RU2661022C2 - Изоформы тропомиозина, связанные с болезнью альцгеймера и умеренными когнитивными нарушениями - Google Patents
Изоформы тропомиозина, связанные с болезнью альцгеймера и умеренными когнитивными нарушениями Download PDFInfo
- Publication number
- RU2661022C2 RU2661022C2 RU2014152876A RU2014152876A RU2661022C2 RU 2661022 C2 RU2661022 C2 RU 2661022C2 RU 2014152876 A RU2014152876 A RU 2014152876A RU 2014152876 A RU2014152876 A RU 2014152876A RU 2661022 C2 RU2661022 C2 RU 2661022C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mci
- tropomyosin
- exon
- patients
- disease
- Prior art date
Links
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 title claims abstract description 56
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 title claims abstract description 42
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 title abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 claims description 38
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 25
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 claims description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 6
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 6
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 4
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000002349 difference gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 3
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 2
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGFIOWHPOGLXPU-UHFFFAOYSA-L 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline 4',4''-disulfonate Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)[O-])=CC=C1C1=CC=NC2=C1C=CC1=C(C=3C=CC(=CC=3)S([O-])(=O)=O)C=CN=C21 HGFIOWHPOGLXPU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010009244 Claustrophobia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000003802 alpha-Synuclein Human genes 0.000 description 1
- 108090000185 alpha-Synuclein Proteins 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007131 anti Alzheimer effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000164 antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- BUGYDGFZZOZRHP-UHFFFAOYSA-N memantine Chemical compound C1C(C2)CC3(C)CC1(C)CC2(N)C3 BUGYDGFZZOZRHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004640 memantine Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 230000003557 neuropsychological effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 208000019899 phobic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000000310 rehydration solution Substances 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- YAYGSLOSTXKUBW-UHFFFAOYSA-N ruthenium(2+) Chemical compound [Ru+2] YAYGSLOSTXKUBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- -1 urea cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2821—Alzheimer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу обнаружения пациентов с подозрением на болезнь Альцгеймера (AD) или умеренные когнитивные нарушения (MCI) in vitro, включающему сравнение уровня экспрессии изоформы тропомиозина Р09493-3 в образце от пациента с контрольным значением, где увеличение уровня экспрессии Р09493-3 является показателем AD или MCI. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В связи с увеличением продолжительности жизни связанные со слабоумием заболевания становятся в глобальном масштабе основной статьей расходов медицинского характера для медицинских бюджетов и являются стрессом для лиц, осуществляющих уход за страдающими этими заболеваниями пациентами, и для семей пациентов. Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой наиболее распространенную нейродегенеративную патологию, и для поиска способов лечения и улучшенных способов диагностики для скрининга и лечения пациентов постоянно прилагаются усилия. Хотя психометрические тесты, такие как краткая оценка когнитивных функций, как правило, хорошо предсказывают AD, вскрытие остается единственным однозначным способом диагностики болезни Альцгеймера. Потеря памяти является обычным феноменом среди пожилых людей. Если тяжелая потеря памяти является преобладающим симптомом, то это состояние называется умеренным когнитивным нарушением (MCI) и часто рассматривается как очень ранняя стадия AD. На этой стадии лечение может быть более эффективным, чем на более поздней стадии. Скорость перехода пациентов с MCI в клиническую AD составляет 50% в течение 3 лет (Karas et al., 2008). В настоящее время в диагностической медицине все активнее применяют белковые биомаркеры. Идентификация белков биомаркеров AD, особенно тех, которые присутствуют в легкодоступных биологических жидкостях, таких как кровь и моча, представляют желаемую и эффективную альтернативу современным способам диагностики. Тропомиозин представляет собой волокнистую молекулу, которая состоит из двух альфа-спиралей. Он широко распространен во всех типах клеток, где он регулирует сокращение актиновых и миозиновых мышечных филаментов. У млекопитающих дифференциальный сплайсинг четырех высококонсервативных генов может привести к более чем 40 изоформам (Schevzov et al., 2005). Кроме того, каждая изоформа может в различной степени подвергаться посттрансляционным модификациям, в том числе фосфорилированию и гликозилированию. Два наиболее распространенных аналитических метода, используемых в разделении и идентификации белков, представляют собой двухмерный гель-электрофорез (2-D DIGE) и 2D вестерн-блоттинг. В ЕР 2293075 с использованием 2-D DIGE для выявления возможных биомаркеров AD в образцах тромбоцитов были выявлены две изоформы тропомиозина, обозначенные как номер доступа Swissprot/UniProt Р07951 и номер доступа NCBI/Genbank ВАВ14554/AK023385.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает способы и наборы для обнаружения связанных с MCI и AD изоформ тропомиозина, включающих экзон 1а и, необязательно, экзон 9d. В соответствии с первым аспектом изобретение обеспечивает способ для содействия диагностике болезни Альцгеймера (AD) или умеренных когнитивных нарушений (MCI) in vitro, включающий определение уровня экспрессии одной или более изоформ тропомиозина, соответствующих Р09493-3 и/или Р09493-1, в образце от пациента.
