RU2634416C1

RU2634416C1 - Producer strains of versions of internaline 321 recombinant proteins, growth factor receptor agonist

Info

Publication number: RU2634416C1
Application number: RU2017115948A
Authority: RU
Inventors: Светлана Александровна Ермолаева; Ярослава Михайловна Чаленко; Елена Владимировна Сысолятина; Константин Александрович Собянин; Егор Валерьевич Калинин
Original assignee: Светлана Александровна Ермолаева; Ярослава Михайловна Чаленко; Елена Владимировна Сысолятина; Константин Александрович Собянин; Егор Валерьевич Калинин
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2017-05-05
Publication date: 2017-10-26

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to production of new strains of E. coli BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-inlBallele9 obtained by transformation of the strain of Escherichia coli BL21 with the BL21-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 or pET28b-inlBallele9 plasmid - the producers of internalin 321 recombinant protein. The invention also relates to internalin 321 production by the said strains.

EFFECT: creation and study of drugs-agonists of natural eukaryotic receptors for soft tissues regeneration and infectious process simulation.

6 cl, 3 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии.The invention relates to biotechnology.

Изобретение относится к получению новых штаммов Е. coli BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-inlBallele9, полученных трансформацией штамма Escherichia coli BL21 плазмидой BL21 -inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-inlBallele9 - продуцентов рекомбинантного белка интерналин 321. Изобретение также относится к получению интерналина 321 с помощью указанных штаммов. Наработанный указанными штаммами интерналин В может применяться во многих сферах биологических и медицинских исследований, в частности при создании и изучении лекарственных средств-агонистов природных эукариотических рецепторов для регенерации мягких тканей и моделирования инфекционного процесса.The invention relates to the production of new strains of E. coli BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-inlBallele9 obtained by transformation of the Escherichia coli strain BL21 with plasmid BL21-inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-derived from recombinant protein to obtain internalin 321 using these strains. The internalins B obtained by these strains can be used in many fields of biological and medical research, in particular, in the creation and study of agonist drugs of natural eukaryotic receptors for the regeneration of soft tissues and modeling of the infectious process.

Рецептор фактора роста гепатоцитов (HGPR), известный также как c-Met, относится к трансмембранным тирозинкиназным рецепторам, регулирующим многие важные клеточные процессы, в том числе пролиферацию, миграцию и дифференциацию клеток человека. Данный рецептор экспрессируется в эпителиальных и мезенхимальных клетках многих органов, включая не только печень, но и кожу, поджелудочную железу, почки и красный костный мозг [1]. HGPR имеет внеклеточный аминоконцевой домен, ответственный за связывание с лигандом, и внутриклеточный домен, обладающий киназной активностью, которые соединяются трансмембранной альфа-спиралью. Первые 500 аминокислотных остатков (а.о.) внеклеточной части HFPR формируют Sema домен. PSI домен, следующий за Sema доменом, охватывает около 50 а.о. и включает 4 дисульфидные связи. Этот домен присоединяется к трансмембранной спирали посредством четырех IPT (immunoglobulin-plexin-transcription) доменов, которых относят к иммуноглобулинподобным доменам. Внутриклеточная часть включает в себя околомембранную последовательность, обуславливающую отрицательную регуляцию киназной активности, киназный домен, положительно модулирующий киназную активность посредством перекрестного фосфорилирования Туr1234 и Туr1235, и мультифункциональный сайт связывания, содержащий два связывающих тирозина 1349 и 1356, с которыми связываются внутриклеточные белки, преимущественно трансдукторы и адапторы сигнальных путей эукариотической клетки [2].Hepatocyte growth factor receptor (HGPR), also known as c-Met, refers to transmembrane tyrosine kinase receptors that regulate many important cellular processes, including the proliferation, migration, and differentiation of human cells. This receptor is expressed in the epithelial and mesenchymal cells of many organs, including not only the liver, but also the skin, pancreas, kidneys, and red bone marrow [1]. HGPR has an extracellular amino-terminal domain responsible for ligand binding and an intracellular domain with kinase activity that are linked by a transmembrane alpha helix. The first 500 amino acid residues (aa) of the extracellular portion of HFPR form the Sema domain. The PSI domain following the Sema domain spans about 50 aa. and includes 4 disulfide bonds. This domain joins the transmembrane helix through four IPT (immunoglobulin-plexin-transcription) domains, which are referred to as immunoglobulin-like domains. The intracellular part includes a near-membrane sequence leading to negative regulation of kinase activity, a kinase domain that positively modulates kinase activity by cross-phosphorylation of Tur-1234 and Tur-1235, and a multifunctional binding site containing two tyrosine-binding proteins 1349 and 1356, to which intracellular proteins bind, mainly adapters of signaling pathways of a eukaryotic cell [2].

Как и многие другие тирозинкиназные рецепторы, HGPR относится к митогенным рецепторам. Активация HGPR его специфическим лигандом - фактором роста гепатоцитов (HGF) - является сигналом начала пролиферации клеток. HGF/HGFR зависимая пролиферация - ключевой момент в процессах регенерации печени и заживлении ран [3, 4]. HGPR вовлечен в регуляцию так называемого процесса рассеяния эпителиальных клеток, которое включает разрушение межклеточных контактов и миграцию клеток [5]. Клеточное рассеяние является одним из ключевых процессов при заживлении ран, а также в эмбриогенезе [6]. Это явление впервые продемонстрировано на MDCK клетках, подвергнутых обработке рекомбинантным лигандом HGF [7].Like many other tyrosine kinase receptors, HGPR is a mitogenic receptor. Activation of HGPR by its specific ligand - hepatocyte growth factor (HGF) - is a signal of the beginning of cell proliferation. HGF / HGFR-dependent proliferation is a key point in the processes of liver regeneration and wound healing [3, 4]. HGPR is involved in the regulation of the so-called epithelial cell scattering process, which includes the destruction of intercellular contacts and cell migration [5]. Cellular scattering is one of the key processes in wound healing, as well as in embryogenesis [6]. This phenomenon was first demonstrated on MDCK cells treated with the recombinant HGF ligand [7].

Активация рецептора HGFR происходит путем, типичным для большинства тирозинкиназных рецепторов. Связывание лиганда приводит к димеризации рецептора, киназные области двух рецепторов сближаются и автофосфорилируются за счет перекрестного фосфорилирования [8]. В случае HGPR рецептора фосфорилируются два тирозиновых остатка (положение 1234 и 1235), расположенных в пределах каталитической петли тирозинкиназного домена [9]. Каскадное фосфорилирование тирозинов в положениях 1349 и 1356 в карбоксильном конце приводит к формированию сайта узнавания для ряда эффекторных белков внутриклеточных сигнальных каскадов, включая адапторные белки GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2), SHC (Src homology-2-containing), CRK (v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homology) и другие. В большинстве случаев они содержат высококонсервативные фосфотирозинсвязывающие домены: SH2-домены или РТВ-домены [8].HGFR receptor activation occurs via a pathway typical of most tyrosine kinase receptors. Ligand binding leads to receptor dimerization, the kinase regions of the two receptors converge and are autophosphorylated due to cross phosphorylation [8]. In the case of the HGPR receptor, two tyrosine residues (position 1234 and 1235) are phosphorylated within the catalytic loop of the tyrosine kinase domain [9]. The cascade phosphorylation of tyrosines at positions 1349 and 1356 at the carboxyl end leads to the formation of a recognition site for a number of effector proteins of intracellular signaling cascades, including adapter proteins GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2), SHC (Src homology-2-containing), CRK ( v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homology) and others. In most cases, they contain highly conserved phosphotyrosine binding domains: SH2 domains or PTB domains [8].

