RU2619170C2 - RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION - Google Patents

RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION Download PDF

Info

Publication number
RU2619170C2
RU2619170C2 RU2015139726A RU2015139726A RU2619170C2 RU 2619170 C2 RU2619170 C2 RU 2619170C2 RU 2015139726 A RU2015139726 A RU 2015139726A RU 2015139726 A RU2015139726 A RU 2015139726A RU 2619170 C2 RU2619170 C2 RU 2619170C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
arns3
per
recombinant
aphc3
gene
Prior art date
Application number
RU2015139726A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2015139726A (en
Inventor
Роман Станиславович Есипов
Дмитрий Александрович Макаров
Василий Николаевич Степаненко
Ярослав Алексеевич Андреев
Сергей Александрович Козлов
Евгений Васильевич Гришин
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2015139726A priority Critical patent/RU2619170C2/en
Publication of RU2015139726A publication Critical patent/RU2015139726A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2619170C2 publication Critical patent/RU2619170C2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: invention refers to biochemistry, namely to recombinant plasmid DNA pER-ARNS3 providing the synthesis of a hybrid polypeptide comprising ARNS3 and mini-intein Ssp DnaB, in Escherichia coli cells. The said plasmid DNA comprises BsaBI/Eco0109I-DNA plasmid fragment pTWIN-1 gene translation amplifier 10 of phage T7, NdeI/BamHI-DNA fragment containing the mini-intein gene Ssp DnaB and sequence of ARNS3 recombinant gene adapted to these sites. The plasmid also contains a b-lactamase gene that determines the resistance of E. coli cells transformed by plasmid pER-ARNS3 to penicillin antibiotics, as a genetic marker and unique restriction endonuclease recognition sites. This invention also discloses a strain of Escherichia coli C3030/pER-ARNS3, producing the said fusion polypeptide. This invention also discloses a method for production of the said ARNS3 recombinant protein, comprising culturing of the said strain of Escherichia coli C3030/pER-ARNS3.
EFFECT: invention provides recombinant ARNS3 with high yield according to a simplified technology.
3 cl, 4 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного АРНС3.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic and protein engineering. It can be used to produce recombinant APHC3.

АРНС3 - это анальгетический полипептид актинии Heteractiscrispa. АРНС3 обладает трипсинингибирующей активностью, способен ингибировать in vitro болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, а также оказывает анальгетическое действие in vivo. Проявляемые им свойства позволяют применять данный полипептид для лечения заболеваний, связанных с воспалительными или нейропатологическими процессами, а также использовать как анальгетический агент.APCS3 is the analgesic actinia polypeptide of Heteractiscrispa. ARNS3 has trypsin-inhibiting activity, is able to inhibit the in vitro pain vanilloid receptor TRPV1, and also has an analgesic effect in vivo. The properties shown by him allow the use of this polypeptide for the treatment of diseases associated with inflammatory or neuropathological processes, as well as use as an analgesic agent.

АРНС3 представляет собой 56-членный полипептид (SEQ ID NO 2).APCS3 is a 56-membered polypeptide (SEQ ID NO 2).

Известен метод выделения АРНС3 из природного источника (S.A. Kozlov, Ya, A. Andreev, А.N. Murashev, D.I. Skobtsov, I.A. D'yachenko, and E.V. Grishin. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2009, vol. 35, No. 6, pp. 711-719). Недостаток данного метода заключается в небольших выходах продукта и невозможности масштабировать выделение.A known method for the isolation of ARNS3 from a natural source (SA Kozlov, Ya, A. Andreev, A.N. Murashev, DI Skobtsov, IA D'yachenko, and EV Grishin. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2009, vol. 35, No. 6 , pp. 711-719). The disadvantage of this method is the small product yields and the inability to scale the selection.

Прототип, наиболее близкий к заявленному для патентования способу получения АРНС3, описан в работе (Yaroslav A. Andreev, Sergey A. Kozlov, Yuliya V. Korolkova, Igor A. Dyachenko, Dmitrii A. Bondarenko, Denis I. Skobtsov, Arkadii N. Murashev, Polina D. Kotova, Olga A. Rogachevskaja, Natalia V. Kabanova, Stanislav S. Kolesnikov, and Eugene V. Grishin. MarDrugs. 2013 Dec; 11(12): 5100-5115). В данной работе пептид получали биотехнологическим методом с использованием экспрессии рекомбинантного гена в бактерии. В результате экспрессии гена синтезировался гибридный белок, состоящий из целевого пептида, тиоредоксина и аффинных меток. Недостаток данного метода заключается в необходимости использовать TEV-протеиназу для выделения из гибридного белка АРНС3.The prototype closest to the patented method for producing ARNS3 is described in (Yaroslav A. Andreev, Sergey A. Kozlov, Yuliya V. Korolkova, Igor A. Dyachenko, Dmitrii A. Bondarenko, Denis I. Skobtsov, Arkadii N. Murashev , Polina D. Kotova, Olga A. Rogachevskaja, Natalia V. Kabanova, Stanislav S. Kolesnikov, and Eugene V. Grishin. MarDrugs. 2013 Dec; 11 (12): 5100-5115). In this work, the peptide was obtained by a biotechnological method using the expression of a recombinant gene in bacteria. As a result of gene expression, a hybrid protein was synthesized consisting of the target peptide, thioredoxin and affinity tags. The disadvantage of this method is the need to use TEV proteinase to isolate APH3 from the fusion protein.

Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный АРНС3 с высоким выходом и по упрощенной технологии.The invention solves the problem of obtaining highly productive recombinant bacterial producer strain, allowing to obtain recombinant ARHC3 in high yield and by simplified technology.

Поставленная задача решается за счет того, что:The problem is solved due to the fact that:

1. Конструируют экспрессионную плазмиду ДНК pER-АРНС3 путем клонирования гена АРНС3 в векторной плазмидер TWIN1.1. The expression plasmid pER-APHC3 DNA was constructed by cloning the APHC3 gene into the TWIN1 vector plasmid.

2. Путем трансформации плазмидной ДНК pER-АРНС3 клеток Escherichia coli С3030 получают штамм-продуцент.2. By transforming the plasmid DNA pER-APHC3 of Escherichia coli C3030 cells, a producer strain is obtained.

3. При индуцированном культивировании штамм-продуцента происходит биосинтез рекомбинантной гибридного белка DnaBAPHC3 в виде телец включения, содержащего наряду с АРНС3 и последовательность мини-интеина Ssp DnaB.3. In the induced cultivation of the producer strain, the biosynthesis of the recombinant fusion protein DnaBAPHC3 takes place in the form of inclusion bodies containing, along with APCS3, the Ssp DnaB mini-intein sequence.

4. Клеточную биомассу разрушают в буферном растворе и выделяют осадок, содержащий гибридный белок АРНС3. Гибридный белок АРНС3 экстрагируют из телец включения буферным раствором (50 мМ Трис/HCl, 2 М мочевина, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 0,5 ДТТ, pH 10) центрифугируют и выделяют супернатант. Супернатант растворяют в ренатурирующем буфере (100 мМ Трис/HCl, 10 мМ глицерин, 1 мМ PMSF). Доводят pH раствора соляной кислотой до 7.2, тем самым инициируя автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течение 48 ч. Доводят pH раствора соляной кислотой до 3.0 и инкубируют при 8°С 24 ч. Центрифугируют и супернатант наносят на ионообменную смолу. Элюируют белок ступенью буфера 50 мМ MES, 1,5 М NaCl, pH 5,5-5,6. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного АРНС3 проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификация образующегося рекомбинантного АРНС3 проведена с помощью масс-спектрометрии.4. Cell biomass is destroyed in the buffer solution and a precipitate containing the APH3 fusion protein is isolated. The APPC3 fusion protein is extracted from inclusion bodies with a buffer solution (50 mM Tris / HCl, 2 M urea, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5 DTT, pH 10) centrifuged and the supernatant is isolated. The supernatant was dissolved in a renaturing buffer (100 mM Tris / HCl, 10 mM glycerol, 1 mM PMSF). The pH of the solution was adjusted with hydrochloric acid to 7.2, thereby initiating the autocatalytic cleavage of the hybrid protein, and incubated at 22 ° C for 48 hours. The pH of the solution was adjusted with hydrochloric acid to 3.0 and incubated at 8 ° C for 24 hours. The solution was centrifuged and the supernatant was applied to an ion exchange resin . The protein is eluted with a buffer step of 50 mM MES, 1.5 M NaCl, pH 5.5-5.6. Further purification and analysis of recombinant APCS3 is carried out by reverse phase chromatography. The identification of the resulting recombinant ARNS3 was carried out using mass spectrometry.

Техническим результатом автокаталитического расщепления гибридного белка является образование АРНС3, выход которого достигает 10% относительно суммарного белка клетки при чистоте препарата не ниже 98%.The technical result of the autocatalytic cleavage of the hybrid protein is the formation of APHC3, the yield of which reaches 10% relative to the total cell protein with a drug purity of at least 98%.

