RU2646132C1 - Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования - Google Patents
Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2646132C1 RU2646132C1 RU2016148722A RU2016148722A RU2646132C1 RU 2646132 C1 RU2646132 C1 RU 2646132C1 RU 2016148722 A RU2016148722 A RU 2016148722A RU 2016148722 A RU2016148722 A RU 2016148722A RU 2646132 C1 RU2646132 C1 RU 2646132C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- canescens
- cel5l
- clostridium thermocellum
- cellulase
- Prior art date
Links
- 241000228172 Penicillium canescens Species 0.000 title claims abstract description 34
- 241000193448 Ruminiclostridium thermocellum Species 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 title description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims abstract description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 13
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 abstract description 9
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 abstract description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 abstract 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 abstract 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 229920000324 Cellulosome Polymers 0.000 description 7
- 210000000166 cellulosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 101150052264 xylA gene Proteins 0.000 description 7
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 6
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 6
- 241001516650 Talaromyces verruculosus Species 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 5
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 101150011516 xlnD gene Proteins 0.000 description 3
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 2
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 101100194363 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) res2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 101150037117 pct-1 gene Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 description 1
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 101100111410 Sulfolobus acidocaldarius (strain ATCC 33909 / DSM 639 / JCM 8929 / NBRC 15157 / NCIMB 11770) bgaS gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 108010029402 cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/80—Penicillium
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium canescens СL14 ВКМ F-4706D, продуцирующий бактериальную термофильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum с молекулярной массой 48 кДа. Указанный штамм получают путем трансформации исходного штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-) плазмидой, несущей ген celL, кодирующей целлюлазу Cel5L из бактерии Clostridium thermocellum. Предложен также способ культивирования указанного штамма, включающий выращивание штамма на питательной среде следующего состава (г/л): соевая мука – 45, кукурузный экстракт – 40, KH2PO4 – 6, CaCl2 - 0,23, MgSO4×7H2O - 0,3, дрожжевой экстракт – 10, пшеничные отруби – 10. Группа изобретений обеспечивает эффективную продукцию целлюлазы Cel5L из Clostridium thermocellum в гетерологичном грибном штамме-хозяине. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения и культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium canescens CL14 ВКМ F-4706D, секретирующего термостабильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum.
Реконструкция целлюлосомы in vitro является технологически востребованной задачей в связи с уникальными гидролитическими свойствами комплекса бактериальных целлюлаз по отношению к целлюлозосодержащим растительным материалам [Roy H.Doi and Akihiko Kosugi, Cellulosomes: Plant-Cell-Wall-Degrading Enzyme Complexes, Nature Reviews, 2004, V.2, 541-551]. Разработка нового рекомбинантного штамма на основе мицелиального гриба Penicillium canescens, продуцирующего термостабильную целлюлазу 5-го семейства гликозил-гидролаз, Cel5L, позволит получить новый компонент целлюлосомы грамположительной бактерии Clostridium thermocellum, что является необходимым шагом для реконструкции целлюлосомы in vitro. Техническая значимость создания синтетической целлюлосомы (реконструкции) состоит в способности бактериальных целлюлаз к синергетическому взаимодействию, что приводит к повышению эффективности каталитического расщепления растительных полимеров до технических сахаров [Stern J, Kahn A, Vazana Y, Shamshoum M, Moraïs S, Lamed R, et al. (2015) Significance of Relative Position of Cellulases in Designer Cellulosomes for Optimized Cellulolysis. PLoS ONE 10(5): e0127326. doi:10.1371/journal.pone.0127326].
Cel5L является одной из основных структурных единиц целлюлосомы Clostridium thermocellum, мультиферментного комплекса, состоящего из ряда целлюлаз с различной субстратной специфичностью. Недавно было показано, что фермент Cel5L обладает свойствами процессивной целлобиозидазы, включая высокую активность по отношению к аморфной и кристаллической целлюлозе, а также существенной активностью по β-глюкану [Pillip J.Brumm et al, Clostridium thermocellum Cel5L- Cloning and Characterization of a New, Thermostable GH5 Cellulase, IJBcRR, 2015, V.6(2), 62-74].
