RU2597987C1 - RECOMBINANT BACTERIAL STRAIN Escherichia coli N42 (pElmI) - PRODUCER OF METHYL-DEPENDANT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE ElmI - Google Patents

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention represents recombinant bacterial strain Escherichia coli N42 (pElmI) being a producer of methyl-dependant site-specific DNA-endonuclease ElmI splitting both chains of DNA sequence 5′-GC^NGC-3′/3′-CGN^CG-5′, in which at least three cytosines are methylated in the C5 position to form 5′-projecting nucleotide ends. Strain is produced by cells transformation of Escherichia coli ER2267 with pElmI plasmid. This plasmid is designed on the basis of vector pMTL22 and contains a gene coding the methyl-dependant site-specific DNA-endonuclease ElmI from the natural strain Escherichia coli N17.

EFFECT: invention enables to obtain DNA-endonucleases ElmI of a specified specificity with higher output.

1 cl, 4 dwg, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии и микробиологической промышленности, и касается нового рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli (E.coli), который может быть использован для получения высокоактивного препарата метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы ElmI, расщепляющей обе цепи последовательности ДНК 5′-GC^NGC-3′/3′-CGN^CG-5′, в которой не менее трех цитозинов метилированы в положении С5 с образованием 5′-выступающих однонуклеотидных концов.The invention relates to biotechnology, in particular to genetic engineering and the microbiological industry, and relates to a new recombinant strain of bacteria Escherichia coli (E. coli), which can be used to obtain a highly active preparation of a methyl-dependent site-specific DNA endonuclease ElmI, cleaving both chains of the DNA sequence 5′-GC ^ NGC-3 ′ / 3′-CGN ^ CG-5 ′, in which at least three cytosines are methylated at position C5 to form 5′-protruding single nucleotide ends.

Главными биотехнологически значимыми параметрами сайт-специфических метилзависимых ДНК-эндонуклеаз (MD-эндонуклеаз) являются узнаваемая последовательность, узнаваемый узор метилирования, позиция гидролиза относительно этой последовательности, необходимость присутствия кофакторов (например, Mg²⁺ или АТФ) и активность препарата фермента, выделенного из соответствующего штамма-продуцента.The main biotechnologically significant parameters of site-specific methyl-dependent DNA endonucleases (MD endonucleases) are the recognizable sequence, the recognizable methylation pattern, the position of hydrolysis relative to this sequence, the need for the presence of cofactors (e.g. Mg ²⁺ or ATP) and the activity of the enzyme preparation isolated from the corresponding producer strain.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Planomicrobium koreense 78K, продуцирующий метилзависимую эндонуклеазу PkrI [1], которая узнает последовательность нуклеотидов 5′-GCN^GC-3′/3′-CG^NCG-5′ со сходным узором метилирования, требует для эффективного расщепления наличия в узнаваемой последовательности не менее трех 5-метитиозинов (5 mC), но расщепляет эту последовательность после центрального нуклеотида N.The closest to the claimed strain, the prototype, is the Planomicrobium koreense 78K strain producing methyl-dependent endonuclease PkrI [1], which recognizes the nucleotide sequence 5′-GCN ^ GC-3 ′ / 3′-CG ^ NCG-5 ′ with a similar methylation pattern, requires for effective cleavage the presence of at least three 5-metithiosines (5 mC) in a recognizable sequence, but cleaves this sequence after the central nucleotide N.

Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза не расщепляет узнаваемую последовательность перед центральным нуклеотидом N с образованием 5′-выступающих концов. Это свойство оказывается существенно важным при проведении генно-инженерных манипуляций, когда необходимо с помощью сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы получать одноцепочечные выступающие (липкие) концы ДНК, которые затем могут быть сшиты с фрагментами, образованными в результате гидролиза другими эндонуклеазами и имеющими такую же «липкость».A disadvantage of the known strain is that the site-specific endonuclease produced by it does not cleave a recognizable sequence in front of the central nucleotide N with the formation of 5′-protruding ends. This property turns out to be significantly important during genetic engineering manipulations, when it is necessary to obtain single-stranded protruding (sticky) DNA ends using site-specific DNA endonuclease, which can then be crosslinked with fragments formed as a result of hydrolysis by other endonucleases and having the same " stickiness. "

В настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих последовательность 5′-GC^NGC-3′/3′-CGN^CG-5′ перед центральным нуклеотидом N, в которой вместо цитозина присутствуют три или четыре 5-метилцитозина.At present, bacterial strains producing methyl-dependent site-specific DNA endonucleases that recognize and cleave the 5′-GC ^ NGC-3 ′ / 3′-CGN ^ CG-5 ′ sequence before the central nucleotide N, in which instead of cytosine three or four 5-methylcytosines are present.

Задачей изобретения является получение рекомбинантного штамма E. coli, продуцирующего MD-эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GC^NGC-3′/3′-CGN^CG-5′, при метилировании в ней не менее трех цитозинов в положении С5 и не расщепляет данную последовательность, если число метилированных цитозинов оказывается меньше трех.The objective of the invention is to obtain a recombinant strain of E. coli that produces MD-endonuclease, which recognizes and cleaves both chains of the nucleotide sequence of DNA 5′-GC ^ NGC-3 ′ / 3′-CGN ^ CG-5 ′, with methylation in it not less than three cytosines at position C5 and does not cleave this sequence if the number of methylated cytosines is less than three.

Поставленная задача решается путем получения рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli N42 (pElmI) - продуцента MD-эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей последовательности нуклеотидов:The problem is solved by obtaining a recombinant strain of bacteria Escherichia coli N42 (pElmI) - a producer of MD-endonuclease that recognizes and cleaves the nucleotide sequence:

5′-G(5mC)^NG(5mC)-3′/3′-(5mC)GN^G(5mC)-5′ (четыре 5-метилцитозина), G(5mC)^NG(5mC)-3′/3′-(5mC)GN^GC-5′ (три 5-метилцитозина), G(5mC)^NG(5mC)-3′/3′-CGN^G(5mC)-5′ (три 5-метилцитозина), где знаком «^» указаны позиции расщепления ДНК.5′-G (5mC) ^ NG (5mC) -3 ′ / 3 ′ - (5mC) GN ^ G (5mC) -5 ′ (four 5-methylcytosines), G (5mC) ^ NG (5mC) -3 ′ / 3 ′ - (5mC) GN ^ GC-5 ′ (three 5-methylcytosines), G (5mC) ^ NG (5mC) -3 ′ / 3′-CGN ^ G (5mC) -5 ′ (three 5-methylcytosines ), where the sign “^” indicates the position of DNA cleavage.

