RU2542968C2 - Set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked dna probes for identification of rna of enteroviruses, rhinoviruses, viruses of hepatitis a and e from water medium by multiplex pcr method - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention proposes a set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescent-marked DNA probes for identification of RNA of enteroviruses, rhinoviruses, viruses of hepatitis A and E in water samples from the environment by means of a multiplex PCR. The invention can be used in virology and epidemiology.

EFFECT: improving use efficiency.

4 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к наборам олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации генетического материала (РНК) энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и может быть использовано в вирусологии и эпидемиологии для обеспечения эпидемической безопасности населения при различных видах водопользования. The invention relates to sets of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently labeled DNA probes for identifying the genetic material (RNA) of enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses in environmental water samples by the method of multiplex polymerase chain reaction and can be used in virology and epidemiology to provide epidemic safety of the population with various types of water use.

Проблема обеспечения эпидемической безопасности населения России при различных видах водопользования является приоритетной государственной задачей в системе предупредительного санитарно-эпидемиологического надзора. Будучи одним из ведущих в реализации кишечных вирусных инфекций, водный путь передачи в настоящее время является одним из основных в формировании спорадической и вспышечной заболеваемости. The problem of ensuring the epidemic safety of the population of Russia with various types of water use is a priority state task in the system of preventive sanitary and epidemiological surveillance. Being one of the leading in the implementation of intestinal viral infections, the waterway is currently one of the main factors in the formation of sporadic and outbreak incidence.

Известно, что для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем, в практической лабораторной службе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Проблема лабораторной диагностики острых кишечных инфекций неустановленной этиологии у детей / Т.В. Амвросьева, Н.В. Поклонская, Е.П. Кишкурно, Н.Л. Клюйко, О.Н. Казинец, А.А. Безручко, О.И. Камяк // Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней: материалы междунар. науч.-практ. конф. / ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора. - Новосибирск, 2009. - С. 52-55). Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции, представляющего собой полимеразную цепную реакцию с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 3-6 часов обнаружить в исследуемом материале вирусную РНК. It is known that in order to indicate cytopathogenic viruses that spread by water, the practical laboratory service uses the method of their isolation on sensitive cell cultures. However, this method has several disadvantages that reduce its practical significance: the duration of the process (3-4 weeks), the inability to isolate non-cytolytic and damaged viral agents that are not able to cause a productive cytolytic infection in the in vitro system, but which nevertheless pose an epidemic danger living organism (The problem of laboratory diagnosis of acute intestinal infections of unknown etiology in children / T.V. Amvrosyeva, N.V. Poklonskaya, E.P. Kishkurno, N.L. Kluyko, O.N. Kazinets, A.A. Bezruchko, O.I. Kamyak // Persp Prospects for cooperation of the SCO member states in countering the threat of infectious diseases: Proceedings of the international scientific and practical conference / Federal State Institution “State Scientific Center of Virology and Biotechnology“ Vector ”of Rospotrebnadzor. - Novosibirsk, 2009. - P. 52-55). These problems arising in the study of the virological quality of water of various water bodies can be solved by using the detection method, which is a polymerase chain reaction with a reverse transcription step (RT-PCR), which allows detecting viral RNA in the test material within 3-6 hours .

Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) является наиболее распространенным методом, используемым в лабораторной практике для дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний. В основе метода лежат две реакции - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция. В реакции обратной транскрипции на матрице вирусной РНК строится комплиментарная ДНК (кДНК). В следующей за реакцией обратной транскрипции ПЦР происходит многократное избирательное удвоение целевого участка кДНК (амплификация). Амплифицируемый участок кДНК является маркерным, так как строго ограничен последовательностями ДНК-затравок (праймеров), без которых невозможно протекание ПЦР. Для детекции накопления продуктов амплификации в режиме реального времени помимо пары праймеров необходим также флуорисцентно-меченый ДНК-зонд. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. В случае если выбранные олигонуклеотиды не обладают видовой специфичностью к целевому объекту либо не обладают достаточной гомологией к целевой нуклеотидной последовательности, возможны ложноотрицательные результаты исследования. В случае если выбранные праймеры и зонды демонстрируют сродство к нецелевым последовательностям ДНК, то возможны ложноположительные результаты исследования. Правильный выбор сочетания пары праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет осуществить строго специфическую амплификацию целевого фрагмента кДНК и провести детекцию накопления продуктов ПЦР в режиме реального времени.The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) is the most common method used in laboratory practice for the differential diagnosis of infectious diseases. The method is based on two reactions - reverse transcription and polymerase chain reaction. In the reverse transcription reaction, a complementary DNA (cDNA) is built on the viral RNA matrix. In the subsequent PCR reverse transcription reaction, multiple selective doubling of the target cDNA region occurs (amplification). The amplified cDNA region is marker, since it is strictly limited to the sequences of DNA seeds (primers), without which PCR cannot occur. In order to detect the accumulation of amplification products in real time, in addition to a pair of primers, a fluorescently-labeled DNA probe is also required. The complexity of the choice of primers and probe is due to the requirement of their strict species specificity. If the selected oligonucleotides do not have species specificity for the target object or do not have sufficient homology to the target nucleotide sequence, false negative results of the study are possible. If the selected primers and probes demonstrate an affinity for non-target DNA sequences, then false-positive test results are possible. The correct choice of a combination of a pair of primers and a fluorescently labeled DNA probe allows for strictly specific amplification of the target cDNA fragment and real-time detection of PCR products accumulation.