К числу наиболее перспективных микроорганизмов для получения ферментных препаратов карбогидраз на сегодняшний день относятся микроскопические грибы рода Trichoderma, Penicillium, а также Aspergillus, что обусловлено в основном их высоким уровнем секреции внеклеточных ферментов [Gusakov A.V. Alternatives to Trichoderma reseei in biofuel production / Trends in Biotechnology. – 2011. - T. 29. - № 9. - С. 419-425, Чекушина А.В., Доценко Г.С., Синицын А.П. / Сравнение эффективности процессов биоконверсии растительного сырья с использованием биокатализаторов на основе Penicillium и Trichoderma. // Катализ в промышленности. – 2012. - № 6. - С. 68-76].
Полученные ранее патенты показывают, что одним из возможных биотехнологически значимых микроорганизмов может являться штамм P.canescens RN3-11-7 niaD(-), неоднократно успешно используемый как реципиент для получения продуцентов гомологичных и гетерологичных белков с использованием сильных промоторов гена ксиланазы и β-галактозидазы, например гетерологичной эндо-1,4-β-глюканазы III P.verruculosum с использованием сильных промоторов гена ксиланазы и β-галактозидазы [Рожкова А.М. Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д. и др. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium canescens. Хранение и переработка сельхозсырья. – 2010. - № 7. - С. 37-39, патент РФ2238974 (С2) опубл. 27.10.2004, ДНК-фрагмент мицелиального гриба Penicillium verruculosum, кодирующего синтез секретируемой эндоглюканазы и группа штаммов Penicillium сanescens, продуцирующих эндоглюканазу III Penicillium verruculosum, cконструированных методами трансформации и генетической инженерии, основываясь на этих фрагментах], α-галактозидазы и пектинлиазы А из P.canescens, целлобиогидролазы I, целлобиогидролазы II и ЭГ II из P.verruculosum [Бушина Е.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Сатрутдинов А.Д., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Создание комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2012. – T. 48. - № 5. - С. 543-549], β-глюкозидазы и инулиназ из A.niger [Волков П.В., Синицына О.А., Федорова Е.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Зоров И.Н., Окунев О.Н., Гусаков А.В., Синицын А.П. Выделение и свойства рекомбинантных инулиназ Aspergillus sp. // Биохимия. – 2012. - Т. 77, - № 5. - С. 611-621]. В качестве примера, демонстрирующего потенциал гриба Penicillium canescens как реципиента для экспрессии гетерологичных генов, следует привести монографию [Sinitsyn AP and Rozhkova AM, Penicillium canescens host as the platform for development of a new recombinant strains producers of carbohydrases, Microbiology Monographs, «Mocroorganisms in Biorefineries», Ed. B.Kamm, Springer, 2015, p.1-19, ISSN 1862-5576, ISBN 978-3-662-45208-0, DOI 10.1007/978-3-662-45209-7, Springer].
Прототипом разработанного технического решения может служить патент РФ № 2378372 «Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата».
Техническая задача, решаемая в результате применения группы разработанных технических решений, состоит в создании штамма-продуцента путем трансформации исходного штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-) плазмидой, несущей ген celL, кодирующей термостабильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum, и подбор среды для культивирования полученного штамма-продуцента с целью получения полноразмерного белка Cel5L.
Техническим результатом, получаемым при реализации разработанных технических решений, является возможность эффективной продукции целлюлазы из Clostridium thermocellum в гетерологичном хозяине Penicillium canescens RN3-11-7 niaD(-).
