RU2597085C2 - Implanted matrix material for regenerative medicine and method of its production (versions) - Google Patents
Implanted matrix material for regenerative medicine and method of its production (versions) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2597085C2 RU2597085C2 RU2013147902/05A RU2013147902A RU2597085C2 RU 2597085 C2 RU2597085 C2 RU 2597085C2 RU 2013147902/05 A RU2013147902/05 A RU 2013147902/05A RU 2013147902 A RU2013147902 A RU 2013147902A RU 2597085 C2 RU2597085 C2 RU 2597085C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagen
- matrix material
- solution
- type
- gel
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретения относятся к медицине, в частности к новому матриксному материалу для тканевой биоинженерии и регенеративной медицины и способам его получения. Основной областью применения материала является реконструктивная терапия травм нервной системы и патологий, сопровождающихся нейродегенерацией. Материал может также применяться и для реконструктивной терапии повреждений других органов и тканей.The invention relates to medicine, in particular to a new matrix material for tissue bioengineering and regenerative medicine and methods for its preparation. The main field of application of the material is reconstructive therapy of injuries of the nervous system and pathologies accompanied by neurodegeneration. The material can also be used for reconstructive therapy of injuries of other organs and tissues.
Аналогами настоящего изобретения являются различные биосовместимые полимерные материалы, предназначенные для тканевой инженерии и реконструктивной терапии. Среди аналогов могут быть рассмотрены изобретения, защищенные патентами РФ №2188206, МПК C07K 14/78, C07K 1/36, A61K 38/39, A61P 9/08, опубл. 2002 г., №2249462, МПК A61K 38/39, A61K 35/12, опубл. 2005 г., №2321597, МПК С08В 37/00, С08L 5/00, A61K 31/715, A61K 31/724, опубл. 2008 г.The analogues of the present invention are various biocompatible polymeric materials for tissue engineering and reconstructive therapy. Among analogues, inventions protected by RF patents No. 2188206, IPC C07K 14/78, C07K 1/36, A61K 38/39, A61P 9/08, publ. 2002, No. 22449462, IPC A61K 38/39, A61K 35/12, publ. 2005, No. 2321597, IPC С08В 37/00, С08L 5/00, A61K 31/715, A61K 31/724, publ. 2008 year
Некоторые из перечисленных изобретений основаны на создании биосовместимого матрикса на основе компонентов, представленных исключительно различными формами коллагенов - ключевых белков внеклеточного матрикса (патенты №2188206 и №2249462). Такие материалы несмотря на продемонстрированные репарационные свойства имеют ряд существенных недостатков. Одним из недостатков материалов на основе коллагенов разных типов является их высокая скорость биодеградации в организме. В техническом решении, защищенном патентом РФ №2249462, заявлено, что полученный гетерогенный матрикс из препаратов коллагена двух классов позвоночных животных, представленный в виде двухфазной полимерной системы (твердые сферы в растворе денатурированного коллагена) согласно описанию изобретения обладает регулируемой скоростью деградации в организме. Однако ни в описании технического решения, ни в примерах, приведенных авторами изобретения, не указано, каким образом была решена известная проблема быстрой биодеградации имплантируемых коллагенов. Авторами изобретения также не продемонстрированы результаты экспериментов, позволяющих оценить скорость биодеградации данного материала. Ни в описании патента, ни в научных публикациях авторов изобретения, находящихся в открытом доступе, не указано об использовании методических подходов, позволяющих оценить скорость биодеградации коллагенов в области имплантации. В то время как из известных технических решений, описанных в научной литературе, скорость деградации коллагенов удается снизить посредством введения ковалентных сшивок между цепями полимера, а также введением коллагенов в сочетании с медленно деградирующими полимерами (такими как альгинат, хитозан, агароза). Данные способы являются единственными из описанных в научной и технической литературе. Другим недостатком материалов на основе коллагенов является отсутствие способности ограничивать формирование глиомезодермального рубца и цист с плотной оболочкой, которые возникают при естественном репарационном процессе после травматического повреждения мозга за счет миграции и адгезии клеток нейроглии и соединительной ткани. Данный недостаток коллагеновых материалов связан с высокими адгезионными свойствами в отношении клеток нейроглии и соединительной ткани. Структуры формирующегося рубца хотя и способствуют восстановлению целостности мозга, тем не менее формируют непреодолимый барьер для роста и регенерации отростков нервных клеток.Some of these inventions are based on the creation of a biocompatible matrix based on components represented exclusively by various forms of collagen — key extracellular matrix proteins (patents No. 2188206 and No. 22449462). Such materials, despite the demonstrated repair properties, have a number of significant drawbacks. One of the disadvantages of materials based on various types of collagen is their high rate of biodegradation in the body. In the technical solution, protected by RF patent No. 22949462, it is stated that the obtained heterogeneous matrix from collagen preparations of two classes of vertebrate animals, presented as a two-phase polymer system (solid spheres in a solution of denatured collagen), according to the description of the invention, has an adjustable rate of degradation in the body. However, neither in the description of the technical solution, nor in the examples cited by the inventors, it is indicated how the known problem of rapid biodegradation of implantable collagen was solved. The inventors also did not demonstrate the results of experiments that allow to evaluate the rate of biodegradation of this material. Neither in the patent description, nor in the scientific publications of the inventors in the public domain, it is indicated about the use of methodological approaches to assess the rate of biodegradation of collagen in the field of implantation. While from the well-known technical solutions described in the scientific literature, the rate of collagen degradation can be reduced by introducing covalent crosslinks between the polymer chains, as well as the introduction of collagen in combination with slowly degrading polymers (such as alginate, chitosan, agarose). These methods are the only ones described in the scientific and technical literature. Another disadvantage of collagen-based materials is the lack of ability to limit the formation of gliomesodermal scar and dense cysts that occur during the natural repair process after traumatic brain damage due to migration and adhesion of neuroglia and connective tissue cells. This disadvantage of collagen materials is associated with high adhesive properties in relation to neuroglia cells and connective tissue. Although the structures of the forming scar contribute to the restoration of brain integrity, they nevertheless form an insurmountable barrier to the growth and regeneration of nerve cell processes.