Чтобы избежать трудностей, связанных с расщеплением рекомбинантного гибридного белка с помощью различных протеаз, таких как энтерокиназа, фактор X и др., а также с целью удешевления этой стадии мы использовали в составе гибридного белка мини-интеин dnaB из Synechocystissp. (Wu, Н., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-4327) для направленного автокаталитического расщепления гибрида на целевой полипептид и интеин. Для этой цели амплифицируют ген АРНС3 (SEQ ID NO 1) с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном АРНС3, и клонировали его в векторной плазмиде pTWIN1, содержащей ген интеина из Synechocystissp. dnaB (Wu, Н., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-432.; Evans, J, T.C., Bermer, J., Xu, M.-Q., (1999) J. Biol. Chem., 274, 18359-18363), по сайтам рестриктаз SapI и BamHI. Полученной экспрессионной плазмидой pER-АРНС3, строение которой приведено на фиг. 1, трансформировали клетки E.coli С3030. Образующийся при экспрессии рекомбинантного гена гибридный белок DnaBAPHC3 способен к автокаталитическому расщеплению на АРНС3 и интеин. Выход АРНС3 высокой степени чистоты (98%) после обращенно-фазовой хроматографии достигает 10% относительно суммарного белка клетки.To avoid the difficulties associated with the cleavage of the recombinant fusion protein using various proteases, such as enterokinase, factor X, etc., as well as to reduce the cost of this stage, we used the mini-intein dnaB from Synechocystissp as part of the fusion protein. (Wu, N., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-4327) for targeted autocatalytic cleavage of a hybrid into a target polypeptide and intein. For this purpose, the APHC3 gene (SEQ ID NO 1) is amplified by PCR using a plasmid with the artificial APHC3 gene as a template and cloned into the vector plasmid pTWIN1 containing the intein gene from Synechocystissp. dnaB (Wu, H., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-432; Evans, J, TC, Bermer, J., Xu , M.-Q., (1999) J. Biol. Chem., 274, 18359-18363), at the restriction enzyme sites SapI and BamHI. The resulting expression plasmid pER-APHC3, the structure of which is shown in FIG. 1, transformed E. coli C3030 cells. The DnaBAPHC3 fusion protein resulting from expression of the recombinant gene is capable of autocatalytic cleavage into APHC3 and intein. The yield of high purity ARNS3 (98%) after reverse phase chromatography reaches 10% relative to the total cell protein.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli С3030, содержащий плазмидную ДНК pER-АРНС3 для суперпродукции гибридного белка DnaBAPHC3, содержащего последовательность АРНС3 и интеин Ssp dnaB.The proposed technical solution uses a producer strain of Escherichia coli C3030 containing plasmid DNA pER-APHC3 for superproduction of the fusion protein DnaBAPHC3 containing the sequence APHC3 and intein Ssp dnaB.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-АРНС3Use recombinant plasmid DNA pER-APHC3

- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного АРНС3;- the coding amino acid sequence of recombinant APHC3;

- состоящую из:- consisting of:

BsaBI/Eco0109I-фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pTWIN1 (фирма NewEnglandBiolabs), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, NdeI/BamHI-фрагмент ДНК, содержащего ген мини-интеина DnaB и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного АРНС3,The BsaBI / Eco0109I DNA fragment of the commercial plasmid pTWIN1 (NewEnglandBiolabs), containing the T7 RNA polymerase promoter and transcriptional terminator, T7 phage 10 gene translation enhancer, NdeI / BamHI DNA fragment containing the DnaB mini-intein gene and adapted to it recombinant APHC3 gene sequence,

- содержащую:- containing:

в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pER-АРНС3 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;as a genetic marker, the β-lactamase gene, which determines the resistance of E. coli cells transformed with the plasmid pER-APHC3 to penicillin antibiotics;

уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI-NdeI-: 849 п.о., XbaI - 888 п.о., EcoRV - 2921 п.о., HpaI - 2977 п.о.unique recognition sites for restriction endonucleases located to the left of the BamHI-NdeI- site: 849 bp, XbaI - 888 bp, EcoRV - 2921 bp, HpaI - 2977 bp

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pER-АРНС3 обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка DnaBAPHC3, содержащего на 3'-конце ген АРНС3, соединенного с геном SspDnaB. Для конструирования плазмиды используют химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.The design of the recombinant plasmid DNA pER-APHC3 provides a high level of expression of the DnaBAPHC3 fusion protein gene cloned therein containing the APHC3 gene connected to the SspDnaB gene at the 3'-end. To construct a plasmid, a chemical approach is used, which allows the use of optimal regulatory elements that control its expression for the expression of the cloned structural gene.

Ген АРНС3 получают амплификацией участка плазмиды (Yaroslav A. Andreev, Sergey А. Kozlov, Yuliya V. Korolkova, Igor A. Dyachenko, Dmitrii A. Bondarenko, Denis I. Skobtsov, Arkadii N. Murashev, Polina D. Kotova, Olga A. Rogachevskaja, Natalia V. Kabanova, Stanislav S. Kolesnikov, and Eugene V. Grishin. MarDrugs. 2013 Dec; 11(12): 5100-5115).The ARNS3 gene is obtained by amplification of a plasmid site (Yaroslav A. Andreev, Sergey A. Kozlov, Yuliya V. Korolkova, Igor A. Dyachenko, Dmitrii A. Bondarenko, Denis I. Skobtsov, Arkadii N. Murashev, Polina D. Kotova, Olga A. Rogachevskaja, Natalia V. Kabanova, Stanislav S. Kolesnikov, and Eugene V. Grishin. MarDrugs. 2013 Dec; 11 (12): 5100-5115).

Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты эндонуклеаз рестриции, введены с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами А1 и Bl (SEQ ID NO 3) и затем ген клонируют в векторную плазмиду pTWIN1.Its terminal sections containing the restriction endonuclease sites corresponding to the vector were introduced by PCR with synthetic oligonucleotide primers A1 and Bl (SEQ ID NO 3) and then the gene was cloned into the vector plasmid pTWIN1.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli С3030/pER-АРНС3 характеризуется следующими признаками.The proposed producer strain Escherichia coli C3030 / pER-APHC3 is characterized by the following features.

