RU2630659C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОГО FcR В ВИДЕ Fc-ГИБРИДА С ИНЕРТНОЙ Fc-ОБЛАСТЬЮ ИММУНОГЛОБУЛИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биохимии. Описан слитый полипептид для получения растворимого Fc-рецептора с формулой R1-FC-R2 (формула I), в котором R1 обозначает первый рецептор Fc, R2 обозначает второй рецептор Fc, и FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи, в котором присутствуют R1 или R2, или оба, в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2, где R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы человеческого рецептора Fc гамма, человеческого неонатального рецептора Fc, мышиного рецептора Fc и кроличьего неонатального рецептора Fc и где FC представляет собой полипептид тяжелой цепи человеческого IgG1, который имеет мутации L234A, L235A и P329G. Также описан cлитый полипептид для получения растворимого Fc-рецептора, имеющего формулу II (см. п.2 формулы изобретения), в котором R1 обозначает первый рецептор Fc, R2 обозначает второй рецептор Fc, FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи, CS1 обозначает первый сайт расщепления, CS2 обозначает второй сайт расщепления, CS3 обозначает третий сайт расщепления, CS4 обозначает четвертый сайт расщепления, L1 обозначает первый линкер и L2 обозначает второй линкер, в котором присутствуют R1 или R2, или оба, в котором любой из CS1, CS2, CS3, CS4, независимо от других, может присутствовать или отсутствовать, в котором L1 и L2 могут независимо друг от друга присутствовать или отсутствовать, в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2, где R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы человеческого рецептора Fc гамма, человеческого неонатального рецептора Fc, мышиного рецептора Fc и кроличьего неонатального рецептора Fc и где FC представляет собой полипептид тяжелой цепи человеческого IgG1, который имеет мутации L234A, L235A и P329G. Также представлен димерный слитый полипептид для получения растворимого Fc-рецептора, содержащий любых два описанных слитых полипептида. Представлено применение иммобилизованного описанного слитого полипептида в качестве лиганда аффинной хроматографии. Представлено применение иммобилизованного слитого полипептида по любому из пп. 1-8 для определения связывания антитела с рецептором Fc. Изобретение позволяет получать растворимые рецепторы Fc путём проведения экспрессии рецептора Fc в виде слитого полипептида. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 10 пр.

Description

Здесь описан способ получения растворимых рецепторов Fc в виде слитого полипептида с инертной областью Fc иммуноглобулина с предотвращением самоагрегации и их применения, как, например, в хроматографических колонках с FcR, при определении взаимодействия FcR с низкоаффинными антителами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Иммуноглобулин, в общем, содержит две легкие полипептидные цепи и две тяжелые полипептидные цепи. Каждая из тяжелой и легкой полипептидных цепей содержит вариабельную область (обычно аминоконцевая часть полипептидной цепи), которая содержит связывающий домен, который способен взаимодействовать с антигеном. Каждая из тяжелой и легкой полипептидных цепей также содержит константную область (обычно карбоксиконцевая часть). Константная область тяжелой цепи опосредует связывание иммуноглобулина, например, с клетками, несущими рецептор Fc гамма (FcγR), такими как фагоциты, или с клетками, несущими неонатальный рецептор Fc (FcRn), также известный как рецептор Брамбелла, и также опосредует связывание с некоторыми факторами, включая факторы классической системы комплемента, такие как компонент (C1q).

Hulett и Hogarth (Hulett, M.D. and Hogarth, P.M., Adv. Immunol. 57 (1994) 1-127) сообщали о том, что внеклеточными рецепторами в отношении Fc части иммуноглобулинов класса G является семейство трансмембранных гликопротеинов, содержащее три разных типа рецепторов, имеющих разную специфичность связывания: FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Рецепторы типа I взаимодействуют с lgG, не находящимся в составе комплекса, тогда как рецепторы типа II и III предпочтительно взаимодействуют с lgG, находящимся в составе комплекса.

Человеческий FcγRIII (CD 16) существует в двух изоформах и двух полиморфных формах. Первая изоформа FcγRIIIa представляет собой трансмембранную молекулу, кодируемую геном, отличным от гена второй изоформы FcγRIIIb, которая представляет собой мембранный белок, заякоренный GPI (гликозилфосфатидилинозитол). Полиморфная форма V159 имеет остаток валина в положении 159 аминокислотных последовательностей, тогда как полиморфная форма F159 имеет остаток фенилаланина в положении 159.

Для класса иммуноглобулинов lgG ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) и ADCP (антителозависимый клеточный фагоцитоз) управляются занятием областью Fc семейства рецепторов, названных рецепторы Fc-гамма (Fcγ) - FcγR. У человека данное семейство белков содержит FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIA, FcγRIIB и FcγRIIC, и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA и FcγRIIIB (Raghavan and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes, et al., Expert Reviews (2009) 735-747). FcγR экспрессируются на целом ряде иммунных клеток, и образование комплекса Fc/FcγR рекрутирует данные клетки к сайтам связанного антигена, что типично приводит к сигнализации и последующим иммунным ответам, таким как высвобождение медиаторов воспаления, активация В-клеток, эндоцитоз, фагоцитоз и цитотоксическая атака. Кроме того, в то время как FcγRI, FcγRIIA/C и FcγRIIIA представляют собой активирующие рецепторы, характеризуемые внутриклеточным иммунорецепторным активирующим мотивом на основе тирозина (ITAM), FcγRIIB имеет ингибирующий мотив (ITIM) и, следовательно, является ингибирующим. В то время как FcγRI связывается с мономерным lgG с высокой аффинностью, FcγRIII и FcγRII являются низкоаффинными рецепторами, взаимодействующими с входящими в состав комплекса или агрегированными lgG.

Связывание lgG с активирующими и ингибирующими рецепторами Fcγ или первым компонентом комплемента (C1q) зависит от остатков, локализованных в шарнирной области и домене СН2. Две области домена СН2 являются критически важными для связывания с FcγR и C1q комплемента и имеют уникальные последовательности. Замена остатков в положениях 233-236 человеческого lgG1 и lgG2 и остатков в положениях 327, 330 и 331 lgG4 значительно уменьшала ADCC и CDC (клеточно-опосредованная цитотоксичность) (Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Idusogie, et al. (J. Immunol 166 (2000) 2571-2575) картировали сайт связывания C1q для терапевтического антитела ритуксан® и показали, что замена Pro329Ala уменьшала способность ритуксимаба связываться с C1q и активировать комплемент. Сообщали о том, что замена Pro329 на Ala приводит к ослабленному связыванию с рецепторами FcγRI, FcγRII и FcγRIIIA (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604), но данная мутация также была описана как демонстрирующая связывание с FcγRI и FcγRII, подобное дикому типу, и лишь очень малое уменьшение связывания с рецептором FcγRIIIA (Таблица 1 и Таблица 2 в ЕР 1068241, Genentech).

В WO 2010/048313 описан рекомбинантный FcRn и его варианты для очистки слитых белков, содержащих Fc. Высокий уровень экспрессии и секреции слитых белков Fc-X в клетках млекопитающих описан Lo et al. (Lo, K-М., et al., Prot. Eng. 11 (1998) 495-500). Dumont, F.A., et al. (Biodrugs 20 (2006) 151-160) описывают мономерные слияния с Fc. Терапевтические средства на основе слияния рецептор-Fc, уловители и технология MIMETIBODYTM описаны Huang, С. (Curr. Opin. Biotechnol. 20 (2009) 592-599). В WO 01/03737 описаны слитые белки на основе иммуноглобулина. Экспрессия и экспорт белков против ожирения в виде слитых белков с Fc описаны в WO 00/40615.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обнаружили, что можно получать растворимые рецепторы Fc путем проведения экспрессии рецептора Fc в виде слитого полипептида с областью Fc, которая по существу не связывается со слитым рецептором Fc. Применение слитого полипептида для экспрессии рецептора Fc увеличивает достижимый выход рецептора Fc либо в форме слитого полипептида, либо в виде выделенного рецептора. Кроме того, описанный здесь слитый полипептид обеспечивает повышенную гибкость для объединения более чем одной копии рецептора Fc в одной молекуле, например, для увеличения авидности, или для объединения разных рецепторов Fc (разного происхождения или разного типа, или и того, и другого) в одной молекуле.

Одним аспектом, как здесь описано, является слитый полипептид согласно формуле I

где

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

В одном воплощении слитый полипептид имеет формулу II

где

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

CS1 обозначает первый сайт расщепления,

CS2 обозначает второй сайт расщепления,

CS3 обозначает третий сайт расщепления,

CS4 обозначает четвертый сайт расщепления,

L1 обозначает первую промежуточную аминокислотную последовательность и

L2 обозначает вторую промежуточную аминокислотную последовательность,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором любой из CS1, CS2, CS3, CS4, независимо от других, может присутствовать или отсутствовать,

в котором L1 и L2 могут независимо друг от друга присутствовать или отсутствовать,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

В одном воплощении R1 и R2 независимо друг от друга выбраны из группы человеческого рецептора Fc гамма, человеческого неонатального рецептора Fc, мышиного рецептора Fc и кроличьего неонатального рецептора Fc.

В одном воплощении человеческий рецептор Fc гамма выбран из человеческого FcγRI (CD64), человеческого FcγRII (CD32), человеческого FcγRIIA, человеческого FcγRIIB, человеческого FcγRIIC, человеческого FcγRIII (CD16), человеческого FcγRIIIA и человеческого FcγRIIIB.

В одном воплощении человеческий неонатальный рецептор Fc представляет собой человеческий FcRn.

В одном воплощении мышиный рецептор Fc выбран из мышиного FcγRI (CD64), мышиного FcγRII (CD32), мышиного FcγRIIB, мышиного FcγRIII (CD16), мышиного FcγRIII-2 (CD16-2), и мышиного FcγRIV.

В одном воплощении FC представляет собой вариант полипептида тяжелой цепи, выбранный из группы полипептида тяжелой цепи человеческого lgG, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG, полипептида тяжелой цепи кроличьего lgG.

В одном воплощении FC представляет собой вариант полипептида тяжелой цепи, выбранный из группы полипептида тяжелой цепи человеческого lgG1, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG2, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG3, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG4, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG1, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG2, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG2a, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG3, полипептида тяжелой цепи кроличьего lgG.

В одном воплощении полипептид области Fc тяжелой цепи имеет мутацию аминокислоты в одном или более чем одном положении 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 и 435.