Известны матриксные гелевые материалы на основе гиалуроновой кислоты - углевода, формирующего аморфное вещество внеклеточного матрикса животных. Такие гели поддерживают жизнеспособность и аксональный рост нейронов дорзального ганглия цыпленка (Horn E.M., Beaumont M., Shu X.Z. et al. Influence of cross-linked hyaluronic acid hydrogels on neurite outgrowth and recovery from spinal cord injury //Journal of Neurosurgery-Spine. 2007. V. 6. P. 133-140).Known matrix gel materials based on hyaluronic acid - a carbohydrate that forms the amorphous substance of the extracellular matrix of animals. Such gels support the viability and axonal growth of chicken dorsal ganglion neurons (Horn EM, Beaumont M., Shu XZ et al. Influence of cross-linked hyaluronic acid hydrogels on neurite outgrowth and recovery from spinal cord injury // Journal of Neurosurgery-Spine. 2007 . V. 6. P. 133-140).
Однако имплантация данных гиалуроновых гелей в область травмы спинного мозга крыс не способствует регенерации последнего. Внедрение гиалуронового геля в область повреждения коры головного мозга крысы ингибирует формирование глиального шрама, позволяет обеспечить миграцию клеток внутрь геля, но не поддерживает аксональный рост (Cui F.Z., Tian W.M., Hou S.P., et al. Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering //Journal of Material Science: Materials in Medicine. 2006. Vol.17. P. 1393-1401). Этого недостатка лишены те же гели, но модифицированные с помощью иммобилизованных RGD-пептидов. В такие гели проникают не только различные клетки, но и активно прорастают регенерирующие аксоны.However, the implantation of these hyaluronic gels in the area of spinal cord injury in rats does not contribute to the regeneration of the latter. The introduction of a hyaluronic gel into the damaged area of the rat cerebral cortex inhibits the formation of a glial scar, allows for cell migration inside the gel, but does not support axonal growth (Cui FZ, Tian WM, Hou SP, et al. Hyaluronic acid hydrogel immobilized with RGD peptides for brain tissue engineering // Journal of Material Science: Materials in Medicine. 2006. Vol.17. P. 1393-1401). The same gels, but modified with immobilized RGD peptides, do not have this drawback. Not only various cells penetrate into such gels, but regenerating axons also actively grow.
Таким образом, без введения дополнительных компонентов или химической модификации, гиалуронат не способствует регенерации нервной системы. Другим ее недостатком, также как и других природных материалов животного происхождения, является быстрая биодеградация. Гели, состоящие только из гиалуроновой кислоты, полностью деградируют при подкожной имплантации уже через 2 недели (Hahn M.S., Teply B.A., Stevens M.M. et al. Collagen composite hydrogels for vocal fold lamina propria restoration //Biomaterials. 2006. Vol.27. P. 1104-1109).Thus, without the introduction of additional components or chemical modifications, hyaluronate does not contribute to the regeneration of the nervous system. Its other drawback, as well as other natural materials of animal origin, is its rapid biodegradation. Gels consisting only of hyaluronic acid are completely degraded by subcutaneous implantation after 2 weeks (Hahn MS, Teply BA, Stevens MM et al. Collagen composite hydrogels for vocal fold lamina propria restoration // Biomaterials. 2006. Vol.27. P. 1104-1109).
Известны матриксы на основе альгинатов - полисахаридов, получаемые из бурых водорослей. Полимеры альгиновой кислоты легко образуют высокогидрофильные, иммунологически инертные и биосовместимые гели при добавлении к ним ионов кальция. Эти гели в отличие от гелей на основе гиалуроновой кислоты биодеградируют медленно в организме млекопитающих, однако при их имплантации в область травмы мозга они не обеспечивают рост аксонов и, соответственно, регенерацию нервных путей. Для придания таким материалам нейрорегенеративных свойств из гелей получают пористые губки, путем лиофильного высушивания материала (Suzuki K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Regeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel //Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894). Только в таком виде материал на основе альгината стимулировал рост аксонов в поврежденном спинном мозге крыс, однако исследователям не удалось достигнуть существенного нейрорепаративного эффекта, который бы позволил значительно восстановить двигательную активность животных, регистрируемую по стандартной шкале оценки восстановления двигательной активности. Другим недостатком альгинатов является их низкие скорости набухания и растворения, что затрудняет их применение при процедурах получения матриксных материалов.Matrices based on alginates - polysaccharides obtained from brown algae are known. Alginic acid polymers easily form highly hydrophilic, immunologically inert and biocompatible gels when calcium ions are added to them. These gels, unlike gels based on hyaluronic acid, biodegrade slowly in mammals, but when they are implanted in the area of the brain injury, they do not provide axon growth and, consequently, nerve pathway regeneration. To impart neuroregenerative properties to such materials, porous sponges are obtained from gels by freeze-drying the material (Suzuki K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Regeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel // Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894). Only in this form did alginate-based material stimulate axon growth in the damaged spinal cord of rats, however, researchers were not able to achieve a significant neuroreparative effect that would significantly restore the motor activity of animals, recorded on a standard scale for assessing recovery of motor activity. Another disadvantage of alginates is their low swelling and dissolution rates, which complicates their use in the procedures for obtaining matrix materials.
