RU2502803C2

RU2502803C2 - PLASMID FOR EXPRESSION IN CELLS OF BACTERIUM BELONGING TO Escherichia CLASS, NON-ACTIVE PREDECESSOR OF DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEINS; BACTERIUM BELONGING TO Escherichia CLASS, - PRODUCER OF NON-ACTIVE PREDECESSOR OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; PREDECESSOR OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; METHOD FOR OBTAINING RECOMBINANT DNase I OF HUMAN OR ITS MUTEIN; METHOD FOR OBTAINING CONJUGATES OF POLYETHYLENE GLYCOL AND RECOMBINANT MUTEIN OF HUMAN DNase I, FERMENTATIVE ACTIVE CONJUGATE OF MUTEIN OF RECOMBINANT DNase I OF HUMAN

Info

Publication number: RU2502803C2
Application number: RU2011120249/10A
Authority: RU
Inventors: Надежда Александровна Орлова; Иван Иванович Воробьев
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ")
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2013-12-27
Also published as: RU2011120249A

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention represents a method for obtaining recombinant DNAse I of a human or its mutein, as well as their conjugates with polyethylene glycol, using a bacterium belonging to Escherichia class, transformed with expression plasmid, containing a promoter functioning in a bacterial cell, DNA fragment coding a hexahistidine cluster, a fragment coding enterokinase recognition sequence amalgamated in frame with human DNAse I or its functionally active mutein containing replacements of asparagine with cysteine, transcription termination section, vector pET28a(+) fragment containing initiation section of replication of bacteriophage fl, sequence coding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, area of beginning of plasmid pBR322 replication, gene RNA-organising protein Rop, sequence coding lactose operon repressor.

EFFECT: invention allows obtaining recombinant human DNAse I or its mutein with high yield.

18 cl, 7 dwg, 1 tbl, 12 ex

Description

Область техникиTechnical field

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения дезоксирибонуклеазы I человека.The invention relates to the field of biotechnology, and in particular to a technology for the production of biologically active substances (BAS) by genetic engineering methods, more specifically to methods for producing human deoxyribonuclease I.

Предшествующий уровень техники.The prior art.

Дезоксирибонуклеаза I (синонимы ДНКаза I, Панкреатическая дезоксирибонуклеаза, Deoxyribonuclease I, DNAse I, шифр международного Классификатора Ферментов ЕС 3.1.21.1) человека - природный внеклеточный фермент, вырабатываемый поджелудочной и слюнными железами. В максимальной концентрации он содержится в ЖКТ, где происходит переваривание ДНК, присутствующей в пище. Низкие концентрации ДНКазы I обнаруживаются в сыворотке здоровых людей. ДНКаза I человека - это гликопротеин, содержащий 260 аминокислот, с молекулярной массой 33000-38000 дальтон. Фермент гомологичен ДНКазе I быка, их аминокислотный состав совпадает на 77%. Пространственная структура ДНКазы быка была определена в работах [Suck, D., С. Oefner, et al. (1984). "Three-dimensional structure of bovine pancreatic DNAse I at 2.5 A resolution." EMBO J 3(10): 2423-2430; Suck, D. and C. Oefner (1986). "Structure of DNAse I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA." Nature 321(6070): 620-625.].Deoxyribonuclease I (synonyms for DNase I, Pancreatic deoxyribonuclease, Deoxyribonuclease I, DNAse I, cipher of the International Classification of Enzymes EU 3.1.21.1) human is a natural extracellular enzyme produced by the pancreas and salivary glands. In maximum concentration, it is found in the digestive tract, where the digestion of DNA present in food occurs. Low concentrations of DNase I are found in the serum of healthy people. Human DNase I is a glycoprotein containing 260 amino acids, with a molecular weight of 33,000-38,000 daltons. The enzyme is homologous to bovine DNase I, their amino acid composition coincides by 77%. The spatial structure of bovine DNase was determined in [Suck, D., C. Oefner, et al. (1984). "Three-dimensional structure of bovine pancreatic DNAse I at 2.5 A resolution." EMBO J 3 (10): 2423-2430; Suck, D. and C. Oefner (1986). "Structure of DNAse I at 2.0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA." Nature 321 (6070): 620-625.].

Основным источником ДНКазы I для научных исследований и фармацевтики являлся крупный рогатый скот. Процесс выделения и хроматографической очистки ДНКазы I описан в работах [Funakoshi, A., Y. Tsubota, et al. (1980). "Simple purification and properties of bovine pancreatic deoxyribonuclease I." J Biochem 88(4): 1113-1118.; Paudel, H.K. and T.H. Liao (1986). "Comparison of the three primary structures of deoxyribonuclease isolated from bovine, ovine, and porcine pancreas. Derivation of the amino acid sequence of ovine DNase and revision of the previously published amino acid sequence of bovine DNase." J Biol Chem 261(34): 16012-16017.; Nefsky, В. and A. Bretscher (1989). "Preparation of immobilized monomeric actin and its use in the isolation of protease-free and ribonuclease-free pancreatic deoxyribonuclease I." Eur J Biochem 179(1): 215-219.].Cattle was the main source of DNase I for research and pharmaceuticals. The process of isolation and chromatographic purification of DNase I is described in [Funakoshi, A., Y. Tsubota, et al. (1980). "Simple purification and properties of bovine pancreatic deoxyribonuclease I." J Biochem 88 (4): 1113-1118 .; Paudel, H.K. and T.H. Liao (1986). "Comparison of the three primary structures of deoxyribonuclease isolated from bovine, ovine, and porcine pancreas. Derivation of the amino acid sequence of ovine DNase and revision of the previously published amino acid sequence of bovine DNase." J Biol Chem 261 (34): 16012-16017 .; Nefsky, B. and A. Bretscher (1989). "Preparation of immobilized monomeric actin and its use in the isolation of protease-free and ribonuclease-free pancreatic deoxyribonuclease I." Eur J Biochem 179 (1): 215-219.].

Проблема использования поджелудочной железы быка как исходного сырья для выделения ДНКазы I состоит в том, что в этой ткани содержится сложная смесь протеаз, что затрудняет выделение, и, кроме того, существует вероятность контаминации препарата прионами и вирусами животных.The problem of using the pancreas of the bull as a raw material for the isolation of DNase I is that this tissue contains a complex mixture of proteases, which complicates the isolation, and, in addition, there is a possibility of contamination of the drug with prions and animal viruses.

В исследованиях in vitro было установлено, что ДНКаза может снижать вязкость гнойных секретов легких [Armstrong, J.В. and J.С. White (1950). "Liquefaction of viscous purulent exudates by deoxyribonuclease." Lancet 2(6641): 739-742; Chemick, W.S., G.J. Barbero, et al. (1961). "In-vitro evaluation of effect of enzymes on tracheobronchial secretions from patients withcystic fibrosis." Pediatrics 27: 589-596].In vitro studies have found that DNase can reduce the viscosity of purulent secretions of the lungs [Armstrong, J. B. and J.C. White (1950). "Liquefaction of viscous purulent exudates by deoxyribonuclease." Lancet 2 (6641): 739-742; Chemick, W.S., G.J. Barbero, et al. (1961). "In-vitro evaluation of effect of enzymes on tracheobronchial secretions from patients withcystic fibrosis." Pediatrics 27: 589-596].

Бычья панкреатическая ДНКаза I (дорназа) была разрешена к клиническому применению в США в 1958 г. как муколитическое средство ингаляционного и парентерального применения, однако из-за многочисленных побочных эффектов вышла из медицинского употребления. Вероятной причиной побочных действий была контаминация препарата другими пищеварительными панкреатическими ферментами быка (он содержал до 2% трипсина и химотрипсина) [Lieberman, J. (1962). "Enzymatic dissolution of pulmonary secretions. An in vitro study of sputum from patients with cystic fibrosis of pancreas." Am J Dis Child 104: 342-348].Bovine pancreatic DNase I (Dornase) was approved for clinical use in the United States in 1958 as a mucolytic agent for inhalation and parenteral administration, however, due to numerous side effects, it was withdrawn from medical use. The likely cause of the side effects was contamination of the drug with other digestive pancreatic enzymes of the bull (it contained up to 2% trypsin and chymotrypsin) [Lieberman, J. (1962). "Enzymatic dissolution of pulmonary secretions. An in vitro study of sputum from patients with cystic fibrosis of pancreas." Am J Dis Child 104: 342-348].

Очевидной заменой лекарственных препаратов ДНКазы I быка является рекомбинантная высокоочищенная ДНКаза I человека.An obvious substitute for bull DNase I drugs is recombinant highly purified human DNase I.

ДНКаза I человека была выделена и частично очищена из поджелудочной железы [Funakoshi, A., Y. Tsubota, et al. (1977). "Purification and properties of human pancreatic deoxyribonuclease I." J Biochem 82(6): 1771-1777], дуоденального сока, сыворотки [Love, J.D. and R.R. Hewitt (1979). "The relationship between human serum and human pancreatic DNAse I." J Biol Chem 254(24): 12588-12594] и мочи [Murai, K., М. Yamanaka, et al. (1978). "Purification and properties of deoxyribonuclease from human urine." Biochim Biophys Acta 517(1): 186-194]. Было установлено, что N-концевой аминокислотой зрелого белка является лейцин [Ito, K., N. Minamiura, et al. (1984). "Human urine DNAse I: immunological identity with human pancreatic DNAse I, and enzymic and proteochemical properties of the enzyme." J Biochem 95(5): 1399-1406].Human DNase I was isolated and partially purified from the pancreas [Funakoshi, A., Y. Tsubota, et al. (1977). "Purification and properties of human pancreatic deoxyribonuclease I." J Biochem 82 (6): 1771-1777], duodenal juice, serum [Love, J.D. and R.R. Hewitt (1979). "The relationship between human serum and human pancreatic DNAse I." J Biol Chem 254 (24): 12588-12594] and urine [Murai, K., M. Yamanaka, et al. (1978). "Purification and properties of deoxyribonuclease from human urine." Biochim Biophys Acta 517 (1): 186-194]. It was found that the N-terminal amino acid of the mature protein is leucine [Ito, K., N. Minamiura, et al. (1984). "Human urine DNAse I: immunological identity with human pancreatic DNAse I, and enzymic and proteochemical properties of the enzyme." J Biochem 95 (5): 1399-1406].

Ген человеческой ДНКазы был изолирован из библиотеки панкреатической кДНК с использованием олигонуклеотидных зондов. Был выделен клон полноразмерной кДНК, состоящий из 1039 пар оснований. Было выявлено, что он содержит одну длинную открытую рамку считывания, кодирующую полипептид из 260 аминокислот, высокогомологичный бычьей ДНКазе I. При экспрессии данной кДНК в клетках человека А-293 был получен активный фермент [Shak, S., D.J. Capon, et al. (1990). "Recombinant human DNAse I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum." Proc Natl Acad Sci USA 87(23): 9188-9192].The human DNase gene was isolated from a pancreatic cDNA library using oligonucleotide probes. A clone of full length cDNA consisting of 1039 base pairs was isolated. It was found that it contains one long open reading frame encoding a 260 amino acid polypeptide highly homologous to bovine DNase I. The active enzyme was obtained by expressing this cDNA in human A-293 cells [Shak, S., D.J. Capon, et al. (1990). "Recombinant human DNAse I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum." Proc Natl Acad Sci USA 87 (23): 9188-9192].

Промышленно пригодная система экспрессии ДНКазы I человека (рчДНКазы), описанная в патенте США 7297526, основана на использовании культивируемых клеток яичника китайского хомячка (СНО-DP7), содержащих множественные копии трансгена рчДНКазы под контролем раннего промотора цитомегаловируса. Данная система позволяет получать рчДНКазу в значительных количествах и используется при промышленном производстве лекарственного препарата рчДНКазы «Дорназа альфа», но в то же время, культивирование клеток СНО требует использования дорогостоящей культуральной среды и сложной системы очистки продукта, включающей стадии вирус-инактивации.The industrially suitable human DNase I (rhDNAse) expression system described in US Pat. No. 7,297,526 is based on the use of cultured Chinese hamster ovary cells (CHO-DP7) containing multiple copies of the rhDNAse transgene under the control of the early cytomegalovirus promoter. This system allows rhDNAase to be produced in significant quantities and is used in the industrial production of the rhDNAase Dornase alpha drug, but at the same time, culturing CHO cells requires the use of an expensive culture medium and a sophisticated product purification system, including virus inactivation stages.

