, on the 10th day 5.76 ± 1.12 μg / ml
Исследование био совместимости с окружающими тканями, возможности резорбции, остеоинтеграции и ремоделирования образцов материала, полученных предлагаемым способом, было выполнено в эксперименте in vivo. Содержание и использование лабораторных животных выполняли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (counici of European communities derective 86/609/ESS, Страсбург 1986) и требованиями «ИСО 10993-2».The study of bio compatibility with surrounding tissues, the possibility of resorption, osseointegration and remodeling of samples of the material obtained by the proposed method was carried out in an in vivo experiment. The maintenance and use of laboratory animals was carried out in accordance with the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Purposes (counici of European communities derective 86/609 / ESS, Strasbourg 1986) and the requirements of ISO 10993-2.
Эксперимент in vivo выполнен на 24 кроликах породы Шиншилла с формированием стандартизированного полостного дефекта в зоне проксимального метаэпифиза большеберцовой кости и последующим замещением дефекта. В условиях стерильной операционной под внутривенным наркозом животному после обработки операционного поля раствором йода и кожного разреза производили доступ к большеберцовой кости. При помощи стоматологического бора выполняли трепанацию большеберцовой кости с отверстием округлой формы диаметром 6-8 мм. Далее формировали полостной дефект костным булавовидным бором диаметром 8 мм глубиной до эндоста противоположной стороны кортикальной стенки (до 10-12 мм) Животным экспериментальной группа (n=12) дефект заполняли костной крошкой из материала, полученного предлагаемым способом, животным контрольной группы (n=12) остеопластическим материалом из головки бедренной кости, заготовленным без применения каких-либо химических веществ методом термической стерилизации в приборе Lobator-SD2 (Telos GmbH, Германия). Всем животным выполняли мультисканирующую компьютерную томографию на 7, 21, 45 и 90 сутки после оперативного вмешательства. Гистоморфологические исследования выполняли в обеих группах на 7, 21, 45 и 90 сутки наблюдения, окраску препаратов проводили гематоксилином и эозином, и методом Маллори.The in vivo experiment was performed on 24 Chinchilla rabbits with the formation of a standardized cavity defect in the area of the proximal tibia metaepiphysis and subsequent defect replacement. In a sterile operating room under intravenous anesthesia, the animal after treatment of the surgical field with iodine solution and skin incision made access to the tibia. With the help of a dental bur, tibia trepanation was performed with a round hole with a diameter of 6-8 mm. Next, a cavity defect was formed with a bone club-shaped boron with a diameter of 8 mm deep to the endoste of the opposite side of the cortical wall (up to 10-12 mm). The animals of the experimental group (n = 12) were filled with bone crumbs from the material obtained by the proposed method, animals of the control group (n = 12 ) osteoplastic material from the femoral head, prepared without using any chemicals by thermal sterilization in a Lobator-SD2 device (Telos GmbH, Germany). All animals underwent multiscanning computed tomography on days 7, 21, 45 and 90 after surgery. Histomorphological studies were performed in both groups on the 7th, 21st, 45th, and 90th days of observation; the preparations were stained with hematoxylin and eosin, and the Mallory method.
У животных контрольной группы гистологически установлены признаки воспалительной реакции в области замещенного дефекта, вплоть до инкапсуляции, которая сопровождала весь процесс костного ремоделирования и протекала до 90 суток эксперимента, что не было отмечено в экспериментальной группе. Формирование зрелой костной ткани отмечено на 21 сутки в контрольной и на 45-е сутки в экспериментальной группах. Явления эндостального и десмального остеогенеза в экспериментальной группе животных, свидетельствуют о наличии остеоиндуктивного потенциала у материала, полученного заявляемым способом. В контрольной группе формирование регенерата происходило преимущественно за счет эндостального костеобразования. Резорбция экспериментального материала зафиксирована на 21 сутки, резорбции материала второй группы - к 45 суткам. На 90-е сутки наблюдения в обеих группах отмечалось восстановление кости как органа с наличием костного мозга в костно-мозговом канале. По данным МСКТ, участки просветления в зоне дефекта были отмечены в экспериментальной группе на 21-е сутки, в группе контроля - на 45-е, при этом на снимках контрольной группы участки просветления были расположены неравномерно, формировалась зона отграничения материала по периметру. К 90 суткам в экспериментальной группе наступало ремоделирование имплантированного материала, в контрольной - определялась неполная резорбция материала (фигура 2).In the animals of the control group, signs of an inflammatory reaction in the area of the substituted defect were histologically established, up to encapsulation, which accompanied the entire process of bone remodeling and lasted up to 90 days of the experiment, which was not observed in the experimental group. The formation of mature bone tissue was observed on day 21 in the control and on day 45 in the experimental group. The phenomena of endostal and desmal osteogenesis in the experimental group of animals indicate the presence of osteoinductive potential in the material obtained by the claimed method. In the control group, regenerate formation occurred mainly due to endosteal bone formation. The resorption of the experimental material was recorded on day 21, and the resorption of the material of the second group by 45 days. On the 90th day of observation in both groups, restoration of bone as an organ with the presence of bone marrow in the marrow canal was noted. According to MSCT, the bleaching areas in the defect zone were observed in the experimental group on the 21st day, in the control group on the 45th day, while in the images of the control group the bleaching areas were uneven, a perimeter material delineation zone was formed. By 90 days in the experimental group remodeling of the implanted material began; in the control group, incomplete resorption of the material was determined (figure 2).
