RU2660566C2 - Иммунизация вектором на основе вируса бешенства, экспрессирующим чужеродный белковый антиген - Google Patents
Иммунизация вектором на основе вируса бешенства, экспрессирующим чужеродный белковый антиген Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660566C2 RU2660566C2 RU2015116904A RU2015116904A RU2660566C2 RU 2660566 C2 RU2660566 C2 RU 2660566C2 RU 2015116904 A RU2015116904 A RU 2015116904A RU 2015116904 A RU2015116904 A RU 2015116904A RU 2660566 C2 RU2660566 C2 RU 2660566C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- virus
- foreign protein
- immunization
- protein antigen
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 169
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 168
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 title claims abstract description 142
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title description 163
- 238000002649 immunization Methods 0.000 title description 161
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 105
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 43
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 86
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 50
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 32
- 241000526636 Nipah henipavirus Species 0.000 claims description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 23
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 22
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 22
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 15
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 102100034452 Alternative prion protein Human genes 0.000 claims description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 4
- -1 c-erb / B2 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 claims description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 3
- LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 3-Amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C=C(N)N=C2C LKKMLIBUAXYLOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 208000004881 Amebiasis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010001980 Amoebiasis Diseases 0.000 claims description 2
- 241001465677 Ancylostomatoidea Species 0.000 claims description 2
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 claims description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 2
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 claims description 2
- 201000006353 Filariasis Diseases 0.000 claims description 2
- 241000893570 Hendra henipavirus Species 0.000 claims description 2
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 2
- 102100020793 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710112634 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 2
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 101710093778 L-dopachrome tautomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102000012894 Matrix Attachment Region Binding Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010090115 Matrix Attachment Region Binding Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 claims description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000243985 Onchocerca volvulus Species 0.000 claims description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035718 Pneumonia legionella Diseases 0.000 claims description 2
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 241000713124 Rift Valley fever virus Species 0.000 claims description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 101710173694 Short transient receptor potential channel 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 2
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015774 TYK2 Kinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010010057 TYK2 Kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 claims description 2
- 206010044608 Trichiniasis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims description 2
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 2
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000002042 onchocerciasis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003982 trichinellosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007588 trichinosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101100015302 Nipah virus G gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 45
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 23
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 17
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 13
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 8
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 8
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 8
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 7
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 101150003957 GAS gene Proteins 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 5
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- UEDWDOQXHOTTRB-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-1-(2-sulfophenyl)methanimine oxide Chemical compound CC(C)(C)[N+]([O-])=CC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O UEDWDOQXHOTTRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 3
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 3
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024522 Bladder cancer-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 101710148305 Bladder cancer-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 2
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 230000037456 inflammatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100186981 Arabidopsis thaliana NGA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000004429 Bacillary Dysentery Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000032163 Emerging Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 208000000832 Equine Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241000035314 Henipavirus Species 0.000 description 1
- 208000000464 Henipavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000979342 Homo sapiens Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 description 1
- 240000002329 Inga feuillei Species 0.000 description 1
- 206010022095 Injection Site reaction Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000004023 Legionellosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035353 Legionnaires disease Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100023050 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 241000694414 Sapindus saponaria Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010040550 Shigella infections Diseases 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282458 Ursus sp. Species 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008303 genetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003017 in situ immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000004904 long-term response Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000013197 protein A assay Methods 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 201000005113 shigellosis Diseases 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 244000059546 zoonotic virus Species 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18211—Henipavirus, e.g. hendra virus
- C12N2760/18234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/20143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Предложенное изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума на чужеродный белковый антиген. Предложенный способ включает стадии получения аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства, кодирующего чужеродный белковый антиген, функционально связанный с последовательностями контроля, инфекции реципиентной клетки указанным вирусом бешенства в условиях, которые позволяют экспрессию чужеродного белкового антигена реципиентной клеткой, и усиления иммунного ответа на указанный чужеродный белковый антиген путем введения указанного чужеродного белкового антигена, содержащегося в усиливающей композиции, которая не содержит адъюванта. При этом чужеродный белковый антиген расположен между двумя генами G в геноме указанного аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства и не экспрессируется в структуре рекомбинантного вируса. Предложенный способ обеспечивает у индивидуума достижение мощного иммунного ответа на чужеродные белковые антигены без использования адъювантов и может быть использован в медицине. 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 11 пр.
Description
Информация о правительственной дотации
Изобретение, описанное в настоящем описании, было осуществлено при правительственной поддержке по гранту № R21AI068837-01A2, выданному National Institutes of Health. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Испрашивается приоритет по дате подачи временной патентной заявки США №61/708197, поданной 1 октября 2012 года. Полное содержание упомянутой выше заявки включено в качестве ссылки.
Список последовательностей
Настоящая заявка включает список последовательностей, который предоставлен в формате ASCII через EFS-Web, и он включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 17 июня 2013 года, названа 37075_0280_00_WO_SeqListing_ST25, и имеет размер 3396 байт.
Область изобретения
Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии, в частности, к применению рекомбинантных вакцин на основе вируса бешенства, экспрессирующих чужеродные антигены, для иммунизации против этих чужеродных антигенов.
Уровень техники, к которому относится изобретение
Вирус бешенства (RV) представляет собой вирус с несегментированной отрицательной цепью РНК семейства Rhabdoviridae и рода лиссавирусов. Геном RV имеет размер приблизительно 12 т.п.н. и кодирует пять моноцистронных РНК, кодирующих нуклеокапсидный белок (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), трансмембранный гликопротеин (G) и вирусную полимеразу (L). Белок N RV заключает в капсид вирусную РНК с формированием рибонуклеопротеина (RNP), который является матрицей для транскрипции и репликации РНК вирусным полимеразным комплексом, состоящим из белков P и L. M RV связывает RNP с цитоплазамтическим доменом (CD) G RV в образовавшейся в клетке-хозяине вирусной мембране. G RV опосредует инфицирование клетки-хозяина. Главным признаком вируса бешенства является нейроинвазивность, которая относится к уникальной способности проникать в центральную нервную систему (ЦНС) из периферических областей.
Вирус бешенства представляет собой перспективный вакцинный вектор, способный эффективно индуцировать гуморальные и клеточные иммунные ответы на чужеродные антигены. Рекомбинантные живые вирусные векторы, экспрессирующие чужеродные антигены, эффективно индуцируют мощные клеточные и гуморальные иммунные ответы против экспрессируемых антигенов. Вследствие низкой распространенности серотипов в человеческой популяции, RV является превосходным кандидатом для вирусного вектора. Способы конструирования вирусов являются устоявшимися, в настоящее время включают вплоть до двух чужеродных генов общим размером 6,5 т.п.н., и чужеродные последовательности стабильно поддерживаются. RV растет до высоких титров в клеточных линиях, одобренных для производства вакцин человека, и его получение является экономичным. См., Smith et al., 2006, Virology, 353(2): 344-356. Например, компетентный по репликации RV, содержащий гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие gp160 ВИЧ-1, описан в WO 01/55330. Иммунизация RV, кодирующим бактериальные, вирусные антигены или антигены злокачественной опухоли, слитые по меньшей мере с частью белка N или белка G RV, описаны в публикации патента США 2008/0311147. Экспрессия Env или Gag ВИЧ-1 приводит к мощным иммунным ответам, направленным против ВИЧ-1 (Schnell et al,. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci USA 97(7): 3544-3549).
Доступность технологии обратной генетики позволила модифицировать вирусные элементы RV, которые обеспечивают патогенность и иммуногенность, и сделала осуществимой систематическую разработку более безопасного и более эффективного модифицированного живого вектора на основе бешенства. Например, патогенность фиксированных штаммов RV (т.е. ERA, SAD) для иммунокомпетентных мышей может быть полностью устранена путем внесения единичных аминокислотных замен в их белке G (Faber et al., 2005, J Virol 79: 14141-14148). RV, содержащие G SADB19 с мутацией Arg333→Glu333 являются непатогенными для взрослых мышей после внутричерепной/внутримозговой инокуляции; мутация Asn194→Ser194 в том же гене препятствует реверсии в патогенный фенотип (Faber et al., 2005, J Virol 79:14141-14148; Dietzschold et al., 2004, Vaccine 23: 518-524; US Pat. 7695724). Ген G, содержащий обе мутации, был обозначен как "GAS". С использованием гена GAS были сконструированы варианты RV с единичным и двойным GAS, SPBNGAS и SPBNGAS-GAS, соответственно (Faber et al., 2005, J Virol 79: 14141-14148; Li et al., 2008, Vaccine 26: 419-426). Внесение второго гена G значительно повышает эффективность вакцин посредством повышения его иммуногенности вследствие более высокой экспрессии G (Faber et al., 2002, J Virol 76: 3374-3381). Повышенная экспрессия G ассоциирована с мощной активацией генов, связанных с каскадом передачи сигнала NFκB, включая IFN-α/β и IFN-γ (Li et al., 2008, Vaccine 26:419-426) и увеличенной клеточной смертью (Faber et al., 2002, J Virol 76:3374-3381). Более того, присутствие двух генов G также существенно снижает вероятность реверсии к патогенности, поскольку непатогенный фенотип, определяемый GAS, доминирует над патогенным G, который может появиться во время роста вируса in vivo или in vitro (Faber et al., 2007, J Virol 81:7041-7047).
Следующим усовершенствованием безопасности рекомбинантного RV является высоко аттенуированный вариант RV с тройным G, SPBAANGAS-GAS-GAS (Faber et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci USA 206(27):11300-11305). Вариант SPBAANGAS-GAS-GAS является полностью непатогенным после внутричерепного инфицирования мышей, которые либо имеют иммунодефицит, связанный со стадией развития (например, мыши в возрасте 5 суток), либо имеют врожденные дефициты иммунной функции.
Рекомбинантный RV, которые экспрессируют чужеродные антигены, происходящие из различных болезнетворных агентов, могут служить подходящими вакцинными векторами. Однако проблема, которая часто появляется при использовании рекомбинантных вирусов в вакцинологии, состоит в том, что они сконструированы так, что иммунная система подвергается воздействию антигенов вирусного вектора и чужеродного агента одновременно, и иммунный ответ против вирусного вектора доминирует над ответом на чужеродный антиген.
Для повышения эффективности вакцин широко используют адъюванты. Безопасность и переносимость являются ключевыми нормативными вопросами, противостоящими применению адъювантов. Область разработки адъювантов рассмотрена Petrovsky et al., "New-Age Vaccine Adjuvants: Friend or Foe?" BioPharm International, August 2, 2007, http<colon>//biopharminternational<dot>findpharma<dot>com/biopharm/article/articleDetail<dot>jsp?id=444996&sk=&date=&pageID=5.
Как описано Petrovsky et al., польза включения любого адъюванта в вакцины должна быть сбалансирована относительно любой увеличенной реактогенности или риска неблагоприятных реакций. В большинстве случаев увеличенная эффективность адъюванта ассоциирована с увеличенной реактогенностью и токсичностью. Например, хотя полный адъювант Фрейнда (CFA) является "золотым стандартом" с точки зрения адъювантной эффективности, его чрезвычайная реактогенность и токсичность препятствуют его применению в вакцинах для человека.
Как описано Petrovsky et al., основной нерешенной проблемой в разработке адъювантов является то, как достигнуть мощного адъювантного эффекта, избегая реактогенности или токсичности. Большинство новых адъювантов для человека, включая MF59,4, ISCOMS,5, QS21,6, AS02,7 и AS048 обладают существенно более высокой локальной реактогенностью и системной токсичностью, чем квасцы. Даже квасцы, хотя и являются одобренными FDA, имеют существенные неблагоприятные эффекты, включая боль в области инъекции, воспаление и лимфаденопатию, и менее часто некроз в области инъекции, гранулемы или стерильный абсцесс. Хотя многие вызываемые адъювантами реакции на вакцины не являются опасными для жизни и устраняются с течением времени, они остаются одним из наиболее важных барьеров для лучшего принятия обществом стандартной профилактической вакцинации. В частности, это касается педиатрической вакцинации, где длительное недомогание ребенка вследствие увеличенной реактогенности может прямо приводить к сопротивлению вакцинации со стороны родителей и общества.