Потенциально более экономичными промышленно пригодными системами экспрессии гена рчДНКазы являются основанные на использовании дрожжей S. cerevisae или P. pastoris либо бактерий Е. coli. Экспрессия гена рчДНКазы в дрожжевых системах экспрессии приводит к появлению N-гликозилированной формы белка (патент США 7118901), экспрессия в Е. coli - к появлению негликозилированной формы. Удельная ферментативная активность рчДНКазы в обоих случаях одинакова. Поскольку структура N-связанных гликанов, продуцируемых дрожжами, значительно отличается от таковой для человека и N-гликаны дрожжей иммуногенны для млекопитающих, экспрессируемая в дрожжевых системах рчДНКаза непригодна для медицинского применения. Таким образом, среди всех систем экспрессии в микроорганизмах, система экспрессии рчДНКазы в клетках Е. coli лучше подходит для получения фармацевтически пригодного продукта.Potentially more economical, industrially suitable rhDNAse gene expression systems are based on the use of S. cerevisae or P. pastoris yeast or E. coli bacteria. Expression of the rhDNAse gene in yeast expression systems leads to the appearance of an N-glycosylated form of the protein (US patent 7118901), expression in E. coli leads to the appearance of a non-glycosylated form. The specific enzymatic activity of rhDNAse is the same in both cases. Since the structure of N-linked glycans produced by yeast is significantly different from that for humans and N-glycans of yeast are immunogenic for mammals, rhDNAase expressed in yeast systems is not suitable for medical use. Thus, among all expression systems in microorganisms, an rhDNAase expression system in E. coli cells is better suited to produce a pharmaceutically acceptable product.

Существует ряд работ по получению ферментативно активной ДНКазы I быка в бактериальной системе, но возможности повышенной экспрессии гена данного белка ограничены в связи с токсичностью продукта для клеток-продуцентов. В отличие от эукариот, у которых процессы транскрипции и трансляции проходят в разных клеточных компартментах, в клетке Е. coli эти процессы сопряжены. Наличие активной ДНКазы в цитоплазме приводит к деградации геномной ДНК и последующему лизису бактериальной клетки, поэтому повышенная экспрессия ДНКазы неизбежно приводит к генетической нестабильности клона, т.е. отбор суперпродуцентов одновременно является отбором наиболее генетически нестабильных бактерий. Так, в работе [Worrall, A.F. and В.A. Cormolly (1990). "The chemical synthesis of a gene coding for bovine pancreatic DNAse I and its cloning and expression in Escherichia coli" J Biol Chem 265(35): 21889-21895] экспрессировали активную ДНКазу быка в системе E. coli, используя синтетический ген с оптимизированными кодонами и промотор поздних генов фага лямбда pL. Показано, что продукт экспрессии обладал токсичностью для клеток штамма-продуцента, поэтому выход целевого белка лежал в пределах от 100 мкг до 1 мг/л культуры. Активность экспрессированного фермента была сопоставима с активностью нативного фермента быка. Однако значения активности, приведенные авторами (5×10⁸ Ед/г белка), были измерены для не полностью очищенного препарата. В работе [Chen, С.Y., S. С.Lu, et al. (1998). "Cloning, sequencing and expression of a cDNA encoding bovine pancreatic deoxyribonuclease I in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant enzyme." Gene 206(2): 181-184] экспрессировали природную кДНК быка в системе E. coli штамм BL21(DE3)pLysE. Однако уровень экспрессии оставался низким, так как продукт оказался токсичным для бактерий. Клетки лизировались после индукции, фермент обнаруживался как в культуральной среде, так и в клетках. По данным авторов, индуцированная культура давала 3500 Ед/л. Активность выделенного фермента составляла 908 Ед/мг, что сопоставимо с контрольным измерением тем же методом активности природного фермента, выделенного авторами параллельно из тканей быка (938 Ед/мг). Таким образом, расчетная продуктивность данного метода составляет около 4 мг/л культуры.There are a number of works on the production of enzymatically active bovine DNase I in the bacterial system, but the possibility of increased gene expression of this protein is limited due to the toxicity of the product for producer cells. Unlike eukaryotes, in which transcription and translation processes occur in different cell compartments, these processes are associated in E. coli cells. The presence of active DNase in the cytoplasm leads to the degradation of genomic DNA and subsequent lysis of the bacterial cell; therefore, increased expression of DNase inevitably leads to genetic instability of the clone, i.e. the selection of superproducers is simultaneously the selection of the most genetically unstable bacteria. So, in [Worrall, AF and B.A. Cormolly (1990). "The chemical synthesis of a gene coding for bovine pancreatic DNAse I and its cloning and expression in Escherichia coli" J Biol Chem 265 (35): 21889-21895] expressed bovine active DNase in the E. coli system using a synthetic gene with optimized codons and promoter of the late lambda phage pL genes. It was shown that the expression product was toxic for the cells of the producer strain; therefore, the yield of the target protein ranged from 100 μg to 1 mg / l of culture. The activity of the expressed enzyme was comparable to the activity of the native bovine enzyme. However, the activity values reported by the authors (5 × 10 ⁸ U / g protein) were measured for a partially purified preparation. In [Chen, C. Y., S. C. Lu, et al. (1998). "Cloning, sequencing and expression of a cDNA encoding bovine pancreatic deoxyribonuclease I in Escherichia coli: purification and characterization of the recombinant enzyme." Gene 206 (2): 181-184] expressed natural bovine cDNA in the E. coli system strain BL21 (DE3) pLysE. However, the expression level remained low, as the product was toxic to bacteria. Cells were lysed after induction; the enzyme was detected both in the culture medium and in the cells. According to the authors, the induced culture yielded 3500 U / L. The activity of the isolated enzyme was 908 U / mg, which is comparable to the control measurement by the same method of the activity of a natural enzyme isolated by the authors in parallel from the tissues of the bull (938 U / mg). Thus, the estimated productivity of this method is about 4 mg / l of culture.

Несколько больший уровень экспрессии дезоксирибонуклеазы I быка был достигнут при помощи трансформации штамма JM109 клеток E. coli плазмидой pHEL12, несущей ген ДНКазы I под контролем промотора Т7 и последующей инфекции культуры клеток бактериофагом М13/Т7 при одновременной индукции экспрессии целевого гена при помощи ИПТГ [Linardou, H., A.A. Epenetos, et al. (2000). "A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I." Int J Cancer 86(4): 561-569]. Существенным ограничением данного метода является необходимость инфицирования рабочей культуры бактериофагом, поскольку при промышленной культивации очистка оборудования от бактериофага практически невозможна.A slightly higher level of bovine deoxyribonuclease I expression was achieved by transforming the E. coli strain JM109 strain with plasmid pHEL12 carrying the DNAse I gene under the control of the T7 promoter and subsequent infection of the cell culture with bacteriophage M13 / T7 while simultaneously inducing the expression of the target gene using IPTG [Linardou, H., AA Epenetos, et al. (2000). "A recombinant cytotoxic chimera based on mammalian deoxyribonuclease-I." Int J Cancer 86 (4): 561-569]. A significant limitation of this method is the need to infect a working culture with a bacteriophage, since during industrial cultivation, cleaning equipment from a bacteriophage is practically impossible.

Подробное описание настоящего изобретенияDetailed description of the present invention

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии получения ферментативно активной рекомбинантной ДНКазы I человека с более высоким выходом.The technical problem solved by the authors was the creation of a technology for producing enzymatically active recombinant human DNase I with a higher yield.

Технический результат достигался путем создания технологии, включающей в себя новую экспрессионную плазмидную ДНК, кодирующую оптимизированный для экспрессии в бактериальной системе ген ДНКазы I человека, создание штамма продуцента E. coli на ее основе и технологии выделения и модификации ДНКазы I.The technical result was achieved by creating a technology that includes a new expression plasmid DNA encoding a human DNase I gene optimized for expression in the bacterial system, creating a producer strain E. coli based on it, and technology for isolating and modifying DNase I.

В основе данного решения лежат разработанные авторами экспрессионные плазмиды pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106, длиной 6091 п.о., содержащие фрагмент ДНК, включающий последовательность, кодирующую синтетический отщепляемый лидерный N-концевой пептид длиной 19 аминокислот, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую ДНКазу I человека, либо ее мутеины [N18C] или [N106C], соответственно. Указанный фрагмент содержит оптимальные для E. coli кодоны, позволяющие увеличить уровень экспрессии гетерологичного белка за счет эффективной трансляции всех аминокислот полипептида. Наличие лидерного пептида подавляет ферментативную активность ДНКазы I, что снижает токсичность продукта экспрессии для бактерии, что приводит к значительному увеличению выхода целевого белка.The solution is based on the expression plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 and pET28EK-DNASEIC106, 6091 bp long, developed by the authors, containing a DNA fragment containing a sequence encoding a 19 amino acid synthetic cleavable leader N-terminal peptide including a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence, and a fusion sequence encoding a human DNase I thereof, or its muteins [N18C] or [N106C], respectively. The indicated fragment contains codons optimal for E. coli, which allow increasing the expression level of a heterologous protein due to the effective translation of all amino acids of the polypeptide. The presence of a leader peptide suppresses the enzymatic activity of DNase I, which reduces the toxicity of the expression product for bacteria, which leads to a significant increase in the yield of the target protein.

Целью настоящего изобретения является предоставление экспрессионной плазмиды, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей ДНКазу I человека, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.An object of the present invention is to provide an expression plasmid containing a DNA fragment encoding a recombinant human DNase I or mutein precursor comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence fused in frame with a human DNAse I encoding sequence , under the control of a promoter functioning in a bacterial cell.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше экспрессионной плазмиды, где указанная плазмида выбрана из группы, состоящей из плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106.It is also an object of the present invention to provide an expression plasmid as described above, wherein said plasmid is selected from the group consisting of plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 and pET28EK-DNASEIC106.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, трансформированной описанной выше плазмидой, - продуцента предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина.It is also an object of the present invention to provide a bacterium belonging to the genus Escherichia transformed with the plasmid described above, a producer of the recombinant human DNase I precursor or its mutein.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где указанная бактерия представлена штаммами E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18 и E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above, wherein said bacterium is represented by E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI18 and E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI106 strains .

Также целью настоящего изобретения является предоставление предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащего отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы.It is also an object of the present invention to provide a recombinant human DNase I or mutein precursor comprising a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше мутеина ДНКазы I человека, при этом мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.It is also an object of the present invention to provide the human DNase I mutein described above, wherein the mutein contains a point change of N18C or N106C.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение зрелого белка.Another objective of the present invention is the provision of a method for producing recombinant human DNase I or its mutein, including culturing the bacteria described above in a nutrient medium, isolating inclusion bodies, solubilizing the precursor protein, denaturing metal chelate chromatography, precursor protein refolding, preparation of the mature protein by treatment with enterokinase and the release of mature protein.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором культивируют штамм E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18 или E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106.It is also an object of the present invention to provide the method described above in which E. coli strain BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI18 or E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI106 is cultivated.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного способа, в котором мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.Another objective of the present invention is the provision of the described method, in which the mutein contains a point replacement of N18C or N106C.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантной дезоксирибонуклазы I человека или ее мутеина, включающего предварительное ограниченное восстановление белков, инкубацию с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученных конъюгатов.Another objective of the present invention is the provision of a method for producing conjugates of polyethylene glycol and recombinant human deoxyribonuclase I or its mutein, including preliminary limited recovery of proteins, incubation with maleimide-polyethylene glycol and isolation of the resulting conjugates.

Также целью настоящего изобретения является предоставление конъюгата полиэтиленгликоля и рекомбинантной дезоксирибонуклазы I человека или ее мутеина, полученного описанным выше способом.It is also an object of the present invention to provide a conjugate of polyethylene glycol and recombinant human deoxyribonuclase I or a mutein thereof obtained by the method described above.

Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание способа получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, а также их конъюгатов с полиэтиленгликолем, с использованием бактерии, трансформированной экспрессионной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, и слитую с ним в рамке последовательность, кодирующую ДНКазу I человека, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.To implement the present invention, the main technical task was to create a method for producing recombinant human DNase I or its mutein, as well as their conjugates with polyethylene glycol, using a bacterium transformed with an expression plasmid containing a DNA fragment encoding a precursor of recombinant human DNase I or its mutein, including the sequence encoding a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence, and fused to it framed sequence encoding human DNase I, under the control of a promoter that functions in a bacterial cell.

Термин «экспрессионная плазмида» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека в составе экспрессионной кассеты, согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.The term "expression plasmid" means plasmid DNA containing all the necessary genetic elements for the expression of a gene embedded in it, for example, such as a promoter, terminator. A specific example of the genetic elements necessary for expression of the recombinant human DNase I precursor in the expression cassette of the present invention is, but is not limited to, the T7 bacteriophage RNA polymerase promoter.

Фрагментом ДНК, кодирующим предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека, согласно настоящему изобретению, является, например, синтетический ген, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей ДНКазу I человека. Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077.A DNA fragment encoding a recombinant human DNAse I precursor according to the present invention is, for example, a synthetic gene encoding a recombinant human DNAse I precursor or its mutein, comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence, fused in frame with a sequence encoding human DNase I. The specified DNA fragment can be obtained by PCR (see Example 1, Figure 1). Also, the indicated DNA fragment can be obtained using the cloning technology of Sloning BioTechnology, described in PCT application WO 2005071077.

Чтобы обеспечить эффективную трансляцию клонированного гена в E. coli, предпочтительно, чтобы в последовательности, кодирующей предшественник ДНКазы I человека, все редкие кодоны были заменены синонимичными часто встречающимися кодонами и часто встречающиеся кодоны были распределены в последовательности равномерно, в соответствии с частотностью кодонов экспрессирующихся генов E. coli.In order to ensure efficient translation of the cloned gene into E. coli, it is preferable that in the sequence encoding the human DNase I precursor all rare codons are replaced by synonymous frequent codons and the frequent codons are evenly distributed in the sequence, in accordance with the frequency of codons of expressed E genes .coli.