В одном воплощении один или более чем один рецептор Fc представляет собой рецептор Fc гамма.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329 и 331.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет одну или более чем одну мутацию аминокислот Е233Р, L234A, L235A, L235E, AG236, D265A, N297A, N297D, Р329А, P329G и P331S.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутации аминокислот L234A и L235A и одну или более чем одну из Е233Р, L235E, AG236, D265A, N297A, N297D, Р329А, P329G и P331S.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутации аминокислот L234A и L235A и Р329А или P329G.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG2 имеет мутации в одном или более чем одном положении аминокислоты 233, 234, 235, 236, 265 и 329.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 228, 235, 265 и 329.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет одну или более чем одну мутацию S228P, L235E, Р329А и P329G.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет мутации S228P и L235E, и Р329А или P329G.

В одном воплощении полипептид области Fc тяжелой цепи имеет мутацию аминокислоты в одном или более чем одном положении 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435 и 436.

В одном воплощении один или более чем один рецептор Fc представляет собой FcRn.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG, который имеет ослабленное связывание с FcRn, имеет одно или более чем одно изменение аминокислот в положениях аминокислот 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 и/или 447.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG, который имеет ослабленное связывание с FcRn, имеет мутации аминокислот I253A, Н310А и Н435А.

В одном воплощении промежуточная аминокислотная последовательность выбрана из первой группы, содержащей (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3 и (G5S)4, или из второй группы, содержащей метку Arg, метку Avi, метку His-Avi, метку His, метку Flag, метку 3xFlag, метку Strep, метку Nano, метку SBP, метку с-myc, метку S, кальмодулинсвязывающий пептид, целлюлозосвязывающий домен, хитинсвязывающий домен, метку GST (глутатион-S-трансфераза), метку МВР (основной белок миелина), или из комбинаций двух элементов из данных групп.

В одном воплощении сайт расщепления выбран из сайта расщепления протеазы lgA, сайта расщепления протеазы гранзим В, сайта расщепления протеазы Tev, сайта расщепления протеазы Precision, сайта расщепления тромбина, сайта протеазы Faktor10a, сайта расщепления протеазы Ides, сайта расщепления энтерокиназы или сайта расщепления протеазы SUMO.

В одном воплощении слитый полипептид не содержит дополнительный сайт расщепления протеазы, но содержит собственный сайт расщепления протеазы, такой как, например, сайт расщепления папаином, сайт расщепления пепсином или сайт расщепления протеазой Ides.

Одним аспектом, как здесь описано, является димерный слитый полипептид, содержащий два слитых полипептида, как здесь описано.

В одном воплощении первый FC содержит мутацию T366W и, возможно, мутацию S354C, и второй FC содержит мутации T366S, L368A и Y407V и, возможно, мутацию Y349C.

В одном воплощении слитый полипептид характеризуется тем, что

а) R1 и R2 первого и второго полипептида являются идентичными,

б) R1 и R2 первого слитого полипептида являются идентичными, R1 и R2 второго слитого полипептида являются идентичными, но отличными от R1 и R2 первого слитого полипептида,

в) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и R2 первого и второго полипептида являются идентичными, но отличными от R1,

г) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и оба R2 отсутствуют,

д) R1 первого и второго слитого полипептида являются отличными, и оба R2 отсутствуют,

е) R2 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и оба R1 отсутствуют,

ж) R2 первого и второго слитого полипептида являются отличными, и оба R1 отсутствуют,

з) R1 первого слитого полипептида и R2 второго слитого полипептида являются отличными, R2 первого слитого полипептида отсутствует, и R1 второго полипептида отсутствует.

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения растворимого рецептора Fc, включающий следующие стадии:

а) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид, как здесь описано,

б) выделение слитого полипептида из клетки или среды культивирования,

в) возможно расщепление слитого полипептида протеазой,

посредством этого получая растворимый рецептор Fc.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение иммобилизованного слитого полипептида или иммобилизованного димерного слитого полипептида, как здесь описано, в качестве лиганда для аффинной хроматографии.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение иммобилизованного слитого полипептида или иммобилизованного димерного слитого полипептида, как здесь описано, для определения связывания антитела с рецептором Fc.

В одном воплощении слитый полипептид связан с твердой фазой.

Одним аспектом, как здесь описано, является фармацевтическая композиция, содержащая слитый полипептид, как здесь описано.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение слитого полипептида, как здесь описано, в изготовлении лекарственного средства.

В одном воплощении данное лекарственное средство предназначено для лечения воспалительного заболевания.

В одном воплощении данное заболевание представляет собой заболевание, характеризуемое повышенными уровнями антитела.

В одном воплощении данное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.

В одном воплощении данное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описание графических материалов

Фиг. 1. Плазмидная карта плазмиды, экспрессирующей слитый полипептид.

Фиг. 2. Гель аналитического SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) расщепления папаином.

Фиг. 3. 12% Bis Tris гель плюс/минус DTT (дитиотрейтол), расщепление FcгаммаRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G протеазой PreScission (полоса 3, 8) соответственно, протеазой lgA (полоса 2, 7): можно наблюдать неспецифичное расщепление РР (полосы 3, 8).

Фиг. 4. Разделение и количественное измерение разных гликозилированных форм антитела против Her (дикого типа, наверху) и антитела против Her с модифицированной углеводной частью.

Фиг. 5. Сравнение аффинной колонки, в которой используется FcгаммаRIIIaV158 и FcгаммаRIIIaV158, меченный Fc.

Фиг. 6. Сенсограмма BIAcore ответа слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Fc LALA P329G демонстрирует более чем 100 единиц ответа по сравнению с FcгаммаRIIIaV158 с 40 RU (единицы ответа); FcgRIIIa V 158_008 обозначает нерасщепленный слитый полипептид, FcgRIIIa V 158_007 обозначает укороченный нефункциональный вариант FcgRIIIa (контроль), FcgRIIIa V 158_jf323 обозначает интактный функциональный вариант FcgRIIIa, содержащий метку HisAvi.

Фиг. 7. Сенсограммы слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7а), рецептора Fcгамма V158 (Фиг. 7b), расщепленного слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7c), нефункционального слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7d) (контроль).

Определения

Термин «связывание с рецептором Fc» обозначает связывание области Fc с рецептором Fc, например, в анализе BIAcore® (Pharmacia Biosensor АВ, Уппсала, Швеция).

В анализе BIAcore® рецептор Fc связывают с поверхностью, и связывание аналита, например, слитого полипептида, содержащего область Fc, или антитела измеряют поверхностным плазмонным резонансом (SPR). Аффинность связывания определяется значениями kа (константа ассоциации: константа скорости ассоциации слитого полипептида, содержащего область Fc, или конъюгата с образованием комплекса область Fc/рецептор Fc), kd (константа диссоциации: константа скорости диссоциации слитого полипептида, содержащего область Fc, или конъюгата от комплекса область Fc/рецептор Fc) и KD (kd/ka). В качестве альтернативы, сигнал связывания сенсограммы SPR можно непосредственно сравнивать с сигналом ответа контроля по отношению к высоте сигнала резонанса и характеристикам диссоциации.

Термин «домен СН2» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 231 по EU до положения 340 по EU (система нумерации EU (Европейский союз) согласно Kabat). В одном воплощении домен СН2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01

Домен СН2 уникален в том, что он не вступает в тесное парное взаимодействие с другим доменом. Скорее две N-связанных разветвленных углеводных цепи вклиниваются между двумя доменами СН2 интактной нативной области Fc. Высказывали предположение о том, что данный углевод может обеспечивать замену парного взаимодействия домен-домен и помогать стабилизировать домен СН2. Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206.

Термин «домен СН3» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 341 по EU до положения 446 по EU. В одном воплощении домен СН3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02

Термин «класс» антитела обозначает тип константного домена или константной области, которыми обладает его тяжелая цепь. Существуют пять главных классов антител: lgA, lgD, lgE, lgG и lgM, и несколько из них могут дополнительно подразделяться на подклассы (изотипы), например, lgG₁, lgG₂, lgG₃, lgG₄, lgA₁ и lgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ соответственно.

Термин «область Fc» обозначает С-концевую область иммуноглобулина. Область Fc представляет собой димерную молекулу, содержащую два полипептида области Fc тяжелой цепи антитела, связанные дисульфидной связью (полипептидные цепи области Fc). Область Fc может быть получена расщеплением папаином или расщеплением IdeS, или расщеплением трипсином интактного (полноразмерного антитела), или может быть получена рекомбинантно.

Область Fc, которую можно получать из полноразмерного антитела или иммуноглобулина, содержит остатки от положения 226 (Cys) до С-конца полноразмерной тяжелой цепи и, таким образом, она содержит часть шарнирной области и два или три константных домена, т.е. домен СН2, домен СН3 и, возможно, домен СН4. Из US 5648260 и US 5624821 известно, что модификация определенных аминокислотных остатков в области Fc приводит к фенотипическим эффектам.

Образование димерной области Fc, содержащей два идентичных или неидентичных фрагмента тяжелой цепи антитела, опосредовано нековалентной димеризацией содержащихся в них доменов СН3 (относительно участвующих аминокислотных остатков, см., например, Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273). Область Fc ковалентно стабилизирована образованием дисульфидных связей в шарнирной области (см., например, Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79). Введение замен аминокислотных остатков в домен СН3 для того, чтобы нарушить димеризацию посредством взаимодействий доменов СН3-СН3, не оказывает вредного влияния на связывание с FcRn из-за локализации остатков, участвующих в димеризации доменов СН3-СН3, на внутренней поверхности домена СН3, тогда как остатки, участвующие во взаимодействии область Fc-FcRn, расположены снаружи домена СН2-СН3.

Эффекторные функции, ассоциированные с областью Fc, инициируются взаимодействием области Fc с рецепторами клеточной поверхности, специфичными в отношении эффекторной функции. Активацию рецептора, главным образом, могут осуществлять антитела изотипа lgG1, тогда как антитела изотипа lgG2 и lgG4 не имеют эффекторной функции или имеют ограниченную эффекторную функцию.

Рецепторами, индуцирующими эффекторную функцию, являются рецепторы Fc типов (и подтипов) FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Эффекторные функции, ассоциированные с изотипом lgG1, могут быть снижены введением специфических аминокислотных замен в нижней шарнирной области, таких как L234A и/или L235A, которая участвует в связывании с FcγR и C1q. Определенные аминокислотные остатки, особенно локализованные в домене СН2 и/или СН3, также ассоциированы с периодом полувыведения молекулы антитела или слитого полипептида с областью Fc в системе кровообращения. Период полувыведения в системе кровообращения определяется связыванием области Fc с неонатальным рецептором Fc (FcRn).

Нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела осуществляется согласно индексу EU по Kabat (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.).

Термин «область Fc человеческого происхождения» обозначает С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина человеческого происхождения, которая содержит по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. В одном воплощении область Fc тяжелой цепи человеческого lgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) области Fc может присутствовать или может не присутствовать. Если здесь не определено иначе, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также именуемой индекс EU, как описано в Kabat, Е.А., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

Термин «часть области Fc, связывающаяся с FcRn» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая простирается приблизительно от положения 243 по EU до положения 261 по EU и приблизительно от положения 275 по EU до положения 293 по EU, и приблизительно от положения 302 по EU до положения 319 по EU, и приблизительно от положения 336 по EU до положения 348 по EU, и приблизительно от положения 367 по EU до положения 393 по EU и положения 408 по EU, и приблизительно от положения 424 по EU до положения 440 по EU. В одном воплощении изменен один или более чем один из следующих аминокислотных остатков согласно нумерации EU по Kabat: F243, Р244, Р245 Р,

Полипептидная цепь человеческой области Fc дикого типа изотипа lgG1 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутациями L234A, L235A имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутациями T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутациями L234A, L235A и T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A и P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией P239G и T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией P329G и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A, P329G и T366S, L368A и Y407V имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG1 с мутацией L234A, L235A, P329G и T366W имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь человеческой области Fc дикого типа изотипа lgG4 имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG4 с мутацией S228P и L235E имеет следующую аминокислотную последовательность:

Полипептидная цепь варианта человеческой области Fc изотипа lgG4 с мутацией S228P, L235E и P329G имеет следующую аминокислотную последовательность:

Термин «рецептор Fc», сокращенно: «FcR», обозначает рецептор, который связывается с областью Fc. В одном воплощении FcR представляет собой человеческий FcR с нативной последовательностью. Кроме того, в одном воплощении FcR представляет собой FcR, который связывается с антителом lgG (рецептор Fc гамма), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая их аллельные варианты и формы, образовавшиея в результате альтернативного сплайсинга. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют аналогичные аминокислотные последовательности, которые отличаются, главным образом, в их цитоплазматических доменах. Обзор FcR делается в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9 (1991) 457-492, Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34, de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341. Термином «FcR» здесь охватываются и другие FcR. Данный термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских lgG в плод (см., например, Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249).

Термин «рецептор Fc гамма», сокращенно: «FcγR» или «FcгаммаR» обозначает любого члена семейства белков, которые связываются с областью Fc антитела lgG и кодируются геном FcγR. У человека данное семейство включает, но не ограничивается, FcγRI (CD64), включая изоформы FcγRIA, FcγRIB и FcγRIC, FcγRII (CD32), включая изоформы FcγRIIA (включая аллотипы Н131 и R131), FcγRIIB (включая FcγRIIB-1 и FcγRIIB-2), и FcγRIIc, и FcγRIII (CD16), включая изоформы FcγRIIIA (включая аллотипы V158 и F158; запись Р08637 Swiss-Prot; N-конец-

и FcγRIIIb (включая аллотипы FcγRIIB-NA1 и FcγRIIB-NA2) (см., например, Jefferis et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65, полностью включенную посредством ссылки), а также изоформы или аллотипы FcγR. FcγR может происходить из любого организма, включая людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян, но не ограничиваясь ими. Мышиные FcγR включают FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIII-2 (CD16-2), а также изоформы или аллотипы FcγR, но не ограничиваются ими. Во взаимодействии область Fc-FcγR участвуют аминокислотные остатки 234-239 (нижняя шарнирная область), 265-269 (петля В/С), 297-299 (петля D/E) и 327-332 (петля F/G) (Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273). Мутации аминокислот, которые приводят к ослабленному связыванию/аффинности в отношении FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA, включают N297A (сопутствуют пониженной иммуногенности и продленному полупериоду связывания/аффинности) (Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847; Friend et al., Transplantation 68 (1999) 1632; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (1995) 6591), остатки 233-236 (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77; Armour et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613). Некоторые типичные аминокислотные замены описаны в US 7355008 и US 7381408.

Термин «неонатальный рецептор Fc», сокращенно: «FcRn», обозначает белок, который связывается с областью Fc антитела lgG и кодируется, по меньшей мере частично, геном FcRn. FcRn может происходить из любого организма, включая людей, мышей, крыс, кроликов и обезьян, но не ограничиваясь ими. Как известно в данной области, функциональный белок FcRn содержит два полипептида, часто называемых тяжелой цепью и легкой цепью. Легкая цепь представляет собой бета-2-микроглобулин, и тяжелая цепь кодируется геном FcRn. Если здесь не отмечено иное, термин «FcRn» или «белок FcRn» относится к комплексу тяжелой цепи FcRn с бета-2-микроглобулином. Взаимодействующие аминокислотные остатки области Fc с FcRn располагаются около соединения доменов СН2 и СН3. Все остатки, образующие контакт область Fc-FcRn, находятся в пределах одной тяжелой цепи lgG. Участвующими аминокислотными остатками являются 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 и 314 (все в домене СН2) и аминокислотные остатки 385-387, 428 и 433-436 (все в домене СН3). Мутации аминокислот, которые приводят к усиленному связыванию/аффинности в отношении FcRn, включают Т256А, Т307А, Е380А и N434A (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591).

Аминокислотные остатки неонатального рецептора Fc, которые являются консервативными у разных видов, представляют собой остатки гистидина в положении 310 и 435 в области Fc. Данные остатки ответственны за рН-зависимость взаимодействия область Fc-Fc-Rn (см., например, Victor, G., et al., Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640); Dall'Acqua, W. F., et al. J. Immunol. 169 (2002) 5171-5180). Мутации области Fc, которые ослабляют взаимодействие с FcRn, могут уменьшать период полувыведения антитела.

Термин «шарнирная область» обозначает часть полипептида тяжелой цепи антитела, которая соединяет домен СН1 и домен СН2, например, примерно от положения 216 до примерно положения 230 согласно системе нумерации EU по Kabat. Шарнирная область обычно представляет собой димерную молекулу, состоящую из двух полипептидов с идентичной аминокислотной последовательностью. Шарнирная область обычно содержит примерно 25 аминокислотных остатков и является гибкой, обеспечивая независимое движение антигенсвязывающих областей. Шарнирная область может подразделяться на три домена: верхний, средний и нижний шарнирный домен (Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).

Термин «нижняя шарнирная область» области Fc обозначает отрезок аминокислотных остатков, расположенный непосредственно С-терминально по отношению к шарнирной области, т.е. отрезки 233-239 области Fc согласно нумерации EU по Kabat.

Термин «область Fc дикого типа» обозначает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. Человеческие области Fc дикого типа включают нативную область Fc человеческого lgG1 (не-А и А аллотипов), нативную область Fc человеческого lgG2, нативную область Fc человеческого lgG3 и нативную область Fc человеческого lgG4, а также их варианты, встречающиеся в природе.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечивать эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводилась бы композиция.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.

Термин «полипептид» обозначает полимер, состоящий из аминокислот, соединенных пептидными связями, независимо от того, продуцируется ли он в природе или синтетически. Полипептиды из менее чем примерно 20 аминокислотных остатков можно называть «пептидами», тогда как молекулы, состоящие из двух или более чем двух полипептидов, или содержащие один полипептид из более чем 100 аминокислотных остатков можно называть «белками». Полипептид также может содержать неаминокислотные компоненты, такие как углеводные группы, ионы металлов или сложные эфиры карбоновых кислот. Неаминокислотные компоненты могут добавляться клеткой, в которой экспрессируется полипептид, и могут варьировать в зависимости от типа клетки. Полипептиды определяются здесь в терминах структуры их аминокислотного остова или кодирующей их нуклеиновой кислоты. Присоединенные компоненты, такие как углеводные группы, обычно не определены, но, тем не менее, могут присутствовать.

Термин «метка в виде аминокислотной последовательности» обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями, которые имеют специфичные свойства связывания. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности представляет собой аффинную метку или метку для очистки. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из группы, содержащей метку Arg, метку His, метку Avi, метку His-Avi, метку Flag, метку 3xFlag, метку Strep, метку Nano, метку SBP, метку с-myc, метку S, кальмодулинсвязывающий пептид, целлюлозосвязывающий домен, хитинсвязывающий домен, метку GST и метку МВР. В одном воплощении метка в виде аминокислотной последовательности выбрана из группы, содержащей

Термин «ферментативный сайт расщепления» обозначает последовательность аминокислотных остатков, соединенных друг с другом пептидными связями, которые могут специфично расщепляться протеазой. В одном воплощении протеаза представляет собой протеазу lgA, гранзим В, протеазу Tev, протеазу PreScission, тромбин, Faktor10a, протеазу Ides или энтерокиназу.

Термин «протеаза lgA» обозначает протеазу, происходящую из Neisseria gonorrhoeae, с сайтом распознавания, содержащим одну из следующих последовательностей, где «Ф» обозначает положение расщепляемой связи:

Термин «линкер» или «пептидный линкер» в том виде, в котором он используется в пределах данной заявки, обозначает пептидные линкеры природного и/или синтетического происхождения. Они состоят из линейной аминокислотной цепи, в которой мономерными строительными блоками являются 20 встречающихся в природе аминокислот. Данная цепь имеет длину от 1 до 50 аминокислот, предпочтительно от 1 до 28 аминокислот, особенно предпочтительно от 3 до 25 аминокислот. Линкер может содержать повторяющиеся аминокислотные последовательности или последовательности встречающихся в природе полипептидов, таких как полипептиды с функцией шарнира. Данный линкер имеет функцию обеспечения того, что пептид, конъюгированный с антителом против CD4, может выполнять его биологическую функцию, обеспечивая правильное сворачивание пептида и правильную презентацию. Предпочтительно линкер представляет собой «синтетический пептидный линкер», который разработан так, чтобы он был обогащен остатками глицина, глутамина и/или серина. Данные остатки организованы, например, в маленькие повторяющиеся единицы из вплоть до пяти аминокислот, такие как GGGGS, QQQQG или SSSSG. Эта маленькая повторяющаяся единица может повторяться от двух до пяти раз с образованием мультимерной единицы. На амино- и/или карбоксиконцах мультимерной единицы могут быть добавлены вплоть до шести дополнительных, произвольных, встречающихся в природе аминокислот. Другие синтетические пептидные линкеры состоят из одной аминокислоты, которая повторяется от 10 до 20 раз, и могут содержать на амино- и/или карбоксиконце вплоть до шести дополнительных, произвольных, встречающихся в природе аминокислот. Все пептидные линкеры могут кодироваться молекулой нуклеиновой кислоты и, следовательно, могут экспрессироваться рекомбинантно.