Для ПЦР диагностики энтеровирусов используются ПЦР-тест-системы с детекцией методом электрофореза таких компаний, как ЗАО «БиоХимМак» (http://www.biochemmack.ru/product/moleculardiagnostics/infectious/), ЗАО «Литех» (наборы реагентов для ПЦР производства "ИзоГен") (http://www.lytech.ru/ catalog_69.htm). Набор с гибридизационно-флуоресцентной детекцией производит компания «ИнтерЛабСервис» (http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/ index.php?sid=678).For PCR diagnostics of enteroviruses, PCR test systems with electrophoresis detection are used by companies such as BioChemMack CJSC (http://www.biochemmack.ru/product/moleculardiagnostics/infectious/) and Litekh CJSC (reagent kits for PCR production of IzoGen) (http://www.lytech.ru/ catalog_69.htm). A kit with hybridization-fluorescence detection is produced by InterLabService (http://www.interlabservice.ru/catalog/reagents/ index.php? Sid = 678).

Для диагностики вирусов гепатита А методом ПЦР используются набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита A (HAV) в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® HAV-F (http://www.product_3056.html).For the diagnosis of hepatitis A viruses by PCR, a set of reagents is used to detect hepatitis A virus RNA (HAV) in clinical material and environmental objects using the polymerase chain reaction (PCR) with hybridization-fluorescence detection "AmpliSens® HAV-F (http: // www .product_3056.html).

Для диагностики вируса гепатита Е методом ПЦР наборы на территории России не выпускаются.For the diagnosis of hepatitis E virus by PCR, kits are not available in Russia.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является набор для детекции кДНК риновируса человека методом ПЦР, включающий набор праймеров: "АмплиСенс®ОРВИ-скрин-FL" (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва). Указанный набор реагентов позволяет выявлять возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (РНК респираторно-синцитиального вируса, метапневмовируса, вирусов парагриппа 1-4 типов, коронавирусов, риновирусов, ДНК аденовирусов групп B, C и E и бокавируса в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (http://www.pacxodka39.ru/product_3056.html)..The closest analogue (prototype) is a kit for the detection of human rhinovirus cDNA by PCR, including a set of primers: AmpliSens®ORVI-screen-FL (Central Research Institute of Epidemiology, Moscow). The indicated set of reagents makes it possible to identify the causative agents of acute human respiratory viral infections (ARVI) (RNA of the respiratory syncytial virus, metapneumovirus, type 1-4 parainfluenza viruses, coronaviruses, rhinoviruses, adenoviruses of groups B, C and E and bocavirus in the clinical material by the polymerase method reactions (PCR) with hybridization-fluorescence detection (http://www.pacxodka39.ru/product_3056.html) ..

Таким образом, в настоящее время мультиплексные ПЦР тест-системы для одновременной диагностики энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е на территории России и за рубежом не известны. Тем более нет специализированных тест-систем для выявления вирусов в образцах воды. Thus, at present, multiplex PCR test systems for the simultaneous diagnosis of enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses in Russia and abroad are not known. Moreover, there are no specialized test systems for detecting viruses in water samples.

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание набора реагентов: праймеры и флуоресцентно-меченые зонды, позволяющие идентифицировать энтеровирусы, риновирусы, вирусы гепатита А и Е, методом мультиплексной ПЦР в реальном времени.The technical result of the claimed invention is the creation of a set of reagents: primers and fluorescently-labeled probes, allowing to identify enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses, by real-time multiplex PCR.