Последовательность гена, кодирующего предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека, согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Аминокислотная последовательность предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2. Аминокислотная последовательность зрелой рекомбинантной ДНКазы I человека представляет собой последовательностей под номером SEQ ID NO:2 без 19 первых аминокислот.The sequence of the gene encoding the recombinant human DNase I precursor according to the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence of the recombinant human DNase I precursor according to the present invention is presented in the Sequence Listing under the number SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence of mature recombinant human DNase I is the sequence number SEQ ID NO: 2 without the first 19 amino acids.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), кодирующего предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке.DNA fragments that encode essentially the same protein can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence of a DNA fragment (SEQ ID NO: 1) encoding a human recombinant DNase I precursor, for example, by a site-directed mutagenesis method such that one or more amino acid residues at a particular site will be delegated, replaced, inserted or added. DNA fragments modified as described above can be obtained using traditional processing methods to obtain mutations. DNA fragments that encode essentially the same protein can be obtained by expression of DNA fragments having the mutation described above in the corresponding cell.

ДНКаза I (панкреатическая дезоксирибонуклеаза I) представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы.DNase I (pancreatic deoxyribonuclease I) is an endonuclease that hydrolyzes both single and double stranded DNA to form a complex mixture of mono- and oligonucleotides containing 5'-phosphate groups.

Термин «мутеин» означает мутантный белок или белок, кодируемый мутантным геном. Предпочтительным мутеином ДНКазы I согласно настоящему изобретению является мутантная ДНКаза I, содержащая замену одной или нескольких аминокислот на цистеин. Наличие дополнительного остатка цистеина в мутеиновых вариантах ДНКазы I человека позволяет производить их направленную модификацию полиэтиленгликолем с получением конъюгатов в ферментативно высокоактивной форме.The term “mutein” means a mutant protein or a protein encoded by a mutant gene. A preferred mutein of DNase I according to the present invention is a mutant DNase I containing one or more amino acids replaced by cysteine. The presence of an additional cysteine residue in the mutein variants of human DNase I allows their directed modification with polyethylene glycol to produce conjugates in an enzymatically highly active form.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами ДНКазы I человека, определяются по его способности гидролизовать как одно-, так и двухцепочечные фрагменты ДНК. Так, например, активность ДНКазы I человека можно детектировать методом зимографии как описано в Примере 10. Считается, что вариант белка обладает свойствами предшественника ДНКазы I человека при условии, что активность указанного варианта составляет не ниже 1% активности нативной ДНКазы I человека.Indicators of functional activity, in which it is believed that the obtained protein has the properties of human DNase I, are determined by its ability to hydrolyze both single- and double-stranded DNA fragments. For example, the activity of human DNase I can be detected by zymography as described in Example 10. It is believed that the protein variant has the properties of a human DNase I precursor, provided that the activity of this variant is not less than 1% of the activity of native human DNase I.

Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий последовательность, кодирующую отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер, и последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с последовательностью, кодирующей ДНКазу I человека, под контролем промотора, функционирующего в бактериальной клетке.The expression plasmid according to the present invention contains a DNA fragment encoding a human recombinant DNAse I or mutein precursor comprising a sequence encoding a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence fused in frame with a human DNAse I encoding sequence under control of a promoter that functions in a bacterial cell.

В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pBR322, pMW119, pUC19, pET22b, pET28b и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.As the recombinant plasmid of the present invention, various plasmids capable of expression in the recipient cell can be used, such as plasmids pBR322, pMW119, pUC19, pET22b, pET28b and the like, but the list of plasmids is not limited to them.

Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения являются плазмиды, которые состоят из:A specific embodiment of the present invention are plasmids that consist of:

1) фрагмента NheI-NcoI длиной 29 п.о., представляющего собой синтетический адаптер, кодирующий гексагистидиновый кластер;1) a 29 bp NheI-NcoI fragment, which is a synthetic adapter encoding a hexahistidine cluster;

2) фрагмента NcoI-HindIII вектора рЕТ28а(+) длиной 5246 п.о., содержащего область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, участок инициации репликации бактериофага f1, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; участок терминации транскрипции; последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона;2) an NcoI-HindIII fragment of pET28a (+) vector with a length of 5246 bp containing the region of the beginning of replication of the plasmid pBR322, the Rop-organizing Rop protein gene, the replication initiation site of bacteriophage f1, the sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, RNA promoter -polymerase bacteriophage T7; transcription termination site; a sequence encoding a repressor of a lactose operon;

3) фрагмента NheI-HindIII длиной 816 п.о., кодирующего ДНКазу I человека либо ее мутеины [N18C] или [N106C] и слитую в рамке последовательность узнавания энтерокиназой.3) a 816 bp NheI-HindIII fragment encoding human DNase I or its muteins [N18C] or [N106C] and a fused enterokinase recognition sequence.

Указанные плазмиды содержат уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: NheI (1), ApaI (1068), PciI (2958), HindIII (5276).These plasmids contain unique recognition sites for restriction endonucleases: NheI (1), ApaI (1068), PciI (2958), HindIII (5276).

Структуры соответствующих плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106 приведены на Фиг.2, 3 и 4.The structures of the corresponding plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106 are shown in Fig.2, 3 and 4.

При помощи созданных плазмид можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта уровень экспрессии предшественника ДНКазы I человека может варьироваться, факт экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки-реципиента.Using the created plasmids, it is possible to transform a bacterial cell, preferably a bacterium belonging to the genus Escherichia, susceptible to such transformation by the indicated plasmid. The choice of a particular cell is not critical, since the methodology and methods of transformation are well known to those skilled in the art. Although the expression level of the human DNase I precursor may vary depending on the type of cell and culturing conditions of the obtained transformant, the fact of expression of the target protein will take place subject to successful transformation of the recipient cell.

«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995)."Transformation of a cell with a plasmid" means the introduction of a plasmid into a cell using methods well known to those skilled in the art. Transformation with this plasmid leads to the expression of the gene encoding the protein of the present invention and to the synthesis of the protein in the bacterial cell. Transformation methods include any standard methods known to one skilled in the art, for example, the method described in Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).

Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка-продуцент предшественника ДНКазы I человека» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению предшественника ДНКазы I человека согласно настоящему изобретению, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка-продуцент предшественника ДНКазы I человека» также означает клетку, которая способна накапливать продуцент предшественника ДНКазы I человека в количестве не менее чем 1 мг/л, более предпочтительно, не менее чем 30 мг/л. Указанный предшественник ДНКазы I человека накапливается в указанной клетке предпочтительно в виде телец включения.According to the present invention, “bacterial cell-producer of the human DNase I precursor” means a bacterial cell having the ability to produce and accumulate the human DNase I precursor of the present invention when the bacterial cell of the present invention is grown in said growth medium. As used herein, the term “human DNase I precursor bacterial cell producer” also means a cell that is capable of accumulating at least 1 mg / L, more preferably at least 30 mg / L, of the human DNase I precursor producer. Said human DNase I precursor accumulates in said cell, preferably in the form of inclusion bodies.

Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей фрагмент ДНК, кодирующий предшественник ДНКазы I человека.It is preferable to use bacteria belonging to the genus Escherichia for transformation with a recombinant plasmid containing a DNA fragment encoding a human DNase I precursor.

Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia" может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E. coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" may mean that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.The range of bacteria belonging to the genus Escherichia is not limited in any way, however, for example, the bacteria described in Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1), can be given as examples.

Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента предшественника ДНКазы I человека согласно настоящему изобретению является, но не ограничиваются им, штамм Escherichia coli BL21[DE3].A specific example of a recipient strain for producing a human DNase I precursor producer according to the present invention is, but is not limited to, Escherichia coli strain BL21 [DE3].

Штамм Escherichia coli BL21[DE3] характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] is characterized by the following cultural, morphological, physiological and biochemical characters and genetic characters.

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки образуют нити; на агаризованной среде - беловатые крупные колонии с неровным краем. Активность штамма определяется методом денситометрии электрофореграммы. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, канамицина сульфат 30 мкг/мл.Cultural and morphological features of the strain: gram-negative rods form strands; on an agar medium — whitish large colonies with an uneven edge. The activity of the strain is determined by the method of densitometry electrophoregram. The strain is stored under the following conditions: Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, 10% glycerol. The strain propagates under the following conditions - Lurie-Bertrand medium, 1% glucose, kanamycin sulfate 30 μg / ml.

Генетические особенности штамма. Генотип штамма - F^- ompT gal dcm lon hsdS_B(r_B ^- m_B ^-)λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).Genetic features of the strain. The genotype of the strain is F ^- ompT gal dcm lon hsdS _B (r _B ^- m _B ^- ) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).

Трансформация штамма Escherichia coli BL21[DE3] плазмидами рЕТ28ЕК-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106 приводит к получению штаммов-продуцентов BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C, соответственно, которые обеспечивали синтез рекомбинантного белка-предшественника ДНКазы I человека в количестве 15-40% от суммарного содержания белка клеток.Transformation of the Escherichia coli strain BL21 [DE3] with plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106 gives the producer strains BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, BL21 [DE3] / pET28EK-BL21E28EK-DNASEE18, -DNASEI106C, respectively, which provided the synthesis of a recombinant human DNAse I precursor protein in an amount of 15-40% of the total cell protein content.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI кодирует гибридный белок предшественник LEK-DNASEI, состоящий из аминокислотной последовательности ДНКазы I человека и слитого в рамке N-концевого лидерного пептида длиной 19 аминокислот, содержащего шестигистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой ДНКазы I человека.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI encodes a hybrid protein precursor LEK-DNASEI, consisting of the amino acid sequence of human DNase I and a 19-amino acid fused N-terminal leader peptide containing a six-histidine cluster and an enterokinase cleavage site immediately before the first human DNase I amino acid.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C кодирует гибридный белок предшественник LEK-DNASEI[N18C], состоящий из аминокислотной последовательности мутеина ДНКазы I человека [N18C] и слитого в рамке N-концевого лидерного пептида длиной 19 аминокислот, содержащего шестигистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой мутеина ДНКазы I человека.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI18C encodes a hybrid protein precursor LEK-DNASEI [N18C], consisting of the amino acid sequence of mutein human DNase I [N18C] and a 19-amino acid fused N-terminal leader peptide containing a six-histidine cluster and enterokinase cleavage site immediately in front of the first human DNAse I mutein amino acid.

Штамм Escherichia coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C кодирует гибридный белок предшественник LEK-DNASEI[N106C], состоящий из аминокислотной последовательности мутеина ДНКазы I человека [N106C] и слитого в рамке N-концевого лидерного пептида длиной 19 аминокислот, содержащего шестигистидиновый кластер и сайт расщепления энтерокиназой, находящийся непосредственно перед первой аминокислотой мутеина ДНКазы I человека.The strain Escherichia coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI106C encodes a hybrid protein precursor LEK-DNASEI [N106C], consisting of the amino acid sequence of mutein human DNase I [N106C] and a 19-amino acid fused N-terminal leader peptide containing a six-histidine cluster enterokinase cleavage site immediately in front of the first human DNAse I mutein amino acid.

Способ получения ДНКазы I человека или ее мутеина согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение указанного зрелого белка рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина.The method for producing human DNase I or its mutein according to the present invention includes culturing the bacterium described above in a nutrient medium suitable for growing said prokaryotic cells, isolating inclusion bodies, solubilizing the precursor protein, denaturing metal chelate chromatography, refolding the precursor protein, obtaining the mature protein treatment with enterokinase and isolation of the indicated mature human recombinant DNase I protein or its mutein.

Ковалентная модификация путем присоединения к белковой молекуле полимеров определенной структуры позволяет создавать препараты с пролонгированным действием, то есть преодолеть ряд недостатков препаратов на основе белков, к которым относятся: недостаточная стабильность (in vitro и in vivo), неустойчивость к действию протеаз (особенно пептидов), короткий период полураспада/полувыведения при введении в организм (минуты), иммуногенность и антигенность, наличие выраженных побочных эффектов при длительном клиническом применении [Abuchowski, A.; McCoy, J.R.; Palczuk, N.С.; van Es, Т.; Davis, F.F. (1977), "Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase". Journal of Biological Chemistry 252 (II): 3582-3586]. Изменение фармакодинамики препарата методом ПЭГилирования используется при производстве ряда разрешенных к клиническому применению препаратов, например, гранулоцитарный колоний стимулирующего фактора (ГКСФ), интерферона бета и др.Covalent modification by attaching polymers of a certain structure to the protein molecule allows the creation of drugs with a prolonged action, that is, to overcome a number of disadvantages of protein-based drugs, which include insufficient stability (in vitro and in vivo), instability to the action of proteases (especially peptides), short half-life / half-life when introduced into the body (minutes), immunogenicity and antigenicity, the presence of pronounced side effects with prolonged clinical use [Abuchowski, A .; McCoy, J.R .; Palczuk, N.C .; van Es, T .; Davis, F.F. (1977), "Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase". Journal of Biological Chemistry 252 (II): 3582-3586]. The change in the pharmacodynamics of the drug by PEGylation is used in the production of a number of drugs approved for clinical use, for example, granulocyte colony of stimulating factor (GCSF), interferon beta, etc.