В соответствии со вторым аспектом изобретение обеспечивает набор, включающий зонды, которые связывают изоформы тропомиозина Р09493-3 и Р09493-1, где первый зонд связывает общий эпитоп Р09493-3 и Р09493-1, который не включает экзон 1а, и второй зонд специфически связывает экзон 1а.
В соответствии с третьим аспектом изобретение обеспечивает агент, который изменяет уровни концентрации одной или более изоформ тропомиозина Р09493-3 и Р09493-1, для применения в лечении AD или MCI.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 показывает окрашивание рутением антител против экзонов 1а и 9d;
Фиг. 2 показывает оценку методом 2D вестерн-блоттинга антитела против экзона 1а; и
Фиг. 3 показывает оценку методом 2D вестерн-блоттинга антитела против экзона 9d.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Если не указано иное, ссылка на экзоны 1а и 9d относится к последовательностям аминокислот, показанным ниже:
экзон 1: -Leu-Asp-Lys-Glu-Asn-Ala-Leu-Asp-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Glu-Ala-Asp-Lys-Lys-Ala-Ala- (SEQ ID NO: 1)
экзон 9d: -Glu-Lys-Val-Ala-His-Ala-Lys-Glu-Glu-Asn-Leu-Ser-Met-His-Gln-Met-Leu-Asp-Gln-Thr-Leu-Leu-Glu-Leu-Asn-Asn-Met- (SEQ ID NO: 2)
Термины "пациент" и "субъект" в настоящем документе применяются взаимозаменяемо и относятся к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь людьми, приматами, не являющимися людьми, собаками, кошками, грызунами и подобными животными, которые должны быть подвержены диагностике. Предпочтительно, субъект или пациент является человеком. Термины "лекарство" и "агент" в настоящем документе применяются взаимозаменяемо и относятся к химическому или биологическому веществу, которое оказывает эффект на биологическую систему. В настоящем документе термин "изоформы тропомиозина" включает все белки на основе тропомиозина, включая белки, образованные в результате дифференциального сплайсинга генов, и формы с пост-трансляционными модификациями. Три изоформы тропомиозина, соответствующие пятнам 2, 3 и 4 на Фиг. 1, 2 и 3, на основании данных 2D-WB и масс-спектрометрии были соотнесены с номером доступа UniprotKB (UniprotKB; www.uniprot.org/uniprot) Р09493-3; ссылка на Р09493-3 в настоящем документе, таким образом, подразумевает пятна 2, 3 и 4, если не указано иное. Ссылка на Р09493 в настоящем документе подразумевает Р09493-3 (пятна 2, 3 и 4) и Р09493-1; ссылка на Р09493-1 в настоящем документе соответствует описанию в UniprotKB и соответствует пятну 1.
В соответствии с первым аспектом изобретение обеспечивает способ для содействия диагностике умеренных когнитивных нарушений (MCI) и/или болезни Альцгеймера (AD), включающий обнаружение и измерение уровня экспрессии одной или более изоформ, выбранных из Р09493 и/или ее аналогов с пост-трансляционными модификациями, в образце от пациента in vitro. В предпочтительном варианте воплощения, изоформы тропомиозина, которые должны быть обнаружены и измерены, соответствуют одной или более из изоформ Р09493-3 (пятна 2, 3 и 4). В настоящем документе уровень экспрессии или экспрессионный уровень относится к количеству конкретного белка или мРНК, кодирующей белок. Р09493 может быть использован с другими биомаркерами MCI и AD для увеличения диагностических возможностей тестов на AD или MCI. Белки биомаркеры не применяют отдельно от других методов диагностики, и специалисту в данной области техники известно, что при применении Р09493 в диагностике MCI или AD диагностика также будет включать клиническую оценку пациента с применением физических и когнитивных тестов, таких как MMSE, для содействия в классификации пациентов как имеющих AD или MCI. В зависимости от диагностических возможностей биомаркеров, применяемых вместе с Р09493 (оцененных, например, с помощью анализа кривой ROC, по чувствительности и специфичности), возможно, биохимический тест с биомаркерами станет главным диагностическим инструментом для диагностики AD или MCI. Изоформы тропомиозина для обнаружения включают экзон 1а и, необязательно, экзон 9d; изоформы тропомиозина Р09493-3 включают экзоны 1а и 9d, в то время как изоформа тропомиозина Р09493-1 включает экзон 1а, но не экзон 9d. Изоформы тропомиозина для обнаружения и измерения предпочтительно происходят из тромбоцитов из образца крови пациента. Для пациентов с MCI и AD было показано, что концентрация Р09493 значительно увеличена по сравнению с контрольным значением.