Описанный здесь слитый полипептид

Обнаружили, что растворимые рецепторы Fc могут быть получены путем проведения экспрессии рецептора Fc в виде слитого полипептида с областью Fc, которая по существу не связывается со слитым рецептором Fc.

Термин «по существу не связывается с рецептором Fc» обозначает то, что область Fc, с которой слит рецептор Fc, не связывается с рецептором Fc в такой степени, что образуются агрегаты.

Одним аспектом, как здесь описано, является слитый полипептид согласно формуле I

в котором

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

Одним аспектом, как здесь описано, является слитый полипептид согласно формуле II

в котором

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc,

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

CS1 обозначает первый сайт расщепления,

CS2 обозначает второй сайт расщепления,

CS3 обозначает третий сайт расщепления,

CS4 обозначает четвертый сайт расщепления,

L1 обозначает первую промежуточную аминокислотную последовательность и

L2 обозначает вторую промежуточную аминокислотную последовательность, ч в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором любой из CS1, CS2, CS3, CS4, независимо от других, может присутствовать или отсутствовать,

в котором L1 и L2 могут независимо друг от друга присутствовать или отсутствовать,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

Рецепторы Fc, содержащиеся в слитом полипептиде, как здесь описано, могут представлять собой любой рецептор Fc из любого вида, включающего человека, мышь, крысу, кролика и обезьяну, но не ограничивающегося ими.

В одном воплощении рецептор Fc выбран из группы, включающей рецептор Fcгамма и неонатальный рецептор Fc. В одном воплощении рецептор Fc представляет собой человеческий рецептор Fcгамма, человеческий неонатальный рецептор Fc, мышиный рецептор Fc и кроличий неонатальный рецептор Fc.

В одном воплощении человеческий рецептор Fcгамма выбран из человеческого FcγRI (CD64), человеческого FcγRII (CD32), человеческого FcγRIIA, человеческого FcγRIIB, человеческого FcγRIIC, человеческого FcγRIII (CD16), человеческого FcγRIIIA и человеческого FcγRIIIB.

В одном воплощении человеческий неонатальный рецептор Fc представляет собой человеческий FcRn.

В одном воплощении мышиный рецептор Fc выбран из мышиного FcγRI (CD64), мышиного FcγRII (CD32), мышиного FcγRIIB, мышиного FcγRIII (CD16), мышиного FcγRIII-2 (CD16-2) и мышиного FcγRIV.

В одном воплощении FC представляет собой вариант полипептида тяжелой цепи, выбранный из группы полипептида тяжелой цепи человеческого lgG, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG, полипептида тяжелой цепи кроличьего lgG.

В одном воплощении FC представляет собой вариант полипептида тяжелой цепи, выбранный из группы полипептида тяжелой цепи человеческого lgG1, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG2, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG3, полипептида тяжелой цепи человеческого lgG4, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG1, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG2, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG2a, полипептида тяжелой цепи мышиного lgG3, полипептида тяжелой цепи кроличьего lgG.

Область Fc, содержащаяся в слитом полипептиде, как здесь описано, по существу не должна связываться с любым рецептором(рами) Fc, слитым(тыми) с ней.

В одном воплощении слитый полипептид по существу не обладает эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для применений, в которых определенные эффекторные функции являются ненеобходимыми или вредными. Для подтверждения уменьшения/ослабления эффекторных функций можно проводить анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, можно проводить анализы связывания с рецептором Fc (FcR) для того, чтобы убедиться в том, что слитый полипептид не имеет связывания с FcγR (и, следовательно, вероятно не имеет активности ADCC). NK (естественный киллер) клетки - главные клетки, опосредующие ADCC, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках обобщена в Таблице 3 на странице 464 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC интересующей молекулы описаны в патенте США №5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); патент США №5821337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В качестве альтернативы, можно использовать нерадиоактивные способы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и клетки-естественные киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнительно, активность ADCC интересущей молекулы можно оценивать in vivo, например, в животной модели, такой как модель, раскрытая в Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Определения связывания с FcRn и клиренса/периода полувыведения in vivo также можно проводить с использованием способов, известных в данной области (см., например, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769).

Аффинности и свойства связывания области Fc в отношении ее лиганда можно определять целым рядом способов анализа in vitro (анализы на основе биохимии или иммунологии), известных в данной области для определения взаимодействий области Fc/FcR, т.е. специфичного связывания области Fc с FcγR, включая равновесные способы (например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммуноанализ (RIA)) или кинетические (например, анализ BIACORE®) и другие способы, такие как непрямые анализы связывания, конкурентные анализы ингибирования, резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), гель-электрофорез и хроматография (например, гель-фильтрация), но не ограничиваясь ими. В данных и других способах может использоваться метка на одном или более чем одном из исследуемых компонентов и/или может использоваться множество способов детекции, включающих хромогенные, флуоресцентные, люминисцентные или изотопные метки, но не ограничивающихся ими. Подробное описание аффинностей связывания и кинетики можно найти в Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999).

В одном воплощении FC представляет собой либо область Fc человеческого происхождения подкласса lgG4, либо область Fc человеческого происхождения подкласса lgG1, lgG2 или lgG3, которая модифицирована таким образом, что отсутствует связывание с рецептором FcγR (например, с FcγRIIIa). В одном воплощении FC представляет собой область Fc человеческого происхождения, особенно либо из подкласса человеческого lgG4, либо мутировавшую область Fc из подкласса человеческого lgG1. В одном воплощении FC происходит из подкласса человеческого lgG1 с мутациями L234A и L235A. В одном воплощении FC происходит из подкласса человеческого lgG4 с мутацией S228P. В то время как lgG4 демонстрирует ослабленное связывание с рецептором FcγR (FcγRIIIa), антитела других подклассов lgG демонстрируют сильное связывание. Однако Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (потеря углевода Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, или/и His435 представляют собой остатки, которые, при изменении, также обеспечивают ослабленное связывание с рецептором Fcγ (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). В одном воплощении FC имеет отношение к связыванию с рецептором Fcγ подкласса lgG4 или подкласса lgG1 или lgG2 с мутацией L234, L235 и/или D265, и/или содержит мутацию PVA236. В одном воплощении FC содержит одну или более чем одну мутацию S228P, L234A, L235A, L235E и/или PVA236 (PVA236 означает то, что аминокислотная последовательность ELLG (приведенная однобуквенным кодом аминокислот) от положения аминокислоты 233 до 236 lgG1 или EFLG lgG4 заменена PVA). В одном воплощении мутациями являются S228P для lgG4, и L234A и L235A для lgG1.

Сайты связывания области Fc известны в современном уровне техники и описаны, например, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324 и EP 0307434. Сайты связывания области Fc, например, характеризуются аминокислотами L234, L235, D270, N297, Е318, K320, K322, Р331 и Р329 (нумерация согласно индексу EU по Kabat).

Области Fc с пониженной эффекторной функцией включают области с заменой одного или более чем одного из остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 области Fc (патент США №6737056). Такие мутанты Fc включают мутантов Fc с заменами в двух или более чем двух положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc «DA» с заменой остатка 265 и так называемый мутант Fc «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США№7332581).

Описаны определенные варианты области Fc с улучшенным или ослабленным связыванием с FcR (см., например, патент США №6737056; WO 2004/056312 и Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

В некоторых воплощениях сделаны изменения в области Fc, которые приводят к измененному (т.е. улучшенному или ослабленному) связыванию с C1q и/или измененной цитотоксичности, зависимой от комплемента (CDC), например, как описано в патенте США №6194551, WO 99/51642 и Idusogie, Е.Е. et al., J. Immunol. 164(2000) 4178-4184.

См. также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5648260; US 5624821 и WO 94/29351 относительно других примеров вариантов области Fc.

В одном воплощении полипептид области Fc тяжелой цепи имеет мутацию аминокислоты в одном или более чем одном положении 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434 и 435. В одном воплощении один или более чем один рецептор Fc представляет собой рецептор Fc гамма.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329 и 331.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет одну или более чем одну мутацию аминокислоты Е233Р, L234A, L235A, L235E, AG236, D265A, N297A, N297D, Р329А, P329G и P331S.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутации аминокислот L234A и L235A и одну или более чем одну из Е233Р, L235E, AG236, D265A, N297A, N297D, Р329А, P329G и P331S.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG1 имеет мутации аминокислот L234A и L235A, и Р329А или P329G.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG2 имеет мутации в одном или более чем одном положении аминокислоты 233, 234, 235, 236, 265 и 329.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 228, 235, 265 и 329.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет одну или более чем одну мутацию S228P, L235E, Р329А и P329G.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG4 имеет мутации S228P и L235E, и Р329А или P329G.

В одном воплощении полипептид области Fc тяжелой цепи имеет мутацию аминокислоты в одном или более чем одном положении 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435 и 436. В одном воплощении один или более чем один рецептор Fc представляет собой FcRn.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG имеет мутацию в одном или более чем одном положении аминокислоты 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 и/или 447.

В одном воплощении полипептид тяжелой цепи человеческого lgG, который имеет ослабленное связывание с FcRn, имеет одну или более чем одну замену аминокислоты в положениях аминокислот 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 и/или 447.

Слитый полипептид может содержать линкерный полипептид между рецептором Fc и областью Fc. Данный линкерный полипептид можно использовать для корректировки расстояния между рецептором Fc и областью Fc для обеспечения того, чтобы обе области функционировали намеченным образом.

В одном воплощении линкерный полипептид выбран из группы, содержащей (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3 и (G5S)4, и любую их комбинацию.

Кроме того, слитый полипептид может содержать метку между рецептором Fc и областью Fc, например, подходящую для аффинной очистки или иммобилизации.

В одном воплощении данная метка выбрана из группы, включающей метку Arg, метку Avi, метку His-Avi, метку His, метку Flag, метку 3xFlag, метку Strep, метку Nano, метку SBP, метку с-myc, метку S, кальмодулинсвязывающий пептид, целлюлозосвязывающий домен, хитинсвязывающий домен, метку GST, метку МВР, стрептавидин или авидин, биотин, лектин, полисахарид, стероид, стероид-связывающий белок, гормон или рецептор гормона.