Использование эмульсий типа "масло-в-воде" ограничивается их реактогенностью и потенциалом в отношении неблагоприятных реакций. Частицы эмульсий типа "масло-в-воде" являются раздражающими и вызывают локальное воспаление, индуцируя хемотактический сигнал, который вызывает локальную инвазию макрофагов. Вследствие частых неблагоприятных реакций, основным применением у человека эмульсий типа "масло-в-воде" являются терапевтические вакцины против злокачественной опухоли и ВИЧ. Petrovsky et al., выше. Другие адъюванты, предложенные для применения у человека, характеризуются проблемами безопасности и/или рисками реактогенности в различной степени: монофосфориллипид A (значительная реактогенность); неметилированный динуклеотид CpG (в основном, реактогенность, токсичность, включая реакции области инъекции, гриппоподобные симптомы и головная боль), QS21, содержащий тритерпеноидные гликозиды (сапонины), происходящие из коры южноамериканского мыльного дерева (сильная боль в области инъекции, гранулемы и тяжелый гемолиз); ISCOM, которые представляют собой иммуностимулирующие комплексы, содержащие сапонин, стерин, и необязательно фосфолипид (проблемы токсичности и безопасности). Petrovsky et al., выше. Только недавно нанокристаллические частицы инулина Advax продемонстрировали перспективу свободы от побочных эффектов, адъювант является природным происходящим из растений полисахаридом, состоящим из цепи молекул фруктозы, оканчивающейся одной молекулой глюкозы.
Существует потребность в рекомбинантных композициях на основе RV и способах иммунизации, которые обеспечивают мощный иммунный ответ на чужеродные антигены, экспрессируемые рекомбинантными RV, без использования адъювантов.
Сущность изобретения
Способ индукции иммунного ответа у индивидуума включает стадии: (a) получения аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства, кодирующего по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, функционально связанный с последовательностями контроля, которые контролируют экспрессию указанного чужеродного антигена в подходящей реципиентной клетке; (b) введения указанного вируса бешенства в реципиентную клетку указанного индивидуума в условиях, которые позволяют экспрессию указанного одного или нескольких чужеродных белковых антигенов, тем самым индуцируя иммунный ответ на указанный чужеродный белковый антиген; и (c) усиления указанного иммунного ответа на указанный чужеродный белковый антиген путем введения указанному индивидууму указанного чужеродного белкового антигена, содержащегося в усиливающей композиции, которая свободна от адъюванта.
Чужеродный белковый антиген может содержать, например, прионный белковый антиген, ассоциированный со злокачественной опухолью антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген или антиген простейших.
Вирус бешенства аттенуируют, т.е. преобразуют в непатогенный, например, путем внесения одной или нескольких мутаций в ген гликопротеина (G) бешенства, которые обеспечивают аттенуацию. Например, аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства может содержать мутантный ген G, который кодирует гликопротеин вируса бешенства, где аминокислота 333 представляет собой глутаминовую кислоту. Мутантный ген G, кроме того, может кодировать гликопротеин вируса бешенства, где аминокислота 194 отлична от лизина, например, аминокислота 194 представляет собой серин. В некоторых вариантах осуществления аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства содержит два или более генов G. По меньшей мере один и предпочтительно все из генов G содержат ослабляющую патогенность мутацию.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, расположена между двумя генами G в геноме указанного аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства. В других вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, расположена между генами M и L в геноме аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства.
В некоторых вариантах осуществления иммунизация аттенуированным рекомбинантным вирусом бешенства, кодирующим по меньшей мере один чужеродный белок, происходит без адъюванта.
Изобретение также относится к набору для осуществления на практике упомянутого выше режима иммунизации. Набор может содержать: (a) первую композицию, содержащую аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства, кодирующий по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, функционально связанный с последовательностями контроля, которые контролируют экспрессию указанного чужеродного антигена в подходящей реципиентной клетке; и (b) вторую композицию, содержащую по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, где указанная вторая композиция является свободной от адъюванта. В некоторых вариантах осуществления первая композиция набора также свободна от адъюванта.
Описание чертежей
На фиг. 1 представлена серия графиков, демонстрирующих титры антител против овальбумина для общего иммуноглобулина (общий IgG), IgG1 и IgG2A у мышей, иммунизированных SPBAANGAS-OVA-GAS или SPBAAGAS-GAS (столбец A), с последующей усиливающей иммунизацией SPBAANGAS-OVA-GAS (столбец B) и третьей иммунизацией растворимым OVA (столбец C). В каждой рамке левый столбик соответствует мышам, первоначально иммунизированным SPBAAGAS-GAS, в то время как правый столбик соответствует мышам, первоначально иммунизированным SPBAAGAS-OVA-GAS.
На фиг. 2 представлены графики продуцирования нейтрализующих антител против вируса Нипах (NiV) (панель A), и антител, связывающих гликопротеин NiV (NiV-G) (панель B). Мышей иммунизировали различными концентрациями (103-106 FFU) варианта RV SPBAANGAS-NG-GAS, а затем у них проводили взятие крови через 21 сутки после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации. Нейтрализующие титры NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 2, панель A (нейтрализующие антитела против NiV) и панель B (антитела, связывающие NiV-G). В каждой паре столбиков левый столбик соответствует титру антител после первичной иммунизации; правый столбик соответствует титру антител после усиливающей иммунизации. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.
На фиг. 3 представлены графики продуцирования нейтрализующих антител против NiV (панель A), и антител, связывающих NiV-G (панель B). Мышей иммунизировали 105 FFU варианта RV SPBNGAS-GAS. Затем через 29 суток в одной группе проводили усиливающую иммунизацию 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS (столбики, обозначенные SPBNGAS-GAS/SPAANGAS-NG-GAS), в то время как другую группу иммунизировали 105 FFU SPBN (столбики, обозначенные SPBNGAS-GAS/SPBNGAS-GAS). Взятие крови у мышей проводили через 21 сутки после первичной иммунизации (1 взятие крови: левые столбики в каждом из двух наборов столбиков на панелях) и через 10 суток после усиливающей иммунизации (2 взятие крови: правые столбики в каждом из двух наборов столбиков на панелях). Нейтрализующие титры NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 3A (NiV нейтрализующие антитела) и на фиг. 3B (антитела, связывающие NiV-G). Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.
На фиг. 4 представлен график продуцирования антител против NiV-G. Сначала две группы мышей иммунизировали 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS или 105 FFU варианта RV SPBNGAS-GAS. Через двадцать три дня обеим группам мышей проводили усиливающую иммунизацию рекомбинантно экспрессируемым растворимым не содержащим адъюванта NiV-G. У мышей проводили взятие крови через 19 суток после первичной иммунизации (левые столбики в каждой паре столбиков на фиг. 4) и через 10 суток после усиливающей иммунизации (правые столбики в каждой паре столбиков) и количественно определяли антитела, связывающие NiV-G. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.
Фиг. 5 включает иммунизацию и расписание взятия образцов крови A, и на серии графиков B-D представлена продукция антител против NiV-G. Мышей иммунизировали на нулевые сутки и 29 сутки 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS. Через сто девяносто пять суток после второй иммунизации мышам проводили усиливающую иммунизацию рекомбинантно экспрессируемым растворимым NiV-G. У мышей проводили взятие крови в моменты времени взятия крови, показанные в расписании, обозначенном A. Количественно определяли нейтрализующие антитела против NiV (панель B), все специфические антитела против NiV-G (панель C), и специфичные к NG изотипы IgM, IgG 1, IgG 2A и IgG 2B (панель D). Нейтрализующие титры NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.
На фиг. 6A и 6B представлена продукция антител против NiV-G. Мышей иммунизировали NiV-G и через 3 недели им проводили усиливающую иммунизацию NiV-G. У мышей проводили взятие крови через 10 суток после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации. Проводили измерение общих антител, связывающих NiV-G, для двух взятий крови (фиг. 6A). Специфичные к NiV-G изотипы IgM, IgG 1, IgG 2A и IgG 2B, продуцированные после усиливающей иммунизации, измеряли с использованием ELISA (фиг. 6B). Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.
Определения
Определения, используемые в настоящей заявке, предназначены для иллюстративных целей и не ограничивают объем изобретения.
Форма единственного числа используется в настоящем описании для обозначения одного или более одного (например, по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более одного элемента.
Термин "приблизительно" понятен специалисту в данной области, и он варьирует в некоторой степени в зависимости от контекста, в котором его используют. Как используют в рамках изобретения, "приблизительно" охватывает варьирование ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1%.
Термин "антитело", как используют в рамках изобретения, относится к молекуле иммуноглобулина, которая способна специфически связываться с определенным эпитопом на антигене. Антитела могут представлять собой интактные иммуноглобулины, происходящие из природных источников или из рекомбинантных источников, и они могут представлять собой иммунореактивные части интактных иммуноглобулинов. Антитела, как правило, представляют собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов. Антитела, которые можно использовать при применении на практике настоящего изобретения, могут существовать в различных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)2, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Harlow et al., 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242: 423-426).
Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить в качестве депо в ткани, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, Calif., p. 384). Адъюванты включают, но не ограничиваются ими, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, полиолы плюроник, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциальные пригодные для человека адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Термин "не содержащий адъюванта" относится к любому препарату, который не содержит адъюванта, как описано выше.
Как используют в рамках изобретения, каждая "аминокислота" представлена с помощью ее полного названия, трехбуквенного кода, соответствующего ему, или соответствующего ему однобуквенного кода, как указано в следующей таблице:
Полное название | Трехбуквенный код | Однобуквенный код |
Аспарагиновая кислота | Asp | D |
Глутаминовая кислота | Glu | E |
Лизин | Lys | K |
Аргинин | Arg | R |
Гистидин | His | H |
Тирозин | Tyr | Y |
Цистеин | Cys | C |
Аспарагин | Asn | N |
Глутамин | Gln | Q |
Серин | Ser | S |
Треонин | Thr | T |
Глицин | Gly | G |
Аланин | Ala | A |
Валин | Val | V |
Лейцин | Leu | L |
Изолейцин | Ile | I |
Метионин | Met | M |
Пролин | Pro | P |
Фенилаланин | Phe | F |
Триптофан | Trp | W |
Выражение "аминокислота", как используют в рамках изобретения, включает как природные, так и синтетические аминокислоты, и как D-, так и L-аминокислоты.
Термин "животное" имеет его обычно значение и включает человека.
"Аттенуированный", как используют в рамках изобретения в контексте живого вируса, такого как вирус бешенства, означает, что способность вируса инфицировать клетку или индивидуума и/или способность вызывать заболевание снижена (например, устранена). Аттенуация может быть результатом либо генетического механизма, вовлекающего преждевременную терминацию транскрипции с генома RV, либо она может быть иммунологической в качестве процесса, при котором патогенный RV утрачивает свою вирулентность.
"Кодирующий" относится к свойству, присущему конкретным последовательностям нуклеотидов в полинуклеотиде, таким как ген, кДНК или мРНК, служить в качестве матриц для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих определенную последовательность нуклеотидов (т.е., рРНК, тРНК и мРНК) или определенную последовательность аминокислот и биологический свойства, являющихся результатом этого. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, приводит к образованию белка в клетке или другой биологической системе. Как кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в списках последовательностей, так и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, может быть указана в качестве кодирующей белок или другой продукт этого гена или кДНК.
"Экспрессия гена" или "экспрессия", как используют в рамках изобретения, относится к процессу, посредством которого информация с гена преобразуется в функциональный продукт гена, такой как РНК или белок. Таким образом, "уровень экспрессии" продукта маркерного гена в представляющем интерес образце относится к уровню РНК, в частности, к уровню мРНК, или к уровню кодируемого белка, и он не ограничивается любым из них.
Как используют в рамках изобретения, "экспрессирующий вектор" представляет собой генетический элемент, который функционирует в качестве автономного элемента репликации ДНК под его собственной последовательностью контроля, с которым может быть связан или в который может быть встроен другой сегмент ДНК, так чтобы осуществлялась репликация связанного или встроенного сегмента. Экспрессирующие векторы включают плазмиды, фаги или космиды. Как правило, экспрессирующие векторы содержат промоторные последовательности, которые способствуют эффективной транскрипции и трансляции связанного или встроенного сегмента ДНК в конкретной клетке-хозяине. Экспрессирующий вектор также обычно содержит ориджин репликации и терминатор(ы) транскрипции, а также конкретные гены, которые способны обеспечивать фенотипическую селекцию в трансфицированных клетках-хозяевах.
