RU2706356C1

RU2706356C1 - Method of treating oncological diseases by drug injections

Info

Publication number: RU2706356C1
Application number: RU2018146823A
Authority: RU
Inventors: Александр Георгиевич Мажуга; Степан Сергеевич Водопьянов; Ксения Юрьевна Власова; Максим Артемович Абакумов; Виктор Алексеевич Науменко
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-11-18

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and can be used for treating oncological diseases. That is ensured by introducing an aqueous suspension of liposomes of the same diameter with an encapsulated anti-tumor drug preparation. Before suspension of liposomes of equal diameter with encapsulated anti-tumor drug, three suspensions of liposomes of various diameters with iodine-containing radiopaque agent are introduced. First suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with pore diameter of 200 nm. Second suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with pore diameter of 100 nm. Third suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with pore diameter of 50 nm. After each suspension of liposomes is introduced by computed tomography, degree of accumulation of liposomes in tumor tissue is determined depending on diameter of liposomes. Then diameter of liposomes with the greatest degree of accumulation in tumor tissue is chosen. Medicinal preparation is introduced intravenously encapsulated in liposomes with the same diameter, which provides their greatest degree of tumor accumulation.

EFFECT: invention provides higher clinical effectiveness in oncological diseases.

1 cl, 3 ex

Description

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, и может быть использовано при лечении онкологических заболеваний у человека и животных с помощью инъекций противоопухолевого лекарственного препарата, предварительно инкапсулированного в липосомы.The invention relates to the field of medicine and veterinary medicine, and can be used in the treatment of cancer in humans and animals by injection of an antitumor drug previously encapsulated in liposomes.

Известен способ лечения онкологических заболеваний с помощью внутривенных инъекций раствора лекарственного противоопухолевого препарата - Доксорубицина пациенту с онкологическим заболеванием [Doxorubicin hydrochloride // European Pharmacopoeia. Sixth Edition: монография. 2005. С. 1389-1390.].A known method of treating cancer using intravenous injection of a solution of an anticancer drug - Doxorubicin to a patient with an oncological disease [Doxorubicin hydrochloride // European Pharmacopoeia. Sixth Edition: Monograph. 2005. S. 1389-1390.].

Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие, как использование внутривенных инъекций раствора лекарственного препарата для лечения онкологических заболеваний.This method contains signs that match the essential features of the proposed technical solution, such as the use of intravenous injection of a solution of a drug for the treatment of cancer.

Известен способ лечения онкологических заболеваний людей с помощью внутривенных инъекций суспензии липосом с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом (Цисплатином) [Boulikas Т., Clinical overview on Lipoplatin™: a successful liposomal formulation of cisplatin // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2009. V. 18(8). P. 1197-1218. doi: l0.1517/13543780903114168].There is a method of treating human cancers by intravenous injection of a suspension of liposomes with an encapsulated antitumor drug (Cisplatin) [Boulikas T., Clinical overview on Lipoplatin ™: a successful liposomal formulation of cisplatin // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2009.V. 18 (8). P. 1197-1218. doi: l0.1517 / 13543780903114168].

Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие, как лечение онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата путем внутривенного введения суспензии липосом с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом.This method contains signs that match the essential features of the proposed technical solution, such as the treatment of cancer by injection of a drug by intravenous administration of a suspension of liposomes with an encapsulated antitumor drug.

Наиболее близким к заявляемому является известный способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата путем введения водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом [Mikhaylov G., Mikac U., Magaeva A.A., Itin V.I., Naiden E.P., Psakhye I., Babes L., Reinheckel Т., Peters C, Zeiser R., Bogyo M, Turk V., Psakhye S.G., Turk В., Vasiljeva O.. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug delivery system for targeting tumours and their microenviroment // Nat. Nanotechnol. 2011. V. 6(9). P. 594-602. см. стр. 600, Фиг. 4 (С)] - прототип.Closest to the claimed is a known method of treating cancer by injection of a drug by introducing an aqueous suspension of liposomes of the same diameter with an encapsulated antitumor drug [Mikhaylov G., Mikac U., Magaeva AA, Itin VI, Naiden EP, Psakhye I., Babes L., Reinheckel T., Peters C, Zeiser R., Bogyo M, Turk V., Psakhye SG, Turk B., Vasiljeva O .. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug delivery system for targeting tumours and their microenviroment / / Nat. Nanotechnol. 2011.V. 6 (9). P. 594-602. see page 600, FIG. 4 (C)] is a prototype.

В данном способе осуществляют лечение онкологического заболевания рака молочной железы in vivo на ортотопически трансплантированной мышиной модели вышеуказанной опухоли (опухолевые клетки линии MMTV-PyMT, полученные из трансгенных мышей) с помощью инъекций противоопухолевого лекарственного препарата JPM 565, являющегося ингибитором цистеиновой протеазы катепсина и замедляющего скорость роста опухоли, предварительно инкапсулированного в липосомы со средним диаметром 92,3 нанометров (нм), имеющие липидный состав, при котором содержание яичного фосфатидилхолина составляет 95% и содержание 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] равно 5%. В данном способе лечение проводят в течение 20 дней путем внутрибрюшинного введения лекарственного препарата в количестве 100 мг/кг тела животного каждые два дня при содержании препарата JPM 565 в водосодержащей суспензии липосом 12,5 мг/мл. При этом используют липосомы, которые кроме лекарственного препарата дополнительно содержат магнитные наночастицы магнетита, имеющие средний диаметр 5-7 нм, используемые для визуализации опухоли и фокусировки (концентрирования) препарата в опухоли с помощью наложения (воздействия) внешнего постоянного магнитного поля. В данном способе об эффективности лечения судят по замедлению скорости роста опухоли. Так, для опухоли, имеющей объем 125 мм³ на момент начала лечения, спустя 18 дней после начала лечения объем опухоли составил 400 мм³, в то время, как без использования противоопухолевого препарата (контрольная группа мышей) объем опухоли возрастал до 950 мм³. Таким образом, известный способ лечения за 18 дней замедлял скорость роста опухоли в 2,4 раза.In this method, an in vivo treatment of an oncological breast cancer cancer is performed on an orthotopically transplanted mouse model of the above tumor (MMTV-PyMT tumor cells obtained from transgenic mice) by injection of the antitumor drug JPM 565, which inhibits the cathepsin cysteine protease and slows the growth rate tumors previously encapsulated in liposomes with an average diameter of 92.3 nanometers (nm) having a lipid composition in which the egg content phosphatidylcholine is 95% and the content of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy- (polyethylene glycol) -2000] is 5%. In this method, treatment is carried out for 20 days by intraperitoneal administration of a drug in an amount of 100 mg / kg of the animal’s body every two days with a JPM 565 drug in an aqueous liposome suspension of 12.5 mg / ml. In this case, liposomes are used, which, in addition to the drug, additionally contain magnetic magnetite nanoparticles having an average diameter of 5-7 nm, which are used to visualize the tumor and focus (concentrate) the drug in the tumor by applying (applying) an external constant magnetic field. In this method, the effectiveness of treatment is judged by slowing down the growth rate of the tumor. So, for a tumor with a volume of 125 mm ³ at the start of treatment, 18 days after the start of treatment, the volume of the tumor was 400 mm ³ , while without the use of an antitumor drug (control group of mice), the volume of the tumor increased to 950 mm ³ . Thus, the known method of treatment for 18 days slowed down the tumor growth rate by 2.4 times.