Указанный технический результат достигается разработкой набора олиго-дезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакциии и имеющие представленную ниже (и в приложении к заявке) структуру нуклеотидных последовательностей:The indicated technical result is achieved by the development of a set of oligo-deoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for identification of RNA enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses from an aqueous medium by the method of multiplex polymerase chain reaction and having the nucleotide structure presented below (and in the application) sequences:

для выявленя РНК риновирусов:for the detection of rinovirus RNA:

- прямые (F1 и F2) и обратные (R1 и R2) праймеры:- direct (F1 and F2) and reverse (R1 and R2) primers:

F1: 5`-TARACCTIGCAGATGRGGC-3` F1: 5`-TARACCTIGCAGATGRGGC-3`

F2: 5`-TTAACCGTYAICCGCCA-3` F2: 5`-TTAACCGTYAICCGCCA-3`

R1: 5`-GAAACACGGACACCCAAAGTAG-3` R1: 5`-GAAACACGGACACCCAAAGTAG-3`

R2: 5`-ACCCAAAGTAGTCGGTCCC-3` R2: 5`-ACCCAAAGTAGTCGGTCCC-3`

- флуоресцентно-меченые ДНК-зонды (Z1 и Z2): - fluorescently-labeled DNA probes (Z1 and Z2):

Z1: FAM-CCYGCGTGGCIGCCTGC-BHQ1 Z1: FAM-CCYGCGTGGCIGCCTGC-BHQ1

Z2: FAM-YIAGCCTGCGTGGCGG-BHQ1 Z2: FAM-YIAGCCTGCGTGGCGG-BHQ1

для выявления РНК всех энтеровирусов A, B, C, D и полиовирусов:to detect RNA of all enteroviruses A, B, C, D and polioviruses:

- прямой (F3) и обратный (R3) праймеры:- direct (F3) and reverse (R3) primers:

F3: 5`- CAAGIACTTCTGTTICCYCGGACIGA -3` F3: 5`- CAAGIACTTCTGTTICCYCGGACIGA -3`

R3: 5`- ATITITCAATTGTCAICATAAGCAGCCA -3` R3: 5`- ATITITCAATTGTCAICATAAGCAGCCA -3`

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z3): - fluorescently-labeled DNA probe (Z3):

Z3: ROX- CCTIGGCNCCTGAIGCGGCTAATCC -BHQ2 Z3: ROX- CCTIGGCNCCTGAIGCGGCTAATCC -BHQ2

для выявления РНК вируса гепатита А:for the detection of hepatitis A virus RNA:

- прямой (F4) и обратный (R4) праймеры:- direct (F4) and reverse (R4) primers:

F4: 5`- GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT -3' F4: 5`- GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT -3 '

R4: 5`- CGGCGTTGAATGGTTTTTGT -3' R4: 5`- CGGCGTTGAATGGTTTTTTGT -3 '

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z4): - fluorescently-labeled DNA probe (Z4):

Z4: R6G- AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGT -BHQ2Z4: R6G- AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGT -BHQ2

для выявления РНК вируса гепатита Е:for the detection of hepatitis E virus RNA:

- прямой (F5) и обратный (R5) праймеры:- direct (F5) and reverse (R5) primers:

F5 5`- CGGCRGTGGTTTCTGGGGTGAC -3' F5 5`- CGGCRGTGGTTTCTGGGGTGAC -3 '

R5 5`- GGGGTTGGTTGGATGAATATAGGGG -3' R5 5`- GGGGTTGGTTGGATGAATATAGGGG -3 '

- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z5): - fluorescently-labeled DNA probe (Z5):

Z5 Cy5- TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCC -BHQ2Z5 Cy5- TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCC -BHQ2

Перечень графических материаловList of graphic materials

На фиг. 1. приведены графики анализа образцов на содержание риновирусов методом ПЦР в реальном времени. На фиг. 2. представлены графики анализа образцов на содержание энтеровирусов методом ПЦР в реальном времени. На фиг. 3. представлены графики анализа образцов на содержание вируса гепатита А методом ПЦР в реальном времени. На фиг. 4. приведены графики анализа образцов на содержание вируса гепатита Е методом ПЦР в реальном времениIn FIG. 1. graphs of the analysis of samples for the content of rhinoviruses by real-time PCR are shown. In FIG. 2. graphs of sample analysis for the content of enteroviruses by real-time PCR are presented. In FIG. 3. presents graphs of analysis of samples for the content of hepatitis A virus by real-time PCR. In FIG. 4. shows graphs of analysis of samples for the content of hepatitis E virus by real-time PCR