Под "чужеродным белковым антигеном" или антигеном, экспрессируемым рекомбинантным вирусом бешенства, подразумевают антиген белка, который не является нативным для вируса бешенства, экспрессирующего антиген. В определенных вариантах осуществления, когда чужеродный антиген представляет собой антиген вируса, вирус отличается от вируса бешенства.
Как используют в рамках изобретения, термин "ген" относится к элементу или комбинации элементов, которые способны экспрессироваться в клетке либо отдельно, либо в комбинации с другими элементами. Как правило, ген содержит (от 5' к 3'-концу): (1) промоторную область, которая включает 5' нетранслируемую лидерную последовательность, способную функционировать в любой клетке, такой как прокариотическая клетка, вирус или эукариотическая клетка (включая трансгенных животных); (2) последовательность структурного гена или полинуклеотидную последовательность, которая кодирует желаемый белок; и (3) 3'-нетранслируемую область, которая, как правило, вызывает терминацию транскрипции и полиаденилирование 3'-области последовательности РНК. Каждый из этих элементов функционально связан путем последовательного присоединения к соседнему элементу.
Как используют в рамках изобретения, "продукты генов" включают любой продукт, который продуцируется в процессе транскрипции, обратной транскрипции, полимеризации, трансляции, посттрансляционного процессинга и/или экспрессии гена. Продукты генов включают, но не ограничиваются ими, белки, полипептиды, пептиды, пептидные фрагменты или полинуклеотидные молекулы.
Как используют в рамках изобретения, "ген белка G RV" или "ген белка G" или "ген G" означает последовательности нуклеиновой кислоты, которые, когда они присутствуют в геноме RV, являются достаточными для кодирования гликопротеина RV в инфицированной клетке. Таким образом, ген белка G включает кодирующую последовательность, которая фланкируется на 3'-конце короткой последовательностью начала транскрипции и на 5'-конце короткой последовательностью остановки транскрипции/полиаденилирования. Ген G может включать межгенную область из 1-59 нетранслируемых нуклеотидов, которая расположена между 5'-последовательность остановки/полиаденилирования и 3'-последовательностью начала транскрипции следующего гена вируса. См., например, pgs. 134-136 Conzelman K-K (1998), Ann. Rev. Genet. 32: 123-62.
"Гомологичный", как используют в рамках изобретения, относится к субъединичному сходству последовательностей между двумя полимерными молекулами, например, между двумя молекулами нуклеиновой кислоты, такими как две молекулы ДНК или две молекулы РНК, или между двумя полипептидными молекулами. Когда положение субъединиц в обеих молекулах занимает одна и та же мономерная субъединица; например, если положение в каждой из двух молекулах ДНК занимает аденин, тогда они являются гомологичными по этому положению. Гомология между двумя последовательностями прямо зависит от количества совпадающих или гомологичных положений; например, если половина (например, пять положений в полимере длиной десять субъединиц) положений в двух последовательностях являются гомологичными, две последовательности являются на 50% гомологичными; если 90% положений (например, 9 из 10), совпадают или гомологичны, две последовательности являются на 90% гомологичными. В качестве примера, последовательности ДНК 3'ATTGCC5' и 5'TATGGC3' являются на 50% гомологичными.
Как используют в рамках изобретения, "гомологию" используют синонимично с "идентичностью".
Термин "иммунизация" относится к процессу индукции частичной или полной защиты от заболевания. Альтернативно термин относится к процессу индукции или усиления ответа иммунной системы на антиген.
"Иммунный ответ" на антиген или вакцинную композицию представляет собой развитие у индивидуума гуморального и/или клеточно-опосредуемого иммунного ответа на молекулы, присутствующие в представляющей интерес антигенной или вакцинной композиции. Для целей настоящего изобретения "гуморальный иммунный ответ" представляет собой опосредуемый антителами иммунный ответ, и он вовлекает образование антител с аффинностью в отношении антигена/вакцины по изобретению, в то время как "клеточно-опосредуемый иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредуемый T-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами. "Клеточно-опосредуемый иммунный ответ" индуцируется презентацией антигенных эпитопов, связанных с молекулами класса I или класса II главного комплекса гистосовместимости (MHC).
"Выделенный" означает измененный или извлеченный из природного состояния действиями человека. Например, нуклеиновая кислота или пептид, присутствующие в природе в живом организме, не являются "выделенными", однако те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от сосуществующих с ними материалов в их природном состоянии, являются "выделенными". Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в по существу очищенной форме или они могут существовать в ненативной среде, например, такой как клетка-хозяин.
"Мутация", как используют в рамках изобретения, относится к изменению последовательности нуклеиновой кислоты или полипептида относительно эталонной последовательности (которая предпочтительно представляет собой встречающуюся в природе нормальную последовательность или последовательность "дикого типа"), и включает транслокации, делеции, инсерции и замены/точковые мутации. "Мутант", как используют в рамках изобретения, относится либо к нуклеиновой кислоте, либо к белку, содержащим мутацию.
"Нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотиду и включает полирибонуклеотиды и полидезоксирибонуклеотиды.
Кодирующая последовательность является "функционально связанной" с последовательностью контроля, такой как последовательность контроля транскрипции и трансляции в клетке, когда РНК-полимераза транскрибирует кодирующую последовательность в мРНК, которая затем подвергается транс-сплайсингу РНК и транслируется в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.
Как используют в рамках изобретения, термины "пептид", "полипептид" и "белок" используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должны содержать по меньшей мере две аминокислоты, и отсутствует ограничение максимального количества аминокислот, которое может составлять последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащие две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями. Как используют в рамках изобретения, термин относится как к коротким цепям, которые обычно в данной области называют, например, пептидами, олигопептидами и олигомерами, и к более длинным цепям, которые обычно называют в данной области белками, для которых существует множество типов. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитые белки, среди прочих. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.
Как используют в рамках изобретения, "полинуклеотид" включает кДНК, РНК, гибрид ДНК/РНК, антисмысловую РНК, рибозим, геномную ДНК, синтетические формы и смешанные полимеры, как смысловые, так и антисмысловые цепи, и он может быть химически или биохимически модифицирован так, чтобы он содержал неприродные или дериватизированные, синтетические или полусинтетические нуклеотидные основания. Также в объем изобретения входят изменения гена дикого типа или синтетического гена, включающие, но не ограничивающиеся ими, делецию, инсерцию, замену одного или нескольких нуклеотидов, или слияние с другими полинуклеотидными последовательностями при условии, что такие изменения первичной последовательности гена не изменят способности экспрессируемого пептида индуцировать пассивный иммунитет.
"Фармацевтически приемлемый" означает физиологически переносимый для применения либо у человека, либо в ветеринарии.
Как используют в рамках изобретения, "фармацевтические композиции" включают составы для применения у человека и в ветеринарии.
Как используют в рамках изобретения, "промотор" относится к области последовательности ДНК, активной при инициации и регуляции экспрессии структурного гена. Эта последовательность ДНК, обычно выше кодирующей последовательности структурного гена, контролирует экспрессию кодирующей области путем обеспечения распознавания РНК-полимеразой и/или другими элементами, требуемыми для начала транскрипции в правильном участке.
Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к любому позвоночному животному, включая, но не ограничиваясь ими, человека и других приматов, грызунов (например, мыши, крысы и морские свинки), зайцеобразных (например, кролики), бычьих (например, крупный рогатый скот), овечьих (например, овца), козьих (например, козы), свиных (например, свинья), лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собаки), кошачьих (например, кошки), домашних птиц (например, куры, индейки, утки, гуси, другие куриноподобные птицы и т.д.), а также неприрученных или диких животных, включая, но не ограничиваясь ими, таких животных как копытное животное (например, олень), медведь, рыбы, зайцеобразные, грызуны, птицы и т.д.
Как используют в рамках изобретения, "трансфицированная" клетка представляет собой клетку, в которую введена экзогенная или гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая была введена, может быть встроена в геном трансфицированной клетки или может поддерживаться эписомально. Стабильно трансфицированная клетка представляет собой клетку, в которой введенная ДНК встроилась в хромосому так, что она наследуется дочерними клетками посредством репликации хромосомы.
Термин "вакцина", как используют в рамках изобретения, определяют как материал, используемый для индукции иммунного ответа после введения материала позвоночному, как правило, млекопитающему. В предпочтительных вариантах осуществления вакцина может представлять собой иммуногенную композицию, обеспечивающую или способствующую предупреждению заболевания. В других вариантах осуществления вакцина представляет собой композицию, которая может обеспечивать или способствовать излечению заболевания. В других вариантах осуществления вакцинная композиция может обеспечивать или способствовать смягчению заболевания. Другие варианты осуществления вакцинной иммуногенной композиции можно использовать в качестве терапевтических и/или профилактических средств.
"Вектор", как используют в рамках изобретения, относится к репликону, такому как плазмида, фаг или космида, с которым может быть связан другой сегмент ДНК для осуществления репликации связанного сегмента.
Термин "вирус", как используют в рамках изобретения, определяют как частицу, состоящую из нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), заключенной в белковую оболочку, с наружной липидной оболочкой или без нее, которая способна реплицироваться в клетке-хозяине.
Как предусматривается настоящим изобретением в отношении описанных композиций и способов, в одном аспекте варианты осуществления изобретения включают компоненты и/или стадии, описанные в настоящем описании. В другом аспекте варианты осуществления изобретения по существу состоят из компонентов и/или стадий, описанных в настоящем описании. В другом аспекте варианты осуществления изобретения состоят из компонентов и/или стадий, описанных в настоящем описании.
Подробное описание изобретения
Проблемой, которая часто возникает при использовании рекомбинантных вирусов в вакцинологии для вакцинации против чужеродных антигенов, включая рекомбинантные RV, экспрессирующие чужеродные антигены, является то, что иммунный ответ против вирусного вектора доминирует над ответом на чужеродный антиген. Для усиления иммунного ответа на чужеродный антиген предусматривается режим первичной/усиливающей иммунизации. В режиме используются живые аттенуированные, предпочтительно непатогенные, рекомбинантные RV, экспрессирующие один или несколько чужеродных белковых антигенов. В одном варианте осуществления чужеродный белковый антиген не экспрессируется в структуре рекомбинантного RV, а экспрессируется только в клетках, инфицированных вирусом. Режим включает первичную иммунизацию вакциной на основе высоко аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства, например, SPBAANGAS-GAS, который экспрессирует конкретный белковый антиген, чужеродный для вируса бешенства, и усиливающую иммунизацию соответствующим чужеродным белковым антигеном в свободной форме, например, в растворимой форме. Режим может включать множество иммунизаций экспрессисрующим чужеродный белковый антиген RV, и/или множество усиливающих иммунизаций чужеродным белковым антигеном. Состав усиливающей композиции не содержит адъюванта.
Первичная иммунизация рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген отдельно, индуцирует длительную память T-клеток в отношении чужеродного белкового антигена. Однако антительный ответ на чужеродный антиген является слабым после первичной иммунизации рекомбинантной вакциной на основе RV и только немного увеличивается при повторном введении той же рекомбинантной вакцины RV. Напротив, усиливающая иммунизация соответствующим свободным чужеродным белковым антигеном приводит к отчетливому увеличению продукции антител, специфичных к чужеродному белковому антигену, неожиданно в отсутствие адъюванта в составе для усиливающей иммунизации. Величина и качество иммунного ответа, который индуцируется с использованием первичной иммунизации рекомбинантным RV с последующим усилением не содержащим от адъюванта чужеродным белковым антигеном, является лучшей, чем в случае первичной/усиливающей иммунизации только одной формой антигена или других стратегий первичной-усиливающей иммунизации (например ДНК, а затем белок).
