RU2610434C1 - Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna enteroviruses, rotoviruses, hepatitis a and e viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by multiplex polymerase chain reaction - Google Patents
Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna enteroviruses, rotoviruses, hepatitis a and e viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by multiplex polymerase chain reaction Download PDFInfo
- Publication number
- RU2610434C1 RU2610434C1 RU2015147562A RU2015147562A RU2610434C1 RU 2610434 C1 RU2610434 C1 RU 2610434C1 RU 2015147562 A RU2015147562 A RU 2015147562A RU 2015147562 A RU2015147562 A RU 2015147562A RU 2610434 C1 RU2610434 C1 RU 2610434C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- hepatitis
- fluorescently
- adenoviruses
- noroviruses
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к наборам олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации генетического материала энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и может быть использовано в вирусологии и эпидемиологии для обеспечения эпидемической безопасности населения при различных видах водопользования. The invention relates to sets of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for identifying the genetic material of enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses in environmental water samples by the method of multiplex polymerase chain reaction and can be used in virus multiplex polymerase chain reaction epidemiology to ensure the epidemic safety of the population in various types of water use.
Известно, что для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем, в практической лабораторной службе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Проблема лабораторной диагностики острых кишечных инфекций неустановленной этиологии у детей / Т.В. Амвросьева, Н.В. Поклонская, Е.П. Кишкурно, Н.Л. Клюйко, О.Н. Казинец, А.А. Безручко, О.И. Камяк // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней: материалы междунар. науч.-практ. конф. / ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора. – Новосибирск, 2009. – С. 52-55). Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции, представляющего собой полимеразную цепную реакцию с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 3-6 часов обнаружить в исследуемом материале вирусную РНК. It is known that in order to indicate cytopathogenic viruses that spread by water, the practical laboratory service uses the method of their isolation on sensitive cell cultures. However, this method has several disadvantages that reduce its practical significance: the duration of the process (3-4 weeks), the inability to isolate non-cytolytic and damaged viral agents that are not able to cause a productive cytolytic infection in the in vitro system, but which nevertheless pose an epidemic danger living organism (The problem of laboratory diagnosis of acute intestinal infections of unknown etiology in children / T.V. Amvrosyeva, N.V. Poklonskaya, E.P. Kishkurno, N.L. Klyuyko, O.N. Kazinets, A.A. Bezruchko, O.I. Kamyak // Persp Prospects for cooperation of the SCO member states in countering the threat of infectious diseases: Proceedings of the international scientific and practical conference / Federal State Institution “State Scientific Center of Virology and Biotechnology“ Vector ”of Rospotrebnadzor. - Novosibirsk, 2009. - P. 52-55). These problems arising in the study of the virological quality of water of various water bodies can be solved by using the detection method, which is a polymerase chain reaction with a reverse transcription step (RT-PCR), which allows detecting viral RNA in the test material within 3-6 hours .
Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) является наиболее распространенным методом, используемым в лабораторной практике для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. В основе метода лежат две реакции – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. В реакции обратной транскрипции на матрице вирусной РНК строится комплиментарная ДНК (кДНК). В следующей за реакцией обратной транскрипции ПЦР происходит многократное избирательное удвоение целевого участка кДНК (амплификация). Амплифицируемый участок кДНК является маркерным, так как строго ограничен последовательностями ДНК-затравок (праймеров) без которых не возможно протекание ПЦР. Для детекции накопления продуктов амплификации в режиме реального времени помимо пары праймеров необходим также флуорисцентно-меченый ДНК-зонд. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. В случае если выбранные олигонуклеотиды не обладают видовой специфичностью к целевому объекту, либо не обладают достаточной гомологией к целевой нуклеотидной последовательности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае если выбранные праймеры и зонды демонстрируют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить строго специфическую амплификацию целевого фрагмента кДНК и провести детекцию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени.The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is the most common method used in laboratory practice for the differential diagnosis of infectious diseases. The method is based on two reactions - reverse transcription and polymerase chain reaction. In the reverse transcription reaction, a complementary DNA (cDNA) is built on the viral RNA matrix. In the subsequent PCR reverse transcription reaction, multiple selective doubling of the target cDNA region occurs (amplification). The amplified cDNA region is marker, since it is strictly limited to the sequences of DNA seeds (primers) without which PCR cannot occur. In order to detect the accumulation of amplification products in real time, in addition to a pair of primers, a fluorescently-labeled DNA probe is also required. The complexity of the choice of primers and probe is due to the requirement of their strict species specificity. If the selected oligonucleotides do not have species specificity for the target object, or do not possess sufficient homology to the target nucleotide sequence, false negative results of the study are possible. If the selected primers and probes demonstrate an affinity for non-target DNA sequences, then false-positive test results are possible. The correct choice of a combination of a pair of primers and a fluorescently labeled DNA probe allows for strictly specific amplification of the target cDNA fragment and real-time detection of PCR products accumulation.
В настоящее время на территории Российской Федерации существует единственный коммерческий набор для детекции кДНК ротовируса человека методом ПЦР "АмплиСенс®ОРВИ-скрин-FL" (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва) - набор реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (РНК респираторно-синцитиального вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1-4 типов, коронавирусов, ротовирусов, ДНК аденовирусов групп B, C и E и бокавируса в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией).Currently, in the territory of the Russian Federation there is the only commercial kit for the detection of human rotovirus cDNA by PCR "AmpliSens®ORVI-screen-FL" (Central Research Institute of Epidemiology, Moscow) - a set of reagents for identifying pathogens of acute respiratory viral infections of humans (ARVI) ( RNA of respiratory syncytial virus, metapneumovirus, parainfluenza viruses of types 1-4, coronaviruses, rotoviruses, DNA of groups B, C and E adenoviruses and bokavirus in clinical material by polymerase chain reaction (PCR) with hybridization by fluorescence detection).
