RU2569834C1 - Method for cryopreservation of haemopoietic stem cells - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: cryopreservation of haemopoietic stem cells is conducted by adding a shielding solution of the cryoprotector dimethyl sulphoxide into a suspension of nucleated cells with haemopoietic stem cells at temperature +4.0°C, preparing the produced suspension for freezing by cold adaptation at +4.0°C for 10 minutes. The stem cell suspension is frozen to temperature -196°C and further thawed. A cell suspension coolant represents Lab Armor dry antiseptic thermal beads having a pre-set temperature of +4±1°C.

EFFECT: high cryopreservation process level, sterility of the procedure, as well as high stability of the greater number of nucleated blood cells to a vital stain.

1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) крови человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения химиолучевого происхождения. Проводят добавление криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в окружении слоя толщиной 3 см из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±0,1°C. После холодовой адаптации криопакет с суспензией клеток герметизируют, помещают в металлический пенал-холдер, подвергают программному замораживанию до -196°C с последующим отогреванием биообъекта.The invention relates to medicine, namely to the technology of cryopreservation of hematopoietic stem cells (HSC) of human blood, and can be used in hematological, oncological, surgical and other centers for the treatment of patients with depression of hemopoiesis of chemoradiation origin. A cryoprotectant dimethyl sulfoxide (DMSO) is added to the concentrate of nucleated cells with HSCs and the media are mixed at + 4.0 ° C, programmed freezing of the cell suspension is from + 4.0 ° C to -196 ° C, followed by heating. Mixing of the media is carried out surrounded by a layer of a thickness of 3 cm from dry disinfected Lab Armor thermogranules with a given temperature of + 4 ± 0.1 ° C. After cold adaptation, a cryopackage with a suspension of cells is sealed, placed in a metal pencil holder, subjected to program freezing to -196 ° C, followed by heating of the biological object.

Изобретение позволяет повысить технологичность замораживания ГСК и их сохранность за счет обеспечения стерильности и сохранности максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.The invention improves the manufacturability of freezing HSCs and their safety by ensuring the sterility and safety of the maximum number of full cryopreserved nucleated cells.

В технологии консервирования гемопоэтических стволовых клеток известны способы их криоконсервирования, например, см. пп. РФ №246197 «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови» или №2233589, A01N 1/02, дата публикации патента 10.08.2004 г. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток человека», который взят за прототип, предусматривает добавление криопротектора - 10% раствора ДМСО в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в криопакете, который установлен в кристаллы замороженной воды (тающий лед или снег).In the technology of preservation of hematopoietic stem cells, methods for their cryopreservation are known, for example, see paragraphs. RF №246197 "Method of cryopreservation of hematopoietic cord blood stem cells" or No. 2233589, A01N 1/02, patent publication date 08/10/2004, "Method of cryopreservation of human hematopoietic stem cells", which is taken as a prototype, provides for the addition of a cryoprotectant - 10% solution DMSO into a concentrate of nucleated cells with HSCs and mixing the media at + 4.0 ° C, programmatically freeze the cell suspension from + 4.0 ° C to -196 ° C, followed by heating. The media are mixed in a cryopackage, which is installed in crystals of frozen water (melting ice or snow).

Недостатками такого способа криоконсервирования ядросодержащих клеток являются: способ нетехнологичен, использование в ледяной бане в качестве хладагента кристаллов замороженной воды для охлаждения критичной для ГСК экзотермической реакции, развивающейся в процессе добавления криопротектора - 10% ДМСО во взвесь ядросодержащих клеток, не только неудобно и непрактично, но и опасно из-за риска микробной контаминации биообъекта при контакте с каплями воды растаявших кристаллов льда (снега); способ не способен поддерживать во взвеси ядросодержащих клеток с ГСК температуру в диапазоне 4,0°±1°C на протяжении всего этапа подготовки к замораживанию и холодовой адаптации и не обеспечивает сохранность максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.The disadvantages of this method of cryopreservation of nucleated cells are: the method is not technologically advanced, the use of frozen water crystals as a coolant to cool an exothermic reaction critical for HSC, which develops when a cryoprotectant - 10% DMSO is added to a suspension of nucleated cells, is not only inconvenient and impractical, but and it is dangerous due to the risk of microbial contamination of a biological object when melted ice (snow) crystals come in contact with water drops; the method is not able to maintain a suspension in the suspension of nucleated cells with HSC temperature in the range of 4.0 ° ± 1 ° C throughout the entire preparation for freezing and cold adaptation and does not ensure the safety of the maximum number of full cryopreserved nucleated cells.