Нижестоящий ответ на активацию HGPR зависит от стереотипных сигнальных модуляторов, общих для всех тирозинкиназных рецепторов, главными из которых являются МАРК-зависимый сигнальный путь (Mitogen activated protein protein kinase), PI3K/Akt-зависимый сигнальный путь и STAT-зависимый сигнальный путь. Все эти пути направлены на то, чтобы передать информацию от рецептора к ядру, что приводит к изменению экспрессии соответствующих генов.The downstream response to HGPR activation depends on stereotypic signal modulators common to all tyrosine kinase receptors, the main of which are the MAPK-dependent signaling pathway (Mitogen activated protein protein kinase), PI3K / Akt-dependent signaling pathway and STAT-dependent signaling pathway. All these paths are aimed at transmitting information from the receptor to the nucleus, which leads to a change in the expression of the corresponding genes.

Сигнальный путь PI3K/Akt стимулирует выживание и рост клеток и включает активацию серин-треониновой киназы mTOR [8]. МАРК-каскадный путь ведет к пролиферации и прогрессированию клеточного цикла. Три компонента этого пути являются протеинкиназами, каждая из которых фосфорилирует последующую, таким образом передавая сигнал дальше к ядру. Последняя киназа Erk непосредственно входит в ядро и активирует факторы транскрипции, обуславливающие регуляцию большого числа генов [1]. Взаимодействие активированного HGPR с белком STAT3 приводит к фосфорилированию этого белка, димеризации и транслокации в ядро, где STAT3 действует как транскрипционный фактор, регулирующий гены, отвечающие за клеточную пролиферацию и дифференциацию.The PI3K / Akt signaling pathway stimulates cell survival and growth and includes activation of the mTOR serine-threonine kinase [8]. The MAPK cascade pathway leads to proliferation and cell cycle progression. The three components of this pathway are protein kinases, each of which phosphorylates the subsequent one, thus transmitting the signal further to the nucleus. The last Erk kinase directly enters the nucleus and activates transcription factors that cause the regulation of a large number of genes [1]. The interaction of activated HGPR with the STAT3 protein leads to the phosphorylation of this protein, dimerization and translocation to the nucleus, where STAT3 acts as a transcription factor that regulates the genes responsible for cell proliferation and differentiation.

Listeria monocytogenes - грамположительная бактерия, факультативный внутриклеточный паразит, вызывающий тяжелое заболевание, как у людей, так и у животных. L. monocytogenes инфицирует главным образом людей с иммунодефицитом, беременных, новорожденных и пожилых. Листерии относятся к энтеропатогенам, и инфекция преимущественно происходит через кишечник, куда возбудитель попадает с контаминированной пищей, приводя к бактериемии, сепсису, энцефалиту и абортам. Бактерия заражает как фагоциты, так и широкий спектр нефагоцитарных клеток. Активная инвазия в непрофессиональные фагоциты происходит благодаря активности двух факторов патогенности L. monocytogenes - белков семейства интерналинов: интерналина А и интерналина В (InlA и InlB) [10, 11]. Интерналины либо секретируются, либо являются закрепленно-поверхностными белками и все имеют общие черты в области N-конца, в то время как С-конец более вариабелен и часто состоит из различных сочетаний небольших доменов, размеры которых порядка 70-80 аминокислотных остатков [12].Listeria monocytogenes is a gram-positive bacterium, an optional intracellular parasite that causes severe illness in both humans and animals. L. monocytogenes primarily infects immunocompromised people, pregnant women, newborns and the elderly. Listeria belongs to enteropathogens, and the infection mainly occurs through the intestines, where the pathogen enters with contaminated food, leading to bacteremia, sepsis, encephalitis and abortion. The bacterium infects both phagocytes and a wide range of non-phagocytic cells. Active invasion of non-professional phagocytes occurs due to the activity of two pathogenicity factors of L. monocytogenes - proteins of the internalin family: internalin A and internalin B (InlA and InlB) [10, 11]. The internalins are either secreted or are surface-attached proteins and all have common features in the N-terminal region, while the C-terminal is more variable and often consists of various combinations of small domains whose sizes are about 70-80 amino acid residues [12] .

Проникновение L. monocytogenes в различные эпителиальные и эндотелиальные клетки требует активации тирозинкиназного рецептора HGPR, которая осуществляется через связывание с белком семейства интерналинов (Интерналин В, InlB). InlB имеет массу 67 кДа и состоит из 630 аминокислот. В структуре белка за короткой cap областью следуют лейцин, богатые повторы (leucine-rich repeat, LRR) и IR-область. Эти три области составляют интерналиновый домен InlВ321 (аминокислоты 36-321). Область, содержащая cap и LRR, достаточна для связывания с рецептором [13], а фрагмент, содержащий и IR область, минимальный фрагмент, способный к активации рецептора [14]. Средняя часть, В-повторы, пока мало изученный домен, функции которого пока неясны. Область С-конца InlB содержит три тандемных повтора длиной около 80 остатков, начинающихся с GW-дипептида. Этот участок опосредует связывания белка с поверхностью бактерии, главным образом через нековалентное взаимодействие с липотейхоевыми кислотами, мембранно-закрепленных полимеров, присутствующих на поверхности грамположительных бактерий [15]. InlB может связываться с гликоаминогликанами, отрицательно заряженными полисахаридами, присутствующими на клеточной поверхности, через GW-повторы. Присутствие на клеточной поверхности гликоаминогликанов значительно повышает интерналинзависимую инвазию [16].The penetration of L. monocytogenes into various epithelial and endothelial cells requires the activation of the HGPR tyrosine kinase receptor, which is carried out through binding to a protein of the family of internalins (Internalin B, InlB). InlB has a mass of 67 kDa and consists of 630 amino acids. In the protein structure, the short cap region is followed by leucine, rich repeats (leucine-rich repeat, LRR) and the IR region. These three regions make up the InlB321 internaline domain (amino acids 36-321). The region containing cap and LRR is sufficient for binding to the receptor [13], and the fragment containing the IR region is the smallest fragment capable of activating the receptor [14]. The middle part, B-repeats, is a little studied domain, whose functions are still unclear. The C-terminal region of InlB contains three tandem repeats with a length of about 80 residues starting with a GW dipeptide. This site mediates protein binding to the bacterial surface, mainly through non-covalent interaction with lipoteichoic acids, membrane-bound polymers present on the surface of gram-positive bacteria [15]. InlB can bind to glycoaminoglycans, negatively charged polysaccharides present on the cell surface, through GW repeats. The presence of glycoaminoglycans on the cell surface significantly increases the internalindependent invasion [16].

В процессе инфекции, вызываемой взаимодействием между InlB и поверхностным рецептором HGPR, сигнальные события приводят к перестройкам цитоскелета клетки млекопитающих и последующей интернализации бактерии [17]. Помимо интернализации клетки активация HGPR через InlB приводит к активации путей, описанных выше, таким образом, делая InlB аналогом эндогенного лиганда этого рецептора - фактора роста гепатоцитов HGF. Было отмечено, что растворимый, не связанный с бактериальной поверхностью InlB ведет себя скорее как фактор роста, чем инвазии, т.е. стимулируя внутриклеточный сигналинг, растворимый белок не вызывает значительных перестроек цитоскелета, связанных с формированием фагоцитарной чаши [15, 18]. Было показано, что InlB ведет к активации PI3/Akt-пути [19], МАРК и STAT3 путей [20].In the process of infection caused by the interaction between InlB and the surface HGPR receptor, signaling events lead to rearrangements of the mammalian cell cytoskeleton and subsequent internalization of the bacterium [17]. In addition to cell internalization, activation of HGPR via InlB leads to activation of the pathways described above, thus making InlB an analogue of the endogenous ligand of this receptor - hepatocyte growth factor HGF. It was noted that soluble InlB, not bound to the bacterial surface, behaves more as a growth factor than an invasion, i.e. By stimulating intracellular signaling, soluble protein does not cause significant cytoskeleton rearrangements associated with the formation of a phagocytic bowl [15, 18]. It was shown that InlB leads to activation of the PI3 / Akt pathway [19], MAPK and STAT3 pathways [20].