Техническим результатом изобретения является получение рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli N42 (pElmI), продуцирующего MD-эндонуклеазу заданной специфичности с более высоким выходом по сравнению с исходным природным штаммом Escherichia coli N17.The technical result of the invention is to obtain a recombinant strain of bacteria Escherichia coli N42 (pElmI) producing MD-endonuclease of a given specificity with a higher yield compared to the original natural strain Escherichia coli N17.

Предлагаемый штамм-продуцент получен путем трансформации клеток Escherichia coli штамма ER2267 плазмидной ДНК pElmI. Данная плазмида, полученная на основе вектора pMTL22 [2], включает участок хромосомной ДНК штамма Escherichia coli N17, являющегося продуцентом метилзависимой ДНК-эндонуклеазы ElmI, выделенного из природного материала (воды) в результате целенаправленного систематического поиска, но не являющегося высокопродуктивным (активность препарата фермента, выделенного из Escherichia coli N17, составляла всего 100 е.а./мл). Благодаря активации промотора гена lacZ в pMTL22 путем добавления индуктора (0.5 мМ IPTG) в процессе выращивания предлагаемого штамма Escherichia coli N42 (pElmI) удалось добиться повышения удельной активности целевого фермента в биомассе в 20 раз по сравнению с природным штаммом.The proposed producer strain obtained by transformation of Escherichia coli cells of strain ER2267 plasmid DNA pElmI. This plasmid, obtained on the basis of the vector pMTL22 [2], includes a chromosomal DNA region of the strain Escherichia coli N17, which is a producer of methyl-dependent ElmI DNA endonuclease isolated from natural material (water) as a result of a targeted systematic search, but which is not highly productive (the activity of the enzyme preparation) isolated from Escherichia coli N17 was only 100 ea / ml). Due to the activation of the lacZ gene promoter in pMTL22 by adding an inducer (0.5 mM IPTG) during the cultivation of the proposed strain of Escherichia coli N42 (pElmI), it was possible to increase the specific activity of the target enzyme in biomass by 20 times compared to the natural strain.

На фигуре 1 представлена физическая карта плазмиды pElmI, гдеThe figure 1 presents the physical map of the plasmid pElmI, where

ORI - точка начала репликации плазмиды pElmI;ORI — replication origin of plasmid pElmI;

Ap^r - ген bla, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;Ap ^r - bla gene, providing resistance to ampicillin;

P(BLA) - промотор гена bla;P (BLA) - bla gene promoter;

P(LAC) - промотор гена lacZ;P (LAC) - lacZ gene promoter;

elmI - ген, кодирующий метилзависимую эндонуклеазу ElmI;elmI — gene encoding the methyl dependent endonuclease ElmI;

Сконструированной плазмидой pElmI трансформируют клетки E.coli штамма ER2267 и подращивают при 37°C в течение ночи. Трансформантов отбирают на селективной агаризованной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, по устойчивости к антибиотику. Содержание рекомбинантной MD-эндонуклеазы ElmI составляет не менее 4000 е.а./г влажной биомассы.The constructed plasmid pElmI transform E. coli cells of strain ER2267 and grow at 37 ° C overnight. Transformants were selected on a selective agarized nutrient medium containing 100 μg / ml ampicillin, antibiotic resistance. The content of recombinant ElmI MD endonuclease is at least 4000 ea / g wet biomass.

Преимуществом заявляемого штамма, по сравнению с наиболее близким аналогом, является то, что при расщеплении метилированной ДНК продуцируемой им метилзависимой ДНК-эндонуклеазой образуются однонуклеотидные 5′-выступающие «липкие» концы, сходные с концами, получающимися при расщеплении ДНК такими эндонуклеазами рестрикции, как, например, Fsp4HI (сайт узнавания 5′-GC^NGC-3′), Bst2UI (5′-CC^WGG-3′), AsuC2I (5′-CC^SGG-3′), MspR9I (5′-CC^NGG-3′), AclWI (5′-GGATC-3′ (4/5)) и других [3], а также рядом метилзависимых ДНК-эндонуклеаз, например, MteI (сайт узнавания 5′-G(5mC)G(5mC)^NG(5mC)G(5mC)-3′), что позволяет эффективно применять фермент ElmI в разнообразных генно-инженерных манипуляциях.The advantage of the claimed strain, compared with the closest analogue, is that when the methylated DNA is cleaved by the methyl-dependent DNA endonuclease produced by it, single-nucleotide 5 ′ protruding “sticky” ends are formed, similar to the ends obtained when the DNA is cleaved with restriction endonucleases such as e.g. Fsp4HI (recognition site 5′-GC ^ NGC-3 ′), Bst2UI (5′-CC ^ WGG-3 ′), AsuC2I (5′-CC ^ SGG-3 ′), MspR9I (5′-CC ^ NGG-3 ′), AclWI (5′-GGATC-3 ′ (4/5)) and others [3], as well as a number of methyl-dependent DNA endonucleases, for example, MteI (recognition site 5′-G (5mC) G ( 5mC) ^ NG (5mC) G (5mC) -3 ′), which allows you to effectively use the ElmI enzyme in a variety of genetic engineering manipulations.

Штамм Escherichia coli N42 (pElmI) имеет следующие характеристики.The strain Escherichia coli N42 (pElmI) has the following characteristics.

Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological characters.

Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, 1×3,5 мкм, подвижные. Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (ΜΠΑ, МПБ, LB-бульон, LB-arap, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.The cells are small, rod-shaped, gram-negative, 1 × 3.5 μm, motile. The strain grows well on ordinary nutrient media (ΜΠΑ, MPB, LB-broth, LB-arap, minimal medium with glucose). When growing on an agarized LB medium, the colonies are round, smooth, translucent, shiny, gray. The edge is even, the diameter of the colonies is 1-3 mm, the consistency is pasty. Growth in liquid media (LB, minimal medium with glucose) is characterized by even turbidity, the sediment easily sedimentes.

Физиолого-биохимические признаки.Physiological and biochemical characteristics.