Недостатком известного способа является то, что он не позволяет обеспечить достаточно высокую эффективность лечения онкологического заболевания. Кроме того, данный способ неизбежно приводит к появлению побочного эффекта, обусловленного комбинацией относительной длительности противоопухолевого лечения и присутствием во всех липосомах кроме лекарственного препарата также наночастиц магнетита, медленно выводящихся из организма, накапливающихся в печени и требующих для их выведения из организма использования дополнительных препаратов.The disadvantage of this method is that it does not allow for a sufficiently high efficiency of the treatment of cancer. In addition, this method inevitably leads to a side effect due to a combination of the relative duration of the anticancer treatment and the presence in all liposomes of the drug also of magnetite nanoparticles that are slowly excreted from the body, accumulate in the liver and require the use of additional drugs for their elimination from the body.

Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, лишенного вышеуказанного недостатка.The technical problem of the invention lies in the development of a method for the treatment of cancer using injections of a drug devoid of the above drawback.

Технический результат изобретения состоит в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний.The technical result of the invention is to increase the effectiveness of the treatment of cancer.

Предварительно были проведены эксперименты с различными способами лечения онкологических заболеваний, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, включающем введение водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом, перед введением суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом вводят три суспензии липосом различного диаметра, с йодсодержащим рентгеноконтрастным средством, первую Previously, experiments were carried out with various methods of treating cancer, which showed that the technical result is achieved when, in the method of treating cancer using injections of a drug, including the introduction of an aqueous suspension of liposomes of the same diameter with an encapsulated antitumor drug, before administration suspension of liposomes of the same diameter with an encapsulated anticancer drug the atom is injected with three suspensions of liposomes of various diameters, with an iodine-containing radiopaque agent, the first

суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200 нм, вторую суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 100 нм, третью суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм, введение каждой последующей суспензии липосом с йодсодержащим рентгеноконтрастным средством осуществляют через 1-4 ч после введения предыдущей суспензии липосом, после введения каждой суспензии липосом методом компьютерной томографии (КТ) определяют степень накопления липосом в опухолевой ткани в зависимости от диаметра липосом, затем выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани, и лекарственный препарат вводят внутривенно, инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.a suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 200 nm, a second suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 100 nm, a third suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 50 nm, the introduction of each subsequent suspension of liposomes with an iodine-containing radiopaque agent is carried out 1-4 hours after the introduction of the previous suspension of liposomes, after the introduction of each suspension of liposomes by computed tomography and (CT) determine the degree of accumulation of liposomes in the tumor tissue depending on the diameter of the liposomes, then select the diameter of the liposomes with the highest degree of accumulation in the tumor tissue, and the drug is administered intravenously encapsulated in liposomes with the same lipid composition and diameter, ensuring their greatest degree accumulation in tumor tissue.

Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.The proposed method is new and is not described in the patent and scientific literature.

Предлагаемый способ может быть использован для лечения различных онкологических заболеваний поверхностной или глубокой локализации, например, таких, как рак молочной железы, глиома, рак простаты и т.д. При этом при лечении могут быть использованы различные лекарственные препараты, например, такие как JPM 565, Цисплатин, Иринотекан и т.д. Следует отметить, что в предлагаемом способе используемые лекарственные препараты обязательно должны селективно (избирательно) действовать на подлежащий лечению тип опухоли и быть предварительно инкапсулированы в липосомы, причем для лечения онкологических заболеваний пациенту или больному животному внутривенно необходимо вводить водосодержащую суспензию таких липосом, поскольку механизм всасывания липосом из желудочно-кишечного тракта при пероральном их введении до конца не ясен. При этом липосмы могут быстро деградировать под действием желудочного сока, либо ферментов желчи, в результате чего лекарственный препарат, не обладающий селективностью (избирательностью) по отношению к клеткам опухоли, но обладающий высокой токсичностью (например, Доксорубицин), неизбежно будет воздействовать как на опухолевые клетки, так и на здоровые клетки организма. Внутримышечное введение используемых липосом также может быть нецелесообразным ввиду того, что при этом создается депо липосом в месте введения, а скорость элиминации из депо зависит от размера липосом и составляет от нескольких часов (при диаметре липосом менее 50 нм) до нескольких дней (при диаметре липосом более 50 нм), что замедляет процесс лечения, а в некоторых случаях даже при минимальном диаметре липосом 30-50 нм такие липосомы ввиду малого диаметра капилляров организма могут вообще не дойти из мышцы до пораженного опухолью органа.The proposed method can be used to treat various oncological diseases of superficial or deep localization, for example, such as breast cancer, glioma, prostate cancer, etc. In this case, various medications can be used in the treatment, for example, such as JPM 565, Cisplatin, Irinotecan, etc. It should be noted that in the proposed method, the drugs used must necessarily selectively (selectively) act on the type of tumor to be treated and be pre-encapsulated in liposomes, and for the treatment of oncological diseases, a patient or sick animal must be injected with an aqueous suspension of such liposomes, since the liposome absorption mechanism from the gastrointestinal tract when administered orally, it is not completely clear. In this case, liposomes can quickly degrade under the influence of gastric juice, or bile enzymes, as a result of which a drug that does not have selectivity towards tumor cells but has high toxicity (for example, doxorubicin) will inevitably affect both tumor cells , and on healthy cells of the body. Intramuscular administration of used liposomes may also be impractical due to the fact that a liposome depot is created at the injection site, and the elimination rate from the depot depends on the size of the liposomes and ranges from several hours (with liposome diameters less than 50 nm) to several days (with liposome diameters more than 50 nm), which slows down the treatment process, and in some cases even with a minimum liposome diameter of 30-50 nm, such liposomes, due to the small diameter of the capillaries of the body, may not reach the organ affected by the tumor from the muscle.

