RU2619170C2 - Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3 - Google Patents

Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3 Download PDF

Info

Publication number
RU2619170C2
RU2619170C2 RU2015139726A RU2015139726A RU2619170C2 RU 2619170 C2 RU2619170 C2 RU 2619170C2 RU 2015139726 A RU2015139726 A RU 2015139726A RU 2015139726 A RU2015139726 A RU 2015139726A RU 2619170 C2 RU2619170 C2 RU 2619170C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
arns3
per
recombinant
aphc3
gene
Prior art date
Application number
RU2015139726A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015139726A (ru
Inventor
Роман Станиславович Есипов
Дмитрий Александрович Макаров
Василий Николаевич Степаненко
Ярослав Алексеевич Андреев
Сергей Александрович Козлов
Евгений Васильевич Гришин
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2015139726A priority Critical patent/RU2619170C2/ru
Publication of RU2015139726A publication Critical patent/RU2015139726A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2619170C2 publication Critical patent/RU2619170C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к рекомбинантной плазмидной ДНК pER-АРНС3, обеспечивающей синтез гибридного полипептида, содержащего АРНС3 и мини-интеин Ssp DnaB, в клетках Escherichia coli. Указанная плазмидная ДНК содержит BsaBI/Eco0109I-фрагмент ДНК плазмиды pTWIN-1, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, NdeI/BamHI-фрагмент ДНК, содержащий ген мини-интеина Ssp DnaB и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного АРНС3. Плазмида также содержит ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-АРНС3 клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам, в качестве генетического маркера и уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз. Настоящее изобретение также раскрывает штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3, продуцирующий указанный гибридный полипептид. Настоящее изобретение также раскрывает способ получения указанного рекомбинантного белка АРНС3, предусматривающий культивирование указанного штамма Escherichia coli C3030/pER-APHC3. Настоящее изобретение позволяет получить рекомбинантный АРНС3 с высоким выходом и по упрощенной технологии. 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного АРНС3.
АРНС3 - это анальгетический полипептид актинии Heteractiscrispa. АРНС3 обладает трипсинингибирующей активностью, способен ингибировать in vitro болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, а также оказывает анальгетическое действие in vivo. Проявляемые им свойства позволяют применять данный полипептид для лечения заболеваний, связанных с воспалительными или нейропатологическими процессами, а также использовать как анальгетический агент.
АРНС3 представляет собой 56-членный полипептид (SEQ ID NO 2).
Известен метод выделения АРНС3 из природного источника (S.A. Kozlov, Ya, A. Andreev, А.N. Murashev, D.I. Skobtsov, I.A. D'yachenko, and E.V. Grishin. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2009, vol. 35, No. 6, pp. 711-719). Недостаток данного метода заключается в небольших выходах продукта и невозможности масштабировать выделение.
Прототип, наиболее близкий к заявленному для патентования способу получения АРНС3, описан в работе (Yaroslav A. Andreev, Sergey A. Kozlov, Yuliya V. Korolkova, Igor A. Dyachenko, Dmitrii A. Bondarenko, Denis I. Skobtsov, Arkadii N. Murashev, Polina D. Kotova, Olga A. Rogachevskaja, Natalia V. Kabanova, Stanislav S. Kolesnikov, and Eugene V. Grishin. MarDrugs. 2013 Dec; 11(12): 5100-5115). В данной работе пептид получали биотехнологическим методом с использованием экспрессии рекомбинантного гена в бактерии. В результате экспрессии гена синтезировался гибридный белок, состоящий из целевого пептида, тиоредоксина и аффинных меток. Недостаток данного метода заключается в необходимости использовать TEV-протеиназу для выделения из гибридного белка АРНС3.
Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный АРНС3 с высоким выходом и по упрощенной технологии.
Поставленная задача решается за счет того, что:
1. Конструируют экспрессионную плазмиду ДНК pER-АРНС3 путем клонирования гена АРНС3 в векторной плазмидер TWIN1.
2. Путем трансформации плазмидной ДНК pER-АРНС3 клеток Escherichia coli С3030 получают штамм-продуцент.
3. При индуцированном культивировании штамм-продуцента происходит биосинтез рекомбинантной гибридного белка DnaBAPHC3 в виде телец включения, содержащего наряду с АРНС3 и последовательность мини-интеина Ssp DnaB.
4. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе и выделяют осадок, содержащий гибридный белок АРНС3. Гибридный белок АРНС3 экстрагируют из телец включения буферным раствором (50 мМ Трис/HCl, 2 М мочевина, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 0,5 ДТТ, pH 10) центрифугируют и выделяют супернатант. Супернатант растворяют в ренатурирующем буфере (100 мМ Трис/HCl, 10 мМ глицерин, 1 мМ PMSF). Доводят pH раствора соляной кислотой до 7.2, тем самым инициируя автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течение 48 ч. Доводят pH раствора соляной кислотой до 3.0 и инкубируют при 8°С 24 ч. Центрифугируют и супернатант наносят на ионообменную смолу. Элюируют белок ступенью буфера 50 мМ MES, 1,5 М NaCl, pH 5,5-5,6. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного АРНС3 проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификация образующегося рекомбинантного АРНС3 проведена с помощью масс-спектрометрии.
Техническим результатом автокаталитического расщепления гибридного белка является образование АРНС3, выход которого достигает 10% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.
Чтобы избежать трудностей, связанных с расщеплением рекомбинантного гибридного белка с помощью различных протеаз, таких как энтерокиназа, фактор X и др., а также с целью удешевления этой стадии мы использовали в составе гибридного белка мини-интеин dnaB из Synechocystissp. (Wu, Н., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-4327) для направленного автокаталитического расщепления гибрида на целевой полипептид и интеин. Для этой цели амплифицируют ген АРНС3 (SEQ ID NO 1) с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном АРНС3, и клонировали его в векторной плазмиде pTWIN1, содержащей ген интеина из Synechocystissp. dnaB (Wu, Н., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-432.; Evans, J, T.C., Bermer, J., Xu, M.-Q., (1999) J. Biol. Chem., 274, 18359-18363), по сайтам рестриктаз SapI и BamHI. Полученной экспрессионной плазмидой pER-АРНС3, строение которой приведено на фиг. 1, трансформировали клетки E.coli С3030. Образующийся при экспрессии рекомбинантного гена гибридный белок DnaBAPHC3 способен к автокаталитическому расщеплению на АРНС3 и интеин. Выход АРНС3 высокой степени чистоты (98%) после обращенно-фазовой хроматографии достигает 10% относительно суммарного белка клетки.
В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli С3030, содержащий плазмидную ДНК pER-АРНС3 для суперпродукции гибридного белка DnaBAPHC3, содержащего последовательность АРНС3 и интеин Ssp dnaB.
Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-АРНС3
- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного АРНС3;
- состоящую из:
BsaBI/Eco0109I-фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pTWIN1 (фирма NewEnglandBiolabs), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, NdeI/BamHI-фрагмент ДНК, содержащего ген мини-интеина DnaB и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного АРНС3,
- содержащую:
в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pER-АРНС3 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI-NdeI-: 849 п.о., XbaI - 888 п.о., EcoRV - 2921 п.о., HpaI - 2977 п.о.
Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pER-АРНС3 обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка DnaBAPHC3, содержащего на 3'-конце ген АРНС3, соединенного с геном SspDnaB. Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.
Ген АРНС3 получают амплификацией участка плазмиды (Yaroslav A. Andreev, Sergey А. Kozlov, Yuliya V. Korolkova, Igor A. Dyachenko, Dmitrii A. Bondarenko, Denis I. Skobtsov, Arkadii N. Murashev, Polina D. Kotova, Olga A. Rogachevskaja, Natalia V. Kabanova, Stanislav S. Kolesnikov, and Eugene V. Grishin. MarDrugs. 2013 Dec; 11(12): 5100-5115).
Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты эндонуклеаз рестриции, введены с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и Bl (SEQ ID NO 3) и затем ген клонируют в векторную плазмиду pTWIN1.
Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli С3030/pER-АРНС3 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.
Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.
Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).
Штамм-продуцент E.coli С3030/pER-АРНС3 отличается от штамма-реципиента E.coli С3030 только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pER-АРНС3, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.
Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток E.coli С3030 соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.
Клетки E.coli С3030/pER-АРНС3 являются суперпродуцентами. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка DnaBAPHC3, который накапливается в клетках в количестве 20% суммарного белка клетки в растворимом виде.
Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-АРНС3, для чего ген рекомбинантного АРНС3 амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 3), содержащими сайты рестриктаз SapI (N-конец гена, праймер А1) и BamHI (С - конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pTWIN1. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli С3030 и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.
Штамм-продуцент E.coli C3030/pER-АРНС3 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.
На (SEQIDNO 1) изображена структура гена рекомбинантного АРНС3. На (SEQIDNO 2) изображена аминокислотная последовательность рекомбинантного АРНС3.
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.
Фиг. 1 - Физическая карта плазмиды pER-АРНС3.
Фиг. 2 - Электрофорграммализата клеток штамма-продуцента E.coli С3030/pER-АРНС3.
Фиг. 3 - Профиль аналитической ВЭЖХ рекомбинантного АРНС3.
Фиг. 4 - Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного АРНС3.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, pH 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой SapI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой BamHII (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку Nucleo Spin ExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Для приготовления гена АРНС3 проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном АРНС3 (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 и В1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку Nucleo Spin ExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.
Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного АРНС3 в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli С3030. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pER-АРНС3 и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI, BamHI. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pER-АРНС3 представлена на фиг. 1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации пзамиды. ApR - ген устойчивости к ампицилину. Lad - ген репрессора лактозного оперона. DnaBAPHC3 - ген рекомбинантного белка, кодирующий АРНС3 и интеин DnaB.
Пример 2
Получение штамма-продуцента E.coli C3030/pER-АРНС3 и определение его продуктивности
Штамм-продуцент E.coli C3030/pER-АРНС3 получают трансформацией компетентных клеток E.coli С3030 плазмидой pER-АРНС3, как описано в примере 1.
Штамм продуцента E.coli C3030/pER-АРНС3 выращивают при 37°С в 100 мл LB-бульона (pH 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. На фиг 2. представлена электрофорграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli C3030/pER-АРНС3, где М - стандарт молекулярных масс, L - лизат клеток, С - расщепление гибридного белка, 1 - гибридный белок, содержащий АРНС3, 2 - интеин Dnab.
Пример 3
Получение гибридного белка АРНС3, его автокаталитическое расщепление и выделение рекомбинантного АРНС3
После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Tris/HCl, 10 mMEDTA, 1 mMPMSF) и выделяют центрифугированием (15000 g, 45 мин) осадок. Гибридный белок экстрагируют из телец включения буферным раствором (50 мМ Трис/HCl, 2 М мочевина, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 0,5 ДТТ, pH 10) центрифугируют и выделяют супернатант. Супернатант растворяют в ренатурирующем буфере (100 мМ Трис/HCl, 10 мМ глицерин, 1 мМ PMSF). Доводят pH раствора соляной кислотой до 7.2, тем самым инициируя автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течение 48 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим нагревают 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Ha Фиг. 2 представлено расщепление гибридного белка. После инкубирования при 22°С в течение 48 ч доводят pH раствора соляной кислотой до 3.0 и инкубируют при 8°С 24 ч. Центрифугируют и супернатант наносят на ионообменную смолу. Элюируют белок ступенью буфера 50 мМ MES, 1,5 М NaCl, pH 5,5-5,6. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного АРНС3 проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификацию образующегося рекомбинантного АРНС3 проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilenttechnologies 6224. Полученный сигнал рекомбинантного АРНС3 соответствует расчетному значению массы 6111 Да. На фиг. 3 представлен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ АРНС3. На Фиг. 4 представлен масс-спектр АРНС3.
Пример 4
Тестирование анальгетической активности АРНС3 на мышах в тесте горячая пластина
Мышей делят на 2 группы (контрольную и экспериментальную) по 10 особей в каждой. Тесты проводят на самцах белых мышей линии CD-1 массой 20-30 г. Болевое раздражение моделируют, помещая мышь на металлическую поверхность, разогретую до 55°С. Для предотвращения ожогов лап время воздействия раздражения ограничивают 180 секундами. Тестируемые образцы растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,1 мг/кг внутривенно. Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента первого облизывания задней лапы. Измерение болевой чувствительности проводят через 15 минут после введения препарата. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью ANOVA и теста Тьюки. Полученный рекомбинантный пептид в данной концентрации увеличивает измеряемое время не менее чем на 50%.

