RU2699180C1 - Set of oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for identifying rnas of burkholderia mallei sap excretion and burkholderia pseudomallei melioidosis based on transcription amplification (nasba) in real time mode - Google Patents
Set of oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for identifying rnas of burkholderia mallei sap excretion and burkholderia pseudomallei melioidosis based on transcription amplification (nasba) in real time mode Download PDFInfo
- Publication number
- RU2699180C1 RU2699180C1 RU2018118282A RU2018118282A RU2699180C1 RU 2699180 C1 RU2699180 C1 RU 2699180C1 RU 2018118282 A RU2018118282 A RU 2018118282A RU 2018118282 A RU2018118282 A RU 2018118282A RU 2699180 C1 RU2699180 C1 RU 2699180C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nasba
- burkholderia
- melioidosis
- real time
- labeled probe
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для выявления РНК возбудителей сапа Burkholderia mallei и мелиоидоза Burkholderia pseudomallei в пробах чистых культур, биологическом материале и объектах окружающей среды специалистами учреждений как практического здравоохранения, службы Роспотребнадзора, так и в научных исследованиях.The invention relates to the field of biotechnology, molecular biology, and can be used to detect RNA pathogen glanders Burkholderia mallei and melioidosis Burkholderia pseudomallei in samples of pure cultures, biological material and environmental objects by specialists of institutions of both practical health care, the Rospotrebnadzor service, and in scientific research.
В связи с развитием транспортного сообщения между странами, расширением туристических направлений, а также значительными миграционными потоками населения возникает настороженность в отношении завоза на территорию РФ новых или «забытых» для страны патогенов, к числу которых относятся возбудители сапа и мелиоидоза. Рост числа подтвержденных случаев заболевания мелиоидозом отмечается не только в эндемичных по данной инфекции регионах Юго-Восточной Азии и Северной Австралии, но и в ряде стран Европы, Северной и Латинской Америки. Заболеваемость людей сапом отмечается редко, в основном носит профессиональный характер, но в ряде стран, в том числе сопредельных с РФ (Монголия, Турция, Иран и др.) продолжают регистрировать вспышки заболевания у животных. Не исключена возможность использования данных возбудителей, которые относятся к микроорганизмам I-II групп патогенности, в качестве потенциальных агентов биотерроризма. Многообразие клинических проявлений сапа и мелиоидоза существенно затрудняют диагностику и своевременное назначение этиотропной терапии этих опасных заболеваний. Совокупность данных факторов определяет необходимость исследований, направленных на совершенствование лабораторных методов выявления патогенных буркхольдерий.In connection with the development of transport links between countries, the expansion of tourist destinations, as well as significant migration flows, there is wariness regarding the importation into the territory of the Russian Federation of new or “forgotten” pathogens for the country, which include glanders and melioidosis. An increase in the number of confirmed cases of melioidosis is noted not only in the regions of Southeast Asia and Northern Australia endemic for this infection, but also in several countries of Europe, North and Latin America. The incidence of glanders in humans is rare, mainly professional in nature, but in a number of countries, including those adjacent to the Russian Federation (Mongolia, Turkey, Iran, etc.), outbreaks of the disease in animals continue to be recorded. It is possible that these pathogens, which belong to microorganisms of pathogenicity groups I-II, can be used as potential agents of bioterrorism. The variety of clinical manifestations of glanders and melioidosis significantly complicate the diagnosis and timely appointment of etiotropic therapy of these dangerous diseases. The combination of these factors determines the need for research aimed at improving laboratory methods for identifying pathogenic burkholderii.
В настоящее время среди молекулярно-генетических способов диагностики различных инфекций все более широкое применение находят методы изотермической амплификации нуклеиновых кислот, что обусловлено их способностью выявлять генетический материал микроорганизма в концентрации меньшей нижнего предела детекции полимеразной цепной реакции (ПЦР). К числу таких методов относится основанная на транскрипции амплификация нуклеиновых кислот NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). Высокая чувствительность метода достигается использованием в качестве целевой мишени молекул матричной РНК (мРНК) или рибосомальной РНК (рРНК) микроорганизмов, количество которых может достигать нескольких десятков тысяч на одну бактериальную клетку. В ПЦР используемые в качестве мишени даже многокопийные участки ДНК не превышают двух десятков на бактериальную клетку. Поэтому, с помощью метода NASBA можно детектировать возбудителей и в тех случаях, когда их количество очень мало и недостаточно для выявления методом ПЦР. Это особенно актуально при латентном течении инфекции, на фоне отсутствия клинических признаков заболевания. Другим важным свойством РНК в качестве мишени амплификации является ее меньшая стабильность по сравнению с молекулой ДНК, что определяет возможность использования метода NASBA для контроля эффективности проведенной терапии.Currently, among molecular genetic methods for diagnosing various infections, isothermal amplification of nucleic acids is increasingly used, due to their ability to detect the genetic material of a microorganism at a concentration lower than the lower limit of detection of polymerase chain reaction (PCR). Among these methods is the transcription-based amplification of nucleic acids NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification). High sensitivity of the method is achieved by using as a target target molecules of matrix RNA (mRNA) or ribosomal RNA (rRNA) of microorganisms, the number of which can reach several tens of thousands per bacterial cell. In PCR, even multi-copy DNA regions used as targets do not exceed two tens per bacterial cell. Therefore, using the NASBA method, pathogens can also be detected in cases where their number is very small and insufficient for detection by PCR. This is especially true with a latent course of infection, against the background of the absence of clinical signs of the disease. Another important property of RNA as an amplification target is its lower stability compared to a DNA molecule, which determines the possibility of using the NASBA method to control the effectiveness of the therapy.