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.Morphological signs. The cells are rod-shaped, gram-negative, non-spore.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.Cultural signs. Cells grow well on simple nutrient media. When growing on Difco agar, the colonies are round, smooth, cloudy, shiny gray, the edge is even. When growing on liquid media (on a minimal medium with glucose or LB broth) they form an intense smooth turbidity.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме pH от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.Physico-biological signs. Cells grow at temperatures from 4 ° C to 40 ° C with optimum pH from 6.8 to 7.5. As a source of nitrogen, both mineral salts in the ammonium form and organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract, amino acids, etc. are used. Amino acids, glycerin, carbohydrates are used as a carbon source.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).Antibiotic resistance. Cells are resistant to penicillin antibiotics (up to 500 μg / ml).

Штамм-продуцент E.coli С3030/pER-АРНС3 отличается от штамма-реципиента E.coli С3030 только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pER-АРНС3, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.The strain producing E. coli C3030 / pER-APHC3 differs from the recipient strain E.coli C3030 only by the presence of recombinant plasmid DNA pER-APHC3, which gives it resistance to penicillin antibiotics.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток E.coli С3030 соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.Producer strains are obtained by transformation of competent E. coli C3030 cells with the corresponding recombinant plasmid DNA.

Клетки E.coli С3030/pER-АРНС3 являются суперпродуцентами. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка DnaBAPHC3, который накапливается в клетках в количестве 20% суммарного белка клетки в растворимом виде.E.coli C3030 / pER-APHC3 cells are superproducers. Upon induction with isopropylthio-β-D-galactoside, an effective biosynthesis of the DnaBAPHC3 fusion protein occurs, which accumulates in the cells in the amount of 20% of the total cell protein in soluble form.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-АРНС3, для чего ген рекомбинантного АРНС3 амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (SEQ ID NO 3), содержащими сайты рестриктаз SapI (N-конец гена, праймер А1) и BamHI (С - конец гена, праймер В1), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pTWIN1. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli С3030 и высевают на LB-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют с помощью секвенирования.The invention is as follows. Recombinant plasmid DNA pER-APH3 is constructed, for which the recombinant APH3 gene is amplified by PCR with synthetic oligonucleotide primers (SEQ ID NO 3) containing the restriction enzyme sites SapI (N-terminus of the gene, primer A1) and BamHI (C is the end of the gene, p B1), the DNA obtained is digested with the appropriate restriction enzymes and then ligated with the vector plasmid pTWIN1 digested at the same sites. The competent E. coli C3030 cells are transformed with a ligase mixture and plated on LB agar containing 50 μg / ml ampicillin or another penicillin antibiotic. The resulting clones are analyzed by sequencing.

Штамм-продуцент E.coli C3030/pER-АРНС3 выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.The strain producing E. coli C3030 / pER-APHCS3 is grown in a rich medium (YT-, LB-broth, etc.) (or isopropylthio-β-D-galactoside is induced and grown again) until the culture density is reached.

На (SEQIDNO 1) изображена структура гена рекомбинантного АРНС3. На (SEQIDNO 2) изображена аминокислотная последовательность рекомбинантного АРНС3.(SEQIDNO 1) shows the structure of the recombinant APHC3 gene. The (SEQIDNO 2) depicts the amino acid sequence of recombinant APHC3.

Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.The invention is illustrated by the following figures.

Фиг. 1 - Физическая карта плазмиды pER-АРНС3.FIG. 1 - Physical map of the plasmid pER-APCS3.

Фиг. 2 - Электрофорграммализата клеток штамма-продуцента E.coli С3030/pER-АРНС3.FIG. 2 - Electrophormalizate of cells of the producer strain of E. coli C3030 / pER-APHC3.

Фиг. 3 - Профиль аналитической ВЭЖХ рекомбинантного АРНС3.FIG. 3 - Analytical HPLC profile of recombinant ARNS3.

Фиг. 4 - Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного АРНС3.FIG. 4 - Mass spectrometric analysis of recombinant ARNS3.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1Example 1

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНКConstruction of recombinant plasmid DNA

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.Chemical synthesis of oligonucleotides is carried out by the solid-state phosphoamidite method on an ASM-102U DNA synthesizer (BIOSET, Novosibirsk) with the oligonucleotide chain being expanded from the 3'-end to the 5'-end using protected phosphamidites - 5'-dimethoxytrityl-N-acyl-2 '-deoxynucleoside-3'-O- (β-cyanethyl-diisopropylamino) -phosphites activated by tetrazole. The synthesis is carried out on a scale of 0.5-0.7 μmol, using porous glass (pore size 500 Å) as a support, to which the first nucleoside unit (load 20-30 μmol / g) is connected via a 3'-succinate bond. The synthetic cycle of the standard phosphoamidite method is used.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, pH 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой SapI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера R (10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой BamHII (10 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку Nucleo Spin ExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.To prepare the DNA vector of plasmid pTWTN1 (3 μg, 1 pmol) is treated in 40 μl of Y buffer (33 mm Tris-acetate, pH 7.9, 10 mm Mg-acetate, 66 mm K-acetate 1, 0.5 mm DTT, 0.1 mg / ml BSA) with the restriction enzyme SapI (10 units act.), And then in 40 μl of buffer R (10 mm Tris-HCl, pH 8.5, 10 mm MgCl 2 , 100 mm KCl, 0.1 mg / ml BSA) with BamHII restriction enzyme (10 units act.) for 1 h at 37 ° C. The vector fragment after electrophoresis in a 15% agarose gel was excised from the gel and transferred to 200 μl NT buffer, dissolved at 50 ° C for 5-10 min and applied to a Nucleo Spin ExtractII column. Wash with NT 3 buffer and elute with 50 μl of NE buffer.

