RU2639404C1 - Method for spleen lymphoid tissue reconstruction in laboratory animals - Google Patents
Method for spleen lymphoid tissue reconstruction in laboratory animals Download PDFInfo
- Publication number
- RU2639404C1 RU2639404C1 RU2016134692A RU2016134692A RU2639404C1 RU 2639404 C1 RU2639404 C1 RU 2639404C1 RU 2016134692 A RU2016134692 A RU 2016134692A RU 2016134692 A RU2016134692 A RU 2016134692A RU 2639404 C1 RU2639404 C1 RU 2639404C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- spleen
- laboratory animals
- mmsc
- lymphoid tissue
- Prior art date
Links
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 abstract 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract 1
- 210000005004 lymphoid follicle Anatomy 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000003562 morphometric effect Effects 0.000 description 5
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 206010073306 Exposure to radiation Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 101150084229 ATXN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- -1 CD 54 Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 101001065556 Mus musculus Lymphocyte antigen 6G Proteins 0.000 description 1
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 238000011892 Von Kossa's method Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000004251 balanced diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 108010041473 complement C3e Proteins 0.000 description 1
- 230000000881 depressing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
- G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
- G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
- G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Computational Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Algebra (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Mathematical Analysis (AREA)
- Mathematical Optimization (AREA)
- Mathematical Physics (AREA)
- Pure & Applied Mathematics (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Educational Administration (AREA)
- Educational Technology (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления регенерации лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных (мыши).The invention relates to medicine and is intended to restore the regeneration of lymphoid tissue of the spleen of laboratory animals (mice).
Известен способ активации регенерации лимфоидной ткани селезенки лабораторных животных (мыши) при воздействии производного индолилтиоалканкарбоновой кислоты (соединения BL-11-02). Соединение BL-11-02 вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг (1/75 от LD50) (Весовые, морфометрческие и цитологические характеристики лимфоидных органов мышей при воздействии производного индолилтиоалканкарбоновой кислоты (соединения BL-11-02) / В.Л. Лимонов, А.В. Шурлыгина, М.В. Робинсон, Л.В. Вербицкая, Н.Г. Пантелеева, М.В. Тендитник, О.П. Колесникова, В.А. Труфакин // Бюллетень СО РАМН. - 2005. - №2 (116). - С. 55-58). Недостатком этого способа является то, что данное вещество обладает дозозависимой антипролиферативной активностью, оказывает угнетающее влияние на пролиферацию Т- и В-клеточного звеньев иммунитета в центральных и периферических органах иммунной системы (Влияние производного индолтиоалканкарбоновой кислоты (соединения ВЛ-11-02) на пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток у интактных мышей / В.Л. Лимонов, А.В. Шурлыгина, М.В. Робинсон, Е.В. Мельникова, О.П. Колесникова, К.В. Гайдуль, А.Н. Мирскова, В.А. Труфакин // Сибирский научный медицинский журнал. - 2005. - Т. 25, №1. - С. 70-73).A known method of activating the regeneration of lymphoid tissue of the spleen of laboratory animals (mice) when exposed to an indolylthioalkanecarboxylic acid derivative (compound BL-11-02). Compound BL-11-02 was administered intraperitoneally at a dose of 10 mg / kg (1/75 of LD 50 ) (Weight, morphometric and cytological characteristics of mouse lymphoid organs when exposed to an indolylthioalkanecarboxylic acid derivative (compound BL-11-02) / B.L. Limonov, A.V. Shurlygina, M.V. Robinson, L.V. Verbitskaya, N.G. Panteleeva, M.V. Tenditnik, O.P. Kolesnikova, V.A. Trufakin // Bulletin SB RAMS .-- 2005. - No. 2 (116). - S. 55-58). The disadvantage of this method is that this substance has a dose-dependent antiproliferative activity, has a depressing effect on the proliferation of T- and B-cell immunity in the central and peripheral organs of the immune system (Effect of the indolthioalkanecarboxylic acid derivative (compound VL-11-02) on proliferative activity immunocompetent cells in intact mice / V.L. Limonov, A.V. Shurlygina, M.V. Robinson, E.V. Melnikova, O.P. Kolesnikova, K.V. Gaidul, A.N. Mirskova, V. A. Trufakin // Siberian Scientific Institute Ditsinsky Journal. - 2005. - T. 25, No. 1. - S. 70-73).