Клетки растут при 4-42°C, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.Cells grow at 4-42 ° C, optimum pH is 6.8-7.6. As a source of nitrogen, both ammonium mineral salts and organic compounds are used: amino acids, peptone, tryptone, yeast extract. When growing on a minimal medium, glycerin, carbohydrates, amino acids are used as a carbon source.

Генетические признаки, устойчивость к антибиотикам.Genetic signs, antibiotic resistance.

Штамм-хозяин Escherichia coli ER2267 (F′ proA+B+lacIqΔ(lacZ)M15 zzf::mini-Tn10 (KanR)/Δ(argF-lacZ)U169 glnV44 e14-(McrA-)Δ(mcrC-mrr)). Проявляет устойчивость к канамицину (до 25 мкг/мл).The host strain Escherichia coli ER2267 (F ′ proA + B + lacIqΔ (lacZ) M15 zzf :: mini-Tn10 (KanR) / Δ (argF-lacZ) U169 glnV44 e14- (McrA-) Δ (mcrC-mrr)). It is resistant to kanamycin (up to 25 μg / ml).

Штамм Escherichia coli N42 (pElmI) дополнительно проявляет устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием гена устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pElmI.The strain Escherichia coli N42 (pElmI) additionally shows resistance to ampicillin (up to 300 μg / ml), due to the presence of a resistance gene in the DNA of the recombinant plasmid pElmI.

Условия хранения штамма.Storage conditions of the strain.

Штамм Escherichia coli N42 (pElmI) хранят на агаризованной среде LB со 100 мкг/мл ампициллина на чашках Петри или в стеклянных пробирках со скошенным агаром при 4°C. Пересевы на свежие среды делают один раз в месяц. Может храниться не менее года в среде LB, содержащей 30% глицерин, при -50-70°C. Длительное хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -70°C.The Escherichia coli strain N42 (pElmI) was stored on LB agar medium with 100 μg / ml ampicillin in Petri dishes or in glass tubes with agar slant at 4 ° C. Reseeding on fresh Wednesday do once a month. It can be stored for at least a year in LB medium containing 30% glycerol at -50-70 ° C. Long-term storage of the strain is carried out in a freeze-dried state or in a solution of 30% glycerol at a temperature of -70 ° C.

Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Культивирование проводят при 37°C с аэрацией до достижения стационарной стадии роста. Выход препарата фермента ElmI составляет ~0,5 мл/г сырой биомассы с концентрацией 2000 е.а./мл.For the cultivation of the strain, the following composition is used (g / l): tryptone - 10, yeast extract - 5, NaCl - 5, with the addition of 100 μg / ml ampicillin. Cultivation is carried out at 37 ° C with aeration until a stationary growth stage is reached. The yield of the ElmI enzyme preparation is ~ 0.5 ml / g of crude biomass with a concentration of 2000 ea / ml.

Продуцируемая новым рекомбинантным штаммом метилзависимая ДНК-энднуклеаза ElmI характеризуется следующими свойствами: 1. Узнает и расщепляет последовательность 5′-GC^ΝGC-3′/3′-CGN^CG-5′ на обеих цепях ДНК перед центральным нуклеотидом N при условии метилирования не менее трех из четырех возможных цитозинов в ней в положении С5.The methyl-dependent DNA endnuclease ElmI produced by the new recombinant strain is characterized by the following properties: 1. Recognizes and cleaves the 5′-GC ^ ΝGC-3 ′ / 3′-CGN ^ CG-5 ′ sequence on both DNA chains in front of the central nucleotide N under the condition of methylation not less than three of the four possible cytosines in it at position C5.

3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, если количество метилированных цитозинов в ней меньше трех, а также неметилированную последовательность 5′-GCNGC-3′/3′-CGNCG-5′.3. Does not split the above sequence if the number of methylated cytosines in it is less than three, as well as the unmethylated sequence 5′-GCNGC-3 ′ / 3′-CGNCG-5 ′.

4. Оптимальная температура реакции 37°C.4. The optimum reaction temperature is 37 ° C.

5. Фермент проявляет высокую активность в буфере следующего состава: 10 мМ Трис-HCl (рН 8,5 при 25°C), 10 мМ магния ацетат, 10 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол.5. The enzyme is highly active in a buffer of the following composition: 10 mM Tris-HCl (pH 8.5 at 25 ° C), 10 mM magnesium acetate, 10 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз является то, что он позволяет получать коммерчески доступный препарат, не имеющий аналогов, метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы ElmI, которая узнает и расщепляет обе цепи последовательности 5′-GC^NGC-3′/3′-CGN^CG-5′ перед центральным нуклеотидом N при условии метилирования в этой последовательности не менее трех цитозинов в положении С5.The defining difference of the proposed strain from all currently known strains of producers of site-specific endonucleases is that it allows you to get a commercially available drug, which has no analogues, methyl-dependent site-specific DNA endonuclease ElmI, which recognizes and cleaves both chains of the 5 ′ sequence -GC ^ NGC-3 ′ / 3′-CGN ^ CG-5 ′ before the central nucleotide N, provided that at least three cytosines in position C5 are methylated in this sequence.

Новая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза ElmI является неошизомером метилзависимой ДНК-эндонуклеазы PkrI, то есть узнает ту же последовательность ДНК, но расщепляет ее в другой позиции. В отличие от ElmI MD-эндонуклеаза PkrI расщепляет узнаваемый сайт 5′-GCN^GC-3′ после центрального нуклеотида с образованием 3′-выступающих однонуклеотидных концов.The new site-specific DNA endonuclease ElmI is a neo-schizomer of the methyl-dependent PkrI DNA endonuclease, that is, it recognizes the same DNA sequence, but cleaves it in a different position. Unlike ElmI, the MD endonuclease PkrI cleaves the recognizable 5′-GCN ^ GC-3 ′ site after the central nucleotide to form 3′-protruding single nucleotide ends.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов, в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».Since the proposed strain was obtained for the first time and to isolate a site-specific endonuclease that recognizes and cleaves the above nucleotide sequence, it has never been used in this position, we can conclude that the proposed strain meets the criteria of the invention of “novelty” and “inventive step”.

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by examples of specific performance.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pElmI.Example 1. Construction of a recombinant plasmid pElmI.