Линкерный полипептид и метка могут быть объединены в промежуточной аминокислотной последовательности, которая расположена между рецептором Fc и областью Fc.

В одном воплощении промежуточная аминокислотная последовательность выбрана из первой группы, включающей (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3 и (G5S)4, или из второй группы, включающей метку Arg, метку Avi, метку His-Avi, метку His, метку Flag, метку 3xFlag, метку Strep, метку Nano, метку SBP, метку с-myc, метку S, кальмодулинсвязывающий пептид, целлюлозосвязывающий домен, хитинсвязывающий домен, метку GST или метку МВР, или из комбинаций двух элементов из данных групп.

Промежуточная аминокислотная последовательность может быть расположена в слитом полипептиде либо до, либо после сайта расщепления.

В одном воплощении сайт расщепления представляет собой сайт ферментативного расщепления. В одном воплощении сайт ферментативного расщепления выбран из группы, состоящей из сайта расщепления протеазы lgA, сайта расщепления протеазы гранзим В, сайта расщепления протеазы Tev, сайта расщепления протеазы PreScission, сайта расщепления тромбина, сайта протеазы Faktor10a, сайта расщепления протеазы Ides, сайта расщепления протеазы SUMO и сайта расщепления энтерокиназы. В одном воплощении сайт расщепления выбран из группы сайта расщепления протеазы lgA, сайта расщепления протеазы PreScission, сайта расщепления гранзима В и сайта расщепления протеазы Ides.

В одном воплощении слитый полипептид содержит собственный сайт расщепления протеазой папаин или протеазой пепсин, или протеазой Ides.

Одним аспектом, как здесь описано, является димерный слитый полипептид, содержащий два слитых полипептида, как здесь описано.

Поскольку слитый полипептид, как здесь описано, содержит область Fc, которая, в свою очередь, содержит шарнирную область иммуноглобулина, димерный слитый полипептид содержит один или более чем один дисульфидный мостик, ковалентно связывающий первый слитый полипептид со вторым слитым полипептидом.

Димерный слитый полипептид может представлять собой гомодимерный слитый полипептид или гетеродимерный слитый полипептид.

Кроме того, димерный слитый полипептид может содержать первый слитый полипептид согласно формуле I

в котором

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2.

или согласно формуле II

в котором

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc,

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

CS1 обозначает первый сайт расщепления,

CS2 обозначает второй сайт расщепления,

CS3 обозначает третий сайт расщепления,

CS4 обозначает четвертый сайт расщепления,

L1 обозначает первую промежуточную аминокислотную последовательность и

L2 обозначает вторую промежуточную аминокислотную последовательность,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором любой из CS1, CS2, CS3, CS4, независимо от других, может присутствовать или отсутствовать,

в котором L1 и L2 могут независимо друг от друга присутствовать или отсутствовать,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2,

в котором первый и второй слитый полипептид димерного слитого полипептида могут быть выбраны независимо друг от друга из формулы I и формулы II.

Если димерный слитый полипептид может содержать два разных слитых полипептида, должен использоваться механизм для обеспечения гетеродимеризации.

В одном воплощении первый FC содержит мутацию T366W и, возможно, мутацию S354C, и второй FC содержит мутации T366S, L368A и Y407V, и, возможно, мутацию Y349C.

В одном воплощении слитый полипептид характеризуется тем, что:

а) R1 и R2 первого и второго полипептида являются идентичными,

б) R1 и R2 первого слитого полипептида являются идентичными, R1 и R2 второго слитого полипептида являются идентичными, но отличными от R1 и R2 первого слитого полипептида,

в) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и R2 первого и второго полипептида являются идентичными, но отличными от R1,

г) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и оба R2 отсутствуют,

д) R1 первого и второго слитого полипептида являются отличными, и оба R2 отсутствуют,

е) R2 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и оба R1 отсутствуют,

ж) R2 первого и второго слитого полипептида являются отличными, и оба R1 отсутствуют,

з) R1 первого слитого полипептида и R2 второго слитого полипептида являются отличными, R2 первого слитого полипептида отсутствует, и R1 второго полипептида отсутствует.

Применения описанного здесь слитого полипептида

Одним аспектом, как здесь описано, является применение иммобилизованного слитого полипептида, как здесь описано, в качестве лиганда аффинной хроматографии.

В одном воплощении слитый полипептид связан с твердой фазой. В одном воплощении данная твердая фаза представляет собой хроматографическое вещество. В одном воплощении слитый полипептид является биотинилированным, и твердая фаза дериватизирована стрептавидином.

В одном воплощении слитый полипептид содержит сайт расщепления между рецептором Fc и областью Fc. В одном воплощении слитый полипептид расщепляется перед биотинилированием.

В одном воплощении слитый полипептид содержит содержит метку для иммобилизации между рецептором Fc и сайтом расщепления. В одном воплощении метка для иммобилизации представляет собой метку His-Avi.

Также описана колонка для аффинной хроматографии, которая содержит матрицу и хроматографические функциональные группы, связанные с матрицей, характеризующаяся тем, что хроматографические функциональные группы, связанные с матрицей, содержат слитый полипептид, как здесь описано.

В одном воплощении слитый полипептид содержит сайт расщепления между рецептором Fc и областью Fc. В одном воплощении слитый полипептид расщепляется перед биотинилированием.

В одном воплощении слитый полипептид содержит метку для иммобилизации между рецептором Fc и сайтом расщепления. В одном воплощении метка для иммобилизации представляет собой метку Avi.

Одним аспектом, как здесь описано, является применение иммобилизованного слитого полипептида, как здесь описано, для определения связывания антитела с рецептором Fc.

В одном воплощении антитело представляет собой низкоаффинное антитело.

В одном воплощении определение осуществляется поверхностным плазмонным резонансом. В одном воплощении антитело захватывается мономерным рецептором Fc. В одном воплощении антитело захватывается димерным антителом.

Методы генной инженерии

Одним аспектом, как здесь описано, является способ получения растворимого рецептора Fc, включающий следующие стадии:

а) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид, как здесь описано,

б) выделение слитого полипептида из клетки или среды культивирования,

в) возможно расщепление слитого полипептида протеазой,

и получение, посредством этого, растворимого рецептора Fc.

Способы и методики, известные специалисту в данной области, которые являются полезными для осуществления настоящего изобретения, описаны, например, в Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Нуклеиновая кислота, кодирующая слитый полипептид, как здесь описано, может экспрессироваться в клетке-хозяине. После рекомбинантной экспрессии слитый пептид можно очищать способами, известными специалисту в данной области. Данные способы являются общепринятыми и широко используются для очистки иммуноглобулинов, и применяются либо одни, либо в комбинации. Такими способами являются, например, аффинная хроматография с использованием белков микробного происхождения (например, аффинная хроматография на белке А или белке Q), ионообменная хроматография (например, катионообменная (карбоксиметильные смолы), анионообменная (аминоэтильные смолы) и комбинированная ионообменная хроматография), тиофильная адсорбция (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH лигандами), хроматография на основе гидрофобных взаимодействий или адсорбции ароматическими соединениями (например, с фенил-сефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилбороновой кислотой), аффинная хроматография на основе образования хелата металла (например, с использованием аффинного вещества на основе Ni(II) и Cu(II)), гель-фильтрация и препаративные электрофоретические способы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, М.А., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). До хроматографической очистки или после хроматографической очистки слитый полипептид может быть ферментативно расщеплен для того, чтобы высвободить рецептор Fc. Экспрессионные кассеты содержат промотор, отрезок ДНК, кодирующий сигнальную последовательность секреции, структурный ген и терминатор/сигнал полиаденилирования. Данные элементы собраны в форму, связанную функциональным образом, либо на одной плазмиде, кодирующей все разные требующиеся слитые полипептиды, либо на двух или более чем двух плазмидах, каждая из которых кодирует один слитый полипептид. Для экспрессии структурных генов плазмида(ды) вводится(дятся) в подходящую клетку-хозяина. Белки продуцируются в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО (клетки яичника китайского хомяка), клетки NS0, клетки Sp2/0, клетки COS (клетки почки обезьяны), клетки НЕK (клетки эмбриональной почки человека), клетки K562, клетки ВНК (клетки почки новорожденного хомяка), клетки PER.C6® и тому подобное. В одном воплощении слитый полипептид экспрессируется в клетке СНО или в клетке ВНК, или в клетке НЕK. Регуляторные элементы плазмиды должны быть выбраны таким способом, чтобы они были функциональными в выбранной клетке-хозяине. Экспрессированные слитые полипептиды являются собранными функциональным образом.

«Экспрессионная плазмида» представляет собой нуклеиновую кислоту, предоставляющую все необходимые элементы для экспрессии содержащегося(щихся) в ней структурного(ных) гена(нов) в клетке-хозяине. Типично экспрессионная плазмида содержит элемент для размножения плазмиды в клетках прокариот, например, для Е.coli содержит репликатор, и селектируемый маркер, эукариотический маркер для селекции и одну или более чем одну экспрессионную кассету для экспрессии интересующего(щих) структурного(ных) гена(нов), причем каждая из них содержит промотор, структурный ген и терминатор транскрипции, включающий сигнал полиаденилирования. Экспрессия гена обычно осуществляется под контролем промотора, и говорят, что такой структурный ген «связан функциональным образом» с промотором. Аналогично, регуляторный элемент и ядро промотора связаны функциональным образом, если регуляторный элемент модулирует активность ядра промотора.

Антитела могут быть получены с использованием методов генной инженерии и композиций, например, как описано в патенте США №4816567. В одном воплощении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая описанное здесь антитело на основе слитого полипептида. В одном воплощении предложен один или более чем один вектор (например, экспрессионные векторы), содержащий такую нуклеиновую кислоту. В другом воплощении предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком воплощении клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую первый слитый полипептид, и аминокислотную последовательность, содержащую второй слитый полипептид, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую первый слитый полипептид, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую второй слитый полипептид. В одном воплощении клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомяка (СНО) или лимфоцитом (например, клетка Y0, NS0, Sp20). В одном воплощении предложен способ получения слитого полипептида, где данный способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид, как предложено выше, при подходящих условиях для экспрессии слитого полипептида, и возможно выделение слитого полипептида из клетки-хозяина (или из культуральной среды клетки-хозяина).