Для ПЦР диагностики энтеровирусов используются ПЦР-тест-системы с детекцией методом электрофореза таких компаний, как ЗАО «БиоХимМак» (http://www.biochemmack.ru/product/moleculardiagnostics/infectious/), ЗАО «Литех» и наборы реагентов для ПЦР производства "ИзоГен" (http://www.lytech.ru/ catalog_69.htm). Набор с гибридизационно-флуоресцентной детекцией производит компания «ИнтерЛабСервис» (http://www.interlabservice.ru/catalog/ reagents/index.php?sid=678).For PCR diagnostics of enteroviruses, PCR test systems with electrophoresis detection are used for such companies as BioChemMack CJSC (http://www.biochemmack.ru/product/moleculardiagnostics/infectious/), Litech CJSC and reagent kits for PCR production of IzoGen (http://www.lytech.ru/ catalog_69.htm). A kit with hybridization-fluorescence detection is produced by InterLabService (http://www.interlabservice.ru/catalog/ reagents / index.php? Sid = 678).
Для диагностики вирусов гепатита А методом ПЦР используется набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита A (HAV) в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® HAV-FL.For the diagnosis of hepatitis A viruses by PCR, a set of reagents is used to detect hepatitis A virus RNA (HAV) in clinical material and environmental objects by polymerase chain reaction (PCR) with hybridization-fluorescence detection of AmpliSens® HAV-FL.
Для диагностики вируса гепатита Е методом ПЦР используется набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита E (HEV) в клиническом материале ООО «Лаборатория ИзоГен».For the diagnosis of hepatitis E virus by PCR, a set of reagents is used to detect hepatitis E virus RNA (HEV) in the clinical material of IsoGen Laboratory LLC.
Наборы для диагностики аденовирусов, астро- и норовирусов методом ПЦР выпускаются компанией «ИнтерЛабСервис».Kits for the diagnosis of adenoviruses, astro- and noroviruses by PCR are produced by InterLabService.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (патент РФ №2542968, МПК С12Q1/68, опубл. 27.02.2015 г.).The closest analogue (prototype) is a set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for identification of RNA enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses from an aqueous medium by the method of multiplex polymerase chain reaction (RF patent No. 2542968, IPC C12l1 / 68, IPC. 02/27/2015).
Однако и такой набор для мультиплексной ПЦР не обеспечивает идентификацию проб из водной среды с целью диагностики энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.However, such a kit for multiplex PCR does not provide identification of samples from the aquatic environment in order to diagnose enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses.
Таким образом, из уровня техники не известны мультиплексные ПЦР тест-системы для идентификации проб из водной среды с целью диагностики энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов. Thus, multiplex PCR test systems for the identification of samples from the aquatic environment for the diagnosis of enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses are not known from the prior art.
Техническим результатом является создание набора для мультиплексной ПЦР, обеспечивающего исследование проб водной среды с целью одновременного выявления в них энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.The technical result is the creation of a kit for multiplex PCR, which provides the study of samples of the aquatic environment in order to simultaneously detect enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses.
Указанный технический результат достигается созданием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, энтеровирусов, аденовирусов, норовирусов и астровирусов из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, имеющих следующую структуру:The specified technical result is achieved by creating a set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for the identification of RNA of rotoviruses, hepatitis A and E viruses, enteroviruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by the method of multiplex polymerase chain reaction, having the following structure:
для выявления РНК ротовирусов:for the detection of rotavirus RNA:
- прямой (F1) и обратный (R1) праймеры:- direct (F1) and reverse (R1) primers:
F1: 5`- GATATTGGACCNTCTGATTCTGC -3`F1: 5`- GATATTGGACCNTCTGATTCTGC -3`
R1: 5`- ATTGCTGTNGATGAATCCATAGACAC -3`R1: 5`- ATTGCTGTNGATGAATCCATAGACAC -3`
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z1):- fluorescently-labeled DNA probe (Z1):
Z1: ROX-TTAGATCGAATGCAGTTAAGACAAACGC-BHQ2Z1: ROX-TTAGATCGAATGCAGTTAAGACAAACGC-BHQ2
для выявления РНК вируса гепатита А:for the detection of hepatitis A virus RNA:
- прямой (F2) и обратный (R2) праймеры:- direct (F2) and reverse (R2) primers:
F2: 5`- GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT -3`F2: 5`- GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT -3`
R2: 5`- CGGCGTTGAATGGTTTTTGT -3`R2: 5`- CGGCGTTGAATGGTTTTTTGT -3`
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z2):- fluorescently-labeled DNA probe (Z2):