Ген, кодирующий MD-эндонуклеазу ElmI, был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК дикого штамма-продуцента Escherichia coli N17, выделенного из природного источника (воды).The gene encoding the ElmI MD endonuclease was amplified by PCR using the chromosomal DNA of a wild producer strain Escherichia coli N17 isolated from a natural source (water).

Для ПЦР использовались следующие праймеры:For PCR, the following primers were used:

Entero direct: 5′-CCCCCATATGAGTGCACGTGAAGCA-3′Entero direct: 5′-PrivCATATGAGTGCACGTGAAGCA-3 ′

Entero reverse 1: 5′-CGCGGATCCTTAGGGATTACACTGACTGAA-3′Entero reverse 1: 5′-CGCGGATCCTTAGGGATTACACTGACTGAA-3 ′

На следующем этапе осуществляли встраивание амплифицированного гена, обработанного эндонуклеазами рестрикции FauNDI+BamHI в плазмиду pMTL22 по сайтам рестрикции FauNDI+BglII. Процедуру лигазной сшивки, а также дальнейшую трансформацию клеток E.coli штамма ER2267 осуществляли известным способом [4].In the next step, the amplified gene treated with the FauNDI + BamHI restriction endonucleases was inserted into the pMTL22 plasmid at the FauNDI + BglII restriction sites. The ligase crosslinking procedure, as well as further transformation of E. coli cells of strain ER2267, was carried out in a known manner [4].

Из одного из полученных трансформантов выделяли рекомбинантную плазмиду, названную pElmI, и содержащую клонированный FauNDI-BamHI ПЦР-фрагмент ДНК Escherichia coli N17 в векторе pMTL22/FauNDI-BglII. Длина встроенного фрагмента составляла 439 пар нуклеотидов. Фрагмент являлся геном метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы ElmI (позиция открытой рамки считывания - 183-625 по комплементарной цепи). Направление рамки считывания гена elmI в рекомбинантной плазмиде совпадало с направлением считывания гена lacZ из pMTL22 (Фиг. 1).A recombinant plasmid called pElmI was isolated from one of the obtained transformants and contained the cloned FauNDI-BamHI PCR DNA fragment of Escherichia coli N17 in the vector pMTL22 / FauNDI-BglII. The length of the inserted fragment was 439 nucleotide pairs. The fragment was the gene of the methyl-dependent site-specific DNA endonuclease ElmI (position of the open reading frame is 183-625 on the complementary chain). The direction of the reading frame of the elmI gene in the recombinant plasmid coincided with the reading direction of the lacZ gene from pMTL22 (Fig. 1).

Первичная структура встроенного гена, кодирующего MD-эндонуклеазу ElmI, была определена методом Сэнгера [5] на автоматическом секвенаторе ABI 3130xI Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США).The primary structure of the inserted gene encoding ElmI MD endonuclease was determined by the Sanger method [5] on an ABI 3130xI Genetic Analyzer automatic sequencer (Applied Biosystems, USA).

На фиг. 2. приведена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего MD-эндонуклеазу ElmI, и соответствующая аминокислотная последовательность белка.In FIG. 2. The nucleotide sequence of the gene encoding the ElmI MD endonuclease and the corresponding amino acid sequence of the protein are shown.

Пример 2. Выращивание штамма и выделение рекомбинантной MD-эндонуклеазы ElmI.Example 2. Growth of a strain and isolation of recombinant ElmI MD endonuclease.

Получение биомассы клеток штамма-продуцента.Obtaining biomass of cells of the producer strain.

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента Escherichia coli N42 (pElmI) переносили в чашку Петри на агаризованную среду LB с ампициллином (100 мкг/мл) и инкубировали в течение ночи при 37°C. Свежевыращенные колонии переносили в две колбы объемом 500 мл, содержащих по 300 мл бульона (1% триптон («Organotechnie», Франция), 0,5% дрожжевой экстракт («Organotechnie», Франция), 0,5% NaCl, 0,05% MgCl₂ и 0,001% тиамин, (рН 7,0), и 100 мкг/мл ампициллина) и подращивали при 37°C в течение 12 часов без встряхивания. Затем культура рассевалась по 10 мл по 20 колбам, содержащим по 300 мл бульона того же состава. Колбы встряхивали при 120-140 об/мин в инкубаторе («New Brunswick», США) при +37°С в течение 3 часов, затем добавляли IPTG до 0.5 мМ и растили еще 16 часов.To obtain biomass, cells of the producer strain Escherichia coli N42 (pElmI) were transferred to a Petri dish on agar medium LB with ampicillin (100 μg / ml) and incubated overnight at 37 ° C. Freshly grown colonies were transferred to two 500 ml flasks each containing 300 ml of broth (1% tryptone (Organotechnie, France), 0.5% yeast extract (Organotechnie, France), 0.5% NaCl, 0.05 % MgCl ₂ and 0.001% thiamine, (pH 7.0), and 100 μg / ml ampicillin) and grown at 37 ° C for 12 hours without shaking. Then the culture was sown in 10 ml of 20 flasks containing 300 ml of broth of the same composition. The flasks were shaken at 120-140 rpm in an incubator (New Brunswick, USA) at + 37 ° C for 3 hours, then IPTG was added to 0.5 mM and grown for another 16 hours.

Для измерения в клетках активности ElmI из культуры отбирались по две пробы по 1 мл в пробирки «Eppendorf», клетки осаждали в настольной центрифуге «5416 Eppendorf» ("Eppendorf GmbH", Германия) при 12000 об/мин 3 минуты, супернатанты убирали, а клетки замораживали при -18°C. Биомассы культур осаждали на центрифуге J2-21 («Beckman», США) в течение 30 минут в роторе JA-10 при 8000 об/мин, замораживали и хранили при -20°C. Получали 12 г замороженных клеток, что составляло 2 г/л бульона. Содержание рекомбинантной рестриктазы ElmI составляло 4000 е.а./г влажной биомассы. Разрушение биомассы клеток, выделение и очистку фермента проводили по модификации известной методики [6]. В результате из 12 г биомассы Escherichia coli N42 (pElmI) получили -5,5 мл препарата рекомбинантной MD-эндонуклеазы ElmI с концентрацией 2000 е.а./мл.To measure ElmI activity in cells, two 1 ml samples were taken from the culture in Eppendorf tubes, cells were besieged in a 5416 Eppendorf benchtop centrifuge (Eppendorf GmbH, Germany) at 12000 rpm for 3 minutes, supernatants were removed, and cells were frozen at -18 ° C. Culture biomass was besieged on a J2-21 centrifuge (Beckman, USA) for 30 minutes in a JA-10 rotor at 8000 rpm, frozen and stored at -20 ° C. Received 12 g of frozen cells, which amounted to 2 g / l of broth. The content of recombinant restriction enzyme ElmI was 4000 EA / g wet biomass. The destruction of cell biomass, the isolation and purification of the enzyme was carried out by modification of the known method [6]. As a result, from 5.5 g of the biomass of Escherichia coli N42 (pElmI) -5.5 ml of a preparation of recombinant MD-endonuclease ElmI with a concentration of 2000 ea / ml was obtained.