Поэтому в рамки настоящего изобретения также включается способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина согласно настоящему изобретению, включающий предварительное ограниченное восстановление ДНКазы I человека или ее мутеина согласно настоящему изобретению, инкубацию их с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученных конъюгатов.Therefore, the scope of the present invention also includes a method for producing conjugates of polyethylene glycol and recombinant human DNase I or its mutein according to the present invention, including preliminary limited recovery of human DNase I or its mutein according to the present invention, incubating them with maleimide-polyethylene glycol and isolating the resulting conjugates.

Также в рамки настоящего изобретения включаются конъюгат полиэтиленгликоля и рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, полученный описанным выше способом.Also included in the scope of the present invention is a conjugate of polyethylene glycol and recombinant human DNase I or a mutein thereof obtained by the method described above.

Использование указанного выше способа позволяет проводить синтез и продукцию конъюгатов мутеинов рекомбинантной ДНКазы I человека с полиэтиленгликолем согласно настоящему изобретению с активностью не менее 10% активности нативной ДНКазы I человека или быка.Using the above method allows the synthesis and production of mutein conjugates of recombinant human DNase I with polyethylene glycol according to the present invention with an activity of at least 10% of the activity of native human DNase I or bovine.

Особенности плазмид и результаты их практического применения приведены на следующих Фигурах.Features of plasmids and the results of their practical application are shown in the following Figures.

Краткое описание Фигур:Brief Description of Shapes:

На Фигуре 1 показана схема сборки синтетического гена ДНКазы I человека из олигонуклеотидных праймеров и схема получения экспрессионных плазмид рЕТ28ЕК-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106.The Figure 1 shows a diagram of the assembly of the synthetic human DNase I gene from oligonucleotide primers and a scheme for obtaining expression plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18, pET28EK-DNASEIC106.

На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI. Используются следующие обозначения: "pBR322ori" область начала репликации плазмиды pBR322; "ROP" - ген РНК-организующего белка Rop; "f1 ori" - участок инициации репликации бактериофага f1; "KanR2" - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; "Т7 prom" - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; "T7term" - участок терминации транскрипции; "lacI" - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; "LEK-DNASEI" - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника ДНКазы I человека, включающего отделяемый N-концевой дополнительный пептид "LEK" и зрелую ДНКазу I человека "DNASEI". Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания. "N18", "N106" - триплеты нуклеотидов, соответствующих сайтам N-гликозилирования природной ДНКазы I человека.Figure 2 shows a map of the expression plasmid pET28EK-DNASEI. The following notation is used: "pBR322ori" region of the beginning of replication of plasmid pBR322; "ROP" - gene of the Rop-organizing protein Rop; "f1 ori" is the site of initiation of replication of bacteriophage f1; "KanR2" is a sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, which provides bacterial resistance to kanamycin; "T7 prom" - promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7; "T7term" - transcription termination site; "lacI" is the sequence encoding the repressor of the lactose operon; "LEK-DNASEI" is an open reading frame (OPC) of a human DNase I precursor protein polypeptide comprising a detachable N-terminal additional LEK peptide and mature human DNase I DNase I. Arrows indicate the direction of gene transcription. The recognition sites of restriction endonucleases are in italics, and the numbers of nucleotides at the cutting points are indicated in parentheses. "N18", "N106" - triplets of nucleotides corresponding to the N-glycosylation sites of natural human DNase I.

На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI18C. Используются обозначения аналогично Фигуре 2, а также: "LEK-DNASEI[N18C]" - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника мутеина ДНКазы I человека [N18C].Figure 3 shows a map of the expression plasmid pET28EK-DNASEI18C. Designations are used similarly to Figure 2, and also: "LEK-DNASEI [N18C]" is an open reading frame (OPC) of the human DNAse I mutein precursor protein polypeptide [N18C].

На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI106C. Используются обозначения аналогично Фигуре 2, а также: "LEK-DNASEI[N106C]" - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида белка-предшественника мутеина ДНКазы I человека [N106C].Figure 4 shows a map of the expression plasmid pET28EK-DNASEI106C. Designations are used similarly to Figure 2, as well as: "LEK-DNASEI [N106C]" - open reading frame (OPC) of the polypeptide of the human precursor protein mutein DNase I [N106C].

На Фигуре 5 показана электрофореграмма тотального белка клеток штамма-продуцента BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI при индукции. ДСН-ПААГ анализ для культур штамма-продуцента, полученных из трех случайно отобранных колоний. Обозначения "-" и "+" - образцы до индукции и через 2 ч после индукции культур 1 мМ ИПТГ. "М" - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы полос маркера указаны в кДа. Положение целевого белка указано стрелкой.Figure 5 shows the electrophoregram of the total protein of the cells of the producer strain BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI upon induction. SDS-PAGE analysis for producer strain cultures obtained from three randomly selected colonies. The designations "-" and "+" - samples before induction and 2 hours after induction of cultures of 1 mm IPTG. "M" is a molecular weight marker. The molecular weights of the marker bands are indicated in kDa. The position of the target protein is indicated by the arrow.

На Фигуре 6 приведены электрофореграммы белковых фракций при очистке, ренатурации и процессинге белка-предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека. Обозначения: "IB" - солюбилизированные тельца включения, "FF" - фракция проскока через металлохелатную колонку, "20"-"500" - фракции ступенчатой элюции возрастающими концентрациями имидазола, в мМ; "Е" - фракция элюата при промывке колонки ЭДТА, "REF" - растворимый белок после рефолдинга, "ЕК" - реакционная смесь после 2 ч расщепления энтерокиназой. Дорожки "REF" и "EK" - электрофорез в невосстанавливающих условиях, остальные дорожки - в восстанавливающих. Положение белка-предшественника указано стрелкой.The Figure 6 shows the electrophoregrams of protein fractions during purification, renaturation and processing of the protein precursor of recombinant human DNase I. Designations: "IB" - solubilized inclusion bodies, "FF" - fraction of slip through the metal chelate column, "20" - "500" - fractions of stepwise elution with increasing concentrations of imidazole, in mm; “E” is the eluate fraction during washing of the EDTA column, “REF” is the soluble protein after refolding, “EC” is the reaction mixture after 2 h of digestion with enterokinase. Lanes "REF" and "EK" - electrophoresis in non-reducing conditions, the rest of the tracks in restoring. The position of the precursor protein is indicated by the arrow.

На Фигуре 7 приведена зимограмма белка-предшественника ДНКазы I. Окраска бромистым этидием. Расположение дорожек: "[M-1]DNASEI" - рекомбинантная ДНКаза I человека с дополнительным N-концевым остатком метионина, "LEK-DNASEI" - белок-предшественник ДНКазы I человека, "bDNAse I" - природная ДНКаза I быка, "М" - предокрашенный маркер молекулярных масс. Количество нанесенных на соответствующие дорожки белков указано в нг, положение белка-предшественника ДНКазы I человека указано стрелкой. Ферментативная активность пропорциональна размеру темной зоны на светлом фоне - участку деградации иммобилизованной в полиакриламидном геле двуцепочечной ДНК.The Figure 7 shows the zymogram of a protein precursor of DNase I. Ethidium bromide staining. Lane location: "[M-1] DNASEI" - recombinant human DNase I with an additional N-terminal methionine residue, "LEK-DNASEI" - human DNAse I precursor protein, "bDNAse I" - natural bovine DNase I, "M" - pre-painted molecular weight marker. The amount of proteins deposited on the corresponding tracks is indicated in ng; the position of the human DNAse I precursor protein is indicated by an arrow. Enzymatic activity is proportional to the size of the dark zone against a light background — the degradation site of double-stranded DNA immobilized in a polyacrylamide gel.

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to the following non-limiting Examples.

Пример 1. Получение плазмидной ДНК PAT-EK-DNASEI, кодирующей предшественник ДНКазы I человека с отделяемым N-концевым пептидомExample 1. Obtaining plasmid DNA PAT-EK-DNASEI encoding a human DNase I precursor with a separable N-terminal peptide

Для известной аминокислотной последовательности ДНКазы I человека с добавленным N-концевым лидерным пептидом (SEQ ID NO:3), содержащим последовательность узнавания энтерокиназой, была проведена обратная трансляция в последовательность нуклеотидов ДНК. При этом были использованы кодоны, оптимальные для экспрессии этого гена в E. coli класса В, а также была проведена оптимизация структуры гена по вторичной структуре мРНК, GC составу, обеспечено отсутствие нежелательных регуляторных элементов (например, отсутствие внутренних сайтов связывания рибосом), а также отсутствие протяженных повторов, палиндромов.For the known amino acid sequence of human DNase I with an added N-terminal leader peptide (SEQ ID NO: 3) containing an enterokinase recognition sequence, reverse translation was performed to the DNA nucleotide sequence. In this case, codons optimal for the expression of this gene in E. coli class B were used, and the structure of the gene was optimized for the secondary structure of mRNA, GC composition, and the absence of undesirable regulatory elements (for example, the absence of internal ribosome binding sites) was ensured, as well as lack of extended repetitions, palindromes.

Индекс CAI (Codon Adaptation Index), отражающий эффективность экспрессии гена в данном организме, для полученной последовательности составил 0,8, что является хорошим прогностическим показателем для промышленной пригодности полученного на его основе штамма-продуцента. Полученная нуклеотидная последовательность приведена в SEQ ID NO:4.The CAI (Codon Adaptation Index) index, reflecting the efficiency of gene expression in a given organism, for the obtained sequence was 0.8, which is a good prognostic indicator for the industrial suitability of the producer strain obtained on its basis. The obtained nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4.

Синтетический ген, кодирующий полипептид ДНКазы I человека, получали методом полимеразной цепной реакции с использованием синтетических олигонуклеотидов, приведенных в таблице 1, на приборе Терцик МС2 («ДНК-Технология», Россия).A synthetic gene encoding a human DNase I polypeptide was obtained by polymerase chain reaction using the synthetic oligonucleotides shown in Table 1 on a Tertsik MS2 instrument (DNA-Technology, Russia).

Готовили инкубационную смесь следующего состава: 1х буфер для термостабильной ДНК-полимеразы; 10 пМ каждого праймера; по 2 мМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата; 1-2 ед. термостабильной ДНК-полимеразы в объеме 50 мкл. Поверх этой смеси наслаивали 50 мкл легкого минерального масла и вели амплификацию по схеме: 1 цикл - денатурация - 94°C, 3 мин; 25 циклов - денатурация 94°C, 30 сек, отжиг 55°C, 30 сек, достройка 72°C, 45-60 сек; 1 цикл - достройка 72°C, 7 мин.An incubation mixture of the following composition was prepared: 1x buffer for thermostable DNA polymerase; 10 pM of each primer; 2 mm of each deoxyribonucleotide triphosphate; 1-2 units thermostable DNA polymerase in a volume of 50 μl. 50 μl of light mineral oil was layered on top of this mixture and amplified according to the scheme: 1 cycle - denaturation - 94 ° C, 3 min; 25 cycles - denaturation 94 ° C, 30 sec, annealing 55 ° C, 30 sec, completion 72 ° C, 45-60 sec; 1 cycle - completion 72 ° C, 7 min.

Продукт ПЦР выделяли из 1% агарозного геля с использованием набора "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя и лигировали в векторную плазмиду PAL-TA (ЗАО «Евроген», Россия) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва). Полученными лигазными смесями трансформировали клетки E. coli штамма DH5α, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r_k-, m_k+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток E. coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 мин, нагревали до 42 С на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут, затем добавляли 800 мкл питательного бульона SOB, инкубировали при 37°C 60 минут, затем переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл агара и помещали в термостат на 37°С 18 часов. Колонии E. coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды M13rev (SEQ ID NO:19) и M13dir (SEQ ID NO:20). 5 отобранных клонов наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных плазмид определяли нуклеотидную последовательность области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием стандартных праймеров T7prom (SEQ ID NO:21) и SP6 (SEQ ID NO:22) к последовательности вектора.The PCR product was isolated from 1% agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, USA) according to the manufacturer's protocol and ligated into the PAL-TA vector plasmid (CJSC Evrogen, Russia) using Phage T4 DNA ligases and standard buffer solution (Fermentas, Lithuania). The obtained ligase mixtures transformed E. coli cells of strain DH5α, with the genotype F-φ80lacZΔM15 Δ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (r _k -, m _k +) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1. For this, 5 μl of the ligase mixture was added to 200 μl of a frozen suspension of E. coli cells, incubated on ice for 30 minutes, heated to 42 ° C for 45 seconds and incubated on ice for 5 minutes, then 800 μl of SOB nutrient broth was added, incubated at 37 ° C 60 minutes, then the suspension was transferred to a Petri dish with solid agar medium containing ampicillin at a concentration of 100 μg / ml agar and placed in a thermostat at 37 ° C for 18 hours. Colonies of E. coli selected as a result of blue-white screening were analyzed by PCR from clones using primers for the recipient plasmid sequences M13rev (SEQ ID NO: 19) and M13dir (SEQ ID NO: 20). 5 selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Amp nutrient broth and plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's protocol. For the obtained plasmids, the nucleotide sequence of the insertion region was determined by PCR sequencing using standard T7prom primers (SEQ ID NO: 21) and SP6 (SEQ ID NO: 22) to the vector sequence.