Z2: R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGT-BHQ2Z2: R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGT-BHQ2
для выявления РНК вируса гепатита Е:for the detection of hepatitis E virus RNA:
- прямой (F3) и обратный (R3) праймеры:- direct (F3) and reverse (R3) primers:
F3: 5`- CGGCRGTGGTTTCTGGGGT -3’F3: 5`- CGGCRGTGGTTTCTGGGGT -3 ’
R3: 5`- GGTTGGTTGGATGAATATAGGG -3’R3: 5`- GGTTGGTTGGATGAATATAGGG -3 ’
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z3):- fluorescently-labeled DNA probe (Z3):
Z3: Cy5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC-BHQ2Z3: Cy5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCC-BHQ2
для выявления РНК энтеровирусов:for the detection of enterovirus RNA:
- прямой (F4) и обратный (R4) праймеры:- direct (F4) and reverse (R4) primers:
F4: 5`- AGTCTATTGAGCTARTTGGT -3’F4: 5`- AGTCTATTGAGCTARTTGGT -3 ’
R4: 5`- ACACGGACACCCAAAGTAGT -3’R4: 5`- ACACGGACACCCAAAGTAGT -3 ’
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z4):- fluorescently-labeled DNA probe (Z4):
Z4: FAM-CCTGAATGCGGCTAATCC-BHQ1Z4: FAM-CCTGAATGCGGCTAATCC-BHQ1
для выявления РНК аденовирусов:for the detection of adenovirus RNA:
- прямой (F5) и обратный (R5) праймеры:- direct (F5) and reverse (R5) primers:
F5: 5`- CCACGGTGGGGTTTCTAAACTT -3`F5: 5`- CCACGGTGGGGTTTCTAAACTT -3`
R5: 5`- CCCAGTGGTCTTACATGCACATC -3`R5: 5`- CCCAGTGGTCTTACATGCACATC -3`
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z1):- fluorescently-labeled DNA probe (Z1):
Z5: ROX-TGCACCAGACCCGGGCTCAG-BHQ2Z5: ROX-TGCACCAGACCCGGGCTCAG-BHQ2
для выявления РНК норовирусов:for the detection of norovirus RNA:
- прямой (F6) и обратный (R6) праймеры:- direct (F6) and reverse (R6) primers:
F6: 5`- CAAGARACNATGTTCAGRTGGATGA -3`F6: 5`- CAAGARACNATGTTCAGRTGGATGA -3`
R6: 5`- TCGACGCCATCTTCATTCACA -3`R6: 5`- TCGACGCCATCTTCATTCACA -3`
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z6):- fluorescently-labeled DNA probe (Z6):
Z6: R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ2Z6: R6G-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ2
для выявления РНК астровирусов:for the detection of astrovirus RNA:
- прямой (F7) и обратный (R7) праймеры:- direct (F7) and reverse (R7) primers:
F7: 5`- AGTTGCTTGCTGCGTTCA -3’F7: 5`- AGTTGCTTGCTGCGTTCA -3 ’
R7: 5`- TTGCTAGCCATCACACTTCT -3’R7: 5`- TTGCTAGCCATCACACTTCT -3 ’
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z7):- fluorescently-labeled DNA probe (Z7):
Z7: Cy5-ACAGAAGAGCAACTCCATCGC-BHQ2,Z7: Cy5-ACAGAAGAGCAACTCCATCGC-BHQ2,
где: присутствие в нуклеотидной последовательности пуринового основания R=A или G; where: the presence in the nucleotide sequence of the purine base R = A or G;
присутствие в нуклеотидной последовательности пиримидинового основания Y=T или C; the presence in the nucleotide sequence of the pyrimidine base Y = T or C;
следующий альтернативный порядок следования нуклеотидов: N=A или C или G или T.The following alternative nucleotide sequence: N = A or C or G or T.
Олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации ротовирусов, вирусов гепатита А и Е и энтеровирусов приготовлены в виде смеси в одной пробирке, а олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды для идентификации аденовирусов, норовирусов и астровирусов приготовлены в виде смеси в другой пробирке.Oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for identification of rotoviruses, hepatitis A and E viruses and enteroviruses were prepared as a mixture in one test tube, and oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for identification of adenoviruses and adenoviruses, another test tube.
Перечень графических материалов. Фиг. 1. Результаты анализа энтеровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал FAM). Фиг. 2. Результаты анализа вируса гепатита Е методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5). Фиг. 3. Результаты анализа вируса гепатита А методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G). Фиг. 4. Результаты анализа ротовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX). Фиг. 5. Результаты анализа аденовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX). Фиг. 6. Результаты анализа астровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5). Фиг. 7. Результаты анализа норовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G).The list of graphic materials. FIG. 1. Real-time PCR analysis of enteroviruses using patentable oligonucleotides (FAM channel). FIG. 2. The results of the analysis of hepatitis E virus by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel Cy5). FIG. 3. The results of the analysis of hepatitis A virus by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel R6G). FIG. 4. The results of the analysis of rotoviruses by real-time PCR using patentable oligonucleotides (ROX channel). FIG. 5. Results of real-time PCR analysis of adenoviruses using patentable oligonucleotides (ROX channel). FIG. 6. Results of the analysis of astroviruses by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel Cy5). FIG. 7. Results of analysis of noroviruses by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel R6G).