В основе метода транскрипционной амплификации NASBA лежит обнаружение фрагмента РНК в изотермических условиях (при температуре 41°С) с помощью двух специфических праймеров и совместной ферментативной активности трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц {avian myeloblastosis virus reverse transcriptase - AMV RT), РНКазы H Escherichia coli и РНК-полимеразы фага T7. При этом происходит экспоненциальное накопление одноцепочечной РНК, которая является удобной мишенью для гибридизационных методов детекции. Использование флуоресцентно-меченых зондов позволяет регистрировать специфический продукт амплификации непосредственно в процессе реакции в режиме «реального времени», что существенно сокращает время анализа, снижает риск контаминации и увеличивает специфичность метода.The NASBA transcriptional amplification method is based on the detection of an RNA fragment under isothermal conditions (at a temperature of 41 ° C) using two specific primers and the joint enzymatic activity of three enzymes: reverse transcriptase of avian myeloblastosis virus {avian myeloblastosis virus reverse transcriptase - AMV RT), RNase H Escherichia coli and RNA polymerase of phage T7. In this case, an exponential accumulation of single-stranded RNA occurs, which is a convenient target for hybridization detection methods. The use of fluorescently-labeled probes allows you to register a specific amplification product directly in the reaction process in real-time mode, which significantly reduces the analysis time, reduces the risk of contamination and increases the specificity of the method.
Технология транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» была применена для выявления возбудителей особо опасных инфекций, таких как Vibrio cholerae [Fykse Е.М., Skogan G., Davies W., et al. (2007) Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl. Environ. Microbiol. 73(5), 1457-1466] и ряда РНК-содержащих вирусов - высоковирулентного штамма вируса гриппа AH5N1, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), коронавируса SARS, вируса энцефалита Сент-Луис, вируса гепатита С, вируса бешенства, а также вирусов лихорадок Денге, Западного Нила и Чикунгунья [Sidoti F., Bergallo М., Costa С, Cavallo R. (2013) Alternative molecular tests for virological diagnosis. Mol. Biotechnol. 53(3), 352-362]. Однако диагностические реагенты на основе реакции транскрипционной амплификации NASBA для выявления В. mallei и В. pseudomallei не разработаны.Real-time NASBA transcriptional amplification technology has been used to identify highly dangerous pathogens, such as Vibrio cholerae [Fykse EM, Skogan G., Davies W., et al. (2007) Detection of Vibrio cholerae by real-time nucleic acid sequence-based amplification. Appl. Environ. Microbiol. 73 (5), 1457-1466] and a number of RNA viruses - a highly virulent strain of the AH5N1 influenza virus, human immunodeficiency virus (HIV-1), SARS coronavirus, St. Louis encephalitis virus, hepatitis C virus, rabies virus, and also viruses dengue, West Nile and Chikungunya fever [Sidoti F., Bergallo M., Costa C, Cavallo R. (2013) Alternative molecular tests for virological diagnosis. Mol. Biotechnol. 53 (3), 352-362]. However, diagnostic reagents based on the NASBA transcriptional amplification reaction to detect B. mallei and B. pseudomallei have not been developed.