Пример 2. Получение плазмид PAT-EK-DNASEIC18 и PAT-EK-DNASEIC106, кодирующих мутеины N18C и N106C ДНКазыI человека с отделяемым N-концевым лидеромExample 2. Obtaining plasmids PAT-EK-DNASEIC18 and PAT-EK-DNASEIC106 encoding muteins N18C and N106C of human DNase I with a detachable N-terminal leader

Для получения плазмиды PAT-EK-DNASEIC18 проводили сайт-направленный мутагенез плазмиды PAT-EK-DNASEI методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-DNA-CN-L-F (SEQ ID NO:23) и IP-DNA-CN-L-R (SEQ ID NO:24).To obtain the plasmid PAT-EK-DNASEIC18, site-directed mutagenesis of the plasmid PAT-EK-DNASEI was performed by inverted PCR using primers IP-DNA-CN-LF (SEQ ID NO: 23) and IP-DNA-CN-LR (SEQ ID NO: 24).

Для получения плазмиды PAT-EK-DNASEIC106 проводили сайт-направленный мутагенез плазмиды PAT-EK-DNASEI методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-DNA-CN-R-F (SEQ ID NO:25) и IP-DNA-CN-R-R (SEQ ID NO:26).To obtain the plasmid PAT-EK-DNASEIC106, site-directed mutagenesis of the plasmid PAT-EK-DNASEI was performed by inverted PCR using primers IP-DNA-CN-RF (SEQ ID NO: 25) and IP-DNA-CN-RR (SEQ ID NO: 26).

Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили по [Michael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. Kretz. Site-directed Mutagenesis using PCR in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M. Griffin and H.G. Griffin. ISBN 1-898486-01-8, 1995. Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, U.K.] с модификациями. Каждый олигонуклеотид фосфорилировали отдельно. Реакцию проводили в буфере трис-HCl, pH 7,5, содержащем 10 мМ MgCl₂, 50 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 100 пМ олигонуклеотида, 1 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в течение 30 мин при 37°C. После окончания реакции фермент инактивировали при 65°C 10 мин. Затем использовали для проведения инвертированной ПЦР в количестве 20 пМ на реакцию. ПЦР вели с использованием набора "Encyclo PCR kit" (ЗАО Евроген, Россия) по инструкции производителя, по следующей схеме: 1 цикл: 4 мин 94°C, 2 мин 50°C, 2 мин 72°C; затем 11 циклов 1 мин - 94°C, 1 мин - 55°C, 2 мин 72°C. Продукт ПЦР разводили вдвое однократным буфером для эндонуклеазы DpnI, добавляли 10 Ед. DpnI и инкубировали при 37°C 30 мин, затем вносили 2.5 Ед. полимеразы Pfu, переносили на 72°C и инкубировали еще 30 мин. Полученную смесь очищали, используя набор реактивов "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя. Проводили лигирование очищенного продукта инвертированной ПЦР с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва) в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки E. coli штамма DH5α. 4 клона E. coli наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидную последовательность полученных плазмид определяли методом ПЦР-секвенирования.Inverted PCR site-directed mutagenesis was performed according to [Michael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. Kretz. Site-directed Mutagenesis using PCR in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. AM Griffin and HG Griffin. ISBN 1-898486-01-8, 1995. Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, UK] with modifications. Each oligonucleotide was phosphorylated separately. The reaction was carried out in Tris-HCl buffer, pH 7.5, containing 10 mM MgCl ₂ , 50 mM dithiothreitol, 1 mM ATP and 100 pM oligonucleotide, 1 unit. polynucleotide kinase of phage T4 (Sibenzym, Russia) for 30 min at 37 ° C. After the reaction, the enzyme was inactivated at 65 ° C for 10 min. Then used to conduct inverted PCR in an amount of 20 pM per reaction. PCR was performed using the Encyclo PCR kit (CJSC Evrogen, Russia) according to the manufacturer's instructions, according to the following scheme: 1 cycle: 4 min 94 ° C, 2 min 50 ° C, 2 min 72 ° C; then 11 cycles of 1 min - 94 ° C, 1 min - 55 ° C, 2 min 72 ° C. The PCR product was diluted twice with a single buffer for DpnI endonuclease, 10 Units was added. DpnI and incubated at 37 ° C for 30 min, then 2.5 Units were added. Pfu polymerase was transferred at 72 ° C and incubated for another 30 min. The resulting mixture was purified using a set of reagents "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System"("Promega", USA) according to the manufacturer's protocol. The purified inverted PCR product was ligated using T4 phage DNA ligase and standard buffer solution (Fermentas, Lithuania) for 1 hour at room temperature. The obtained ligase mixture transformed cells of E. coli strain DH5α. 4 clones of E. coli were grown in 5 ml of 2xYT-Amp nutrient broth and plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania). The nucleotide sequence of the obtained plasmids was determined by PCR sequencing.

Для секвенирования плазмиды PAT-EK-DNASEIC18 использовали специфический олигонуклеотид SQ-DNA-CN-L-F (SEQ ID NO:27).For sequencing of the plasmid PAT-EK-DNASEIC18, the specific oligonucleotide SQ-DNA-CN-L-F (SEQ ID NO: 27) was used.

Для секвенирования плазмиды PAT-EK-DNASEIC106 использовали специфический олигонуклеотид SQ-DNA-CN-R-F (SEQ ID NO:28).For sequencing of the plasmid PAT-EK-DNASEIC106, the specific oligonucleotide SQ-DNA-CN-R-F (SEQ ID NO: 28) was used.

Пример 3. Получение векторной плазмиды pET28Thr-Example 3. Obtaining a vector plasmid pET28Thr-

Векторная плазмида была получена на основе коммерческого вектора рЕТ28а(+) (Novagen, США), со вставленным коротким ДНК адаптером. Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) обрабатывали последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и NheI, после чего инактивировали ферменты прогреванием 20 мин при 65°C и выделяли из геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя, и лигировали с адаптером. Адаптер получали отжигом двух частично комплиментарных олигонуклеотидов AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:29) и AD-6H-NheR (SEQ ID NO:30), при отжиге образующих дуплекс с выступающими «липкими» 5'-концами. Для получения адаптера вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°C и медленно охлаждали до комнатной температуры. Адаптер лигировали с NcoI-NheI фрагментом плазмиды рЕТ28а Т4 ДНК-лигазой (Fermentas), полученными лигазными смесями, трансформировали клетки E. coli штамма DH5α. Колонии E. coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:29) и T7t (SEQ ID NO:31).The vector plasmid was obtained on the basis of the commercial vector pET28a (+) (Novagen, USA), with the inserted short DNA adapter. The recipient plasmid pET28a (+) was sequentially treated with each of the NcoI and NheI endonucleases, after which the enzymes were inactivated by heating for 20 min at 65 ° C and isolated from the gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, USA) according to manufacturer's protocol, and ligated with the adapter. The adapter was obtained by annealing two partially complementary oligonucleotides AD-6H-NcoF (SEQ ID NO: 29) and AD-6H-NheR (SEQ ID NO: 30), upon annealing forming duplex with protruding “sticky” 5'-ends. To obtain an adapter, 100 pm of each oligonucleotide was introduced into the tube, heated to 95 ° C, and slowly cooled to room temperature. The adapter was ligated with the NcoI-NheI fragment of the plasmid pET28a T4 DNA ligase (Fermentas) obtained by ligase mixtures, E. coli strain DH5α cells were transformed. E. coli colonies were analyzed by clone PCR using AD-6H-NcoF oligonucleotides (SEQ ID NO: 29) and T7t (SEQ ID NO: 31).

Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Kan и проводили выделение плазмидной ДНК с набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидную последовательность области вставки адаптера в полученных плазмидах определяли методом ПЦР-секвенирования с праймера T7t (SEQ ID NO:31).Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan and plasmid DNA was isolated with the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania). The nucleotide sequence of the adapter insertion region in the obtained plasmids was determined by PCR sequencing with T7t primer (SEQ ID NO: 31).

Пример 4. Получение экспрессионных плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106Example 4. Obtaining expression plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 and pET28EK-DNASEIC106

Реципиентную плазмиду pET28Thr-, полученную как описано в примере 3, обрабатывали эндонуклеазами NheI и HindIII; проводили дефосфорилирование с последующей инактивацией щелочной фосфатазы 10 мин при 65°C. Фрагмент ДНК выделяли из агарозного геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США) по методике производителя.The recipient plasmid pET28Thr-, obtained as described in example 3, was treated with endonucleases NheI and HindIII; dephosphorylation was performed followed by inactivation of alkaline phosphatase for 10 min at 65 ° C. The DNA fragment was isolated from agarose gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, USA) according to the manufacturer's procedure.

Донорные плазмиды также обрабатывали эндонуклеазами NheI и HindIII, продукты рестрикции разделяли в 1% агарозном геле и выделяли из геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США).Donor plasmids were also treated with NheI and HindIII endonucleases, the restriction products were separated on a 1% agarose gel and isolated from the gel using the Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System kit (Promega, USA).

Для получения экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEI в качестве донорной использовали плазмиду PAT-EK-DNASEI, полученную как описано в примере 1.To obtain the expression plasmid pET28EK-DNASEI as a donor used the plasmid PAT-EK-DNASEI, obtained as described in example 1.

Для получения экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEIC18 в качестве донорной использовали плазмиду PAT-EK-DNASEIC18, полученную как описано в примере 2.To obtain the expression plasmid pET28EK-DNASEIC18 as a donor plasmid PAT-EK-DNASEIC18 obtained as described in example 2 was used.

Для получения экспрессионной плазмиды pET28EK-DNASEIC106 в качестве донорной использовали плазмиду PAT-EK-DNASEIC106, полученную как описано в примере 2.To obtain the expression plasmid pET28EK-DNASEIC106 as the donor used the plasmid PAT-EK-DNASEIC106, obtained as described in example 2.

Реакцию лигирования очищенных фрагментов донора и акцептора проводили с использованием Т4 ДНК лигазы (Fermentas, Литва) по методике производителя. Лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli штамма DH5α, колонии E. coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательности векторов T7t (SEQ ID NO:31) и T7prom (SEQ ID NO:21). Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Каn и проводили выделение плазмидной ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидную последовательность в области вставки в полученных генетических конструкциях определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием стандартных праймеров к последовательности вектора T7t (SEQ ID NO:31) и T7prom (SEQ ID NO:21).The ligation reaction of the purified donor and acceptor fragments was carried out using T4 DNA ligase (Fermentas, Lithuania) according to the manufacturer's procedure. E. coli strain DH5α cells were transformed with a ligase mixture, E. coli colonies were analyzed by clone PCR using primers for the sequence of vectors T7t (SEQ ID NO: 31) and T7prom (SEQ ID NO: 21). Selected clones were grown in 5 ml of 2xYT-Kan and plasmid DNA was isolated using the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Lithuania). The nucleotide sequence in the insertion region in the obtained genetic constructs was determined by PCR sequencing using standard primers for the sequences of the vector T7t (SEQ ID NO: 31) and T7prom (SEQ ID NO: 21).

Пример 5. Получение штаммов-продуцентов Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC18, BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC106, оценка продуктивности штаммов-продуцентов и локализация целевого белкаExample 5. Obtaining producer strains of E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEIC18, BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEIC106, evaluating the productivity of producer strains and localization of the target protein

Для получения штаммов-продуцентов гибридных белков предшественников ДНКазыI человека и ее мутеинов экспрессионные конструкции, полученные по примеру 5, использовали для трансформации компетентных клеток E. coli BL21[DE3] (с генотипом F-ompT hsdS_B (r-m-) gal dcm (DE3)) и проводили отбор клонов, сохраняющих уровень биосинтеза рекомбинантного полипептида не ниже 30-50% от суммарного клеточного белка в течение, по крайней мере, четырех последовательных пассажей.To obtain producer strains of hybrid proteins of human DNase I precursors and its muteins, the expression constructs obtained in Example 5 were used to transform competent E. coli BL21 [DE3] cells (with the F-ompT hsdS _B (rm-) gal dcm (DE3) genotype ) and select clones that maintain the level of biosynthesis of the recombinant polypeptide at least 30-50% of the total cellular protein for at least four consecutive passages.

Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI - продуцента белка-предшественника ДНКазы I человека клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28EK-DNASEI.To obtain E. coli strain BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, a producer of the human DNase I precursor protein, cells of strain E. coli BL21 [DE3] were transformed with the expression plasmid pET28EK-DNASEI.

Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC18 - продуцента белка-предшественника мутеина [N18C] ДНКазы I человека клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28EK-DNASEIC18.To obtain E. coli strain BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEIC18, a producer of the mutein [N18C] DNAse I precursor protein, human E. coli BL21 [DE3] strain cells were transformed with the expression plasmid pET28EK-DNASEIC18.