Наиболее близким техническим решением является способ восстановления селезенки после лучевой нагрузки путем внутривенной аллогенной трансплантации лабораторным животным через час после облучения мультипотентных мезенхиальных стволовых клеток (ММСК) и гемопоэтичных стволовых клеток (ГСК), полученных из плаценты самок-мышей при сроке гестации 14 дней, при этом ММСК вводят в дозе 6,5 млн клеток, кг, а ГСК - в дозе 400 тыс. клеток/кг (патент RU №2551937, МПК G09B 23/28, A61K 35/44, A61P 43/00, опубл. 10.06.2015).The closest technical solution is the method of recovery of the spleen after radiation exposure by intravenous allogeneic transplantation to laboratory animals an hour after irradiation of multipotent mesenchial stem cells (MMSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs) obtained from the placenta of female mice with a gestational age of 14 days, MMSCs are administered at a dose of 6.5 million cells, kg, and HSCs at a dose of 400 thousand cells / kg (patent RU No. 2551937, IPC G09B 23/28, A61K 35/44, A61P 43/00, publ. 06/10/2015 )
Данный способ позволяет расширить арсенал средств, способных обеспечить регенераторный потенциал тканей селезенки, а также повысить регенерацию основных морфометрических показателей селезенки после воздействия лучевой нагрузки, однако он не приводит к активации регенерации лимфоидной ткани селезенки, т.е. не влияет на структуру селезенки.This method allows you to expand the arsenal of tools that can provide the regenerative potential of spleen tissue, as well as increase the regeneration of the main morphometric parameters of the spleen after exposure to radiation, but it does not lead to activation of regeneration of lymphoid tissue of the spleen, i.e. does not affect the structure of the spleen.
Задачей изобретения является получение лекарственных средств, улучшающих структуру селезенки после лучевой нагрузки.The objective of the invention is to obtain drugs that improve the structure of the spleen after radiation exposure.
Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в увеличении морфометрических и цитологических показателей лимфоидной ткани селезенки.The technical result that will be obtained from the use of the invention is to increase the morphometric and cytological parameters of the lymphoid tissue of the spleen.
Технический результат достигается тем, что в способе восстановления лимфоидной ткани селезенки путем внутривенной сочетанной аллогенной трансплантации лабораторным животным через 20 мин после облучения проводят внутривенную аллогенную трансплантацию мультипотентных стромальных клеток ММСК) и гемопоэтичных стволовых клеток (ГСК), полученных из хориона плаценты лабораторных животных, при этом ММСК вводят в дозе 6,2 млн клеток/кг, а ГСК - в дозе 330 тыс. клеток/кг.The technical result is achieved by the fact that in the method of restoring spleen lymphoid tissue by intravenous combined allogeneic transplantation to laboratory animals, intravenous allogeneic transplantation of multipotent stromal cells MMSC) and hematopoietic stem cells (HSC) obtained from the chorion of the placenta of laboratory animals is performed 20 minutes after irradiation. MMSCs are administered at a dose of 6.2 million cells / kg, and HSCs at a dose of 330 thousand cells / kg.
Сущность изобретения состоит в сочетанной трансплантации лабораторным животным плацентарных ММСК и ГСК в количестве 6,2 млн клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг соответственно.The invention consists in the combined transplantation of laboratory animals of placental MMSC and HSC in the amount of 6.2 million cells / kg and 330 thousand cells / kg, respectively.
Эффективность применения ММСК в качестве котрансплантата при введении ГСК обусловлена тем, что они вырабатывают цитокины и факторы роста, необходимые для хоуминга и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (Kavanagh D. J. et al., 2011). ММСК синтезируют компоненты матрикса, в том числе фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны. При этом ММСК способны дифференцироваться в клетки стромы, которая обеспечивает синтез экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микроокружение, необходимое для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток (Chow A. et al., 2011; Jones Е. et al., 2011). Кроме того, ММСК обладают свойством продуцировать противовоспалительные цитокины, а также обеспечивать стимуляцию ангиогенеза (Kavanagh Н. et al., 2011; Kidd S. et al., 2010).The effectiveness of the use of MMSCs as a co-graft with the introduction of HSCs is due to the fact that they produce cytokines and growth factors necessary for the homing and differentiation of hematopoietic stem cells (Kavanagh D. J. et al., 2011). MMSCs synthesize matrix components, including fibronectin, laminin, collagen and proteoglycans. Moreover, MMSCs are able to differentiate into stromal cells, which provides the synthesis of an extracellular matrix that forms the microenvironment necessary for the proliferation and differentiation of stem cells (Chow A. et al., 2011; Jones E. et al., 2011). In addition, MMSCs have the ability to produce anti-inflammatory cytokines, as well as provide stimulation of angiogenesis (Kavanagh H. et al., 2011; Kidd S. et al., 2010).