Наиболее близким техническим решением по количеству существенных признаков является имплантируемая пористая матрица для регенеративной медицины, формируемая из биологически совместимого полимера или полимерной смеси, в частности для этого используют растительные полисахариды и белки внеклеточного матрикса. Формирование матрицы ведут путем уплотнения частиц полимера и частиц хлорида натрия с использованием прессования. Затем из прессованного полимера удаляют частицы хлорида натрия растворением. В одном из вариантов матрицы после удаления из нее хлорида натрия поверхность покрывают белками внеклеточного матрикса, в том числе коллагенами I и IV типов (п. РФ №2392287, МПК С08J 9/26, A61L 27/56, опубл. 2010 г.).The closest technical solution in terms of the number of essential features is an implantable porous matrix for regenerative medicine, formed from a biocompatible polymer or polymer mixture, in particular, plant polysaccharides and extracellular matrix proteins are used for this. The formation of the matrix is carried out by compaction of polymer particles and particles of sodium chloride using compression. Then, particles of sodium chloride are removed from the pressed polymer by dissolution. In one embodiment of the matrix, after removal of sodium chloride from it, the surface is covered with extracellular matrix proteins, including type I and IV collagens (Cl. RF No. 2392287, IPC
К недостаткам данной матрицы следует отнести:The disadvantages of this matrix include:
- она не предназначена для использования в качестве консолидирующего матрикса для реконструктивной и регенеративной терапии травм мозга, поскольку не препятствует формированию плотного глиомезодермального рубца и цист с плотной оболочкой в области травматического повреждения мозга;- it is not intended for use as a consolidating matrix for reconstructive and regenerative therapy of brain injuries, since it does not impede the formation of a dense gliomesodermal scar and cysts with a dense membrane in the area of traumatic brain damage;
- высокую пористость матрицы, которая обеспечивает после имплантации быстрое проникновение в ее структуру клеток, обладающих высокой миграционной и ремоделирующей матрикс способностью, что является нежелательным, поскольку приводит к высокой скорости биодеградации имплантата, который разрушается до момента прохождения медленных процессов восстановления поврежденных тканей, наблюдаемых при нейрорегенерации;- high porosity of the matrix, which after implantation provides for rapid penetration of cells with high migration and remodeling matrix ability into its structure, which is undesirable, since it leads to a high biodegradation rate of the implant, which is destroyed before the slow processes of restoration of damaged tissues undergo neuroregeneration ;
- механические свойства жесткого пористого матрикса хуже имитируют естественный внеклеточный матрикс мягких тканей по сравнению с таковым, представляющим собой гидрогель;- the mechanical properties of a rigid porous matrix mimic the natural extracellular matrix of soft tissues worse than that of a hydrogel;
- имплантирование матрикса возможно только путем сложной хирургической операции, затрагивающей неповрежденные участки тела, поскольку необходимы процедуры диссекции тканей для получения открытого операционного поля;- implantation of the matrix is possible only through complex surgical operations involving intact areas of the body, since tissue dissection procedures are necessary to obtain an open surgical field;
- сложность способа приготовления матрикса, особенно в случаях получения композиционного матрикса, поскольку предусматривает процедуры прессования, циклы промывки растворителем и нанесения на подготовленные пористые поверхности других компонентов композиции, в связи с чем невозможно инъекционное низко травматическое введение материала и формирование матрикса непосредственно в участке имплантации.- the complexity of the method of preparation of the matrix, especially in cases of obtaining a composite matrix, since it involves pressing procedures, cycles of washing with a solvent and applying other components of the composition to prepared porous surfaces, which makes it impossible to inject low-traumatic introduction of the material and the formation of the matrix directly in the implantation site.
Задачей настоящей группы изобретений является создание нового матриксного материала для регенеративной медицины, предназначенного, в частности, для реконструктивной терапии травм мозга, который обеспечивает регенерацию нервных проводников, обладает низкой скоростью биодеградации в организме млекопитающих, сопоставимой со скоростью регенерации, и способного ограничивать формирование плотных рубцов и крупных цист в очаге ремоделирования тканей.The objective of this group of inventions is to create a new matrix material for regenerative medicine, intended, in particular, for reconstructive therapy of brain injuries, which provides regeneration of nerve conductors, has a low biodegradation rate in mammals, comparable to the rate of regeneration, and is able to limit the formation of dense scars and large cysts in the focus of tissue remodeling.
Поставленная задача решается созданием нового имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины, на основе биосовместимой полимерной смеси из растительного полисахарида и белков внеклеточного матрикса коллагенов I и IV типов, в которой согласно изобретению в качестве растительного полисахарида используют пектин со степенью этерификации не более 50%, причем конечные концентрации компонентов в матриксном материале находятся в диапазоне, вес. %:The problem is solved by creating a new implantable matrix material for regenerative medicine, based on a biocompatible polymer mixture of plant polysaccharide and extracellular matrix proteins of type I and IV collagen, in which according to the invention pectin is used as a plant polysaccharide with an esterification degree of not more than 50%, and the final the concentration of components in the matrix material are in the range, weight. %:
пектин со степенью этерификации не более 50% - 0,5-2,0,pectin with an esterification degree of not more than 50% - 0.5-2.0,
коллаген I типа - 0,1-1,5,type I collagen - 0.1-1.5,
коллаген IV типа - 0,01-0,5.type IV collagen - 0.01-0.5.
Кроме традиционных препаратов коллагена IV в имплантируемом матриксном материале также используют препарат его NCl-гексамеров.In addition to traditional collagen IV preparations, the preparation of its NCl hexamers is also used in the implantable matrix material.
Использование пектина со степенью этерификации не более 50% позволяет получать стабильные матриксы в форме гидрогелей, легко имплантируемые в области травматических повреждений, которые способны эффективно заселяться клетками регенерирующего участка и стимулировать регенерацию нервных проводников. Применение пектина в композиции с белками внеклеточного матрикса придает материалу низкую скорость биодеградации в организме и препятствует формированию плотных рубцов, поскольку уменьшает в составе композиции с белками их адгезионные свойства и таргетинг клеток, за счет которых формируются плотные структуры рубцов. Использование пектина со степенью этерификации не более 50% позволяет сформировать упорядоченные матриксные структуры типа «egg-box», в которые могут быть вовлечены и обратимо иммобилизованы за счет электростатических взаимодействий другие компоненты материала. Применение пектина со степенью этерификации, превышающей 50%, не обеспечивает формирование стабильных гидрогелей.The use of pectin with an esterification degree of not more than 50% makes it possible to obtain stable matrices in the form of hydrogels that are easily implantable in the area of traumatic injuries, which can be effectively colonized by the cells of the regenerating region and stimulate the regeneration of nerve conductors. The use of pectin in the composition with extracellular matrix proteins gives the material a low biodegradation rate in the body and prevents the formation of dense scars, since it reduces the adhesion properties and targeting of cells in the composition of the proteins, due to which dense scar structures are formed. The use of pectin with an esterification degree of not more than 50% allows the formation of ordered egg-box matrix structures into which other components of the material can be involved and reversibly immobilized due to electrostatic interactions. The use of pectin with an esterification degree exceeding 50% does not provide the formation of stable hydrogels.