Для рекомбинантной продукции слитого полипептида, как здесь описано, нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид, например, как описано выше, выделяют и вставляют в один или более чем один вектор для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такую нуклеиновую кислоту можно легко выделять и секвенировать с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые могут специфично связываться с генами, кодирующими слитый полипептид).

Здесь описаны подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих слитый полипептид, включающие прокариотические или эукариотические клетки. Например, слитый полипептид может быть продуцирован в бактериях, в частности, когда не нужны гликозилирование и эффекторная функция Fc. Относительно экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см, например, US 5648237, US 5789199 и US 5840523 (см. также Charlton, K.А., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, описывающую экспрессию фрагментов антител в Е.coli). После экспрессии слитый полипептид можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и можно очищать далее.

Помимо прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих слитый полипептид, являются эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что приводит к продукции слитого полипептида с частично или полностью человеческой картиной гликозилирования (см. Gemgross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; and Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215).

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного слитого полипептида также происходят из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные штаммы бакуловирусов, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев также можно использовать культуры клеток растений (см., например, патенты США №5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для продукции антител в трансгенных растениях)).

В качестве хозяев также можно использовать клетки позвоночных. Например, могут быть полезными линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами полезных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (COS-7); линия клеток эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клетки почки новорожденного хомяка (ВНК); мышиные клетки Сертоли (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки человеческой карциномы шейки матки (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени серой крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, как описано, например, в Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие полезные линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), включая клетки СНО DHFR (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Относительно обзора определенных линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продукции антитела, см., например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.

Способы и композиции для диагностики и детекции

В определенных воплощениях любой из предложенных здесь слитых полипептидов является полезными для детектирования присутствия в биологическом образце молекул, содержащих область Fc. Термин «детектирование» в том виде, как он здесь используется, охватывает количественную или качественную детекцию.

В одном воплощении предложен слитый полипептид, как здесь описано, для применения в способе диагностики или детекции. В другом аспекте предложен способ детектирования присутствия в биологическом образце молекул, содержащих область Fc. В определенных воплощениях данный способ включает приведение биологического образца в контакт со слитым полипептидом, как здесь описано, при условиях, допускающих связывание слитого полипептида с молекулой, содержащей область Fc, и детектирование того, образуется ли комплекс между слитым полипептидом и молекулой, содержащей область Fc. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo.

В определенных воплощениях предложены меченые слитые полипептиды. Метки включают метки или группировки, которые детектируются непосредственно (такие как флуоресцентные, хромофорные, электроноплотные, хемилюминисцентные и радиоактивные метки), а также группировки, такие как ферменты или лиганды, которые детектируются опосредованно, например, через ферментативную реакцию или молекулярное взаимодействие, но не ограничиваются ими. Типичные метки включают радиоактивные изотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты на основе редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, оксидазы гетероциклов, такие как уриказа и ксантиноксидаза, связанные с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, таким как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, метки в виде бактериофагов, стабильные свободные радикалы и тому подобное, но не ограничиваются ими.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции слитого полипептида, как здесь описано, получают смешиванием такого слитого полипептида, имеющего желательную степень чистоты, с одним или более чем одним возможным фармацевтически приемлемым носителем (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (меньше, чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелаторы, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Типичные фармацевтически приемлемые носители здесь, кроме того, включают агенты для диспергирования лекарственного средства в межклеточном пространстве, такие как растворимые гиалуронидазные гликопротеины, активные при нейтральном рН (sHASEGP), например, человеческие растворимые гиалуронидазные гликопротеины РН-20, такие как rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Определенные типичные sHASEGP и способы применения, включающие rhuPH20, описаны в публикациях патентов США №2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP объединяют с одной или более чем одной дополнительной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназа.

Типичные лиофилизированные композиции антитела описаны в патенте США №6267958. Водные композиции антитела включают композиции, описанные в патенте США №6171586 и WO 2006/044908, причем последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.

По мере необходимости предложенная здесь композиция также может содержать более чем один активный ингредиент для конкретного показания, которое лечат, предпочтительно агенты с дополняющими друг друга активностями, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели.

Активные ингредиенты могут захватываться в микрокапсулах, полученных, например, методиками коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсулах и поли-(метилметакрилатных) микрокапсулах соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.)(1980).

Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие слитый полипептид, которые находятся в виде формованных предметов, например, пленок, или микрокапсул.

Композиции, подлежащие применению для введения in vivo, обычно являются стерильными. Стерильности можно легко достигать, например, фильтрованием через мембраны для стерилизующего фильтрования.

Терапевтические способы и композиции

В терапевтических способах можно использовать любой из описанных здесь слитых полипептидов.

В одном аспекте предложен слитый полипептид для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах предложен слитый полипептид для применения в лечении заболевания, характеризующегося повышенными уровнями антител. В одном воплощении данное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. В определенных воплощениях предложен слитый полипептид для применения в способе лечения. В определенных воплощениях согласно изобретению предложен слитый полипептид для применения в способе лечения индивида, имеющего заболевание, характеризующееся повышенными уровнями антител, включающем введение индивиду эффективного количества слитого полипептида. В одном таком воплощении данный способ, кроме того, включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В других воплощениях согласно изобретению предложен слитый полипептид для применения в снижении уровней антител. В определенных воплощениях согласно изобретению предложен слитый полипептид для применения в способе снижения уровней антител у индивида, включающий введение индивиду эффективного количества слитого полипептида для снижения уровней антител. «Индивидом» согласно любому из приведенных выше воплощений предпочтительно является человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложено применение слитого полипептида в изготовлении или получении лекарственного средства. В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения заболевания, характеризуемого повышенными уровнями антител. В одном воплощении заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения повышенных уровней антител, включающем введение индивиду, имеющему заболевание, характеризуемое повышенными уровнями антител, эффективного количества лекарственного средства. В одном таком воплощении данный способ, кроме того, включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для снижения уровней антител. В другом воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе снижения уровней антител у индивида, включающем введение индивиду эффективного количества лекарственного средства для снижения уровня антитела. «Индивидом» согласно любому из приведенных выше воплощений может быть человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ лечения заболевания, характеризуемого повышенными уровнями антител. В одном воплощении заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. В одном воплощении способ включает введение индивиду, имеющему такое заболевание, характеризуемое повышенными уровнями антител, эффективного количества слитого полипептида. В одном таком воплощении данный способ, кроме того, включает введение индивиду эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента. «Индивидом» согласно любому из приведенных выше воплощений может быть человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложен способ снижения уровней антител у индивида. В одном воплощении данный способ включает введение индивиду эффективного количества слитого полипептида для снижения уровней антител. В одном воплощении «индивидом» является человек.

В другом аспекте согласно изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие любой из описанных здесь слитых полипептидов, например, для применения в любом из описанных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит любой из слитых полипептидов, как здесь описано, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит любой из описанных здесь слитых полипептидов и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент.

Слитые полипептиды по изобретению можно использовать в терапии либо одни, либо в комбинации с другими агентами. Например, слитый полипептид по изобретению можно вводить совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом.

Такие комбинированные терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (когда два или более чем два терапевтических агента включены в ту же самую или в отдельные композиции) и раздельное введение, в случае которого введение слитого полипептида по изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта.

Слитый полипептид по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное и, если это желательно для местного лечения, введение в область поражения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться любым подходящим путем, например, инъекциями, такими как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или хроническим. Здесь рассматриваются разные схемы дозирования, включающие однократные или многократные введения на протяжении разных моментов времени, болюсное введение и импульсную инфузию, но не ограничивающиеся ими.

Слитые полипептиды по изобретению готовили бы, дизировали и вводили способом, совместимым с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинским практикам. Слитый полипептид не должен, но возможно приготовлен с одним или более чем одним агентом, используемым в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества слитого полипептида, присутствующего в композиции, типа расстройства или лечения и других факторов, обсуждавшихся выше. Они обычно используются в таких же дозировках и с использованием описанных здесь путей введения или в количестве примерно от 1 до 99% описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым путем, который эмпирически/клинически определен как подходящий.

Для предупреждения или лечения заболевания подходящая дозировка слитого полипептида по изобретению (при использовании одиночно или в комбинации с одним или более чем одним другим дополнительным терапевтическим агентом) будет зависеть от типа заболевания, которое нужно лечить, типа слитого полипептида, тяжести и хода заболевания, от того, вводится ли слитый полипептид для предупредительных или терапевтических целей, от предыдущей терапии, клинической истории пациента, ответа на слитый полипептид и решения лечащего врача. Слитый полипептид подходящим образом вводится пациенту разом или на протяжении ряда обработок. В зависимости от типа и тяжести заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг) слитого полипептида может быть исходной подходящей дозировкой для введения пациенту, независимо от того, например, осуществляется ли она одним или более чем одним раздельным введением или непрерывной инфузией. Одна типичная суточная дозировка может варьировать от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от вышеупомянутых факторов. Для повторных введений на протяжении нескольких суток или более длительного периода, в зависимости от условия, лечение обычно продолжалось бы до появления желательного подавления симптомов заболевания. Одна типичная дозировка слитого полипептида находилась бы в интервале от примерно 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более чем одну дозу примерно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, что пациент получает от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз слитого полипептида). Можно вводить исходную более высокую загрузочную дозу, с последующей одной или более чем одной меньшими дозами. Однако могут быть полезными другие схемы дозировки. Прогресс данной терапии легко отслеживать традиционными методиками и анализами.

Понятно, что в любых из приведенных выше композиций или терапевтических способов можно использовать иммуноконъюгат по изобретению вместо слитого полипептида или помимо него.

Изделия

В другом аспекте изобретения предложено изделие, содержащее полезные вещества для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше расстройств. Данное изделие содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш в упаковке на или ассоциированные с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, сосуды, шприцы, мешки для в.в. (внутривенный) раствора и т.д. Данные контейнеры могут быть получены из целого ряда материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния, и он может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок с внутривенным раствором или сосуд, имеющий пробку, проницаемую подкожной инъекционной иглой). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой слитый полипептид по изобретению. На этикетке или листке-вкладыше в упаковке указано то, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит слитый полипептид по изобретению; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит другой цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие в данном воплощении изобретения может, кроме того, содержать листок-вкладыш в упаковке с указанием того, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В качестве альтернативы или дополнительно, изделие, кроме того, может содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекции (BWFI), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно, кроме того, может включать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и точки зрения пользователя, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Понятно, что любое из приведенных выше изделий может включать иммуноконъюгат по изобретению вместо слитого полипептида или помимо него.