Предпочтительно, контрольное значение представляет собой концентрацию Р09493 в образце, предпочтительно образце тромбоцитов, полученном от здорового субъекта. Альтернативно, контроль может представлять собой ссылочное значение. Тромбоциты, которые используют в измерении для потенциальных пациентов с AD и здоровых контролей, предпочтительно получены с помощью способа, описанного в ЕР 1891445, который описывает способ, который приводит к выделению неактивированных тромбоцитов из образца крови. Контрольные данные также могут представлять собой значения для образцов, полученных от пациентов с MCI/AD до наступления MCI/AD. Применение наборов контрольных данных, которые были ранее получены и архивированы, является обычной практикой в таких способах диагностики с биомаркерами. В предпочтительном варианте воплощения увеличение уровня экспрессии одной или более изоформ тропомиозина по сравнению с контрольным значением является показателем AD или MCI. Способ согласно изобретению необязательно может дополнительно включать лечение пациента, у которого была диагностирована AD или MCI (или для которого способ согласно изобретению показал вероятность AD или MCI), агентом, который изменяет уровень концентрации Р09493.
Во втором аспекте изобретение обеспечивает набор, включающий первый зонд, который специфически распознает экзон 1а, и второй зонд, который специфически распознает общий эпитоп Р09493-3 и Р09493-1, который не включает экзон 1а, для применения в диагностике MCI и AD. Для целей диагностики AD или MCI второй зонд может быть специфичным к экзону 9d. Специфичность подразумевает, что в пределах диапазона обнаружения теста зонды по существу обнаруживают только Р09493, т.е. любое связывание зондами белков, отличающихся от Р09493, находится на таком низком уровне, который не влияет на результат диагностики. Зонды предпочтительно представляют собой антитела.
В настоящем документе термин "антитело" относится к иммуноглобулину, который специфически распознает эпитоп на мишени, что определяется характеристиками связывания вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (VНS и VLS), более конкретно, их определяющих комплементарность районов (CDRs). В уровне техники известно множество потенциальных форм антител, которые могут включать, без ограничения, множество интактных моноклональных антител или смеси поликлональных антител, включая интактные моноклональные антитела, фрагменты антител (например, фрагменты Fab, 
и Fr, линейные антитела, одноцепочечные антитела и мультиспецифические антитела, включающие фрагменты антител), одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFvS), мультиспецифические антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела и слитые белки, включающие домены, необходимые для распознавания заданного эпитопа на мишени. Предпочтительно, ссылка на антитела в контексте настоящего изобретения относится к моноклональным антителам. Антитела также могут быть конъюгированы с различными репортерными фрагментами для диагностики, включая, но не ограничиваясь радионуклидами, флуорофорами или красителями. Ссылка на антитела также включает короткоцепочечные вариабельные фрагменты и другие варианты подструктур целых антител. Специалисту в данной области понятно, что антитела для применения в способах и наборах согласно изобретению должны распознавать экзон lа и, необязательно, 9d. Для такого распознавания каждое специфичное к экзону антитело распознает целую последовательность аминокислот экзона или часть последовательности экзона. Например, часть экзона lа, распознаваемая антителом, может включать только 7 аминокислот, но при этом быть специфичной для экзона lа. Другие зонды, подходящие для применения в изобретении, представляют собой молекулы, способные распознавать Р09493, такие как аптамеры, полимеры с молекулярным импринтингом и т.д.
Третий аспект изобретения направлен на применение агента, который изменяет уровень концентрации Р09493; такое применение относится к лечению для облегчения или подавления симптомов MCI и AD.