Важно, что InlB не проявляет конкурентной способности по отношению к HGF при связывании с рецептором, что говорит об отсутствии конкурентной борьбы между лигандами за место связывания [13]. В исследовании [14], кристаллизовав комплекс между Inl В321 и HGPR, представлено, что первой зоной взаимодействия является контакт между LRR-областью белка и Ig1-доменом рецептора, а второй зоной - между IR-областью белка и 4 и 6 основанием Sema-домена α-цепи рецептора, в то время как взаимодействие HGF с рецептором затрагивает 2 и 3 основание Sema-домена α-цепи рецептора. Данная работа доказывает также, что второй контакт важен именно для активации рецептора, а первый для связывания белка с рецептором. Кроме того, для полноценной активации рецептора требуется полный белок, включающий GW-домен.It is important that InlB does not show competitive ability against HGF upon binding to the receptor, which indicates the absence of competition between ligands for the binding site [13]. In a study [14], having crystallized the complex between Inl B321 and HGPR, it was suggested that the first interaction zone is the contact between the LRR region of the protein and the Ig1 domain of the receptor, and the second zone is between the IR region of the protein and the 4 and 6 base of the Sema domain receptor α-chains, while the interaction of HGF with the receptor affects the 2nd and 3rd base of the Sema domain of the receptor α-chain. This work also proves that the second contact is important for the activation of the receptor, and the first for the binding of the protein to the receptor. In addition, for the full activation of the receptor requires a complete protein, including the GW domain.

В последующих работах [14, 18] показано, что, меняя структуру белка InlB, можно менять активацию рецептора. В [18] определили две новые структуры InlB, антипараллельная, димерная конформация, в которой два промотора взаимодействуют через LRR-домен. Эта связь была обнаружен и в комплексе с рецептором. Разрушение этого контакта приводит к уменьшению способности активировать рецептор и нижележащие пути. Стабилизация связи посредством дисульфидных связей делает димерный вариант с высокой сигнальной активностью, который стимулирует клеточную пролиферацию. В другой работе [20] был сконструирован димер интерналинового домена InlB321 через связующий пептид. Продемонстрировано, что в сравнении с обычным доменом димер показал более высокую степень активации рецептора и стимулирует пролиферацию на уровне полноценного HGF. Изучение природных изолятов L. monocytogenes выявило существование вариантов интерналинового домена InlB, которые отличаются структурно - по наличию аминокислотных замен и функционально - по способности поддерживать вирулентность L. monocytogenes и активировать контролируемые c-Met сигнальные [21, 22].Subsequent studies [14, 18] showed that, by changing the structure of the InlB protein, one can change the activation of the receptor. In [18], two new InlB structures were determined, the antiparallel, dimeric conformation, in which two promoters interact via the LRR domain. This connection was also found in combination with the receptor. The destruction of this contact leads to a decrease in the ability to activate the receptor and underlying pathways. Stabilization of the bond through disulfide bonds makes a dimeric variant with high signaling activity that stimulates cell proliferation. In another work [20], a dimer of the InlB321 internaline domain was constructed through a binding peptide. It was demonstrated that, in comparison with the usual domain, the dimer showed a higher degree of receptor activation and stimulates proliferation at the level of full-fledged HGF. A study of natural isolates of L. monocytogenes revealed the existence of variants of the InlB internaline domain, which differ structurally in the presence of amino acid substitutions and functionally in their ability to maintain virulence of L. monocytogenes and activate c-Met-controlled signaling [21, 22].

Рассматривая потенциальные возможности использования рекомбинантных лигандов рецептора HGFR в терапии, можно выделить следующие преимущества InlB в сравнении с HGF:Considering the potential use of recombinant HGFR receptor ligands in therapy, the following advantages of InlB compared to HGF can be distinguished:

1. Бактериальный белок InlB не имеет структурного сходства с HGF, что предполагает отсутствие потенциальных аутоиммунных реакций.1. The bacterial protein InlB has no structural similarity with HGF, which suggests the absence of potential autoimmune reactions.

2. InlB не требует посттрансляционных модификаций, что значительно упрощает как получение очищенного препарата in vitro, так и возможности использования InlB в генотерапии.2. InlB does not require post-translational modifications, which greatly simplifies both the preparation of a purified preparation in vitro and the possibility of using InlB in gene therapy.

3. Для InlB доступны структурные варианты, отличающиеся по степени активации рецептора HGFR (HGPR), что позволяет оптимизировать использование InlB.3. Structural options are available for InlB, differing in the degree of activation of the HGFR receptor (HGPR), which allows optimizing the use of InlB.

4. Взаимодействие InlB с HGFR включает домены рецептора, альтернативные доменам, вовлеченным в связывание лиганда HGF, что позволяет использовать InlB в ситуациях, в которых невозможна активация рецептора эндогенным лигандом.4. The interaction of InlB with HGFR includes receptor domains alternative to the domains involved in the binding of the HGF ligand, which allows the use of InlB in situations in which activation of the receptor by the endogenous ligand is impossible.

Сущностью настоящего изобретения является создание новых штаммов клеток Escherichia coli BL21, содержащих pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-inlBallele9, продуцирующих рекомбинантный белок - фрагмент InlB - интерналин 321, включающий полноценный рецепторсвязывающий интерналиновый домен белка InlB. Способность клеток Escherichia coli штамма BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 или pET28b-inlBallele9 секретировать рекомбинантный интерналин 321 достигается при помощи генной модификации клеток Escherichia coli плазмидами pET28b (Последовательность №1), каждая из которых содержит аллель гена интерналинового домена inlBallele13 (Последовательность №2), inlBallele14 (Последовательность №3), inlBallele9 (Последовательность №4), соответствующие альтернативным вариантам белка.The essence of the present invention is the creation of new strains of Escherichia coli cells BL21, containing pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14, pET28b-inlBallele9, producing a recombinant protein fragment InlB - internalin 321, including a full-fledged receptor-binding internalin protein domain. The ability of Escherichia coli cells of strain BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 or pET28b-inlBallele9 to secrete recombinant internalin 321 is achieved by gene modification of Escherichia coli cells with plasmids pET28b (Sequence No. 1), each of which contains the allelene domain of the allelene domain ), inlBallele14 (Sequence No. 3), inlBallele9 (Sequence No. 4), corresponding to alternative protein variants.

Целью настоящего изобретения является создание коллекции уникальных клеточных штаммов, которые можно использовать для получения рекомбинантного интерналина 321, соответствующего определенному аллельному варианту гена. Эта задача является актуальной для современной фармакологической биотехнологии. Наработанный указанными штаммами интерналин В может применяться во многих сферах биологических и медицинских исследований, в частности при создании и изучении лекарственных средств-агонистов природных эукариотических рецепторов для регенерации мягких тканей и моделирования инфекционного процесса.An object of the present invention is to provide a collection of unique cell strains that can be used to produce recombinant internalin 321 corresponding to a particular allelic variant of a gene. This task is relevant for modern pharmacological biotechnology. The internalins B obtained by these strains can be used in many fields of biological and medical research, in particular, in the creation and study of agonist drugs of natural eukaryotic receptors for the regeneration of soft tissues and modeling of the infectious process.