Примечательно, против чужеродного белка продуцируются преимущественно антитела IgG 2A/C и IgG 2B после первичной/усиливающей иммунизации рекомбинантной вакциной RV и растворимым антигеном, что указывает на TH1-ответ. Важно, что этот режим не индуцирует патологические воспалительные механизмы. С другой стороны, первичная/усиливающая иммунизация с использованием только растворимых белков приводит к продуцированию относительно низких количеств специфичных к антигену антител, которые практически исключительно представляют собой изотип IgG 1, что указывают на ответ TH2. TH1-ответ T-клеток обычно считают преимущественным при защите против определенных патогенов и неопластических клеток относительно TH2-ответа. Это особенно справедливо для инфекций/злокачественных опухолей в тканях, для терапии которых требуется инфильтрация иммунных клеток. Таким образом, режим первичной/усиливающей иммунизации с использованием рекомбинантной вакцины RV вместе с соответствующим растворимым чужеродным белком индуцирует иммунный ответ и иммунологическую память, подходящие для оптимальной защиты против множества инфекционных агентов.
Живой аттенуированный рекомбинантный RV доставляет синтезированный de novo чужеродный белковый антиген для безопасного примирования иммунного ответа на белок с соответствующими характеристиками, например, ответа TH1 в отсутствие воспаления. Усиливающая иммунизация соответствующим растворимым чужеродным белком стимулирует примированные B- и T-клетки в вакцинированном хозяине, вызывая мощный антительный TH1-ответ на белок. В то время как белки пригодны в качестве антигенов, поскольку их точное химическое определение позволяет определить точные эпитопы, против которых будет индуцироваться иммунный ответ, растворимые белки сами по себе могут быть слабоиммуногенными, требующими совместного введения с мощными адъювантами, например, адъювантом Фрейнда. Неожиданно, мощного ответа достигают с использованием усиливающего состава, который не включает адъюванта.
Первичная иммунизация рекомбинантной вакциной RV, экспрессирующей чужеродный белок в заданных инфицированных клетках, с последующей усиливающей иммунизацией соответствующим растворимым чужеродным белком, даже в отсутствие адъюванта в усиливающем составе, индуцирует иммунный ответ и иммунологическую память, пригодную для оптимальной защиты от множества инфекционных агентов. В случае иммунизации против патогена, индуцированный иммунный ответ может включать "защитный" иммунный ответ, который служит для защиты индивидуума от инфекции. Обеспечиваемая защита может не быть абсолютной, т.е. инфекция не должна предупреждаться или устраняться полностью, если существует статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией млекопитающих. Защита может ограничиваться уменьшением тяжести или быстроты появления симптомов инфекции.
Неожиданно, изобретение относится к индукции иммунитета против антигенов, которые являются слабоиммуногенными, как в случае вирусов, которые опосредуют определенные острые и хронические вирусные инфекции, а также антигенов, которые экспрессируются различными злокачественными клетками. Таким образом, изобретение удовлетворяет потребность в вакцинах, которые являются эффективными для предупреждения или излечения появляющихся инфекционных заболеваний и злокачественных опухолей. Важно, что патологические воспалительные механизмы не индуцируются режимом иммунизации/усиления по настоящему изобретению.
Пригодным RV для применения настоящего изобретения на практике является аттенуированный RV. Варианты осуществления RV для применения в рамках настоящего изобретения включают рекомбинантные непатогенные живые вирусы бешенства, которые модифицированы для предупреждения или устранения мутации или реверсии в патогенную форму. В некоторых вариантах осуществления непатогенный рекомбинантный RV содержит модифицированный или измененный ген G. В определенных вариантах осуществления ослабления достигают с помощью одной или нескольких мутаций в гене G RV, который кодирует гликопротеин. Аминокислота(ы) в белке G живого вируса бешенства, которые обеспечивают патогенную форму вируса, можно определять, и ген G, или более конкретно кодон(ы) для одной или нескольких аминокислот в гене G, можно модифицировать путем замены одного или нескольких нуклеотидов. Модифицированный ген G обеспечивает непатогенный живой вирус бешенства, который устраняет или противодействует последующему возникновению мутации, приводящей к замене аминокислот в экспрессируемом гликопротеине.
Способы модификации последовательностей G-белка для обеспечения аттенуации вирусов известны и обобщенно представлены в патенте США 7223584. Например, патогенность конкретного вируса бешенства связана с детерминантой G-белка, которая взаимодействует с предполагаемыми рецепторами клеточной поверхности (Coulon et al. (1982), J. Gen. Virol. 61: 97; Coulon et al. (1983), J. Gen. Virol. 64: 693-696; и Dietzschold et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci USA. Изменение этой детерминанты белка G может ослабить патогенность RV. В частности, замена аргинина в положении 333 белка G глутамином или глицином приводит к замедлению захвата вируса и полной утрате патогенности определенных штаммов RV (например, ERA, CVS-11). См. Dietzschold et al. (1983), выше, и Dietzschold et al. (1985), J. Virol. 56: 12-18.
Делеции или другие изменения в цитоплазматическом домене белка G, так чтобы цитоплазматическая хвостовая часть белка G более не связывалась с комплексом RNP-M, также ослабляют патогенность штамма RV. Например, замена цитоплазматического домена конкретного белка G цитоплазматическим доменом из другого штамма RV делает RV непатогенным при в/м введении. См. Morimoto et al. (2000), J. Neuro Virol. 6: 373-381.
Например, рекомбинантный RV SPBNGA сконструирован так, чтобы он содержал ген G штамма SAD B19, в котором Arg333 заменен на Glu333. Содержащий Glu333 белок G, обозначаемый как "GA", делает вирус непатогенным. Arg333 можно заменять другими аминокислотами, которые делают его непатогенным, например, аспарагиновую кислоту можно использовать для замены Arg333 с получением белка G с Asp333.
Вирус бешенства может быть далее ослаблен путем изменения гена G так, чтобы обеспечить по меньшей мере один нуклеотид, кодирующий аминокислоту 194, который препятствует мутации, как описано в патенте США 7695724. По меньшей мере один нуклеотид из нуклеотидов 637-639, кодирующих аминокислоту в положении 194 гликопротеина, изменяют сайт-направленным мутагенезом с AAT, например, на TCC. Эта мутация, которая заменяет аспарагин в положении 194 белка серином, минимизирует возможность замены Asn→Lys в положении аминокислоты 194 белка G. Можно использовать другие вырожденные кодоны для серина в гене G в положении 637-639, и кодоны других аминокислот, которые минимизируют возможность замены Asn→Lys в положении аминокислоты 194 белка GA, могут быть встроены в положении 637-639 в гене G. Для белка GA, имеющего, например, аминокислоту, подобную серину, кодируемую в положении аминокислоты 194, подвергнутый мутагенезу белок GA может быть обозначен как "GAS" и рекомбинантные вирусы, экспрессирующие ген GAS, называют "SPBNGAS". Рекомбинантный вирус, содержащий два или три экспрессирующихся гена GAS, называют "SPBNGAS-GAS" и "SPBNGAS-GAS-GAS", соответственно.
Нуклеотидная последовательность гена GAS представлена в патенте США 7695724 в качестве SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления рекомбинантный RV может содержать два или более генов G, и, в частности, два или более генов G, содержащих аттенуирующие модификации, описанные выше. Получение рекомбинантного RV, содержащего множество генов G, описано в патенте США 7223584 (SPBNGA-GA), патенте США 7695724 (SPBNGAS-GAS) и в публикации патента США US-2011-0064764 (SPBNGAS-GAS-GAS).
Аттенуации RV также можно достигать путем комбинирования мутаций в двух различных частях вирусного генома, например, в генах фосфопротеина (P) и G. См. публикацию патента США 2002-0164356, в которой описаны RV, содержащие мутацию в области гена P, охватывающей остатки 139-170, и одновременно замену Arg333 в гене G.
Кроме того, аттенуированный RV модифицируют для экспрессии чужеродного белкового антигена. Белковый антиген может кодировать целый белок или любой его иммуногенный фрагмент, который способен индуцировать иммунный ответ у иммунизированного хозяина. Таким образом, под "чужеродным белковым антигеном", как используют в рамках изобретения, подразумевают либо целый белок, либо любой его фрагмент, способный индуцировать иммунный ответ у иммунизированного хозяина. Нуклеотидную последовательность, кодирующую чужеродный белковый антиген, можно встраивать в участок, который не является необходимым для инфекции или репликации вируса, где встраивание не препятствует значительно инфекции или репликации RV. Предпочтительные положения для встраивания гена, экспрессирущего чужеродный белковый антиген, включают положения между множеством копий гена G в RV, содержащем множество генов G, или между генами M и L вируса бешенства.
В соответствии с одним вариантом осуществления кДНК плазмидного вектора SPBAANGAS-GAS содержит один участок клонирования, который расположен между двумя генами GAS. Этот участок используют для встраивания кДНК выбранного белка с использованием стандартной технологии клонирования.
Стандартную технологию рекомбинантных ДНК можно использовать для изменения генома RV для достижения аттенуации и для встраивания генов, кодирующих чужеродные белковые антигены, в геном RV. Например, рекомбинантные геномы RV можно конструировать, сначала получая (путем клонирования, рестрикционного расщепления и выделения, или иным путем) одну или несколько модифицированных последовательностей генов белка G для встраивания в геном RV для обеспечения аттенуации и одну или несколько последовательностей генов, кодирующих один или несколько чужеродных белковых антигенов. Можно использовать сайт-направленный мутагенез, рестрикцию и повторное легирование с гетерологичными последовательностями. Расщепление соответствующими ферментами рестрикции позволяет встраивание дополнительных нуклеотидных последовательностей. Надлежащее встраивание дополнительных нуклеотидных последовательностей можно подтверждать с использованием способов, таких как анализ с ферментами рестрикции и/или секвенирование ДНК.
Живые инфекционные вирусные частицы, способные экспрессировать чужеродные белковые антигены при инфицировании реципиентной клетки для применения в качестве вакцин в соответствии с изобретением, можно выделять или "спасать" путем трансфекции подходящих клеток-хозяев экспрессирующим вектором, содержащим рекомбинантный геном RV, в который встроен ген(ы), кодирующий чужеродный белковый антиген. Встраивание рекомбинантного генома в экспрессирующий вектор для последующей трансфекции в клетки-хозяева для получения вакцины находится в пределах квалификации специалиста в данной области.
Экспрессирующий вектор, содержащий модифицированный геном RV, должен содержать промотор, такой как промотор T7, который является активным в клетке-хозяине. Например, в качестве клетки-хозяина можно использовать клетки BSR, стабильно трансфицированные геном полимеразы T7, как описано в Buchholz et al. (1999), J. Virol. 73: 251-259l. Эти клетки конститутивно экспрессируют полимеразу T7, которая может активировать транскрипцию с промотора T7, содержащегося в экспрессирующем векторе. После подходящего периода времени после трансфекции (например, трое суток), инфекционную рекомбинантную вакцину RV можно выделять из культуральной среды трансфицированных клеток-хозяев. Инфекционность выделенной живой вакцины можно подтверждать путем воздействия на клетки BSR культуральной среды трансфицированных клеток-хозяев, или выделенной живой вакцины. Спасенную живую вакцину можно визуализировать в этих клетках BSR путем окрашивания клеточной культуры меченными FITC антителами против белков RV.
Режим первичной/усиливающей иммунизации по настоящему изобретению можно использовать для иммунизации либо до, либо после воздействия, а также для терапевтической иммунизации против инфицирования патогенами. Режим также можно использовать в качестве профилактической иммунизации против злокачественной опухоли или для лечения злокачественной опухоли.
Индивидуум может включать позвоночное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно человека. Индивидуумы для иммунизации в соответствии с настоящим изобретением включают, например, человека и других приматов, грызунов (например, мыши, крысы и морские свинки), зайцеобразных (например, кролики), бычьих (например, крупный рогатый скот), овечьих (например, овца), козьих (например, козы), свиных (например, свинья), лошадиных (например, лошади), собачьих (например, собаки), кошачьих (например, кошки), домашних птиц (например, куры, индейки, утки, гуси, другие куриноподобные птицы и т.д.).
Чужеродный белковый антиген, экспрессируемый рекомбинантным RV и предоставляемый при последующей усиливающей иммунизации, представляет собой антиген, который является мишенью для иммунного ответа, который приведет к лечению или предупреждению заболевания, вызванного болезнетворными агентами. Чужеродный белковый антиген может включать антиген любого белка, против которого пытаются достигнуть иммунитета или против которого могут индуцироваться антитела.
