RU2624214C1 - Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: cryopreservation of blood HSC is carried out by stages. Initially, a cryoprotective 10% solution of the DMSO cryoprotectant is mixed with a concentrate of nucleated cells in an elastic package and the adaptation of the prepared cell suspension is carried out for 10 minutes at a temperature of 4±1°C, bio-object freezing from +4±1°C to -80÷-196°C is carried out in the fast two-stage program mode. At the first stage of freezing, cold adaptation is performed at a temperature of -26÷-30°C, with aging duration of 25 minutes, at the second stage, the bioobject is quickly transferred to a storage facility with a temperature of -80÷-196°C. Granulated heat transfer medium consisting of dry, disinfected Lab Armor thermogranules with a specified temperature of +4±1°C and -28±2°C, respectively is used as the refrigerant at the stages of cell suspension mixing with cryopreservant and cold adaptation of the hematopoietic stem cells.

EFFECT: method for hematopoietic stem cells cryopreservation improves the sterility and number of morphologically preservative nucleated cells.

1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения различного происхождения. Принцип изобретения заключается в следующем: проводят смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, холодовую адаптацию при температуре +4±1°С в течение 10 мин, замораживание клеточной взвеси от +4±1°С до -80÷-196°С в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.The invention relates to medicine, namely to the technology of cryopreservation of human hematopoietic stem cells (HSC), and can be used in hematological, oncological, surgical and other centers for the treatment of patients with hematopoietic depression of various origins. The principle of the invention is as follows: they mix a cryoprotective 10% DMSO solution with a concentrate of nucleated cells in an elastic package, cold adaptation at a temperature of + 4 ± 1 ° C for 10 min, freeze the cell suspension from + 4 ± 1 ° C to -80 ÷ -196 ° C in the fast two-stage program mode, in which the first stage of freezing performs cold adaptation at a temperature of -26 ÷ -30 ° C with a holding time of 25 min, in the second stage, the biological object is quickly transferred to a storage with a temperature of -80 ÷ -196 ° C, while The granule coolant from the dry, disinfected Lab Armor thermogranules with a given temperature of + 4 ± 1 ° С and -28 ± 2 ° С, respectively, is the agent at the stages of mixing cell suspension with a cryopreservative and cold adaptation of hematopoietic stem cells.

Изобретение позволяет повысить технологичность способа криоконсервирования клеток, его безопасность для здоровья персонала, приготовить гарантированно максимальное количество стерильных и полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток с ГСК за счет замены токсичного жидкого хладагента в виде раствора этилового спирта 42-45 об.% на нетоксичный сухой теплоноситель в виде обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С или -28±2°С.The invention improves the manufacturability of the method of cryopreservation of cells, its safety for the health of personnel, to guarantee the maximum number of sterile and complete cryopreserved nucleated cells with HSCs by replacing toxic liquid refrigerant in the form of a solution of ethyl alcohol 42-45 vol.% With a non-toxic dry heat carrier in the form of disinfected Lab Armor thermogranules with the set temperature + 4 ± 1 ° С or -28 ± 2 ° С.

В технологии консервирования ГСК известны способы их криоконсервирования, например, см. пат. РФ №2569834, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток», опубл. 27.11.2015 г., Бюл. №33 и пат. РФ №2195111, A01N 1/02, «Способ криоконсервирования клеточных суспензий», опубл. 27.12.2002 г., Бюл. №36, который взят за прототип, предусматривает смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, поэтапное замораживание до -80°С с выдерживанием в морозильной камере в хладагенте в виде раствора этилового спирта 42-45 об.% с фиксированной температурой холодовой адаптации от -26 до -30°С в течение 25 мин, перемещение для замораживания в хранилище и последующее размораживание в водяной бане при 38-42°С до температуры клеточной взвеси 2-4°С.In the technology of conservation of HSCs, methods for their cryopreservation are known, for example, see US Pat. RF №2569834, A01N 1/02, "The method of cryopreservation of hematopoietic stem cells", publ. November 27, 2015, Bull. No. 33 and US Pat. RF №2195111, A01N 1/02, "Method of cryopreservation of cell suspensions", publ. 12/27/2002, bull. No. 36, which is taken as a prototype, involves mixing a cryoprotective 10% DMSO solution with a concentrate of nucleated cells in an elastic package, stage-by-stage freezing to -80 ° C with keeping in a freezer in the refrigerant in the form of a solution of ethyl alcohol 42-45 vol.% With fixed the temperature of cold adaptation from -26 to -30 ° C for 25 min, the movement for freezing in storage and subsequent thawing in a water bath at 38-42 ° C to a temperature of cell suspension of 2-4 ° C.

