RU2475533C1 - BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI - Google Patents
BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI Download PDFInfo
- Publication number
- RU2475533C1 RU2475533C1 RU2011150595/10A RU2011150595A RU2475533C1 RU 2475533 C1 RU2475533 C1 RU 2475533C1 RU 2011150595/10 A RU2011150595/10 A RU 2011150595/10A RU 2011150595 A RU2011150595 A RU 2011150595A RU 2475533 C1 RU2475533 C1 RU 2475533C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mtei
- site
- dna
- endonuclease
- specific endonuclease
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, используемого для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.The invention relates to biotechnology and relates to the production of a new strain used to isolate a new site-specific endonuclease that recognizes and cleaves DNA only if 5-methylcytosine is recognized in the recognition site.
К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.To date, several site-specific endonucleases are known that recognize and cleave DNA, only if 5-methylcytosine is recognized in the site.
Известен штамм Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5′-G(m5C)^GC-3′, где m5C - С5-метилцитозин [1].A known strain of Glacial ice bacterium I, producing GlaI endonuclease, which recognizes and cleaves the methylated
Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2] и Bacillus subtilis Т30 [3], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы, которые узнают и расщепляют метилированную нуклеотидную последовательность 5′-GCNGC-3′, при наличии в сайте узнавания С5-метилцитозиновых оснований.Known strains of Bacillus simplex 23 [2] and Bacillus subtilis T30 [3] producing site-specific endonucleases that recognize and cleave the methylated nucleotide sequence of 5′-GCNGC-3 ′ when C5-methylcytosine bases are recognized at the recognition site.
Однако в настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)G(m5C)NG(m5C)G(m5C)-3′/3′-(m5C)G(m5C)GN(m5C)G(m5C)G-5′ и не расщепляющих метилированную последовательность ДНК 5′-G(mSC)∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN∧(m5C)G-5′.However, bacterial strains producing site-specific endonucleases that recognize and cleave the
Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Glacial ice bacterium 24, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции GluI, которая узнает последовательность нуклеотидов 5′-GCNGC-3′ и расщепляет ее перед центральным нуклеотидом (N) с образованием однонуклеотидного 5′-выступающего конца, если все цитозиновые основания узнаваемой последовательности метилированы в положении 5 (С5-метилцитозин) [4].Closest to the claimed strain, the prototype is the Glacial ice bacterium 24 strain producing the GluI restriction endonuclease, which recognizes the 5′-GCNGC-3 ′ nucleotide sequence and cleaves it in front of the central nucleotide (N) with the formation of a
Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза расщепляет короткую метилированную последовательность 5′-G(m5C)∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′, что в ряде случаев не позволяет использовать ее для получения крупных фрагментов при сайт-специфическом расщеплении ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.A disadvantage of the known strain is that the site-specific endonuclease produced by it cleaves the short methylated
Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-G(m5C)G(m5C)^NG(m5C)G(m5C)-3'.An object of the invention is to obtain a bacterial strain producing a site-specific endonuclease that recognizes and cleaves both strands of the 5′-G (m5C) G (m5C) ^ NG (m5C) G (m5C) -3 ′ DNA nucleotide sequence.
Поставленная техническая задача достигается получением штамма Microbacterium testaceum 17В - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей метилированную последовательность нуклеотидов:The technical task is achieved by obtaining a strain of Microbacterium testaceum 17B, a producer of a site-specific endonuclease that recognizes and cleaves the methylated nucleotide sequence:
5′-G(m5C)G(m5C)∧G(m5C)G(m5C)-3′,5′-G (m5C) G (m5C) ∧ G (m5C) G (m5C) -3 ′,
3′-(m5C)G(m5C)GN∧(m5C)G(m5C)G-5′,3 ′ - (m5C) G (m5C) GN ∧ (m5C) G (m5C) G-5 ′,
где m5C - С5-метилцитозин. (Символом "∧" указаны позиции расщепления ДНК.)where m5C is C5-methylcytosine. (The “ ∧ ” symbol indicates DNA cleavage positions.)
Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.The proposed strain is isolated from natural material (soil) as a result of a targeted systematic search.
Полученный штамм Microbacterium testaceum 17B депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10628, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа MteI.The resulting strain of Microbacterium testaceum 17B was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms FSUE GosNIIgenetika under the registration number VKPM B-10628, and the site-specific endonuclease produced by it was named MteI.