В предлагаемом техническом решении, так же, как и в прототипе, используют водосодержащую суспензию липосом, которая в качестве дисперсионной среды может содержать воду или водные растворы различных добавок, например, таких как компоненты буфера, соли, например, NaCl, сахара и т.д. При этом концентрация липосом с инкапсулированным в них лекарственным препаратом в каждом курсе лечения может быть различна.In the proposed technical solution, as well as in the prototype, an aqueous suspension of liposomes is used, which as a dispersion medium may contain water or aqueous solutions of various additives, for example, such as buffer components, salts, for example, NaCl, sugar, etc. . In this case, the concentration of liposomes with the drug encapsulated in them in each course of treatment may be different.

Следует отметить, что получение липосом с инкапсулированным в них лекарственным препаратом описано в литературе [см. прототип]. Кроме того, коммерчески доступен ряд противоопухолевых препаратов, которые уже инкапсулированны в липосомы [Upendra Bulbake, Sindhu Doppalapudi, Nagavendra Kommineni and Wahid Khan. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review // Pharmaceutics. 2017. V. 9. Р. 1-33].It should be noted that the preparation of liposomes with a drug encapsulated in them is described in the literature [see prototype]. In addition, a number of anticancer drugs that are already encapsulated in liposomes are commercially available [Upendra Bulbake, Sindhu Doppalapudi, Nagavendra Kommineni and Wahid Khan. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review // Pharmaceutics. 2017. V. 9. R. 1-33].

Липидный состав используемых липосом может быть различен и определяется качественным и количественным соотношением смеси липидов, используемых в процессе получения липосом, однако в пределах одного курса лечения липидный состав всегда должен быть одинаков, поскольку степень и скорость накопления липосом зависят от их липидного состава. В предлагаемом способе перед курсом лечения больного человека или животного им предварительно необходимо внутривенно ввести три суспензии липосом различного диаметра, которые могут быть получены путем пропускания суспенизии липосом через экструдер, снабженный мембраной с круглыми порами, диаметр которых выбран из группы, включающей 200, 100 и 50 нм. Экспериментально было показано, что полученные липосомы имеют сферическую форму и достаточно узкое распределение по размеру, причем их средний диаметр близок к диаметру пор в использованной мембране. Вводимые липосомы не должны содержать лекарственного препарата, но должны содержать внутри одинаковую мольную концентрацию рентгеноконтрастного средства.The lipid composition of the liposomes used can be different and is determined by the qualitative and quantitative ratio of the lipid mixture used in the process of liposome production, however, within the same course of treatment, the lipid composition should always be the same, since the degree and rate of accumulation of liposomes depend on their lipid composition. In the proposed method, before the course of treatment of a sick person or animal, they first need to intravenously administer three suspensions of liposomes of different diameters, which can be obtained by passing a suspension of liposomes through an extruder equipped with a round pore membrane, the diameter of which is selected from the group of 200, 100 and 50 nm It was experimentally shown that the obtained liposomes have a spherical shape and a fairly narrow size distribution, with their average diameter being close to the pore diameter in the used membrane. The injected liposomes must not contain the drug, but must contain the same molar concentration of the radiopaque agent inside.

При реализации способа исходная суспензия липосом может быть получена методом обращения фаз с последующей гомогенизацией суспензии методом экструзии. В качестве ЙРС можно использовать различные коммерчески доступные водорастворимые средства, содержащие неионогенный йод, например, такие препараты, как Йогексол, Йопромид, Йопамидол и т.д. При этом концентрация ЙРС внутри липосом может быть различной, однако перед началом конкретного курса лечения концентрация ЙРС в липосомах всегда должна быть одинакова. Используемый ЙРС малотоксичны и выводятся из организма в неизменном виде.When implementing the method, the initial suspension of liposomes can be obtained by phase reversal followed by homogenization of the suspension by extrusion. As YRS, you can use various commercially available water-soluble agents containing nonionic iodine, for example, drugs such as Yoheksol, Yopromid, Yopamidol, etc. Moreover, the concentration of YRS inside liposomes can be different, however, before starting a specific course of treatment, the concentration of YRS in liposomes should always be the same. Used YRS are low toxic and excreted unchanged.

Загрузку ЙРС в липосомы проводят на стадии получения липосом. В круглодонной колбе диспергируют необходимую смесь липидов в смеси, содержащей 75 об. % хлороформа и 25 об. % метанола, затем к этому раствору добавляют предварительно сконцентрированный водный раствор йодсодержащего препарата. Смесь обрабатывают ультразвуком на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем колбу присоединяют к роторному испарителю для отгонки органических растворителей. К образовавшемуся гелю добавляют аликвоту водосодержащего натрий-фосфатного буфера и встряхивают до получения суспензии. Для получения гомогенизированных по размеру липосом полученную суспензию последовательно пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200, 100 и 50 нм. Способ получения липосом с различным диаметром и достаточно узким распределением по размеру известен [Ong S., Chitneni М., Lee K., Ming L., Yuen K. Evaluation of Extrusion Technique for Nanosizing Liposomes // Pharmaceutics. 2016. V. 8(4), P. 1-12. doi:10.3390/pharmaceutics8040036]. Мембраны с диаметром пор 50, 100 и 200 нм коммерчески доступны [https://avantilipids.com/divisions/equipment-products].The loading of IRS into liposomes is carried out at the stage of liposome production. The necessary mixture of lipids is dispersed in a round bottom flask in a mixture containing 75 vol. % chloroform and 25 vol. % methanol, then a pre-concentrated aqueous solution of an iodine-containing preparation is added to this solution. The mixture is sonicated in an ultrasonic bath until a stable colloidal solution is formed, then the flask is attached to a rotary evaporator to distill off the organic solvents. An aliquot of aqueous sodium phosphate buffer was added to the resulting gel and shaken until a suspension was obtained. To obtain liposomes homogenized in size, the suspension obtained is subsequently passed through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 200, 100 and 50 nm. A method of producing liposomes with different diameters and fairly narrow size distributions is known [Ong S., Chitneni M., Lee K., Ming L., Yuen K. Evaluation of Extrusion Technique for Nanosizing Liposomes // Pharmaceutics. 2016. V. 8 (4), P. 1-12. doi: 10.3390 / pharmaceutics8040036]. Membranes with pore diameters of 50, 100 and 200 nm are commercially available [https://avantilipids.com/divisions/equipment-products].