Недостатками такого способа криоконервирования ГСК являются: использование раствора этилового спирта 42÷45 об.% в качестве хладагента консервируемых клеток нежелательно из-за высокого токсического воздействия на клетки и организм человека в целом, а также профессиональная и бытовая вредность химического соединения.The disadvantages of this method of cryopreservation of HSCs are: the use of a solution of ethyl alcohol 42 ÷ 45 vol.% As a refrigerant of preserved cells is undesirable due to the high toxic effects on cells and the human body as a whole, as well as professional and domestic harmfulness of the chemical compound.

Цель изобретения: заменить раствор этилового спирта 42÷45 об.% на нетоксичный, сухой и стерильный хладагент, а также стандартизировать условия криоконсервирования ГСК человека.The purpose of the invention: to replace the solution of ethyl alcohol 42 ÷ 45 vol.% With non-toxic, dry and sterile refrigerant, as well as standardize the conditions for cryopreservation of human HSCs.

Техническим результатом предложенного решения является повышение технологичности и эффективности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современных технических средств.The technical result of the proposed solution is to increase the manufacturability and efficiency of cryopreservation of cell suspension using modern technical means.

Этот результат достигается за счет смешивания криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке и холодовой адаптации в течение 10 мин при температуре +4±1°С, последующего замораживания клеточной взвеси в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.This result is achieved by mixing a cryoprotective 10% DMSO solution with a concentrate of nucleated cells in an elastic package and cold adaptation for 10 min at a temperature of + 4 ± 1 ° C, followed by freezing of the cell suspension in a fast two-stage program, in which at the first stage of freezing carry out cold adaptation at a temperature of -26 ÷ -30 ° С with a holding time of 25 min; in the second stage, the biological object is quickly transferred to a storage with a temperature of -80 ÷ -196 ° С, while the refrigerant at the stages of Sewing cell suspension with a cryopreservative and cold adaptation of hematopoietic stem cells is a granular heat carrier from dry disinfected Lab Armor thermogranules with a set temperature of + 4 ± 1 ° С and -28 ± 2 ° С, respectively.

После отогревания в водяной бане все пробы консервированных ядросодержащих клеток были стерильны, количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 87,3±11,2%, устойчивостью к витальному красителю обладали 83,1±10,3 ядерных клеток крови.After heating in a water bath, all samples of canned nucleated cells were sterile, the number of morphologically preserved nuclear cells under these conditions was 87.3 ± 11.2%, 83.1 ± 10.3 nuclear blood cells had resistance to vital dye.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - приготовление взвеси ядросодержащих клеток с ГСК в эластичной упаковке; Б - поэтапное замораживание приготовленной взвеси в морозильной камере с выдерживанием упаковок в хладагенте при -26÷-30°С - фиксированной температуре холодовой адаптации продолжительностью 25 мин; В - замораживание и консервирование биообъекта в хранилище при температуре -80÷-196°C; Г - отогревание ГСК при +38-42°С.The essential features of the proposed method, which coincides with the known features, are: A - preparation of a suspension of nucleated cells with HSC in an elastic package; B - stage-by-stage freezing of the prepared suspension in the freezer with keeping the packages in the refrigerant at -26 ÷ -30 ° С - fixed temperature of cold adaptation lasting 25 minutes; B - freezing and preserving of a biological object in storage at a temperature of -80 ÷ -196 ° C; G - heating of HSC at + 38-42 ° C.

Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток являются: Д - использование для холодовой адаптации взвеси ядросодержащих клеток с ГСК в качестве хладагента гранулированного теплоносителя сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С; Е - подготовка гранулированного теплоносителя Lab Armor к работе включает сборку устройства для холодовой адаптации ГСК, состоящего из «Термоконтейнера ТМ-20», хладоэлементов МХД-2 с охлажденным раствором антифриза, обеспечивающих температуру +4°С или -28±2°С термогранулам Lab Armor массой 4 кг и консервируемым клеткам.Salient features of the method of cryopreservation of hematopoietic stem cells are: D - use for the cold adaptation of a suspension of nucleated cells with HSCs as a refrigerant granulated coolant dry disinfected Lab Armor thermogranules with a predetermined temperature of + 4 ± 1 ° C and -28 ± 2 ° C; E - preparation of granulated heat carrier Lab Armor for work includes the assembly of a device for cold adaptation of HSC, consisting of “Thermocontainer TM-20”, MHD-2 refrigerants with a cooled solution of antifreeze, providing a temperature of + 4 ° С or -28 ± 2 ° С for Lab thermogranules Armor weighing 4 kg and conserved cells.

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем (пример выполнения):The method of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells is as follows (example of execution):

- производят заготовку концентратов ядросодержащих клеток периферической крови с ГСК. Концентраты ядросодержащих клеток крови с ГСК получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартную эластичную полимерную упаковку, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты и герметизируют, после чего помещают в устройство для холодовой адаптации клеточной взвеси. Для холодовой адаптации ГСК поэтапно используют электрический морозильник на +4±1°С и «Термоконтейнер ТМ-20», выложенный изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором антифриза, гарантированно обеспечивающих температуру +4±1°С и -28±2°С вложенным в нее теплоносителю в виде сухих обеззараженных термогранул Lab Armor и консервируемому биообъекту;- produce the procurement of concentrates of nucleated cells of peripheral blood with HSC. Concentrates of nucleated blood cells with HSCs are obtained by separation on an Amicus apparatus in a volume of 38.0 to 81.0 (56.3 ± 7.3) ml in a standard flexible polymer packaging, from where they are transferred into plastic cryopackages in a closed way and sealed, after which placed in a device for cold adaptation of cell suspension. For cold adaptation, HSCs use an electric freezer at + 4 ± 1 ° С and a “ТМ-20 Thermocontainer”, laid out from the inside in the form of a rectangular cell with MHD-2 refrigerants with an antifreeze solution, guaranteeing a temperature of + 4 ± 1 ° С and -28 ± 2 ° C the heat carrier enclosed in it in the form of dry disinfected Lab Armor thermogranules and a preserved bioobject;

- производят сборку устройства для холодовой адаптации клеточной взвеси. Для этого используют «Термоконтейнер ТМ-20» для временного хранения и транспортирования термонеустойчивых медицинских и других препаратов, который выкладывают изнутри в виде прямоугольной ячейки хладоэлементами МХД-2 с раствором антифриза, предварительно охлажденных в электроморозильнике до +4±1°С или -28±2°С и гарантированно обеспечивающих заданную температуру в течение всего цикла холодовой адаптации биообъектов. Техническим носителем указанных температурных режимов являются сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor массой до 4 кг, которые помещают в ячейку устройства и покрывают эластичную упаковку с консервируемыми клетками слоем охлажденного теплоносителя толщиной от 3 до 5 см;- assemble the device for cold adaptation of cell suspension. For this, “Thermocontainer TM-20” is used for temporary storage and transportation of thermally unstable medical and other drugs, which are laid out from the inside in the form of a rectangular cell with MHD-2 cold elements with an antifreeze solution, previously cooled in an electric freezer to + 4 ± 1 ° C or -28 ± 2 ° C and guaranteed to provide a given temperature throughout the cycle of cold adaptation of biological objects. The technical carrier of these temperature conditions are dry disinfected Lab Armor thermogranules weighing up to 4 kg, which are placed in the device’s cell and cover the elastic packaging with preserved cells with a layer of chilled heat carrier with a thickness of 3 to 5 cm;

- готовят 10% раствор ДМСО и помещают его для охлаждения в бытовой электрический холодильник до температуры +4±1°С;- prepare a 10% DMSO solution and place it for cooling in a household electric refrigerator to a temperature of + 4 ± 1 ° C;

- производят подготовку полученной клеточной взвеси к замораживанию. Для этого клеточную взвесь в эластичном пластиковом криопакете погружают в слой теплоносителя толщиной от 3 до 5 см с заданной температурой +4±1°С, затем к ней порционно добавляют охлажденный до +4±1°С 10% раствор ДМСО, криопакет герметизируют, после чего клеточную взвесь подвергают холодовой адаптации при +4±1°С в течение 10 мин.- prepare the resulting cell suspension for freezing. For this, the cell suspension in an elastic plastic cryopackage is immersed in a coolant layer with a thickness of 3 to 5 cm with a predetermined temperature of + 4 ± 1 ° C, then a 10% solution of DMSO cooled to + 4 ± 1 ° C is added portionwise to it, the cryopackage is sealed, after whereby the cell suspension is subjected to cold adaptation at + 4 ± 1 ° C for 10 minutes

