RU2646132C1 - Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования - Google Patents

Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования Download PDF

Info

Publication number
RU2646132C1
RU2646132C1 RU2016148722A RU2016148722A RU2646132C1 RU 2646132 C1 RU2646132 C1 RU 2646132C1 RU 2016148722 A RU2016148722 A RU 2016148722A RU 2016148722 A RU2016148722 A RU 2016148722A RU 2646132 C1 RU2646132 C1 RU 2646132C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
strain
canescens
cel5l
clostridium thermocellum
cellulase
Prior art date
Application number
RU2016148722A
Other languages
English (en)
Inventor
Аркадий Пантелеймонович Синицын
Иван Никитич Зоров
Александра Михайловна Рожкова
Павел Валерьевич Волков
Игорь Александрович Шашков
Анна Сергеевна Середа
Анна Вячеславовна Баширова
Original Assignee
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) filed Critical Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН)
Priority to RU2016148722A priority Critical patent/RU2646132C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2646132C1 publication Critical patent/RU2646132C1/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/24Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405Glucanases
    • C12N9/2434Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145Fungal isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12YENZYMES
    • C12Y302/00Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/80Penicillium

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium canescens СL14 ВКМ F-4706D, продуцирующий бактериальную термофильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum с молекулярной массой 48 кДа. Указанный штамм получают путем трансформации исходного штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-) плазмидой, несущей ген celL, кодирующей целлюлазу Cel5L из бактерии Clostridium thermocellum. Предложен также способ культивирования указанного штамма, включающий выращивание штамма на питательной среде следующего состава (г/л): соевая мука – 45, кукурузный экстракт – 40, KH2PO4 – 6, CaCl2 - 0,23, MgSO4×7H2O - 0,3, дрожжевой экстракт – 10, пшеничные отруби – 10. Группа изобретений обеспечивает эффективную продукцию целлюлазы Cel5L из Clostridium thermocellum в гетерологичном грибном штамме-хозяине. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 4 пр.