Техническим результатом предложенного решения является: повышение технологичности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современного промышленного оборудования, снижение риска инфицирования взвеси ГСК при добавлении к ней криопротектора ДМСО, повышение количества криоконсервированных ядросодержащих клеток, устойчивых к витальному красителю клеточной мембраны.The technical result of the proposed solution is: increasing the adaptability of cryopreservation of cell suspension using modern industrial equipment, reducing the risk of infection of HSC suspension by adding a DMSO cryoprotectant to it, increasing the number of cryopreserved nucleated cells resistant to vital dye of the cell membrane.

Этот результат достигается за счет помещения криопакета со взвесью ядросодержащих клеток в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4,0±1°C, после смешивания взвеси ядросодержащих клеток с криопротектором ДМСО и холодовой адаптации клеточной суспензии при +4,0°C в течение 10 мин осуществляют ее программное замораживание до -196°C с последующим отогреванием.This result is achieved by placing a cryopackage with a suspension of nucleated cells in the refrigerant from dry disinfected Lab Armor thermogranules with a set temperature of + 4.0 ± 1 ° C, after mixing the suspension of nucleated cells with a DMSO cryoprotectant and cold adaptation of the cell suspension at + 4.0 ° C for 10 min carry out its program freezing to -196 ° C, followed by heating.

После отогрева в водяной бане все пробы ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.After heating in a water bath, all samples of nucleated cells with hematopoietic stem cells were sterile, the number of morphologically preserved nuclear cells ranged from 95.3% to 98.6%, from 73.3% to 94.5% of nuclear cells were resistant to vital membrane dye. blood cells.

Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.The invention consists in the combination of essential features sufficient to achieve the technical result provided by the invention.

Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в суспензию ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C; Б - подготовка полученной смеси к замораживанию, включающая холодовую адаптацию суспензии при +4,0°C в течение 10 мин; В - многоэтапное замораживание суспензии со стволовыми клетками до температуры -196°C с последующим отогреванием.The essential features of the proposed method, which coincides with the known features, are: A - adding a cryoprotectant dimethyl sulfoxide enclosing solution to the suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells at a temperature of + 4.0 ° C; B - preparing the resulting mixture for freezing, including cold adaptation of the suspension at + 4.0 ° C for 10 minutes; B - multi-stage freezing of a suspension with stem cells to a temperature of -196 ° C, followed by heating.

Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови являются: Г - в качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C; Д - подготовка термогранул к работе включает фасовку изделий в стеклянные 250-500 мл флаконы и термообработку в сушильном шкафу при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4°C.The salient features of the cryopreservation method of hematopoietic blood stem cells are: G - dry disinfected Lab Armor thermogranules with a predetermined temperature of + 4 ± 1 ° C are used as a cell suspension refrigerant; D - preparation of thermogranules for work includes packing products in glass 250-500 ml bottles and heat treatment in an oven at a temperature of + 180 ° C for 5 minutes, followed by cooling to + 4 ° C.