Поставленная задача решена получением новых штаммов Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 и pET28b-inlBallele9, трансформированных плазмидой pET28b-inlBallele13 (Последовательность №2), pET28b-inlBallele14 (Последовательность №3) или pET28b-inlBallele9 (Последовательность №4) соответственно и продуцирующих рекомбинантный белок интерналин В в количестве не менее 4 мкг очищенного рекомбинантного белка на 1 мл ростовой среды за 6 часов (по методике Лоури и Бредфорда). Полученный штамм обладает стабильными культуральными и морфологическими свойствами и в результате генной модификации обладает способностью продуцировать рекомбинантный интерналин 321.The problem is solved by obtaining new strains of Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 and pET28b-inlBallele9 transformed with plasmid pET28b-inlBallele13 (Sequence No. 2), pET28b-inlBallele14 (Sequence No. 4-p or (3) or and producing recombinant protein internalin B in an amount of at least 4 μg of purified recombinant protein per 1 ml of growth medium for 6 hours (according to the method of Lowry and Bradford). The resulting strain has stable cultural and morphological properties and, as a result of gene modification, has the ability to produce recombinant internalin 321.

Таким образом, техническим результатом, достигаемым при осуществлении изобретения, является получение вариантов белка интерналина В в количестве не менее 4 мкг очищенного рекомбинантного белка на 1 мл ростовой среды за 6 часов (по методике Лоури и Бредфорда). Кроме того, технический результат также заключается в получении стабильных штаммов, то есть штаммов, обладающих стабильными культуральными и морфологическими свойствами, и в результате генной модификации обладающих способностью продуцировать рекомбинантный интерналин 321.Thus, the technical result achieved by the implementation of the invention is to obtain variants of the protein internalin B in an amount of at least 4 μg of purified recombinant protein per 1 ml of growth medium in 6 hours (according to the method of Lowry and Bradford). In addition, the technical result also consists in obtaining stable strains, that is, strains having stable cultural and morphological properties, and as a result of gene modification with the ability to produce recombinant internalin 321.

Штамм E. coli BL21, содержащий плазмиду pET28b-inlBallele13 (Последовательность №2), pET28b-inlBallele14 (Последовательность №3) или pET28b-inlBallele9 (Последовательность №4), - продуцент рекомбинантного белка интерналина 321, характеризуется следующими признаками.Strain E. coli BL21 containing the plasmid pET28b-inlBallele13 (Sequence No. 2), pET28b-inlBallele14 (Sequence No. 3) or pET28b-inlBallele9 (Sequence No. 4), a producer of the recombinant protein internalin 321, is characterized by the following features.

Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные прямые палочки с закругленными краями, размером 1.1-1.5×2.0-3.0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Колонии на питательном агаре LB гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную муть. Штамм идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.Cultural and morphological characters. Gram-negative straight rods with rounded edges, 1.1-1.5 × 2.0-3.0 microns in size, single, do not form spores and capsules. The colonies on nutrient agar LB are smooth, slightly convex, with a smooth edge. In liquid media form a uniform turbidity. The strain was identified by the Bergi Key (1974) as a strain of the species Escherichia coli.

Физико-биологические признаки. Типичные для Escherichia coli. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Катаболизируют D-глюкозу, L-арабинозу, D-ксилозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, маннит, D-маннозу, L-рамнозу, сорбит, тригаллозу с образованием кислоты (и газа). Не гидролизуют желатину, мочевину, индол (+), триптофандезаминаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), рост в присутствии KCN (-), малонат не используют, пигмент не образуют. Реакция «Фогес-Проскауэра» отрицательная. Не образуют H₂S. Не растут на цитратной среде «Симмонса».Physico-biological signs. Typical for Escherichia coli. Catalopositive. Oxidase-negative. Optional anaerobes. D-glucose, L-arabinose, D-xylose, sucrose, lactose, maltose, mannitol, D-mannose, L-rhamnose, sorbitol, trigallose are catabolized with the formation of acid (and gas). Do not hydrolyze gelatin, urea, indole (+), tryptophandesaminase (-), lysine decarboxylase (+), growth in the presence of KCN (-), malonate is not used, the pigment is not formed. The reaction of the Voges-Proskauer is negative. They do not form H ₂ S. Do not grow on Simmons citrate medium.

Условия хранения штамма. Штамм хранится криоконсервированным при -70°С (до 6 месяцев) в 10%-ном растворе глицерина в питательной среде LB (Бакто-триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, рН 6.8). Условия размножения штамма: штамм выращивают при 37°С в LB-бульоне. Все среды содержат канамицин в концентрации 100 мкг/мл.Storage conditions of the strain. The strain is stored cryopreserved at -70 ° C (up to 6 months) in a 10% solution of glycerol in LB nutrient medium (Bacto-tryptone - 10 g / l, yeast extract - 5 g / l, sodium chloride - 10 g / l, pH 6.8). The conditions of propagation of the strain: the strain is grown at 37 ° C in LB broth. All media contain kanamycin at a concentration of 100 μg / ml.

Условия индукции целевого белка.The conditions for the induction of the target protein.

Индуктор - IPTG.Inductor - IPTG.

Основные свойства штаммаThe main properties of the strain

Является продуцентом интерналина 321, может быть использован для получения медицинских и ветеринарных препаратов на основе рекомбинантного интерналина 321.It is a producer of internalin 321, can be used to obtain medical and veterinary drugs based on recombinant internalin 321.

Описание чертежейDescription of drawings

Фиг. 1 - генетическая карта плазмиды pET28b-inlBallele9.FIG. 1 is a genetic map of the plasmid pET28b-inlBallele9.

Фиг. 2 показывает результат анализа фракций, собранных после очистки рекомбинантных белков и лизиса бактериальных культур Escherichia coli BL21, содержащих плазмиды pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 или pET28b-inlBallele9. Пропорциональные количества белка из каждой фракции анализировали с помощью ДСН-ПАГЭ в 10%-ном акриламидном геле с последующим окрашиванием геля красителем Coomassie Brilliant Blue (Serva). Для оценки молекулярной массы белков использовали маркер молекулярной массы Unstained Protein Molecular Weight Marker производства (Fermentas), крайняя дорожка слева. Стрелка указывает на положение в геле рекомбинантного белка интерналина 321. Кажущаяся молекулярная масса белка интерналина 321 составляет около 37 кДа и соответствует теоретически рассчитанной (36863 Да).FIG. 2 shows the result of the analysis of fractions collected after purification of recombinant proteins and lysis of bacterial cultures of Escherichia coli BL21 containing plasmids pET28b-inlBallele13, pET28b-inlBallele14 or pET28b-inlBallele9. Proportional amounts of protein from each fraction were analyzed using SDS-PAGE in a 10% acrylamide gel, followed by gel staining with Coomassie Brilliant Blue (Serva). The molecular weight marker Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas), left lane, was used to evaluate the molecular weight of the proteins. The arrow indicates the position in the gel of the recombinant protein internalin 321. The apparent molecular weight of the protein internalin 321 is about 37 kDa and corresponds to the theoretically calculated (36863 Da).