Введение пектина в концентрации ниже 0,5% не позволяет получать стабильные гидрогели, пригодные для создания имплантируемого матриксного материала, а превышение концентрации пектина более 2,0% в составе материала приводит к образованию плотного матрикса с большим модулем упругости, что не обеспечивает эффективное проникновение клеток и их отростков, необходимое для регенерации тканей.The introduction of pectin at a concentration below 0.5% does not allow to obtain stable hydrogels suitable for creating an implantable matrix material, and an excess of pectin concentration of more than 2.0% in the composition of the material leads to the formation of a dense matrix with a large modulus of elasticity, which does not provide effective penetration of cells and their processes, necessary for tissue regeneration.
Введение в состав материала коллагена I типа в количестве 0,1-1,5% способствует достижению заявленного технического результата, при этом использование концентраций менее 0,1% не обеспечивает материал необходимыми адгезионными свойствами, что не способствует росту нервных проводников и не обеспечивает эффективную регенерацию. Кроме того, снижение концентрации ниже указанного значения не придает имплантируемому материалу стабильность. Превышение концентрации коллагена I типа более 1,5% в составе композиции так же, как и в случае с пектином, приводит к формированию плотного матрикса с большим модулем упругости, что не обеспечивает эффективное проникновение клеток и их отростков, необходимое для регенерации тканей.The introduction of collagen of type I in the amount of 0.1-1.5% contributes to the achievement of the claimed technical result, while the use of concentrations of less than 0.1% does not provide the material with the necessary adhesive properties, which does not contribute to the growth of nerve conductors and does not provide effective regeneration . In addition, a decrease in concentration below the specified value does not give the implantable material stability. An excess of type I collagen concentration of more than 1.5% in the composition, as in the case of pectin, leads to the formation of a dense matrix with a large elastic modulus, which does not ensure the effective penetration of cells and their processes, necessary for tissue regeneration.
Использование в составе имплантируемого матриксного материала коллагена IV типа в конечных концентрациях 0,01-0,5% обеспечивает реализацию регенераторного потенциала клеток, приближает состав композиционного матрикса к таковому в развивающихся эмбриональных структурах, для которых характерны активная миграция клеток вдоль путей, маркированных коллагеном данного типа, что стимулирует, в частности, регенерацию нервных проводников. Снижение концентрации ниже 0,01% не является эффективным стимулом для роста отростков клеток, а превышение концентрации более 0,5% подавляет их рост.The use of type IV collagen in the implantable matrix material in final concentrations of 0.01-0.5% ensures the realization of the regenerative potential of cells, brings the composition of the composite matrix closer to that in developing embryonic structures, which are characterized by active cell migration along pathways marked with this type of collagen , which stimulates, in particular, the regeneration of nerve conductors. A decrease in concentration below 0.01% is not an effective incentive for the growth of cell processes, and an excess of concentration of more than 0.5% inhibits their growth.
Применение в составе имплантируемого матриксного материала коллагена IV типа в форме препарата его NC1-гексамеров, повышает эффективность применения коллагена IV типа как матриксного компонента, стимулирующего миграцию клеток и рост их отростков.The use of collagen type IV in the form of a preparation of its NC1 hexamers as part of the implantable matrix material increases the efficiency of the use of type IV collagen as a matrix component that stimulates the migration of cells and the growth of their processes.
Заявленный технический результат достигается также способами получения имплантируемого матриксного материала.The claimed technical result is also achieved by methods of obtaining implantable matrix material.
Заявленный имплантируемый матриксный материал для регенеративной медицины в форме гидрогеля получают смешиванием при температуре не выше 5оС уксуснокислого раствора коллагена I типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,1-1,5% с раствором коллагена IV типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,01-0,5%. Затем полученную смесь смешивают с предварительно приготовленным инициатором гелеобразования, включающим раствор хлорида кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси, и раствор хлорида натрия до физиологической концентрации; после чего в полученную смесь вводят раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5-2,0% и формируют гель путем повышения температуры смеси до физиологической.The inventive implantable matrix material for regenerative medicine obtained by mixing at temperatures not exceeding 5 ° C acetic acid solution of collagen type I to its final concentration in the matrix material of 0.1-1.5% with type IV collagen solution to its final concentration in the matrix in the form of hydrogel material 0.01-0.5%. Then, the resulting mixture is mixed with a pre-prepared gelation initiator, including a solution of calcium chloride in a concentration that ensures the gelation process, a non-toxic buffer system in an amount that ensures neutralization of the mixture, and a sodium chloride solution to a physiological concentration; then a pectin solution with an esterification degree of not higher than 50% to a final concentration of 0.5-2.0% is introduced into the resulting mixture and a gel is formed by raising the temperature of the mixture to physiological.
Последовательность процедур смешения компонентов является принципиально важной, поскольку именно это обеспечивает достижение заявленного результата. Отклонение от данной схемы, в частности смешивание уксуснокислого раствора коллагена I типа непосредственно с раствором пектина, вызывает выпадение в осадок обоих компонентов, что не приводит к формированию матриксного материала в форме гидрогеля. А первичное смешивание раствора пектина с инициатором гелеобразования приводит к быстрому формированию геля и невозможности введения в его состав белков внеклеточного матрикса, что не позволяет получить композиционный материал.The sequence of procedures for mixing the components is fundamentally important, since this is precisely what ensures the stated result. Deviation from this scheme, in particular, mixing of type I collagen acetic acid solution directly with pectin solution, causes both components to precipitate, which does not lead to the formation of a matrix material in the form of a hydrogel. And the primary mixing of the pectin solution with the initiator of gelation leads to the rapid formation of the gel and the impossibility of introducing extracellular matrix proteins into its composition, which does not allow to obtain composite material.