В предлагаемом способе перед началом лечения используют три типа липосом с различным диаметром, не содержащих инкапсулированного противоопухолевого препарата, но содержащих внутри одинаковую мольную концентрацию одного из ЙРС.In the proposed method, before starting treatment, three types of liposomes with different diameters are used, not containing an encapsulated antitumor preparation, but containing the same molar concentration of one of the IRS inside.

В предложенном способе после каждой инъекции суспензии липосом с ЙРС методом КТ с помощью специальной программы определяют наибольшую степень накопления липосом в зависимости от диаметра используемых липосом. Определять степень накопления липосом в опухолевой ткани можно начинать непосредственно после инъекции суспензии липосом, содержащей ЙРС. Осуществлять последующие инъекции суспензии липосом с другим диаметром можно через 1-4 ч после введения предыдущей суспензии. Указанный оптимальный интервал времени между инъекциями липосом был определен экспериментально.In the proposed method, after each injection of a suspension of liposomes with YRS by the CT method, using the special program, the greatest degree of liposome accumulation is determined depending on the diameter of the liposomes used. The degree of liposome accumulation in tumor tissue can be determined immediately after injection of a liposome suspension containing YPC. Subsequent injections of a suspension of liposomes with a different diameter can be carried out 1-4 hours after the introduction of the previous suspension. The indicated optimal time interval between liposome injections was determined experimentally.

Накопление липосом в опухолевой ткани обусловлено известным эффектом повышенной проницаемости кровеносных сосудов опухоли и удерживания наночастиц (EPR-эффектом) [Nichols J.W.; Bae Y.Н. EPR: Evidence and fallacy // Journal of Controlled Release. 2014. V. 190. P. 451-464]. После этого выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани и лекарственный препарат вводят инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.The accumulation of liposomes in the tumor tissue is due to the known effect of increased permeability of the blood vessels of the tumor and the retention of nanoparticles (EPR-effect) [Nichols J.W .; Bae Y.N. EPR: Evidence and fallacy // Journal of Controlled Release. 2014. V. 190. P. 451-464]. After that, the diameter of the liposomes with the highest degree of accumulation in the tumor tissue is selected, and the drug is administered encapsulated in liposomes with the same lipid composition and diameter, which ensures their greatest degree of accumulation in the tumor tissue.

Из научно-технической литературы известно, что накопление липосом зависит как от размеров самих липосом, так и от размера пор сосудов в опухолевой ткани и стадии онкологического заболевания. Поскольку накопление липосом варьируется от пациента к пациенту, заранее нельзя достоверно предсказать оптимальную методику лечения [Гуревич Д.Г., Меерович И.Г., Меерович Г.А., Воробьев С.И., Певгов В.Г., Смирнова З.С, Оборотова Н.А., Лукьянец Е.А., Барышников А.Ю. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли // Российский биотерапевтический журнал. 2007. Т. 2. С. 45-49]. При использовании описанного в прототипе способа в клинической практике могут наблюдаться случаи нерационального введения лекарственного препарата, инкапсулированного в липосомы, одновременно содержащие магнитные наночастицы. Учитывая относительную длительность курса лечения вышеописанными противоопухолевыми препаратами это неизбежно может приводить к накоплению в организме критических концентраций железа и лекарственного препарата, требующих дополнительных манипуляций по их выведению из организма, что осложняет известный способ лечения. В предложенном способе липосомы не содержат наночастиц железа и, следовательно, не требуют дополнительного введения препаратов для выведения железа из организма.From the scientific and technical literature it is known that the accumulation of liposomes depends both on the size of the liposomes themselves and on the pore size of the vessels in the tumor tissue and the stage of cancer. Since the accumulation of liposomes varies from patient to patient, it is impossible to reliably predict the optimal treatment technique in advance [Gurevich DG, Meerovich I.G., Meerovich G.A., Vorobyev S.I., Pevgov V.G., Smirnova Z. S, Oborotova N.A., Lukyanets E.A., Baryshnikov A.Yu. The effect of liposome size on the level and selectivity of thiosens accumulation in a tumor // Russian Biotherapeutic Journal. 2007.Vol. 2. S. 45-49]. When using the method described in the prototype in clinical practice, cases of irrational administration of a drug encapsulated in liposomes simultaneously containing magnetic nanoparticles can be observed. Given the relative duration of the course of treatment with the antitumor drugs described above, this can inevitably lead to the accumulation in the body of critical concentrations of iron and a drug, requiring additional manipulations to remove them from the body, which complicates the known treatment method. In the proposed method, liposomes do not contain iron nanoparticles and, therefore, do not require additional administration of drugs to remove iron from the body.

При реализации предлагаемого способа диаметр и степень полидисперсности используемых липосом контролируют методом динамического светорассеяния. Концентрация неиногенного йода в липосомах при необходимости может быть определена рентгенофлуоресцентным методом. Степень накопления липосом в опухоли определяют методом КТ по отношению модуля разности усредненного сигнала для ткани до и после введения суспензии липосом с ИРС к стандартному отклонению шума фона изображения.When implementing the proposed method, the diameter and degree of polydispersity of the liposomes used are controlled by dynamic light scattering. The concentration of non-inogenic iodine in liposomes, if necessary, can be determined by X-ray fluorescence. The degree of liposome accumulation in the tumor is determined by CT using the ratio of the difference module of the average signal for tissue before and after the introduction of a suspension of liposomes with IRS to the standard deviation of the background image noise.

Об эффективности лечения судят либо по уменьшению скорости роста опухоли в процессе лечения, либо по уменьшению объема опухоли в процессе лечения. При этом объем опухоли рассчитывают по формуле V=(a×b²)/2, где а и b - это самый большой и самый маленький диаметры опухоли. Начинать лечение целесообразно после выхода липосом с ЙРС из организма.The effectiveness of treatment is judged either by a decrease in the rate of tumor growth during treatment, or by a decrease in tumor volume during treatment. The tumor volume is calculated using the formula V = (a × b ² ) / 2, where a and b are the largest and smallest tumor diameters. It is advisable to begin treatment after the release of liposomes from YRS from the body.

Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.The advantages of the proposed method are illustrated by the following examples.