Фиг. 3 показывает результат анализа стабильности рекомбинантного белка интерналина В в процессе замораживания-оттаивания. Пропорциональные количества белка из каждой фракции анализировали с помощью ДСН-ПАГЭ в 10%-ном акриламидном геле с последующим окрашиванием геля красителем Coomassie Brilliant Blue (Serva). Для оценки молекулярной массы белков использовали маркер молекулярной массы Unstained Protein Molecular Weight Marker производства (Fermentas), крайняя дорожка слева. Стрелка указывает на положение в геле рекомбинантного белка интерналина 321. Белок интерналин 321 выдерживает замораживание при -85°С и последующее оттаивание.FIG. 3 shows the result of stability analysis of the recombinant protein internalin B during the freezing-thawing process. Proportional amounts of protein from each fraction were analyzed using SDS-PAGE in a 10% acrylamide gel, followed by gel staining with Coomassie Brilliant Blue (Serva). The molecular weight marker Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas), left lane, was used to evaluate the molecular weight of the proteins. The arrow indicates the position in the gel of the recombinant protein internalin 321. The protein internalin 321 can withstand freezing at -85 ° C and subsequent thawing.

Примеры осуществления настоящего изобретенияExamples of the implementation of the present invention

Пример 1. Процедура получения штамма бактерий E. coli BL21, продуцирующего рекомбинантный белок интерналина 321Example 1. The procedure for obtaining a bacterial strain of E. coli BL21 producing recombinant protein internalin 321

Фрагмент гена inlB, кодирующий интерналиновый домен 321, синтезировали в полимеразной цепной реакции на матрице ДНК, полученной из стационарной культуры листерий [23]. В качестве ДНК матрицы использовались лизаты соответствующих штаммов листерий: VIMHA034 (14 аллель), VIMHA015 (9 аллель) и EGDe(13 аллель) (согласно [22]). В ПЦР использовали праймеры: InlBF 5'-aca-agc-gga-tcc-tat-cac-tgt-gcc-3' и InlBR 5'-tgt-aaa-gct-ttt-tca-gtg-gtt-ggg-3' («Синтол», Россия) с введенными сайтами рестрикции для BamHI и HindIII соответственно. ПЦР-продукты клонировали в вектор pGemT-Easy с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems («Promega», США). Конструкции pGemT-Easy-InlBallele14, pGemT-Easy-InlBallele9 и pGemT-Easy-InlBallele13 траснформировали в штамм E. coli JM109 с использованием электропоратора GenPulsar Xcell Total System («Bio-Rad») при параметрах 25 μF, 2,5 kV, 200 Ω. Для выделения плазмидной ДНК из рекомбинантных штаммов использовали набор БиоСилика («Biosilica», Россия). Выделенные плазмидные ДНК очищали с помощью Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System («Promega», США). В дальнейшем ПЦР продукты переклонировали в вектор рЕТ28b(+) по сайтам рестрикции BamHI и HindIII, с последующей электропорацией конструкций pET28b-InlBallele14, pET28b-InlBallele13 и pET28b-InlBallele9 в штамм E. coli BL21. Плазмиды, полученные на последнем этапе, кодировали фрагменты интерналинового домена 321 слитые с 6 остатками гистидина (His-tag) на аминоконце белка.A fragment of the inlB gene encoding the 321 internalin domain was synthesized in a polymerase chain reaction on a DNA matrix obtained from a stationary Listeria culture [23]. As the matrix DNA, lysates of the corresponding listeria strains were used: VIMHA034 (14 allele), VIMHA015 (9 allele) and EGDe (13 allele) (according to [22]). Primers used in PCR were: InlBF 5'-aca-agc-gga-tcc-tat-cac-tgt-gcc-3 'and InlBR 5'-tgt-aaa-gct-ttt-tca-gtg-gtt-ggg-3' (Synthol, Russia) with restriction sites introduced for BamHI and HindIII, respectively. PCR products were cloned into the pGemT-Easy vector using the pGEM®-T Easy Vector Systems kit (Promega, USA). The pGemT-Easy-InlBallele14, pGemT-Easy-InlBallele9 and pGemT-Easy-InlBallele13 constructs were transformed into E. coli strain JM109 using the GenPulsar Xcell Total System (“Bio-Rad”) electroporator at 25 μF, 2.5 kV, 200 Ω. To isolate plasmid DNA from recombinant strains, a BioSilica kit (Biosilica, Russia) was used. Isolated plasmid DNAs were purified using the Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA). Subsequently, PCR products were cloned into the pET28b (+) vector at the BamHI and HindIII restriction sites, followed by electroporation of the pET28b-InlBallele14, pET28b-InlBallele13 and pET28b-InlBallele9 constructs into E. coli BL21 strain. The plasmids obtained in the last step encoded fragments of the 321 internalin domain fused to 6 histidine residues (His-tag) at the amino terminus of the protein.

Пример 2. Получение рекомбинантной плазмиды pET28b-inlBalleleExample 2. Obtaining recombinant plasmids pET28b-inlBallele

В плазмиду рЕТ28b встраивали inlBallele13, inlBallele 14 или inlBallele9, содержащие последовательность областей, кодирующих интерналин 321, что обеспечивало экспрессию рекомбинантного белка интерналин 321 за счет эффективной транскрипции мРНК рекомбинантного гена; нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции; промотор РНК-полимеразы Т7, обеспечивающий индуцируемую экспрессию генов в клетках Е. coli; ген устойчивости к канамицину, обладающий сайтами узнавания для рестриктаз и содержащий последовательность, кодирующую His-tag; бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E. coli.InlBallele13, inlBallele 14, or inlBallele9 containing the sequence of regions encoding internalin 321 was inserted into the pET28b plasmid, which allowed expression of the recombinant protein internalin 321 by efficient transcription of the recombinant gene mRNA; the untranslated region of the transcription termination of the bacterial operon, which ensures the efficient termination of transcription; T7 RNA polymerase promoter providing inducible gene expression in E. coli cells; kanamycin resistance gene having restriction enzyme recognition sites and containing a sequence encoding His-tag; ColE1 type bacterial replication initiation site providing plasmid replication in E. coli strains.

Пример 3. Процедура получения рекомбинантного белка интерналина 321 в бактериальной системе экспрессииExample 3. The procedure for obtaining recombinant protein internalin 321 in the bacterial expression system