Наиболее близким аналогом являются панбактериальные праймеры и зонд, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности гена 23 S рибосомальной РНК и предназначенные для выявления целевого фрагмента нуклеиновой кислоты бактерий методом NASBA в режиме «реального времени» с целью мониторинга микробиологического качества рециркулируемой воды на борту международной космической станции [Bechy-Loizeau A.L., Flandrois J.P., Abaibou Н. (2015) Assessment of polycarbonate filter in a molecular analytical system for the microbiological quality monitoring of recycled waters onboard ISS. Life Sci. Space. Res. (Amst). 6, 29-35]. Однако отсутствие определения видовой специфичности бактерий с помощью олигонуклеотидов, используемых в вышеприведенном прототипе, исключает возможность их использования для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза.The closest analogues are panbacterial primers and a probe designed on the basis of the nucleotide sequence of the 23 S ribosomal RNA gene and designed to detect the target fragment of the bacterial nucleic acid by the NASBA method in real time in order to monitor the microbiological quality of the recirculated water aboard the international space station [Bechy -Loizeau AL, Flandrois JP, Abaibou N. (2015) Assessment of polycarbonate filter in a molecular analytical system for the microbiological quality monitoring of recycled waters onboard ISS. Life Sci. Space Res. (Amst). 6, 29-35]. However, the lack of determination of the species specificity of bacteria using the oligonucleotides used in the above prototype excludes the possibility of their use for identification of glanders and melioidosis.
Целью настоящего изобретения является разработка набора высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации В. mallei и В, pseudomallei методом транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени».The aim of the present invention is to develop a set of highly specific oligonucleotide primers and a fluorescently labeled probe for identification of B. mallei and B, pseudomallei by NASBA transcription amplification in real time.
Цель достигается созданием набора олигонуклеотидов для идентификации РЫК возбудителей сапа и мелиоидоза, содержащего пару высокоспецифичных олигонуклеотидных полимеров к целевой последовательности гена 23 S рРНК, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции транскрипционной амплификации NASBA, и флуоресцентно-меченый зонд с комплементарными концевыми последовательностями по типу «молекулярного маяка», обеспечивающего детекцию продуктов реакции в режиме «реального времени», имеющих следующую структуру:The goal is achieved by creating a set of oligonucleotides for identifying the RNA of glanders and melioidosis pathogens, containing a pair of highly specific oligonucleotide polymers to the target sequence of the 23 S rRNA gene, with forward and reverse primer activity in the NASBA transcriptional amplification reaction, and with a fluorescently-labeled probe with complementary sequences molecular beacon ”, providing detection of reaction products in the“ real time ”mode, having the following structure:
5'-ААТ ТСТ ААТ ACG ACT САС TAT AGG GAG ACG GCT ААС ААТ АСА ААТ AAA GAG ТА-3' - Burk23SrRNA-T7-P15'-AAT TST AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACG GCT AAC AAT ACA AAT AAA GAG TA-3 '- Burk23SrRNA-T7-P1
5'-ССТ ТТТ GGG ТСА ТСС TAG А-3' - Burk23SrRNA-P25'-CCT TTT GGG TCA TCC TAG A-3 '- Burk23SrRNA-P2
5'(FAM)-CCA САС ATA GGT СТА GTG AGG CGT GTG G-(RTQ-1)3' - Burk23SrRNA-MM5 '(FAM) -CCA CAC ATA GGT STA GTG AGG CGT GTG G- (RTQ-1) 3' - Burk23SrRNA-MM
где FAM - карбоксифлуоресцеин, флуоресцентный краситель, длина волны поглощения которого составляет 490 нм, а длина волны флуоресценции - 520 нм. RTQ-1 - гаситель флуоресценции с диапазоном гашения 470-570 нм.where FAM is carboxyfluorescein, a fluorescent dye with an absorption wavelength of 490 nm and a fluorescence wavelength of 520 nm. RTQ-1 is a fluorescence quencher with a quenching range of 470-570 nm.
Характеристика олигонуклеотидных праймеров, зонда и РНК-мишени для гибридизации.Characterization of oligonucleotide primers, probe and RNA target for hybridization.
Основываясь на данных, представленных в международной базе GenBank Национального центра биотехнологической информации США (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome), подобраны праймеры, обозначенные Burk23SrRNA-T7-P l/Burk23SrRNA-P2, комплементарные участку гена 23S pPHK и обеспечивающие в реакции NASBA амплификацию специфичного фрагмента рибонуклеиновой кислоты размером 159 п.н.Based on the data presented in the international GenBank database of the US National Center for Biotechnological Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome), primers designated Burk23SrRNA-T7-P l / Burk23SrRNA-P2, complementary to the gene 23S pRNA and providing the amplification of a specific fragment of ribonucleic acid of 159 bp in the NASBA reaction
Для детекции продуктов амплификации NASBA в режиме «реального времени» сконструирован зонд формата «молекулярный маяк», обозначенный Burk23SrRNA-MM, на разных концах которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. Подобная структура зонда обеспечивает максимальный эффект тушения и низкую фоновую флуоресценцию, поскольку молекулы флуорофора и гасителя сближены в пространстве.To detect NASBA amplification products in real-time mode, a molecular beacon probe, designated Burk23SrRNA-MM, was constructed at different ends of which a fluorophore and fluorescence quencher are located. Such a probe structure provides the maximum quenching effect and low background fluorescence, since the fluorophore and quencher molecules are brought together in space.