Болезнетворный агент или болезненное состояние имеют ассоциированный с ними антиген, который запускает иммунное распознавание и конечное устранение или контроль болезнетворного агента или болезненного состояния у хозяина, путем инициации гуморального и/или клеточного иммунного ответа против ассоциированного болезнетворного агента. Болезнетворные агенты включают, но не ограничиваются ими, злокачественную опухоль и патогенные микроорганизмы.
Злокачественные опухоли, которые можно лечить с использованием рекомбинантного вируса бешенства и способа усиливающей иммунизации по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, первичную или метастатическую меланому, злокачественные опухоли головного мозга, тимому, лимфому, саркому, рак легкого, рак печени, неходжкинскую лимфому, ходжкинскую лимфому, лейкозы, рак тела матки и аденокарциномы, такие как рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак поджелудочной железы и т.п. Ген, кодирующий антиген, ассоциированный со злокачественной опухолью, включают в рекомбинантный геном вируса RV. Антиген, ассоциированный со злокачественной опухолью, может экспрессироваться на поверхности злокачественной клетки или он может представлять собой внутренний антиген. Предпочтительными антигенами являются молекулы клеточной поверхности.
Ассоциированные со злокачественной опухолью антигены, которые могут целиком или частично включать чужеродный белковый антиген, экспрессируемый RV в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, тирозинкиназу 2, ассоциированные с меланомой антигены (MAGE, например, MAGE-1 и MAGE-3), MART-1 (меланома); сурвивин, AIM-2, MAGE-1, TRP-2, gp100, HER-2 и IL13Rα2 (глиобластома); ассоциированный с предстательной железой антиген (PSA) (рак предстательной железы), альфафетопротеин (AFP); карциноэмбриональный антиген (CEA); CA-125 (рак яичника); MUC-1; MCU-2; эпителиальный опухолевый антиген (ETA); ассоциированный с раком молочной железы белок 3 (BCA3); c-erb/B2 (рак молочной железы); ассоциированные с карциномой молочной железы MAR-связывающие белки p90 и p70; тирозиназу; аномальные продукты ras и аномальные продукты p53 (рак поджелудочной железы); и ассоциированный с раком мочевого пузыря белок (BLCAP).
В одном варианте осуществления антиген, ассоциированный со злокачественной опухолью, представляет собой опухолеассоциированный антиген (TAA) или его часть. Ассоциированные со злокачественной опухолью антигены, содержащие TAA, можно идентифицировать, выделять и клонировать способами, известными в данной области, такими как способы, описанные в патенте США №4514506.
В другом варианте осуществления комбинация первичной/усиливающей иммунизации предназначена для вакцинации против болезнетворного агента, где агент представляет собой патогенный микроорганизм. Патогенные микроорганизмы могут включать прион, вирус, бактерию, простейшее или дрожжи. Таким образом, антиген содержит прионный антиген, вирусный антиген, бактериальный антиген, антиген простейших или антиген дрожжей.
Болезнетворные вирусные агенты включают, например, следующие вирусы, где предоставленные антигены являются иллюстративными, но не ограничивающими: ВИЧ (антигены GP-120, p17, GP-160); цитомегаловирус; вирус гриппа (антиген NP, HA); вирус Хендра; вирус простого герпеса (антиген HSVdD); вирус папилломы человека; вирус энцефалита лошадей; вирус гепатита (поверхностный антиген Hep B); нейротропные вирусы; вирус японского энцефалита и т.п. Вирус также может включать вновь появляющийся или повторно появляющийся вирус, такой как вирус Денге, вирус лихорадки западного Нила, вирус Эбола, вирус Нипах или вирус лихорадки долины Рифт. Вирусный антиген может включать, например, поверхностные белки вируса или другие белковые антигены вируса.
В одном варианте осуществления, чужеродный белковый антиген представляет собой антиген вируса Нипах (NiV). NiV представляет собой зоонозный вирус, принадлежащий семейству Paramyxovirus рода Henipaviruses. Биологические свойства NiV, включая широкий видовой тропизм, высокую скорость распространения, высокую смертность у человека, и значительное экономическое влияние на животноводческую промышленность, сделали его значительной общественной и ветеринарной проблемой здоровья. Хотя иммунные ответы, необходимые для защиты от инфекции NiV, не были полностью определены, нейтрализующие антитела, которые индуцируются гликопротеином вируса Нипах (NiV-G), являются основными эффекторами против этой вирусной инфекции. Таким образом, в одном варианте осуществления чужеродный белковый антиген представляет собой NiV-G или его фрагмент.
Патогенные дрожжи включают, например, Aspergillus, инвазивные Candida и т.п.
Белковые антигены прионов включают белки, такие как прионный белок BSE и прионный белок почесухи.
Патогенные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Mycobacteria, Legioniella и т.п.
Следующие известные этиологические агенты, ответственные за заболевания, из которых могут происходить подходящие антигены, включают, но не ограничиваются ими, хламидии, дифтерию, коклюш, столбняк, туберкулез, ассоциированные с нетуберкулезными микобактериями заболевания, бактериальные и грибковые пневмонии, бабезиоз, холеру, тиф, чуму, шигеллез, сальмонеллез, болезнь легионеров, болезнь Лайма, малярию, анкилостому, онхоцеркоз, шистозоматоз, трипанозомоз, лейшманиаз, гиардиоз, амебиаз, филяриоз, боррелиоз и трихинеллез. Чужеродный белковый антиген для применения изобретения на практике представляет собой антиген, ассоциированный с заболеванием, более конкретно антиген патогена, вызывающего заболевание.
Рекомбинантные RV, экспрессирующие чужеродный белковый антиген, можно использовать для индукции иммунного ответа против опухолевых клеток и патогенов, которые экспрессируют белок. Прямую доставку фармацевтических композиций in vivo, как правило, осуществляют путем инъекции с использованием общепринятого шприца. В этом отношении композиции можно инъецировать подкожно, эпидермально, внутрикожно, интратекально, интраорбитально, в слизистую оболочку (например, назально, ректально и вагинально), внутрибрюшинно, внутривенно, перорально или внутримышечно. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные аппликации.
После первоначальной иммунизации рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген ("первоначальная иммунизация") могут следовать дополнительные иммунизации рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген. В зависимости от предполагаемого пути введения, рекомбинантный RV может быть включен в различные фармацевтические композиции. Композиции могут включать фармацевтически приемлемый носитель и, необязательно, они могут включать другие медицинские агенты, фармацевтические средства, носители, адъюванты, разбавители и эксципиенты. "Фармацевтически приемлемый" означает материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. материал можно вводить индивидууму вместе с рекомбинантной композицией RV без возникновения каких-либо нежелательных биологических эффектов или взаимодействия вредоносным образом с какими-либо другими компонентами фармацевтической композиции, в которой он содержится. Примеры физиологически приемлемых носителей включают солевые растворы, такие как нормальный солевой раствор, раствор Рингера, PBS (фосфатно-солевой буфер), и, как правило, смеси различных солей, включая калиевые и фосфатные соли с добавками или без добавок сахаров, таких как глюкоза. Пригодные эксципиенты представляют собой, например, воду, солевой раствор декстрозу, глицерин и этанол. В композицию можно добавлять нетоксичные вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, буферы или эмульгаторы. В одном варианте осуществления адъюванты не используют для иммунизаций рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген.
Парентеральное введение, если его используют, обычно характеризуется инъекцией. Стерильные инъецируемые препараты можно получать в общепринятых формах, либо в качестве жидких растворов, либо в качестве суспензий, в качестве твердых форм, пригодных для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией, или в качестве эмульсий.
В соответствии с изобретением, иммунологически эффективное количество рекомбинантного RV, экспрессирующего чужеродный белковый антиген, вводят индивидууму, нуждающемуся в защите от или лечении злокачественной опухоли или индуцируемого патогеном заболевания для индукции защитного иммунный ответ на чужеродный белковый антиген. Эффективное иммунизирующее количество, вводимое индивидууму, представляет собой количество, в котором достигается достаточный иммунологический ответ на антиген для обеспечения эффективного с медицинской точки зрения иммунного ответа на злокачественную опухоль или патоген, при усилении усиливающими иммунизациями свободного от адъювантов чужеродного белкового антигена. Для каждого реципиента общее количество вакцины, подлежащее введению, можно устанавливать из протоколов для иммунизации другими вакцинами. Точное количество рекомбинантного RV, экспрессирующего чужеродный белковый антиген, варьирует от индивидуума к индивидууму, в зависимости от вида, возраста, массы тела и общего состояния индивидуума, конкретного штамма RV и кодируемого чужеродного белкового антигена, пути введения и т.п. Иммунологически эффективную дозировку или эффективное иммунизирующее количество, которым инокулируют животное и которое индуцирует удовлетворительный иммунный ответ, можно без труда определять и его можно без труда титровать путем общепринятого тестирования, например, такого как стандартные исследования с титрованием дозы. Как правило, дозировка приближается к дозировке, которая является типичной для введения других вакцин. В определенных вариантах осуществления одна доза рекомбинантного RV, экспрессирующего чужеродный белковый антиген, вводимый индивидууму, составляет от приблизительно 104 до приблизительно 106 инфекционных единиц тканевой культуры (TCIU), более предпочтительно от приблизительно 105 до приблизительно 106 TCIU. Также осуществляют многократное дозирование.
После первичной иммунизации индивидууму инокулируют по меньшей мере один раз усиливающую композицию, содержащую чужеродный белковый антиген. Усиливающая композиция содержит чужеродный белковый антиген в фармацевтически приемлемом носителе. В усиливающей композиции можно использовать любой носитель, подходящий для парентерального введения чужеродного белкового антигена. Усиливающая композиция может содержать носители, указанные выше для составления рекомбинантного RV. Однако усиливающая композиция является свободной от адъювантов. Несмотря на отсутствие адъюванта, усиливающая иммунизация приводит к значительному увеличению продукции антител, специфичных к чужеродному белку.
В предпочтительных вариантах осуществления усиливающая композиция может содержать фосфатно-солевой буфер, водный раствор хлорида натрия, например, 0,9% раствор хлорида натрия. В одном варианте осуществления усиливающая композиция диспергирована или растворена в носителе, обеспечивающем усиливающую композицию. В одном варианте осуществления белковый антиген является растворимым в воде, и он растворен в свободном от адъювантов носителе на водной основе, таком как солевой раствор или фосфатно-солевой буфер. Усиливающая композиция может содержать дополнительные ингредиенты, такие как стабилизаторы или другие добавки в состав при условии, что они не содержат адъюванта.
Усиливающую иммунизацию можно проводить после инициации иммунного ответа на чужеродный белковый антиген рекомбинантным RV. Как правило, следует позволить пройти по меньшей мере приблизительно 5 суткам, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 суткам после первичной иммунизации рекомбинантным RV перед усиливающей иммунизацией. В некоторых вариантах осуществления усиливающую иммунизацию проводят в пределах от 1 до 300 суток, от 5 до 250, от 10 до 200, от 15 до 150, от 20 до 100, или от 30 до 60 суток после первичной иммунизации рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белок. В конкретных вариантах осуществления усиливающую иммунизацию проводят через 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60 суток после первичной иммунизации.
Можно проводить множество усиливающих иммунизаций для усиления иммунного ответа хозяина на чужеродный белковый антиген. Например, можно проводить 2, 3, 4, 5 или 6 усиливающих иммунизаций с интервалами. Интервалы между усиливающими иммунизациями могут быть единообразными, например, усиливающие иммунизации разделены интервалами, составляющими 5, 10, 20, 25 или 30 суток, или усиливающие иммунизации могут быть запланированы с нерегулярными временными интервалами. Мониторинг развития иммунного ответа индивидуума можно осуществлять общепринятыми способами анализа. Например, мониторинг появления антител к чужеродному белковому антигену в крови или сыворотке индивидуума, которому проводили инокуляцию, можно проводить с помощью стандартных способов анализа антител, включая, но не ограничиваясь ими, радиоиммунный анализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), "сэндвич"-иммуноанализы, иммунорадиометрические анализы, реакции преципитина с диффузией в геле, анализы иммунодиффузии, иммуноанализы in situ (с использованием, например, коллоидного золота, ферментных или радиоизотопных меток), вестерн-блоттинга, реакций преципитации, анализов агглютинации (например, анализы агглютинации в геле, анализы гемагглютинации и т.д.), анализов фиксации комплемента, иммунофлуоресцентных анализов, анализов с белком A и анализов на основе иммуноэлектрофореза. Схему усиливающей иммунизации можно пересматривать в соответствии с развитием индивидуального ответа у индивидуума.