Claims (3)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-АРНС3 для экспрессии гибридного полипептида DnaBAPHC3, содержащего АРНС3, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и мини-интеина Ssp DnaB, содержащая BsaBI/Eco0109I-фрагмент ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащий промотор и терминатор траснкрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, NdeI/BamHI-фрагмент ДНК, содержащий ген мини-интеина Ssp DnaB и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного АРНС3, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1, ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-АРНС3 клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам, в качестве генетического маркера и уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI-NdeI - 849 п.о., Xba - 888 п.о., EcoRV - 2921 п.о., HpaI - 2977 п.о
2. Штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3, продуцирующий гибридный полипептид DnaBAPHC3, содержащий аминокислотные последовательности АРНС3 и мини-интеина Ssp DnaB, полученный путем трансформации клеток штамма Escherichia coli С3030 рекомбинантной плазмидной ДНК pER - АРНС3 по п. 1.
3. Способ получения рекомбинантного АРНС3 с SEQ ID NO: 2, включающий трансформацию штамма Escherichia coli С3030 полученной плазмидной ДНК pER-АРНС3 по п. 1, культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli C3030/pER-APHC3 по п. 2, отделение гибридного белка в виде телец включения после разрушения клеток, экстракцию гибридного белка из телец включения, разбавление в ренатурационном буфере, инкубирование раствора при значении рН 7,2 и температуре 22°С, инкубирование раствора белка при 8°С и значении рН 3,0, центрифугирование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку целевого продукта.
RU2015139726A 2015-09-18 2015-09-18 Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3 RU2619170C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015139726A RU2619170C2 (ru) 2015-09-18 2015-09-18 Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015139726A RU2619170C2 (ru) 2015-09-18 2015-09-18 Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015139726A RU2015139726A (ru) 2016-02-10
RU2619170C2 true RU2619170C2 (ru) 2017-05-12