Для получения штамма E. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC106 - продуцента белка-предшественника мутеина [N106C] ДНКазы I человека клетки штамма E. coli BL21[DE3] трансформировали экспрессионной плазмидой pET28EK-DNASEIC106.To obtain E. coli strain BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEIC106, a producer of the mutein [N106C] DNAse I precursor protein, human E. coli BL21 [DE3] strain cells were transformed with the expression plasmid pET28EK-DNASEIC106.

Трансформанты E. coli BL21[DE3] высевали на агаризованную среду 2xYT-агар с добавлением канамицина до 30 мкг/мл и глюкозы до 2%, проводили аналитическую экспрессию целевых белков для пяти случайно выбранных клонов типичного фенотипа. Клоны подращивали в питательном бульоне с добавлением канамицина до 30 мкг/мл и раствора глюкозы до 2% в течение 6-7 часов, инокулировали новую порцию питательной среды в соотношении 1:100, растили культуру до достижения оптической плотности 2 О.Е., индуцировали изопропилтио-р-D-галактозидом, и культивировали еще 2 ч. После окончания культивации осадок клеток отделяли центрифугированием, ресуспендировали клетки в растворе 10 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА-Na, 0.1% Тритона-Х100, 10 мкг/мл лизоцима в соотношении 10 мл раствора на 1 г клеточной пасты, выдерживали суспензию 30 мин на льду и проводили разрушение клеток ультразвуковым диспергатором до исчезновения видимой вязкости суспензии. Отбирали образцы для электрофоретического анализа, разделяли в них растворимую и нерастворимую фракцию белков центрифугированием в микроцентрифуге, дополнительно ресуспендировали осадок в том же растворе и осаждали центрифугированием. Результаты электрофоретического анализа тотального белка для штамма BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI приведены на Фиг.5, электрофоретическая подвижность и интенсивность полосы целевого белка для мутеинов [N18C] и [N106C] полностью аналогичны. По данным гель-электрофореза белковых фракций все 3 целевых белка практически полностью были локализованы в нерастворимой фракции белков, т.е. находились в форме «телец включения».Transformants of E. coli BL21 [DE3] were plated on 2xYT agar agar medium supplemented with kanamycin up to 30 μg / ml and glucose up to 2%; the target proteins were analytically expressed for five randomly selected clones of a typical phenotype. Clones were grown in nutrient broth with the addition of kanamycin up to 30 μg / ml and glucose solution up to 2% for 6-7 hours, a new portion of the nutrient medium was inoculated with a ratio of 1: 100, the culture was grown until the optical density reached 2 O.E., induced isopropylthio-r-D-galactoside, and cultured for another 2 hours. After cultivation, the cell pellet was separated by centrifugation, the cells were resuspended in a solution of 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA-Na, 0.1% Triton-X100, 10 μg / ml lysozyme the ratio of 10 ml of solution per 1 g of cell paste, kept suspended iju 30 minutes on ice and cell disruption was performed by ultrasonic disperser until the disappearance of the apparent viscosity of the slurry. Samples were taken for electrophoretic analysis, the soluble and insoluble fraction of proteins was separated by centrifugation in a microcentrifuge, the precipitate was additionally resuspended in the same solution, and precipitated by centrifugation. The results of electrophoretic analysis of the total protein for strain BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI are shown in FIG. 5, the electrophoretic mobility and intensity of the target protein band for muteins [N18C] and [N106C] are completely similar. According to gel electrophoresis of protein fractions, all 3 target proteins were almost completely localized in the insoluble fraction of proteins, i.e. were in the form of “inclusion bodies”.

Пример 6. Наработка, выделение и очистка в денатурирующих условиях белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C]Example 6. Production, isolation and purification under denaturing conditions of the human DNAse I precursor proteins and its muteins DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C]

Получение очищенных денатурированных белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов N18C и N106C из штаммов-продуцентов Е.coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI; BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC18 и BL21[DE3]/pET28EK-DNASEIC106 проводили по следующей общей схеме: выращивание штаммов-продуцентов, индукция, отделение биомассы, лизис и дезинтеграция клеток в присутствии ЭДТА-Na; отделение телец включения; солюбилизация; металлохелатная хроматография. Для этого штаммы-продуценты высевали из музея петлей истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 2% глюкозы, растили 14 часов при +37°C. Одну отдельную колонию соответствующего штамма переносили в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина и 2% глюкозы, и растили на качалке 14 часов при +37°C. Полученными культурами инокулировали 3 колбы по 250 мл среды 2xYT, содержащих 30 мкг/мл канамицина и 0,1% глюкозы, растили на качалке 3,5 часа при +37°C, отбирали образцы бактериальной суспензии для анализа, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и растили еще 4 часа.Obtaining purified denatured human DNAse I precursor proteins and its muteins N18C and N106C from E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI producer strains; BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEIC18 and BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEIC106 were carried out according to the following general scheme: growing producer strains, induction, separation of biomass, lysis and cell disintegration in the presence of EDTA-Na; Department of inclusion bodies; solubilization; metal chelate chromatography. For this, producer strains were seeded from the museum with a loop by a draining stroke on a Petri dish with agarized LB medium containing 30 μg / ml kanamycin and 2% glucose, grown for 14 hours at + 37 ° C. One single colony of the corresponding strain was transferred to 5 ml of LB liquid medium containing 30 μg / ml kanamycin and 2% glucose and grown on a shaker for 14 hours at + 37 ° C. The resulting cultures inoculated 3 flasks of 250 ml of 2xYT medium containing 30 μg / ml kanamycin and 0.1% glucose, grown on a shaker for 3.5 hours at + 37 ° C, samples of the bacterial suspension were taken for analysis, IPTG was added to a final concentration of 1 mm and grew another 4 hours.

Отделяли осадки биомассы центрифугированием, осадки клеток ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис pH 7,4, 2 мМ ЭДТА), добавляли лизоцим до 10 мкг/мл и Тритон Х100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадки центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Осадки ресуспендировали в 20 мл раствора А, добавляли детергент NP-40 до 1%, суспензии обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли тельца включения центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные осадки телец включения ресуспендировали в растворе А, добавляли NaCl до 500 мМ, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные препараты обогащенных телец включения хранили при -70°C. Чистота всех целевых белков в полученных препаратах составляла не менее 80% по данным денситометрии электрофореграмм.Biomass pellets were separated by centrifugation, cell pellets were resuspended in 20 ml of solution A (50 mM Tris pH 7.4, 2 mM EDTA), lysozyme up to 10 μg / ml and Triton X100 up to 0.1% were added, incubated for 30 min on ice. Cells and genomic DNA were destroyed using an ultrasonic disperser in 10 s pulses until the increased viscosity of the suspension disappeared. Precipitation was separated by centrifugation for 10 minutes at 18,000 rpm. Precipitation was resuspended in 20 ml of solution A, NP-40 detergent was added to 1%, the suspensions were treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, inclusion bodies were separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The resulting precipitates of inclusion bodies were resuspended in solution A, NaCl was added to 500 mM, the suspension was treated with an ultrasonic disperser until the sediment particles larger than 1 mm disappeared, and the precipitate was separated by centrifugation for 10 min at 20,000 rpm. The resulting preparations of enriched inclusion bodies were stored at -70 ° C. The purity of all target proteins in the obtained preparations was at least 80% according to the densitometry data of electrophoregrams.

Для проведения солюбилизации целевых белков к навескам приблизительно 50 мг телец включения добавляли раствор Б (8 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ бета-меркаптоэтанола, pH 8.0) в соотношении 10 мл раствора на 1 г телец. Суспензии инкубировали при перемешивании 2 часа при +37°C, отделяли не растворившийся клеточный дебрис центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Супернатанты наносили на колонки HiTrap Chelating Sepharose (GE Healthcare, США), содержащие хелатированные ионы кобальта и уравновешенные раствором В (6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ хлорида натрия, pH 7,0). Колонки промывали раствором Г (6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ имидазола pH 7,0) и элюировали целевые белки раствором Д (6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 500 мМ хлорида натрия, 50 мМ имидазола pH 7,0). Элюаты концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации белка 20 мг/мл, обессоливали диафильтрацией и замораживали. Чистота всех целевых белков в полученных препаратах составляла не менее 95% по данным денситометрии электрофореграмм.To solubilize the target proteins, a solution of B (8 M urea, 50 mM Tris-HCl, 50 mM beta-mercaptoethanol, pH 8.0) in a ratio of 10 ml of solution per 1 g of bodies was added to weighed portions of approximately 50 mg of inclusion bodies. Suspensions were incubated with stirring for 2 hours at + 37 ° C, insoluble cell debris was separated by centrifugation for 10 min at 18000 rpm. Supernatants were applied to HiTrap Chelating Sepharose columns (GE Healthcare, USA) containing chelated cobalt ions and equilibrated with solution B (6 M urea, 50 mM Tris-HCl, 500 mM sodium chloride, pH 7.0). The columns were washed with solution G (6 M urea, 50 mm Tris-HCl, 500 mm sodium chloride, 50 mm imidazole pH 7.0) and the target proteins were eluted with solution D (6 M urea, 50 mm Tris-HCl, 500 mm sodium chloride, 50 mM imidazole pH 7.0). The eluates were concentrated by ultrafiltration to a final protein concentration of 20 mg / ml, desalted by diafiltration and frozen. The purity of all target proteins in the obtained preparations was at least 95% according to the densitometry data of electrophoregrams.

Пример 7. Ренатурация белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов [N18C] и [N106C]Example 7. Renaturation of human DNAse I precursor proteins and its muteins [N18C] and [N106C]

Ренатурацию белков проводили при помощи рефолдинга быстрым разбавлением. Дисульфидные связи денатурированных белков-предшественников восстанавливали обработкой 5 мМ дитиотреитола в течение 30 мин при комнатной температуре. Для всех трех белков использовали раствор для рефолдинга одинакового состава, содержащий 50 мМ Tris-HCl pH=8,0, 4 мМ CaCl₂, 4 мМ MgSO₄, 2 мМ восстановленного глутатиона, 0,4 мМ окисленного глутатиона, 1% ПЭГ 1500, 2 М мочевины. Растворы денатурированных белков-предшественников вводили в растворы для рефолдинга по каплям при постоянном перемешивании, использовали разведение 1:40. Вели рефолдинг 1 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании без доступа кислорода. После этого отделяли выпавший осадок центрифугированием. Выход растворимых ковалентно мономерных белков-предшественников составлял во всех случаях не менее 70% по денситометрии электрофореграммы. Растворы ренатурированных белков концентрировали ультрафильтрацией до конечной концентрации белка 3-4 мг/мл и немедленно отделяли N-концевые пептиды обработкой энтерокиназой.Protein renaturation was performed by rapid dilution refolding. Disulfide bonds of denatured precursor proteins were reduced by treatment with 5 mM dithiothreitol for 30 min at room temperature. For all three proteins, a refolding solution of the same composition was used, containing 50 mM Tris-HCl pH = 8.0, 4 mM CaCl ₂ , 4 mM MgSO ₄ , 2 mM reduced glutathione, 0.4 mM oxidized glutathione, 1% PEG 1500, 2 M urea. Solutions of denatured precursor proteins were added dropwise to the solutions for refolding with constant stirring, a 1:40 dilution was used. Refolding was carried out for 1 h at room temperature with constant stirring without oxygen. After this, the precipitate was separated by centrifugation. The yield of soluble covalent monomeric precursor proteins was in all cases at least 70% by densitometry of the electrophoregram. Solutions of the renatured proteins were concentrated by ultrafiltration to a final protein concentration of 3-4 mg / ml, and the N-terminal peptides were immediately separated by treatment with enterokinase.

Пример 8. Отделение N-концевых пептидов от белков-предшественников ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C].Example 8. The separation of N-terminal peptides from the precursor proteins of human DNase I and its muteins DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C].

Отделение N-концевых пептидов проводили при помощи рекомбинантной энтерокиназы ("Sigma", США), используя соотношение фермент:субстрат 1:10 (по массе). Реакцию вели в течение 2 ч при +37°C, используя разбавленные в 2 раза водой растворы белков-предшественников, т.е. при концентрации субстратов 1,5-2 мг/мл. Степень превращения для всех трех белков-предшественников составила около 70% по данным гель-электрофоретического анализа.The N-terminal peptides were separated using recombinant enterokinase (Sigma, USA) using an enzyme: substrate ratio of 1:10 (mass). The reaction was carried out for 2 hours at + 37 ° C, using precursor protein solutions diluted in 2 times with water, i.e. at a substrate concentration of 1.5-2 mg / ml. The degree of conversion for all three precursor proteins was about 70% according to gel electrophoretic analysis.

Пример 9. Финальная очистка ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C].Example 9. Final purification of human DNase I and its muteins DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C].