Апробация разработанного набора олигонуклеотидов была осуществлена на наборе штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора. В качестве положительного контроля в экспериментах использовали референтные штаммы В. mallei 10230 и В. pseudomallei С-141. Выделение РНК проводили из обеззараженных бактериальных суспензий микроорганизмов в концентрациях от 1×109 м.к./мл до 1×100 м.к./мл. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.Testing of the developed set of oligonucleotides was carried out on a set of strains of glanders and melioidosis pathogens from the collection of FKUZ Volgograd Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor. The reference strains of B. mallei 10230 and B. pseudomallei C-141 were used as a positive control in the experiments. RNA was isolated from disinfected bacterial suspensions of microorganisms in concentrations from 1 × 10 9 m.k. / ml to 1 × 10 0 m.k. / ml. The specificity of amplification was further confirmed by sequencing.
Оптимизацию условий реакции NASBA в режиме «реального времени» проводили с использованием коммерчески доступных реагентов, ферментов и приборов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет осуществлять быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.Real-time NASBA reaction conditions were optimized using commercially available reagents, enzymes and devices intended for mass use in laboratory practice, which allows for the rapid and reliable use of this invention in medical and research laboratories.
Примеры конкретного выполнения.Examples of specific performance.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого гибридизационного зонда для идентификации РНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом NASBA в режиме «реального времени».Example 1. The method of designing oligonucleotide primers and fluorescently-labeled hybridization probe to identify RNA pathogens glanders and melioidosis by NASBA in real time.
На основе изучения in silico структуры рибосомального кластера генов (16SpPHK, 23SpPHK, 5S рРНК) в составе секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей сапа и мелиоидоза, представленных в генетической базе данных GenBank NCBI, для конструирования праймеров и зонда был выбран ген 23S рРНК (GeneID: 3112968 (BPSLr08)) (таб. 1).Based on the in silico study of the structure of the ribosomal gene cluster (16SpPHK, 23SpPHK, 5S rRNA) as part of the sequenced nucleotide sequences of glanders and melioidosis pathogens, presented in the GenBank NCBI genetic database, the 23S rR9 gene was selected for constructing primers and probes (GeneID: 31 BPSLr08)) (tab. 1).
Для синтеза целевого фрагмента 23 S рРНК методом транскрипционной амплификации NASBA подобрана пара праймеров Burk23SrRNA-T7-P1 и Burk23SrRNA-P2, длина нуклеотидной последовательности которых составила 53 и 19 нуклеотидов, соответственно. GC-содержание гибридизующихся частей праймеров с мишенью составило 32% для праймера Burk23SrRNA-T7-P1 и 47,4% для праймера Burk23SrRNA-P2. При конструировании праймера Burk23SrRNA-T7-P1 для формирования функционального промотора Т7 РНК-полимеразы к 5'-концевому участку добавлена последовательность длиной 25 нуклеотидов. Между промоторной зоной праймера Burk23SrRNA-T7-P1 и его участком, гибридизующимся с мишенью, дополнительно добавлены три пуриновых нуклеотида с целью улучшения амплификации. Расчетный размер фрагмента гена 23S рРНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами, - 159 п.н.A pair of primers Burk23SrRNA-T7-P1 and Burk23SrRNA-P2, the nucleotide sequence length of which was 53 and 19 nucleotides, respectively, were selected for the synthesis of the target 23 S rRNA fragment by NASBA transcriptional amplification. The GC content of the hybridizing parts of the target primers was 32% for the Burk23SrRNA-T7-P1 primer and 47.4% for the Burk23SrRNA-P2 primer. When designing the Burk23SrRNA-T7-P1 primer to form the functional promoter of the T7 RNA polymerase, a sequence of 25 nucleotides was added to the 5'-terminal region. Between the promoter region of the Burk23SrRNA-T7-P1 primer and its portion hybridizing to the target, three purine nucleotides were additionally added to improve amplification. The estimated size of the 23S rRNA gene fragment flanked by the proposed primers is 159 bp
Для детекции продуктов реакции NASBA в режиме «реального времени» сконструирован зонд Burk23SrRNA-MM в формате «молекулярный маяк», потенциально способный гибридизоваться с амплифицированными 23 S рРНК-мишенями возбудителей сапа и мелиоидоза с образованием стабильных гибридов при температуре 41°С. Флуоресцентное мечение зонда осуществляли ко мбинацией красителя FAM на 5'-конце и гасителя RTQ-1 на 3'-конце. Сконструированный флуоресцентно-меченый зонд представлял собой стебель-петля-структурированный олигонуклеотид и имел в регионе стебля 6 взаимнокомплементарных нуклеотидов, при этом размер петли составил 16 нуклеотидов. Вторичную структуру и термодинамические параметры разработанного зонда оценивали в онлайн-режиме с использованием сервера Mfold Web Server (http://mfold.rna.albany.edu).To detect NASBA reaction products in real-time mode, a Burk23SrRNA-MM probe in the molecular beacon format has been constructed, which is potentially capable of hybridizing with amplified 23 S rRNA targets of glanders and melioidosis pathogens with the formation of stable hybrids at a temperature of 41 ° C. Fluorescent labeling of the probe was carried out by combining the FAM dye at the 5'-end and the RTQ-1 quencher at the 3'-end. The designed fluorescently-labeled probe was a stem-loop-structured oligonucleotide and had 6 mutually complementary nucleotides in the stem region, while the loop size was 16 nucleotides. The secondary structure and thermodynamic parameters of the developed probe were evaluated online using the Mfold Web Server (http://mfold.rna.albany.edu).