Штамм Microbacterium testaceum 17B характеризуется следующими признаками.The strain of Microbacterium testaceum 17B is characterized by the following features.
Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует гладкие, блестящие, бледно-оранжевые колонии. Клетки палочковидные размером 0,8×(1,5-2) мкм, неподвижные. Грамположительные. Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Оксидаза не обнаружена. Растут при температуре от 10 до 40°С, при рН от 6 до 9.Cultural and morphological characters. On agar medium Luria-Bertrani (LB) forms smooth, shiny, pale orange colonies. Rod-shaped cells 0.8 × (1.5-2) microns in size, motionless. Gram-positive. Physiological and biochemical characteristics. Obligatory aerobic. Catalopositive. Oxidase not detected. Grow at a temperature of 10 to 40 ° C, at a pH of 6 to 9.
Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [5]. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза MteI названа по номенклатуре [6].The strain is identified on the basis of the analysis of morphological and biochemical properties by the determinant [5]. The site-specific endonuclease MteI produced by the claimed strain is named according to nomenclature [6].
Хранение штамма осуществляется в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.The strain is stored in a freeze-dried state or in a solution of 30% glycerol at a temperature of -60 ° C.
Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста. Выход целевого фермента составляет 100 ед./г сырой биомассы с концентрацией 16000 ед./мл.For the cultivation of the strain, the following composition is used (g / l): peptone - 10, yeast extract - 5, NaCl - 5. Cultivation is carried out at 28 ° С with aeration until the stationary growth stage is reached. The yield of the target enzyme is 100 units / g of crude biomass with a concentration of 16,000 units / ml.
Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза MteI характеризуется следующими свойствами:The resulting site-specific endonuclease MteI is characterized by the following properties:
1. Узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов 5′-G(m5C)G(m5C)NG(m5C)G(m5C)-3′/3′-(m5C)G(m5C)GN(m5C)G(m5C)G-5′, где m5C - 5-метилцитозин.1. Recognizes and cleaves the methylated
2. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, не содержащую С5-метилцитозиновых оснований (неметилированную), а также короткую метилированную последовательность 5′-G(m5C)∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′.2. Does not cleave the above sequence that does not contain C5-methylcytosine bases (unmethylated), as well as the short methylated
3. Расщепляет связи перед центральным нуклеотидом в обеих цепях узнаваемой последовательности.3. Cleaves bonds in front of the central nucleotide in both chains of a recognizable sequence.
4. Оптимальная температура действия 37-45°С.4. The optimum temperature is 37-45 ° C.
5. Оптимальное значение рН для действия фермента 7,5-8,5.5. The optimal pH for the action of the enzyme is 7.5-8.5.
6. Оптимальная концентрация соли при расщеплении ДНК 30-70 мМ NaCl.6. The optimal salt concentration during DNA cleavage 30-70 mm NaCl.
7. Для проявления активности MteI требуются ионы Mg2+, оптимальная концентрация - 3-10 мМ.7. For the manifestation of MteI activity, Mg 2+ ions are required, the optimal concentration is 3-10 mm.
Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-продуцента сайт-специфической эндонуклеазы GluI является то, что первый продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GCGC∧N GCGC-3′ и не расщепляет метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′. Сайт узнавания GluI 5′-GCNGC-3′ является частью сайта узнавания MteI (5′-GCGCNGCGC-3′). Данное отличие от GluI позволяет использовать эндонуклеазу MteI для более крупноблочной фрагментации С5-метилированной ДНК. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза MteI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.The defining difference between the proposed strain and the producer strain of the site-specific endonuclease GluI is that the former produces a site-specific endonuclease that recognizes and cleaves both chains of the methylated nucleotide sequence of 5′-GCGC ∧ N GCGC-3 ′ DNA and does not cleave the
Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».Since the proposed strain was obtained for the first time and was never used to isolate the site-specific endonuclease that recognizes and cleaves the above nucleotide sequence, we can conclude that the proposed strain meets the criteria of the invention of “novelty” and “inventive step”.
Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by examples of specific performance.
Пример 1. Выращивание штамма и выделение ферментаExample 1. Growing strain and isolation of the enzyme
Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ, и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С. Выход биомассы составляет 5 г/л среды. Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [7].To obtain biomass, cells of the producer strain are transferred onto agarized LB medium in a Petri dish and incubated overnight at 28 ° C. Freshly grown colonies are transferred with a sterile bacteriological loop to flasks containing LB liquid culture medium and cultivated on shakers at 28 ° C with stirring at 150 rpm until a stationary growth phase is reached. Cells are pelleted by centrifugation at 5000 rpm at 4 ° C. The biomass yield is 5 g / l of medium. Disintegration of cells, isolation and purification of the enzyme is carried out by a known method [7].