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем. Перед криоконсервированием ГСК проводят подготовку клеточной суспензии, являющейся концентратом ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, к замораживанию. Концентрат ядросодержащих клеток получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартные полимерные контейнеры, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты, герметизируют, после чего переносят в емкость для охлаждения клеточной взвеси, помещают в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1,0°C. Для этого термогранулы фасуют в стеклянные 250-500 мл флаконы, подвергают термообработке в сушильном шкафе при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4C, достигают обеззараживания термогранул, после чего охлаждают до рабочей температуры +4°±1,0°C. Термогранулы, охлажденные до температуры +4±1,0°C, способны сохранить заданный температурный режим охлажденным клеткам в течение всего этапа подготовки к замораживанию. Далее суспензию ГСК замораживают поэтапно до - 196°C. После отогрева в водяной бане при +38°C все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, а устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.The method of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells is as follows. Before cryopreservation of HSCs, a cell suspension, which is a concentrate of nucleated cells with hematopoietic stem cells, is prepared for freezing. The concentrate of nucleated cells is obtained by separation on an Amicus apparatus in a volume of 38.0 to 81.0 (56.3 ± 7.3) ml into standard polymer containers, from where they are transferred into plastic cryopackages in a closed way, sealed, and then transferred to a container for cooling the cell suspension, is placed in the refrigerant from the dry disinfected Lab Armor thermogranules with the set temperature + 4 ± 1.0 ° C. To do this, the thermogranules are packed in 250-500 ml glass bottles, heat treated in an oven at a temperature of + 180 ° C for 5 min, followed by cooling to + 4C, the thermogranules are decontaminated, and then cooled to a working temperature of + 4 ° ± 1, 0 ° C. Thermogranules cooled to a temperature of + 4 ± 1.0 ° C are able to maintain a predetermined temperature regime for chilled cells during the entire stage of preparation for freezing. Next, the suspension of HSCs is frozen in stages to - 196 ° C. After heating in a water bath at + 38 ° C, all samples of the suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells were sterile, the number of morphologically preserved nuclear cells ranged from 95.3% to 98.6%, and resistance to vital membrane dye had from 73.3 % to 94.5% of nuclear blood cells.

Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.A comparative analysis of the criteria used in assessing the claimed and known methods of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells is presented in table 1.

Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:The proposed "Method of cryopreservation of hematopoietic stem cells" of blood compared with the prototype:

а) обладает повышенной технологичностью;a) has high manufacturability;

б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;b) provides sterility of cryopreserved cell suspension;

в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;c) ensures the morphological safety of a larger number of nuclear cells;

г) обеспечивает высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.g) provides high resistance to vital dye membranes of a larger number of cryopreserved nuclear cells.

При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.When using funds of scientific and technical literature, no equivalent solutions were found, which confirms the novelty of the proposed method for cryopreservation of hematopoietic blood stem cells.

Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.The use of simple techniques and available equipment confirms industrial applicability.

Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.The non-obviousness and original approach to solving the problem confirms the inventive step.

Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, гематологической клиники ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России» и кафедры физики и методики обучения физике факультета информатики, математики и физики ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет Минобрнауки России».The studies were carried out on the basis of the blood and tissue preservation laboratory, the hematology clinic of the Federal State Budgetary Scientific Institution Kirov Research Institute of Hematology and Blood Transfusion, Federal Medical and Biological Agency of Russia and the Department of Physics and Methods of Physics Education, Faculty of Informatics, Mathematics and Physics, Federal State Budgetary Educational Establishment of Higher Vocational Education Vyatka State Humanitarian University of the Russian Ministry of Education and Science.

Claims (1)

Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови, заключающийся в добавлении ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксида во взвесь ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C, подготовке полученной взвеси к замораживанию, включающей холодовую адаптацию при +4,0°C в течение 10 минут, и замораживание взвеси со стволовыми клетками до температуры -196°C с последующим отогреванием, отличающийся тем, что в качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C. The method of cryopreservation of hematopoietic blood stem cells, which consists in adding a dimethyl sulfoxide cryoprotectant enclosing solution to a suspension of nucleated cells with hematopoietic stem cells at a temperature of + 4.0 ° C, preparing the resulting suspension for freezing, including cold adaptation at + 4.0 ° C for 10 minutes, and freezing the suspension with stem cells to a temperature of -196 ° C, followed by heating, characterized in that as a coolant in the cell suspension use dry disinfected Lab Armor thermogranules with the set temperature + 4 ± 1 ° C.