Следующие примеры, графические материалы и последовательности приведены для того, чтобы помочь пониманию настоящего изобретения, истинный объем которого изложен в приложенной формуле изобретения. Понятно, что в изложенных методиках можно сделать модификации, не отступая от духа изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение экспрессионных плазмид

а) Получение экспрессионной плазмиды для слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы IqA-Fc LALA P239G

Ген, кодирующий слитый полипептид FсгаммаRIIIаV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G собирали путем слияния химически синтезированных фагментов ДНК, кодирующих i) сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина (MGWSCIILFLVATATGVHS: SEQ ID NO: 55), ii) человеческий рецептор Fc гамма IIIa V158 из аминокислотных остатков 2-193 (т.е. исключая исходный метионин) и iii) константную область тяжелой цепи человеческого Fc-гамма-1 (шарнирная область-СН2-СН3) с мутациями L234A, L235A и P329G.

Экспрессионная плазмида для временной экспрессии слитого полипептида FсгаммаRIIIаV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G в клетках НЕК293, помимо экспрессионной кассеты слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G содержала репликатор из вектора pUC18, который обеспечивает репликацию данной плазмиды в Е.coli, и ген бета-лактамазы, который придает Е.coli устойчивость к ампициллину. Подробно транскрипционная единица гена, кодирующего слитый полипептид FcгaммaRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G содержит следующие функциональные элементы:

- немедленный ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

- 5'-нетранслируемая область (5'UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- полипептид растворимого человеческого рецептора Fc гамма III V158 из аминокислот, соответствующих положениям 2-193, белка человеческого рецептора Fc гамма III V158 дикого типа,

- человеческая константная область тяжелой цепи Fc-гамма-1 (шарнирная область-СН2-СН3, LALA P239G) и

- последовательность полиаденилирования коровьего гормона роста (сигнальная поли А последовательность BGH).

Аминокислотная последовательность зрелого слитого полипептида FсгаммаRIIIаV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G является следующей:

Аналогичным образом можно получить следующие слитые полипептиды:

- слитый полипептид FcгаммаRIIa-LR(H131)-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G:

- слитый полипептид FcгаммаRIIb-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G:

- слитый полипептид FcгаммаRIIIb-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G:

- минимальный слитый полипептид FcгаммаRIIIa-Avi-Fc LALA P239G (без сайта расщепления протеазы):

б) Получение экспрессионных плазмид типа «выступ во впадину» для димерного слитого полипептида рецептора Fc

Экспрессионная плазмида для временной экспрессии слитого полипептида рецептор Fc-область Fc (впадина) в клетках НЕK293 была получена из описанного выше в разделе а) экспрессионного вектора. Ее дифференцировали из него в последовательности ДНК, кодирующей область Fc с мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C, приводящими к образованию впадины, в пределах константной области тяжелой цепи человеческого гамма-1.

Экспрессионная плазмида для временной экспрессии слитого полипептида рецептор Fc-область Fc (выступ) в клетках HEK293 была получена из описанного выше в разделе а) экспрессионного вектора. Ее дифференцировали из него в последовательности ДНК, кодирующей область Fc с мутациями T366W и S354C, приводящими к образованию выступа, в пределах константной области тяжелой цепи человеческого гамма-1.

Экспрессионная плазмида для временной экспрессии слитого полипептида рецептор Fc-область Fc (выступ/впадина) в клетках HEK293, помимо экспрессионной кассеты слитого полипептида (выступ/впадина), содержала репликатор из вектора pUC18, который обеспечивает репликацию данной плазмиды в Е.coli, и ген бета-лактамазы, который придает Е.coli устойчивость к ампициллину. Подробно транскрипционная единица гена, кодирующего слитый полипептид (выступ/впадина), содержит следующие функциональные элементы:

- немедленный ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

- 5'-нетранслируемая область (5'UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальная последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- константная область тяжелой цепи человеческого Fc-гамма-1 (шарнирная область-СН2-СН3) с мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C, приводящими к образованию впадины, или мутациями T366W и S354C, приводящими к образованию выступа, в пределах константной области тяжелой цепи человеческого гамма-1 и

- последовательность полиаденилирования коровьего гормона роста (сигнальная поли А последовательность BGH).

Пример 2

Временная экспрессия, очистка и аналитическая характеризация слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G

Слитые полипептиды получали временной трансфекцией клеток НЕK293 (происходящие из линии клеток 293 человеческой эмбриональной почки), культивируемых в среде F17 (Invitrogen Corp.). Для трансфекции использовали трансфекционный реактив, «не содержащий 293» (Novagen). Пары слитых полипептидов типа «выступ во впадину» экспрессировались из двух разных плазмид с использованием эквимолярного соотношения плазмид при трансфекции. Трансфекции проводили, как определено в инструкциях изготовителя. Супернатанты культуры клеток, содержащие слитые полипептиды, отбирали через семь суток после трансфекции. Супернатанты хранили при пониженной температуре до очистки.

Общая информация относительно рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в клетках HEK293 приведена в: Meissner, P., et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Супернатанты культуры, содержащие слитые полипептиды, фильтровали и очищали посредством двух хроматографических стадий. Слитые полипептиды захватывали посредством аффинной хроматографии с использованием HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare), уравновешенной PBS (1 мМ KH₂PO₄, 10 мМ Na₂HPO₄, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl), рН 7,4. Несвязавшиеся белки удаляли посредством промывки буфером для уравновешивания, и слитый полипептид выделяли с использованием 0,05 M цитратного буфера, рН 3, а немедленно после элюции нейтрализовали до рН 6,5 1 M основанием Tris, рН 9,0. В качестве второй стадии очистки использовали гель-фильтрацию на Superdex 200™ (GE Healthcare). Гель-фильтрацию проводили в 2 мМ буфере MOPS, 0,125 M NaCl, рН 7,2. Элюированные слитые полипептиды концентрировали с использованием центрифужного фильтрационной установки Ultrafree-CL, оснащенной мембраной Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA), и хранили при -80°С.

Согласно данному протоколу очищали четыре разных слитых полипептида FcгаммаRIIIa-Fc:

а) FcгаммаRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G (без сайта расщеления)

б) минимальный FcгаммаRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G (без сайта расщеления)

в) FcгаммаRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы PreScission (PP)-Fc LALA P239G

г) FcгаммаRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P239G

Концентрации белка слитых полипептидов определяли измерением оптической плотности (ОП) при 280 нм с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности. Чистоту и правильное образование димеров слитых полипептидов анализировали посредством SDS-PAGE в присутствии и в отсутствие восстанавливающего агента (5 мМ 1,4-дитиотрейтол) и с окрашиванием кумасси бриллиантовым синим. Содержание агрегатов в препаратах слитых полипептидов определяли высокоэффективной SEC (гель-фильтрация) с использованием аналитической гель-фильтрационной колонки Superdex 200™ (GE Healthcare). Целостность аминокислотного остова восстановленного слитого полипептида подтверждали наноэлектрораспылительной QTOF масс-спектрометрией после удаления N-гликанов ферментативной обработкой комбинацией нейраминидазы, О-гликаназы и пептид-N-гликозидазы F (Roche Applied Science).

Пример 3

Расщепление папаином

Слитые полипептиды FcгаммаRIII-Fc, которые не содержат сайта ферментативного расщепления, могут быть расщеплены папаином. Слитый полипептид FcгаммаRIIIa-Fc расщепляли добавлением цистеина и 0,1 mU папаина (из Carica papaya, Roche Diagnostics GmbH) на мг слитого полипептида при 37°С в течение 1 ч. Последующая очистка была проведена, как описано в Примере 2. Гель аналитического SDS-PAGE показан на Фиг. 2.

Пример 4

Расщепление протеазой Ides

Расщепление слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G протеазой Ides является очень неэффективным и, следовательно, в данном случае не является полезным.

Пример 5

Расщепление протеазой PreScission

После диализа против 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, рН 7,4 слитый полипептид FcгаммаRIIIa-(PP)-Fc расщепляли добавлением от 1 до 15 U протеазы PreScission (GE Healthcare) на 100 мкг слитого полипептида при комнатной температуре в течение ночи. Только часть белка могла быть расщеплена. С другой стороны, наблюдали неспецифичное расщепление рецептора без сайта расщепления РР протеазой PreScission.

Пример 6

Расщепление протеазой lgA

После диализа против 50 мМ Tris, рН 8 с использованием кассеты для диализа Slide-a-lyzer слитый полипептид FcгаммаRIIIa-Fc расщепляли добавлением протеазы lgA (Roche Diagnostics GmbH) в соотношении 1:100 масс.(протеаза)/масс.(слитый полипептид) при 21°С в течение ночи. Расщепление контролировали аналитической гель-фильтрацией (SEC, Superdex 75; GE Healthcare). После расщепления рецептор FcгаммаRIIIa отделяли от протеазы lgA препаративной гель-фильтрацией на Superdex 75™ (GE Healthcare) и от Fc-метки посредством HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare). Гель аналитического SDS-PAGE показан на Фиг. 3.

Пример 7

Получение аффинной колонки с FcгаммаRIIIaV158

Аффинную колонку с FcгаммаRIIIaV158 получали посредством биотинилирования in vitro метки Avi и последующего связывания с сефарозой со стрептавидином. Это можно делать с использованием интактного слитого полипептида, а также с использованием рецептора после отщепления области Fc. Это очень быстрый и эффективный способ получения аффинной колонки для аналитических и препаративных целей.

Биотинилирование рецептора

Растворимый внеклеточный домен FcгаммаRIIIaV158 с меткой Avi, экспрессируемый в клетках HEK293, биотинилировали после очистки согласно следующему протоколу: от 1,2 до 12 мг FcгаммаRIIIaV158 или от 2,4 до 24 мг слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-область Fc метили в 2 мМ MOPS, 125 мМ NaCl, рН 7,2, 0,02% Tween и с одной таблеткой полного ингибитора протеаз (Roche) в 3 мл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), используя набор для биотинилирования от Avidity согласно инструкциям изготовителя. Реакцию биотинилирования осуществляли при комнатной температуре в течение ночи. Модифицированный полипептид диализировали против 20 мМ натрий-фосфатного буфера, 150 мМ NaCl, рН 7,5 при 4°С в течение ночи для удаления избытка биотина.