Экспрессия полученной конструкции проходила под контролем встроенного в вектор фагового промотора. На всех этапах создания генных конструкций нуклеотидные последовательности анализировали методом секвенирования. Штаммы-продуценты рекомбинантного белка интерналина В высевали штрихом на чашку Петри с LB агаром, содержащую селективный антибиотик канамицин в концентрации 100 мкг/мл, и растили в течение 16-18 часов при температуре 37°С. С чашки Петри брали единичную колонию бактерий, инокулировали 1 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл канамицина, и растили при постоянном перемешивании и температуре 37°С в течение 16-18 часов. По 500 мкл ночной культуры штамма-продуцента переносили стерильной пипеткой в две 500-миллилитровые колбы, содержащие 50 мл жидкой среды LB, и растили при постоянном перемешивании и температуре 37°С в течение 3 часов, после чего индуцировали экспрессию рекомбинантного белка путем добавления изопропил-β-D-тиогалактозида (Fermentas) до конечной концентрации 0,02 мМ и бактерии растили при температуре 37°С в течение 3 часов. Клетки осаждали центрифугированием при 4200 об/мин и температуре 4°С в течение 15 минут, супернатант удаляли, а осадок промывали с использованием 20 мл фосфатно-солевого буфера (0,01 М фосфат натрия, 0,138 М NaCl, 0,0027 М КСl, рН 7,4), предварительно охлажденного до 4°С, и затем клетки осаждали центрифугированием при 4200 об/мин и температуре 4°С в течение 15 минут. Супернатант удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в 1 мл буфера (0,01 М фосфат натрия, 0,138 М NaCl, 0,0027 М КСl, рН 7,4) и добавляли кристаллический лизоцим (Sigma) до конечной концентрации 10 мкг/мл. Далее суспензию бактериальных клеток гомогенизировали при помощи прибора SuperFastPrep. После чего проводилась очистка белка с использованием коммерческого набора Dynabeads® His-Tag Isolation and Pulldown, основанного на антителах, конъюгированных с магнитными наночастицами. Для удаления стабилизирующего буфера от наночастиц хорошо ресуспендированные частицы Dynabeads объемом 50 мкл помещали в микроцентрифужную пробирку, расположенную на магните. После осаждения частиц супернатант сливали, в пробирку добавляли полученный лизат, приготовленный в объеме 700 мкл фосфатно-солевого буфера (0,01 М фосфат натрия, 0,138 М NaCl, 0,0027 М КСl, рН 7,4), и инкубировали при постоянном перемешивании 10 минут. Пробирку помещали на магнит и после осаждения частиц, нагруженных белком, супернатант сливали. Для исключения неспецифического связывания проводили процедуру отмывки, добавляя 300 мкл Binding Wash Buffer (50 мМ фосфатного буфера, рН 8.0, 300 мМ NaCl, 0,01% Tween-20) к наночастицам, нагруженным рекомбинантным белком, хорошо ресуспендировали и после осаждения частиц, нагруженных рекомбинантным белком, супернатант сливали. Процедуру отмывки повторяли 4 раза. После промывания добавляли 100 мкл His-Elution Buffer (300 мМ имидазол, 50 мМ фосфатный буфер, рН 8.0, 300 мМ NaCl 0,01% Tween-20) и инкубировали при постоянном перемешивании 10 минут. После осаждения частиц на магните супернатант, содержащий белок, собирали в новую пробирку. Элюированный рекомбинантный белок замораживали и хранили при -80°С в аликвотах.The expression of the resulting construct was controlled by the phage promoter integrated into the vector. At all stages of creating gene constructs, nucleotide sequences were analyzed by sequencing. The strains producing the recombinant protein internalin B were plated on a Petri dish with LB agar containing a selective antibiotic kanamycin at a concentration of 100 μg / ml and grown for 16-18 hours at 37 ° C. A single colony of bacteria was taken from a Petri dish, inoculated with 1 ml of LB liquid medium containing 100 μg / ml kanamycin, and grown with constant stirring at 37 ° C for 16-18 hours. 500 μl of the overnight culture of the producer strain was transferred with a sterile pipette into two 500 ml flasks containing 50 ml of LB liquid medium and grown with constant stirring at 37 ° C for 3 hours, after which expression of the recombinant protein was induced by adding isopropyl- β-D-thiogalactoside (Fermentas) to a final concentration of 0.02 mm and bacteria were grown at 37 ° C for 3 hours. Cells were pelleted by centrifugation at 4200 rpm and a temperature of 4 ° C for 15 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was washed using 20 ml of phosphate-buffered saline (0.01 M sodium phosphate, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4), pre-cooled to 4 ° C, and then the cells were besieged by centrifugation at 4200 rpm and a temperature of 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was removed and the cell pellet was resuspended in 1 ml of buffer (0.01 M sodium phosphate, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4) and crystalline lysozyme (Sigma) was added to a final concentration of 10 μg / ml. The bacterial cell suspension was then homogenized using a SuperFastPrep instrument. After that, protein was purified using a commercial Dynabeads® His-Tag Isolation and Pulldown kit, based on antibodies conjugated to magnetic nanoparticles. To remove the stabilizing buffer from the nanoparticles, well-resuspended Dynabeads particles with a volume of 50 μl were placed in a microcentrifuge tube located on a magnet. After sedimentation of the particles, the supernatant was poured, the resulting lysate prepared in a volume of 700 μl phosphate-saline buffer (0.01 M sodium phosphate, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4) was added to the tube, and incubated with constant stirring 10 minutes. The tube was placed on a magnet and after precipitation of the particles loaded with protein, the supernatant was discarded. To eliminate nonspecific binding, a washing procedure was carried out by adding 300 μl of Binding Wash Buffer (50 mM phosphate buffer, pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.01% Tween-20) to nanoparticles loaded with recombinant protein, and they were well resuspended after sedimentation of particles loaded recombinant protein, the supernatant was poured. The washing procedure was repeated 4 times. After washing, 100 μl of His-Elution Buffer (300 mM imidazole, 50 mM phosphate buffer, pH 8.0, 300 mM NaCl 0.01% Tween-20) was added and incubated with constant stirring for 10 minutes. After the particles were deposited on a magnet, the supernatant containing the protein was collected in a new tube. The eluted recombinant protein was frozen and stored at -80 ° C in aliquots.

Пример 4. Процедура определения концентрации рекомбинантного белка интерналина 321 по Лоури и БредфордуExample 4. The procedure for determining the concentration of recombinant protein internalin 321 according to Lowry and Bradford

Концентрацию рекомбинантного белка интерналина 321 определяли методом Лоури и Брэлфорда, используя набор Protein Assay Dye Reagent Concentrate. Для этого разводили красящий реагент в 5 раз дистиллированной водой. Готовили 5 разведений BSA в концентрации от 0,2 до 3 мг/мл. Смешивали 100 мкл каждого стандарта с 5 мл разведенного красящего реагента. Инкубировали смесь при комнатной температуре 5 мин, измеряли оптическую плотность при длине волне 595 нм с помощью бескюветного спектрофотометра «NanoVue Plus».The concentration of the recombinant internalin 321 protein was determined by the Lowry and Braelford method using the Protein Assay Dye Reagent Concentrate kit. For this, the coloring reagent was diluted 5 times with distilled water. 5 dilutions of BSA were prepared at a concentration of 0.2 to 3 mg / ml. 100 μl of each standard was mixed with 5 ml of diluted coloring reagent. The mixture was incubated at room temperature for 5 min, and the absorbance was measured at a wavelength of 595 nm using a cuvette-free NanoVue Plus spectrophotometer.

Основные характеристики клеток (по данным паспорта штамма):The main characteristics of the cells (according to the strain passport):

1. Родовое и видовое название штамма-хозяина (реципиента) - Escherichia coli.1. The generic and species name of the host strain (recipient) is Escherichia coli.

2. Номер или наименование штаммов: Escherichia coli BL21[pET28b-InlBallele14], Escherichia coli [pET28b-InlBallele13] и Escherichia coli [pET28b-InlBallele9].2. The number or name of the strains: Escherichia coli BL21 [pET28b-InlBallele14], Escherichia coli [pET28b-InlBallele13] and Escherichia coli [pET28b-InlBallele9].

3. Способ получения штамма: получен трансформацией.3. A method of obtaining a strain: obtained by transformation.

4. Продукт, синтезируемый штаммами, интерналин 321.4. The product synthesized by the strains, internalin 321.

5. Активность (продуктивность) штамма: 4 мкг очищенного рекомбинантного белка на 1 мл ростовой среды по данным.5. The activity (productivity) of the strain: 4 μg of purified recombinant protein per 1 ml of growth medium according to the data.

6. Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: среда LB+10% глицерина в ампулах при -80°С.6. The method, conditions and composition of the media for long-term storage of the strain: LB medium + 10% glycerol in ampoules at -80 ° C.

7. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: среда LB, содержащая 100 мкг/мл канамицина.7. The method, conditions and composition of the media for the propagation of the strain: LB medium containing 100 μg / ml kanamycin.