Смешивание уксуснокислого раствора коллагена I типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,1-1,5% с раствором коллагена IV типа до его конечной концентрации в матриксном материале 0,01-0,1%, с последующим введением в полученную смесь предварительно приготовленного инициатора гелеобразования, при температуре выше 5оС приводит к быстрому формированию белкового геля, что не позволяет включить в его состав пектин.Mixing an acetic acid solution of type I collagen to its final concentration in the matrix material 0.1-1.5% with a solution of type IV collagen to its final concentration in the matrix material 0.01-0.1%, followed by the introduction of the previously prepared gel initiator at a temperature above 5 ° C leads to the rapid formation of a protein gel that does not allow to include in its composition the pectin.
Использование в составе инициатора гелеобразования хлорида кальция, который в конечной концентрации в матриксном материале составляет 1-10 мМ, обеспечивает процесс гелеобразования и позволяет сформировать упорядоченные матриксные структуры типа «egg-box», которые образуют гелевый матрикс посредством ассоциации молекул пектина с низкой степенью этерификации. Введение в состав инициатора гелеобразования нетоксичной буферной системы в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси коллагенов, приводит к формированию гелей за счет ассоциации молекул коллагенов.The use of calcium chloride in the gel initiator, which is 1-10 mM in the final concentration in the matrix material, provides a gel process and allows the formation of ordered egg-box matrix structures that form a gel matrix by associating pectin molecules with a low degree of esterification. The introduction of a non-toxic buffer system into the gel initiator in an amount that ensures the neutralization of the collagen mixture leads to the formation of gels due to the association of collagen molecules.
В качестве нетоксичной буферной системы в способе могут быть использованы, в частности, NaOH-N-2-гидроксиэтипиперазин-N′-этансульфоновая кислота (HEPES), NaOH-N-2-гидроксиэтилпиперазин-N′-3-пропансульфоновая кислота (EPPS).As a non-toxic buffer system in the method, in particular, NaOH-N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-ethanesulfonic acid (HEPES), NaOH-N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-3-propanesulfonic acid (EPPS) can be used.
Введение хлорида натрия в состав инициатора необходимо для создания физиологических условий, изотонических по отношению к клеткам млекопитающих.The introduction of sodium chloride in the initiator is necessary to create physiological conditions that are isotonic with respect to mammalian cells.
Формирование гидрогелей стимулируется повышением температуры до физиологических значений, характерных для организма млекопитающего.The formation of hydrogels is stimulated by an increase in temperature to physiological values characteristic of the mammalian organism.
Лиофильное высушивание сформированного матриксного материала в форме гидрогеля позволяет получить пористый матриксный материал в форме губки, что способствует расширению области его применения, поскольку такой матрикс обеспечивает большую скорость заселения клетками, их ускоренную миграцию внутрь материала, что может являться преимуществом при создании биоискусственных аналогов тканей в лабораторных условиях.Lyophilized drying of the formed matrix material in the form of a hydrogel allows one to obtain a porous matrix material in the form of a sponge, which helps to expand its field of application, since such a matrix provides a high rate of population of cells, their accelerated migration into the material, which can be an advantage when creating bio-artificial tissue analogues in laboratory conditions.
Заявленный технический результат достигается также вторым способом получения имплантируемого матриксного материала для регенеративной медицины в форме гидрогеля, заключающегося в смешивании при температуре не выше 5оС уксуснокислого раствора коллагена I типа до конечной концентрации 0,1-1,5% с раствором коллагена IV типа до конечной концентрации 0,01-0,1%. Затем в смесь белков внеклеточного матрикса добавляют хлорид натрия до физиологической концентрации и нетоксичную буферную систему в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси. После нейтрализации к смеси добавляют раствор пектина со степенью этерификации не выше 50% до конечной концентрации 0,5-2,0% и только после этого формируют гель.The claimed technical result is also achieved by a second method of producing the implantable matrix material for regenerative medicine in the form of hydrogel, which consists in mixing at a temperature of not higher than 5 ° C acetic acid solution of collagen type I to a final concentration of 0.1-1.5% with Type IV collagen solution to final concentration of 0.01-0.1%. Then, sodium chloride is added to the extracellular matrix protein mixture to a physiological concentration and a non-toxic buffer system in an amount to neutralize the mixture. After neutralization, a pectin solution with an esterification degree of not higher than 50% to a final concentration of 0.5-2.0% is added to the mixture and only after that a gel is formed.
Смешивание белков внеклеточного матрикса с хлоридом натрия до физиологической концентрации и с нетоксичной буферной системой в количестве, обеспечивающем нейтрализацию смеси, позволяет затем ввести раствор пектина и получить жидкую композицию, которую в последующем формируют в гелевый матрикс различными способами.Mixing extracellular matrix proteins with sodium chloride to a physiological concentration and with a non-toxic buffer system in an amount that ensures the neutralization of the mixture, then allows you to enter the pectin solution and obtain a liquid composition, which is subsequently formed into a gel matrix in various ways.
В одном из вариантов формирование геля проводят путем наслаивания на поверхность жидкой композиции раствора инициатора гелеобразования, включающего хлорид кальция в концентрации, обеспечивающей процесс гелеобразования, нетоксичную буферную систему, поддерживающую нейтральный рН и хлорид натрия до физиологической концентрации в матриксном материале, с последующим повышением температуры до физиологической.In one embodiment, the gel formation is carried out by layering on the surface of the liquid composition a solution of a gelation initiator, including calcium chloride in a concentration that ensures the gelation process, a non-toxic buffer system that maintains a neutral pH and sodium chloride to a physiological concentration in the matrix material, followed by a temperature increase to physiological .