Отделение процессированных белков от белков-предшественников, свободных N-концевых пептидов, энтерокиназы и посторонних примесных белков проводили адсорбцией в объеме, добавляя к реакционным смесям суспензию сорбента Chelating Sepharose FF ("GE Healthcare", США) с иммобилизованными ионами кобальта в соотношении 300 мкл суспензии на 1 мг белка. Реакционные смеси инкубировали с сорбентом 1 ч при комнатной температуре при помешивании. После этого супернатанты отделяли, осадки сорбента промывали 5 объемами раствора 25 мМ Tris-HCl pH8,0, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgSO₄, 1 мМ восстановленного глутатиона, 1 М мочевины, объединяли супернатанты, концентрировали их ультрафильтрацией до конечной концентрации общего белка 1,5-2 мг/мл и удаляли восстановленный глютатион диафильтрацией до отрицательной реакции фильтрата с реактивом Эллмана (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой)). В результате этой процедуры были получены растворы очищенной рекомбинантной ДНКазы I человека и ее мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C], содержащие не более 5% примесных белков по данным гель-электрофоретического анализа.Processed proteins were separated from precursor proteins, free N-terminal peptides, enterokinase and extraneous impurity proteins by volume adsorption, adding a suspension of the Chelating Sepharose FF sorbent (GE Healthcare, USA) with immobilized cobalt ions in a ratio of 300 μl to the reaction mixtures. per 1 mg of protein. The reaction mixtures were incubated with the sorbent for 1 h at room temperature with stirring. After this, the supernatants were separated, the sorbent precipitates were washed with 5 volumes of a solution of 25 mM Tris-HCl pH8.0, 2 mM CaCl ₂ , 2 mM MgSO ₄ , 1 mM reduced glutathione, 1 M urea, supernatants were combined, concentrated by ultrafiltration to a final concentration of total protein 1.5-2 mg / ml and reduced glutathione was removed by diafiltration until the filtrate reacted negatively with Ellman's reagent (5.5'-dithiobis- (2-nitrobenzoic acid)). As a result of this procedure, solutions of purified recombinant human DNase I and its muteins DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C] containing no more than 5% impurity proteins according to gel electrophoretic analysis were obtained.

Пример 10. Измерение активности рекДНКазы I человека методом зимографии.Example 10. The measurement of the activity of human reDNAse I method of zymography.

Готовили пластину геля для электрофореза по Лэммли. В разделяющий гель перед полимеризацией добавляли ДНК из тимуса крупного рогатого скота до конечной концентрации 10 мкг/мл. Наносили по несколько разведений образцов исследуемых белков в растворе для подготовки образца к электрофорезу по Лэммли, а также аналогично солюбилизированные отмытые тельца включения контрольного белка - ДНКазы I человека с дополнительным N-концевым остатком метионина, и стандарт ферментативной активности - природную ДНКазу I крупного рогатого скота.A plate of gel for electrophoresis according to Laemmli was prepared. Before polymerization, DNA from cattle thymus was added to the separation gel to a final concentration of 10 μg / ml. Several dilutions of the samples of the studied proteins in the solution were applied to prepare the sample for Laemmli electrophoresis, as well as similarly solubilized washed inclusion bodies of the control protein - human DNase I with an additional N-terminal methionine residue, and the standard of enzymatic activity - natural cattle DNase I.

По завершении электрофореза отделяли концентрирующий гель, разделяющий гель отмывали в растворе (Тритон Х-100 1%, Трис-HCl pH 7,5, 20 мМ) 3 раза по 10 мин для удаления из геля ЭДТА, додецилсульфата натрия и ренатурации белков в смешанных мицеллах детергентов. Затем гель промывали в растворе (Трис-HCl 20 мМ, NaCl 150 мМ, Твин 20 0,05%, CaCl₂ 5 мМ, MgCl₂ 5 мМ, MnSO₄ 5 мМ) 2 раза по 5 мин. В третью порцию раствора добавляли бромистый этидий до 1 мкг/мл и вели инкубацию геля в течение 30 мин при +37°C. Гель помещали на трансиллюминатор и фотографировали. Продолжали инкубирование на +37°C до проявления видимых зон распада субстрата, но не больше 2-х суток. При денситометрии полученных зимограмм было установлено, что удельная активность белка-предшественника ДНКазы I по отношению к природной ДНКазе I быка составляет не более 0,01%, при этом удельная активность метионил-ДНКазы I составляет около 0,1%, а удельная активность зрелой рекомбинантной ДНКазы I человека - около 1%. Поскольку единственным отличием рекомбинантной ДНКазы от природного белка является отсутствие N-связанных олигосахаридов, было предположено, что ферментативная активность белка может быть восстановлена при конъюгации аминокислот в сайтах N-гликозилирования (позиции 18 и 106) с гидрофильными полимерами.Upon completion of electrophoresis, a concentration gel was separated, the separation gel was washed in a solution (Triton X-100 1%, Tris-HCl pH 7.5, 20 mM) 3 times for 10 min to remove EDTA, sodium dodecyl sulfate from the gel and protein renaturation in mixed micelles detergents. Then the gel was washed in a solution (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 0.05%, CaCl ₂ 5 mM, MgCl ₂ 5 mM, MnSO ₄ 5 mM) 2 times for 5 min. Ethidium bromide up to 1 μg / ml was added to the third portion of the solution and the gel was incubated for 30 min at + 37 ° C. The gel was placed on a transilluminator and photographed. Continued incubation at + 37 ° C until the appearance of visible zones of substrate decomposition, but not more than 2 days. With densitometry of the obtained zymograms, it was found that the specific activity of the DNAase I precursor protein in relation to the bovine natural DNase I is not more than 0.01%, while the specific activity of methionyl DNase I is about 0.1%, and the specific activity of mature recombinant Human DNase I - about 1%. Since the only difference between recombinant DNase and natural protein is the absence of N-linked oligosaccharides, it was suggested that the enzymatic activity of the protein can be restored by conjugation of amino acids at the N-glycosylation sites (positions 18 and 106) with hydrophilic polymers.

Пример 11. Направленная конъюгация мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C] с малеимид-полиэтиленгликолемExample 11. Directional conjugation of muteins DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C] with maleimide-polyethylene glycol

Очищенные мутеины DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C], содержащие замены остатков аспарагина на остатки цистеина, обрабатывали реактивом ТСЕР (трихлорэтилфосфат) в молярном соотношении 5:1 в течение 10 мин при комнатной температуре для полного восстановления непарного остатка цистеина и добавляли ПЭГ-малеимид 10 кДа ("CreativePEGWorks", США) в молярном соотношении 5:1. Реакционную смесь инкубировали 60 мин при комнатной температуре. Осаждали непрореагировавшие мутеины разбавлением реакционной смеси в 4 раза водой и отделяли осадки центрифугированием. Очистку конъюгатов проводили анионообменной хроматографией на колонках HiTrap Capto DEAE 1 мл ("GE Healthcare", США), уравновешенных раствором 20 мМ Трис-HCl pH 7,0; 5 мМ CaCl₂. Супернатанты разбавленных реакционных смесей наносили на колонки немедленно по окончании центрифугирования. Колонки промывали 5 объемами стартового раствора и вели элюцию линейным градиентом концентрации хлорида натрия от 0 до 300 мМ за 20 мл, собирая элюат фракциями по 1 мл. Фракции, содержащие только монозамещенные конъюгаты мутеинов (по данным ДСН-ПААГ анализа), объединяли, концентрировали ультрафильтрацией на мембранах с порогом отсечения 10 кДа, обессоливали диафильтрацией к раствору 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ CaCl₂ до конечной концентрации белка 1-2 мг/мл и использовали для определения ферментативной активности. Анионообменная хроматография позволяет эффективно отделять конъюгаты от остатков непрореагировавших мутеинов за счет изменения заряда поверхности белка после конъюгации и более ранней элюции конъюгатов.The purified DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C] muteins containing substitutions of asparagine residues with cysteine residues were treated with TCEP reagent (trichloroethyl phosphate) in a 5: 1 molar ratio for 10 min at room temperature to completely restore the unpaired cysteine residue and PEG-maleimide was added 10 kDa (CreativePEGWorks, USA) in a 5: 1 molar ratio. The reaction mixture was incubated 60 min at room temperature. Unreacted muteins were precipitated by diluting the reaction mixture 4 times with water and precipitates were separated by centrifugation. The conjugates were purified by anion exchange chromatography on HiTrap Capto DEAE 1 ml columns (GE Healthcare, USA) balanced with a solution of 20 mM Tris-HCl pH 7.0; 5 mM CaCl ₂ . The supernatants of the diluted reaction mixtures were applied to the columns immediately after centrifugation. The columns were washed with 5 volumes of the starting solution and eluted with a linear gradient of sodium chloride concentration from 0 to 300 mM per 20 ml, collecting the eluate in 1 ml fractions. Fractions containing only monosubstituted mutein conjugates (according to SDS-PAGE analysis) were combined, concentrated by ultrafiltration on membranes with a cut-off threshold of 10 kDa, desalted by diafiltration to a solution of 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl ₂ to a final protein concentration of 1-2 mg / ml and used to determine the enzymatic activity. Anion exchange chromatography makes it possible to efficiently separate conjugates from residues of unreacted muteins by changing the surface charge of the protein after conjugation and earlier elution of the conjugates.

Пример 12. Определение ферментативной активности в растворе рекомбинантной ДНКазы I человека, мутеинов DNASEI(N18C] и DNASEI[N18C] и их конъюгатов с полиэтиленгликолем 10 кДаExample 12. Determination of enzymatic activity in a solution of recombinant human DNase I, muteins DNASEI (N18C] and DNASEI [N18C] and their conjugates with polyethylene glycol 10 kDa

Поскольку ПЭГ-производные мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N106C] обладают переменной молекулярной массой и не образуют сфокусированных зон при электрофорезе в ДСН-ПААГ, измерение их ферментативной активности зимографией затруднительно. Для сравнения удельной ферментативной активности конъюгатов, мутеинов и исходной рекомбинантной ДНКазы I человека использовали методику гидролиза сверхскрученной плазмиды в растворе с последующим разделением продуктов реакции в агарозном геле и расчетом степени гидролиза субстрата по денситометрии цифровой фотографии геля.Since the PEG derivatives of muteins DNASEI [N18C] and DNASEI [N106C] have a variable molecular weight and do not form focused zones during electrophoresis in SDS-PAGE, measurement of their enzymatic activity by zymography is difficult. To compare the specific enzymatic activity of conjugates, muteins, and the initial recombinant human DNase I, we used the hydrolysis method of a supercoiled plasmid in solution, followed by separation of the reaction products in an agarose gel and calculating the degree of hydrolysis of the substrate by densitometry of a digital photograph of the gel.

Гидролиз вели в растворе, содержащем сверхскрученную плазмиду pUC19 в концентрации 30 нг/мкл, 25 мМ Hepes, pH 7.0, 0,1 мкг/мкл бычьего сывороточного альбумина, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ MnSO₄ и/или CaCl₂. Реакционные смеси инкубировали ровно 10 мин, реакцию останавливали добавлением Na-ЭДТА до 20 мМ. Было установлено, что удельная ферментативная активность рекомбинантной ДНКазы I человека составляет не более 2% от активности ДНКазы I быка, ферментативная активность мутеинов DNASEI[N18C] и DNASEI[N18C] в данном тесте не выявляется, т.е. составляет менее 10% от удельной активности рекомбинантной ДНКазы I человека. В то же время удельная активность обоих конъюгатов DNASEI[N18C] и DNASEI[N18C] с ПЭГ составляет 10-20% от активности ДНКазы I быка.Hydrolysis was carried out in a solution containing supercoiled plasmid pUC19 at a concentration of 30 ng / μl, 25 mM Hepes, pH 7.0, 0.1 μg / μl bovine serum albumin, 4 mM MgCl ₂ , 4 mM MnSO ₄ and / or CaCl ₂ . The reaction mixtures were incubated for exactly 10 min, the reaction was stopped by the addition of Na-EDTA to 20 mM. It was found that the specific enzymatic activity of recombinant human DNase I is no more than 2% of the activity of bull DNAse I, the enzymatic activity of DNASEI [N18C] and DNASEI [N18C] muteins is not detected in this test, i.e. less than 10% of the specific activity of recombinant human DNase I. At the same time, the specific activity of both conjugates DNASEI [N18C] and DNASEI [N18C] with PEG is 10-20% of the activity of bovine DNase I.