Пример 1.Example 1

В опыте используют подопытных животных - иммунокомпетентных FVB/N мышей с привитой опухолью молочной железы мыши (опухолевые клетки линии MMTV-PyMT, полученные из трансгенной мыши). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (мыши, которых не лечат) и опытную (мыши, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли.In the experiment, experimental animals were used - immunocompetent FVB / N mice with inoculated mouse breast tumors (tumor cells of the MMTV-PyMT line obtained from transgenic mice). Experimental animals with a grafted tumor are divided into two groups of 6 animals each - control (mice that are not treated) and experimental (mice that are treated). The effectiveness of the treatment of the disease is monitored by slowing the growth rate of the tumor.

В качестве ЙРС в примере используют препарат Йогексол. Липосомы с тем же липидным составом, что и в прототипе, получают методом обращения фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 95 мг фосфатидилхолина и 5 мг 1,2-дистеароил-зп-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 7,5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 2 мл предварительно сконцентрированного водного раствора Йогексола, содержащего 500 мг йода/мл раствора. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 15 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют использованные органические растворители. К полученному гелю добавляют 3 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4) и перемешивают до получения суспензии. Для получения трех суспензий липосом с различным диаметром весь объем исходной суспензии липосом, предварительно загруженных ЙРС, вначале пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Треть прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшиеся две трети прошедшей через мембрану суспензии повторно пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Половину прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшуюся половину суспензии снова пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 50 нм. Прошедшую через мембрану суспензию также используют для проведения эксперимента. Неинкапсулированный ЙРС отделяют от суспензии липосом путем диализа в течение 10 ч в диализном мешке с размером пор 100 килодальтон (кДа) против 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4). Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 210, 105 и 55 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1.As YRS in the example, the drug Yogexol is used. Liposomes with the same lipid composition as in the prototype are obtained by phase reversal by dispersing 95 mg of phosphatidylcholine and 5 mg of 1,2-distearoyl-zp-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) - in a round bottom flask 2000] in a mixture containing 7.5 ml of chloroform and 2.5 ml of methanol, after which 2 ml of a pre-concentrated aqueous solution of Yogexol containing 500 mg of iodine / ml of solution are added to the resulting solution. The resulting mixture is treated with ultrasound for 5 minutes with a frequency of 15 kHz in an ultrasonic bath until a stable colloidal solution is formed, then the used organic solvents are distilled off using a rotary evaporator. To the resulting gel was added 3 ml of aqueous 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4) and stirred until a suspension was obtained. To obtain three suspensions of liposomes with different diameters, the entire volume of the initial suspension of liposomes previously loaded with IRS is first passed through an extruder with a membrane with a pore diameter of 200 nm. A third of the suspension passed through the membrane is left for the experiment, and the remaining two thirds of the suspension passed through the membrane are re-passed through an extruder with a membrane with a different pore diameter of 100 nm. Half of the suspension passed through the membrane is left for the experiment, and the remaining half of the suspension is again passed through an extruder with a membrane with a different pore diameter of 50 nm. The suspension passed through the membrane is also used for the experiment. Unencapsulated IRS is separated from the liposome suspension by dialysis for 10 hours in a dialysis bag with a pore size of 100 kilodaltons (kDa) against 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4). Using dynamic light scattering, it was shown that three different liposome dispersions were obtained in the experiment, with average diameters of 210, 105, and 55 nm, with a polydispersity index equal to or less than 0.1.

На 5-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 150 мкл суспензии липосом со средним диаметром 210 нм, содержащей ЙРС, после чего методом КТ определяют степень накопления липосом в опухоли. При этом максимальную степень накопления, равную 9%, наблюдают через 50 мин после введения суспензии липосом. Через 1 ч после введения вышеуказанной суспензии липосом внутривенно вводят другую суспензию липосом со средним диаметром 105 нм, содержащую Йогексол. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 13%, наблюдают через 30 мин после инъекции. Через 1 ч после введения второй суспензии липосом внутривенно вводят третью суспензию липосом со средним диаметром 55 нм. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 25%, наблюдают через 30 мин после инъекции.On the 5th day after the grafting of the tumor, the animals from the experimental group were intravenously injected with 150 μl of a suspension of liposomes with an average diameter of 210 nm containing YRS, after which the degree of liposome accumulation in the tumor was determined by CT. Moreover, the maximum degree of accumulation, equal to 9%, is observed 50 minutes after the introduction of the suspension of liposomes. One hour after the administration of the above liposome suspension, another suspension of liposomes with an average diameter of 105 nm containing Yohexol is intravenously administered. The maximum value of the degree of accumulation of a suspension of liposomes in the tumor, equal to 13%, is observed 30 minutes after injection. One hour after the administration of the second suspension of liposomes, a third suspension of liposomes with an average diameter of 55 nm was intravenously administered. The maximum value of the degree of accumulation of a suspension of liposomes in the tumor, equal to 25%, is observed 30 minutes after injection.

Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, имеющие средний диаметр 55 нм.Comparison of the results showed that liposomes with an average diameter of 55 nm have the highest degree of accumulation in tumor tissue.

После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 50 нм, не содержащие ЙРС, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - ингибитор цистеиновой протеазы катепсина JPM-565. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора липидов в смеси хлороформ-метанол в соотношении 3:1 по объему до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют в водном растворе противоопухолевого препарата, содержащего 12,5 мг JPM-565 в 1 мл раствора, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 50 нм. Для очистки от незагрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).After that, liposomes with the above lipid composition and an optimal average diameter close to 50 nm are obtained, which do not contain YPCs but contain the antitumor drug, a cathepsin cysteine protease inhibitor JPM-565, inside. Obtaining these liposomes is carried out by evaporation on a rotary evaporator of a solution of lipids in a mixture of chloroform-methanol in a ratio of 3: 1 by volume until a uniform film forms on the walls of the flask. The resulting film was suspended in an aqueous solution of an antitumor preparation containing 12.5 mg of JPM-565 in 1 ml of a solution until a liposome suspension formed, which was then passed through an extruder with a membrane with a pore diameter of 50 nm. To clear the antitumor preparation that did not load into the liposomes, the resulting suspension was passed through a NAP-25 brand desalting column (GE Healthcare illustra ™ NAP ™ Columns) with a mobile phase representing 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4).