Апробация олигонуклеотидов была осуществлена с использованием лабораторной вирусной коллекции изолятов энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е (порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360)). Экспериментально было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонды обеспечивают надежный синтез целевых ДНК-фрагментов. Специфичность амплификации дополнительно подтверждали секвенированием.The oligonucleotides were tested using a laboratory viral collection of isolates of enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses (the research procedure was approved by the ethical committee of the Federal State Budget Scientific Center of the World Bank "Vector" (IRB 00001360)). It was experimentally shown that the selected primers and DNA probes provide reliable synthesis of target DNA fragments. The specificity of amplification was further confirmed by sequencing.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК риновирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры, фланкируют участок гена кодирующего вирусный гликопротеин 1 (VP1-ген). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 28117 по 28630 нуклеотид (513 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplifiable genomic RNA of rhinoviruses. The primers proposed for patenting flank a portion of the gene encoding the viral glycoprotein 1 (VP1 gene). In PCR, the genome fragment from 28117 to 28630 nucleotides (513 bp) is amplified. The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК энтеровирусов. Предлагаемые к патентованию праймеры комплементарны некодирующей части геномной РНК (5”-UTR). В ПЦР амплифицируется фрагмент генома с 72 по 521 нуклеотид (449 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of a set of primers and plot amplified genomic RNA enteroviruses. The primers proposed for patenting are complementary to the non-coding part of the genomic RNA (5 ”-UTR). In PCR, a fragment of the genome from 72 to 521 nucleotides (449 bp) is amplified. The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК вируса гепатита А. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 311 по 421 нуклеотид (110 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of the set of primers and the site of the amplified genomic RNA of hepatitis A. The primers proposed for patenting in PCR amplify a fragment of the genome from 311 to 421 nucleotides (110 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.

Характеристика набора праймеров и участка амплифицируемой геномной РНК вируса гепатита Е. Предлагаемые к патентованию праймеры в ПЦР амплифицируют фрагмент генома с 5298 по 5370 нуклеотид (72 п.н.). Использование в комплекте с диагностическими праймерами флуоресцентно-меченого ДНК-зонда позволяет производить детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени.Characterization of the set of primers and the site of the amplified genomic RNA of hepatitis E. The primers proposed for patenting in PCR amplify a fragment of the genome from 5298 to 5370 nucleotides (72 bp). The use of a fluorescently-labeled DNA probe complete with diagnostic primers allows real-time detection of the accumulation of amplification products.

Оптимизация условий проведения ПЦР осуществлялась с использованием коммерчески доступных наборов реагентов, приборов и ферментов, предназначенных для массового использования в лабораторной практике, что позволяет быстрое и надежное применение данного изобретения в медицинских и научно-исследовательских лабораториях.The optimization of the PCR was carried out using commercially available sets of reagents, devices and enzymes intended for mass use in laboratory practice, which allows quick and reliable application of this invention in medical and research laboratories.

Методика получения положительных контрольных образцовThe method of obtaining positive control samples

Положительные контрольные образцы были получены методом клонирования. Компетентные клетки E. coli линии TOP 10 (Invitrogen, США) были трансформированы рекомбинантными плазмидами pCR2.1 (Invitrogen, США), несущими вирусспецифическую вставку искусственно синтезированных фрагментов кДНК. Наличие специфической к вирусному геному ДНК-вставки подтверждали секвенированием.Positive control samples were obtained by cloning. Competent E. coli cells of the TOP 10 line (Invitrogen, USA) were transformed with recombinant plasmids pCR2.1 (Invitrogen, USA) carrying a virus-specific insert of artificially synthesized cDNA fragments. The presence of a viral genome-specific DNA insert was confirmed by sequencing.

Определение концентрации плазмидной ДНК осуществляли при помощи флуориметра QUBIT (Invitrogen, США) и наборов реагентов Quant-iT DNA HS. Измерение флюоресценции проводили на приборах “Rotor Gene 6000” (Corbet), ABI Prizm 7000 и iQ5 «BioRad» (США). Специфичность каждого из полученных амплификационных фрагментов была подтверждена секвенированием на генетическом анализаторе 3130x/ Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).The concentration of plasmid DNA was determined using a QUBIT fluorimeter (Invitrogen, USA) and Quant-iT DNA HS reagent kits. Fluorescence was measured using Rotor Gene 6000 instruments (Corbet), ABI Prizm 7000 and iQ5 BioRad (USA). The specificity of each of the obtained amplification fragments was confirmed by sequencing on a 3130x / Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).