Приведенные результаты показали, что включение в последовательность синтезируемого белка лидерного N-концевого пептида, кодируемого оптимальными для Е. coli кодонами снижает токсичность продукта экспрессии для бактерий, что приводит к значительному увеличению выхода целевого белка. N-концевой пептид также позволяет проводить хроматографическую очистку экспрессируемого белка в денатурирующих условиях методом металлохелатной хроматографии, что, в свою очередь, дает возможность получать гомогенный продукт при помощи одной хроматографической стадии. После удаления дополнительного пептида обработкой энтерокиназой и отделения зрелой ДНКазы I повторной металлохелатной хроматографией может быть получен очищенный препарат белка. Полученные указанным способом мутеиновые варианты ДНКазы I человека могут быть превращены в ферментативно высокоактивную форму при направленной конъюгации с полиэтиленгликолем.The results showed that the inclusion in the sequence of the synthesized protein of the leader N-terminal peptide encoded by codons optimal for E. coli reduces the toxicity of the expression product for bacteria, which leads to a significant increase in the yield of the target protein. The N-terminal peptide also allows chromatographic purification of the expressed protein under denaturing conditions by metal chelate chromatography, which, in turn, makes it possible to obtain a homogeneous product using a single chromatographic step. After removal of the additional peptide by treatment with enterokinase and separation of the mature DNAse I by repeated metal chelate chromatography, a purified protein preparation can be obtained. Obtained in this way mutein variants of human DNase I can be converted to an enzymatically highly active form when directed conjugation with polyethylene glycol.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes can be made and equivalent replacements made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Таблица 1.Table 1. Олигонуклеотиды для получения синтетического гена ДНКазы I человека.Oligonucleotides for the production of a synthetic human DNase I gene. НазваниеTitle Последовательность (5'-3')Sequence (5'-3 ') SEQ ID NOSEQ ID NO AS-DN-F1AS-DN-F1 GCGGCAACGATACCTTCAATCGTGAACCGGCAATTGT GCGGTTTTTCTCTCGCTTCACCGAAGTTCGCGAGTTTG CGATCGTACGCGGCAACGATACCTTCAATCGTGAACCGGCAATTGT GCGGTTTTTTCTCTCGCTTCACCGAAGTTCGCGAGTTTG CGATCGTAC 55 AS-DN-F2AS-DN-F2 TTCGTGTATCGCCCTGATCAGGTGAGCGCAGTAGACA GCTACTATTATGACGATGGGTGCGAGCCTTGCGGCAA CGATACCTTCTTCGTGTATCGCCCTGATCAGGTGAGCGCAGTAGACA GCTACTATTATGACGATGGGTGCGAGCCTTGCGGCAA CGATACCTTC 66 AS-DN-F3AS-DN-F3 CCCGGACACCTATCATTATGTCGTGAGTGAACCACTG GGCCGCAATAGCTATAAAGAGCGCTACCTGTTCGTGT ATCGCCCTGACCCGGACACCTATCATTATGTCGTGAGTGAACCACTG GGCCGCAATAGCTATAAAGAGCGCTACCTGTTCGTGT ATCGCCCTGA 77 AS-DN-F4AS-DN-F4 CAGGAAGTTCGCGACTCACATTTAACGGCGGTTGGCA AACTGCTGGATAATCTGAATCAGGATGCCCCGGACA ССТАТСАТТАТCAGGAAGTTCGCGACTCACATTTAACGGCCGGTTGGCA AACTGCTGGATAATCTGAATCAGGATGCCCCGGACA STATSATTAT 88 AS-DN-F5AS-DN-F5 AATGAGTAACGCCACCCTCGTCTCCTATATTGTGCAG ATTCTGAGCCGTTACGATATCGCACTGGTACAGGAAG TTCGCGACTCAATGAGTAACGCCACCCTCTCGTCTCCTATATTGTGCAG ATTCTGAGCCGTTACGATATCGCACTGGTACAGGAAG TTCGCGACTC 99 AS-DN-F6AS-DN-F6 ACTATAAAGATGACGATGACAAACTGAAAATTGCCG CGTTTAATATTCAGACGTTTGGGGAAACCAAAATGAG TAACGCCACCCACTATAAAGATGACGATGACAAACTGAAAATTGCCG CGTTTAATATTCAGACGTTTGGGGAAACCAAAATGAG TAACGCCACCC 1010 AS-DN-F7AS-DN-F7 TTGCTAGCGACTATAAAGATGACGATGACAAA*TTGCTAGCGACTATAAAGATGACGATGACAAA * 11eleven AS-DN-R1AS-DN-R1 CATCCAGATACACATCGTAGAGGGCATCAATTTCTGC GACAGCGTCCCCCGGGGCAGCATGTAACGGTACGAT CGCAAACTCGCCATCCAGATACACATCGTAGAGGGCATCAATTTCTGC GACAGCGTCCCCCGGGGCAGCATGTAACGGTACGAT CGCAAACTCGC 1212 AS-DN-R2AS-DN-R2 ATGAACAACCGGCGTTAAAATCCCCCATGAGCATTAC ATCCTCCAGGCCCCATTTCTCTTGTACATCCAGATAC ACATCGTAGAATGAACAACCGGCGTTAAAATCCCCCATGAGCATTAC ATCCTCCAGGCCCCATTTCTCTTGTACATCCAGATAC ACATCGTAGA 1313 AS-DN-R3AS-DN-R3 GGAATCAACCATTGGAAAGTCGGAGACGTCCACAGC CGAATGGAAGACCACTGGGACGGGCGTACATATGAA CAACCGGCGTTAGGAATCAACCATTGGAAAGTCGGAGACGTCCACAGC CGAATGGAAGACCACTGGGACGGGCGTACATATGAA CAACCGGCGTTA 14fourteen AS-DN-R4AS-DN-R4 GCCCGCCACTACAATACGATCATACGCACAATGGGTC GGGGTTGCCGTAGTATCTGCGCTGTCTGGAATCAACC ATTGGAAAGTGCCCGCCACTACAATACGATCATACGCACAATGGGTC GGGGTTGCCGTAGTATCTGCGCTGTCTGGAATCAACC ATTGGAAAGT 15fifteen AS-DN-R5AS-DN-R5 GACCATACGCCGCCTGAAAGTTAAACGGTAACGCAC TATCTGGAACCACAGCGCCACGTAAAAGCATGCCCG ССАСТАСААТАСGACCATACGCCGCCTGAAAGTTAAACGGTAACGCAC TATCTGGAACCACAGCGCCACGTAAAAGCATGCCCG SASASTASAATAS 1616 AS-DN-R6AS-DN-R6 GCTTCTATTATTTCAACATCACTTCGACCGGATAGTG ATCCGAAATCGCTTGTGCAAGTTGATCGCTCAGACCA TACGCCGCCTGCTTCTATTATTTCAACATCACTTCGACCGGATAGTG ATCCGAAATCGCTTGTGCAAGTTGATCGCTCAGACCA TACGCCGCCT 1717 AS-DN-R7AS-DN-R7 TTAAGCTTCTATTATTTCAACATCACT**TTAAGCTTCTATTATTTCAACATCACT ** 18eighteen * жирным шрифтом выделен сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции NheI* NheI restriction endonuclease recognition site is in bold ** жирным шрифтом выделен сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции HindIII** HindIII restriction endonuclease recognition site is in bold

Claims

1. Плазмида для экспрессии в клетках бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, неактивного предшественника ДНКазы I человека или ее мутеинов, содержащего отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, по существу, содержащая:
- промотор, функционирующий в бактериальной клетке;
- фрагмент ДНК, кодирующий гексагистидиновый кластер;
- фрагмент, кодирующий последовательность узнавания энтерокиназы, слитую в рамке с ДНКазой I человека или ее функционально активным мутеином, содержащим замены аспарагина на цистеин;
- участок терминации транскрипции;
- фрагмент вектора рЕТ28а(+), содержащий участок инициации репликации бактериофага fl, последовательность, кодирующую аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, область начала репликации плазмиды pBR322, ген РНК-организующего белка Rop, последовательность, кодирующую репрессор лактозного оперона.1. A plasmid for expression in cells of a bacterium belonging to the genus Escherichia, an inactive precursor of human DNase I or its muteins containing a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence essentially comprising:
- a promoter that functions in a bacterial cell;
- a DNA fragment encoding a hexahistidine cluster;
- a fragment encoding a sequence for recognition of enterokinase fused in frame with human DNase I or its functionally active mutein containing substitutions of asparagine to cysteine;
- plot termination of transcription;
- a fragment of the pET28a (+) vector containing the bacteriophage ph replication initiation site fl, the sequence encoding aminoglycoside-3'-phosphotransferase, the region of replication initiation of plasmid pBR322, the Rop-organizing protein Rop gene, the sequence encoding the repressor of the lactose operon.

2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным фрагментом ДНК, кодирующим предшественник ДНКазы I, является фрагмент ДНК, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID:1, или его вариант.2. The plasmid according to claim 1, characterized in that said DNA fragment encoding a DNase I precursor is a DNA fragment represented in the Sequence Listing under the number SEQ ID: 1, or a variant thereof.

3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7.3. The plasmid according to claim 1, characterized in that the specified promoter is a promoter of RNA polymerase of the bacteriophage T7.

4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанный мутеин ДНКазы I содержит замену N18C или N106C.4. The plasmid according to claim 1, characterized in that the mutein DNase I contains the replacement of N18C or N106C.

5. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанная плазмида выбрана из группы, состоящей из плазмид pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 и pET28EK-DNASEIC106.5. The plasmid according to claim 1, characterized in that the plasmid is selected from the group consisting of plasmids pET28EK-DNASEI, pET28EK-DNASEIC18 and pET28EK-DNASEIC106.

6. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, трансформированная плазмидой по п.1, - продуцент неактивного предшественника рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащего замены аспарагина на цистеин.6. A bacterium belonging to the genus Escherichia, transformed with the plasmid according to claim 1, is a producer of an inactive precursor of recombinant human DNase I or its mutein containing substitutions of asparagine to cysteine.

7. Бактерия по п.6, отличающая тем, что указанный мутеин ДНКазы I содержит замену N18C или N106C.7. The bacterium according to claim 6, characterized in that said mutein of DNase I contains an N18C or N106C substitution.

8. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что указанная бактерия выбрана из группы, включающей бактерии Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, E.coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C и Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C.8. The bacterium according to claim 6, characterized in that said bacterium is selected from the group consisting of E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI18C and E. coli BL21 [DE3 ] / pET28EK-DNASEI106C.

9. Предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, содержащий отщепляемый N-концевой лидер, включающий гексагистидиновый кластер и последовательность узнавания энтерокиназы, полученный путем культивирования бактерии по п.6 в питательной среде и предназначенный для получения активной формы ДНКазы 1 человека или ее мутеина.9. The precursor of recombinant human DNase I or its mutein containing a cleavable N-terminal leader comprising a hexahistidine cluster and an enterokinase recognition sequence obtained by culturing the bacterium according to claim 6 in a nutrient medium and intended to obtain an active form of human DNase 1 or its mutein.

10. Предшественник рекомбинантной ДНКазы I человека по п.9, содержащий последовательность аминокислот, представленную в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, или ее вариант.10. The precursor of the recombinant human DNase I according to claim 9, containing the amino acid sequence presented in the List of sequences under the number SEQ ID NO: 2, or a variant thereof.

11. Предшественник мутеина ДНКазы I человека по п.9, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит замену аспарагина на цистеин N18C или N106C.11. The human DNase I mutein precursor of claim 9, wherein said mutein comprises replacing asparagine with N18C or N106C cysteine.

12. Способ получения рекомбинантной ДНКазы I человека или ее мутеина, включающий культивирование бактерии по п.6 в питательной среде, выделение телец включения, солюбилизацию белка-предшественника, металлохелатную хроматографию в денатурирующих условиях, рефолдинг белка-предшественника, получение зрелого белка обработкой энтерокиназой и выделение указанного зрелого белка рекомбинантной ДНКазы 1 человека или ее мутеина.12. A method for producing recombinant human DNase I or its mutein, including culturing the bacterium according to claim 6 in a nutrient medium, isolating inclusion bodies, solubilizing the precursor protein, denaturing metal chelate chromatography, refolding the precursor protein, obtaining the mature protein by treatment with enterokinase and isolating the specified mature protein of recombinant human DNase 1 or its mutein.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что культивируют штамм Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI, Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI18C или Е. coli BL21[DE3]/pET28EK-DNASEI106C.13. The method according to p. 12, characterized in that the strain of E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI, E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI18C or E. coli BL21 [DE3] / pET28EK-DNASEI106C is cultivated.

14. Способ по п.12, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит замену N18C или N106C.14. The method according to p. 12, characterized in that said mutein contains a replacement N18C or N106C.

15. Способ получения конъюгатов полиэтиленгликоля и рекомбинантного мутеина ДНКазы I человека, полученного способом по п.12, включающий предварительное ограниченное восстановление белка, инкубацию с малеимид-полиэтиленгликолем и выделение полученного конъюгата.15. A method for producing conjugates of polyethylene glycol and recombinant mutein of human DNase I, obtained by the method according to item 12, including preliminary limited recovery of the protein, incubation with maleimide-polyethylene glycol and isolation of the resulting conjugate.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит точечную замену N18C или N106C.16. The method according to clause 15, wherein said mutein contains a point replacement of N18C or N106C.

17. Ферментативно активный конъюгат мутеина рекомбинантной ДНКазы I человека, содержащего замены аспарагина на цистеин, и полиэтиленгликоля, полученный способом по п.15.17. An enzymatically active conjugate of mutein of recombinant human DNase I containing substitutions of asparagine with cysteine and polyethylene glycol obtained by the method according to item 15.

18. Ферментативно активный конъюгат по п.17, отличающийся тем, что указанный мутеин содержит точечную замену N18C или N106C. 18. The enzymatically active conjugate according to 17, characterized in that said mutein contains a point change of N18C or N106C.