Изобретение также обеспечивает способ лечения MCI и/или AD, включающий (i) определение, является ли уровень экспрессии одной или более изоформ тропомиозина, соответствующих Р09493-3 и/или Р09493-1, в образце от пациента увеличенным по сравнению с контролем; и (ii) введение агента, который изменяет уровень концентрации Р09493.
Содержание всех публикаций, цитированных в настоящем документе, включено в настоящий документ посредством ссылки.
Изобретение проиллюстрировано со ссылкой на прилагаемые чертежис помощью следующих неограничивающих примеров.
ПРИМЕРЫ
Способы
Популяция для исследования
Пациенты с болезнью Альцгеймера: в исследование были включены сорок семь пациентов с AD. Набор нейрофизиологических тестов CERAD (Консорциум для разработки регистра болезни Альцгеймера) проводили в день взятия образцов крови. Никто из пациентов не подвергался лечению препаратами против AD, например ингибиторами ацетилхолинэстеразы или мемантином. Более того, пациенты с деменцией не получали систематическое хроническое лечение антипсихотическими лекарствами, которое могло повлиять на экспрессию Мао-В. Чтобы исключить другие причины когнитивных нарушений (например, инсульт или опухоль), все пациенты прошли структурную визуализацию сканированием мозга (магнитно-резонансная томография), за исключением двух пациентов, которые вместо этого подверглись компьютерной томографии (клаустрофобия, металлический имплантат). На основе критериев CERAD (http://cerad.mc.duke.edu/Assesment.htm/), например истории болезни, визуализации мозга и набора нейрофизиологических тестов CERAD, были поставлены следующие диагнозы: 47 AD (9 подтверждены аутопсией). Посмертное невропатологическое обследование проводили всего для 13 пациентов. Пациенты умерли через 10-18 месяцев после отбора образцов крови. Для 9 из 47 пациентов с клиническим подозрением на AD клинический диагноз был подтвержден невропатологическим обследованием и у четырех из 13 пациентов сосудистая деменция (VD) соответствовала невропатологическим критериям для деменции смешанного типа (AD и VD). Невропатологическое обследование в соответствии со стандартным протоколом включало окрашивание гематоксилином/эозином, модифицированную импрегнацию по Бильшовскому и иммуногистохимический анализ на белок тау (антитело АТ-8, Innogenetics, Ghent, Belgium), β-амилоид (клон 4G8, Signet Labs, Dedham, MA) и альфа-синуклеин (моноклональные и поликлональные антитела, Chemicon, Temecula, СА). Невропатологический диагноз ставили в соответствии с признанным патологоанатомическим единым критерием для AD, включающим шкалу CERAD. Образцы от пациентов с AD продемонстрировали невропатологическую картину CERAD С и стадий по Braak V/VI, что соответствовало высокой вероятности AD в соответствии с критерием «деменции» института NIA-Reagan. Контроли: соответствующая по полу и возрасту группе с AD контрольная группа из 49 субъектов без признаков нейродегенеративного заболевания или когнитивных нарушений. Всех субъектов опрашивали, и опытные психологи проводили их нейропсихологическое обследование (MMSE). Все индивидуумы, включенные в исследование, были некурящими. Умеренные когнитивные нарушения определяли в соответствии с Petersen et al. (1999 & 2004).
Этические аспекты исследования
Методика исследования была одобрена местной комиссией по вопросам этики, и исследование проводили в соответствии с принципами Хельсинкской декларации в редакции 2000 г. От каждого субъекта или от его представителя после объяснения целей и процедуры исследования было получено информированное согласие.