Пример 2. Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой MteIExample 2. Site-specific hydrolysis of C5-methylated plasmid DNA with MteI endonuclease
Расщепление ДНК проводили в оптимальных условиях (45°С, реакционный буфер - 10 мМ TrisHCl, рН 8.0, 5 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяли путем электрофореза в 1% агарозном геле.DNA digestion was performed under optimal conditions (45 ° С,
В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления использовали различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда (λ) и Т7, pHspAI (содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)GC-3′/3′-CG(5mC)G-5′ [1]) и pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)NGC-3′/3′-(5mC)GNCG-5′ [4]) и предварительно полученные плазмиды pBstMW1 и pBstMW2 (последние две содержат метилированные последовательности 5′-G(5mC)NNNNNNNGC3′/3′-CGNNNNNNN(5mC)G-5′.Various methylated and non-methylated plasmid and phage DNAs were used as substrates for revealing the cleavage specificity: lambda (λ) and T7 phages, pHspAI (contains
Плазмида pBstMW1 была получена путем клонирования фрагментов геномной ДНК штамма бактрерии Bacillus stearothermophilus MW, продуцирующего метилазу BstMW, которая метилирует первый цитозин в обеих цепях сайта узнавания с образованием метилированной последовательности 5′-G(5mC)NNNNNNNGC3′/3′-CGNNNNNNN(5mC)G-5′.Plasmid pBstMW1 was obtained by cloning fragments of the genomic DNA of the bacterium strain Bacillus stearothermophilus MW, producing BstMW methylase, which methylates the first cytosine in both chains of the recognition site to form the methylated
Клонируемый фрагмент был получен путем гидролиза геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции XmaI и последующим встраиванием в вектор pUC19 по сайту узнавания XmaI. Вставка имеет длину 4000 т.п.н. и содержит ген метилазы BstMWI.The cloned fragment was obtained by hydrolysis of genomic DNA with an XmaI restriction endonuclease and then inserted into the pUC19 vector at the XmaI recognition site. The insert is 4000 kb in length. and contains the BstMWI methylase gene.
Плазмида pBstMW2 была получена из плазмиды pBstMW1 путем встраивания по сайтам узнавания рестриктаз Sfr274 и SphI олигонуклеотидного дуплекса, образованного из следующих нуклеотидов:Plasmid pBstMW2 was obtained from plasmid pBstMW1 by embedding on the recognition sites of the restriction enzymes Sfr274 and SphI of the oligonucleotide duplex formed from the following nucleotides:
В17-1: 5′-TCGAGCGCAGCGCGCGCAGCGCGCGCAGCGCCATG-3′,B17-1: 5′-TCGAGCGCAGCGCGCGCAGCGCGCGCAGCGCCATG-3 ′,
В17-2: 5′-GCGCTGCGCGCGCTGCGCGCGCTGCGC-3′.B17-2: 5′-GCGCTGCGCGCGCTGCGCGCGCTGCGC-3 ′.
Таким образом, плазмида pBstMW2 в отличие от плазмиды pBstMW1 имеет метилированную метилазой BstMWI последовательность, содержащую единственный сайт узнавания MteI (узнаваемая последовательность выделена рамочкой):Thus, the plasmid pBstMW2, unlike the plasmid pBstMW1, has a methylated BstMWI methylase sequence containing a single MteI recognition site (the recognition sequence is outlined):
На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов, образованных в результате обработки ДНК плазмид pHspAI и pFsp4HI3 и pBstMW эндонуклеазой MteI.Figure 1 presents the electrophoregram of products formed by processing DNA plasmids pHspAI and pFsp4HI3 and pBstMW with MteI endonuclease.
Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.1:Description of the tracks on the electrophoregram depicted in figure 1:
1 - ДНК фага λ;1 - DNA of phage λ;
2 - ДНК фага λ, обработанная эндонуклеазой MteI;2 - phage λ DNA treated with MteI endonuclease;
3 - ДНК фага Т7;3 - DNA of phage T7;
4 - ДНК фага Т7, обработанная эндонуклеазой MteI;4 - phage T7 DNA treated with MteI endonuclease;
5 - ДНК плазмиды pHspAI;5 - DNA plasmid pHspAI;
6 - ДНК плазмиды pHspAI, обработанная эндонуклеазой MteI;6 - DNA plasmid pHspAI treated with endonuclease MteI;
7 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим);7 - 1 kb DNA molecular weight marker (produced by NPO SibEnzyme);
8 - ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;8 — DNA of plasmid pFsp4HI3 linearized with DriI restriction endonuclease;
9 - ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой GluI;9 — DNA of plasmid pFsp4HI3 linearized with DriI restriction endonuclease treated with GluI endonuclease;
10 - ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой MteI;10 — DNA of plasmid pFsp4HI3 linearized with DriI restriction endonuclease treated with MteI endonuclease;
11 - ДНК плазмиды pBstMW1, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;11 - DNA of plasmid pBstMW1, linearized with DriI restriction endonuclease;
12 - ДНК плазмиды pBstMW1, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой GluI;12 — DNA of plasmid pBstMW1 linearized with DriI restriction endonuclease treated with GluI endonuclease;
13 - ДНК плазмиды pBstMW1, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой MteI;13 — DNA of plasmid pBstMW1 linearized with DriI restriction endonuclease treated with MteI endonuclease;
14 - ДНК плазмиды pBstMW2, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;14 — DNA of plasmid pBstMW2 linearized with DriI restriction endonuclease;
15 - ДНК плазмиды pBstMW2, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой GluI;15 — DNA of plasmid pBstMW2 linearized with DriI restriction endonuclease treated with GluI endonuclease;
16 - ДНК плазмиды pBstMW2, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой MteI.16 — DNA of plasmid pBstMW2 linearized with DriI restriction endonuclease treated with MteI endonuclease.
Как видно из фиг.1, эндонуклеаза MteI не расщепляет плазмид pFsp4HI3, pBstMW1 и pHspAI, в которых отсутствует метилированная последовательность 5′-G(m5C)G(m5C)∧NG(m5C)G(m5C)-3′/5′-(m5C)G(m5C)∧GN(m5C)G(m5C)G-3′.As can be seen from figure 1, the MteI endonuclease does not cleave plasmids pFsp4HI3, pBstMW1 and pHspAI, in which there is no
В отличие от MteI эндонуклеаза GluI расщепляет pFsp4HI3 по единственному сайту 5′-G(m5C)∧NG(m5C)-3′/3′-(m5C)GN∧(m5C)G-5′.Unlike MteI, the endonuclease GluI cleaves pFsp4HI3 at a
ДНК плазмиды pBstMW1 длиной 4969 п.н., линеаризованную рестриктазой DriI, данный фермент расщепляет в единственном месте. Электрофоретическая подвижность образуемых в результате данного расщепления фрагментов ДНК соответствует теоретически рассчитанным для гидролиза по последовательности 5′-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3′/5′-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3′: 1260 п.н. и 3709 п.н.The DNA of plasmid pBstMW1, 4969 bp in length, linearized with the restriction enzyme DriI, this enzyme cleaves in a single place. The electrophoretic mobility of DNA fragments formed as a result of this cleavage corresponds to theoretically calculated for hydrolysis using the
Пример 3. Определение позиции гидролиза ДНК рестриктазой MteI на олигонуклеотидных дуплексахExample 3. Determination of the position of DNA hydrolysis by restriction enzyme MteI on oligonucleotide duplexes
Определение места гидролиза ДНК рестриктазой MteI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазами рестрикции MteI и GluI олигонуклеотидного дуплекса MteI/Mte2, образованного из олигонуклеотидов MteI и Mte2:The site of DNA hydrolysis by MteI restriction enzyme was determined by comparing the lengths of the fragments formed upon cleavage of the MteI and GluI restriction endonucleases of the MteI / Mte2 oligonucleotide duplex formed from MteI and Mte2 oligonucleotides:
MteI: 5′GCGGGATATG(m5C)G(m5C)∧N G(m5C)G(m5C)GCCAGTCA 3′,MteI: 5′GCGGGATATG (m5C) G (m5C) ∧ NG (m5C) G (m5C)
Mte2: 5′TGACTGGG(m5C)G(m5C)∧N G(m5C)G(m5C)GATATCCCGC 3'.Mte2: 5′TGACTGGG (m5C) G (m5C) ∧ NG (m5C) G (m5C) GATATCCCGC 3 '.