Апробация олигонуклеотидов была осуществлена с использованием лабораторной коллекции энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, норовирусов, астровирусов и аденовирусов человека ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360)). Выбранные праймеры и ДНК-зонды обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации вирусной кДНК была подтверждена секвенированием.The oligonucleotides were tested using a laboratory collection of enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, noroviruses, astroviruses, and human adenoviruses of the Federal State Budget Scientific Center of the World Health Bank "Vector" (the research procedure was approved by the ethical committee of the Federal State Biological Research Center of the World Bank "Vector" (IRB 00001360)). Selected primers and DNA probes provide reliable synthesis of target DNA fragments. The specificity of the amplification of viral cDNA was confirmed by sequencing.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК ротовирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры фланкируют участок гена, кодирующего вирусный гликопротеин 1 (VP1-ген). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 28117 по 28630 нуклеотид (513 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplifiable genomic RNA of rotoviruses. The primers proposed for patenting flank a portion of the gene encoding the viral glycoprotein 1 (VP1 gene). In PCR, the genome fragment from 28117 to 28630 nucleotides (513 bp) is amplified. The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК энтеровирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры комплементарны не кодирующей части геномной РНК (5”-UTR). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 72 по 521 нуклеотид (449 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplified genomic RNA enteroviruses. The primers proposed for patenting are complementary to the non-coding part of the genomic RNA (5 ”-UTR). In PCR, a fragment of the genome from 72 to 521 nucleotides (449 bp) is amplified. The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК вируса гепатита А. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 311 по 421 нуклеотид (110 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of the set of primers and the site of the amplified genomic RNA of hepatitis A. The primers proposed for patenting in PCR amplify a fragment of the genome from 311 to 421 nucleotides (110 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК вируса гепатита Е. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 5298 по 5370 нуклеотид (72 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of the set of primers and the site of the amplified genomic RNA of hepatitis E. The primers proposed for patenting in PCR amplify a fragment of the genome from 5298 to 5370 nucleotides (72 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК норовирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 4986 по 5084 нуклеотид (98 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplifiable genomic RNA of noroviruses. The PCR primers for patenting amplify a fragment of the genome from 4986 to 5084 nucleotides (98 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК астровирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 4168 по 4349 нуклеотид (181 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplified genomic RNA of astroviruses. The PCR primers proposed for patenting amplify a fragment of the genome from 4168 to 4349 nucleotides (181 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК аденовирусов человека. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома (hexon protein gene) с 21 по 152 нуклеотид (132 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplified genomic RNA of human adenoviruses. The PCR primers proposed for patenting amplify a fragment of the genome (hexon protein gene) from 21 to 152 nucleotides (132 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.
В результате научных исследований достигнут следующий технический результат, а именно: разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих надежную детекцию энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, норовирусов, астровирусов и аденовирусов человека в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакцией (см. таблицу 1).As a result of scientific research, the following technical result was achieved, namely: a set of oligonucleotide primers and fluorescently-labeled probes were developed that provide reliable detection of enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, noroviruses, astroviruses and human adenoviruses in water samples from the environment using multiplex polymerase chain reaction (see table 1).
Таблица 1Table 1
Высокоспецифичные праймеры и зонды для детекции энтеровирусов человека, ротавирусов, вируса гепатита А, вируса гепатита Е, норовирусов, астровирусов и аденовирусов человека с помощью метода ПЦР в реальном времени.Highly specific primers and probes for the detection of human enteroviruses, rotaviruses, hepatitis A virus, hepatitis E virus, noroviruses, astroviruses and human adenoviruses using real-time PCR.
РотовирусыRotoviruses
(°С)Tm
(° C)
Вирус гепатита АHepatitis A virus
Праймеры и зонд
Primers and probe
Последовательность (5’ → 3’)
Sequence (5 '→ 3')
(°С)Tm
(° C)
Вирус гепатита ЕHepatitis E virus
Праймеры и зонд
Primers and probe
Последовательность (5’ → 3’)
Sequence (5 '→ 3')
(°С)Tm
(° C)
ЭнтеровирусыEnteroviruses
Праймеры и зонд
Primers and probe
Последовательность (5’ → 3’)
Sequence (5 '→ 3')
(°С)Tm
(° C)
АденовирусыAdenoviruses
(°С)Tm
(° C)
НоровирусыNoroviruses
Праймеры и зонд
Primers and probe
Последовательность (5’ → 3’)
Sequence (5 '→ 3')
(°С)Tm
(° C)
АстровирусыAstroviruses
Праймеры и зонд
Primers and probe
Последовательность (5’ → 3’)
Sequence (5 '→ 3')
(°С)Tm
(° C)
Примечание. Где: Note. Where:
присутствие в нуклеотидной последовательности пуринового основания R=A или G; the presence in the nucleotide sequence of the purine base R = A or G;
присутствие в нуклеотидной последовательности пиримидинового основания Y=T или C; the presence in the nucleotide sequence of the pyrimidine base Y = T or C;
следующий альтернативный порядок следования нуклеотидов: N=A или C или G или T.The following alternative nucleotide sequence: N = A or C or G or T.
Конструирование внутреннего контрольного образца. В качестве внутреннего контрольного образца была использована защищенная двухцепочечная РНК фага MS-2. Псевдофаг получали клонированием под T5 фаговый промотер фрагмента 370 п.н. кДНК фага MS-2 в вектор pQE31. Синтез матричной РНК индуцировали IPTG. Фаговые частицы очищали центрифугированием. Construction of an internal control sample. As an internal control sample, protected double-stranded RNA of phage MS-2 was used. The pseudophage was obtained by cloning under T5 the phage promoter of the 370 bp fragment. phage MS-2 cDNA into pQE31 vector. Matrix RNA synthesis was induced by IPTG. Phage particles were purified by centrifugation.