Лечение подопытных животных так же, как и в прототипе, проводят после того, как объем опухоли достигнет 125 мм³ и начинают через 3 ч после последней инъекции суспензии липосом с ЙРС. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 100 мг/кг тела мыши (по количеству JPM-565). Контрольной группе мышей вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор 10 мМ натрий-фосфатного буфера. Внутривенные инъекции проводят каждые два дня, при этом общее количество инъекций в каждой группе мышей было равно 10. Объем опухоли у мышей измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.Treatment of experimental animals, as in the prototype, is carried out after the tumor volume reaches 125 mm ³ and begins 3 hours after the last injection of a suspension of liposomes with YRS. The treatment is carried out by intravenous administration of an aqueous suspension of liposomes containing an antitumor preparation in a dose of 100 mg / kg of the mouse body (in the amount of JPM-565). In the control group of mice, instead of a suspension of drug liposomes, the above solution of 10 mM sodium phosphate buffer was intravenously administered. Intravenous injections are carried out every two days, with the total number of injections in each group of mice being 10. The tumor volume in mice is measured every day and the treatment efficiency is judged by the change in the tumor growth rate.

Опыт показал, что в экспериментальной группе мышей объем опухоли на 18-й день лечения составлял 310 мм³, что в 4 раза меньше, чем у контрольной группы мышей, не получающих лекарство. При этом достигнутый в прототипе эффект замедления скорости роста опухоли в 2,4 раза в нашем случае наблюдают уже на 12-й день лечения.Experience showed that in the experimental group of mice the tumor volume on the 18th day of treatment was 310 mm ³ , which is 4 times less than in the control group of mice not receiving the drug. Moreover, the effect achieved in the prototype of the effect of slowing down the tumor growth rate by 2.4 times in our case is already observed on the 12th day of treatment.

Пример 2.Example 2

В опыте используют подопытных животных - мышей с привитой опухолью предстательной железы человека (клеточная линия 22Rv1). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (мыши, которых не лечат) и опытную (мыши, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли. В качестве ЙРС используют препарат Йопромид.In the experiment, experimental animals are used - mice vaccinated with a human prostate tumor (cell line 22Rv1). Experimental animals with a grafted tumor are divided into two groups of 6 animals each - control (mice that are not treated) and experimental (mice that are treated). The effectiveness of the treatment of the disease is monitored by slowing the growth rate of the tumor. As YRS use the drug Yopromide.

Липосомы получают методом обращения фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 80 мг лецитина, 15 мг холестерина и 5 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 7,5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 2 мл предварительно сконцентрированного водного раствора Йопромида, содержащие 450 мг йода/мл раствора. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 20 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют использованные органические растворители. К полученному гелю добавляют 3 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4), перемешивают до получения суспензии. Для получения трех суспензий липосом с различным диаметром весь объем исходной суспензии липосом, предварительно загруженных ЙРС, вначале пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Треть прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшиеся две трети прошедшей через мембрану суспензии повторно пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Половину прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшуюся половину суспензии снова пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 50 нм. Прошедшую через мембрану суспензию также используют для проведения эксперимента. Неинкапсулированное ЙРС отделяют от суспензии липосом путем диализа в течение 10 ч в диализном мешке с размером пор 100 кДа против 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4). Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 198, 113 и 49 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1.Liposomes are prepared by phase reversal by dispersing in a round bottom flask 80 mg of lecithin, 15 mg of cholesterol and 5 mg of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy- (polyethylene glycol) -2000] in a mixture containing 7 , 5 ml of chloroform and 2.5 ml of methanol, after which 2 ml of a pre-concentrated aqueous solution of Yopromide containing 450 mg of iodine / ml of solution are added to the resulting solution. The resulting mixture is treated with ultrasound at a frequency of 20 kHz for 5 min in an ultrasonic bath until a stable colloidal solution is formed, then the used organic solvents are distilled off using a rotary evaporator. To the resulting gel was added 3 ml of aqueous 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4), stirred until a suspension was obtained. To obtain three suspensions of liposomes with different diameters, the entire volume of the initial suspension of liposomes previously loaded with IRS is first passed through an extruder with a membrane with a pore diameter of 200 nm. A third of the suspension passed through the membrane is left for the experiment, and the remaining two thirds of the suspension passed through the membrane are re-passed through an extruder with a membrane with a different pore diameter of 100 nm. Half of the suspension passed through the membrane is left for the experiment, and the remaining half of the suspension is again passed through an extruder with a membrane with a different pore diameter of 50 nm. The suspension passed through the membrane is also used for the experiment. Unencapsulated YRS is separated from the liposome suspension by dialysis for 10 hours in a dialysis bag with a pore size of 100 kDa against 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4). Using dynamic light scattering, it was shown that three different liposome dispersions with average diameters of 198, 113, and 49 nm, with a polydispersity index equal to or less than 0.1, were obtained in the experiment.

На 7-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 150 мкл суспензии липосом со средним диаметром 198 нм, после чего методом КТ определяют степень накопления липосом в опухоли. При этом максимальную степень накопления, равную 7%, наблюдают через 1 ч после введения (инъекции) суспензии липосом с ЙРС. Через 1,5 ч после введения вышеуказанной суспензии липосом внутривенно вводят другую суспензию липосом со средним диаметром 113 нм, содержащую ЙРС. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 17%, наблюдают через 1 ч после внутривенной инъекции суспензии. Через 1,5 ч после введения второй суспензии липосом внутривенно вводят третью суспензию липосом со средним диаметром 49 нм. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 9%, наблюдают через 30 мин после инъекции суспензии.On the 7th day after the grafting of the tumor, the animals from the experimental group were intravenously injected with 150 μl of a suspension of liposomes with an average diameter of 198 nm, after which the degree of liposome accumulation in the tumor was determined by CT. In this case, the maximum degree of accumulation, equal to 7%, is observed 1 h after the introduction (injection) of a suspension of liposomes with YRS. 1.5 hours after the introduction of the above liposome suspension, another liposome suspension with an average diameter of 113 nm containing IRS is administered intravenously. The maximum value of the degree of accumulation of a suspension of liposomes in the tumor, equal to 17%, is observed 1 hour after intravenous injection of the suspension. 1.5 hours after the introduction of the second suspension of liposomes, a third suspension of liposomes with an average diameter of 49 nm is intravenously administered. The maximum value of the degree of accumulation of a suspension of liposomes in the tumor, equal to 9%, is observed 30 minutes after injection of the suspension.

Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, имеющие средний диаметр 113 нм.A comparison of the results showed that liposomes with an average diameter of 113 nm have the highest degree of accumulation in the tumor tissue.