В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ЕхоIII. Последовательности олигонуклеотидов, использованных для определения позиции гидролиза MteI, приведены в таблице.As a marker of fragment lengths, the products of partial cleavage of the same duplexes with exonuclease ExoIII were used. The sequences of oligonucleotides used to determine the position of MteI hydrolysis are shown in the table.
На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления дезоксирибоолигонуклеотидного радиоактивно меченного дуплекса MteI/Mte2 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину. Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:Figure 2 shows a radio-autograph of the electrophoregram of the cleavage products of a deoxyribo oligonucleotide radioactively labeled duplex MteI / Mte2 in a 20% polyacrylamide gel containing 7 molar urea. Description of the tracks on the electrophoregram depicted in figure 2:
1 - исходный дуплекс MteI*/Mte2;1 - source duplex MteI * / Mte2;
2 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный эндонуклеазой GluI;2 - duplex MteI * / Mte2 treated with endonuclease GluI;
3 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный экзонуклеазой III из E.coli;3 - duplex MteI * / Mte2 treated with exonuclease III from E. coli;
4 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный эндонуклеазой MteI;4 - duplex MteI * / Mte2 treated with endonuclease MteI;
5 - исходный дуплекс Mte2*/Mte;5 - source duplex Mte2 * / Mte;
6 - дуплекс Mte2*/Mte обработанный эндонуклеазой GluI;6 - duplex Mte2 * / Mte treated with endonuclease GluI;
7 - дуплекс Mte2*/Mte обработанный экзонуклеазой III из E.coli;7 - duplex Mte2 * / Mte treated with exonuclease III from E. coli;
8 - дуплекс Mte2*/Mte, обработанный эндонуклеазой MteI.8 - duplex Mte2 * / Mte treated with endonuclease MteI.
Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором 32Р по 5′-концу, обозначены знаком *.Oligonucleotides labeled with 32 P radioactive phosphorus at the 5′-end are indicated by *.
Из фиг.2 видно, что продукты гидролиза ДНК дуплекса MteI*/Mte2 на дорожках 2 и 4, а также дуплекса Mte2*/MteI на дорожках 6 и 8 имеют одинаковые длины. Это означает, что позиции гидролиза ферментами GluI и MteI совпадают.Figure 2 shows that the products of DNA hydrolysis of the duplex MteI * / Mte2 in
На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в вырожденной палиндромной последовательности эндонуклеаза MteI расщепляет ДНК перед центральным нуклеотидом N: 5′-G(m5C)G(m5C)∧NG(m5C)G(m5C)-3′, где m5C - 5-метилцитозин.Based on the results obtained, it can be concluded that in a degenerate palindromic sequence, the endonuclease MteI splits DNA in front of the central nucleotide N: 5′-G (m5C) G (m5C) ∧ NG (m5C) G (m5C) -3 ′, where m5C - 5 methylcytosine.
Выход сайт-специфической эндонуклеазы MteI определяют по электрофоретической картине расщепления ДНК олигонуклеотидов MteI*/Mte2. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 пмоль олигонуклеотидного дуплекса MteI*/Mte2 за 1 час при температуре 37°С в объеме реакционной смеси 20 мкл. Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы, концентрация 16000 ед./мл.The yield of site-specific endonuclease MteI is determined by the electrophoretic pattern of DNA cleavage of MteI * / Mte2 oligonucleotides. The unit of activity is the minimum amount of enzyme required for complete cleavage of 1 pmol of the MteI * / Mte2 oligonucleotide duplex for 1 hour at 37 ° C in a volume of 20 μl of the reaction mixture. The yield of the enzyme is 200 units / g of crude biomass, a concentration of 16,000 units / ml.
Фермент хранится при -20°С в буфере, содержащем 50% глицерин, 0,08% тритон XI00, 0,2 М NaCl, 10 мМ трисНСl (рН 7,5), 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА.The enzyme is stored at -20 ° C in a buffer containing 50% glycerol, 0.08% Triton XI00, 0.2 M NaCl, 10 mM TrisHCl (pH 7.5), 7 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA.
Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу MteI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5′-G(m5C)G(m5C)∧NG(m5C)G(m5C)-3′/3′-(m5C)G(m5C)GN∧(m5C)G(m5C)G-5′, где m5C - 5-метилцитозин, с образованием однонуклеотидного 5′-выступающего конца и не расщепляет короткую метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′.Thus, a new strain was obtained that produces the site-specific endonuclease MteI, which recognizes and cleaves both chains of the nucleotide sequence of
Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.This site-specific endonuclease can be used to identify and analyze methylated DNA.
Источники информацииInformation sources
1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5′-GCGC-3′. - Биотехнология. - 2006. - №4. - С.31-35.1. Chernukhin V.A., Nayakshina T.N., Abdurashitov M.A., Tomilova Yu.E., Mezentseva N.V., Dedkov BC, Mikhnenkova N.A., Gonchar D.A., Degtyarev S. X. // New GlaI restriction endonuclease recognizes the methylated
2. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК 5′-G(5mC)NGC-3′ и расщепляет ее с образованием 3′-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №1. - С.28-33.2. Chernukhin V.A., Tomilova Yu.E., Chmuzh E.V., Sokolova O.O., Dedkov B.C., Degtyarev S.Kh. Site-specific endonuclease BlsI recognizes 5′-G (5mC) NGC-3 ′ DNA sequences and cleaves it to form 3′-protruding ends // Herald of Biotechnology and Physico-Chemical Biology Yu.A. Ovchinnikova. - 2007. - T.3. - No. 1. - S. 28-33.
3. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis T30 узнает метилированную последовательность ДНК 5′G(m5C)∧NGC-3′ // Биотехнология. - 2005. - №3. - С.22-26.3. Chmuzh E.V., Kashirina Yu.G., Tomilova Yu.E., Mezentseva N.V., Dedkov BC, Gonchar D.A., Abdurashitov M.A., Degtyarev S.Kh. New BisI restriction endonuclease from Bacillus subtilis T30 recognizes the 5′G (m5C) ∧ NGC-3 ′ methylated DNA sequence // Biotechnology. - 2005. - No. 3. - S. 22-26.
4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфичесчкая эндонклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5′-G(5mC)NG(5mC)-3′/3′-(5mC)GN(5mC)G-5′ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №2. - С.13-17.4. Chernukhin V.A., Chmuzh E.V., Tomilova Yu.E., Nayakshina T.N., Gonchar D.A., Dedkov B.C., Degtyarev S.Kh. The new site-specific endonclease GluI recognizes the methylated
5. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина). - М., 1997.5. The determinant of bacteria Bergey. / Ed. J. Houlta et al.: (9th edition in 2 volumes: transl. From English under the editorship of Acad. RAS G.A.Zavarzin). - M., 1997.
6. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.6. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.
7. Sugisaki, H., Yamamoto, K., Takanami М. The HgaI restriction-modification system contains two cytosine methylase genes responsible for modification of different DNA strands. // 1991. - J. Biol. Chem. - V.266 - P.13952-13957.7. Sugisaki, H., Yamamoto, K., Takanami M. The HgaI restriction-modification system contains two cytosine methylase genes responsible for modification of different DNA strands. // 1991. - J. Biol. Chem. - V.266 - P.13952-13957.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011150595/10A RU2475533C1 (en) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011150595/10A RU2475533C1 (en) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2475533C1 true RU2475533C1 (en) | 2013-02-20 |
Family
ID=49120976
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011150595/10A RU2475533C1 (en) | 2011-12-12 | 2011-12-12 | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2475533C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2614262C1 (en) * | 2016-03-17 | 2017-03-24 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2164043A (en) * | 1984-08-31 | 1986-03-12 | Takara Shuzo Co | Restriction enzyme and process for producing the same |
| DE3840358A1 (en) * | 1988-11-30 | 1990-05-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | TYPE II RESTRICTION ENDONUCLEASE MAMI |
| RU2057806C1 (en) * | 1994-05-17 | 1996-04-10 | Товарищество с ограниченной ответственностью "Сибэнзим" | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-gatnnnn-atc-3′ |
-
2011
- 2011-12-12 RU RU2011150595/10A patent/RU2475533C1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2164043A (en) * | 1984-08-31 | 1986-03-12 | Takara Shuzo Co | Restriction enzyme and process for producing the same |