Для получения указанного технического результата используют полинуклеотидную последовательность гена целевого белка. Целевая плазмида содержит кодирующую последовательность гена celL и функционально связанные с ним регуляторные элементы, промотор и терминатор гена ксиланазы А (xylA) из P.canescens. При реализации указанного способа получают штамм гриба Penicillium canescens CL14 ВКМ F- F-4706D, мультикопийный по гену celL из C.thermocellum.
Кроме того, для получения указанного технического результата предложен способ культивирования полученного штамма-продуцента P.canescens, секретирующего целевой белок Cel5L, на среде, состав которой существенно отличается от стандартной среды для культивирования гриба P.canescens. Одним из ключевых изменений в составе среды является добавление дополнительного количества хлорида кальция и замена дрожжевого экстракта на соевую муку, обеспечивающего стабильность секретируемого целевого белка Cel5L.
Указанные варианты не исчерпывают возможности разработанного способа получения рекомбинантных штаммов P.canescens, экспрессирующих гетерологичные гены из C.thermocellum.
Схема разработки способа получения каждого из рекомбинантных штаммов, секретирующих целлюлосомальные ферменты из C.thermocellum, состоит из трех типовых этапов.
Этап 1. Амплифицируют целевой ген целлюлосомального фермента из C.thermocellum – celL, а также промоторную и терминаторную область гена xylA из P.canescens. Конструируют плазмиду pCelL, представляющую собой полинуклеотидную последовательность, состоящую из промоторной области гена xylA, сигнального пептида, целевого гена celL и терминаторной области гена xylA.
Этап 2. Проводят трансформацию реципиентного высокопродуктивного штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-) целевой плазмидой pCelL, полученной на Этапе 1, в условиях котрансформации вместе с плазмидой, несущей последовательность niaD гена, как маркера селекции, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость целевой фермент. Проводят ферментацию отобранных трансформантов в качалочных колбах и среди них выбирают наиболее продуктивные варианты штаммов-продуцентов.
Этап 3. Подбирают оптимальные условия культивирования наиболее продуктивного варианта штаммов-продуцентов, обеспечивающих стабильность целевого белка во время культивирования и его максимальную продуктивность.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Получение целевой плазмиды pCelL заключалось в клонировании гена сelL [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Clostridium+thermocellum] в универсальный вектор, обеспечивающий экспрессию целевого гена под контролем промотора и терминатора гена xylA из P.canescens.
Амплификацию гена celL из C.thermocellum проводили с использованием праймеров соответствующего состава:
CLU 5' GCACAGGCAGCAGGAGCTTCGCCCACTGTTGCTGCTGATC 3'
CLL 5' AGAGCAAGCCGAGCAGGTTACTCCAGAATAGGAATCTTC 3'
Методом секвенирования по Сэнгеру были определены нуклеотидные последовательности полученных фрагментов. Схематическое изображение структуры экспрессионных кассет показано на Рис. 1. Косым штрихом на Рис.1 обозначена промоторная область гена ксиланазы А (xylA) из P.canescens, черным цветом – сигнальный пептид (bgaS SS), прямым штрихом - целевой ген из C.thermocellum (celL), квадратным штрихом – терминаторная область гена ксиланазы А (xylA) из P.canescens.
Аминокислотная последовательность целевого фермента CEL5L представлена на Рис.2, где подчеркнут сигнальный пептид β-галактозидазы.
Пример 2. Трансформация высокопродуктивного штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7 niaD(-) плазмидами, указанными в Примере 1, для получения набора рекомбинантных штаммов, секретирующих целлюлосомальный фермент Cel5L из C.thermocellum.