Пример 3. Сайт-специфический гидролиз субстратных ДНК рекомбинантной MD-эндонуклеазой ElmI.Example 3. Site-specific hydrolysis of substrate DNAs with recombinant ElmI MD endonuclease.

Расщепление субстратных ДНК рекомбинантной MD-эндонуклеазой ElmI проводили в оптимальных условиях при температуре 37°C в реакционном буфере - SE-буфер «W» (10 мМ Трис-HCl (рН 8,5 при 25°C), 10 мМ магния ацетат, 10 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол) в течение 60 мин.DNA digestion with recombinant ElmI MD endonuclease was performed under optimal conditions at 37 ° C in the reaction buffer — SE buffer “W” (10 mM Tris-HCl (pH 8.5 at 25 ° C), 10 mM magnesium acetate, 10 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol) for 60 minutes

Продукты расщепления ДНК разделяли путем электрофореза в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ.DNA digestion products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel in TAE buffer.

В качестве субстратов для определения специфичности фермента ElmI использовали ДНК плазмид, содержащих гены различных ДНК-метилтрансфераз. Благодаря активности этих генов в штаммах E.coli, из которых были выделены эти плазмиды, данные ДНК-субстраты оказывались модифицированными соответствующими ДНК-метилтрансферазами и несли определенный узор метилирования.As substrates for determining the specificity of the ElmI enzyme, plasmid DNA containing genes of various DNA methyltransferases was used. Due to the activity of these genes in E. coli strains from which these plasmids were isolated, these DNA substrates turned out to be modified with the corresponding DNA methyltransferases and carried a specific methylation pattern.

В качестве таких метилированных ДНК-субстратов были использованы следующие плазмиды:The following plasmids were used as such methylated DNA substrates:

1) pMHpaII, содержащая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HpaII, вследствие чего в данной плазмиде метилирован первый цитозин во всех последовательностях 5′-CCGG-3′ на обеих цепях ДНК [7].1) pMHpaII containing the gene encoding the HpaII DNA methyltransferase; as a result, the first cytosine in all 5′-CCGG-3 ′ sequences on both DNA chains was methylated in this plasmid [7].

2) pMHaeIII, содержащая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HaeIII, вследствие чего в данной плазмиде метилирован первый цитозин во всех последовательностях 5′-GGCC-3′ на обеих цепях ДНК [8].2) pMHaeIII, containing the gene encoding the HaeIII DNA methyltransferase; as a result, the first cytosine in all 5′-GGCC-3 ′ sequences on both DNA chains was methylated in this plasmid [8].

3) pHspAI2, содержащая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HspAI, вследствие чего в данной плазмиде метилирован первый цитозин во всех последовательностях 5′-GCGC-3′ на обеих цепях ДНК [9]. Кроме того, данная плазмида содержит гиперметилированный участок:3) pHspAI2 containing the gene encoding the HspAI DNA methyltransferase; as a result, the first cytosine in all 5′-GCGC-3 ′ sequences on both DNA chains was methylated in this plasmid [9]. In addition, this plasmid contains a hypermethylated site:

5′-G(5mC)G(5mC)G(5mC)GC-3′5′-G (5mC) G (5mC) G (5mC) GC-3 ′

3′-CG(5mC)G(5mC)G(5mC)G-5′.3′-CG (5mC) G (5mC) G (5mC) G-5 ′.

4) pHspAI10, также содержащая ген, кодирующий ДНК-метилтрансферазу HspAI, вследствие чего в данной плазмиде метилирован первый цитозин во всех последовательностях 5′-GCGC-3′ на обеих цепях ДНК [10]. Кроме того, данная плазмида содержит гиперметилированный участок:4) pHspAI10, also containing the gene encoding the HspAI DNA methyltransferase; as a result, the first cytosine in all 5′-GCGC-3 ′ sequences on both DNA chains was methylated in this plasmid [10]. In addition, this plasmid contains a hypermethylated site:

5′-G(5mC)G(5mC)G CAG(5mC)G(5mC)G С-3′5′-G (5mC) G (5mC) G CAG (5mC) G (5mC) G C-3 ′

3′-С G(5mC)G(5mC)GTC G(5mC)G(5mC)G-5′.3′-C G (5mC) G (5mC) GTC G (5mC) G (5mC) G-5 ′.

5) Та же pHspAI10, но дополнительно метилированная ДНК-метилтрансферазой Fsp4HI, в результате чего в данной плазмиде дополнительно метилирован первый цитозин во всех последовательностях 5′-GCNGC-3′ [10]. Данная плазмида содержит гиперметилированный участок:5) The same pHspAI10, but additionally methylated with Fsp4HI DNA methyltransferase, as a result of which the first cytosine in all 5′-GCNGC-3 ′ sequences was additionally methylated in this plasmid [10]. This plasmid contains a hypermethylated site:

5′-G(5mC)G(5mC)G(5mC)A G(5mC)G(5mC)G С-3′5′-G (5mC) G (5mC) G (5mC) A G (5mC) G (5mC) G C-3 ′

3′-С G(5mC)G(5mC) G T(5mC)G(5mC)G(5mC)G-5′.3′-C G (5mC) G (5mC) G T (5mC) G (5mC) G (5mC) G-5 ′.