Для приготовления гена АРНС3 проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном АРНС3 (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 и В1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. Ген после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку Nucleo Spin ExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые используют при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля.To prepare the APHC3 gene, amplification is carried out by PCR using a plasmid with the artificial APHC3 gene (0.01 μg in the sample) as a template, and synthetic oligonucleotides A1 and B1 (60 pmol each) as primers. PCR is carried out in a DNA amplifier, in a buffer solution consisting of each of four dNTPs at a concentration of 0.5 mM and 5 units. Act. Taq DNA polymerase, in the following mode: denaturation - 1 min at 94 ° С, annealing - 30 sec at 60 ° С, elongation - 40 sec at 72 ° С, 30 PCR cycles. The gene after electrophoresis in a 15% agarose gel is excised from the gel and transferred to 200 μl NT buffer, dissolved at 50 ° C for 5-10 minutes and applied to a Nucleo Spin ExtractII column. Wash with NT 3 buffer and elute with 50 μl of NE buffer, then digest with the same restriction enzymes used in the preparation of the vector and isolate the target fragment from the agarose gel.

Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного АРНС3 в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, pH 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед. акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.The resulting synthetic fragment with the recombinant APHC3 gene in an amount of 2 pmol was added to a solution of 1 μg of the above vector fragment in 10 μl of buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.56, 10 mM MgCl 2 , 0.2 mM rATP, 10 mM dithiothreitol ) and are ligated with 10 units. Act. T4 DNA ligases for 12 hours at 10 ° C.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli С3030. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pER-АРНС3 и анализируют с помощью эндонуклеаз NdeI, BamHI. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования. Физическая карта плазмиды pER-АРНС3 представлена на фиг. 1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации пзамиды. ApR - ген устойчивости к ампицилину. Lad - ген репрессора лактозного оперона. DnaBAPHC3 - ген рекомбинантного белка, кодирующий АРНС3 и интеин DnaB.An aliquot of the reaction mixture is used to transform competent E. coli C3030 cells. Transformants are plated on plates with LB agar containing 50 μg / ml ampicillin. The DNA of plasmid pER-APCS3 was isolated from the clones and analyzed using endonucleases NdeI, BamHI. Screening of recombinants is carried out using sequencing. The physical map of the plasmid pER-APHC3 is shown in FIG. 1. Indicated restriction endonuclease sites. Ori is the site of initiation of replication of the tsamid. Ap R is an ampicillin resistance gene. Lad - lactose operon repressor gene. DnaBAPHC3 is a recombinant protein gene encoding APHC3 and DnaB intein.

Пример 2Example 2

Получение штамма-продуцента E.coli C3030/pER-АРНС3 и определение его продуктивностиObtaining a producer strain of E. coli C3030 / pER-APHC3 and determining its productivity

Штамм-продуцент E.coli C3030/pER-АРНС3 получают трансформацией компетентных клеток E.coli С3030 плазмидой pER-АРНС3, как описано в примере 1.The strain producing E. coli C3030 / pER-APH3 is obtained by transformation of competent E. coli cells C3030 with the plasmid pER-APH3, as described in example 1.

Штамм продуцента E.coli C3030/pER-АРНС3 выращивают при 37°С в 100 мл LB-бульона (pH 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А550 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А550 и количество культуры, соответствующее 1 мл с А550 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. На фиг 2. представлена электрофорграмма лизата клеток штамма-продуцента E.coli C3030/pER-АРНС3, где М - стандарт молекулярных масс, L - лизат клеток, С - расщепление гибридного белка, 1 - гибридный белок, содержащий АРНС3, 2 - интеин Dnab.The producer strain E. coli C3030 / pER-APHCS3 was grown at 37 ° C in 100 ml of LB broth (pH 7.0) with 50 μg / ml ampicillin for 2 hours on a shaker at a speed of 190 rpm to a turbidity of A 550 0.7-0.8, add isopropylthio-β-D-galactoside to a concentration of 0.2 mM and continue the process for another 6 hours, or continue to grow in the absence of an inductor for 6 hours. Each hour, a 2 ml sample is taken, A is determined 550 and the amount of culture corresponding to 1 ml with A 550 1.0, centrifuged for 5 minutes at 6000 rpm. The precipitated cells in 100 μl of lysing buffer with dye bromphenol blue are treated with ultrasound for 20 seconds, heated for 3 min at 100 ° C and 4 μl samples are used for electrophoresis in 15% SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie R-250 according to a standard technique and scanned using a Shimadzu CS-930 densitometer. Figure 2. presents the electrogram of the cell lysate of the producer strain E.coli C3030 / pER-APH3, where M is the molecular weight standard, L is the cell lysate, C is the cleavage of the hybrid protein, 1 is a hybrid protein containing APHC3, 2 is Dnab intein .