После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 100 нм, не содержащие ЙРС, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - доксорубицин. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора липидов в смеси хлороформ-метанол, взятых в соотношении 3:1 по объему, до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют 120 мМ водным раствором (NH₄)₂SO₄, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 100 нм. Далее полученную суспензию очищают от сульфата аммония во внешнем буфере с помощью обессоливающей колонки марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns), затем к ней добавляют водный раствор Доксорубицина с концентрацией 12 мг/мл и инкубируют в течение 2 ч. Для очистки от незагрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).After that, liposomes with the above lipid composition and an optimal average diameter close to 100 nm are obtained, not containing YRS, but containing the antitumor drug doxorubicin inside. Obtaining these liposomes is carried out by evaporation on a rotary evaporator of a lipid solution in a mixture of chloroform-methanol, taken in a ratio of 3: 1 by volume, until a uniform film is formed on the walls of the flask. The resulting film was suspended in a 120 mM aqueous solution of (NH ₄ ) ₂ SO ₄ until a liposome suspension formed, which was then passed through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 100 nm. Next, the suspension obtained is purified from ammonium sulfate in an external buffer using a NAP-25 brand desalting column (GE Healthcare illustra ™ NAP ™ Columns), then an aqueous solution of Doxorubicin with a concentration of 12 mg / ml is added to it and incubated for 2 hours. from an antitumor preparation that has not been loaded into liposomes, the suspension obtained is passed through a NAP-25 brand desalting column (GE Healthcare illustra ™ NAP ™ Columns) with a mobile phase, which is 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4).

Лечения подопытных животных начинают через 4 ч после последней инъекции суспензии липосом с ЙРС. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 9 мг/кг тела животного (по концентрации Доксорубицина). Суспензию липосом внутривенно вводят на 7, 12 и 17 дни после имплантации опухоли. Контрольной группе мышей вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Объем опухоли у мышей измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.Treatment of experimental animals begins 4 hours after the last injection of a suspension of liposomes with YRS. Treatment is carried out by intravenous administration of an aqueous suspension of liposomes containing an antitumor drug at a dose of 9 mg / kg of the animal’s body (according to the concentration of Doxorubicin). A suspension of liposomes is intravenously administered on days 7, 12, and 17 after tumor implantation. In the control group of mice, instead of a suspension of liposomes with a drug, the above solution of sodium phosphate buffer was intravenously administered. Tumor volume in mice is measured every day and treatment efficacy is judged by the change in tumor growth rate.

Опыт показал, что в экспериментальной группе мышей объем опухоли на 17-й день лечения оказался в 4 раза меньше, чем у контрольной группы мышей. При этом в среднем опухоль у мышей, получающих противоопухолевый препарат, с момента лечения уменьшилась на 80%.Experience showed that in the experimental group of mice, the tumor volume on the 17th day of treatment was 4 times less than in the control group of mice. Moreover, on average, a tumor in mice receiving an antitumor drug has decreased by 80% since treatment.

Пример 3.Example 3

В опыте используют подопытных животных - крыс с привитой опухолью глиомы головного мозга (клеточная линия С6). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (крысы, которых не лечат) и опытную (крысы, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли. В качестве ЙРС используют Йопамидол.In the experiment, experimental animals are used - rats vaccinated with a brain glioma tumor (cell line C6). Experimental animals with a vaccinated tumor are divided into two groups of 6 individuals in each - control (rats that are not treated) and experimental (rats that are treated). The effectiveness of the treatment of the disease is monitored by slowing the growth rate of the tumor. As YRS use Yopamidol.

Липосомы получают методом обращения фаз путем диспергирования в кругло донной колбе 250 мг фосфатидилхолина, 125 мг дипальмитоилфосфатидилхолина и 25 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 37,5 мл хлороформа и 12,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 10 мл предварительно сконцентрированного водного раствора препарата Йопамидол, содержащие 520 мг йода/мл раствора. Полученную смесь в течение 10 мин обрабатывают ультразвуком с частотой 14 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют использованные органические растворители. К полученному гелю добавляют 15 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4) и перемешивают до получения суспензии. Для получения трех суспензий липосом с различным диаметром весь объем исходной суспензии липосом, предварительно загруженных ЙРС, вначале пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Треть прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшиеся две трети прошедшей через мембрану суспензии повторно пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Половину прошедшей через мембрану суспензии оставляют для проведения эксперимента, а оставшуюся половину суспензии снова пропускают через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 50 нм. Прошедшую через мембрану суспензию также используют для проведения эксперимента. Неинкапсулированный ЙРС отделяют от суспензии липосом путем диализа в течение 10 ч в диализном мешке с размером пор 100 кДа против 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7,4). Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 187, 94 и 50 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1.Liposomes are prepared by phase reversal by dispersing 250 mg of phosphatidylcholine, 125 mg of dipalmitoylphosphatidylcholine and 25 mg of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -2000] in a mixture containing 37.5 ml of chloroform and 12.5 ml of methanol, after which 10 ml of a pre-concentrated aqueous solution of the drug Yopamidol containing 520 mg of iodine / ml solution is added to the resulting solution. The resulting mixture is treated with ultrasound at 10 kHz for 10 min in an ultrasonic bath until a stable colloidal solution is formed, then the used organic solvents are distilled off using a rotary evaporator. To the resulting gel was added 15 ml of aqueous 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4) and stirred until a suspension was obtained. To obtain three suspensions of liposomes with different diameters, the entire volume of the initial suspension of liposomes previously loaded with IRS is first passed through an extruder with a membrane with a pore diameter of 200 nm. A third of the suspension passed through the membrane is left for the experiment, and the remaining two thirds of the suspension passed through the membrane are re-passed through an extruder with a membrane with a different pore diameter of 100 nm. Half of the suspension passed through the membrane is left for the experiment, and the remaining half of the suspension is again passed through an extruder with a membrane with a different pore diameter of 50 nm. The suspension passed through the membrane is also used for the experiment. Unencapsulated IRS is separated from the liposome suspension by dialysis for 10 hours in a dialysis bag with a pore size of 100 kDa against 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4). Using dynamic light scattering, it was shown that three different liposome dispersions with average diameters of 187, 94, and 50 nm, with a polydispersity index equal to or less than 0.1, were obtained in the experiment.