Далее взвесь ядросодержащих клеток с ГСК замораживают в режиме быстрой двухступенчатой программы. На первом этапе клеточную взвесь в эластичном пакете погружают в слой теплоносителя толщиной от 3 до 5 см с заданной температурой -28±2°С и выдерживают при ней в течение 25 мин. На втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С и в последующем взвесь клеток отогревают при +38-42°С до 2-4°С.Next, a suspension of nucleated cells with HSCs is frozen in a fast two-stage program. At the first stage, the cell suspension in an elastic bag is immersed in a coolant layer with a thickness of 3 to 5 cm with a predetermined temperature of -28 ± 2 ° C and kept there for 25 minutes. At the second stage, the biological object is quickly transferred to a storage with a temperature of -80 ÷ -196 ° С and in the subsequent suspension of cells is heated at + 38-42 ° С to 2-4 ° С.

После отогревания в водяной бане все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток при этих условиях составляло 87,3±11,2%, устойчивостью к витальному красителю обладали 83,1±10,3% ядерных клеток крови.After heating in a water bath, all samples of a suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells were sterile, the number of morphologically preserved nuclear cells under these conditions was 87.3 ± 11.2%, 83.1 ± 10.3% of nuclear cells had resistance to vital dye blood.

Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.A comparative analysis of the criteria used in assessing the claimed and known methods of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells is presented in table 1.

Таблица 1 - Сравнительный анализ способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток кровиTable 1 - Comparative analysis of the methods of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells

Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:The proposed "Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells" of blood compared with the prototype:

а) обладает повышенной технологичностью;a) has high manufacturability;

б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;b) provides sterility of cryopreserved cell suspension;

в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;c) ensures the morphological safety of a larger number of nuclear cells;

г) обеспечивает гарантированно высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.d) provides guaranteed high resistance to vital dye membranes of a larger number of cryopreserved nuclear cells.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.When using funds of scientific and technical literature, no equivalent solutions were found, which confirms the novelty of the proposed method for cryopreservation of hematopoietic blood stem cells.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.The use of simple techniques and available equipment confirms industrial applicability.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.The non-obviousness and original approach to solving the problem confirms the inventive step.

Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».The studies were performed on the basis of the laboratory for the preservation of blood and tissues, Federal State Budgetary Institution Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion FMBA of Russia.

Claims (1)

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток, включающий смешивание криозащитного 10% раствора ДМСО с концентратом ядросодержащих клеток в эластичной упаковке, холодовую адаптацию при температуре +4±1°С в течение 10 мин, замораживание клеточной взвеси от +4±1°С до -80÷-196°С в режиме быстрой двухступенчатой программы, при которой на первом этапе замораживания осуществляют холодовую адаптацию при температуре -26÷-30°С с продолжительностью выдерживания 25 мин, при втором этапе биообъект быстро переносят в хранилище с температурой -80÷-196°С, при этом хладагентом на этапах смешивания клеточной взвеси с криоконсервантом и холодовой адаптации гемопоэтических стволовых клеток является гранулированный теплоноситель из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1°С и -28±2°С соответственно.A method of cryopreservation of hematopoietic stem cells, comprising mixing a cryoprotective 10% DMSO solution with a concentrate of nucleated cells in an elastic package, cold adaptation at a temperature of + 4 ± 1 ° C for 10 min, freezing a cell suspension from + 4 ± 1 ° C to -80 ÷ -196 ° С in the fast two-stage program mode, in which at the first stage of freezing, cold adaptation is carried out at a temperature of -26 ÷ -30 ° С with a holding time of 25 min, in the second stage, the biological object is quickly transferred to the storage with temperature -80 ÷ -196 ° С, while the refrigerant at the stages of mixing cell suspension with a cryopreservative and cold adaptation of hematopoietic stem cells is a granular coolant from dry disinfected Lab Armor thermogranules with a set temperature of + 4 ± 1 ° С and -28 ± 2 ° С, respectively .