К смеси двух плазмид (1 мкг котрансформационной плазмиды PSTA10, несущей ген niaD из A.niger, и 10 мкг плазмиды pCelL, несущей ген celL из C.thermocellum) объемом 20 мкл добавляют 200 мкл раствора протопластов штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-), полученных по методике, описанной в статье [A. Y. Aleksenko, N. A. Makarova, I. V. Nikolaev, A. J. Clutterbuck Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. - 1995. - V. 28. - P. 474-477] и 50 мкл буфера PCT1, содержащего: 50 %-ный ПЭГ 4000 (по объему)+ 0.01M трис-HCl pH 7.5 + 0.02M CaCl2. Смесь аккуратно перемешивают и оставляют на 20 мин во льду. Затем добавляют 500 мкл буфера PCT1 и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Параллельно проводят эксперимент с контрольными протопластами без добавления ДНК. Далее пробирки со смесью протопластов и ДНК центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в 200 мкл стерильного раствора сорбитола (182,2 г/л). Трансформационную смесь стерильно переносят над пламенем горелки в 5 мл верхнего агара (для приготовления 100 мл верхнего агара берут 21,86 г 1,2 М сорбитола, 0,7 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1 М источника азота) перемешивают и распределяют агар по поверхности предварительно подготовленных чашек с нижним агаром (для приготовления 100 мл нижнего агара берут 21,86 г 1,2 М сорбитола, 2 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1М источника азота). Так же переносят и контрольные смеси.
Готовят три чашки Петри с нижним агаром, две с селективной средой (источник азота: NaNO3 10 мM) и одна – с неселективной (источник азота: NH4Cl 10 мM). Чашки Петри помещают в инкубатор на 30°С и оставляют там на 6 дней. На шестой день роста трансформанты переносят на селективную минимальную среду (источник азота: NaNO3 10 мM). В результате трансформации реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 смесью плазмид получают около от 90 до 170 трансформантов на 10 мкг введенной целевой ДНК, что соответствует стандартной частоте трансформации грибных штаммов.
Чтобы среди полученных трансформантов отобрать штаммы, в хромосоме которых содержится встроенный ген целевого белка, проводят первичный скрининг трансформантов методом ПЦР-реакции. Скрининг трансформантов pCELL осуществляли с использованием пары праймеров CLU и CLL. Размер полученного ПЦР-продукта ~1500 п.н. соответствует размеру полинуклеотидной последовательности гена celL из C.thermocellum (Рис. 3, РС – штамм-реципиент, 1-23 – трансформанты, PR – плазмида pCELL, отобранные для культивирования клоны подчеркнуты).
Пример 3. Получение рекомбинантных штаммов P.canescens CL14, мультикопийного по гену celL из C.thermocellum (5-е семейство гликозид-гидролаз, теоретическая молекулярная масса 50 кДа).
Полученные в Примере 2 позитивные по целевому гену celL трансформанты пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO3 и инкубируют при 28ºС в течение 140 часов до образования конидий. Затем трансформанты ферментируют в качалочных колбах, используя ферментационную среду следующего состава, в г/л: соевая шелуха – 45, кукурузный экстракт – 50, KH2PО4 – 25. Колбы инкубируют на качалке при 30оС и 220 об/мин в течение 144 ч. Далее отбирают рекомбинантные штаммы, ферментный комплекс которых содержит целевой белок.
Для культуральной жидкости отобранных штаммов проводят ДДС-электрофорез в денатурирующих условиях, чтобы идентифицировать полосу, соответствующую целевому белку Cel5L (см. Рис. 4, соответствующая полоса обведена овалом). Для доказательства принадлежности экспрессированного белка к целлюлазе CEL5L был проведен масс-спектрометрический анализ образцов полос, вырезанных из гелей, молекулярная масса которых соответствовала искомой - 45-50 кДа. Результаты MALDI-TOF спектрометрии подтвердили наличие ожидаемого CEL5L белка (см. Рис. 5, совпадающие пептиды обозначены подчеркиванием).
Таким образом, среди полученных трансформантов был выбран штамм Penicillium canescens CL14, который был депонирован в Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под номером ВКМ F-4706 D.
Пример 4. Оптимизация условий культивирования рекомбинантного штамма P.canescens CL14, мультикопийного по гену celL из C.thermocellum.