Family

ID=55313274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015139726A RU2619170C2 (ru) 2015-09-18 2015-09-18 Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2619170C2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235983A1 (ru) 2020-05-20 2021-11-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) Средство пролонгированного анальгетического действия

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2435858C2 (ru) * 2009-10-23 2011-12-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Hir, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА, ШТАММ Escherichia coli ER2566/pER-Hir-ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА
EP2665744B1 (en) * 2011-01-20 2015-04-08 University Of Rochester Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2435858C2 (ru) * 2009-10-23 2011-12-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Hir, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА, ШТАММ Escherichia coli ER2566/pER-Hir-ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО [Leu1, Thr2]-63-ДЕСУЛЬФАТОГИРУДИНА
EP2665744B1 (en) * 2011-01-20 2015-04-08 University Of Rochester Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOZLOV S.A., et al., New polypeptide components from Heteractis crispa sea anemone with analgesic activity, Bioorganicheskaia Khimiia, 2009, 35(6), pp.789-798. SUN Z., et al., Use of Ssp dnaB derived mini-intein as a fusion partner for production of recombinant human brain natriuretic peptide in Escherichia coli, Protein Expr Purif, 2005, 43(1), pp.26-32. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235983A1 (ru) 2020-05-20 2021-11-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) Средство пролонгированного анальгетического действия

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015139726A (ru) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200325462A1 (en) Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
KR102623312B1 (ko) Ruvc 도메인이 존재하는 효소
KR102647766B1 (ko) 클래스 ii, 타입 v crispr 시스템
KR102369533B1 (ko) 뉴클레아제 프로파일링 시스템
US5856090A (en) DNA-methylase linking reaction
US20230076421A1 (en) Methods and compositions for manufacturing polynucleotides
JP7093417B2 (ja) ヌクレアーゼシステムのノッキングアウトによるインビトロ生合成活性の調節方法
RU2619170C2 (ru) Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3
JP2023539237A (ja) カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法
JP2002541861A (ja) ｍＲＮＡキャップ形成の薬理学的ターゲティング
JP2023542976A (ja) カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法
US8372601B2 (en) Compositions and methods for the synthesis of APPA-containing peptides
KR100888513B1 (ko) 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법
RU2700452C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк ptrx-tevrs-ртн, кодирующая гибридный белок, способный к протеолитическому расщеплению с образованием фрагмента эндогенного человеческого паратиреоидного гормона (1-34), штамм escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-ртн - продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного pth (1-34)
JP3822006B2 (ja) シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法
RU2593172C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TA1 GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА α1 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА α1 ЧЕЛОВЕКА
RU2302465C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА
KR100752683B1 (ko) 발리엔아민 생합성에 관여하는 발리오론 생합성 효소, 이의유전자, 프라이머쌍 및 이를 이용한 발리오론 생합성효소의 생산방법
KR101039596B1 (ko) 새로운 인 비보 단백질 발현 방법
RU2592860C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, КОДИРУЮЩАЯ СЕРИНОВУЮ АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗУ, СПОСОБНУЮ in vivo АЦЕТИЛИРОВАТЬ N-КОНЦЕВОЙ СЕРИН ДЕЗАЦЕТИЛТИМОЗИНА β4 И ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ТИМОЗИНА β4 ЧЕЛОВЕКА, ШТАММ Eschrichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННЫХ БЕЛКОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ТИМОЗИНА β4 ЧЕЛОВЕКА
RU2188234C2 (ru) Способ получения рекомбинантной тимидин-фосфорилазы, рекомбинантная плазмидная днк pertpho1 и штамм escherichia coli bl21(de3)/pertpho1-продуцент тимидин-форфорилазы
van Heeke et al. Expression of human asparagine synthetase in Saccharomyces cerevisiae
TWI537382B (zh) 有氧下可提升重組蛋白質表現的菌株
RU2233879C1 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк pes1-6, кодирующая полипептид соматотропин, и штамм escherichia coli bl 21(de3)/pes1-6-продуцент рекомбинантного соматотропина
CN114438065B (zh) 喹啉酸中间产物6-羟基喹啉酸脱羧酶QuiB及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190816

Effective date: 20190816

QC41 Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190816

Effective date: 20211209