Пример 3Example 3

Получение гибридного белка АРНС3, его автокаталитическое расщепление и выделение рекомбинантного АРНС3Obtaining a hybrid protein ARNC3, its autocatalytic cleavage and isolation of recombinant ARNC3

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе в буфере (50 мМ Tris/HCl, 10 mMEDTA, 1 mMPMSF) и выделяют центрифугированием (15000 g, 45 мин) осадок. Гибридный белок экстрагируют из телец включения буферным раствором (50 мМ Трис/HCl, 2 М мочевина, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, 0,5 ДТТ, pH 10) центрифугируют и выделяют супернатант. Супернатант растворяют в ренатурирующем буфере (100 мМ Трис/HCl, 10 мМ глицерин, 1 мМ PMSF). Доводят pH раствора соляной кислотой до 7.2, тем самым инициируя автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют при 22°С в течение 48 ч. Из полученной смеси отбирают пробу в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим нагревают 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Ha Фиг. 2 представлено расщепление гибридного белка. После инкубирования при 22°С в течение 48 ч доводят pH раствора соляной кислотой до 3.0 и инкубируют при 8°С 24 ч. Центрифугируют и супернатант наносят на ионообменную смолу. Элюируют белок ступенью буфера 50 мМ MES, 1,5 М NaCl, pH 5,5-5,6. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного АРНС3 проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификацию образующегося рекомбинантного АРНС3 проводят с помощью TOF-ESI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Agilenttechnologies 6224. Полученный сигнал рекомбинантного АРНС3 соответствует расчетному значению массы 6111 Да. На фиг. 3 представлен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ АРНС3. На Фиг. 4 представлен масс-спектр АРНС3.After fermentation, the cells of the hybrid protein producer (biomass) were separated by centrifugation (5000 g, 20 min, 4 ° C), destroyed on an ultrasonic disintegrator in a buffer (50 mM Tris / HCl, 10 mMEDTA, 1 mMPMSF) and isolated by centrifugation (15000 g, 45 min) precipitate. The fusion protein is extracted from inclusion bodies with a buffer solution (50 mM Tris / HCl, 2 M urea, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.5 DTT, pH 10) centrifuged and the supernatant is isolated. The supernatant was dissolved in a renaturing buffer (100 mM Tris / HCl, 10 mM glycerol, 1 mM PMSF). The pH of the solution was adjusted with hydrochloric acid to 7.2, thereby initiating the autocatalytic cleavage of the hybrid protein, and incubated at 22 ° C for 48 hours. A sample of 30 μl was taken from the resulting mixture and heated with bromphenol blue dye for 3 minutes at 100 ° C. Samples of 4 μl are used for electrophoresis in 15% SDS-PAGE. The gel was stained with Coomassie R-250 according to a standard technique and scanned using a Shimadzu CS-930 densitometer. Ha FIG. 2 shows the cleavage of a hybrid protein. After incubation at 22 ° C for 48 h, the pH of the solution was adjusted with hydrochloric acid to 3.0 and incubated at 8 ° C for 24 h. It was centrifuged and the supernatant was applied to an ion-exchange resin. The protein is eluted with a buffer step of 50 mM MES, 1.5 M NaCl, pH 5.5-5.6. Further purification and analysis of recombinant APCS3 is carried out by reverse phase chromatography. The resulting recombinant APHC3 is identified using TOF-ESI mass spectrometry using an Agilenttechnologies 6224 mass spectrometer. The resulting recombinant APHC3 signal corresponds to a calculated mass value of 6111 Da. In FIG. 3 shows the profile of analytical RP HPLC ARNS3. In FIG. 4 presents the mass spectrum of ARNS3.

Пример 4Example 4

Тестирование анальгетической активности АРНС3 на мышах в тесте горячая пластинаTesting the APC3 analgesic activity in mice in the hot plate test

Мышей делят на 2 группы (контрольную и экспериментальную) по 10 особей в каждой. Тесты проводят на самцах белых мышей линии CD-1 массой 20-30 г. Болевое раздражение моделируют, помещая мышь на металлическую поверхность, разогретую до 55°С. Для предотвращения ожогов лап время воздействия раздражения ограничивают 180 секундами. Тестируемые образцы растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,1 мг/кг внутривенно. Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента первого облизывания задней лапы. Измерение болевой чувствительности проводят через 15 минут после введения препарата. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью ANOVA и теста Тьюки. Полученный рекомбинантный пептид в данной концентрации увеличивает измеряемое время не менее чем на 50%.Mice are divided into 2 groups (control and experimental), 10 animals each. Tests are carried out on male CD-1 mice weighing 20-30 g. Painful stimulation is modeled by placing the mouse on a metal surface heated to 55 ° C. To prevent paw burns, the exposure time is limited to 180 seconds. Test samples are dissolved in sterile saline and administered at a dose of 0.1 mg / kg intravenously. The analgesic effect is measured by the increase in the elapsed time from the moment the animal was placed on the plate until the first licking of the hind paw. Measurement of pain sensitivity is carried out 15 minutes after administration of the drug. The results are processed statistically, the significance of differences in the results of the control and experimental groups is determined using ANOVA and Tukey test. The resulting recombinant peptide at a given concentration increases the measured time by at least 50%.