Получение образцов
Кровь собирали без стаза из латеральной подкожной вены руки в вакуумные пробирки (Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria), содержащие 0,129 моль/л цитрата натрия в качестве антикоагулянта (соотношение для смешивания с кровью 1: 9). Первую пробирку с собранной кровью отбраковывали, чтобы исключить какое-либо загрязнение тканью при венепункции. Дифференциальную гемограмму измеряли с использованием анализатора крови MicroDiff 18 (Coulter Electronics, Miami, FL, USA). Выделение тромбоцитов и выделение белка проводили, как описано ранее [31]. Кратко, осадок растворяли в денатурирующем буфере для образцов 2-D, содержащем 7 М мочевину, 2 М тиомочевину, 4% CHAPS, 20 мМ Трис-HCl (pH 8,5) при встряхивании в течение ночи при 4°C. На 100×106 тромбоцитов использовали семьдесят микролитров буфера для образцов. Концентрацию белка в растворенных образцах определяли в трех повторах с помощью набора для анализа белка с кумасси бриллиантовым голубым с BSA в качестве стандартного белка (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). При соответствующем разбавлении компоненты буфера для образцов 2-D не мешают анализу белка. Таким образом, образцы разбавляли 1:20 в PBS и 5% буфера для образцов 2-D добавляли к стандартам BSA. Внутренние стандарты для анализа 2D DIGE получали, отбирая то же количество общего белка от каждого из образцов для исследования. Аликвоты внутреннего стандарта и индивидуальные образцы для исследования хранили при -80°C. Мечение белка флуоресцентным цианиновым красителем (CyDyes, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) проводили до электрофореза в соответствии с инструкциями производителя с минимальными изменениями. Соотношение CyDye к белку было уменьшено до 5 пмоль красителя на мкг белка. Внутренний стандарт метили Су2, а образцы метили альтернативно Су3 или Су5. Для ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR) общую РНК экстрагировали из подвергнутых гель-фильтрации тромбоцитов, как описано ранее.
Электрофорез 2D DIGE и анализ изображения геля
Электрофорез и обработку изображения геля проводили, как описано ранее. Кратко, 24 см pH 4-7 9 IPG-Drystrips пассивно регидратировали в модифицированном растворе для регидратации (7 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% CHAPS, 70 мМ DTT и 0,5% амфолитов с pH 4-7), включающем меченный красителем образец. Затем с помощью пассивной регидратации было нанесено 25 мкг меченного красителем белка. Изоэлектрофокусирование проводили до достижения 30 киловольт-часов. Во втором направлении проводили 11,5% SDS-PAGE (35 В в течение 1 ч, 50 В в течение 1,5 ч и, наконец, ПО В в течение 16,5 ч при 10°C), и гели сканировали при разрешении 100 мкм с помощью сканера Typhoon 9410 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Обнаружение пятен на изображениях гелей проводили с помощью модуля Differential In-gel Analysis программного обеспечения DeCyder (версия 6.00.28; GE Healthcare, Uppsala, Sweden), устанавливая количество пятен 2500. Каждый гель добавляли в соответствующую рабочую среду и группу и выравнивали с эталонным гелем с помощью модуля Biological Variation Analysis программного обеспечения DeCyder (версия 6.01.02). Процедура анализа изображения геля описана в подробностях ранее.
Идентификация белков
Белки идентифицировали с помощью масс-спектрометрии. Получение гидролизатов белка трипсином для последующих стадий проводили, как описано ранее. Пептиды наносили на колонку Zorbax 300SB-C8 (5 мкм, 0,3 мм×5 мм) и разделяли с помощью нанопроточной жидкостной хроматографии (система 1100 Series LC, Agilent, Palo Alto, CA) на колонке Zorbax 300SB-C18 (5 мкм, 75 мкм×150 мм) при скорости потока 250 нл/мин с помощью градиента от 0,2% муравьиной кислоты и 3% ацетонитрила до 0,2% муравьиной кислоты и 45% ацетонитрила в течение 12 мин. Идентификацию пептидов проводили методом тандемной масс-спектрометрии с фрагментацией (MS/MS) с масс-спектрометром ионной ловушкой (ХСТ - Plus, Agilent), оснащенным ортогональным источником ионов с нанораспылением. Данные MS/MS интерпретировали с помощью программного обеспечения Spectrum Mill MS Proteomics Workbench (версия A.03.03, Agilent), поиск проводили в базе данных SwissProt для белков человека (версия 14.3, включающая 20328 записей), устанавливая для предшественника отклонение массы 1,5 Да, допустимое отклонение массы продукта 0,7 Да и минимальную интенсивность совпавших пиков (% SPI) 70%, и одно пропущенное расщепление. Из-за предшествующей химической модификации карбамидометилирование цистеинов установили в качестве постоянной модификации. Уровень ложноположительных результатов для пептидов с оценкой более 13 составлял менее 1%, что давало достоверность более 99,9% для белков, которые идентифицировали по двум или более пептидам с оценкой более 13.