Анализ эффективности проведенной трансформации осуществляли методом ПЦР в режиме реального времени в соответствии с протоколом, описанным ниже, где в реакционную смесь в качестве положительного образца добавляли 1×ТЕ-буфер, содержащий рекомбинантную плазмиду, со встройкой вирусспецифического синтезированного кДНК-дуплекса. В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь добавляли 1×ТЕ-буфер.The analysis of the efficiency of the transformation was carried out by real-time PCR in accordance with the protocol described below, where a 1 × TE buffer containing a recombinant plasmid was added to the reaction mixture with the insertion of a virus-specific synthesized cDNA duplex. As a negative control, 1 × TE buffer was added to the reaction mixture.

Конструирование внутреннего контрольного образцаConstruction of an internal control sample

В качестве внутреннего контрольного образца была использована защищенная двухцепочечная РНК фага MS-2. Псевдофаг получали клонированием под T5 фаговый промотор фрагмента 370 п.н. кДНК фага MS-2 в вектор pQE31. Синтез матричной РНК индуцировали IPTG. Фаговые частицы очищали центрифугированием.  As an internal control sample, protected double-stranded RNA of phage MS-2 was used. The pseudophage was obtained by cloning under T5 the phage promoter of the 370 bp fragment. phage MS-2 cDNA into pQE31 vector. Matrix RNA synthesis was induced by IPTG. Phage particles were purified by centrifugation.

Внутренний контрольный образец (ВКО), позволяет компенсировать ингибирование и контролировать процессы пробоподготовки и амплификации, что обеспечивает более точное определение РНК в каждом анализируемом образце. ВКО представляет собой неинфекционную защищенную РНК бактериофага MS2 (концентрация 10⁵ копий РНК MS2/мл).The internal control sample (CTP) allows you to compensate for inhibition and control the processes of sample preparation and amplification, which provides a more accurate determination of RNA in each analyzed sample. EKO is a non-infectious protected RNA of the bacteriophage MS2 (concentration of 10 ⁵ copies of MS2 RNA / ml).

Выделение вируссодержащего материала из образцов воды.Isolation of virus-containing material from water samples.

Пробу воды готовили 1000-кратным разведением клинического образца, содержащего ротавирус в дистилированной и автоклавированнной воде. Пробы подвергались фильтрации через подобранную оптимальную фильтрационную систему. После чего производилась элюция с мембраны, выделение РНК, обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени с использованием мультиплексного варианта тест-систем. Наиболее удобной в работе оказалась система вакуумной фильтрации с приставкой предварительной фильтрации (Sartorius, Германия), поскольку одновременно позволяла проводить отсечку бактериального компонента из образцов воды (на первый 0.22 мкм фильтр) и сорбцию вирусного материала на мембрану марки ММПА+-020-142 (ООО НПП «Технофильтр», Россия). Мембраны обладают повышенной сорбционной способностью по отношению к вирусам, колифагам и пирогенам. Мембраны микропористые полиамидные с положительным дзета-потенциалом, изготовленные на основе полиамида (Nylon-6 и Nylon-66). Мембраны ММПА+ имеют крупноячеистое строение с тонкими микропористыми перегородками, что предопределяет непрерывность структуры мембран и обеспечивает прочность и эластичность в сухом и смоченном виде. Благодаря высокой пористости и контролируемому размеру пор мембраны обладают высокой эффективностью удержания микрочастиц при большой скорости фильтрации.A water sample was prepared by 1000-fold dilution of a clinical sample containing rotavirus in distilled and autoclaved water. Samples were filtered through a matched optimal filtration system. After that, elution from the membrane, RNA isolation, reverse transcription and real-time PCR were performed using the multiplex version of the test systems. The most convenient vacuum filtering system with a prefilter attachment (Sartorius, Germany) turned out to be the most convenient in operation, since it simultaneously allowed the bacterial component to be cut off from water samples (onto the first 0.22 μm filter) and the sorption of viral material onto an MMPA + -020-142 membrane (LLC NPP Technofilter, Russia). Membranes have increased sorption ability with respect to viruses, coliphages and pyrogens. Positive zeta-potential microporous polyamide membranes made on the basis of polyamide (Nylon-6 and Nylon-66). MMPA + membranes have a coarse-grained structure with thin microporous partitions, which determines the continuity of the membrane structure and provides strength and elasticity in a dry and moistened form. Due to their high porosity and controlled pore size, membranes have high microparticle retention efficiency at high filtration rates.