Это позволяет получать имплантируемые матриксные материалы различной геометрии, поскольку предварительно подготовленную жидкую композицию можно поместить в различные сосуды, сформировать ровные поверхности и только затем выполнить процедуру формирования геля путем создания условий для гелеобразования. Это важно как при проведении научных исследований биосовместимых материалов, так и для создания имплантатов различной формы и назначения.This makes it possible to obtain implantable matrix materials of various geometries, since a previously prepared liquid composition can be placed in various vessels, formed smooth surfaces, and only then perform the gel formation procedure by creating conditions for gel formation. This is important both when conducting research on biocompatible materials, and for creating implants of various shapes and purposes.
В другом варианте формирование геля производят путем введения жидкой композиции непосредственно в область имплантации в организм реципиента. Наличие свободных ионов кальция в жидкой среде организма и температура близкая к 37оС обеспечивают условия формирования геля непосредственно в области имплантации. Это позволяет отказаться от диссекции тканей для получения открытого операционного поля и избрать менее травматичный способ введения имплантируемой конструкции путем инъекции.In another embodiment, the formation of the gel is carried out by introducing a liquid composition directly into the area of implantation in the recipient's body. The presence of free calcium ions in the body fluids and the temperature close to 37 ° C provide conditions of gel formation directly in the implantation area. This allows you to abandon the dissection of tissues to obtain an open surgical field and choose a less traumatic method of introducing an implantable structure by injection.
Примеры осуществления изобретений.Examples of the invention.
Для приготовления материала используют стерильные компоненты.To prepare the material using sterile components.
Пример 1.Example 1
Предварительно готовят инициатор гелеобразования путем смешивания 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 1M HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 300 мкл 5M NaCl, 60 мкл 1M CaCl2, 2,736 мл деионизованной водыA gel initiator is preliminarily prepared by mixing 4 μl of 10M NaOH, 300 μl of 1M HEPES (titrated with sodium hydroxide solution to pH 7.4), 300 μl of 5M NaCl, 60 μl of 1M CaCl 2 , 2.736 ml of deionized water
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 0оС 1,1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 4,5 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 0,5 мл раствора коллагена IV типа в виде NC1-гексамеров концентрацией 1 мг/мл и 3,4 мл инициатора гелеобразования. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 3% со степенью этерификации 30%, тщательно перемешивают и проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал представляет собой прозрачный гель, который содержит 1,5% пектина со степенью этерификации 30%, 0,5% коллагена I типа, 0,05% коллагена IV типа.To prepare 10 ml of implantable matrix material is mixed under aseptic conditions at 0 ° C 1.1 ml type I collagen solution with a concentration of 4.5 mg / ml, prepared in 0.03 M acetic acid; 0.5 ml of type IV collagen solution in the form of NC1-hexamers with a concentration of 1 mg / ml and 3.4 ml of a gelation initiator. Then 5 ml of solution is administered a concentration of 3% of pectin having a degree of esterification of 30%, mixed thoroughly and gel formation is carried out in an oven at 37 C. The resulting matrix material is a transparent gel which contains 1.5% pectin having a degree of esterification of 30%; 0.5% collagen type I, 0.05% collagen type IV.
Пример 2.Example 2
Предварительно готовят инициатор гелеобразования путем смешивания 9 мкл 10М NaOH, 300 мкл 1M HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 300 мкл 5M NaCl, 100 мкл 1M CaCl2, 1,691 мл деионизованной воды.A gel initiator is preliminarily prepared by mixing 9 μl of 10M NaOH, 300 μl of 1M HEPES (titrated with sodium hydroxide solution to pH 7.4), 300 μl of 5M NaCl, 100 μl of 1M CaCl 2 , 1.691 ml of deionized water.
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 5оС 2,5 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 6 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 0,1 мл раствора коллагена IV типа концентрацией 1 мг/мл и 2,4 мл инициатора гелеобразования. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 4% со степенью этерификации 50%, тщательно перемешивают и проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал представляет собой прозрачный гель, содержащий 2% пектина со степенью этерификации 50%, 1,5% коллагена I типа, 0,01% коллагена IV типа.To prepare 10 ml of implantable matrix material is mixed under aseptic conditions at a temperature of 5 ° C. 2.5 ml type I collagen solution with a concentration of 6 mg / ml, prepared in 0.03 M acetic acid; 0.1 ml of a type IV collagen solution with a concentration of 1 mg / ml and 2.4 ml of a gelation initiator. Then administered 5 ml of a 4% pectin having a degree of esterification of 50%, mixed thoroughly and gel formation is carried out in an oven at 37 C. The resulting matrix material is a transparent gel, containing 2% pectin having a degree of esterification of 50%, 1.5 % collagen type I, 0.01% collagen type IV.
Пример 3.Example 3
Предварительно готовят инициатор гелеобразования путем смешивания 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 1M EPPS (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 300 мкл 5M NaCl, 40 мкл 1M CaCl2, 1,356 мл деионизованной воды.Pre initiator gel was prepared by mixing 4 ul 10M NaOH, 300 .mu.l of 1M EPPS (titrated with sodium hydroxide solution to pH 7.4), 300 l of 5M NaCl, 40 .mu.l of 1M CaCl 2, 1,356 ml of deionized water.
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 5оС 1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 1 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 2 мл раствора коллагена IV типа концентрацией 2,5 мг/мл и 2,0 мл инициатора гелеобразования. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 1% со степенью этерификации 10%, тщательно перемешивают и проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал представляет собой прозрачный гель, содержащий 0,5% пектина со степенью этерификации 10%, 0,1% коллагена I типа, 0,5% коллагена IV типа.To prepare 10 ml of implantable matrix material is mixed under aseptic conditions at a temperature of 5 ° C. 1 ml of type I collagen solution with a concentration of 1 mg / ml, prepared in 0.03 M acetic acid; 2 ml of type IV collagen solution with a concentration of 2.5 mg / ml and 2.0 ml of a gel initiator. Then 5 ml of solution is administered a concentration of 1% pectin having a degree of esterification of 10%, mixed thoroughly and gel formation is carried out in an oven at 37 C. The resulting matrix material is a transparent gel, containing 0.5% of pectin having a degree of esterification of 10% 0 , 1% collagen type I, 0.5% collagen type IV.