Режим лечения по настоящему изобретению не ограничивается однократной иммунизацией рекомбинантным RV. После первичной иммунизации рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген, можно проводить усиливающие иммунизации, содержащие такой же или отличающийся рекомбинантный RV, экспрессирующий чужеродный белковый антиген. Усиливающие иммунизации RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген, и свободным чужеродным белком при необходимости можно чередовать для увеличения или усиления иммунного ответа индивидуума.
В одном варианте осуществления предусматривается набор, содержащий два вакцинных препарата, пригодных для парентерального введения. Набор содержит первую композицию, содержащую рекомбинантный RV, экспрессирующий по меньшей мере один представляющий интерес чужеродный белковый антиген, для иммунизации индивидуума. Кроме того, набор содержит вторую композицию для усиления иммунного ответа индивидуума на чужеродный белковый антиген. Первая композиция необязательно может содержать адъювант. Предпочтительно, она не содержит адъюванта. Вторая композиция не содержит адъюванта. Соответствующие композиции могут находиться в жидкой или в твердой (лиофилизированной) форме.
Наборы по настоящему изобретению необязательно могут содержать различные контейнеры (например, флакон, ампула, пробирка, колба или бутылка) для каждой индивидуальной композиции. Набор может содержать дополнительные реагенты, такие как буферы, разбавители и т.п., для составления индивидуальных компонентов. Каждый компонент, как правило, является пригодным в качестве распределенного в его соответствующий контейнер или предоставленного в концентрированной форме.
Могут быть включены инструкции по применению набора в соответствии со способами иммунизации, описанными выше. Материал инструкций может содержать публикацию, запись, диаграмму или любой другой носитель, который можно использовать для сообщения о полезности способа по изобретению в наборе для оценки качества ооцитов. Вкладыш в упаковку может содержать текст, находящийся на любом физическом носителе, например, на бумаге, картоне, пленке, или он может содержаться на электронном носителе, таком как дискета, чип, карта памяти или другая электронная форма хранения. Инструкционный материал набора по изобретению может, например, быть прикреплен к контейнеру, который содержит другие компоненты набора, или он может транспортироваться вместе с контейнером, который содержит набор. Альтернативно инструкции могут транспортироваться отдельно от контейнера с тем, чтобы инструкции и содержимое набора могли быть использованы совместно реципиентом.
В определенных вариантах осуществления изобретения режим первичной/усиливающей иммунизации представляет собой иммунизацию против NiV, и чужеродный белок, экспрессируемый рекомбинантным RV и предоставленный в растворимой форме в усиливающей композиции, содержит NiV-G или его иммуногенный фрагмент. Как описано в разделе "Примеры" ниже, иммунизация рекомбинантным RV SPBAANGAS-NG-GAS, высоко аттенуированной живой рекомбинантной вакциной на основе вируса бешенства, экспрессирующей NiV-G, обеспечивала продукцию антител, которые распознают NiV-G и способны нейтрализовать NiV. Однако титры антител были низкими. Усиливающая иммунизация тем же препаратом приводила к мощному анамнестическому антительному ответу и количеству нейтрализующего вирус антитела, которое коррелировало с титрами антител, связывающих NiV-G, в зависимости от концентрации вакцины, использованной для первичной иммунизации. У мышей, которым проводили первичную и вторичную иммунизацию рекомбинантным RV SPBNGAS-GAS, не развивались никакие нейтрализующие NIV или связывающие NIV-G антитела, однако мыши, которым проводили первичную иммунизацию SPBNGAS-GAS, а затем усиливающую иммунизацию SPBAANGAS-NG-GAS, продемонстрировали анамнестический специфичный к NiV-G антительный ответ.
Более того, развитие анамнестического ответа против NiV-G опосредовалось не только вектором RV. Мышей сначала иммунизировали SPBAANGAS-NG-GAS или SPBNGAS-GAS, а затем им проводили усиливающую иммунизацию растворимым свободным от адъюванта NiV-G. Только у мышей, которым проводили первичную иммунизацию SPBAANGAS-NG-GAS, развивался мощный анамнестический антительный ответ против NIV-G, что указывает на то, что иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS индуцирует иммунологическую память, которая в основном является специфичной к NiV-G.
Требованием для любой вакцины является ее способность индуцировать длительный иммунитет. Мыши, иммунизированные два раза SPBAANGAS-NG-GAS, проявляли титры Ig против NiV-G, определенные через 176 суток после второй иммунизации, сходные с титрами, определенными через 10 суток после второй иммунизации. Титры антитела против NiV резко возрастали после третьей иммунизации растворимым свободным от адъюванта NiV-G через 195 суток после второй иммунизации SPBAANGAS-NG-GAS.
Иммунный ответ, достигаемый путем первичной иммунизации рекомбинантным RV, экспрессирующим чужеродный белковый антиген, с последующей усиливающей иммунизацией соответствующим растворимым чужеродным белковым антигеном в свободном от адъюванта препарате, является более мощным, чем иммунный ответ, достигаемый посредством первичной и усиливающей иммунизаций только растворимым чужеродным белком. Когда мышам проводили первичную и усиливающую инокуляции растворимым NiV-G с интервалами, составляющими три недели, после первичной иммунизации не продуцировалось значительных количеств специфичных к NiV-G антител. Усиливающая иммунизация NiV-G приводила к продуцированию только низких титров антител против NG. Более того, продуцировался только изотип IgG 1 и не продуцировался изотип IgG 2 после первичной /усиливающей иммунизации растворимым NiV-G отдельно.
Иммунизация двумя последовательными дозами SPBAANGAS-NG-GAS индуцировала мощный длительный ответ против NiV-G. Однако ответ значительно возрастал после дополнительной иммунизации не содержащим адъюванта растворимым NiV-G. Первичная иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS с последующей усиливающей иммунизацией не содержащим адъюванта растворимым NiV-G, растворимым NG, также индуцировала высокие титры специфичных к NG антител. Усиливающая иммунизация не содержащим адъюванта растворимым NiV-G, которую проводили после первичной и вторичной иммунизаций SPBAANGAS-NG-GAS, индуцировала в основном изотипы IgG 2A и IgG 2B, что указывает на то, что SPBAANGAS-NG-GAS стимулирует доминирующий Th1-ответ против NiV-G.
Применение изобретения на практике иллюстрируется следующими неограничивающими примерами. Изобретение не следует истолковывать как ограниченное только композициями и способами, описанными в настоящем описании, однако его следует истолковывать как также включающее другие композиции и способы. Специалисту в данной области будет известно, что доступны другие композиции и способы для выполнения способов, описанных в настоящем описании.
ПРИМЕРЫ
Пример получения 1: Рекомбинантные векторы на основе вируса бешенства SPBNGAS и SPBNGAS-GAS
Получение рекомбинантных векторов RV SPBNGAS и SPBNGAS-GAS описано в патенте США 7695724. Рекомбинантная вакцина RV SPBNGAS основана на прототипном рекомбинантном вирусе SPBN, который происходит из клона кДНК SAD B19 (Schnell et al., 1994, EMBO J 13:4195-4203).
Для уменьшения патогенности вакцинного вектора RV SPBN, ген G SPBN заменяли сходным геном G, кодирующим одну аминокислотную замену Arg3333→Glu333 с получением вектора SPBN-GA. Мутантный ген G, кодирующий замену Arg3333→Glu333, обозначают как "GA". Для этого подхода ген G RV амплифицировали способом ПЦР с использованием полимеразы Vent (New England Biolabs, Beverly, Mass.) с SN10-333 (Morimoto et al., Vaccine 19:3543-3551, 2001) и клонировали в SPBN. Полученная плазмида была обозначена как pSPBN-GA. Для конструирования рекомбинантного RV, экспрессирующего два идентичных G RV, ген G амплифицировали способом ПЦР с использованием полимеразы Vent с SN10-333 в качестве матрицы и праймеров SN-10 BsiWI (смысловой;CGATGTATACGTACGAAGATGTTCCTCAGCTCTCCTG [участок BsiWI подчеркнут, инициирующий кодон выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO:1)), и SN-10 NheI (антисмысловой; CTTATCAGCTAGCTAGCTAGTTACAGTCTGTCTCACCCCCA [участок NheI подчеркнут, стоп-кодон выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO:2). Продукт ПЦР расщепляли BsiWI и NheI (New England Biolabs) и лигировали с pSPBNGA, который предварительно был расщеплен BsiWI и NheI. Полученная плазмида была обозначена pSPBNGAGA.
Для стабилизации непатогенного фенотипа и предотвращения реверсии SPBN-GA в патогенный фенотип посредством мутации Asn194→Lys194 в GA, Asn194 заменяли на Ser194; реверсия патогенного фенотипа потребовала бы трех замен оснований вместо одной. Далее подвергнутый мутагенезу таким образом ген GA (ATT TCC) обозначили как "GAS". Ген GAS встраивали в вектор RV SPBNGA с получением вектора SPBNGA-S. Вектор pSPBNGAS-GAS, содержащий две копии гена GAS, получали путем встраивания дополнительной копии гена гликопротеина из pSPBNGA-S, как описано выше для конструирования pSPBNGAGA.
Правильные нуклеотидные последовательности встроенных генов подтверждали ПЦР с обратной транскрипцией и секвенированием ДНК следующим образом. Для анализа нуклеотидной последовательности клетки BSR, выращенные во флаконах для культивирования тканей T25, инфицировали спасенными вирусами и инкубировали в течение 3 суток при 34°C. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и экстрагировали РНК с использованием набора RNeasy mini-kit (QIAGEN, Valencia, CA) в соответствии с протоколом изготовителя. Для синтеза кДНК G RV с геномной РНК RV использовали Superscript One-Step RT-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA) и праймеры SADB19 -120seq(+) (AACATGTTATGGTGCCAT TAAACCGCT) (SEQ ID NO:3) и SADB19 +50seq(−) (GGG TGT TAG TTT TTT TCA TGG ACT TGG) (SEQ ID NO:4). Для синтеза кДНК G RV со второго гена G SPBNGA-GA использовали праймеры SBsi2seq(+) (TAA TTA ACG TCC TTT CAA CGA TCC) (SEQ ID NO:5) и SNhe2seq(−) (GAG CAT CTT GAA GTA AGT AGT CTC AGG T) (SEQ ID NO:6). Амплифицированные способом ПЦР продукты подвергали нуклеотидному секвенированию и получали полные нуклеотидные последовательности гена(ов) G и анализировали в отношении присутствия мутаций.
Пример получения 2: Рекомбинантный вектор на основе вируса бешенства SPBAANGAS-GAS
Для облегчения встраивания генов чужеродных антигенов в вектор SPBNGAS вносили участки рестрикции AsiSI и AscI. Фрагмент pSPBNGAS, содержавший межгенные и регуляторные последовательности между PacI и BsiWI, амплифицировали с использованием полимеразы Deep Vent (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) и праймеров InterG BA(+) (5'-CGA TGT ATA CGT ACG TTT TTG CGA TCG CCG TCC TTT CAA CGA TCC AAG TC-3'[участок BsiWI подчеркнут; участок AsiSI выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO: 7)) и InterG AN(-) (5'-CTT AGC GCT AGC AAA AAG GCG CGC CGG AGG GGT GTT AGT TTT TTT CAT G-3'[участок NheI подчеркнут; участок AscI выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO: 8)). Продукт ПЦР расщепляли BsiWI и NheI и лигировали в вакцинный вектор RV pSPBNGAS, предварительно расщепленный BsiWI и NheI, с получением вектора, обозначенного как pSPBAANGAS. Вторую копию гена GAS встраивали в pSPBAANGAS между AscI и NheI аналогичным образом с использованием праймеров, которые содержат участки AscI и NheI: SADB19 AscI(+) (5'-CGA ATT TAT TGG CGC GCC AAG ATG GTT CCT CAG GCT CTC CTG-3' [участок AscI подчеркнут; инициирующий кодон выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO: 9)) и SADB19 NheI(-) (5'-CTT ATC AGC TAG CTA GCT AGT TAC AGT CTG GTC TCA CCC CCA-3' [участок NheI подчеркнут; стоп-кодон выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO: 10)) с получением pSPBAANGAS-GAS. Присутствие встроенных фрагментов подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием.