Предварительно специфичность разработанных праймеров и зонда оценивали in silico методом множественного сравнения последовательностей с помощью ресурса BLAST NCBI для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных видов рода Burkholderia и гетерологичных микроорганизмов. На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.Preliminarily, the specificity of the developed primers and probe was evaluated in silico by multiple sequence comparison using the BLAST NCBI resource to establish homology between them and the nucleotide sequences of closely related species of the genus Burkholderia and heterologous microorganisms. At the time of the computer analysis, no homology was detected.
Пример 2. Амплификация и детекция специфических фрагментов 23S рРНК с помощью разработанного набора праймеров Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA-MM для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом NASBA в режиме «реального времени».Example 2. Amplification and detection of specific fragments of 23S rRNA using the developed set of primers Burk23SrRNA-T7-P1 / Burk23SrRNA-P2 and fluorescently labeled probe Burk23SrRNA-MM to identify causative agents of glanders and melioidosis by NASBA in real time.
Для проведения NASBA в режиме «реального времени» с разработанными праймерами Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и олигонуклеотидным зондом Burk23SrRNA-MM необходимо отдельно приготовить раствор ферментов и реакционную смесь, содержащую все остальные компоненты реакции.For real-time NASBA with the developed Burk23SrRNA-T7-P1 / Burk23SrRNA-P2 primers and the Burk23SrRNA-MM oligonucleotide probe, it is necessary to separately prepare the enzyme solution and the reaction mixture containing all other reaction components.
Реакционная смесь объемом 12.3 мкл (из расчета на одну пробу) включала следующие компоненты: 40 мМ Tris-HCl (рН=8,5), 1 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов («Fermentas», США), 2 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов («Fermentas», США), 12 мМ MgCb («Dialat Ltd», Россия), 87 мМ KCl («Sigma-ALDRICH», Германия), 0.5 мМ DTT («Fermentas», США), 15% ДМСО («АррНСЬет», Германия), 0.125 мкМ прямого и обратного праймеров и 0.0625 мкМ флуоресцентно-меченого зонда. Полученную реакционная смесь выдерживали при температуре 65°С в течение 5 мин.The reaction mixture with a volume of 12.3 μl (per sample) included the following components: 40 mM Tris-HCl (pH = 8.5), 1 mM each of deoxynucleoside triphosphates (Fermentas, USA), 2 mm each of ribonucleoside triphosphates (Fermentas ”, USA), 12 mM MgCb (Dialat Ltd, Russia), 87 mM KCl (Sigma-ALDRICH, Germany), 0.5 mM DTT (Fermentas, USA), 15% DMSO (ArrNset, Germany) ), 0.125 μM forward and reverse primers, and 0.0625 μM fluorescently-labeled probe. The resulting reaction mixture was kept at 65 ° C for 5 minutes.
Раствор ферментов объемом 2.7 мкл (из расчета на одну пробу) включал следующие компоненты: 2.1 мкг BSA («Fermentas», США), 0.08 активных единиц RNase Н («Thermo Scientific)), США), 6.4 активных единиц AMV Reverse Transcriptase («Promega», США), 32 активные единицы Т7 RNA Polymerase («Thermo Scientific)), США).An enzyme solution with a volume of 2.7 μl (per sample) included the following components: 2.1 μg BSA (Fermentas, USA), 0.08 active units of RNase H (Thermo Scientific), USA, 6.4 active units of AMV Reverse Transcriptase (" Promega ", USA), 32 active units of T7 RNA Polymerase (" Thermo Scientific)), USA).