Способность ММСК оказывать иммуносупрессивное действие может обеспечить приживление аллогенного трансплантата (Aldinucci A. et al., 2010; Gebler A. et al., 2012; Han Z. et al., 2012). Выделение ММСК хемоаттрактантов для ГСК обеспечивает направленный хоуминг ГСК, а формирование соответствующего микроокружения дополнительно улучшает приживление трансплантированных аллогенных ГСК (Zhang Y. et al., 2004, Jorgensen С. et al., 2010).The ability of MMSCs to exert an immunosuppressive effect can provide engraftment in an allogeneic transplant (Aldinucci A. et al., 2010; Gebler A. et al., 2012; Han Z. et al., 2012). Isolation of MMSC chemoattractants for HSCs provides directed homing of HSCs, and the formation of the corresponding microenvironment further improves the engraftment of transplanted allogeneic HSCs (Zhang Y. et al., 2004, Jorgensen C. et al., 2010).
Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности свойств, влияющих положительно на структуру лимфоидной ткани селезенки, не выявлено, что соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».From the analysis of scientific, technical and patent literature of the claimed combination of properties that positively affect the structure of the lymphoid tissue of the spleen, it was not revealed that meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is as follows.
Эксперименты выполнены на 20 зрелых лабораторных мышах-самцах в возрасте 3-4 месяцев с массой 18-20 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.The experiments were performed on 20 mature laboratory male mice aged 3-4 months with a weight of 18-20 g. Animals were kept in standard laboratory vivarium conditions under natural light and a balanced diet.
Лабораторные животные были разделены на две группы: опытную и контрольную. Лабораторным животным опытной группы через 20 мин после облучения внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 6,2 млн. клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл среды RPMI. Животным контрольной подгруппы вводили 0,2 мл среды RPMI внутривенно. Забой лабораторных животных осуществлялся на 7 сутки трансплантации клеток.Laboratory animals were divided into two groups: experimental and control. MMSC and HSC, respectively, at a dose of 6.2 million cells / kg and 330 thousand cells / kg, suspended in 0.2 ml of RPMI medium, were intravenously administered to laboratory animals of the experimental group 20 minutes after irradiation. Animals of the control subgroup were injected with 0.2 ml of RPMI medium intravenously. Slaughter of laboratory animals was carried out on the 7th day of cell transplantation.
Клеточные культуры. Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США)) обработки ткани плаценты.Cell culture. The cell culture of MMSC and HSC was obtained from the placenta chorion of laboratory animals. In this case, the mononuclear fraction of the cells was obtained by sequential mechanical and enzymatic (nekazy solution (Millipore, USA)) processing of placental tissue.
Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (X. Munira et al., 2009).HSC was isolated by positive immunomagnetic separation according to SCA-1 antigens (StemCell Technologies, USA) and CD 117 (StemCell Technologies, USA) (X. Munira et al., 2009).
Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD 117, Sca-1 и отрицательных по Lin- (CD45, С3е, Ly-6G, M1/70, Ter-119).Flow cytometry was performed on a FACS Calibur cytometer (BD Bioscienses, USA). In the suspension of transplanted cells, the content of HSCs with immunophenotype positive for CD 117, Sca-1 and negative for Lin- (CD45, C3e, Ly-6G, M1 / 70, Ter-119) was evaluated.
В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела PE labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).PE labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses) antibodies were used as an isotypic control for antibodies during positive immunomagnetic separation on SCA-1 and CD117. In order to determine Lin antigens on the cell surface, a set of antibodies was used - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, USA).
Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.The studies performed allowed us to establish that the cell content after immunomagnetic separation with the immunophenotype CD117 + (Fig. 1), Sca-1 +, Lin- was 70-93%.
Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-), был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).Colony formation test. In order to determine the functional ability of cells isolated by positive immunomagnetic separation (Sca1 +, CD 117+, Lin-), a standard colony formation test was performed in MethoCult methylcellulose medium (StemCell Technologies, Canada). This test allows you to establish the ability of the obtained cells to form various types of hematopoietic colonies. Colony formation was recorded under an Unico inverted microscope (USA).
Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из ткани плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1⋅106 клеток на 1 см2. Культивирование ММСК проводилось в условиях CO2-инкубатора при температуре 37°C с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 ч инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.Culture MMSK. In order to obtain the primary MMSC culture, the mononuclear fraction of cells isolated from placental tissue was passage in a specialized medium for the cultivation of MMSCs in Petri dishes at a concentration of 1 × 10 6 cells per cm 2 . The MMSC was cultured under the conditions of a CO 2 incubator at a temperature of 37 ° C with a carbon dioxide content of 5% and a humidity of 90%. After 24-48 hours of incubation, cells not attached to the bottom of the Petri dish were aspirated. The MMSC culture medium was added to the cells attached to the plastic. The medium was replaced every 3-4 days until the cells reached 70-80% confluency. When the corresponding monolayer was formed, the cells were reseeded.
При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.When transplanted to laboratory animals, the MMSC culture of the third passage was used.
Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagen type I и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).Immunocytochemistry To confirm that the culture belongs to MMSCs, cells were stained using the Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, United States), which contained positive (antibodies to integrin β1, CD 54, collagen type I and fibronectin) and negative markers (antibodies to CD 14, CD 45).
Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies)), Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies)), Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCell Technologies)), Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies)), Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски von Kossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil Red О (J.J. Minguell et al., 2004).The resulting culture was differentiated in adipocytic and osteogenic directions. Composition of differentiation inducing medium: MesenCult ™ Osteogenic Stimulatory Supplement (StemCell Technologies), Canada) / MesenCult ™ Adipogenic Stimulatory Supplement (StemCell Technologies), Canada) and MesenCult ™ MSC Basal Medium (Mouse) (StemCell Technologies)) , Canada) in a ratio of 1: 4, 2 mmol of a solution of L-glutamine (StemCell Technologies), Canada). The fact of osteogenic differentiation is confirmed by the histochemical method of detecting an increase in the expression of alkaline phosphatase, as well as using von Kossa stain, which reveals the presence of mineralized calcium phosphate. The ability of cells to differentiate in the adipocytic direction was confirmed by the histochemical method of detecting lipid vacuoles stained with Oil Red O stain (J.J. Minguell et al., 2004).
Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥ 100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.Counting and determining cell viability. Cell viability was determined by supravital staining with trypan blue solution. Cell counting was performed in 5 large squares of the Goryaev chamber (or ≥ 100 cells). The viability of the isolated cells before transplantation was 95-97%.
Морфологическое исследование селезенки.Morphological study of the spleen.
Оценка регенераторных процессов в белой пульпе селезенки производилась по определению основных морфометрических показателей и анализе цитограммы данного органа. Для проведения гистологического исследования селезенки были изготовлены гистологические препараты органа толщиной 5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрическое исследование проводили с использованием программы Biovison 4.0.Assessment of regenerative processes in the white pulp of the spleen was carried out by determining the main morphometric indicators and analysis of the cytogram of this organ. For histological examination of the spleen, histological preparations of an organ 5 μm thick were made, which were stained with hematoxylin and eosin. Morphometric studies were performed using the Biovison 4.0 software.
Были определены следующие показатели:The following indicators were identified:
- площадь лимфоидного фолликула = суммарная площадь лимфоидных фолликулов/количество лимфоидных фолликулов;- area of the lymphoid follicle = total area of lymphoid follicles / number of lymphoid follicles;
- площадь В-зоны лимфоидного фолликула = суммарная площадь В-зоны лимфоидных фолликулов/количество лимфоидных фолликулов;- area of the B-zone of the lymphoid follicle = total area of the B-zone of the lymphoid follicles / number of lymphoid follicles;
- площадь герминативного центра лимфоидного фолликула = суммарная площадь герминативных центров лимфоидных фолликулов/количество лимфоидных фолликулов;- area of the germinal center of the lymphoid follicle = total area of the germinal centers of the lymphoid follicles / number of lymphoid follicles;
- площадь периартериальной зоны лимфоидного фолликула = суммарная площадь периартериальной зоны лимфоидных фолликулов/количество лимфоидных фолликулов;- area of the periarterial zone of the lymphoid follicle = total area of the periarterial zone of the lymphoid follicles / number of lymphoid follicles;
Для каждого лабораторного животного было проведено по 10 измерений в случайно выбранных срезах из разных отделов органа.For each laboratory animal, 10 measurements were taken in randomly selected sections from different parts of the organ.
Окраска цитологических мазков селезенки проводилась по методу Паппенгейма.Staining of cytological smears of the spleen was carried out according to the Pappenheim method.