Выполненный заявителями поиск существующих способов, включал анализ патентов, источников научной литературы, содержащих информацию о существующих способах, аналогичных заявленному. Способы, описанные выше в качестве примеров патентов других авторов, содержат отдельные технические решения, наиболее близкий «аналог- прототип» предполагает деминерализацию получаемого материала, кроме того в этап отмывки костной ткани основан на химической обработке с применением токсических веществ - хлороформа и толуола. Заявляемый способ позволяет изготовить безопасный биологический биодеградируемый минерализованный костнопластический материал на основе головок бедренной кости человека, полученных от прижизненных доноров, прошедших контроль на инфицирование вирусными гепатитами В и С и ВИЧ, путем применения циклической очистки фрагментов кости от клеточных элементов, миелоидно-жирового костного мозга и растворимых белков до минерально-коллагенового матрикса, основанной на комбинации физических факторов: ультразвуковой кавитации, орбитального вращения, покачивающих движений и центробежной силы без применения агрессивных химических веществ в условиях нагревания до температуры, не превышающей пороговую для деградации белков внеклеточного матрикса кости, с возможностью импрегнации антибиотиком и/или биологически активным последующей лиофилизацией, упаковкой, и стерилизацией потоком быстрых электронов. Следовательно, заявляемый способ соответствует критерию «новизна».A search by the applicants for existing methods included an analysis of patents and sources of scientific literature containing information on existing methods similar to the claimed one. The methods described above as examples of patents of other authors contain individual technical solutions, the closest “prototype analogue” assumes demineralization of the material obtained, in addition to the bone washing stage, it is based on chemical treatment using toxic substances - chloroform and toluene. The inventive method makes it possible to produce a safe biodegradable mineralized bone-plastic material based on human femoral heads obtained from intravital donors that have passed the control for infection with viral hepatitis B and C and HIV by applying cyclic cleaning of bone fragments from cellular elements, myeloid-fat bone marrow and soluble proteins to a mineral-collagen matrix based on a combination of physical factors: ultrasonic cavitation, orbital rotation, swaying movements and centrifugal force without the use of aggressive chemicals under conditions of heating to a temperature not exceeding the threshold for degradation of extracellular matrix bone proteins, with the possibility of antibiotic impregnation and / or biologically active subsequent lyophilization, packaging, and sterilization by a stream of fast electrons. Therefore, the claimed method meets the criterion of "novelty."
Таким образом, как видно из приведенных выше результатов исследований, биологический биодеградируемый минерализованный костнопластический материал на основе головок бедренной кости человека, изготовленный заявляемым способом подтвердил свою стерильность, безопасность, отсутствием токсичности, хорошие показатели восстановления естественной структуры кости, биосовместимости с окружающими тканями и возможностью его использования в качестве матрицы для культуры ММСК в серии экспериментов in vivo и in vitro, а также длительной, не менее 10 суток, элюцией импрегнированного вещества. Эти достоинства позволяют использовать данный способ для изготовления нового безопасного биологического биодеградируемого минерализованного костнопластического материала.Thus, as can be seen from the above research results, biological biodegradable mineralized osteoplastic material based on the heads of the human femur, made by the claimed method confirmed its sterility, safety, lack of toxicity, good indicators of the restoration of the natural structure of the bone, biocompatibility with surrounding tissues and the possibility of its use as a matrix for MMSC culture in a series of in vivo and in vitro experiments, as well as long-term, at least 10 days, elution of the impregnated substance. These advantages make it possible to use this method for the manufacture of a new safe biological biodegradable mineralized osteoplastic material.