Внутренний контрольный образец (ВКО), позволяет компенсировать ингибирование и контролировать процессы пробоподготовки и амплификации, что обеспечивает более точное определение РНК в каждом анализируемом образце. ВКО представляет собой неинфекционную защищенную РНК бактериофага MS2 (концентрация 105 копий РНК MS2/мл).The internal control sample (CTP) allows you to compensate for inhibition and control the processes of sample preparation and amplification, which provides a more accurate determination of RNA in each analyzed sample. EKO is a non-infectious protected RNA of the bacteriophage MS2 (concentration of 10 5 copies of MS2 RNA / ml).
Выделение вируссодержащего материала из образцов воды.Isolation of virus-containing material from water samples.
Пробу воды готовили 1000-кратным разведением клинического образца, содержащего вирус, в дистилированной и автоклавированнной воде. Пробы подвергались фильтрации через подобранную оптимальную фильтрационную систему. Используемые в работе системы для фильтрации воды с целью дальнейшего исследования на наличие вирусного генетического материала:A water sample was prepared by 1000-fold dilution of a clinical sample containing the virus in distilled and autoclaved water. Samples were filtered through a matched optimal filtration system. The systems used in the work for filtering water for the purpose of further research for the presence of viral genetic material
1. Мембранный фильтрующий модуль МФМ-0142.1. Membrane filter module MFM-0142.
2. Фильтрационная система Midisart 2000 (Sartorius, Германия).2. Filtration system Midisart 2000 (Sartorius, Germany).
3. Система вакуумной фильтрации (Sartorius, Германия). 3. Vacuum filtration system (Sartorius, Germany).
4. Система вакуумной фильтрации с приставкой предварительной фильтрации (Sartorius, Германия).4. Vacuum filtration system with prefilter attachment (Sartorius, Germany).
Для концентрирования вирусов с фильтрационными системами использовали мембраны марки ММПА+-020-142 (ООО НПП «Технофильтр», Россия). В качестве системы сравнения использовали адсорбирующее картриджи из набора для отбора проб и индикации вирусов в питьевой воде ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» (Республика Беларусь).To concentrate viruses with filtration systems, MMPA + -020-142 brand membranes were used (OOO NPP Tekhnofiltr, Russia). As a comparison system, we used adsorbent cartridges from the kit for sampling and indicating viruses in drinking water of the State Institution “Republican Scientific and Practical Center for Epidemiology and Microbiology” (Republic of Belarus).
Фильтрацию воды проводили после предварительного добавления в нее 10-кратных разведений вируссодержащих образцов с известной концентрацией вируса, после чего проводили элюцию концентрированного вируссодержащего материала из мембраны и затем проводили выделение вирусной РНК (ДНК). Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции (Евроген, Россия), после чего в реакции обратной транскрипции (наборы для обратной транскрипции, Изоген, Россия) получали кДНК и проводили ПЦР в режиме реального времени, используя мультиплексный вариант тест-системы. Оптимальными считались те способы фильтрации воды и выделения вирусной РНК, при которых достигалась наибольшая чувствительность.Water filtration was carried out after preliminary addition of 10-fold dilutions of virus-containing samples with a known virus concentration to it, after which concentrated virus-containing material was eluted from the membrane and then virus viral RNA (DNA) was isolated. RNA was isolated by phenol-chloroform extraction (Eurogen, Russia), after which cDNA was obtained in the reverse transcription reaction (reverse transcription kits, Isogen, Russia) and real-time PCR was performed using the multiplex version of the test system. Optimum were considered those methods of water filtration and isolation of viral RNA, in which the greatest sensitivity was achieved.
Пробу воды готовили 1000-кратным разведением клинического образца, содержащего ротавирус в дистилированной и автоклавированнной воде. Пробы подвергались фильтрации через подобранную оптимальную фильтрационную систему. После чего производилась элюция с мембраны, выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени с использованием мультиплексного варианта тест-систем. Наиболее удобной в работе оказалась система вакуумной фильтрации с приставкой предварительной фильтрации (Sartorius, Германия), поскольку одновременно позволяла проводить отсечку бактериального компонента из образцов воды (на первый 0.22 мкм фильтр) и сорбцию вирусного материала на мембрану марки ММПА+-020-142 (ООО НПП «Технофильтр», Россия). Мембраны обладают повышенной сорбционной способностью по отношению к вирусам, колифагам и пирогенам. Мембраны микропористые полиамидные с положительным дзета-потенциалом изготовленные на основе полиамида (Nylon-6 и Nylon-66). Мембраны ММПА+ имеют крупноячеистое строение с тонкими микропористыми перегородками, что предопределяет непрерывность структуры мембран и обеспечивает прочность и эластичность в сухом и смоченном виде. Благодаря высокой пористости и контролируемому размеру пор мембраны обладают высокой эффективностью удержания микрочастиц при большой скорости фильтрации.A water sample was prepared by 1000-fold dilution of a clinical sample containing rotavirus in distilled and autoclaved water. Samples were filtered through a matched optimal filtration system. After that, elution from the membrane, RNA isolation, reverse transcription and real-time PCR were performed using the multiplex version of the test systems. The most convenient vacuum filtering system with a prefilter attachment (Sartorius, Germany) turned out to be the most convenient in operation, since it simultaneously allowed the bacterial component to be cut off from water samples (onto the first 0.22 μm filter) and the sorption of viral material onto an MMPA + -020-142 membrane (LLC NPP Technofilter, Russia). Membranes have increased sorption ability with respect to viruses, coliphages and pyrogens. Positive zeta potential microporous polyamide membranes made on the basis of polyamide (Nylon-6 and Nylon-66). MMPA + membranes have a coarse-grained structure with thin microporous partitions, which determines the continuity of the membrane structure and provides strength and elasticity in a dry and moistened form. Due to their high porosity and controlled pore size, membranes have high microparticle retention efficiency at high filtration rates.