6) pFsp4HI3, содержащая ген, кодирующий ДНК-метилтранс-феразу Fsp4HI, в результате чего в данной плазмиде во всех последовательностях 5′-GCNGC-3′ метилирован первый цитозин [11]. Данная плазмида содержит гиперметилированный участок6) pFsp4HI3 containing the gene encoding the Fsp4HI DNA methyltransferase; as a result, the first cytosine was methylated in this plasmid in all 5′-GCNGC-3 ′ sequences [11]. This plasmid contains a hypermethylated site

5′-G(5mC)C G(5mC)G G(5mC)A G C-3′5′-G (5mC) C G (5mC) G G (5mC) A G C-3 ′

3′-С G G(5mC) G C(5mC)G T(5mC)G-5′.3′-C G G (5mC) G C (5mC) G T (5mC) G-5 ′.

Все плазмиды были предварительно переведены из кольцевой формы в линейную путем гидролиза эндонуклеазой рестрикции DriI по уникальному (для каждой плазмиды) сайту 5′-GACNNNNNGTC-3′.All plasmids were preliminarily converted from a circular form to a linear one by hydrolysis with DriI restriction endonuclease at the unique (for each plasmid) 5′-GACNNNNNGTC-3 ′ site.

На фиг. 3 представлена электрофореграмма продуктов расщепления указанных выше ДНК-субстратов рекомбинантной метилзависимой ДНК-эндонуклеазой ElmI, где дорожки:In FIG. 3 shows an electrophoregram of the cleavage products of the above DNA substrates with recombinant methyl-dependent DNA endonuclease ElmI, where the tracks:

1 - pMHpaII/DriI;1 - pMHpaII / DriI;

2 - pMHpaII/DriI+ElmI;2 - pMHpaII / DriI + ElmI;

3 - pMHaeIII/DriI;3 - pMHaeIII / DriI;

4 - pMHaeIII/DriI+ElmI;4 - pMHaeIII / DriI + ElmI;

5 - pHspAI2/DriI;5 - pHspAI2 / DriI;

6 - pHspAI2/DriI+ElmI;6 - pHspAI2 / DriI + ElmI;

7 - pHspAI10/DriI;7 - pHspAI10 / DriI;

8 - pHspAI10/Dril+ElmI;8 - pHspAI10 / Dril + ElmI;

9 - pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI);9 - pHspAI10 / (M.Fsp4HI + DriI);

10 - pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI)+ElmI;10 - pHspAI10 / (M.Fsp4HI + DriI) + ElmI;

11 - pFsp4HI3/DriI;11 - pFsp4HI3 / DriI;

12 - pFsp4HI3/DriI+ElmI12 - pFsp4HI3 / DriI + ElmI

M - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производства ООО «СибЭнзайм»).M is a 1 kb DNA molecular weight marker (manufactured by SibEnzyme LLC).

Как видно из фиг. 3, эндонуклеаза ElmI не расщепляет последовательности, метилированные ДНК-метилтрансферазами HpaII (дорожка 2), HaeIII (дорожка 4), HspAI (дорожка 6).As can be seen from FIG. 3, ElmI endonuclease does not cleave sequences methylated with HpaII DNA methyltransferases (lane 2), HaeIII (lane 4), HspAI (lane 6).

ElmI также не расщепляет плазмиду pHspAI10, предварительно линеаризованную Dril (дорожка 8). В данной плазмиде содержится гиперметилированный участок, включающий последовательность 5′-GCAG(5mC)-3′/3′-(5mC)GTCG-5′, в которой метилированы вторые (внешние) цитозины на обеих цепях, и которая не расщепляется ElmI. Однако ElmI расщепляет эту же плазмиду (pHspAI10) после дополнительного ее метилирования ДНК-метилтрансферазой Fsp4HI с образованием пяти фрагментов (дорожка 10).ElmI also does not cleave the plasmid pHspAI10 previously linearized by Dril (lane 8). This plasmid contains a hypermethylated region, including the 5′-GCAG (5mC) -3 ′ / 3 ′ - (5mC) GTCG-5 ′ sequence, in which the second (external) cytosines on both chains are methylated and which is not cleaved by ElmI. However, ElmI cleaves the same plasmid (pHspAI10) after additional methylation with Fsp4HI DNA methyltransferase to form five fragments (lane 10).

Поскольку ElmI узнает и расщепляет последовательность 5′-GCNGC-3′ при наличии в ней не менее трех 5-метилцитозинов, можно предположить, что сайты узнавания ElmI на данной плазмиде могут образовываться в двух случаях:Since ElmI recognizes and cleaves the 5′-GCNGC-3 ′ sequence with at least three 5-methylcytosines, it can be assumed that ElmI recognition sites on this plasmid can form in two cases:

1) При перекрывании сайтов узнавания ДНК-метилтрансфераз HspAI и Fsp4HI (5′-GCGCNGC-3′) с образованием гиперметилированного сайта1) When overlapping recognition sites of HspAI and Fsp4HI DNA methyltransferases (5′-GCGCNGC-3 ′) with the formation of a hypermethylated site

5′-G(5mC)G(5mC)NGC-3′/3′-CG(5mC)GN(5mC)G-5′.5′-G (5mC) G (5mC) NGC-3 ′ / 3′-CG (5mC) GN (5mC) G-5 ′.

2) При перекрывании двух сайтов узнавания ДНК-метилтрансферазы Fsp4HI (5′-GCNGCNGC-3′) с образованием гиперметилированного сайта2) By overlapping two recognition sites of Fsp4HI DNA methyltransferase (5′-GCNGCNGC-3 ′) to form a hypermethylated site

5′-G(5mC)NG(5mC)NGC-3′/3′-CGN(5mC)GN(5mC)G-5′5′-G (5mC) NG (5mC) NGC-3 ′ / 3′-CGN (5mC) GN (5mC) G-5 ′

В обоих случаях эти гиперметилированные сайты содержатIn both cases, these hypermethylated sites contain

последовательности 5′-GCNGC-3′ с тремя 5-метилцитозинами.5′-GCNGC-3 ′ sequences with three 5-methylcytosines.