Description

Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения и культивирования рекомбинантного штамма мицелиального гриба Penicillium canescens CL14 ВКМ F-4706D, секретирующего термостабильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum.
Реконструкция целлюлосомы in vitro является технологически востребованной задачей в связи с уникальными гидролитическими свойствами комплекса бактериальных целлюлаз по отношению к целлюлозосодержащим растительным материалам [Roy H.Doi and Akihiko Kosugi, Cellulosomes: Plant-Cell-Wall-Degrading Enzyme Complexes, Nature Reviews, 2004, V.2, 541-551]. Разработка нового рекомбинантного штамма на основе мицелиального гриба Penicillium canescens, продуцирующего термостабильную целлюлазу 5-го семейства гликозил-гидролаз, Cel5L, позволит получить новый компонент целлюлосомы грамположительной бактерии Clostridium thermocellum, что является необходимым шагом для реконструкции целлюлосомы in vitro. Техническая значимость создания синтетической целлюлосомы (реконструкции) состоит в способности бактериальных целлюлаз к синергетическому взаимодействию, что приводит к повышению эффективности каталитического расщепления растительных полимеров до технических сахаров [Stern J, Kahn A, Vazana Y, Shamshoum M, Moraïs S, Lamed R, et al. (2015) Significance of Relative Position of Cellulases in Designer Cellulosomes for Optimized Cellulolysis. PLoS ONE 10(5): e0127326. doi:10.1371/journal.pone.0127326].
Cel5L является одной из основных структурных единиц целлюлосомы Clostridium thermocellum, мультиферментного комплекса, состоящего из ряда целлюлаз с различной субстратной специфичностью. Недавно было показано, что фермент Cel5L обладает свойствами процессивной целлобиозидазы, включая высокую активность по отношению к аморфной и кристаллической целлюлозе, а также существенной активностью по β-глюкану [Pillip J.Brumm et al, Clostridium thermocellum Cel5L- Cloning and Characterization of a New, Thermostable GH5 Cellulase, IJBcRR, 2015, V.6(2), 62-74].
К числу наиболее перспективных микроорганизмов для получения ферментных препаратов карбогидраз на сегодняшний день относятся микроскопические грибы рода Trichoderma, Penicillium, а также Aspergillus, что обусловлено в основном их высоким уровнем секреции внеклеточных ферментов [Gusakov A.V. Alternatives to Trichoderma reseei in biofuel production / Trends in Biotechnology. – 2011. - T. 29. - № 9. - С. 419-425, Чекушина А.В., Доценко Г.С., Синицын А.П. / Сравнение эффективности процессов биоконверсии растительного сырья с использованием биокатализаторов на основе Penicillium и Trichoderma. // Катализ в промышленности. – 2012. - № 6. - С. 68-76].
Полученные ранее патенты показывают, что одним из возможных биотехнологически значимых микроорганизмов может являться штамм P.canescens RN3-11-7 niaD(-), неоднократно успешно используемый как реципиент для получения продуцентов гомологичных и гетерологичных белков с использованием сильных промоторов гена ксиланазы и β-галактозидазы, например гетерологичной эндо-1,4-β-глюканазы III P.verruculosum с использованием сильных промоторов гена ксиланазы и β-галактозидазы [Рожкова А.М. Волков П.В., Кондратьева Е.А., Сатрутдинов А.Д. и др. Создание продуцентов биотехнологически важных ферментов на основе рекомбинантного штамма гриба Penicillium canescens. Хранение и переработка сельхозсырья. – 2010. - № 7. - С. 37-39, патент РФ2238974 (С2) опубл. 27.10.2004, ДНК-фрагмент мицелиального гриба Penicillium verruculosum, кодирующего синтез секретируемой эндоглюканазы и группа штаммов Penicillium сanescens, продуцирующих эндоглюканазу III Penicillium verruculosum, cконструированных методами трансформации и генетической инженерии, основываясь на этих фрагментах], α-галактозидазы и пектинлиазы А из P.canescens, целлобиогидролазы I, целлобиогидролазы II и ЭГ II из P.verruculosum [Бушина Е.В., Рожкова А.М., Зоров И.Н., Сатрутдинов А.Д., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Создание комплексных ферментных препаратов пектиназ и целлюлаз для переработки свекловичного жома. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2012. – T. 48. - № 5. - С. 543-549], β-глюкозидазы и инулиназ из A.niger [Волков П.В., Синицына О.А., Федорова Е.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Зоров И.Н., Окунев О.Н., Гусаков А.В., Синицын А.П. Выделение и свойства рекомбинантных инулиназ Aspergillus sp. // Биохимия. – 2012. - Т. 77, - № 5. - С. 611-621]. В качестве примера, демонстрирующего потенциал гриба Penicillium canescens как реципиента для экспрессии гетерологичных генов, следует привести монографию [Sinitsyn AP and Rozhkova AM, Penicillium canescens host as the platform for development of a new recombinant strains producers of carbohydrases, Microbiology Monographs, «Mocroorganisms in Biorefineries», Ed. B.Kamm, Springer, 2015, p.1-19, ISSN 1862-5576, ISBN 978-3-662-45208-0, DOI 10.1007/978-3-662-45209-7, Springer].
Прототипом разработанного технического решения может служить патент РФ № 2378372 «Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба Penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба Penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата».
Техническая задача, решаемая в результате применения группы разработанных технических решений, состоит в создании штамма-продуцента путем трансформации исходного штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-) плазмидой, несущей ген celL, кодирующей термостабильную целлюлазу Cel5L из Clostridium thermocellum, и подбор среды для культивирования полученного штамма-продуцента с целью получения полноразмерного белка Cel5L.
Техническим результатом, получаемым при реализации разработанных технических решений, является возможность эффективной продукции целлюлазы из Clostridium thermocellum в гетерологичном хозяине Penicillium canescens RN3-11-7 niaD(-).
Для получения указанного технического результата используют полинуклеотидную последовательность гена целевого белка. Целевая плазмида содержит кодирующую последовательность гена celL и функционально связанные с ним регуляторные элементы, промотор и терминатор гена ксиланазы А (xylA) из P.canescens. При реализации указанного способа получают штамм гриба Penicillium canescens CL14 ВКМ F- F-4706D, мультикопийный по гену celL из C.thermocellum.
Кроме того, для получения указанного технического результата предложен способ культивирования полученного штамма-продуцента P.canescens, секретирующего целевой белок Cel5L, на среде, состав которой существенно отличается от стандартной среды для культивирования гриба P.canescens. Одним из ключевых изменений в составе среды является добавление дополнительного количества хлорида кальция и замена дрожжевого экстракта на соевую муку, обеспечивающего стабильность секретируемого целевого белка Cel5L.
Указанные варианты не исчерпывают возможности разработанного способа получения рекомбинантных штаммов P.canescens, экспрессирующих гетерологичные гены из C.thermocellum.
Схема разработки способа получения каждого из рекомбинантных штаммов, секретирующих целлюлосомальные ферменты из C.thermocellum, состоит из трех типовых этапов.
Этап 1. Амплифицируют целевой ген целлюлосомального фермента из C.thermocellum – celL, а также промоторную и терминаторную область гена xylA из P.canescens. Конструируют плазмиду pCelL, представляющую собой полинуклеотидную последовательность, состоящую из промоторной области гена xylA, сигнального пептида, целевого гена celL и терминаторной области гена xylA.
Этап 2. Проводят трансформацию реципиентного высокопродуктивного штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-) целевой плазмидой pCelL, полученной на Этапе 1, в условиях котрансформации вместе с плазмидой, несущей последовательность niaD гена, как маркера селекции, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость целевой фермент. Проводят ферментацию отобранных трансформантов в качалочных колбах и среди них выбирают наиболее продуктивные варианты штаммов-продуцентов.