Поскольку стандартная среда для культивирования гриба P.canescens содержит 25 г/л дигидрофосфата калия, то в процессе культивирования в среде должен наблюдаться дефицит ионов кальция, выпадающего в осадок в виде фосфата. В отсутствие ионов кальция в среде для культивирования целлюлосомальный белок Cel5L из C.thermocellum нестабилен, что приводит к деформации белковой глобулы фермента и доступности сайтов протеолиза. Поэтому при формировании состава сред, представленных в Таблице 1, был учтен предыдущий опыт работы с бактериальными целлюлазами, экспрессированными в грибном реципиенте (Среды 1-4, с постепенным снижением количества фосфат-ионов и введением ионов кальция). Основной особенностью сред 5-8 является полная замена соевой шелухи на соевую муку с постепенным снижением концентрации соевой муки в среде и введением стабилизирующих компонентов, взятых на основании предыдущих экспериментов с экспрессией другой целлюлазы Cel48S в грибном штамме Penicillium canescens.
На фореграммах образцов культуральной жидкости рекомбинантных штаммов P.canescens CL14 в 12%-ном ПААГ на 6-е сутки культивирования (Рис. 6) видно, что при использовании сред 1-4 с соевой шелухой молекулярная масса целлюлазы Cel5L ниже теоретически посчитанной (трек 4, Рис. 6, примерно 43-44 кДа), что может быть связано с протеолитическим отщеплением С-конца белка. При замене соевой шелухи на соевую муку в случае использования среды 6 (трек 6, Рис.6, обведено овалом) наблюдалось изменение положения полосы, соответствующей целлюлазе Cel5L. Молекулярная масса Cel5L в случае использования среды 6 составляла 48 кДа, что соответствует теоретической. Следует отметить, что среда 5 (трек 5, Рис.6) без добавления стабилизирующих агентов приводила к увеличению экспрессии целевого, но неполноразмерного белка, а среды 7 и 8 со сниженным содержанием соевой муки приводили к низкой экспрессии Сel5L (данные не приведены).
Таким образом, целевой белок, Cel5L, был стабилизирован в результате снижения концентрации дигидрофосфата калия до 6 г/л, добавления 0,23 г/л хлорида кальция и замене соевой шелухи на соевую муку в концентрации 45 г/л.
Анализируя полученные данные, можно заключить, что состав среды № 6 является оптимальным для культивирования рекомбинантного штамма P.canescens CL14 ВКМ F-4706D.
Таблица 1
Состав сред для культивирования продуцента P.canescens CL14
Компоненты, г/л | Номер среды | |||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
Соевая шелуха | 45 | 45 | 45 | 45 | ||||
Соевая мука | 45 | 45 | 35 | 35 | ||||
Кукурузный экстракт | 50 | 50 | 50 | 40 | 40 | 40 | 50 | 50 |
KH2PO4 | 25 | 12,5 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 |
CaCl2 | - | - | - | 0,23 | - | 0,23 | - | 0,23 |
MgSO4×7H2O | - | - | - | 0,3 | - | 0,3 | - | |
Дрожжевой экстракт | - | - | - | 10 | - | 10 | - | |
Пшеничные отруби | - | - | - | 10 | - | 10 | - |
Claims (2)
1. Рекомбинантный штамм гриба Penicillium canescens CL14 (ВКМ F-4706D), продуцирующий бактериальную термофильную целлюлазу Clostridium thermocellum c молекулярной массой 48 кДа.