На 7-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 1 мл суспензии липосом со средним диаметром 187 нм, содержащей ЙРС, после чего методом КТ определяют степень накопления липосом в опухоли. При этом максимальную степень накопления, равную 5%, наблюдают через 70 мин после введения суспензии липосом. Через 4 ч после введения вышеуказанной суспензии липосом внутривенно вводят другую суспензию липосом со средним диаметром 94 нм. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 20%, наблюдают через 1 ч после инъекции суспензии. Через 4 ч после введения второй суспензии липосом внутривенно вводят третью суспензию липосом со средним диаметром 50 нм. Максимальное значение степени накопления суспензии липосом в опухоли, равное 21%, наблюдают через 50 мин после инъекции.On the 7th day after grafting the tumor, the animals from the experimental group are injected intravenously with 1 ml of a suspension of liposomes with an average diameter of 187 nm containing YRS, after which the degree of liposome accumulation in the tumor is determined by CT. Moreover, the maximum degree of accumulation, equal to 5%, is observed 70 minutes after the introduction of a suspension of liposomes. 4 hours after the administration of the above liposome suspension, another liposome suspension with an average diameter of 94 nm was intravenously administered. The maximum value of the degree of accumulation of a suspension of liposomes in the tumor, equal to 20%, is observed 1 h after injection of the suspension. 4 hours after the introduction of the second suspension of liposomes, a third suspension of liposomes with an average diameter of 50 nm is intravenously administered. The maximum value of the degree of accumulation of a suspension of liposomes in the tumor, equal to 21%, is observed 50 minutes after injection.

Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, имеющие средний диаметр 50 нм.A comparison of the results showed that liposomes with an average diameter of 50 nm have the highest degree of accumulation in tumor tissue.

После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 50 нм, не содержащие ЙРС, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - Йринотекан. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора вышеуказанных липидов с общей массой липидов 4,0 г в смеси хлороформ - метанол, взятых в соотношении 3:1 по объему, до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют в водном раствором противоопухолевого препарата, содержащего 750 мг Йринотекана в 50 мл водного 5% раствора декстрозы с рН=6,2. При этом проводят три цикла, каждый из которых включает заморозку и разморозку смеси, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм. Для очистки от незагрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).After that, liposomes with the above lipid composition and an optimal average diameter close to 50 nm are obtained, not containing YRS, but containing the antitumor drug Yrinotecan inside. Obtaining these liposomes is carried out by evaporating on a rotary evaporator a solution of the above lipids with a total lipid mass of 4.0 g in a mixture of chloroform-methanol taken in a ratio of 3: 1 by volume, until a uniform film is formed on the walls of the flask. The resulting film is suspended in an aqueous solution of an antitumor preparation containing 750 mg of Yrinotecan in 50 ml of an aqueous 5% dextrose solution with pH = 6.2. In this case, three cycles are carried out, each of which includes freezing and thawing the mixture until a liposome suspension is formed, which is then passed through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 50 nm. To clear the antitumor preparation that did not load into the liposomes, the resulting suspension was passed through a NAP-25 brand desalting column (GE Healthcare illustra ™ NAP ™ Columns) with a mobile phase representing 10 mM sodium phosphate buffer (pH = 7.4).

Лечения подопытных животных начинают через 4 ч после последней инъекции суспензии липосом с ЙРС. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 50 мг/кг тела (по концентрации Йринотекана). Суспензию липосом вводят по схеме 2 раза в неделю в течение 4-х недель. Контрольной группе крыс вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Объем опухоли у крыс измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.Treatment of experimental animals begins 4 hours after the last injection of a suspension of liposomes with YRS. The treatment is carried out by intravenous administration of an aqueous suspension of liposomes containing an antitumor drug at a dose of 50 mg / kg body (according to the concentration of Yrinotecan). A suspension of liposomes is administered according to the scheme 2 times a week for 4 weeks. In the control group of rats, instead of a suspension of liposomes with a drug, the above solution of sodium phosphate buffer is intravenously administered. Tumor volume in rats is measured every day and treatment efficacy is judged by the change in tumor growth rate.

Объем опухоли у леченых крыс на 28-й день лечения оказался в 4 раза меньше, чем у контрольных нелеченных крыс.The tumor volume in the treated rats on the 28th day of treatment was 4 times less than in the control untreated rats.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ по сравнению с прототипом на 18-й день лечения замедляет рост опухоли с 400 мм³ (в прототипе) до 310 мм³, действительно повышая тем самым эффективность лечения онкологического заболевания в 1,5 раза. При этом в предложенном способе стадия подготовки к лечению занимает несколько часов.Thus, it can be seen from the above examples that the proposed method, compared to the prototype on the 18th day of treatment, slows down tumor growth from 400 mm ³ (in the prototype) to 310 mm ³ , thereby really increasing the cancer treatment efficiency by 1.5 times . Moreover, in the proposed method, the stage of preparation for treatment takes several hours.

Claims

Способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, включающий введение водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом, отличающийся тем, что перед введением суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом вводят три суспензии липосом различного диаметра с йодсодержащим рентгеноконтрастным средством, первую суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200 нм, вторую суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 100 нм, третью суспензию получают путем пропускания через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм, введение каждой последующей суспензии липосом с йодсодержащим рентгеноконтрастным средством осуществляют через 1-4 ч после введения предыдущей суспензии липосом, после введения каждой суспензии липосом методом компьютерной томографии определяют степень накопления липосом в опухолевой ткани в зависимости от диаметра липосом, затем выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани, и лекарственный препарат вводят внутривенно инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.A method of treating cancer by injection of a drug, comprising administering an aqueous suspension of liposomes of the same diameter with an encapsulated antitumor drug, characterized in that before administering a suspension of liposomes of the same diameter with an encapsulated antitumor drug, three suspensions of liposomes of different diameters with iodine are administered the suspension is obtained by passing through an extruder, supplying a membrane with a pore diameter of 200 nm, a second suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 100 nm, a third suspension is obtained by passing through an extruder equipped with a membrane with a pore diameter of 50 nm, the introduction of each subsequent suspension of liposomes with an iodine-containing radiopaque agent is carried out 1-4 hours after the introduction of the previous suspension of liposomes, after the introduction of each suspension of liposomes by computed tomography, determine the degree of accumulation of liposomes in the tumor tissue in The dependence on liposome diameter then diameter of the liposomes is selected with the highest degree of accumulation in the tumor tissue, and the medicament is administered intravenously encapsulated into liposomes with the same lipid composition and diameter allowing them to the greatest degree of accumulation in the tumor tissue.