В микроцентрифужные пробирки объемом 0,2 мл вносили 12.3 мкл приготовленной реакционной смеси и 5 мкл экстракта РНК анализируемых образцов, после чего термостатировали в следующем режиме: 65°С - 5 мин, 41°С - 5 мин. По окончании инкубации добавляли раствор ферментов и устанавливали пробирки в амплификатор. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли РНК-буфер.12.3 μl of the prepared reaction mixture and 5 μl of RNA extract of the analyzed samples were added to 0.2 ml microcentrifuge tubes, after which they were thermostated in the following mode: 65 ° С for 5 min, 41 ° С for 5 min. At the end of the incubation, an enzyme solution was added and the tubes were installed in an amplifier. As a negative control, RNA buffer was added to the reaction mixture.
Реакцию транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» проводили на приборе «Rotor-Gene Q» («QIAGEN GmbH», Германия) в изотермических условиях: 41°С - 5 мин, затем 95 циклов (41°С - 60 с) с детекцией интенсивности флуоресцентного сигнала.The real-time NASBA transcriptional amplification reaction was performed on a Rotor-Gene Q instrument (QIAGEN GmbH, Germany) under isothermal conditions: 41 ° C for 5 min, then 95 cycles (41 ° C for 60 s) s detection of the intensity of the fluorescent signal.
Регистрацию результатов проводили в графической и табличной форме. Детекцию продукта амплификации участка 23SpPHK В. mallei и В. pseudomallei для флуорофора FAM осуществляли по каналу Green. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала установленную на определенном уровне пороговую линию, что соответствует наличию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов.The results were recorded in graphical and tabular form. The amplification product of the 23SpPHK region of B. mallei and B. pseudomallei for the FAM fluorophore was detected via the Green channel. The result was considered positive if the fluorescence accumulation curve for the corresponding sample had a characteristic "sigmoid" shape and crossed the threshold line set at a certain level, which corresponds to the presence of the threshold cycle value "Ct" in the corresponding column in the results table.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» с помощью разработанного набора олигонуклеотидных праймеров Burk23SrRNA-T7-P l/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA -ММ для идентификации РНК В. mallei и В. pseudomallei.Example 3. Determination of the sensitivity and specificity of the reaction of transcriptional amplification of NASBA in real time using the developed set of oligonucleotide primers Burk23SrRNA-T7-P l / Burk23SrRNA-P2 and fluorescence-labeled probe Burk23SrRNA-MM for RNA identification of B. mallei and B. pseudomallei.
Чувствительность реакции транскрипционной амплификации NASBA с разработанным набором олигонуклеотидных праймеров Burk23SrRNA-T7-Pl/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA-MM оценивали при исследовании десятикратных разведений препаратов РНК, полученных из чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза. Штаммы буркхольдерий выращивали на плотных питательных средах в течение 1-2 суток. Готовили бактериальные взвеси клеток в 4 мл 0,15 М раствора натрия хлорида в концентрации 1×109 м.к./мл по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (10МЕ).The sensitivity of the NASBA transcriptional amplification reaction with the developed set of Burk23SrRNA-T7-Pl / Burk23SrRNA-P2 oligonucleotide primers and the Burk23SrRNA-MM fluorescently labeled probe was evaluated by studying ten-fold dilutions of RNA preparations obtained from pure cultures of sap pathogens and sap. Burkholder strains were grown on solid nutrient media for 1-2 days. Bacterial cell suspensions were prepared in 4 ml of a 0.15 M sodium chloride solution at a concentration of 1 × 10 9 MK / ml according to the industry standard sample of turbidity of 10 units of FSBI NTsESMP (OSO 42-28-85-P (10ME).
Предварительную инактивацию образцов и выделение нуклеиновых кислот проводили в условиях, регламентированных СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности» и методическими указаниями МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Процедуру выделения нуклеиновых кислот из исследуемого материала осуществляли с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. Постановку реакции NASBA в режиме «реального времени» проводили, как описано в примере 2.The preliminary inactivation of the samples and the isolation of nucleic acids were carried out under the conditions regulated by SP 1.3.3118-13 “Safety of work with microorganisms of pathogenicity groups I-II” and guidelines of MU 1.3.2569-09 “Organization of the work of laboratories using nucleic acid amplification methods during operation with material containing microorganisms of I-IV pathogenicity groups. " The procedure for isolating nucleic acids from the test material was carried out using the RIBO-prep kit (FBUN Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) according to the manufacturer's instructions. The formulation of the NASBA reaction in real time was carried out as described in example 2.