Экстракция вирусной РНКViral RNA Extraction

Вирусную РНК выделяли из 100 мкл вируссодержащей жидкости с использованием набора «ЛИТЕХ» (г. Москва) согласно инструкции производителя.Viral RNA was isolated from 100 μl of virus-containing liquid using the LITEX kit (Moscow) according to the manufacturer's instructions.

Реакция обратной транскрипцииReverse transcription reaction

Синтез комплементарной ДНК (кДНК) проводили на матрице суммарной РНК с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИЭ, г. Москва) согласно инструкции производителя.The synthesis of complementary DNA (cDNA) was carried out on a total RNA matrix using the Revert-L reagent kit (FBUN TSNIIE, Moscow) according to the manufacturer's instructions.

Проведение полимеразной цепной реакцииPolymerase chain reaction

Условия проведения амплификации оптимизировали по концентрации ионов магния, концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси, а также по температуре отжига праймеров.The amplification conditions were optimized by the concentration of magnesium ions, the concentration of primers and probes in the reaction mixture, and also by the annealing temperature of the primers.

Реакцию амплификации проводили в 30 мкл смеси для ПЦР (таб. 1), содержащей 1×Taq буфер для амплификации, 2.5 мМ MgCl₂, 0.17 мМ каждого из нуклеозидтрифосфатов, 1.5 активных единиц Smart Taq ДНК-полимеразы (все компоненты ООО «Лаборатория МЕДИГЕН»), 20 пМ прямого и обратного праймеров и 8 пМ флуоресцентного ДНК-зонда.The amplification reaction was carried out in 30 μl of a PCR mixture (Table 1) containing 1 × Taq amplification buffer, 2.5 mM MgCl ₂ , 0.17 mM each of the nucleoside triphosphates, 1.5 active units of Smart Taq DNA polymerase (all components of MEDIGEN Lab LLC ), 20 pM forward and reverse primers and 8 pM fluorescent DNA probe.

Таблица 1Table 1 ПЦР-смесь (из расчета на одну пробирку)PCR mixture (per tube) КомпонентComponent Объем, мклVolume μl ПЦР-буфер×10PCR buffer × 10 33 дНТФ (5 мМ)dNTP (5 mm) 1one MgCl₂ (50 мМ)MgCl ₂ (50 mm) 1.51.5 Hot Start Taq ДНК-полимеразаHot Start Taq DNA Polymerase 0.30.3 Смесь прямых праймеров - F (10 нМ)The mixture of direct primers - F (10 nm) 22 Смесь обратных праймеров - R (10 нМ)The mixture of reverse primers - R (10 nm) 22 Смесь ДНК-зондов - Z (15 нМ)A mixture of DNA probes - Z (15 nm) 0.50.5 ОбразецSample 33 diH₂OdiH ₂ O 16.716.7

ПЦР в режиме реального времени проводили согласно программе амплификации (таблица 2). Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналам - по каналам Green (FAM, 470 nm /510 nm), Yellow (530 нм / 555 нм), Red (625 нм / 660 нм) и Orange ( ). Измерение флуоресценции проводили на приборах “Rotor Gene 6000” (Corbet Research, Австралия) и iQ5 (BioRad, США). Результаты оценивали по наличию флуоресценции до 30 цикла (фиг. 1-4).Real-time PCR was performed according to the amplification program (table 2). The fluorescence intensity was detected through the channels - through the channels Green (FAM, 470 nm / 510 nm), Yellow (530 nm / 555 nm), Red (625 nm / 660 nm) and Orange (). Fluorescence was measured on a Rotor Gene 6000 instrument (Corbet Research, Australia) and iQ5 (BioRad, USA). The results were evaluated by the presence of fluorescence up to 30 cycles (Fig. 1-4).

Таблица 2table 2 Программа амплификации Amplification program №No. ОперацияOperation T, °CT, ° C T, мин:сT, min: s 1one Hold/Активация Smart-Taq-ДНК-полимеразыHold / Activation of Smart-Taq-DNA Polymerase 9595 05:0005:00 22 Cycling 1/Циклирование 1 (10 циклов)Cycling 1 / Cycling 1 (10 cycles) 9595 00:1000:10 5555 00:3000:30 7272 00:2000:20 33 Cycling 2/Циклирование 2 (30 циклов)Cycling 2 / Cycling 2 (30 cycles) 9595 00:1000:10 5555 00:30 детекция00:30 detection 7272 00:2000:20

В эксперименте методом ПЦР в реальном времени были проанализированы последовательные десятикратные разведения кДНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е из образцов воды. На фиг. 1-4 представлены графики результатов анализа образцов методом ПЦР в реальном времени. In a real-time PCR experiment, sequential tenfold dilutions of cDNA of enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses from water samples were analyzed. In FIG. Figures 1–4 show real-time PCR analysis of samples.