Связывание с сефарозой со стрептавидином

1 г сефарозы со стрептавидином (GE Healthcare) добавляли к биотинилированному и диализированному рецептору, инкубировали в течение 2 часов со встряхиванием и, наконец заполняли ими 1 мл колонку ХК (GE Healthcare).

Пример 8

Хроматографические методы

Общие условия:

Буфер для уравновешивания А: 20 мМ лимонная кислота/150 мМ NaCl, рН 6,0

Буфер для элюции Б: 20 мМ лимонная кислота/150 мМ NaCl, рН 3,0

Элюция:

5 мин 100% А

за 60 мин до 100% Б,

0,1 мин 100% Б,

6 мин 100% А

Количество образца: 50 мкг или более

Разделение фукозилированных и афукозилированных антител

Хроматография антител на колонке с FcγRIIIa позволяет количественно измерять полностью фукозилированную и афукозилированную фракцию антитела.

Афукозилированная фракция антитела коррелировала с ADCC препарата антитела.

На Фиг. 4 показано разделение и количественное измерение разных гликозилированных форм антитела против Her (дикого типа, сверху) и антитела против Her с модифицированным углеводным компонентом на колонке с Fc-FcγRIIIa. Время анализа могло быть сокращено путем модификации градиента при сохранении разрешения.

Сравнение аффинной колонки с использованием FcгаммаRIIIaV158 и FcгаммаRIIIaV158, меченного Fc

После связывания обеих конструкций рецептора в эквимолярных количествах аффинные колонки ведут себя одинаково при разделении полностью фукозилированных и афукозилированных антител (Фиг. 5: черный: FcгаммаRIIIaV158; синий: FcгаммаRIIIaV158-Fc).

Пример 9

Измерение взаимодействия FcYRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P329G с lgG

Система BIAcore® является общепринятой для исследования молекулярных взаимодействий. Она обеспечивает непрерывный мониторинг в реальном времени связывания лиганд/аналит и, таким образом, определение констант скорости ассоциации (k_a), констант скорости диссоциации (k_d) и констант равновесия (K_D). Изменения показателя преломления указывают на изменения массы на поверхности, вызванные взаимодействием иммобилизованного лиганда с аналитом, инъецированным в растворе. Если молекулы связываются с иммобилизованными лигандами на поверхности, масса возрастает, в случае диссоциации масса снижается.

Для определения активности слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Fc LALA P329G использовали прямой анализ связывания

Примерно 400 резонансных единиц (RU) системы захвата (20 мкг/мл набора для захвата человеческого Fab от GE Healthcare, 28-9583-25) связывали на чипе СМ5 (GE Healthcare BR1005-30) при рН 5,0 с использованием набора для аминного связывания, поставляемого GE. Образцом и буферной системой были HBS-P + рН 7,4 (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) поверхностно-активное вещество Р20). Температура проточной ячейки была установлена на уровне 25°С, и температура блока для образцов - 12°С. Антитело захватывали путем инъецирования 50 нМ раствора в течение 360 с при скорости тока 10 мкл/мин. Связывание измеряли путем инъекции 50 нМ слитого полипептида FcгаммаRIIIa в течение 180 с при скорости тока 50 мкл/мин для ассоциации и в течение 360 с для диссоциации: Поверхность регенерировали 60 с промывкой раствором глицина, рН 2,1 при скорости тока 20 мкл/мин. Для оценки активности сравнивали высоту сигналов конструкций и характеристики диссоциации.

Как показано на Фиг. 6, ответ слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Fc LALA P329G демонстрирует больше чем 100 единиц ответа по сравнению с FcгаммаRIIIaV158 c 40 RU.

Пример 10

Измерение кинетики взаимодействия слитого полипептида FcγRIIIaV158-Avi-сайт расщепления протеазы lgA-Fc LALA P329G с lgG до и после расщепления

Для определения активности расщепленного слитого полипептида FcгаммаRIIIaV158-Fc LALA P329G использовали прямой анализ связывания.

Примерно 400 резонансных единиц (RU) системы захвата (20 мкг/мл набора для захвата человеческого Fab от GE Healthcare, 28-9583-25) связывали на чипе СМ5 (GE Healthcare BR1005-30) при рН 5,0 с использованием набора для аминного связывания, поставляемого GE. Образцом и буферной системой были HBS-P + рН 7,4 (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,05% (об./об.) поверхностно-активное вещество Р20). Температура проточной ячейки была установлена на уровне 25°С, и температура блока для образцов - 12°С. Антитело захватывали путем инъецирования 50 нМ раствора в течение 80 с при скорости тока 10 мкл/мин.

Для измерения ассоциации через проточные ячейки пропускали разные концентрации антител, варьирующие от 0 до 250 нМ (разведения 1:2), со скоростью тока 30 мкл/мин при 25°С в течение 120 с. Фазу диссоциации отслеживали в течение 420 с путем переключения от раствора с образцом на промывочный буфер. Поверхность регенерировали 60 с промывкой раствором глицина, рН 2,1 при скорости тока 20 мкл/мин.

Общие различия показателя преломления корректировали путем вычитания ответа, полученого от поверхности без захваченного FcγRIIIaV158. Значения от инъекций пустого буфера также вычитали (двойной контроль).

Равновесную константу диссоциации (K_D), определенную как k_a/k_d, определяли проведением анализа кривых сенсограмм, полученных с несколькими разными концентрациями, используя программный пакет BIAevaluation. Аппроксимация данных подчинялась подходящей модели связывания. На Фиг. 7 показаны сенсограммы слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7а), рецептора Fcгамма V158 (Фиг. 7b), расщепленного слитого полипептида рецептор Fcгамма V158-Fc LALA P329G (Фиг. 7с).

Claims (49)

1. Слитый полипептид для получения растворимого Fc-рецептора согласно формуле I

,

в котором

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc, и

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2,

где R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы человеческого рецептора Fc гамма, человеческого неонатального рецептора Fc, мышиного рецептора Fc и кроличьего неонатального рецептора Fc, и

где FC представляет собой полипептид тяжелой цепи человеческого IgG1, который имеет мутации L234A, L235A и P329G.

2. Слитый полипептид для получения растворимого Fc-рецептора, характеризующийся тем, что данный слитый полипептид имеет формулу II

,

в котором

R1 обозначает первый рецептор Fc,

R2 обозначает второй рецептор Fc,

FC обозначает полипептид области Fc тяжелой цепи,

CS1 обозначает первый сайт расщепления,

CS2 обозначает второй сайт расщепления,

CS3 обозначает третий сайт расщепления,

CS4 обозначает четвертый сайт расщепления,

L1 обозначает первый линкер и

L2 обозначает второй линкер,

в котором присутствуют R1 или R2, или оба,

в котором любой из CS1, CS2, CS3, CS4, независимо от других, может присутствовать или отсутствовать,

в котором L1 и L2 могут независимо друг от друга присутствовать или отсутствовать, в котором FC по существу не связывается с R1 и/или R2,

где R1 и R2 независимо друг от друга выбирают из группы человеческого рецептора Fc гамма, человеческого неонатального рецептора Fc, мышиного рецептора Fc и кроличьего неонатального рецептора Fc, и

где FC представляет собой полипептид тяжелой цепи человеческого IgG1, который имеет мутации L234A, L235A и P329G.

3. Слитый полипептид по п. 1 или п. 2, характеризующийся тем, что человеческий рецептор Fc гамма выбран из человеческого FcγRI, человеческого FcγRII, человеческого FcγRIIA, человеческого FcγRIIB, человеческого FcγRIIC, человеческого FcγRIII, человеческого FcγRIIIA и человеческого FcγRIIIB.

4. Слитый полипептид по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что человеческий рецептор Fc гамма выбран из человеческого FcγRIA, человеческого FcγRIB, человеческого FcγRIC, человеческого FcγRIIA, человеческого FcγRIIA аллотип Н131, человеческого FcγRIIA аллотип R131, человеческого FcγRIIB, человеческого FcγRIIB-1, человеческого FcγRIIB-2, человеческого FcγRIIc, человеческого FcγRIIIA, человеческого FcγRIIIA аллотип V158, человеческого FcγRIIIA аллотип F158, человеческого FcγRIIIb, человеческого FcγRIIIb аллотип FcγRIIB-NA1, человеческого FcγRIIIb аллотип FcγRIIB-NA2, изоформы человеческого FcγR.

5. Слитый полпипетид по п. 3, характеризующийся тем, что человеческий рецептор Fc гамма представляет собой FcγRIIIaV158.

6. Димерный слитый полипептид для получения растворимого Fc-рецептора, содержащий два слитых полипептида по любому из пп. 1-5.

7. Слитый полипептид по п. 6, характеризующийся тем, что первый FC содержит мутацию T366W и возможно мутацию S354C, и второй FC содержит мутации T366S, L368A и Y407V и, возможно, мутацию Y349C.

8. Слитый полипептид по любому из пп. 6, 7, характеризующийся тем, что

a) R1 и R2 первого и второго полипептида являются идентичными,

б) R1 и R2 первого слитого полипептида являются идентичными, R1 и R2 второго слитого полипептида являются идентичными, но отличными от R1 и R2 первого слитого полипептида,

в) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными, и R2 первого и второго полипептида являются идентичными, но отличными от R1,

г) R1 первого и второго слитого полипептида являются идентичными и оба R2 отсутствуют,

д) R1 первого и второго слитого полипептида являются отличными и оба R2 отсутствуют,

е) R2 первого и второго слитого полипептида являются идентичными и оба R1 отсутствуют,

ж) R2 первого и второго слитого полипептида являются отличными и оба R1 отсутствуют,

з) R1 первого слитого полипептида и R2 второго полипептида являются отличными, R2 первого слитого полипептида отсутствует и R1 второго полипептида отсутствует.

9. Способ получения растворимого рецептора Fc, включающий следующие стадии:

а) культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый полипептид по любому из пп. 1-6,

б) выделение слитого полипептида из клетки или среды культивирования,

в) расщепление слитого полипептида протеазой,

и получение посредством этого растворимого рецептора Fc.

10. Применение иммобилизованного слитого полипептида по любому из пп. 1-8 в качестве лиганда аффинной хроматографии.

11. Применение иммобилизованного слитого полипептида по любому из пп. 1-8 для определения связывания антитела с рецептором Fc.

12. Применение по любому из пп. 10, 11, характеризующееся тем, что слитый полипептид связан с твердой фазой.

Images