Получение антител
Овец ежемесячно иммунизировали пептидами с последовательностями, соответствующими H-Cys-Leu-Asp-Lys-Glu-Asn-Ala-Leu-Asp-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Glu-Ala-Asp-Lys-Lys-Ala-Ala-NH2 и H-Cys-Glu-Lys-Val-Ala-His-Ala-Lys-Glu-Glu-Asn-Leu-Ser-Met-His-Gln-Met-Leu-Asp-Gln-Thr-Leu-Leu-Glu-Leu-Asn-Asn-Met-OH, конъюгированными с бычьим сывороточным альбумином (BSA) через N-концевые остатки цистеина. Полученные иммуногены ежемесячно вводили взрослым овцам для получения поликлональных антител. Затем были выделены лимфоциты, которые сливали с клетками гетеромиеломы. Супернатанты из полученных гибридом скринировали на присутствие специфичных к экзонам антител с применением основанных на ELISA анализах, в которых планшеты для микротитрования были покрыты полноразмерным белком. Положительные гибридомы клонировали для получения стабильных линий. Антитела, вырабатываемые полученными моноклональными гибридомами, очищали, характеризовали методом одномерного и двумерного вестерн-блоттинга (ID и 2D WB) и применяли для разработки сэндвич-иммуноанализа на биочипах. Анализ применяли в анализаторе Evidence Investigator, который использует технологию микроматричных биочипов на основе принципов иммуноанализа ELISA (Fitzgerald et al., 2005).
Анализ методом двумерного вестерн-блоттинга
Для анализа методом 2D вестерн-блоттинга 30 мкг осажденного ТС А и растворенного в мочевине/тиомочевине/CHAPS белка тромбоцитов разделяли в первом направлении с помощью IEF на 24 см IPG полоске с pH 4-7 (GE Healthcare). Разделение во втором направлении проводили методом SDS PAGE в геле 13×16 см, и разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Pall, East Hills, NY). Весь белок на мембране окрашивали с помощью флуоресцентного красителя на основе рутений-(II)-трис-(батофенантролин дисульфоната) (RuBPS). Затем мембрану блокировали 5% раствором обезжиренного сухого молока в PBS, содержащим 0,3% Tween-20 (PBS-T), в течение 2 часов. Связанные с AD изоформы тропомиозина обнаруживали, инкубируя мембрану: а) для обнаружения анти-1а экзона применяли HRP-меченное антитело анти-1а экзон (1/1000), инкубация в течение 1 ч, обнаружение с помощью Luminol PLUS/пероксид, экспозиция 10 с; b) для обнаружения анти-9 с1 экзона применяли HRP-меченное антитело анти-9d экзон (1/1000), инкубация в течение 1 ч, обнаружение с помощью Luminol PLUS/ пероксид, экспозиция 30 с - 1 мин.
Результаты
Специфичное к экзону 9d антитело для захвата выбирали для иммобилизации на поверхности биочипа, и специфичное к экзону 1а обнаруживающее антитело конъюгировали с пероксидазой хрена для получения трейсера для анализа. Разработанный с использованием этих иммунореагентов иммуноанализ на биочипе имел специфичность к трем из четырех связанных с AD и MCI изоформ тропомиозина Р09493. Анализы методом ID и 2D вестерн-блоттинга подтвердили, что антитела, полученные к экзонам 1а и 9d, связывают пятна 2, 3 и 4 (Фиг. 1). Также было показано, что каждая из изоформ тропомиозина, уровень которых был повышен в образцах AD и MCI, включала экзон 1а. Уровень четырех других изоформ тропомиозина, определенных методом масс-спектрометрии, соответствующих пятнам 5, 6, 7 и 8 (Фиг. 1), которые не включали экзон 1а, не был повышен в образцах AD и MCI. Чувствительность анализа составляла <10 нг/мл (диапазон измерения 0-700 нг/мл), и точность в пределах одного измерения составляла <10% для стандартных концентраций. При используемых экспериментальных условиях пятно 1 имело pI=4,5 и MW=~37 кДа, пятно 2 имело pI=4,5 и MW=~37 кДа, пятно 3 имело pI=4,6 и MW=~35 кДа, и пятно 4 имело pI=4,56 и MW=-~33 кДа. В выделенных из крови тромбоцитах были обнаружены уровни до 12 мкг/мл. Таблица 1 (строка % изменения) подтверждает, что уровни изоформ тропомиозина Р09493, соответствующие пятнам 1, 2, 3 и 4, отдельно и в комбинации, повышены у пациентов с AD и MCI по сравнению с контролем. t-Тест подтвердил, что пятно 2 и комбинация всех четырех пятен значительно повышены у пациентов с AD и MCI по сравнению с контролем (P<0,05). Результаты этого исследование указывают, что обнаружение и измерение в образце от пациента с подозрением на AD или MCI повышения уровня изоформ тропомиозина Р09493-3 и Р09493-1 in vitro предсказывают AD и MCI.