На фиг. 1. приведены результаты анализа образцов на содержание риновирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов, где:In FIG. 1. presents the results of the analysis of samples for the content of rhinoviruses by real-time PCR using patented oligonucleotides, where:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция, содержащая кДНК риновируса);1 - positive control sample (plasmid construct containing rhinovirus cDNA);

2 - кДНК риновируса, (разведение 1:100);2 - rhinovirus cDNA, (1: 100 dilution);

3 - кДНК риновируса, (разведение 1:1000);3 - cDNA of rhinovirus, (dilution 1: 1000);

4 - кДНК риновируса, (разведение 1:10000);4 - cDNA of rhinovirus, (dilution 1: 10000);

5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5 - negative control sample (single TE buffer).

На фиг. 2. Приведены результаты анализа образцов на содержание энтеровирусов методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов, где:In FIG. 2. The results of analysis of samples for the content of enteroviruses by real-time PCR using patented oligonucleotides, where:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция содержащая кДНК энтеровируса);1 - positive control sample (plasmid construct containing enterovirus cDNA);

2 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:100);2 - enterovirus cDNA, (1: 100 dilution);

3 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:1000);3 - enterovirus cDNA, (1: 1000 dilution);

4 - кДНК энтеровируса, (разведение 1:10000);4 - enterovirus cDNA, (dilution 1: 10000);

5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5 - negative control sample (single TE buffer).

На фиг. 3. представлены результаты анализа образцов на содержание вируса гепатита А методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов, где:In FIG. 3. presents the results of the analysis of samples for the content of hepatitis A virus by real-time PCR using patentable oligonucleotides, where:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция содержащая кДНК вируса гепатита А);1 - positive control sample (plasmid construct containing hepatitis A virus cDNA);

2 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:100);2 - hepatitis A virus cDNA, (1: 100 dilution);

3 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:1000);3 - hepatitis A virus cDNA, (1: 1000 dilution);

4 - кДНК вируса гепатита А, (разведение 1:10000);4 - hepatitis A virus cDNA, (dilution 1: 10000);

5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5 - negative control sample (single TE buffer).

На фиг. 4. приведены результаты анализа образцов на содержание вируса гепатита Е методом ПЦР в реальном времени с использованием патентуемых олигонуклеотидов, где:In FIG. 4. presents the results of the analysis of samples for the content of hepatitis E virus by real-time PCR using patentable oligonucleotides, where:

1 - положительный контрольный образец (плазмидная конструкция содержащая кДНК вируса гепатита Е);1 - positive control sample (plasmid construct containing hepatitis E virus cDNA);

2 - кДНК вируса гепатита Е (разведение 1:100);2 - hepatitis E virus cDNA (1: 100 dilution);

3 - кДНК вируса гепатита Е (разведение 1:1000);3 - hepatitis E virus cDNA (dilution 1: 1000);

4 - кДНК вируса гепатита Е (разведение 1:10000);4 - hepatitis E virus cDNA (dilution 1: 10000);

5 - отрицательный контрольный образец (однократный ТЕ-буфер).5 - negative control sample (single TE buffer).

Таким образом, из вышеизложенного следует, что достигнут заявляемый технический результат, а именно: разработан набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов, обеспечивающих надежную детекцию энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е в образцах воды из окружающей среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакции.Thus, it follows from the foregoing that the claimed technical result is achieved, namely: a set of oligonucleotide primers and fluorescently-labeled probes have been developed that provide reliable detection of enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses in water samples from the environment by the multiplex polymerase chain reaction.

В рамках заявляемого технического решения разработанные праймеры и ДНК-зонды обладают высокой степенью гомологии ко всем известным нуклеотидным последовательностям геномов изолятов РНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е человека, доступным в международной базе данных биотехнологической информации GenBank.In the framework of the claimed technical solution, the developed primers and DNA probes have a high degree of homology to all known nucleotide sequences of the genomes of RNA isolates of enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses of humans, available in the GenBank international database of biotechnological information.