Этап 3. Подбирают оптимальные условия культивирования наиболее продуктивного варианта штаммов-продуцентов, обеспечивающих стабильность целевого белка во время культивирования и его максимальную продуктивность.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Получение целевой плазмиды pCelL заключалось в клонировании гена сelL [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Clostridium+thermocellum] в универсальный вектор, обеспечивающий экспрессию целевого гена под контролем промотора и терминатора гена xylA из P.canescens.
Амплификацию гена celL из C.thermocellum проводили с использованием праймеров соответствующего состава:
CLU 5' GCACAGGCAGCAGGAGCTTCGCCCACTGTTGCTGCTGATC 3'
CLL 5' AGAGCAAGCCGAGCAGGTTACTCCAGAATAGGAATCTTC 3'
Методом секвенирования по Сэнгеру были определены нуклеотидные последовательности полученных фрагментов. Схематическое изображение структуры экспрессионных кассет показано на Рис. 1. Косым штрихом на Рис.1 обозначена промоторная область гена ксиланазы А (xylA) из P.canescens, черным цветом – сигнальный пептид (bgaS SS), прямым штрихом - целевой ген из C.thermocellum (celL), квадратным штрихом – терминаторная область гена ксиланазы А (xylA) из P.canescens.
Аминокислотная последовательность целевого фермента CEL5L представлена на Рис.2, где подчеркнут сигнальный пептид β-галактозидазы.
Пример 2. Трансформация высокопродуктивного штамма-реципиента P.canescens RN3-11-7 niaD(-) плазмидами, указанными в Примере 1, для получения набора рекомбинантных штаммов, секретирующих целлюлосомальный фермент Cel5L из C.thermocellum.
К смеси двух плазмид (1 мкг котрансформационной плазмиды PSTA10, несущей ген niaD из A.niger, и 10 мкг плазмиды pCelL, несущей ген celL из C.thermocellum) объемом 20 мкл добавляют 200 мкл раствора протопластов штамма P.canescens RN3-11-7 niaD(-), полученных по методике, описанной в статье [A. Y. Aleksenko, N. A. Makarova, I. V. Nikolaev, A. J. Clutterbuck Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. - 1995. - V. 28. - P. 474-477] и 50 мкл буфера PCT1, содержащего: 50 %-ный ПЭГ 4000 (по объему)+ 0.01M трис-HCl pH 7.5 + 0.02M CaCl2. Смесь аккуратно перемешивают и оставляют на 20 мин во льду. Затем добавляют 500 мкл буфера PCT1 и оставляют на 5 мин при комнатной температуре. Параллельно проводят эксперимент с контрольными протопластами без добавления ДНК. Далее пробирки со смесью протопластов и ДНК центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в 200 мкл стерильного раствора сорбитола (182,2 г/л). Трансформационную смесь стерильно переносят над пламенем горелки в 5 мл верхнего агара (для приготовления 100 мл верхнего агара берут 21,86 г 1,2 М сорбитола, 0,7 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1 М источника азота) перемешивают и распределяют агар по поверхности предварительно подготовленных чашек с нижним агаром (для приготовления 100 мл нижнего агара берут 21,86 г 1,2 М сорбитола, 2 г агара, 0,8 г глюкозы, 1 мл 1М источника азота). Так же переносят и контрольные смеси.
Готовят три чашки Петри с нижним агаром, две с селективной средой (источник азота: NaNO3 10 мM) и одна – с неселективной (источник азота: NH4Cl 10 мM). Чашки Петри помещают в инкубатор на 30°С и оставляют там на 6 дней. На шестой день роста трансформанты переносят на селективную минимальную среду (источник азота: NaNO3 10 мM). В результате трансформации реципиентного штамма P.canescens RN3-11-7 смесью плазмид получают около от 90 до 170 трансформантов на 10 мкг введенной целевой ДНК, что соответствует стандартной частоте трансформации грибных штаммов.
Чтобы среди полученных трансформантов отобрать штаммы, в хромосоме которых содержится встроенный ген целевого белка, проводят первичный скрининг трансформантов методом ПЦР-реакции. Скрининг трансформантов pCELL осуществляли с использованием пары праймеров CLU и CLL. Размер полученного ПЦР-продукта ~1500 п.н. соответствует размеру полинуклеотидной последовательности гена celL из C.thermocellum (Рис. 3, РС – штамм-реципиент, 1-23 – трансформанты, PR – плазмида pCELL, отобранные для культивирования клоны подчеркнуты).
Пример 3. Получение рекомбинантных штаммов P.canescens CL14, мультикопийного по гену celL из C.thermocellum (5-е семейство гликозид-гидролаз, теоретическая молекулярная масса 50 кДа).