Анализ первичной структуры плазмиды pHspAI10, проведенный с помощью программы Vector NTI Suite 7, показал, что при расщеплении по двум указанным выше сайтам эндонуклеазой ElmI (с учетом предварительной линеаризации плазмидной ДНК рестриктазой Dril) образуются ДНК-фрагменты следующей длины: ~1800, ~1200, ~490, ~420, ~60 п. н.Analysis of the primary structure of the plasmid pHspAI10 using the Vector NTI Suite 7 program showed that, upon cleavage at the two sites indicated above with ElmI endonuclease (taking into account the preliminary linearization of plasmid DNA with restriction enzyme Dril), DNA fragments of the following lengths are formed: ~ 1800, ~ 1200, ~ 490, ~ 420, ~ 60 bp

Как видно из фиг. 3, электрофоретическая подвижность ДНК-фрагментов, образованных ElmI после гидролиза pHspAI10/(M.Fsp4HI+DriI) соответствует теоретически предсказанной длине (дорожка 10).As can be seen from FIG. 3, the electrophoretic mobility of DNA fragments formed by ElmI after hydrolysis of pHspAI10 / (M.Fsp4HI + DriI) corresponds to the theoretically predicted length (lane 10).

Анализ первичной структуры плазмиды pFsp4HI3, проведенный с помощью программы Vector NTI Suite 7, показал, что при ее расщеплении по двум указанным выше сайтам эндонуклеазой ElmI (с учетом предварительной линеаризации плазмидной ДНК рестриктазой Dril) образуются фрагменты следующей длины: ~3500, ~490 (два фрагмента), -340 п. н. Как видно из фиг 3, электрофоретическая подвижность ДНК-фрагментов, образованных после гидролиза плазмиды pFsp4HI3/DriI эндонуклеазой Elm соответствует теоретически предсказанной длине (дорожка 12). Остальные же последовательности 5′-GCNGC-3′ в данной плазмиде содержат только два 5-метилцитозина и не расщепляются ElmI.Analysis of the primary structure of the plasmid pFsp4HI3, carried out using the Vector NTI Suite 7 program, showed that when it is split at the two sites indicated above by ElmI endonuclease (taking into account the preliminary linearization of plasmid DNA with the restriction enzyme Dril), fragments of the following length are formed: ~ 3500, ~ 490 (two fragment), -340 bp As can be seen from FIG. 3, the electrophoretic mobility of DNA fragments formed after hydrolysis of the plasmid pFsp4HI3 / DriI with Elm endonuclease corresponds to the theoretically predicted length (lane 12). The remaining 5′-GCNGC-3 ′ sequences in this plasmid contain only two 5-methylcytosines and are not cleaved by ElmI.

Полученные результаты свидетельствует о том, что MD-эндонуклеаза ElmI узнает и расщепляет только те варианты последовательности 5′-GCNGC-3′, которые содержат только три или четыре 5-метилцитозина.The results obtained indicate that the ElmI MD endonuclease recognizes and cleaves only those variants of the 5′-GCNGC-3 ′ sequence that contain only three or four 5-methylcytosines.

Пример 4. Определение позиции гидролиза ДНК эндонуклеазой ElmI.Example 4. Determination of the position of DNA hydrolysis by endonuclease ElmI.

Определение места гидролиза ДНК ElmI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазами рестрикции ElmI и BisI олигонуклеотидного дуплекса D1/D2, образованного из олигонуклеотидов D1 и D2 (узнаваемая ElmI последовательность выделена рамочкой):The location of ElmI DNA hydrolysis was carried out by comparing the lengths of the fragments formed upon cleavage by the restriction endonucleases ElmI and BisI of the oligonucleotide duplex D1 / D2 formed from oligonucleotides D1 and D2 (the recognized ElmI sequence is outlined):

На фиг. 4 приведен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления радиоактивно меченного дуплекса D1*/D2 в 20% полиакриламидном геле с 7М мочевиной, где дорожки:In FIG. Figure 4 shows the radio-autograph of the electrophoregram of the products of the cleavage of the radioactively labeled D1 * / D2 duplex in a 20% polyacrylamide gel with 7M urea, where the tracks:

1 - дуплекс D1*/D2;1 - duplex D1 * / D2;

2 - дуплекс D1*/D2, обработанный эндонуклеазой ElmI;2 - D1 * / D2 duplex treated with ElmI endonuclease;

3 - дуплекс D1*/D2, обработанный эндонуклеазой BisI;3 - D1 * / D2 duplex treated with BisI endonuclease;

Знаком «*» обозначена меченная цепь.The “*” sign indicates a labeled chain.

Как видно из фиг. 4, фрагменты ДНК, образованные в результате гидролиза ферментами ElmI и BisI дуплекса D1*/D2, имеют одинаковую длину, что говорит об идентичности позиций гидролиза узнаваемой последовательности этих метилзависимых эндонуклеаз. Так как BisI расщепляет последовательность 5′-GC^NGC-3′ перед центральным нуклеотидом N, то и ElmI также расщепляет ее перед центральным нуклеотидом.As can be seen from FIG. 4, the DNA fragments formed as a result of hydrolysis by the ElmI and BisI enzymes of the D1 * / D2 duplex have the same length, which indicates the identical hydrolysis positions of the recognizable sequence of these methyl-dependent endonucleases. Since BisI cleaves the 5′-GC ^ NGC-3 ′ sequence before the central nucleotide N, ElmI also cleaves it before the central nucleotide.

Таким образом, ElmI узнает последовательность ДНК 5′-GC^NGC-3′ и расщепляет ее перед центральным нуклеотидом N на обеих цепях ДНК, образуя 5′-выступающие однонуклеотидные «липкие» концы.Thus, ElmI recognizes the 5′-GC ^ NGC-3 ′ DNA sequence and cleaves it in front of the central N nucleotide on both DNA strands, forming 5′-protruding single-nucleotide “sticky” ends.

Использование предлагаемого изобретения позволит расширить ассортимент высокопродуктивных штаммов-продуцентов, позволяющих получать высокоактивный препарат MD-эндонуклеазу ElmI с активностью 2000 е.а./мл.Using the present invention will expand the range of highly productive producer strains, allowing to obtain a highly active drug MD-endonuclease ElmI with an activity of 2000 EA / ml

Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована в молекулярной биологии, эпигенетике и генной инженерии для сайт-специфического расщепления метилированной ДНК и для получения библиотек в совокупности с ферментами, дающими в результате гидролиза ДНК такие же «липкие» концы.This site-specific endonuclease can be used in molecular biology, epigenetics, and genetic engineering for site-specific cleavage of methylated DNA and to obtain libraries in conjunction with enzymes that produce the same “sticky” ends as a result of DNA hydrolysis.