Экстракция вирусной РНКViral RNA Extraction
Предварительную инактивацию образцов и выделение вирусной РНК проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3. 2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».Preliminary inactivation of samples and isolation of viral RNA was carried out under conditions regulated by MU 1.3. 2569 -09 “Organization of the work of laboratories using nucleic acid amplification methods when working with material containing microorganisms of pathogenicity groups I-IV”.
Вирусную РНК выделяли из 100 мкл вируссодержащей жидкости фенол-хлороформным реагентом, с использованием набора «Евроген» (г. Москва) согласно инструкции производителя.Viral RNA was isolated from 100 μl of the virus-containing fluid with a phenol-chloroform reagent using the Eurogen kit (Moscow) according to the manufacturer's instructions.
Реакция обратной транскрипцииReverse transcription reaction
Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили на матрице суммарной РНК с использованием набора реагентов «ИзоГен» (г. Москва) согласно инструкции производителя.The synthesis of complementary DNA (cDNA) was performed on a total RNA matrix using the IsoGen reagent kit (Moscow) according to the manufacturer's instructions.
Проведение полимеразной цепной реакцииPolymerase chain reaction
Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, а также, по температуре отжига праймеров.The amplification conditions were optimized by the concentration of magnesium ions, the concentration of primers and probes in the reaction mixture, and also by the annealing temperature of the primers.
Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси для ПЦР (таб. 1), содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl2, 0.17 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), 20 пМ прямого и обратного праймеров и 8 пМ флуоресцентного ДНК-зонда.The amplification reaction was carried out in 30 μl of a PCR mixture (Table 1) containing 1 × Taq amplification buffer, 2.5 mM MgCl 2 , 0.17 mM each of the nucleoside triphosphates, 1.5 active units of Smart Taq DNA polymerase (all components of MEDIGEN Lab LLC ), 20 pM forward and reverse primers and 8 pM fluorescent DNA probe.
Таблица 2table 2
ПЦР-смесь А (из расчета на одну пробирку)PCR mixture A (based on one tube)
ПЦР-смесь В (из расчета на одну пробирку)PCR mixture B (based on one tube)
ПЦР в режиме реального времени проводили согласно программе амплификации Таблицы 3. Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналам – Green (FAM, 470 nm /510 nm), Yellow (R6G, 530 нм / 560 нм), Red (Cy5, 625 нм / 660 нм) и Orange (ROX, 585 нм / 605 нм), в двух пробирках: Real-time PCR was performed according to the amplification program of Table 3. Fluorescence intensity was detected by the channels Green (FAM, 470 nm / 510 nm), Yellow (R6G, 530 nm / 560 nm), Red (Cy5, 625 nm / 660 nm ) and Orange (ROX, 585 nm / 605 nm), in two tubes:
Пробирка А: смесь олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих детекцию энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е. Test tube A: a mixture of oligonucleotide primers and fluorescently-labeled probes that detect enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E.
Пробирка В: смесь олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих детекцию норовирусов, астровирусов, аденовирусов и ВКО (внутренний контольный образец). Test tube B: a mixture of oligonucleotide primers and fluorescently-labeled probes for the detection of noroviruses, astroviruses, adenoviruses and CTP (internal control sample).
Результаты оценивали по наличию флюоресценции до 30 цикла (фиг. 1-7).The results were evaluated by the presence of fluorescence up to 30 cycles (Fig. 1-7).
Таблица 3Table 3
Программа амплификации Amplification program
На фиг. 1-7 представлены результаты анализа образцов методом ПЦР в реальном времени. В эксперименте методом ПЦР в реальном времени были проанализированы последовательные десятикратные разведения кДНК энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов.In FIG. Figures 1-7 show real-time PCR analysis of samples. In a real-time PCR experiment, sequential ten-fold dilutions of the cDNA of enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses were analyzed.
На фиг. 1 приведены результаты анализа энтеровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал FAM).In FIG. Figure 1 shows the results of real-time PCR analysis of enteroviruses using patentable oligonucleotides (FAM channel).
Примечание:Note:
1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК энтеровирусов);1 - positive control sample (plasmid construct containing enterovirus cDNA);
2 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:100);2 - enterovirus cDNA, (1: 100 dilution);
3 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:1000);3 - enterovirus cDNA, (1: 1000 dilution);
4 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:10000);4 - enterovirus cDNA, (dilution 1: 10000);
5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5 - negative control sample (single TE buffer).
На фиг. 2 приведены результаты анализа вируса гепатита Е методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5).In FIG. 2 shows the results of the analysis of hepatitis E virus by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel Cy5).