Полученные в Примере 2 позитивные по целевому гену celL трансформанты пересевают на чашки с минимальной средой и источником азота NaNO3 и инкубируют при 28ºС в течение 140 часов до образования конидий. Затем трансформанты ферментируют в качалочных колбах, используя ферментационную среду следующего состава, в г/л: соевая шелуха – 45, кукурузный экстракт – 50, KH24 – 25. Колбы инкубируют на качалке при 30оС и 220 об/мин в течение 144 ч. Далее отбирают рекомбинантные штаммы, ферментный комплекс которых содержит целевой белок.
Для культуральной жидкости отобранных штаммов проводят ДДС-электрофорез в денатурирующих условиях, чтобы идентифицировать полосу, соответствующую целевому белку Cel5L (см. Рис. 4, соответствующая полоса обведена овалом). Для доказательства принадлежности экспрессированного белка к целлюлазе CEL5L был проведен масс-спектрометрический анализ образцов полос, вырезанных из гелей, молекулярная масса которых соответствовала искомой - 45-50 кДа. Результаты MALDI-TOF спектрометрии подтвердили наличие ожидаемого CEL5L белка (см. Рис. 5, совпадающие пептиды обозначены подчеркиванием).
Таким образом, среди полученных трансформантов был выбран штамм Penicillium canescens CL14, который был депонирован в Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под номером ВКМ F-4706 D.
Пример 4. Оптимизация условий культивирования рекомбинантного штамма P.canescens CL14, мультикопийного по гену celL из C.thermocellum.
Поскольку стандартная среда для культивирования гриба P.canescens содержит 25 г/л дигидрофосфата калия, то в процессе культивирования в среде должен наблюдаться дефицит ионов кальция, выпадающего в осадок в виде фосфата. В отсутствие ионов кальция в среде для культивирования целлюлосомальный белок Cel5L из C.thermocellum нестабилен, что приводит к деформации белковой глобулы фермента и доступности сайтов протеолиза. Поэтому при формировании состава сред, представленных в Таблице 1, был учтен предыдущий опыт работы с бактериальными целлюлазами, экспрессированными в грибном реципиенте (Среды 1-4, с постепенным снижением количества фосфат-ионов и введением ионов кальция). Основной особенностью сред 5-8 является полная замена соевой шелухи на соевую муку с постепенным снижением концентрации соевой муки в среде и введением стабилизирующих компонентов, взятых на основании предыдущих экспериментов с экспрессией другой целлюлазы Cel48S в грибном штамме Penicillium canescens.
На фореграммах образцов культуральной жидкости рекомбинантных штаммов P.canescens CL14 в 12%-ном ПААГ на 6-е сутки культивирования (Рис. 6) видно, что при использовании сред 1-4 с соевой шелухой молекулярная масса целлюлазы Cel5L ниже теоретически посчитанной (трек 4, Рис. 6, примерно 43-44 кДа), что может быть связано с протеолитическим отщеплением С-конца белка. При замене соевой шелухи на соевую муку в случае использования среды 6 (трек 6, Рис.6, обведено овалом) наблюдалось изменение положения полосы, соответствующей целлюлазе Cel5L. Молекулярная масса Cel5L в случае использования среды 6 составляла 48 кДа, что соответствует теоретической. Следует отметить, что среда 5 (трек 5, Рис.6) без добавления стабилизирующих агентов приводила к увеличению экспрессии целевого, но неполноразмерного белка, а среды 7 и 8 со сниженным содержанием соевой муки приводили к низкой экспрессии Сel5L (данные не приведены).
Таким образом, целевой белок, Cel5L, был стабилизирован в результате снижения концентрации дигидрофосфата калия до 6 г/л, добавления 0,23 г/л хлорида кальция и замене соевой шелухи на соевую муку в концентрации 45 г/л.
Анализируя полученные данные, можно заключить, что состав среды № 6 является оптимальным для культивирования рекомбинантного штамма P.canescens CL14 ВКМ F-4706D.
Таблица 1
Состав сред для культивирования продуцента P.canescens CL14
Компоненты, г/л Номер среды
1 2 3 4 5 6 7 8
Соевая шелуха 45 45 45 45
Соевая мука 45 45 35 35
Кукурузный экстракт 50 50 50 40 40 40 50 50
KH2PO4 25 12,5 6 6 6 6 6 6
CaCl2 - - - 0,23 - 0,23 - 0,23
MgSO4×7H2O - - - 0,3 - 0,3 -
Дрожжевой экстракт - - - 10 - 10 -
Пшеничные отруби - - - 10 - 10 -