8. Группа уровня риска штамма: I.8. The risk level group of the strain: I.

9. Генетические особенности штамма:9. Genetic features of the strain:

а. Генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие генетические особенности):but. The genotype of the host strain (mutations, deletions, inversions, the presence of plasmids or prophages, resistance (sensitivity) to antibiotics, phages, etc., other genetic features):

[F-, ompT, hsdSB (r-B, m-B), dcm, gal].[F-, ompT, hsdSB (r-B, m-B), dcm, gal].

б. Описание рекомбинантной плазмиды:b. Description of the recombinant plasmid:

Название плазмид: pET28b-InlBallele14, pET28b-InlBallele13 и pET28b-InlBallele9.The name of the plasmids: pET28b-InlBallele14, pET28b-InlBallele13 and pET28b-InlBallele9.

Размер плазмиды: 6225 пар нуклеотидов.Plasmid size: 6225 nucleotide pairs.

в. Сведения о векторе, на основе которого сконструирована плазмида:at. Information about the vector on the basis of which the plasmid was constructed:

Название вектора: рЕТ28b.Vector name: pET28b.

Размер вектора: 5368 п. н.Vector Size: 5368 bp

Полная нуклеотидная последовательность вектора рЕТ28b: Последовательность №1The complete nucleotide sequence of the vector pET28b: Sequence No. 1

Происхождение вектора и его основных генетических элементов:The origin of the vector and its basic genetic elements:

вектор содержит:The vector contains:

- ген устойчивости к канамицину;- kanamycin resistance gene;

- промотор РНК-полимеразы Т7;- promoter of RNA polymerase T7;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E. coli;- a bacterial replication initiation site of the ColE1 type, which provides plasmid replication in E. coli strains;

- содержит последовательность, кодирующую His-tag.- contains a sequence encoding His-tag.

г. Сведения о клонированной ДНК:Information about cloned DNA:

Видовая принадлежность донорного организма: Listeria monocytogenes.Species of the donor organism: Listeria monocytogenes.

Размер клонированного фрагмента и включенные в его состав гены: 961 п. н.The size of the cloned fragment and the genes included in its composition: 961 bp

ЛитератураLiterature

1. Organ S.L., Tsao M.-S. An overview of the c-HGPR signaling pathway // Ther. Adv. Med. Oncol. 2011. Vol.3. P. 7-19.1. Organ S.L., Tsao M.-S. An overview of the c-HGPR signaling pathway // Ther. Adv. Med. Oncol. 2011. Vol. 3. P. 7-19.

2. Trusolino L., Bertotti A., Comoglio P.M. HGPR signalling: principles and functions in development, organ regeneration and cancer // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2010. Vol.11, №12. P. 834-848.2. Trusolino L., Bertotti A., Comoglio P.M. HGPR signalling: principles and functions in development, organ regeneration and cancer // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2010. Vol. 11, No. 12. P. 834-848.

3.

TG, de Oliveira AG, Tobar N, Saad MJ, Moreira LR, Reis ER, Nicola EM, de Jorge GL, dos

RR, Boin IF, Teixeira AR. Liver regeneration followingpartial hepatectomy is improved by enhancing the HGF/Met axis and Akt and Erk pathways after low-power laser irradiation in rats. Lasers Med Sci. 2013 28:1511-1517.3.

RR, Boin IF, Teixeira AR. Liver regeneration followingpartial hepatectomy is improved by enhancing the HGF / Met axis and Akt and Erk pathways after low-power laser irradiation in rats. Lasers Med Sci. 2013 28: 1511-1517.

4. Li JF, Duan HF, Wu CT, Zhang DJ, Deng Y, Yin HL, Han B, Gong HC, Wang HW, Wang YL. HGF accelerates wound healing by promoting the dedifferentiation of epidermal cells through β1-integrin/ILK pathway. Biomed Res Int. 2013; 2013:470418. doi: 10.1155/2013/470418.4. Li JF, Duan HF, Wu CT, Zhang DJ, Deng Y, Yin HL, Han B, Gong HC, Wang HW, Wang YL. HGF accelerates wound healing by promoting the dedifferentiation of epidermal cells through β1-integrin / ILK pathway. Biomed Res Int. 2013; 2013: 470418. doi: 10.1155 / 2013/470418.

5. Zhu H., Naujokas M. a, Park M. Receptor chimeras indicate that the HGPR tyrosine kinase mediates the motility and morphogenic responses of hepatocyte growth/scatter factor. // Cell Growth Differ. 1994. Vol. 5, №4. P. 359-366.5. Zhu H., Naujokas M. a, Park M. Receptor chimeras indicate that the HGPR tyrosine kinase mediates the motility and morphogenic responses of hepatocyte growth / scatter factor. // Cell Growth Differ. 1994. Vol. 5, No. 4. P. 359-366.

6. Bladt F. et al. Essential role for the c-HGPR receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud // Nature. Nature Publishing Group, 1995. P. 768-771.6. Bladt F. et al. Essential role for the c-HGPR receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud // Nature. Nature Publishing Group, 1995. P. 768-771.

7. Schmidt C. et al. Scatter factor/hepatocyte growth factor is essential for liver development. //Nature. 1995. Vol. 373, №6516. P. 699-702.7. Schmidt C. et al. Scatter factor / hepatocyte growth factor is essential for liver development. // Nature. 1995. Vol. 373, No. 6516. P. 699-702.

8. Alberts B. et al. Essential Cell Biology. 2009. 731 p.8. Alberts B. et al. Essential Cell Biology. 2009.731 p.

9. Rodrigues G.A., Park M. Autophosphorylation modulates the kinase activity and oncogenic potential of the HGPR receptor tyrosine kinase // Oncogene. 1994. Vol. 9, №7. P. 2019-2027.9. Rodrigues G.A., Park M. Autophosphorylation modulates the kinase activity and oncogenic potential of the HGPR receptor tyrosine kinase // Oncogene. 1994. Vol. 9, No. 7. P. 2019-2027.

10. Dramsi S. et al. Entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes requires expression of InIB, a surface protein of the internalin multigene family // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 16, №2. P. 251-261.10. Dramsi S. et al. Entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes requires expression of InIB, a surface protein of the internalin multigene family // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 16, No. 2. P. 251-261.

11. Gaillard J.L. The inlAB locus mediates the entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes in vivo // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183, №2. P. 359-369.11. Gaillard J.L. The inlAB locus mediates the entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes in vivo // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183, No. 2. P. 359-369.

12. Ebbes M. et al. Fold and function of the InlB B-repeat // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. P. 15496-15506.12. Ebbes M. et al. Fold and function of the InlB B-repeat // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286. P. 15496-15506.

13. Shen Y. et al. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the HGPR receptor tyrosine kinase // Cell. 2000. Vol. 103, №3. P. 501-510.13. Shen Y. et al. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the HGPR receptor tyrosine kinase // Cell. 2000. Vol. 103, No. 3. P. 501-510.

14. Niemann H.H. et al. Structure of the Human Receptor Tyrosine Kinase HGPR in Complex with the Listeria Invasion Protein InlB // Cell. 2007. Vol. 130, №2. P. 235-246.14. Niemann H.H. et al. Structure of the Human Receptor Tyrosine Kinase HGPR in Complex with the Listeria Invasion Protein InlB // Cell. 2007. Vol. 130, No. 2. P. 235-246.