| DE3840358A1 (en) * | 1988-11-30 | 1990-05-31 | Boehringer Mannheim Gmbh | TYPE II RESTRICTION ENDONUCLEASE MAMI |
| RU2057806C1 (en) * | 1994-05-17 | 1996-04-10 | Товарищество с ограниченной ответственностью "Сибэнзим" | Strain of bacterium bacillus coagulans - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting the nucleotide sequence 5′-gatnnnn-atc-3′ |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MARIKO TAKEUCHI and KAZUNOR1 HATANO "Union of the genera Microbacterium Orla-Jensen and Aureobacterium Collins et al. in a redefined genus Microbacterium", International Journal of Systematic Bacteriology, 1998, 48, p.739-747. * |
| MARIKO TAKEUCHI and KAZUNOR1 HATANO "Union of the genera Microbacterium Orla-Jensen and Aureobacterium Collins et al. in a redefined genus Microbacterium", International Journal of Systematic Bacteriology, 1998, 48, p.739-747. ЧЕРНУХИН B.A. и др. Новая 5-метилцитозин-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза Glul узнает последовательность ДНК 5′-G(5mC)↓NG(5mC)-3′/3′-(5mC)GN↓(5mC)G-5′. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, 2007, т.3, №2, с.13-17. * |
| ЧЕРНУХИН B.A. и др. Новая 5-метилцитозин-зависимая сайт-специфическая эндонуклеаза Glul узнает последовательность ДНК 5'-G(5mC)↓NG(5mC)-3'/3'-(5mC)GN↓(5mC)G-5'. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, 2007, т.3, No.2, с.13-17. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2614262C1 (en) * | 2016-03-17 | 2017-03-24 | Общество с ограниченной ответственностью "СибЭнзайм" | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7113877B2 (en) | RNA-directed DNA cleavage by Cas9-crRNA complex | |
| KR102623312B1 (en) | Enzyme with RUVC domain | |
| US10975415B2 (en) | Methods of utilizing thermostable mismatch endonuclease | |
| JP2023533417A (en) | Enzymes with RUVC domains | |
| RU2475533C1 (en) | BACTERIA STRAIN Microbacterium testaceum 17B-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE MteI | |
| RU2475534C1 (en) | BACTERIA STRAIN Planomicrobium koreense 78K-PRODUCENT OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PkrI | |
| RU2340670C1 (en) | Arthrobacter luteus B BACTERIA STRAIN-PRODUCER OF SITE-SPECIFIC Alu BI ENDONUCLEASE | |
| RU2377294C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM Paracoccus carotinifaciens 3K - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PcsI | |
| US20030211506A1 (en) | N. bstnbi nicking endonuclease and methods for using endonucleases in single-stranded displacement amplification | |
| RU2597987C1 (en) | RECOMBINANT BACTERIAL STRAIN Escherichia coli N42 (pElmI) - PRODUCER OF METHYL-DEPENDANT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE ElmI | |
| RU2593723C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA Plantibacter flavus 3Kz - PRODUCER OF METHYL-DEPENDENT SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PfsI | |
| RU2399663C1 (en) | Arthrobacter oxydans BACTERIA STRAIN - AoxI SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE PRODUCER | |
| RU2394099C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA Kocuria rasea-PRODUCER OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASES KroI | |
| RU2614262C1 (en) | STRAIN OF BACTERIA MICROCOCCUS LUTEUS 805 - PRODUCER OF SITE-SPECIFIC METHYL-DEPENDEDN ENDONUCLEASE MluVI | |
| CN110577923A (en) | Screening method of methylation protection strain for expressing restriction enzyme ApaLI | |
| RU2322492C1 (en) | Glacial ice bacterium microorganism strain as producer of site-specific endonuclease glu i | |
| RU2322494C1 (en) | MICROORGANISM STRAIN BACILLUS SIMPLEX AS PRODUCER OF SITE-SPECIFIC ENDONUCLEASE BlsI | |
| JP4143070B2 (en) | NOVEL ENZYME, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND METHOD FOR PRODUCING MOLECULAR WEIGHT ADJUSTED DOUBLE-STRAIN DNA USING THE SAME | |
| RU2270859C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM BACILLUS SUBTILIS AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Bisi | |
| JP3092817B2 (en) | Method for producing restriction enzyme | |
| RU2287012C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM Glacial ice bacterium I AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Gla I | |
| RU2603086C1 (en) | Recombinant bacterial strain escherichia coli n16 (pm.alubi) - producer of dna methyltransferase m.alubi | |
| WO2023039377A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
| JPH0669373B2 (en) | New restriction enzyme | |
| JPS6357038B2 (en) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191213 |