Claims (3)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-АРНС3 для экспрессии гибридного полипептида DnaBAPHC3, содержащего АРНС3, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и мини-интеина Ssp DnaB, содержащая BsaBI/Eco0109I-фрагмент ДНК плазмиды pTWIN-1, содержащий промотор и терминатор траснкрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, NdeI/BamHI-фрагмент ДНК, содержащий ген мини-интеина Ssp DnaB и адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного АРНС3, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1, ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-АРНС3 клеток E. coli к пенициллиновым антибиотикам, в качестве генетического маркера и уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI-NdeI - 849 п.о., Xba - 888 п.о., EcoRV - 2921 п.о., HpaI - 2977 п.о1. Recombinant plasmid DNA pER-APHC3 for expression of a hybrid DnaBAPHC3 polypeptide containing APHC3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and mini-intein Ssp DnaB containing the BsaBI / Eco0109I plasmid pTWIN-1 DNA fragment containing the promoter and terminator of the transcript T7 RNA polymerase, translation enhancer of the T7 phage 10 gene, NdeI / BamHI DNA fragment containing the Ssp DnaB mini-intein gene and a recombinant APCS3 gene sequence adapted to these sites having the sequence SEQ ID NO: 1, β-lactamase gene, determining stability of tra penicillin antibiotics formed by the plasmid pER-ARNS3 of E. coli as a genetic marker and unique restriction endonuclease recognition sites located at the next distance to the left of the BamHI-NdeI site - 849 bp, Xba - 888 bp, EcoRV - 2921 bp; HpaI - 2977 bp 2. Штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3, продуцирующий гибридный полипептид DnaBAPHC3, содержащий аминокислотные последовательности АРНС3 и мини-интеина Ssp DnaB, полученный путем трансформации клеток штамма Escherichia coli С3030 рекомбинантной плазмидной ДНК pER - АРНС3 по п. 1.2. The strain Escherichia coli C3030 / pER-APHC3 producing a hybrid DnaBAPHC3 polypeptide containing the amino acid sequences of APHC3 and mini-intein Ssp DnaB obtained by transforming the cells of the Escherichia coli C3030 strain of the recombinant plasmid DNA pER - APHC3 according to claim 1. 3. Способ получения рекомбинантного АРНС3 с SEQ ID NO: 2, включающий трансформацию штамма Escherichia coli С3030 полученной плазмидной ДНК pER-АРНС3 по п. 1, культивирование полученного штамма-продуцента Escherichia coli C3030/pER-APHC3 по п. 2, отделение гибридного белка в виде телец включения после разрушения клеток, экстракцию гибридного белка из телец включения, разбавление в ренатурационном буфере, инкубирование раствора при значении рН 7,2 и температуре 22°С, инкубирование раствора белка при 8°С и значении рН 3,0, центрифугирование, отделение супернатанта и хроматографическую очистку целевого продукта.3. A method for producing recombinant APHC3 with SEQ ID NO: 2, comprising transforming the Escherichia coli C3030 strain of the obtained pER-APHC3 plasmid DNA according to claim 1, culturing the resulting Escherichia coli C3030 / pER-APHC3 producing strain of claim 2, separating the hybrid protein in the form of inclusion bodies after cell disruption, extraction of the hybrid protein from inclusion bodies, dilution in renature buffer, incubation of the solution at a pH of 7.2 and a temperature of 22 ° C, incubation of a protein solution at 8 ° C and a pH of 3.0, centrifugation, supernatant separation and chromatograph ical desired product purification.
RU2015139726A 2015-09-18 2015-09-18 RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION RU2619170C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015139726A RU2619170C2 (en) 2015-09-18 2015-09-18 RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015139726A RU2619170C2 (en) 2015-09-18 2015-09-18 RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015139726A RU2015139726A (en) 2016-02-10
RU2619170C2 true RU2619170C2 (en) 2017-05-12

Family

ID=55313274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015139726A RU2619170C2 (en) 2015-09-18 2015-09-18 RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2619170C2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235983A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) Drug with prolonged analgesic action