Измерение концентрации РНК проводили при помощи коммерческого набора «Qubit™ RNA HS Assay Kit» («Invitrogen», США) и флуориметра «QUBIT 2.0» («Invitrogen», США). Определение количества тотальной РНК осуществляли в пробах чистых культур В. mallei и В. pseudomallei, выделенных из концентрации 1×108 м.к./мл, а затем проводили последовательные десятикратные разведения образцов нуклеиновых кислот.RNA concentration was measured using a commercial Qubit ™ RNA HS Assay Kit (Invitrogen, USA) and a QUBIT 2.0 fluorimeter (Invitrogen, USA). The amount of total RNA was determined in samples of pure cultures of B. mallei and B. pseudomallei, isolated from a concentration of 1 × 10 8 MK / ml, and then sequential ten-fold dilutions of nucleic acid samples were performed.
В результате была определена чувствительность реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» с разработанным набором олигонуклеотидов, составившая 0.4 фг/мкл тотальной РНК в образце, что соответствовало 101 м.к./мл (рис. 1).As a result, the sensitivity of the “real-time” NASBA transcriptional amplification reaction with the developed set of oligonucleotides was determined, which amounted to 0.4 fg / μl of total RNA in the sample, which corresponded to 10 1 μm / ml (Fig. 1).
Рисунок 1 отображает график нарастания кривых флуоресценции, полученных при амплификации РНК штаммов В. mallei 10230 и В. pseudomallei С-141 с помощью сконструированных праймеров Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и зонда Burk23SrRNA-ММ (1 - В. mallei 10230 в концентрации 102 м.к./мл, 2 - В. pseudomallei С-141 в концентрации 102 м.к./мл, 3-B. mallei 10230 в концентрации 101 м.к./мл, 4 - В. pseudomallei С-141 в концентрации 101 м.к./мл, 5 - отрицательный контроль).Figure 1 shows a graph of the increase in fluorescence curves obtained by amplification of RNA of B. mallei 10230 and B. pseudomallei C-141 strains using the designed primers Burk23SrRNA-T7-P1 / Burk23SrRNA-P2 and the Burk23SrRNA-MM probe (1 - B. mallei 102 concentration of 10 2 mk / ml, 2 - B. pseudomallei С-141 at a concentration of 10 2 mk / ml, 3-B. mallei 10230 at a concentration of 10 1 mk / ml, 4 - V. pseudomallei C-141 at a concentration of 10 1 mk./ml, 5 - negative control).
Специфичность разработанного набора олигонуклеотидов оценена на коллекции из 58 штаммов микроорганизмов, из которых 14 штаммов В. mallei, 20 штаммов В. pseudomallei и 24 штаммов гетерологичных микроорганизмов (12 штаммов Burkholderia cepacia, 5 штаммов Burkholderia thailandensis и по 1 штамму Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Echerichia coli). Оценка специфичности показала отсутствие перекрестных реакций с гетерологичными штаммами и наличие специфической амплификации со всеми штаммами В. mallei и В. pseudomallei.The specificity of the developed set of oligonucleotides was evaluated on a collection of 58 strains of microorganisms, of which 14 strains of B. mallei, 20 strains of B. pseudomallei and 24 strains of heterologous microorganisms (12 strains of Burkholderia cepacia, 5 strains of Burkholderia thailandensis, and 1 strain of Pseudomonasasensugensaensugensaensugensaensugensa aerugensa Pseudomonas putida, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Echerichia coli). Assessment of specificity showed the absence of cross-reactions with heterologous strains and the presence of specific amplification with all strains of B. mallei and B. pseudomallei.