Примечание:Note:
1. положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК гепатита Е);1. a positive control sample (plasmid construct containing hepatitis E cDNA);
2. кДНК гепатита Е, (разведение 1:100);2. hepatitis E cDNA, (1: 100 dilution);
3. кДНК гепатита Е, (разведение 1:1000);3. hepatitis E cDNA, (1: 1000 dilution);
4. кДНК гепатита Е, (разведение 1:10000);4. hepatitis E cDNA, (dilution 1: 10000);
5. отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер)5. negative control sample (single TE buffer)
На фиг. 3 представлены езультаты анализа вируса гепатита А методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G).In FIG. Figure 3 presents the results of the analysis of hepatitis A virus by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel R6G).
Примечание:Note:
1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК вируса гепатита А);1 - positive control sample (plasmid construct containing hepatitis A virus cDNA);
2 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:100);2 - hepatitis A virus cDNA, (1: 100 dilution);
3 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:1000);3 - hepatitis A virus cDNA, (1: 1000 dilution);
4 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:10000);4 - hepatitis A virus cDNA, (dilution 1: 10000);
5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5 - negative control sample (single TE buffer).
На фиг. 4 приведены результаты анализа ротовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX).In FIG. Figure 4 shows the results of the analysis of rotoviruses by real-time PCR using patentable oligonucleotides (ROX channel).
Примечание:Note:
1. положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК ротовируса);1. a positive control sample (plasmid construct containing rotovirus cDNA);
2. кДНК ротовируса, (разведение 1:100);2. cDNA of rotovirus, (1: 100 dilution);
3. кДНК ротовируса, (разведение 1:1000);3. cDNA of rotovirus, (dilution 1: 1000);
4. кДНК ротовируса, (разведение 1:10000);4. rotovirus cDNA, (dilution 1: 10000);
5. отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5. negative control sample (single TE buffer).
На фиг. 5 представлены результаты анализа аденовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал ROX).In FIG. Figure 5 presents the results of real-time PCR analysis of adenoviruses using patentable oligonucleotides (ROX channel).
Примечание:Note:
1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК аденовирусов);1 - positive control sample (plasmid construct containing adenovirus cDNA);
2 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:102);2 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 2 );
3 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:103);3 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 3 );
4 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:104);4 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 4 );
5 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:105);5 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 5 );
6 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:106);6 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 6 );
7 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:107);7 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 7 );
8 - кДНК аденовирусов, (разведение 1:108);8 - cDNA of adenoviruses, (dilution 1:10 8 );
9 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).9 - negative control sample (single TE buffer).
На фиг. 6 представлены результаты анализа астровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал Cy5).In FIG. 6 presents the results of the analysis of astroviruses by real-time PCR using patentable oligonucleotides (Cy5 channel).
Примечание:Note:
1 - кДНК астровирусов, (разведение 1:101);1 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 1 );
2 - кДНК астровирусов, (разведение 1:102);2 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 2 );
3 - кДНК астровирусов, (разведение 1:103);3 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 3 );
4 - кДНК астровирусов, (разведение 1:104);4 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 4 );
5 - кДНК астровирусов, (разведение 1:106);5 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 6 );
6 - кДНК астровирусов, (разведение 1:107);6 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 7 );
7 - кДНК астровирусов, (разведение 1:108); 7 - cDNA of astroviruses, (dilution 1:10 8 );
8 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).8 - negative control sample (single TE buffer).
На фиг. 7 приведены результаты анализа норовирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов (канал R6G).In FIG. 7 shows the results of the analysis of noroviruses by real-time PCR using patentable oligonucleotides (channel R6G).
Примечание:Note:
1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК норовирусов);1 - positive control sample (plasmid construct containing norovirus cDNA);
2 - кДНК норовирусов, (разведение 1:102);2 - cDNA of noroviruses, (dilution 1:10 2 );
3 - кДНК норовирусов, (разведение 1:103);3 - cDNA of noroviruses, (dilution 1:10 3 );
4 - кДНК норовирусов, (разведение 1:104);4 - cDNA of noroviruses, (dilution 1:10 4 );
5 - кДНК норовирусов, (разведение 1:105);5 - cDNA of noroviruses, (dilution 1:10 5 );
6 - кДНК норовирусов, (разведение 1:106);6 - cDNA of noroviruses, (dilution 1:10 6 );
7 - кДНК норовирусов, (разведение 1:107);7 - cDNA of noroviruses, (dilution 1:10 7 );
8 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).8 - negative control sample (single TE buffer).
Заявленная чувствительность известных наборов (аналогов и прототипа) не более 103 геномных эквивалентов (ГЭ) в образце. Разработанный авторами заявляемый набор реагентов для одновременного выявления энтеровирусов, ротовирусов, вирусов гепатита А и Е, аденовирусов, норовирусов и астровирусов методом ПЦР в реальном времени также имеет чувствительность – не более 103 геномных эквивалентов (ГЭ) в образце, но при этом позволяет реализовать большую мультиплексность – 7 инфекционных агентов (передающихся через воду) в одном образце, что подтверждает получение заявленного технического результата.The claimed sensitivity of the known kits (analogues and prototype) is not more than 10 3 genomic equivalents (GE) in the sample. Developed by the authors of the inventive set of reagents for the simultaneous detection of enteroviruses, rotoviruses, hepatitis A and E viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses by real-time PCR also has a sensitivity of not more than 10 3 genomic equivalents (GE) in the sample, but it allows to realize a large multiplicity - 7 infectious agents (transmitted through water) in one sample, which confirms the receipt of the claimed technical result.