Пример получения 3: Рекомбинантный вектор на основе вируса бешенства SPBAANGAS-NG-GAS
Ген G NiV клонировали в или pSPBAANGAS-GAS следующим образом с получением варианта с двойным GAS pSPBAANGAS-NG-GAS. Ген G NiV амплифицировали с использованием полимеразы Deep Vent (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) и специфических для гена G праймеров NGB(+) (5'-CCG GAA TTC CGT ACG AAG ATG CCG GCA GAA AAC AAG AAA GTT AGA TTC GA -3'[участок BsiWI подчеркнут; инициирующий кодон выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO: 11)) и NGA2(-) (5'- TGC TCT AGA GCG ATC GCC GTT TAT GTA CAT TGC TCT GGT ATC TTA ACC -3' [участок AsiSI подчеркнут; стоп-кодон выделен полужирным шрифтом] (SEQ ID NO: 12)). Участки распознавания BsiWI и AsiSI вносили с 5'- и 3'-стороны гена NiV G (подчеркнут). Продукт ПЦР расщепляли BsiWI и AsiSI и лигировали в вакцинный вектор RV pSPBAANGAS-GAS, предварительно расщепленный BsiWI и AsiSI. Присутствие вставок и фланкирующих последовательностей подтверждали секвенированием.
Пример получения 4: Рекомбинантный вектор на основе вируса бешенства SPBAANGAS-OV-GAS
Ген OV клонировали в pSPBAANGAS-GAS в соответствии с методологией, сходной с методологией, описанной для pSPBAANGAS-NG-GAS с получением двойного варианта GAS pSPBAANGAS-OV-GAS. В кратком изложении, кДНК OVA синтезировали (GenScript), амплифицировали в Escherichia coli, а затем клонировали в pSPBAANGAS-GAS с получением pSPBAANGAS-OVA-GAS. Присутствие вставки OVA и фланкирующих последовательностей подтверждали секвенированием.
Пример получения 5: Спасение SPBNGAS, SPBNGAS-GAS, SPBNGAS-OVA-GAS и SPBNGAS-NG-GAS из клонов кДНК и оценка экспрессии NG и OVA
Для спасения рекомбинантных вирусов клетки BSR трансфицировали с помощью набора для трансфекции с фосфатом кальция (Stratagene, La Jolla, Calif.) с 5,0 мкг pSPBNGAS, pSPBNGAS-GA, pSPBAANGAS-NG-GAS или pSPBAANGAS-OVA-GAS и 5,0 мкг pTIT-N, 2,5 мкг pTIT-P, 2,5 мкг pTIT-L и 2,0 мкг pTIT-G. После инкубации в течение 3 суток супернатанты переносили на клетки BSR и инкубацию продолжали в течение 3 суток при 37°C. Клетки исследовали в отношении присутствия спасенного вируса путем иммунного окрашивания меченным флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) антителом против белка N RV (Centocor, Malvern, Pa.).
Для анализа экспрессии NG клетки BSR инфицировали SPBAANGAS-NG-GAS. Для обнаружения экспрессии NG клетки инкубировали в течение 24 ч, затем фиксировали 4% параформальдегидом, инкубировали со специфичным к G NiV моноклональным антителом, а затем с конъгированным с FITC антителом против антител кролика, и экспрессию NG на поверхности определяли проточной цитометрией. Для анализа экспрессии OVA клетки BSR инфицировали SPBAANGAS-OVA-GAS, инкубировали в течение 48 ч, а затем лизировали буфером для лизиса. Присутствие OVA в лизате определяли с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела кролика против OVA.
Пример 6: Первичная/усиливающая иммунизация SPBAANGAS-OVA-GAS и растворимым OVA
Мышей иммунизировали внутримышечно (в/м) SPBAANGAS-OVA-GAS или сходным вектором, лишенным гена, кодирующего овальбумин (SPBAAGAS-GAS) с последующей в/м усиливающей иммунизацией SPBAANGAS-OVA-GAS и третьей иммунизацией растворимым не содержащим адъювантов овальбумином (OVA) следующим образом.
Самок мышей Swiss Webster в возрасте от восьми до 10 недель сначала иммунизировали внутримышечно 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержавшего 105 FFU SPBAAGAS-OVA-GAS или SPBAAGAS-GAS. Через двадцать восемь суток всем мышам проводили усиливающую иммунизацию 100 мкл PBS, содержавшего 105 FFU SPBAAGAS-OVA-GAS. Через двадцать пять суток после усиливающей иммунизации мышей подвергали в/м гипериммунизации посредством 100 мкл PBS, содержавшего 100 мкг растворимого овальбумина. У мышей проводили взятие крови через 24 суток после первичной иммунизации, через 11 суток после усиливающей иммунизации и через 10 суток после третьей иммунизации. Взятие образцов крови проводили после каждой иммунизации, и их анализировали в отношении присутствия антител против овальбумина.
Титры антител против овальбумина измеряли способом ELISA для общего иммуноглобулина (общий IgG), IgG1 и IgG2A (фиг. 1). В каждой рамке на фиг. 1 левый столбик соответствует мышам, первоначально иммунизированным SPBAAGAS-GAS, в то время как правый столбик соответствует мышам, первоначально иммунизированным SPBAAGAS-OVA-GAS. Первичная вакцинация каждым вектором (фиг. 1, столбик A) индуцировала слабый ответ антител против овальбумина, который только немного возрастал после усиливающей иммунизации (фиг. 1, колонка B). Гипериммунизация путем введения растворимого овальбумина привела к значительному увеличению продукции антител против овальбумина (фиг. 1, столбик C). Примечательно, что после различных иммунизаций продуцировались в основном антитела IgG 2A и не продуцировалось значительных количеств антител IgG 1 против OVA, что указывает на преобладающий ответ TH1.
Сравнительный пример 7: Первичная/усиливающая иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS
Мышей внутримышечно (в/м) иммунизировали SPBAANGAS-NG-GAS, а затем проводили в/м усиливающую иммунизацию SPBAANGAS-NG-GAS следующим образом.
Группы из десяти самок мышей Swiss Webster в возрасте 6-8 иммунизировали в/м 100 мкл PBS, содержавшего различные концентрации (от 103 до 106 FFU) SPBAANGAS-NG-GAS и через 29 суток проводили в/м усиливающую иммунизацию 100 мкл PBS, содержавшего 106 FFU SPBAANGAS-NG-GAS. У мышей проводили взятие крови через 21 сутки после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации. Нейтрализующие антитела против NiV и антитела, связывающие NiV-G, количественно определяли с использованием ELISA или теста микронейтрализации, соответственно. Титры нейтрализации NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 2 (панель A: нейтрализующие антитела проти NiV; панель B: антитела, связывающие NiV-G). В каждой паре столбиков правый столбик соответствует титру антител после первичной иммунизации; правый столбик соответствует титру антител после усиливающей иммунизации. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних значений ± стандартная ошибка.
Результаты первичной иммунизации демонстрируют, что у иммунизированных мышей продуцировались антитела, которые распознавали NiV-G и были способны нейтрализовать NiV, хотя титры антител были низкими. Первичная иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS также запускала иммунологическую память против NiV-G, поскольку усиливающая иммунизация 105 FFU той же вакцины приводила к мощному анамнестическому антительному ответу. Количество нейтрализующего вирус антитела, которое коррелировало с титрами антител, связывающих NiV-G, зависело от концентрации вакцины, использованной для первичной иммунизации.
Сравнительный пример 8: Первичная иммунизация SPBAANGAS, с последующей усиливающей иммунизацией SPBAANGAS-NG-GAS
Две группы из 10 самок мышей Swiss Webster в возрасте 6-8 недель сначала иммунизировали в/м посредством 100 мкл PBS, содержавшего 105 FFU варианта RV SPBNGAS-GAS. Через 29 суток после первичной иммунизации в одной группе мышей проводили усиливающую иммунизацию 100 мкл PBS, содержавшего 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS, в то время как другую группу вновь иммунизировали 100 мкл PBS, содержавшего 105 FFU SPBNGAS-GAS. У мышей проводили взятие крови через 21 сутки после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации, и количественно определяли нейтрализующие антитела против NiV и антитела, связывающие NiV-G, с использованием ELISA или теста микронейтрализации, соответственно. Титры нейтрализации NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Результаты представлены на фиг. 3: панель A, нейтрализующие антитела против NiV; панель B, антитела, связывающие NiV-G. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних величин ± стандартная ошибка.
Результаты показывают, что в то время как у мышей, которым проводили первичную и вторичную иммунизацию 105 FFU SPBNGAS-GAS (столбики, обозначенные SPBNGAS-GAS/SPBNGAS-GAS на фиг. 3) не развивались никакие нейтрализующие антитела против NIV или антитела, связывающие NIV-G, мыши, первично иммунизированные 105 FFU SPBNGAS-GAS, а затем подвергнутые усиливающей иммунизацией 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS (столбики, обозначенные SPBNGAS-GAS/SPAANGAS-NG-GAS на фиг. 3) продемонстрировали анамнестический специфичный к NiV-G антительный ответ.
Пример 9: первичная иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS, с последующей усиливающей иммунизацией растворимым гликопротеином вируса Нипах
Две группы из 10 самок мышей Swiss Webster в возрасте 6-8 недель сначала иммунизировали в/м посредством 100 мкл PBS, содержавшего 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS или 105 FFU варианта RV SPBNGAS-GAS. Через 23 дня в обеих группах проводили в/м усиливающую иммунизацию 100 мкл PBS, содержавшего 12 мкг рекомбинантно экспрессируемого растворимого не содержащего адъювантов гликопротеина вируса Нипах (NiV-G). У мышей проводили взятие крови через 19 суток после первичной иммунизации (левые столбики в каждой паре столбиков на фиг. 4) и через 10 суток после усиливающей иммунизации (правые столбики в каждой паре столбиков). Антитела, связывающие NiV-G, измеряли с использованием ELISA. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних величин ± стандартная ошибка на фиг. 4. Только у мышей, которым проводили первичную иммунизацию SPBAANGAS-NG-GAS (SPBAANGAS-NG-GAS/NG на фиг. 4) развивался мощный анамнестический ответ антител против NiV-G, что указывает на то, что иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS индуцирует иммунологическую память, которая по большей части является специфичной к NiV-G.
Пример 10: Первичная иммунизация SPBAANGAS-NG-GAS с последующей усиливающей иммунизацией растворимым гликопротеином вируса Нипах - продолжительность эффекта
Группу из десяти самок мышей Swiss Webster в возрасте 6-8 недель иммунизировали в/м два раза, на нулевые сутки и на сутки 29, посредством 100 мкл PBS, содержавшего 105 FFU SPBAANGAS-NG-GAS. Через сто девяносто пять суток после второй иммунизации мышам проводили в/м усиливающую иммунизацию 100 мкл PBS, содержавшего 12 мкг рекомбинантно экспрессируемый NiV-G. У мышей проводили взятие крови через 21 сутки после первичной иммунизации (взятие крови 1), через 10 и 176 суток после второй иммунизации (взятие крови 2 и взятие крови 3), и через 10 суток после третьей иммунизации (взятие крови 4). См. расписание A на фиг. 5. Нейтрализующие антитела против NiV (панель B на фиг. 5), общие специфические антитела против NiV-G (панель C), и специфичные к NG изотипы IgM, IgG 1, IgG 2A и IgG 2B (панель D) количественно определяли с использованием ELISA. Титры нейтрализации NiV определяли с использованием объединенной сыворотки. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних величин ± стандартная ошибка.
Как показано на фиг. 5, титры Ig против NiV-G, определенные через 176 суток (взятие крови 3) после второй иммунизации, были сходными с титрами, определенными через 10 суток (взятие крови 2) после второй иммунизации. Более того, титры антител против NiV резко возрастали (взятие крови 4) после третей иммунизации растворимым NiV-G через 195 суток после второй иммунизации SPBAANGAS-NG-GAS.