Препараты были исследованы с помощью микроскопа Micros МС-50 (Австрия), фоторегистрацию осуществляли цифровой камерой cam V400.The preparations were examined using a Micros MC-50 microscope (Austria), photographic recording was carried out with a cam V400 digital camera.
Статистический анализStatistical analysis
Для каждого ряда значений показателя вычисляли среднюю арифметическую, стандартную ошибку среднего. Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено по критерию Манна-Уитни (U). Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17.0). Вероятность различий считалась достоверной при значениях p<0,05.For each series of indicator values, the arithmetic mean, standard error of the mean was calculated. The significance of differences in the compared samples was carried out according to the Mann-Whitney criterion (U). Statistical data processing was performed using the SPSS Statistics software package (version 17.0). The probability of differences was considered significant at values p <0.05.
Как видно из таблицы, на 7 сутки по заявляемому способу данные морфометрического анализа, отражающие состояние лимфоидной ткани селезенки (площадь фолликула, площадь В-зоны фолликула, площадь реактивного центра), существенно выше, чем в прототипе. Анализ результатов цитограммы селезенки подтверждает данные морфометрического анализа. Так, в цитограмме селезенки установлено достоверное повышение содержания бластов, лимфоцитов и плазматических клеток. Таким образом выявлено, что трансплантация плацентарных ММСК и ГСК (заявляемый способ) влияет на клеточные и тканевые параметры лимфоидной ткани селезенки селезенки, отражающие процессы миграции, пролиферации и дифференцировки в существенно большей степени, чем прототип.As can be seen from the table, on the 7th day according to the claimed method, the data of morphometric analysis, reflecting the state of the spleen lymphoid tissue (follicle area, follicle B-zone area, area of the reactive center), is significantly higher than in the prototype. Analysis of the results of the cytogram of the spleen confirms the data of morphometric analysis. So, in the cytogram of the spleen, a significant increase in the content of blasts, lymphocytes and plasma cells was established. Thus, it was found that transplantation of placental MMSCs and HSCs (the claimed method) affects the cellular and tissue parameters of the lymphoid tissue of the spleen of the spleen, reflecting the processes of migration, proliferation and differentiation to a much greater extent than the prototype.
Способ позволяет активировать регенерацию лимфоидной ткани селезенки.The method allows to activate the regeneration of lymphoid tissue of the spleen.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016134692A RU2639404C1 (en) | 2016-08-24 | 2016-08-24 | Method for spleen lymphoid tissue reconstruction in laboratory animals |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016134692A RU2639404C1 (en) | 2016-08-24 | 2016-08-24 | Method for spleen lymphoid tissue reconstruction in laboratory animals |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2639404C1 true RU2639404C1 (en) | 2017-12-21 |
Family
ID=63857514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016134692A RU2639404C1 (en) | 2016-08-24 | 2016-08-24 | Method for spleen lymphoid tissue reconstruction in laboratory animals |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2639404C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729931C1 (en) * | 2019-07-29 | 2020-08-13 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Method for recovering biochemical parameters of peripheral blood of laboratory animals with hepatic cirrhosis |
| RU2739855C1 (en) * | 2020-01-09 | 2020-12-29 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Method for recovering biochemical indices of peripheral blood of laboratory animals with toxic hepatitis |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2029466C1 (en) * | 1992-01-22 | 1995-02-27 | Юрий Юрьевич Ивницкий | Agent for increase of body mass, thymus, spleen and red marrow bone in animals |
| US6548299B1 (en) * | 1999-11-12 | 2003-04-15 | Mark J. Pykett | Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices |
| RU2463081C2 (en) * | 2005-08-26 | 2012-10-10 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота | Removal and recovery of cell content in organs and tissues |
| US8986743B2 (en) * | 2005-05-17 | 2015-03-24 | Universität Leipzig | Animal model for the human immune system, and method for producing the same |
| RU2551937C1 (en) * | 2013-12-26 | 2015-06-10 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр организации специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий) | Method of recovering spleen after radiation load |
-
2016
- 2016-08-24 RU RU2016134692A patent/RU2639404C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2029466C1 (en) * | 1992-01-22 | 1995-02-27 | Юрий Юрьевич Ивницкий | Agent for increase of body mass, thymus, spleen and red marrow bone in animals |
| US6548299B1 (en) * | 1999-11-12 | 2003-04-15 | Mark J. Pykett | Lymphoid tissue-specific cell production from hematopoietic progenitor cells in three-dimensional devices |