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129034A RU2722266C1 (en) | 2019-09-13 | 2019-09-13 | Lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019129034A RU2722266C1 (en) | 2019-09-13 | 2019-09-13 | Lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material and method for production thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2722266C1 true RU2722266C1 (en) | 2020-05-28 |
Family
ID=71067399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019129034A RU2722266C1 (en) | 2019-09-13 | 2019-09-13 | Lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material and method for production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2722266C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2746532C1 (en) * | 2020-07-27 | 2021-04-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method of surgical treatment of the pubic symphysis of the pelvic ring using osteoplastic biological material based on bone tissue impregnated with gentamicin and tobramycin |
| RU2771963C1 (en) * | 2018-05-17 | 2022-05-16 | Тубулл Медитерапи П.С. | Diagnostic blood test |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5167961A (en) * | 1988-06-02 | 1992-12-01 | Ed. Geistlich Sohne Ag Fur Chemische Industrie | Process for preparing high purity bone mineral |
| RU2223104C2 (en) * | 2001-09-28 | 2004-02-10 | Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии | Method for obtaining osseous transplant |
| RU2665962C1 (en) * | 2017-03-17 | 2018-09-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Матрифлекс" | Bioresorable biological matrix for substitution of bone tissue defects and method of its obtaining |
-
2019
- 2019-09-13 RU RU2019129034A patent/RU2722266C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5167961A (en) * | 1988-06-02 | 1992-12-01 | Ed. Geistlich Sohne Ag Fur Chemische Industrie | Process for preparing high purity bone mineral |
| RU2223104C2 (en) * | 2001-09-28 | 2004-02-10 | Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии | Method for obtaining osseous transplant |
| RU2665962C1 (en) * | 2017-03-17 | 2018-09-05 | Общество с ограниченной ответственностью "Матрифлекс" | Bioresorable biological matrix for substitution of bone tissue defects and method of its obtaining |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| BEEBE K.S. et.al. Effects of a new allograft processing procedure on graft healing in a canine model: a preliminary study. Clin Orthop Relat Res. 2009. 467 (1): 273-80. * |
| BOYCE, T.E. et.al. Allograft bone. Orthopedic Clinics of North America, 1999. 30(4), 571-581. * |
| BOYCE, T.E. et.al. Allograft bone. Orthopedic Clinics of North America, 1999. 30(4), 571-581. BEEBE K.S. et.al. Effects of a new allograft processing procedure on graft healing in a canine model: a preliminary study. Clin Orthop Relat Res. 2009. 467 (1): 273-80. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2771963C1 (en) * | 2018-05-17 | 2022-05-16 | Тубулл Медитерапи П.С. | Diagnostic blood test |
| RU2746532C1 (en) * | 2020-07-27 | 2021-04-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени Н.Н. Приорова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова" Минздрава России) | Method of surgical treatment of the pubic symphysis of the pelvic ring using osteoplastic biological material based on bone tissue impregnated with gentamicin and tobramycin |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9114191B2 (en) | Process for demineralization of bone matrix with preservation of natural growth factors | |
| CA2880157C (en) | Reinforced placental tissue grafts and methods of making and using the same | |
| RU2665962C1 (en) | Bioresorable biological matrix for substitution of bone tissue defects and method of its obtaining | |
| JP6621539B2 (en) | Composite material for bone repair based on decellularized biological tissue matrix material and method for preparing it | |
| JP2009261955A (en) | Graft prosthesis, materials and methods | |
| Cho et al. | Natural sources and applications of demineralized bone matrix in the field of bone and cartilage tissue engineering | |
| Zhou et al. | Repair of segmental defects with nano-hydroxyapatite/collagen/PLA composite combined with mesenchymal stem cells | |
| WO2011064724A1 (en) | Biomimetic composite materials, preparation process thereof and use thereof to produce mono-, bi- or multi -layer structures for the regeneration of bone, cartilaginous and osteocartilaginous tissue | |
| Zhao et al. | The study of the feasibility of segmental bone defect repair with tissue-engineered bone membrane: a qualitative observation | |
| JP2004506660A (en) | A method for reducing dimensional changes associated with freeze-drying and removing water bound to bone | |
| KR20180100069A (en) | Electron beam irradiated osseous bone implants | |
| Qiao et al. | 3D-printed composite scaffold with anti-infection and osteogenesis potential against infected bone defects | |
| RU2722266C1 (en) | Lyophilized biological biodegradable mineralized osteoplastic material and method for production thereof | |
| Karalashvili et al. | Decellularized bovine bone graft for zygomatic bone reconstruction | |
| Mansouri et al. | The role of cuttlebone and cuttlebone derived hydroxyapatite with platelet rich plasma on tibial bone defect healing in rabbit: an experimental study. | |
| JP5763790B2 (en) | Biological transplant material derived from mammalian cartilage tissue | |
| RU2147800C1 (en) | Method for producing bone allotransplant | |
| FI108403B (en) | Material suitable for tissue reconstruction in an individual | |
| RU2715238C1 (en) | Method of producing allogenic bone-replacement material | |
| WO2019168428A1 (en) | Method for cleaning a bone matrix and a skin matrix using supercritical fluid | |
| RU86455U1 (en) | BIO ENGINEERING DESIGN | |
| Giardino et al. | A resorbable biomaterial shaped as a tubular chamber and containing stem cells: a pilot study on artificial bone regeneration | |
| RU2746529C1 (en) | Method for producing osteoplastic material | |
| RU2440730C1 (en) | Method of manufacturing spongy bone transplants | |
| Miron et al. | Novel Natural Bovine Bone Graft with Integrated Atelo-Collagen Type I: Atelo-collagen Bovine Bone Mineral (ABBM) Characterization in-vivo |