JP6908810B2 - 4リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
(1)検体中のタウタンパク質の279位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに特異的に結合する特異的結合試薬によりアルツハイマー病と、進行性核上性麻痺/大脳皮質基底核変性症を鑑別する検査方法。
(2)前記特異的結合試薬が抗体である(1)記載の検査方法。
(3)前記検体が、髄液、血液、脳神経組織、生検組織である(1)又は(2)に記載の検査方法。
(4)ELISA、又は免疫組織染色により検出することを特徴とする(2)又は(3)記載の検査方法。
(5)アルツハイマー病と、進行性核上性麻痺/大脳皮質基底核変性症を鑑別する特異的結合試薬であって、タウタンパク質の279位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに対して特異的に結合することを特徴とする試薬。
(6)前記特異的結合試薬が抗体である(5)記載の特異的結合試薬。
(7)前記抗体がモノクローナル抗体である(6)記載の特異的結合試薬。
(8)前記抗体がポリクローナル抗体を精製して得られたものである(6)記載の特異的結合試薬。
(9)(5)〜(8)いずれか1つ記載の特異的結合試薬と検出に必要な試薬を備えていることを特徴とする検査キット。
(10)前記検出がELISA又は免疫染色によるものであることを特徴とする(9)記載の検査キット。
(11)タウタンパク質の279位の脱アミド化を指標としてスクリーニングすることを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
4リピートタウを認識する抗体としては、配列番号2で示すペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体(RD4抗体、メルク株式会社製)、配列番号3で示すペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体(4R抗体、コスモ・バイオ株式会社製)が市販されている。
抗体は公知の方法(非特許文献7)を参考に作製することができる。配列番号2、又は3に特異的な抗体を、ウサギ、マウスに抗原を免疫することによって、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を作製することができる。
D279抗体を検査に用いる場合には、脳脊髄液、血液、尿などの体液や生検検体を試料として用いることができる。生検検体としては、タウやαシヌクレインの検出が認められている鼻粘膜、皮膚、唾液腺、消化管粘膜などを好適に用いることができる。脳脊髄液を用いることが、感度の点から好ましい。免疫染色法、ELISAを以下に具体例として挙げるが、特異的な反応を検出することができる方法であれば、これに限らずどのような方法を用いてもよい。
組織染色は、常法によりホルマリン固定、パラフィン包埋された組織を薄切し、上記のタウペプチドに特異的な一次抗体、標識された二次抗体を用いて染色を行い検出することができる。検出方法は、酵素標識による発色、蛍光標識を検出する方法など、公知の方法を用いて行うことができる。
96穴ELISA用プレートに配列番号2又は3のペプチドを入れ、一定時間静置し、固相化を行う。固相化したプレートは洗浄、ブロッキングを行い、検査に使用すればよい。
D279抗体は、AD病変を特異的に認識することから、これを用いてアルツハイマー病を治療する医薬をスクリーニングすることが可能となる。
タウタンパク質の279位のアスパラギン酸への脱アミド化を抑制することができる化合物はアルツハイマー病の医薬として有効である可能性が高い。培養細胞を用いて279位のアスパラギン酸の脱アミド化を指標として化合物をスクリーニングすることにより、アルツハイマー病に効果のある化合物を選択することができる。
培養細胞を用いたスクリーニング系で効果が見られた化合物は、モデル動物を用いてさらに検討することができる。モデル動物としては、加齢した正常動物や老化促進モデルマウスなどの老化モデルを用いることができる。また、特許文献3〜5に記載されているタウ遺伝子を改変し、アルツハイマー様の病変を生じるトランスジェニック動物を用いてもよい。
以下、データを示しながら、本発明の検査方法を詳細に説明する。抗体を精製するためのアフィニティカラムは、配列番号3のペプチドをセルファインホルミル(JNC株式会社製)のホルミル基に結合させて用いた。具体的には、セルファインホルミルを蒸留水で洗浄後、カップリングバッファー(50mM炭酸-重炭酸緩衝液、pH8.5)に配列番号3(279位がアスパラギン酸に置換したペプチド、以下D279ペプチドと記載することもある。)のペプチドとともに懸濁し、室温で約30分振盪させる。次に、水酸化シアノホウ素ナトリウムを添加し、4℃、一晩振盪し、余剰のホルミル基を還元する。ブロッキングバッファー(0.1M モノエタノールアミン、50mM Tris−HCl、pH8.0)で洗浄後、再度水酸化シアノホウ素ナトリウムを添加し、完全に還元を行う。その後、ペプチドを結合させた樹脂をカラムに充填し、蒸留水、溶出バッファー(0.1M Gly−HCl、pH2.5)、蒸留水、洗浄バッファー(1M NaCl、1% Triton−X 100、20mM Tris−Hcl、pH7.5)、蒸留水の順で洗浄し、アフィニティカラムを作製した。
病理標本を用いて、配列番号3で示すペプチドを用いて作製された未精製ポリクローナル抗体(DN279抗体)、又はペプチドカラムを用いて精製したD279抗体を用いて組織染色を行った。
脳脊髄液などの体液中に存在するタウタンパク質はELISAによっても検出することができる。図3は、配列番号2で示すペプチド(N279ペプチド)、配列番号3で示すペプチド(D279ペプチド)の濃度を変えてマイクロタイタープレートにコートし、D279抗体の反応性を解析したものである。
Claims (9)
- 検体中のタウタンパク質の279位がアスパラギンであるペプチドには結合せず、279位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに特異的に結合する特異的結合試薬によりアルツハイマー病と、進行性核上性麻痺又は大脳皮質基底核変性症を鑑別する検査方法であって、
前記特異的結合試薬が279位がアスパラギン酸であるペプチドを免疫原として得られたポリクローナル抗体を
279位がアスパラギンであるペプチドと混合し、
279位がアスパラギン酸であるペプチドに対して吸着させて精製した抗体であることを特徴とする検査方法。 - 前記検体が、
髄液、血液、脳神経組織、生検組織である請求項1に記載の検査方法。 - ELISA、又は免疫組織染色により検出することを特徴とする請求項1又は2記載の検査方法。
- アルツハイマー病と、進行性核上性麻痺又は大脳皮質基底核変性症を鑑別する特異的結合試薬であって、
前記特異的結合試薬が抗体であり、
タウタンパク質の279位がアスパラギンであるペプチドには結合せず、279位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに対して特異的に結合することを特徴とする特異的結合試薬。 - 前記抗体がモノクローナル抗体である請求項4記載の特異的結合試薬。
- 前記抗体がポリクローナル抗体を精製して得られたものである請求項4記載の特異的結合試薬。
- 請求項4〜6いずれか1項記載の特異的結合試薬と
検出に必要な試薬を備えていることを特徴とする検査キット。 - 前記検出がELISA又は免疫染色によるものであることを特徴とする請求項7記載の検査キット。
- 請求項4〜6いずれか1項記載の特異的結合試薬を用いる医薬のスクリーニング方法であって、
タウタンパク質の279位の脱アミド化を指標としてスクリーニングすることを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
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