Пример 4.Example 4
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях в чашке Петри смешивают при температуре 0оС 1,1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 4,5 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 0,5 мл раствора коллагена IV типа в виде NC1-гексамеров концентрацией 1 мг/мл. К полученной смеси прибавляют 300 мкл 1M HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 5M NaCl, 2,796 мл деионизованной воды. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 3% со степенью этерификации 30%, тщательно перемешивают. На поверхность полученной жидкой композиции аккуратно наслаивают равный объем раствора, содержащего 12 мМ хлорид кальция, 150 мМ NaCl, 50 мМ HEPES (рН 7,4), затем проводят формирование геля в термостате при температуре 37оС. Полученный матриксный материал сформированный в виде пласта геля с гладкими ровными поверхностями содержит 1,5% пектина со степенью этерификации 30%, 0,5% коллагена I типа, 0,05% коллагена IV типа.To prepare 10 ml of implantable matrix material aseptically in a petri dish is mixed at 0 ° C 1.1 ml of collagen type I solution with a concentration of 4.5 mg / ml, prepared in 0.03 M acetic acid; 0.5 ml of type IV collagen solution in the form of 1 mg / ml NC1-hexamers. To the resulting mixture were added 300 μl of 1M HEPES (titrated with sodium hydroxide solution to pH 7.4), 4 μl of 10M NaOH, 300 μl of 5M NaCl, 2.796 ml of deionized water. Then 5 ml of a solution of pectin with a concentration of 3% with a degree of esterification of 30% are introduced, mix thoroughly. On the surface, containing 12 mM calcium chloride, the resulting liquid composition was layered gently equal volume of a solution of 150 mM NaCl, 50 mM HEPES (pH 7.4), then subjected to the formation of gel in an oven at 37 C. The resulting matrix material is formed into a reservoir gel with smooth smooth surfaces contains 1.5% pectin with an esterification degree of 30%, 0.5% collagen type I, 0.05% collagen type IV.
Пример 5.Example 5
Для приготовления 10 мл имплантируемого матриксного материала в асептических условиях смешивают при температуре 5оС 1 мл раствора коллагена I типа с концентрацией 1 мг/мл, приготовленного на 0,03 М уксусной кислоте; 2 мл раствора коллагена IV типа концентрацией 2,5 мг/мл и нейтрализуют, добавляя к полученной смеси 300 мкл 1М HEPES (титрованного раствором гидроксида натрия до рН 7,4), 4 мкл 10М NaOH, 300 мкл 5М NaCl, 1,396 мл деионизованной воды. Затем вводят 5 мл раствора пектина концентрацией 3% со степенью этерификации 30%, тщательно перемешивают и заполняют полученной жидкой композицией шприц. После чего жидкую композицию вводят крысам путем выполнения инъекции в область имплантации. Через 1 и 10 суток после имплантации животных выводили из эксперимента путем декапитации. Образцы тканей, из области имплантации, исследовали на наличие сформированного матриксного материала. Исследования показали, что как при подкожной имплантации, так и в случае имплантации в область травматического повреждения спинного мозга введенная жидкая композиция формировала матриксный материал, представляющий собой гель. При исследовании гистологических срезов данных образцов на сроке 10 суток после имплантации наблюдали фрагменты имплантированного матриксного материала, содержащие клеточные элементы.To prepare 10 ml of implantable matrix material is mixed under aseptic conditions at a temperature of 5 ° C. 1 ml of type I collagen solution with a concentration of 1 mg / ml, prepared in 0.03 M acetic acid; 2 ml of type IV collagen solution with a concentration of 2.5 mg / ml and neutralized by adding 300 μl of 1M HEPES (titrated with sodium hydroxide solution to pH 7.4) to the resulting mixture, 4 μl of 10M NaOH, 300 μl of 5M NaCl, 1.396 ml of deionized water . Then, 5 ml of a 3% pectin solution with an esterification degree of 30% is introduced, mixed thoroughly and the syringe filled with the resulting liquid composition. Then the liquid composition is administered to rats by injection into the implantation area. After 1 and 10 days after implantation, the animals were removed from the experiment by decapitation. Tissue samples from the implantation area were examined for the presence of formed matrix material. Studies have shown that both with subcutaneous implantation and in the case of implantation in the area of traumatic damage to the spinal cord, the injected liquid composition formed a matrix material, which is a gel. In the study of histological sections of these samples for a period of 10 days after implantation, fragments of the implanted matrix material containing cellular elements were observed.
Пример 6. Матриксный материал получают согласно примеру 2, затем проводят его лиофильное высушивание. В результате чего в сформированном геле образуются поры, а сам готовый продукт представляет собой биополимерную губку.Example 6. The matrix material is obtained according to example 2, then carry out its freeze drying. As a result, pores are formed in the formed gel, and the finished product itself is a biopolymer sponge.
Для доказательства функциональной работоспособности заявленных изобретений проводили следующие эксперименты. Результаты экспериментов демонстрируются фигурами 1-8.To prove the functional performance of the claimed inventions, the following experiments were carried out. The results of the experiments are shown in figures 1-8.
На фиг. 1. представлены результаты культивирования нейральных стволовых клеток фетального мозга крыс на различных подложках, где: фиг. 1А - на полистироле, фиг. 1Б - на пектине, фиг. 1В - на матриксном (заявляемом) материале в форме гидрогеля.In FIG. 1. presents the results of the cultivation of neural stem cells of rat fetal brain on various substrates, where: FIG. 1A on polystyrene, FIG. 1B — on pectin, FIG. 1B — on a matrix (claimed) material in the form of a hydrogel.