Сравнительный пример 11: первичная иммунизация и усиливающая иммунизация растворимым гликопротеином вируса Нипах
Группы из десяти самок мышей Swiss Webster в возрасте 6-8 недель иммунизировали в/м 100 мкл PBS, содержавшего 12 мкг NiV-G и через 3 недели проводили в/м усиливающую иммунизацию 100 мкл PBS, содержавшего 12 мкг NiV-G. У мышей проводили взятие крови через 10 суток после первичной иммунизации и через 10 суток после усиливающей иммунизации. Общие связывающие NiV-G измеряли с использованием ELISA. Результаты представлены на фиг. 6A для двух взятий крови. Также, специфичные к NiV-G изотипы IgM, IgG 1, IgG 2A, и IgG 2B, продуцированные после усиливающей иммунизации, количественно определяли с использованием ELISA. Результаты представлены на фиг. 6B. Титры антител, связывающих NiV-G, представлены в качестве средних величин ± стандартная ошибка.
В то время как после первичной иммунизации не продуцировалось значительных количеств антител, специфичных к NiV-G, усиливающая иммунизация NiV-G приводила к продуцированию относительно низких титров антител против NiV-G (фиг. 6A). Примечательно, что после первичной/усиливающей иммунизации посредством NiV-G отдельно продуцировался только изотип IgG 1 и не продуцировался изотип 2, что указывает на ответ TH2 (фиг. 6B).
Описание каждого патента, патентной заявки и публикации, цитированных в настоящем описании, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Специалисту в данной области будет хорошо понятно, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для осуществления задач и достижения упомянутых результатов и преимуществ, а также его неотъемлемых результатов и преимуществ. В то время как изобретение описано применительно к конкретным вариантам осуществления, очевидно, что другие варианты осуществления и варианты настоящего изобретения могут быть установлены другими специалистами в данной области без отклонения от сущности и объема, используемых при применении настоящего изобретения на практике. Прилагаемую формулу изобретения следует истолковывать как включающую все такие варианты осуществления и эквивалентные варианты.
Claims (14)
1. Способ индукции иммунного ответа у индивидуума, включающий стадии:
(a) получения аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства, кодирующего по меньшей мере один чужеродный белковый антиген, функционально связанный с последовательностями контроля, где чужеродный белковый антиген расположен между двумя генами G в геноме указанного аттенуированного рекомбинантного вируса бешенства и не экспрессируется в структуре рекомбинантного вируса; причем указанные последовательности контроля контролируют экспрессию указанного чужеродного антигена в подходящей реципиентной клетке, инфицированной указанным вирусом; причем аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства содержит мутацию, где аминокислота 333 в гликопротеине представляет собой глутаминовую кислоту, и где аминокислота 194 в гликопротеине представляет собой серин;
(b) инфекции реципиентной клетки указанного индивидуума указанным вирусом бешенства в условиях, которые позволяют экспрессию указанного одного или нескольких чужеродных белковых антигенов реципиентной клеткой, тем самым индуцируя иммунный ответ на указанный чужеродный белковый антиген; и
(с) усиления указанного иммунного ответа на указанный чужеродный белковый антиген путем введения указанному индивидууму указанного чужеродного белкового антигена, содержащегося в усиливающей композиции, которая не содержит адъюванта.
2. Способ по п.1, где чужеродный белковый антиген содержит прионный белковый антиген.
3. Способ по п.1, где указанный чужеродный белковый антиген содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы, состоящей из ассоциированных со злокачественной опухолью антигенов, вирусных антигенов, бактериальных антигенов и антигенов простейших.
4. Способ по п.3, где ассоциированный со злокачественной опухолью антиген выбран из группы, состоящей из AIM-2, альфафетопротеина, ассоциированного с раком мочевого пузыря белка, ассоциированных с карциномой молочной железы MAR-связывающих белков p90 и p70, ассоциированного с раком молочной железы белка 3, карциноэмбрионального антигена, CA-125, антигена эпителиальной опухоли, c-erb/B2, gp100, HER-2, IL13Rα2, MAGE-1, MART-1, ассоциированных с меланомой антигенов, MUC-1, MCU-2, ассоциированного с предстательной железой антигена, аномальных продуктов p53, аномальных продуктов ras, сурвивина, тирозиназы, TRP-2 и тирозинкиназы 2.
5. Способ по п.3, где чужеродный белковый антиген представляет собой вирусный антиген.
6. Способ по п.5, где вирусный антиген представляет собой антиген вируса, выбранного из группы, состоящей из цитомегаловируса, вируса Денге, вируса Эбола, вируса энцефалита лошадей, вируса гепатита, ВИЧ, вируса Хендра, вируса простого герпеса, вируса папилломы человека, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, нейротропных вирусов, вируса Нипах, вируса лихорадки долины Рифт и вируса лихорадки западного Нила.
7. Способ по п.6, где вирусный антиген представляет собой ген G вируса Нипах.
8. Способ по п.3, где чужеродный белковый антиген представляет собой антиген патогена, который ассоциирован с хламидиозом, дифтерией, коклюшем, столбняком, туберкулезом, ассоциированным с нетуберкулезными микобактериями заболеванием, бактериальными и грибковыми пневмониями, бабезиозом, холерой, тифом, чумой, шигеллезом, сальмонеллезом, болезнью Легионеров, болезнью Лайма, малярией, анкилостомой, онхоцеркозом, шистозоматозом, трипанозомозом, лейшманиазом, гиардиозом, амебиазом, филяриозом, боррелиозом или трихинозом.
9. Способ по п.1, где аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства содержит два или более генов G.
10. Способ по п.1, где аттенуированный рекомбинантный вирус бешенства, кодирующий по меньшей мере один чужеродный белок, вводят в реципиентную клетку индивидуума без адъюванта.
11. Способ по п.1, где не содержащая адъюванта усиливающая композиция содержит солевой раствор или фосфатно-солевой буфер.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261708197P | 2012-10-01 | 2012-10-01 | |
US61/708,197 | 2012-10-01 | ||
PCT/US2013/061359 WO2014055289A1 (en) | 2012-10-01 | 2013-09-24 | Immunization with rabies virus vector expressing foreign protein antigen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015116904A RU2015116904A (ru) | 2016-11-27 |
RU2660566C2 true RU2660566C2 (ru) | 2018-07-06 |
Family
ID=50435329
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015116904A RU2660566C2 (ru) | 2012-10-01 | 2013-09-24 | Иммунизация вектором на основе вируса бешенства, экспрессирующим чужеродный белковый антиген |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9889192B2 (ru) |
RU (1) | RU2660566C2 (ru) |
WO (1) | WO2014055289A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180162913A1 (en) * | 2015-05-01 | 2018-06-14 | Immunovaccine Technologies Inc. | Methods for potentiating an immune response using depot-forming and non-depot-forming vaccines |
EP4104854A3 (en) * | 2016-04-04 | 2023-03-08 | The United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Multivalent vaccines for rabies virus and coronaviruses |
CN116063410B (zh) * | 2022-10-20 | 2023-07-14 | 北京标驰泽惠生物科技有限公司 | 一种狂犬病毒g蛋白的突变体及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003030933A1 (en) * | 2001-10-10 | 2003-04-17 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use |
US20080274130A1 (en) * | 2005-10-14 | 2008-11-06 | The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept.Of Health And Human Services | Rabies Virus Vector Systems and Compositions and Methods Thereof |
US20080311147A1 (en) * | 2004-04-19 | 2008-12-18 | Thomas Jeffeson University | Rhabdoviral N-Fusion Proteins as Carrier for Foreign Antigens |
RU2435857C2 (ru) * | 2006-03-15 | 2011-12-10 | Интервет Интернэшнл Б.В. | ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСОВ ОТРЯДА Mononegavirales |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003535577A (ja) | 2000-01-28 | 2003-12-02 | トーマス・ジェファーソン・ユニバーシティー | 免疫不全ウイルス用生ウイルスワクチンとしての組換えラブドウイルス |
PT1573022E (pt) | 2001-04-10 | 2011-08-23 | Agensys Inc | Ácido nucleico e proteína correspondente intitulada 184p1e2, utilizadas para o tratamento e detecção de cancro |
US7695724B2 (en) | 2004-07-12 | 2010-04-13 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies virus compositions |
EP1861424B1 (en) * | 2005-03-14 | 2011-03-30 | The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services | Human monoclonal antibodies against hendra and nipah viruses |
US8282939B2 (en) | 2009-09-11 | 2012-10-09 | Thomas Jefferson University | Attenuated live triple G protein recombinant rabies virus vaccine for pre- and post-exposure prophylaxis of rabies |
-
2013
- 2013-09-24 US US14/430,441 patent/US9889192B2/en active Active
- 2013-09-24 WO PCT/US2013/061359 patent/WO2014055289A1/en active Application Filing
- 2013-09-24 RU RU2015116904A patent/RU2660566C2/ru active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003030933A1 (en) * | 2001-10-10 | 2003-04-17 | Thomas Jefferson University | Recombinant rabies vaccine and methods of preparation and use |
US20080311147A1 (en) * | 2004-04-19 | 2008-12-18 | Thomas Jeffeson University | Rhabdoviral N-Fusion Proteins as Carrier for Foreign Antigens |
US20080274130A1 (en) * | 2005-10-14 | 2008-11-06 | The Govt. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept.Of Health And Human Services | Rabies Virus Vector Systems and Compositions and Methods Thereof |
RU2435857C2 (ru) * | 2006-03-15 | 2011-12-10 | Интервет Интернэшнл Б.В. | ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ВИРУСОВ ОТРЯДА Mononegavirales |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
FABER ET AL. A single amino acid change in Rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity. JOURNAL OF VIROLOGY. 2005, V.79, No.22, P.14141-14148;. * |
FAUL E.J. ET AL. Rabies virus-based vaccines elicit neutralizing antibodies, polyfunctional CD8+ T cell, and protect rhesus macaques from AIDSlike disease after SIVmac251 challenge. Vaccine. 2009, V.28, No.2, P.299-308;. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2014055289A1 (en) | 2014-04-10 |
US20150209422A1 (en) | 2015-07-30 |
US9889192B2 (en) | 2018-02-13 |
RU2015116904A (ru) | 2016-11-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20220105170A1 (en) | African swine fever vaccine | |
BRPI0921927B1 (pt) | Sensibilização de uma resposta imune | |
CN105039372A (zh) | 一种核苷酸疫苗 | |
CN113151184B (zh) | 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法 | |
US20120276139A1 (en) | Use of newcastle disease virus-based vector for inducing an immune response in mammals | |
KR20230124888A (ko) | 광범위한 범위의 코로나바이러스 변이체에 대한 메신저 rna 백신 | |
WO2021254270A1 (zh) | 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法 | |
WO2023023940A1 (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
CN113666990A (zh) | 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用 | |
WO2022212659A1 (en) | Multi-genic mrna vaccine compositions and methods of use | |
RU2660566C2 (ru) | Иммунизация вектором на основе вируса бешенства, экспрессирующим чужеродный белковый антиген | |
US5766601A (en) | Cross-reactive influenza a immunization | |
US20230372466A1 (en) | Universal mammalian influenza vaccine | |
US20170173146A1 (en) | Attenuated Parvovirus Vaccine for Muscovy Duck Parvovirus and Goose Parvovirus (Derzsys Disease) | |
US6673601B1 (en) | Chimeric lyssavirus nucleic acids and polypeptides | |
US20230190919A1 (en) | Coronavirus vaccine compositions and methods of use | |
US8465748B2 (en) | Vaccine compositions and methods containing an immunogen derived from equine arteritis virus | |
JP5946453B2 (ja) | 変異狂犬病ウイルス及びワクチン | |
EP1667715B1 (en) | Antigen delivery system | |
WO2014189654A1 (en) | Co-immunization with attenuated rabies virus and non-rabies antigen | |
EP4306641A1 (en) | Novel nucleic acid molecule | |
WO2023236822A1 (zh) | H5n6禽流感广谱性疫苗的开发及其应用 | |
JP2024518565A (ja) | 組換え重複ペプチド及びネイティブタンパク質を含むワクチン製剤 | |
JP2024503482A (ja) | 複製可能アデノウイルス4型sars-cov-2ワクチンおよびそれらの使用 | |
JP2023543033A (ja) | 弱毒化ブタ流行性下痢ウイルス |