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2435858C2 (en) * 2009-10-23 2011-12-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН RECOMBINANT PLASMID DNA pER-Hir CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE TO AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM [LeuL, Thr2]-63-DESULPHATOHIRUDIN, Escherichia coli ER2566/pER-Hir STRAIN - PRODUCER OF SAID PROTEIN AND METHOD FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED [LeuL, Thr2]-63-DESULPHATOHIRUDIN
EP2665744B1 (en) * 2011-01-20 2015-04-08 University Of Rochester Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2435858C2 (en) * 2009-10-23 2011-12-10 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН RECOMBINANT PLASMID DNA pER-Hir CODING HYBRID PROTEIN CAPABLE TO AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM [LeuL, Thr2]-63-DESULPHATOHIRUDIN, Escherichia coli ER2566/pER-Hir STRAIN - PRODUCER OF SAID PROTEIN AND METHOD FOR PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED [LeuL, Thr2]-63-DESULPHATOHIRUDIN
EP2665744B1 (en) * 2011-01-20 2015-04-08 University Of Rochester Macrocyclic compounds with a hybrid peptidic/non-peptidic backbone and methods for their preparation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOZLOV S.A., et al., New polypeptide components from Heteractis crispa sea anemone with analgesic activity, Bioorganicheskaia Khimiia, 2009, 35(6), pp.789-798. SUN Z., et al., Use of Ssp dnaB derived mini-intein as a fusion partner for production of recombinant human brain natriuretic peptide in Escherichia coli, Protein Expr Purif, 2005, 43(1), pp.26-32. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021235983A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) Drug with prolonged analgesic action

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015139726A (en) 2016-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200325462A1 (en) Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
KR102623312B1 (en) Enzyme with RUVC domain
KR102647766B1 (en) Class II, type V CRISPR systems
KR102369533B1 (en) Nuclease profiling system
US5856090A (en) DNA-methylase linking reaction
US20230076421A1 (en) Methods and compositions for manufacturing polynucleotides
JP7093417B2 (en) How to regulate in vitro biosynthetic activity by knocking out the nuclease system
RU2619170C2 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pER-ARNS3, ENCODING FUSION PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC SPLITTING WITH FORMATION OF ARNS3, ESCHERICHIA COLI STRAIN C3030/pER-ARNS3 PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHODS FOR RECOMBINANT ARNS3 PRODUCTION
JP2023539237A (en) Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences
JP2002541861A (en) Pharmacological targeting of mRNA cap formation
JP2023542976A (en) Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences
US8372601B2 (en) Compositions and methods for the synthesis of APPA-containing peptides
KR100888513B1 (en) Novel N-Acetylglucosamine-2-Epimerase and Method for Producing CMP-neuraminic acid Using the Same
RU2700452C1 (en) Recombinant plasmid dna of ptrx-tevrs-pth coding a hybrid protein capable of proteolytic splitting to form a fragment of endogenous human parathyroid hormone (1-34), an escherichia coli bl21(de3)/ptrx-tevrs-pth strain - producer of said protein and a method of producing recombinant pth (1-34)
JP3822006B2 (en) Method for producing cytidine 5'-choline diphosphate
RU2593172C2 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pER-TA1 GyrA-AcSer CODING SERINE ACETYLTRANSFERASE CAPABLE OF in vivo ACETYLATION OF N-TERMINAL SERINE DEACETYL-THYMOSIN α1 AND HYBRID PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM HUMAN THYMOSIN α1, STRAIN OF Eschrichia coli C3030/pER-TA1GyrA-AcSer PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHOD OF PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED HUMAN THYMOSIN
RU2302465C2 (en) METHOD FOR PRODUCTION OF HUMAN GENE ENGINEERED GLUCAGONE, RECOMBINANT PLASMIDE DNA pER-Gl, ENCODING AUTOCATALITICALLY CLEAVABLE HYBRID PROTEIN FORMING HUMAN GLUCAGONE AND STRAIN OF Escherichia coli ER-2566/pER-Gl AS PRODUCER OF SAID PROTEIN
KR100752683B1 (en) A valiolone synthase its gene and primer for valienamine biosynthesis and method for producing the same
KR101039596B1 (en) A novel method for expressing protein in vivo
RU2592860C2 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pER-TB4GyrA-AcSer CODING SERINE ACETYLTRANSFERASE CAPABLE OF in vivo ACETYLATION OF N-TERMINAL SERINE DEACETYL-THYMOSIN β4 AND HYBRID PROTEIN CAPABLE OF AUTOCATALYTIC BREAKDOWN TO FORM HUMAN THYMOSIN β4, STRAIN OF Eschrichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer PRODUCER OF SAID PROTEINS AND METHOD OF PRODUCING GENETICALLY ENGINEERED HUMAN THYMOSIN
RU2188234C2 (en) Method of preparing recombinant thymidine phosphorylase, recombinant plasmid dna pertpho1 and strain escherichia coli bl21(de3)/pertpho1 as producer of thymidine phosphorylase
van Heeke et al. Expression of human asparagine synthetase in Saccharomyces cerevisiae
TWI537382B (en) Constructed bacterial strain for promoting recombinant protein expression aerobically
RU2233879C1 (en) Recombinant plasmid dna pes1-6 encoding polypeptide somatotropin and strain escherichia coli bl21(de3)/pes1-6 as producer of recombinant somatotropin
CN114438065B (en) Quinolinic acid intermediate product 6-hydroxyquinolinic acid decarboxylase QuiB and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
QB4A Licence on use of patent

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190816

Effective date: 20190816

QC41 Official registration of the termination of the licence agreement or other agreements on the disposal of an exclusive right

Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20190816

Effective date: 20211209