Claims (1)

Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для идентификации РНК энтеровирусов, риновирусов, вирусов гепатита А и Е из водной среды методом мультиплексной полимеразной цепной реакциии и имеющие следующую структуру:
Для выявления РНК риновирусов:
прямые (F1 и F2) и обратные (R1 и R2) праймеры:
F1: 5`-TA(A/G)ACCT(A/T/C/G)GCAGATG(A/G)GGC-3`
F2: 5`-TTAACCGT(А/С)A(A/T/C/G)CCGCCA-3`
R1: 5`-GAAACACGGACACCCAAAGTAG-3`
R2: 5`-ACCCAAAGTAGTCGGTCCC-3`
флуоресцентно-меченые ДНК-зонды (Z1 и Z2):
Z1: FAM-CC(A/C)GCGTGGC(A/T/C/G)GCCTGC-BHQ1
Z2: FAM-(A/C)(A/T/C/G)AGCCTGCGTGGCGG-BHQ1
Для выявления РНК всех энтеровирусов А, В, С, D и полиовирусов:
- прямой (F3) и обратный (R3) праймеры:
F3: 5`-CAAG(A/T/C/G)ACTTCTGTT(A/T/C/G)CC(A/C)CGGAC(A/T/C/G)GA-3`
R3: 5`-AT(A/T/C/G)T(A/T/C/G)TCAATTGTCA(A/T/C/G)CATAAGCAGCCA-3`
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z3):
Z3: ROX-CCT(A/T/C/G)GGC(A/T/C/G)CCTGA(A/T/C/G)GCGGCTAATCC-BHQ2
Для выявления РНК вируса гепатита А:
- прямой (F4) и обратный (R4) праймеры:
F4: 5`-GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT-3′
R4: 5`-CGGCGTTGAATGGTTTTTGT-3′
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z4):
Z4: R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGT-BHQ2
Для выявления РНК вируса гепатита Е:
- прямой (F5) и обратный (R5) праймеры:
F5: 5`-CGGC(A/G)GTGGTTTCTGGGGTGAC-3′
R5: 5`-GGGGTTGGTTGGATGAATATAGGGG-3′
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z5):
Z5 Су5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCC-BHQ2 A set of oligodeoxyribonucleotide primers and fluorescently-labeled DNA probes for the identification of RNA enteroviruses, rhinoviruses, hepatitis A and E viruses from an aqueous medium by the method of multiplex polymerase chain reaction and having the following structure:
To detect rhinovirus RNA:
forward (F1 and F2) and reverse (R1 and R2) primers:
F1: 5`-TA (A / G) ACCT (A / T / C / G) GCAGATG (A / G) GGC-3`
F2: 5`-TTAACCGT (A / C) A (A / T / C / G) CCGCCA-3`
R1: 5`-GAAACACGGACACCCAAAGTAG-3`
R2: 5`-ACCCAAAGTAGTCGGTCCC-3`
fluorescently-labeled DNA probes (Z1 and Z2):
Z1: FAM-CC (A / C) GCGTGGC (A / T / C / G) GCCTGC-BHQ1
Z2: FAM- (A / C) (A / T / C / G) AGCCTGCGTGGCGG-BHQ1
To detect RNA of all enteroviruses A, B, C, D and polioviruses:
- direct (F3) and reverse (R3) primers:
F3: 5`-CAAG (A / T / C / G) ACTTCTGTT (A / T / C / G) CC (A / C) CGGAC (A / T / C / G) GA-3`
R3: 5`-AT (A / T / C / G) T (A / T / C / G) TCAATTGTCA (A / T / C / G) CATAAGCAGCCA-3`
- fluorescently-labeled DNA probe (Z3):
Z3: ROX-CCT (A / T / C / G) GGC (A / T / C / G) CCTGA (A / T / C / G) GCGGCTAATCC-BHQ2
To detect hepatitis A virus RNA:
- direct (F4) and reverse (R4) primers:
F4: 5`-GTAGGCTACGGGTGAAACCTCTT-3 ′
R4: 5`-CGGCGTTGAATGGTTTTTTGT-3 ′
- fluorescently-labeled DNA probe (Z4):
Z4: R6G-AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGT-BHQ2
To detect hepatitis E virus RNA:
- direct (F5) and reverse (R5) primers:
F5: 5`-CGGC (A / G) GTGGTTTCTGGGGTGAC-3 ′
R5: 5`-GGGGTTGGTTGGATGAATATAGGGG-3 ′
- fluorescently-labeled DNA probe (Z5):
Z5 Su5-TGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCC-BHQ2

Images