15. Bierne H., Cossart P. InlB, a surface protein of Listeria monocytogenes that behaves as an invasin and a growth factor // J. Cell Sci. 2002. Vol. 115. P. 3357-3367.15. Bierne H., Cossart P. InlB, a surface protein of Listeria monocytogenes that behaves as an invasin and a growth factor // J. Cell Sci. 2002. Vol. 115. P. 3357-3367.

16. Jonquieres R., Pizarro-Cerda J., Cossart P. Synergy between the N- and C-terminal domains of InlB for efficient invasion of non-phagocytic cells by Listeria monocytogenes // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 42, №4. P. 955-965.16. Jonquieres R., Pizarro-Cerda J., Cossart P. Synergy between the N- and C-terminal domains of InlB for efficient invasion of non-phagocytic cells by Listeria monocytogenes // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 42, No. 4. P. 955-965.

17. Pizarro-cerda J., Ku A. Entry of Listeria monocytogenes in Mammalian // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012. Vol. 2, №11. P. 1-18.17. Pizarro-cerda J., Ku A. Entry of Listeria monocytogenes in Mammalian // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2012. Vol. 2, No. 11. P. 1-18.

18. Ferraris D.M. et al. Ligand-Mediated Dimerization of the HGPR Receptor Tyrosine Kinase by the Bacterial Invasion Protein InlB // J. Mol. Biol. Elsevier Ltd, 2010. Vol. 395, №3. P. 522-532.18. Ferraris D.M. et al. Ligand-Mediated Dimerization of the HGPR Receptor Tyrosine Kinase by the Bacterial Invasion Protein InlB // J. Mol. Biol. Elsevier Ltd, 2010. Vol. 395, No. 3. P. 522-532.

19. Mansell A. et al. Internalin В Activates Nuclear Factor-??B via Ras, Phosphoinositide 3-Kinase, and Akt // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, №5. P. 43597-43603.19. Mansell A. et al. Internalin In Activates Nuclear Factor - ?? B via Ras, Phosphoinositide 3-Kinase, and Akt // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, No. 5. P. 43597-43603.

20. Mungunsukh O. et al. A tandem repeat of a fragment of Listeria monocytogenes internalin В protein induces cell survival and proliferation // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010. Vol. 299, №58. P. L905-L914.20. Mungunsukh O. et al. A tandem repeat of a fragment of Listeria monocytogenes internalin In protein induces cell survival and proliferation // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010. Vol. 299, No. 58. P. L905-L914.

21. Voronina Olga L ⋅ Ryzhova Natalia N ⋅ Kunda Marina S ⋅ Kurnaeva Margarita A ⋅ Semenov Audrey N ⋅Aksenova Ekaterina I ⋅ Egorova Irina Yu ⋅ Kolbasov Denis V ⋅ Ermolaeva Svetlana A ⋅ Gintsburg Alexander L Diversity and Pathogenic Potential of Listeria monocytogenes Isolated from Environmental Sources in the Russian Federation Int J Mod Emg Res 2015, 5:5-13.21. Voronina Olga L ⋅ Ryzhova Natalia N ⋅ Kunda Marina S ⋅ Kurnaeva Margarita A ⋅ Semenov Audrey N ⋅ Aksenova Ekaterina I ⋅ Egorova Irina Yu ⋅ Kolbasov Denis V ⋅ Ermolaeva Svetlana A ⋅ Gintsburg Alexander L Diversity and Pathogenic Potential of Listeria monogenic Environmental Sources in the Russian Federation Int J Mod Emg Res 2015, 5: 5-13.

22. Adgamov R, Zaytseva E, Thiberge J-M, Brisse S, Ermolaeva S. Genetically related Listeria monocytogenes strains isolated from lethal human cases and wild animals. In Genetic Diversity of Microorganisms. Caliskan M (Ed). 2012, Part 2, 235-250, ISBN 978-953-51-0064-5. InTech, Croatia.22. Adgamov R, Zaytseva E, Thiberge J-M, Brisse S, Ermolaeva S. Genetically related Listeria monocytogenes strains isolated from lethal human cases and wild animals. In Genetic Diversity of Microorganisms. Caliskan M (Ed). 2012, Part 2, 235-250, ISBN 978-953-51-0064-5. InTech, Croatia.

23. Карпова Т.И., Фирсова. Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности Typing of Listeria monocytogenes on the Basis of Polymorphism of Genes // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2003. Vol. 5, №3. Р. 251-258.23. Karpova T.I., Firsova. Typing of Listeria monocytogenes based on polymorphism of pathogenicity factor genes Typing of Listeria monocytogenes on the Basis of Polymorphism of Genes // Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2003. Vol. 5, No. 3. R. 251-258.

Claims

1. Рекомбинантный белок интерналин 321 с последовательностью №5, №6 или №7.1. Recombinant protein internalin 321 with the sequence No. 5, No. 6 or No. 7.

2. Рекомбинантная плазмида pET28b-inlBallele, где inlBallele представляет собой inlBallele13, inlBallele 14 или inlBallele9, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка интерналин 321 по п. 1, содержащая последовательность, кодирующую интерналин 321; нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона; промотор РНК-полимеразы Т7; ген устойчивости к канамицину; бактериальный участок инициации репликации типа ColEl.2. The recombinant plasmid pET28b-inlBallele, where inlBallele is inlBallele13, inlBallele 14 or inlBallele9, providing expression of the recombinant protein internalin 321 according to claim 1, containing a sequence encoding internalin 321; untranslated region of transcription termination of a bacterial operon; T7 RNA polymerase promoter; kanamycin resistance gene; ColEl type bacterial replication initiation site.

3. Штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13, полученный трансформацией штамма Escherichia coli BL21 плазмидой pET28b-inlBallele13, - продуцент рекомбинантного белка интерналин 321 по п. 1.3. The strain Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele13 obtained by transforming the strain of Escherichia coli BL21 plasmid pET28b-inlBallele13, the producer of the recombinant protein internalin 321 according to claim 1.

4. Штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele14, полученный трансформацией штамма Escherichia coli BL21 плазмидой pET28b-inlBallele14, - продуцент рекомбинантного белка интерналин 321 по п. 1.4. The strain Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele14, obtained by transforming the strain of Escherichia coli BL21 with the plasmid pET28b-inlBallele14, is a producer of the recombinant protein internalin 321 according to claim 1.

5. Штамм Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele9, полученный трансформацией штамма Escherichia coli BL21 плазмидой pET28b-inlBallele9, - продуцент рекомбинантного белка интерналин 321 по п. 1.5. The strain Escherichia coli BL21 pET28b-inlBallele9, obtained by transformation of the Escherichia coli BL21 strain with plasmid pET28b-inlBallele9, is a producer of the recombinant protein internalin 321 according to claim 1.

6. Способ получения рекомбинантного белка интерналин 321 по п. 1, включающий выращивание клеток штамма Escherichia coli BL21[pET28b-inlBallele13], Escherichia coli BL21[pET28b-inlBallele14] или Escherichia coli BL21[pET28b-inlBallele9], индукцию синтеза белка интерналина 321, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, очистку рекомбинантного белка с использованием коммерческого набора, основанного на антителах к гистидиновым повторам, конъюгированных с магнитными наночастицами.6. A method of producing a recombinant internalin 321 protein according to claim 1, comprising growing cells of the strain Escherichia coli BL21 [pET28b-inlBallele13], Escherichia coli BL21 [pET28b-inlBallele14] or Escherichia coli BL21 [pET28b-inlBallele9], induction of protein 32 interna destruction of cells, obtaining a supernatant containing a protein, purification of a recombinant protein using a commercial kit based on antibodies to histidine repeats conjugated to magnetic nanoparticles.