Claims (48)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015147562A RU2610434C1 (en) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna enteroviruses, rotoviruses, hepatitis a and e viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by multiplex polymerase chain reaction |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015147562A RU2610434C1 (en) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna enteroviruses, rotoviruses, hepatitis a and e viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by multiplex polymerase chain reaction |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2610434C1 true RU2610434C1 (en) | 2017-02-10 |
Family
ID=58457480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015147562A RU2610434C1 (en) | 2015-11-05 | 2015-11-05 | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna enteroviruses, rotoviruses, hepatitis a and e viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by multiplex polymerase chain reaction |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2610434C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2689718C1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-05-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals |
| RU2818960C1 (en) * | 2023-12-04 | 2024-05-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-labelled probe for jmtv rna identification by pcr with hybridisation-fluorescence detection |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7351819B2 (en) * | 2000-09-29 | 2008-04-01 | Bml, Inc. | Method of detecting norwalk-like virus (GII) |
| RU2506317C2 (en) * | 2012-04-17 | 2014-02-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Method for detection of intestinal viruses in clinical samples of real-time multiplex pcr and list of sequencies for implementing it |
| RU2542968C2 (en) * | 2013-06-25 | 2015-02-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna of enteroviruses, rhinoviruses, viruses of hepatitis a and e from water medium by multiplex pcr method |
-
2015
- 2015-11-05 RU RU2015147562A patent/RU2610434C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7351819B2 (en) * | 2000-09-29 | 2008-04-01 | Bml, Inc. | Method of detecting norwalk-like virus (GII) |
| RU2506317C2 (en) * | 2012-04-17 | 2014-02-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Method for detection of intestinal viruses in clinical samples of real-time multiplex pcr and list of sequencies for implementing it |
| RU2542968C2 (en) * | 2013-06-25 | 2015-02-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna of enteroviruses, rhinoviruses, viruses of hepatitis a and e from water medium by multiplex pcr method |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHANG SOO LEE et al., Occurrence of human enteric viruses at freshwater beaches during swimming season and its link to water inflow, Science of the Total Environment, 2014, Vol.472, pp.757-766.. JIE LIU et al., Multiplex Reverse Transcription PCR Luminex Assay for Detection and Quantitation of Viral Agents of Gastroenteritis, J Clin Virol. 2011 April, Vol.50, No.4, pp.308-313.. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2689718C1 (en) * | 2018-01-16 | 2019-05-28 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Method for detecting genome of rotavirus infection agent in farm animals |
| RU2818960C1 (en) * | 2023-12-04 | 2024-05-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-labelled probe for jmtv rna identification by pcr with hybridisation-fluorescence detection |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Corpuz et al. | Viruses in wastewater: occurrence, abundance and detection methods | |
| CN111254228B (en) | Kit for detecting novel coronavirus and influenza virus | |
| CN106399590B (en) | Universal nucleic acid isothermal detection reagent for respiratory tract infection related adenovirus | |
| CN108192996B (en) | Multiple RT-RPA primer combination for detecting influenza A virus and parting H1 and H3 and application thereof | |
| TWI461541B (en) | Primer set, method and kit for detecting pathogen in animals or plants | |
| TWI451086B (en) | Primer set, method and kit for detecting pathogen in fish | |
| TWI435935B (en) | Kit and method for rapidly detecting a target nucleic acid fragment | |
| La Rosa et al. | Molecular detection of viruses in water and sewage | |
| CN108411039B (en) | Kit for detecting respiratory syncytial virus A, B type based on microfluidic chip and use method thereof | |
| CA2035471A1 (en) | Techniques for the amplification of nucleic acid | |
| CN110343784B (en) | Composition and kit for quadruple influenza virus nucleic acid detection based on melting curve | |
| CN110982940A (en) | Composition and kit for detecting nucleic acid of measles virus, rubella virus and mumps virus based on melting curve | |
| RU2610434C1 (en) | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna enteroviruses, rotoviruses, hepatitis a and e viruses, adenoviruses, noroviruses and astroviruses from an aqueous medium by multiplex polymerase chain reaction | |
| RU2681473C1 (en) | Test system for detection of the virus genome of parainfluenza 3 types at cattle with a multiplex polymerase chain reaction with fluorescent detection in real time mode | |
| CN113699279A (en) | Kit for detecting avian influenza virus and detection method thereof | |
| RU2542968C2 (en) | Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna of enteroviruses, rhinoviruses, viruses of hepatitis a and e from water medium by multiplex pcr method | |
| RU2511440C2 (en) | Method of quantitative determination of fixed rabies virus "moskva 3253" | |
| CN113817870B (en) | Primer composition for simultaneously detecting seven respiratory tract related viruses and application thereof | |
| CN112126715B (en) | Microfluidic chip kit for canine infectious virus and application method thereof | |
| JP2024502387A (en) | Method for detecting nucleic acids | |
| CN114214455A (en) | Hepatitis B virus DNA rapid quantitative primer probe and CRISPR/Cas12b detection system thereof | |
| CN109182597B (en) | Multiplex fluorescence quantitative PCR kit for simultaneously detecting avian adenovirus group I, II and III and detection method thereof | |
| CN112760417A (en) | RAP gene detection kit, detection method and application and RAP virus detection kit | |
| CN110106267A (en) | Methicillin-resistant staphylococcus aureus mecA genetic test primer sets | |
| RU2441917C2 (en) | Method for identification of 5т-htp genome of enteroviruses of evi and evii gene group implementing polymerase chain reaction |