Ссылки
Karas et al. (2008). Am. J. Neuroradiol, 29 (5): 944-949
Schevzov G. et al. (2005). J. Histochem. Cytochem., 53 (5): 557-570
Fitzgerald et al. (2005). Clin. Chem., 51 (7): 1165-1176
Petersen et al. (1999). Arch. Neurol, 56 (3): 303-308
Petersen et al. (2004). J. Intern. Med. 256 (3): 183-194.
Claims (6)
1. Способ обнаружения пациентов с подозрением на болезнь Альцгеймера (AD) или умеренные когнитивные нарушения (MCI) in vitro, включающий сравнение уровня экспрессии изоформы тропомиозина Р09493-3 в образце от пациента с контрольным значением, где увеличение уровня экспрессии Р09493-3 является показателем AD или MCI.
2. Способ по п. 1, где способ дополнительно содержит определение уровня экспрессии изоформы тропомиозина Р09493-1 в образце.
3. Способ по п. 1 или 2, где увеличение уровня экспрессии одной или более изоформ тропомиозина по сравнению с контрольным значением является показателем AD или MCI.
4. Способ по п. 1 или 2, где образец от пациента представляет собой образец крови, сыворотки, плазмы или тромбоцитов.
5. Набор для обнаружения пациентов с подозрением на болезнь Альцгеймера (AD) или умеренные когнитивные нарушения (MCI), включающий зонды, которые связывают изоформу тропомиозина Р09493-3, где первый зонд специфически связывает экзон 9d, и второй зонд специфически связывает экзон 1а.
6. Набор по п. 5, где зонды представляют собой антитела.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1212084.6 | 2012-07-06 | ||
| GBGB1212084.6A GB201212084D0 (en) | 2012-07-06 | 2012-07-06 | Tropomyosin isoforms related to alzheimers disease and mild cognitive impairment |
| PCT/EP2013/064397 WO2014006224A1 (en) | 2012-07-06 | 2013-07-08 | Tropomyosin isoforms related to alzheimers disease and mild cognitive impairment |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014152876A RU2014152876A (ru) | 2016-08-27 |
| RU2661022C2 true RU2661022C2 (ru) | 2018-07-11 |
Family
ID=46766286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014152876A RU2661022C2 (ru) | 2012-07-06 | 2013-07-08 | Изоформы тропомиозина, связанные с болезнью альцгеймера и умеренными когнитивными нарушениями |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9927429B2 (ru) |
| EP (2) | EP2870481B1 (ru) |
| JP (1) | JP6262727B2 (ru) |
| CN (1) | CN104487847B (ru) |
| AU (1) | AU2013285362B2 (ru) |
| BR (1) | BR112014033124A2 (ru) |
| CA (1) | CA2878418A1 (ru) |
| GB (1) | GB201212084D0 (ru) |
| RU (1) | RU2661022C2 (ru) |
| WO (1) | WO2014006224A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018008764A1 (ja) * | 2016-07-08 | 2018-01-11 | 味の素株式会社 | 軽度認知障害又はアルツハイマー型認知症の評価方法 |
| CN111323597A (zh) * | 2018-12-14 | 2020-06-23 | 陈志成 | 用于检测受试者中mci和/或ad的方法、试剂盒及筛选化合物的方法 |
| CN112858697B (zh) * | 2021-03-29 | 2024-03-01 | 鲁东大学 | ALG-2-interacting protein X在制备分子标志物中的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004113568A2 (fr) * | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Aventis Pharma S.A. | Méthodes de détection de la maladie d'alzheimer |
| WO2005050219A1 (de) * | 2003-10-22 | 2005-06-02 | Universität Leizig | Schnelltest zur diagnose der alzheimerschen erkrankung |
| WO2007149798A2 (en) * | 2006-06-20 | 2007-12-27 | Novartis Ag | Biomarkers for the progression of alzheimer's disease |
| WO2011067610A1 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Randox Laboratories Limited | Diagnostic method for alzheimer's disease |
| WO2012053255A1 (ja) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | アルツハイマー病又は軽度認知症のバイオマーカー |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008506415A (ja) * | 2004-07-19 | 2008-03-06 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | 神経変性疾患の生物マーカー |
| GB0512401D0 (en) * | 2005-06-17 | 2005-07-27 | Randox Lab Ltd | Method |