Таким образом, разработанный набор олигонуклеотидных праймеров Burk23SrRNA-T7-P1/Burk23SrRNA-P2 и флуоресцентно-меченого зонда Burk23SrRNA-MM может быть использован для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом транскрипционной амплификации NASBA в режиме «реального времени» и позволяет в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать РНК В. mallei и В. pseudomallei в пробах чистых культур, биологическом материале и объектах окружающей среды.Thus, the developed set of oligonucleotide primers Burk23SrRNA-T7-P1 / Burk23SrRNA-P2 and a fluorescently labeled probe Burk23SrRNA-MM can be used to identify glanders and melioidosis by NASBA transcription amplification in real time with a short time and allows sensitivity and specificity to detect RNA of B. mallei and B. pseudomallei in samples of pure cultures, biological material and environmental objects.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118282A RU2699180C1 (en) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Set of oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for identifying rnas of burkholderia mallei sap excretion and burkholderia pseudomallei melioidosis based on transcription amplification (nasba) in real time mode |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118282A RU2699180C1 (en) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Set of oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for identifying rnas of burkholderia mallei sap excretion and burkholderia pseudomallei melioidosis based on transcription amplification (nasba) in real time mode |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2699180C1 true RU2699180C1 (en) | 2019-09-03 |
Family
ID=67851850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018118282A RU2699180C1 (en) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Set of oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for identifying rnas of burkholderia mallei sap excretion and burkholderia pseudomallei melioidosis based on transcription amplification (nasba) in real time mode |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2699180C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011146756A1 (en) * | 2010-05-19 | 2011-11-24 | The Translational Genomics Research Institute | Methods and kits useful in the differentiation of burkholderia species |
| RU2545710C2 (en) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Oligonucleotide primers burk1526s/burk1526as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia |
| AU2013262783B2 (en) * | 2012-05-15 | 2018-03-29 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University | Primers, assays and methods for detecting Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei |
-
2018
- 2018-05-17 RU RU2018118282A patent/RU2699180C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011146756A1 (en) * | 2010-05-19 | 2011-11-24 | The Translational Genomics Research Institute | Methods and kits useful in the differentiation of burkholderia species |
| AU2013262783B2 (en) * | 2012-05-15 | 2018-03-29 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Northern Arizona University | Primers, assays and methods for detecting Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei |
| RU2545710C2 (en) * | 2013-07-26 | 2015-04-10 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Oligonucleotide primers burk1526s/burk1526as for assessment of adaptive variability of genome of pathogenic burkholderia |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| САВЧЕНКО С.С. Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Авто диссертации. ВАК РФ 03.00.07, Микробиология. ВОЛГОГРАД - 2008. * |
| САВЧЕНКО С.С. Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Автореферат диссертации. ВАК РФ 03.00.07, Микробиология. ВОЛГОГРАД - 2008. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Uphoff et al. | Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures | |
| JP6335119B2 (en) | Direct amplification and detection of viral and bacterial pathogens | |
| CN108546736A (en) | Composition and method for the nucleic acid sequence in detection and identification biological sample | |
| TW201706414A (en) | Nucleic acid detection and quantification method and compositions | |
| JP4903722B2 (en) | Method for detecting live cells in a sample by using a virus | |
| US20080090224A1 (en) | Nucleic acid detection | |
| JP2023536962A (en) | Compositions and methods for the detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-2), influenza A and influenza B | |
| US11041216B2 (en) | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples | |
| JP2014501494A (en) | Quantitative multiple identification of nucleic acid targets | |
| RU2551208C1 (en) | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF Burkholderia mallei AND ITS DIFFERENTIATION FROM Burkholderia pseudomallei | |
| CN106916903A (en) | The real-time fluorescence RT PCR detection methods and kit of mycobacterium tuberculosis 85B mRNA | |
| RU2699180C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and a fluorescent-labeled probe for identifying rnas of burkholderia mallei sap excretion and burkholderia pseudomallei melioidosis based on transcription amplification (nasba) in real time mode | |
| JP2009039105A (en) | Oligonucleotide for detection of acid-fast bacterium and use thereof | |
| AU2019375773B2 (en) | Rapid PCR methodology | |
| WO2019163672A1 (en) | Primer set for detecting trichophyton gene by lamp method, kit including same, and method for detecting trichophyton using same | |
| Zhuang et al. | Unique Barcoded Primer-Assisted Sample-Specific Pooled Testing (Uni-Pool) for Large-Scale Screening of Viral Pathogens | |
| US20120082995A1 (en) | Method for quantitative pcr amplification of deoxyribonucleic acids from a sample containing pcr inhibitors | |
| RU2738358C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescent-labelled probes and method for detecting dna of agents of glanders and melioidosis by pcr method with product detection in real time | |
| RU2556810C1 (en) | SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND FLUORESCENTLY LABELLED PROBE FOR IDENTIFICATION OF Burkholderia pseudomallei | |
| US20170283888A1 (en) | Use of rnase h for the selective amplification of viral dna | |
| JP7472476B2 (en) | Primers and method for detecting Bordetella pertussis rRNA | |
| RU2776163C1 (en) | Method for identifying the dna of bacterium mycobacterium tuberculosis using isothermal loop-mediated amplification | |
| RU2737396C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and a fluorescence-labeled probe for identifying west nile virus lineage 4 | |
| WO2017091809A1 (en) | Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples | |
| RU2439159C1 (en) | OLIGONUCLEOTIDE PROBE FOR IDENTIFICATION OF CAUSATIVE AGENTS OF GLANDERS AND MELIOIDOSIS B. pseudomallei AND B. mallei |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200518 |