| US8986743B2 (en) * | 2005-05-17 | 2015-03-24 | Universität Leipzig | Animal model for the human immune system, and method for producing the same |
| RU2463081C2 (en) * | 2005-08-26 | 2012-10-10 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота | Removal and recovery of cell content in organs and tissues |
| RU2551937C1 (en) * | 2013-12-26 | 2015-06-10 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр организации специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" (ГБУЗСО Институт медицинских клеточных технологий) | Method of recovering spleen after radiation load |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HU KX et al. Effects of mesenchymal stem cells on cell cycle and apoptosis of hematopoietic tissue cells in irradiated mice Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2007 Dec;15(6):1226-30. * |
| ГРЕБНЕВ Д.Ю. Влияние стволовых клеток на процессы регенерации быстрообновляющихся тканей при старении и после воздействия экстремальных факторов. авто диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Екатеринбург, 2015. * |
| ГРЕБНЕВ Д.Ю. Влияние стволовых клеток на процессы регенерации быстрообновляющихся тканей при старении и после воздействия экстремальных факторов. автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, Екатеринбург, 2015. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2729931C1 (en) * | 2019-07-29 | 2020-08-13 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Method for recovering biochemical parameters of peripheral blood of laboratory animals with hepatic cirrhosis |
| RU2739855C1 (en) * | 2020-01-09 | 2020-12-29 | Государственное автономное учреждение здравоохранения Свердловской области "Центр специализированных видов медицинской помощи "Институт медицинских клеточных технологий" | Method for recovering biochemical indices of peripheral blood of laboratory animals with toxic hepatitis |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5766944A (en) | T cell differentiation of CD34+ stem cells in cultured thymic epithelial fragments | |
| Ratajczak et al. | Adult murine bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells differentiate into the hematopoietic lineage after coculture over OP9 stromal cells | |
| EP0812201B1 (en) | In vitro amplification of stem cells | |
| Huang et al. | Three-dimensional co-culture of mesenchymal stromal cells and differentiated osteoblasts on human bio-derived bone scaffolds supports active multi-lineage hematopoiesis in vitro: Functional implication of the biomimetic HSC niche | |
| Li et al. | Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on hematopoietic recovery and acute graft-versus-host disease in murine allogeneic umbilical cord blood transplantation model | |
| Shi et al. | Transplantation of dermal multipotent cells promotes survival and wound healing in rats with combined radiation and wound injury | |
| Tiwari et al. | Impact of oxygen levels on human hematopoietic stem and progenitor cell expansion | |
| RU2639404C1 (en) | Method for spleen lymphoid tissue reconstruction in laboratory animals | |
| Zhao et al. | Interactions of hematopoietic stem cells with bone marrow niche | |
| Shizhu et al. | Bone marrow mononuclear cell transplant therapy in mice with CCl4-induced acute liver failure | |
| Medvinsky et al. | Analysis and manipulation of hematopoietic progenitor and stem cells from murine embryonic tissues | |
| US9650604B2 (en) | Equine amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells | |
| Elkhafif et al. | Homing of transplanted bone marrow cells in livers of Schistosoma mansoni‐infected mice | |
| RU2729931C1 (en) | Method for recovering biochemical parameters of peripheral blood of laboratory animals with hepatic cirrhosis | |
| Maklakova et al. | Effects of combined transplantation of multipotent mesenchymal stromal and hemopoietic stem cells on regeneration of the hemopoietic tissue | |
| RU2628092C1 (en) | Method for obtaining of msc-associated non-differentiated hemopoietic precursor cells with cd34+/cd133+ phenotype | |
| Madlambayan et al. | Umbilical cord-derived stem cells for tissue therapy: current and future uses | |
| Janel et al. | Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche | |
| Pavlović et al. | Animal and plant stem cells | |
| Mobaraki et al. | Evaluation of expansion and maintenance of umbilical cord blood CD34+ cells in the co-culture with umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in the presence of microcarrier beads | |
| RU2654228C1 (en) | Method of activating erythropoesis of laboratory animals after radiation exposure | |
| WO2004005496A1 (en) | Novel undifferentiated stem cells contained in cord blood, bone marrow, peripheral blood or the like | |
| Rao et al. | Structural and functional characterization of deceased donor stem cells: a viable alternative to living donor stem cells | |
| RU2739855C1 (en) | Method for recovering biochemical indices of peripheral blood of laboratory animals with toxic hepatitis | |
| Abu-Khader et al. | Characterization of the growth modulatory activities of osteoblast conditioned media on cord blood progenitor cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200825 |