2. Способ культивирования штамма по п. 1, отличающийся тем, что штамм по п. 1 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: соевая мука - 45, кукурузный экстракт - 40, КН2РО4 - 6, СaCl2 - 0,23, MgSO4×7H2O - 0,3, дрожжевой экстракт - 10, пшеничные отруби - 10.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016148722A RU2646132C1 (ru) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016148722A RU2646132C1 (ru) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2646132C1 true RU2646132C1 (ru) | 2018-03-01 |
Family
ID=61568396
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016148722A RU2646132C1 (ru) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2646132C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2741078C1 (ru) * | 2019-10-11 | 2021-01-22 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS mtCBHI ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ I И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В САХАРА |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2361918C1 (ru) * | 2008-02-26 | 2009-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы |
RU2378372C2 (ru) * | 2008-03-03 | 2010-01-10 | ООО НПК "Фермтек" | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
WO2010096562A2 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Mascoma Corporation | Yeast cells expressing an exogenous cellulosome and methods of using the same |
-
2016
- 2016-12-13 RU RU2016148722A patent/RU2646132C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2361918C1 (ru) * | 2008-02-26 | 2009-07-20 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" | Штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы |
RU2378372C2 (ru) * | 2008-03-03 | 2010-01-10 | ООО НПК "Фермтек" | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата |
WO2010096562A2 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Mascoma Corporation | Yeast cells expressing an exogenous cellulosome and methods of using the same |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BRUMM P. J. ET AL. Clostridium thermocellum Cel5L - Cloning and Characterization of a New, Thermostable GH5 Cellulase // IJBcRR, 2015, 6(2): 62-74; Article no.IJBcRR.2015.038. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2741078C1 (ru) * | 2019-10-11 | 2021-01-22 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) | ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS mtCBHI ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ I И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В САХАРА |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Visser et al. | Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1 | |
US20220145278A1 (en) | Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates | |
CN105802854B (zh) | 一种纤维素酶高产菌株及其应用 | |
Ruanglek et al. | Cloning, expression, characterization, and high cell-density production of recombinant endo-1, 4-β-xylanase from Aspergillus niger in Pichia pastoris | |
Silva et al. | Production, purification, characterization and application of a new halotolerant and thermostable endoglucanase of Botrytis ricini URM 5627 | |
RU2378372C2 (ru) | Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата | |
Moukouli et al. | Cloning and optimized expression of a GH-11 xylanase from Fusarium oxysporum in Pichia pastoris | |
Jain et al. | Functional expression of a thermostable endoglucanase from Thermoascus aurantiacus RCKK in Pichia pastoris X-33 and its characterization | |
CN108251310B (zh) | 一种新型木霉宿主细胞及其应用 | |
US20230174998A1 (en) | Compositions and methods for enhanced protein production in filamentous fungal cells | |
RU2646132C1 (ru) | Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования | |
Giridhar et al. | Xylanase production by halophilic bacterium Gracilibacillus sp. TSCPVG under solid state fermentation | |
RU2701308C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
US10266814B2 (en) | Systems and methods for production and use of fungal glycosyl hydrolases | |
Rastegari | Molecular mechanism of cellulase production systems in penicillium | |
RU2550044C2 (ru) | ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ | |
CN104371994A (zh) | 一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法 | |
RU2612158C1 (ru) | Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cs15, продуцирующий целлюлазу clostridium thermocellum, и способ его культивирования | |
RU2532840C2 (ru) | ШТАММ ГРИБА Penicillium verruculosum B10 EGII ПРОДУЦЕНТ ЭНДО-1.3/1.4-β-ГЛЮКАНАЗЫ, ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА | |
EP3227430B1 (en) | Fungal host strains, dna constructs, and methods of use | |
Luo et al. | Disruption of vacuolar protein sorting receptor gene Poxvps10 improves cellulolytic enzyme production by Penicillium oxalicum | |
CN111893107A (zh) | 一株异源表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母工程菌株及应用 | |
TOMOTSUNE et al. | Cloning and sequence analysis of the cellulase genes isolated from two cellulolytic Streptomycetes and their heterologous expression in Streptomyces lividans | |
CN110938550A (zh) | 一种促进褐色喜热裂孢菌降解农业废弃物的方法 | |
Orleneva et al. | Identification of the Talaromyces cellulolyticus Gene Encoding an Extracellular Enzyme with β-galactosidase Activity and Testing it as a Reporter for Gene Expression Assays |