Claims (2)

1. Рекомбинантный штамм гриба Penicillium canescens CL14 (ВКМ F-4706D), продуцирующий бактериальную термофильную целлюлазу Clostridium thermocellum c молекулярной массой 48 кДа.
2. Способ культивирования штамма по п. 1, отличающийся тем, что штамм по п. 1 выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: соевая мука - 45, кукурузный экстракт - 40, КН2РО4 - 6, СaCl2 - 0,23, MgSO4×7H2O - 0,3, дрожжевой экстракт - 10, пшеничные отруби - 10.
RU2016148722A 2016-12-13 2016-12-13 Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования RU2646132C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148722A RU2646132C1 (ru) 2016-12-13 2016-12-13 Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148722A RU2646132C1 (ru) 2016-12-13 2016-12-13 Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2646132C1 true RU2646132C1 (ru) 2018-03-01

Family

ID=61568396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016148722A RU2646132C1 (ru) 2016-12-13 2016-12-13 Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2646132C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2741078C1 (ru) * 2019-10-11 2021-01-22 Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS mtCBHI ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ I И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В САХАРА

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2361918C1 (ru) * 2008-02-26 2009-07-20 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" Штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы
RU2378372C2 (ru) * 2008-03-03 2010-01-10 ООО НПК "Фермтек" Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата
WO2010096562A2 (en) * 2009-02-20 2010-08-26 Mascoma Corporation Yeast cells expressing an exogenous cellulosome and methods of using the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2361918C1 (ru) * 2008-02-26 2009-07-20 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная компания "Фермтек" Штамм мицелиального гриба penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы
RU2378372C2 (ru) * 2008-03-03 2010-01-10 ООО НПК "Фермтек" Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата
WO2010096562A2 (en) * 2009-02-20 2010-08-26 Mascoma Corporation Yeast cells expressing an exogenous cellulosome and methods of using the same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUMM P. J. ET AL. Clostridium thermocellum Cel5L - Cloning and Characterization of a New, Thermostable GH5 Cellulase // IJBcRR, 2015, 6(2): 62-74; Article no.IJBcRR.2015.038. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2741078C1 (ru) * 2019-10-11 2021-01-22 Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS mtCBHI ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗЫ I И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ БИОКОНВЕРСИИ ВОЗОБНОВЛЯЕМОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ В САХАРА

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Visser et al. Development of a mature fungal technology and production platform for industrial enzymes based on a Myceliophthora thermophila isolate, previously known as Chrysosporium lucknowense C1
US20220145278A1 (en) Protein production in filamentous fungal cells in the absence of inducing substrates
CN105802854B (zh) 一种纤维素酶高产菌株及其应用
Ruanglek et al. Cloning, expression, characterization, and high cell-density production of recombinant endo-1, 4-β-xylanase from Aspergillus niger in Pichia pastoris
Silva et al. Production, purification, characterization and application of a new halotolerant and thermostable endoglucanase of Botrytis ricini URM 5627
RU2378372C2 (ru) Генетическая конструкция для обеспечения экспрессии целевых гомологичных и гетерологичных генов в клетках мицелиального гриба penicillium verruculosum, используемого в качестве хозяина, способ получения штамма гриба penicillium verruculosum и способ получения ферментного препарата
Moukouli et al. Cloning and optimized expression of a GH-11 xylanase from Fusarium oxysporum in Pichia pastoris
Jain et al. Functional expression of a thermostable endoglucanase from Thermoascus aurantiacus RCKK in Pichia pastoris X-33 and its characterization
CN108251310B (zh) 一种新型木霉宿主细胞及其应用
US20230174998A1 (en) Compositions and methods for enhanced protein production in filamentous fungal cells
RU2646132C1 (ru) Рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cl14, продуцирующий компонент целллюлосомы clostridium thermocellum, и способ его культивирования
Giridhar et al. Xylanase production by halophilic bacterium Gracilibacillus sp. TSCPVG under solid state fermentation
RU2701308C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы
US10266814B2 (en) Systems and methods for production and use of fungal glycosyl hydrolases
Rastegari Molecular mechanism of cellulase production systems in penicillium
RU2550044C2 (ru) ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА Penicillium verruculosum, ИСПОЛЬЗУЕМОГО В КАЧЕСТВЕ ХОЗЯИНА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА ГРИБА Penicillium verruculosum И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ЕГО ОСНОВЕ
CN104371994A (zh) 一种结合常压室温等离子体诱变方式高通量筛选重组酶高产枯草芽孢杆菌宿主的方法
RU2612158C1 (ru) Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба penicillium canescens cs15, продуцирующий целлюлазу clostridium thermocellum, и способ его культивирования
RU2532840C2 (ru) ШТАММ ГРИБА Penicillium verruculosum B10 EGII ПРОДУЦЕНТ ЭНДО-1.3/1.4-β-ГЛЮКАНАЗЫ, ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, β-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА
EP3227430B1 (en) Fungal host strains, dna constructs, and methods of use
Luo et al. Disruption of vacuolar protein sorting receptor gene Poxvps10 improves cellulolytic enzyme production by Penicillium oxalicum
CN111893107A (zh) 一株异源表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母工程菌株及应用
TOMOTSUNE et al. Cloning and sequence analysis of the cellulase genes isolated from two cellulolytic Streptomycetes and their heterologous expression in Streptomyces lividans
CN110938550A (zh) 一种促进褐色喜热裂孢菌降解农业废弃物的方法
Orleneva et al. Identification of the Talaromyces cellulolyticus Gene Encoding an Extracellular Enzyme with β-galactosidase Activity and Testing it as a Reporter for Gene Expression Assays