Источники информацииInformation sources

1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Болтенгаген А.А., Тарасова Г.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерий Planomicrobium koreense 78Л - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы PkrI // Патент RU 2475534, C1, оп. - 2011.1. Chernukhin V.A., Nayakshina T.N., Boltengen A.A., Tarasova G.V., Dedkov B.C., Mikhnenkova N.A., Degtyarev S.Kh. The bacterial strain Planomicrobium koreense 78L - producer of site-specific endonuclease PkrI // Patent RU 2475534, C1, op. - 2011.

2. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTLnic-cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing // Gene - 1988. - V.68. - P. 139-149.2. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTLnic-cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing // Gene - 1988. - V.68. - P. 139-149.

3. Roberts R.J., Vineze T., Posfai J., Macelis D. REBASE - restriction enzymes and methylases // Nucl. Acids Res. - 2003. - V.31. - P.418-420.3. Roberts R.J., Vineze T., Posfai J., Macelis D. REBASE - restriction enzymes and methylases // Nucl. Acids Res. - 2003. - V.31. - P. 418-420.

4. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. / Molecular Cloning: A laboratory manual. - 2-nd ed. - Cold Spring Harbor Laboratory Press. - Cold Spring Harbor, New York. - 1989.4. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. / Molecular Cloning: A laboratory manual. - 2-nd ed. - Cold Spring Harbor Laboratory Press. - Cold Spring Harbor, New York. - 1989.

5. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1977. - V. 74. - P.5463-5467.5. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA. - 1977. - V. 74. - P.5463-5467.

6. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P. 561-2572.6. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P. 561-2572.

7. Чернухин B.A., Килева E.B., Томилова Ю.Э., Болтенгаген А.А., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Голикова Л.Н., Дегтярев С.Х. Новая метил-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза KroI узнает и расщепляет последовательность ДНК 5′-G^C(5mC)GGC-3′ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю. А. Овчинникова. - 2011. - Т. 7. - №1. - С. 14-20.7. Chernukhin B.A., Kileva E.B., Tomilova Yu.E., Boltengen A.A., Dedkov B.C., Mikhnenkova N.A., Gonchar D.A., Golikova L.N., Degtyarev S.Kh. The new methyl-dependent site-specific endonuclease KroI recognizes and cleaves the DNA sequence 5′-G ^ C (5mC) GGC-3 ′ // Bulletin of Biotechnology and Physico-Chemical Biology named after Yu. A. Ovchinnikov. - 2011. - T. 7. - No. 1. - S. 14-20.

8. Чернухин В.А., Беличенко О.А., Тарасова Г.В., Гончар Д.А., Акишев А.Г., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Штамм бактерии Arthrobacter oxydans - продуцент сайт-специфической эндонуклеазы AoxΙ // Патент RU 2399663, C1, оп. - 2009.8. Chernukhin V.A., Belichenko O.A., Tarasova G.V., Gonchar D.A., Akishev A.G., Dedkov B.C., Mikhnenkova N.A., Degtyarev S.Kh. The strain of the bacterium Arthrobacter oxydans - producer of site-specific endonuclease AoxΙ // Patent RU 2399663, C1, op. - 2009.

9. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5′-G(5mC)^GC-3′ // Биотехнология. - 2006. - №4. - С. 31-35.9. Chernukhin V.A., Nayakshina T.N., Abdurashitov M.A., Tomilova Yu.E., Mezentseva N.V., Dedkov BC, Mikhnenkova N.A., Gonchar D.A., Degtyarev S. X. New GlaI restriction endonuclease recognizes the methylated sequence 5′-G (5mC) ^ GC-3 ′ // Biotechnology. - 2006. - No. 4. - S. 31-35.

10. Чернухин В.А., Гончар Д.А., Килева Е.В., Соколова В.А., Голикова Л.Н., Дедков B.C., Михценкова Н.А., Дегтярев С.Х. Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI расщепляет девятинуклеотидную последовательность 5′-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)GC-3′/3′-CG(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5′ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2012.- Т.8. - №1. -С. 16-26.10. Chernukhin V.A., Gonchar D.A., Kileva E.V., Sokolova V.A., Golikova L.N., Dedkov B.C., Mikhtsenkova N.A., Degtyarev S.Kh. The new methyl-dependent site-specific DNA endonuclease MteI cleaves the nine-nucleotide sequence 5′-G (5mC) G (5mC) NG (5mC) GC-3 ′ / 3′-CG (5mC) GN (5mC) G (5mC) G-5 ′ // Bulletin of biotechnology and physico-chemical biology named after Yu.A. Ovchinnikov. - 2012.- T.8. - No. 1. -FROM. 16-26.

11. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5′-G(5mC)^NG(5mC)-3′/3′-(5mC)GN^(5mC)G-5′. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2007. - Т3. - №2. - С. 13-17.11. Chernukhin V.A., Chmuzh E.V., Tomilova Yu.E., Nayakshina T.N., Gonchar D.A., Dedkov B.C., Degtyarev S.Kh. The new site-specific endonuclease GluI recognizes the methylated DNA sequence 5′-G (5mC) ^ NG (5mC) -3 ′ / 3 ′ - (5mC) GN ^ (5mC) G-5 ′. // Bulletin of biotechnology and physico-chemical biology named after Yu.A. Ovchinnikov. - 2007. - T3. - No. 2. - S. 13-17.

Claims (1)

Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli N42 (pElmI) - продуцент метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазы ElmI, узнающей последовательность ДНК 5′-GC^ANGC-3′, в которой не менее трех цитозинов метилированы в положении С5, и расщепляющей обе ее цепи перед центральным нуклеотидом N с образованием 5′-выступающих однонуклеотидных концов, полученный путем трансформации штамма Escherichia coli ER2267 плазмидой pElmI, сконструированной на основе вектора pMTL22 и содержащей ген, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующий метилзависимую сайт-специфическую эндонуклеазу ElmI. The recombinant bacterial strain Escherichia coli N42 (pElmI) is a producer of the methyl-dependent site-specific endonuclease ElmI, recognizing the 5′-GC ^ ANGC-3 ′ DNA sequence in which at least three cytosines are methylated at position C5 and cleaving both of its chains in front of the central nucleotide N with the formation of 5′-protruding single nucleotide ends, obtained by transforming the Escherichia coli strain ER2267 with the plasmid pElmI, constructed on the basis of the pMTL22 vector and containing a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding a methyl-dependent site-specific ical endonuclease ElmI.

Images