| EP1847615A1 (en) * | 2006-04-18 | 2007-10-24 | Genoscreen | Expression and polymorphism of the ornithine transcarbamylase (OTC) gene as markers for diagnosing Alzheimer's disease |
-
2012
- 2012-07-06 GB GBGB1212084.6A patent/GB201212084D0/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-07-08 BR BR112014033124A patent/BR112014033124A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-07-08 JP JP2015519246A patent/JP6262727B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-07-08 WO PCT/EP2013/064397 patent/WO2014006224A1/en active Application Filing
- 2013-07-08 RU RU2014152876A patent/RU2661022C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-07-08 AU AU2013285362A patent/AU2013285362B2/en not_active Ceased
- 2013-07-08 CA CA2878418A patent/CA2878418A1/en not_active Abandoned
- 2013-07-08 EP EP13734774.6A patent/EP2870481B1/en active Active
- 2013-07-08 CN CN201380032698.9A patent/CN104487847B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2013-07-08 US US14/411,496 patent/US9927429B2/en active Active
- 2013-07-08 EP EP17189117.9A patent/EP3290923B1/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004113568A2 (fr) * | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Aventis Pharma S.A. | Méthodes de détection de la maladie d'alzheimer |
| WO2005050219A1 (de) * | 2003-10-22 | 2005-06-02 | Universität Leizig | Schnelltest zur diagnose der alzheimerschen erkrankung |
| WO2007149798A2 (en) * | 2006-06-20 | 2007-12-27 | Novartis Ag | Biomarkers for the progression of alzheimer's disease |
| WO2011067610A1 (en) * | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Randox Laboratories Limited | Diagnostic method for alzheimer's disease |
| WO2012053255A1 (ja) * | 2010-10-20 | 2012-04-26 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | アルツハイマー病又は軽度認知症のバイオマーカー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112014033124A2 (pt) | 2017-06-27 |
| CA2878418A1 (en) | 2014-01-09 |
| EP3290923A1 (en) | 2018-03-07 |
| JP2015524551A (ja) | 2015-08-24 |
| US20150198590A1 (en) | 2015-07-16 |
| EP3290923B1 (en) | 2021-04-28 |
| US9927429B2 (en) | 2018-03-27 |
| CN104487847B (zh) | 2016-08-17 |
| EP2870481A1 (en) | 2015-05-13 |
| EP2870481B1 (en) | 2017-09-06 |
| AU2013285362B2 (en) | 2016-12-01 |
| GB201212084D0 (en) | 2012-08-22 |
| AU2013285362A1 (en) | 2015-01-22 |
| CN104487847A (zh) | 2015-04-01 |
| RU2014152876A (ru) | 2016-08-27 |
| WO2014006224A1 (en) | 2014-01-09 |
| JP6262727B2 (ja) | 2018-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5207469B2 (ja) | アルツハイマーの診断キット、診断マーカー及び病態指標の検出方法 | |
| JP7492711B2 (ja) | アルツハイマー病バイオマーカー | |
| WO1998040748A1 (en) | Diagnosing neurologic disorders | |
| US20180120328A1 (en) | Biomarker for psychiatric and neurological disorders | |
| JP2010271078A (ja) | 認知機能障害疾患を含む精神疾患のバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた認知機能障害疾患を含む精神疾患の検出方法 | |
| US20140370529A1 (en) | Method for diagnosing alzheimer's disease | |
| RU2661022C2 (ru) | Изоформы тропомиозина, связанные с болезнью альцгеймера и умеренными когнитивными нарушениями | |
| WO2018030252A1 (ja) | 尿バイオマーカーを用いたアルツハイマー病の診断補助方法 | |
| WO2019022064A1 (ja) | 神経変性疾患を判定するための診断補助方法 | |
| JP5892169B2 (ja) | 補体ｃ３タンパク質の糖鎖測定によるアルツハイマー型認知症の診断キット、診断マーカー及び検出方法 | |
| US20200200767A1 (en) | Biomarker for cognitive impairment disorders and detection method for cognitive impairment disorders using said biomarker | |
| JP6908810B2 (ja) | ４リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 | |
| Kanani et al. | False-positive high sensitivity troponin I on Alinity i | |
| KR20200077779A (ko) | 퇴행성 뇌질환 발병 위험성 예측용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 발병 위험성 예측 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190709 |