На фиг. 2. представлена морфология имплантатов на основе пектинового гидрогеля (фиг. 2А и фиг. 2Б), заявляемого матриксного материала (фиг. 2В и фиг. 2Г), коллагена (фиг. 2Д и 2Е) на препаратах-срезах через 10 дней после подкожной имплантации крысам. На фиг. 2 использованы следующие обозначения: КГ - коллагеновая губка, КМ - композиционный матриксный материал, М - макрофаги, ФК - фиброзная капсула, С - сосуды.In FIG. 2. presents the morphology of implants based on pectin hydrogel (Fig. 2A and Fig. 2B), the inventive matrix material (Fig. 2B and Fig. 2G), collagen (Figs. 2E and 2E) on slice preparations 10 days after subcutaneous implantation to rats. In FIG. 2, the following notation is used: KG - collagen sponge, KM - composite matrix material, M - macrophages, FC - fibrous capsule, C - vessels.
На фиг. 3. представлена морфология имплантатов на основе пектинового (фиг. 3А, фиг. 3Б), заявляемого матриксного материала (фиг. 3В, фиг. 3Г, фиг. 3Д, фиг. 3Е) на сроках 1 месяц после подкожной имплантации (фиг. 3А, фиг. 3В, фиг. 3Г), 3 месяца после имплантации (фиг. 3Б, фиг. 3Д, фиг. 3Е). На фиг. 3 использованы следующие обозначения: КМ - композиционный матриксный материал, М - мышцы, ФК - фиброзная капсула. Двойная стрелка на фиг. 3Б обозначает область имплантации.In FIG. 3. presents the morphology of implants based on pectin (Fig. 3A, Fig. 3B), the inventive matrix material (Fig. 3B, Fig. 3G, Fig. 3D, Fig. 3E) for 1 month after subcutaneous implantation (Fig. 3A, Fig. 3B, Fig. 3G), 3 months after implantation (Fig. 3B, Fig. 3D, Fig. 3E). In FIG. 3 the following notation is used: KM - composite matrix material, M - muscles, FC - fibrous capsule. The double arrow in FIG. 3B denotes the implantation area.
На фиг. 4. представлены изображения спинного мозга крыс на магниторезонансных томограммах через 4 дня после острой спинальной травмы и имплантации коллагеновой губки (фиг. 4А) и заявляемого матриксного материала (фиг 4Б).In FIG. 4. presents images of the spinal cord of rats on magnetic resonance imaging 4 days after acute spinal injury and implantation of a collagen sponge (Fig. 4A) and the inventive matrix material (Fig. 4B).
На фиг. 5. представлены изображения покадровой видеосъемки различных групп экспериментальных животных в процессе движения, где: фиг 5А - из контрольной группы, фиг. 5Б - из группы «Пектиновый гель» и фиг. 5В - из группы «Матриксный материал» на 60 день после спинальной сегментэктомии.In FIG. 5. images of frame-by-frame video recording of various groups of experimental animals in the process of movement, where: FIG. 5A from the control group, FIG. 5B - from the group "Pectin gel" and Fig. 5B - from the
На фиг. 6. представлен внешний вид задних конечностей крыс из контрольной группы (фиг. 6А), группы «Пектиновый гель» (фиг. 6Б) и группы «Матриксный материал» (фиг. 6В) на 60 день после сегментэктомии спинного мозга.In FIG. 6. shows the appearance of the hind limbs of rats from the control group (Fig. 6A), the "Pectin gel" group (Fig. 6B) and the "Matrix material" group (Fig. 6B) on the 60th day after the spinal cord segmentectomy.
На фиг. 7. представлено гистологическое строение спинного мозга крыс из экспериментальной группы «Матриксный материал» через 3 месяца после операции. Окраска гематоксилином и эозином (фиг. 7А, фиг. 7Г); иммуногистохимическое выявление β-III-тубулина, вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 546 (фиг. 7Б, фиг. 7В). Изображения получены методом светлого поля (фиг. 7А, фиг. 7Г), эпифлуоресцентной микроскопии (фиг. 7Б) и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (фиг. 7В - слитое изображение, полученное в проходящем свете и отраженном свете). Фиг. 7А - общий вид; фиг. 7Б - область, обозначенная прямоугольником на фиг. 7А; фиг. 7В - область рубца, стрелками указаны отростки нервных клеток, прорастающие в гель; фиг. 7Г - макрофаги в области рубца, где: М - макрофаги; НС - нейрональные структуры.In FIG. 7. presents the histological structure of the spinal cord of rats from the experimental group "Matrix material" 3 months after surgery. Stained with hematoxylin and eosin (Fig. 7A, Fig. 7G); immunohistochemical detection of β-III-tubulin, secondary antibodies conjugated to Alexa Fluor 546 (Fig. 7B, Fig. 7B). Images were obtained by the bright field method (Fig. 7A, Fig. 7G), epifluorescence microscopy (Fig. 7B) and confocal laser scanning microscopy (Fig. 7B is a merged image obtained in transmitted light and reflected light). FIG. 7A is a general view; FIG. 7B is a region indicated by a rectangle in FIG. 7A; FIG. 7B - region of the scar, arrows indicate the processes of nerve cells germinating in the gel; FIG. 7G - macrophages in the scar area, where: M - macrophages; NS - neuronal structures.
На фиг. 8. представлено гистологическое строение спинного мозга крыс из контрольной группы через 3 месяца после операции. Фиг. 8А - общий вид, окраска гематоксилином и эозином; фиг. 8Б, фиг. 8В - область, обозначенная прямоугольником на фиг. 8А; фиг. 8Б - иммуногистохимическое выявление β-III-тубулина (вторичные антитела, конъюгированные с Alexa 546); фиг. 8В - окраска ядер DAPI. Изображения получены методом светлого поля (фиг. 8А), эпифлуоресцентной микроскопии (фиг. 8Б, фиг. 8В). Где: НВ - нервные волокна, СК - стенка капсулы.In FIG. 8. presents the histological structure of the spinal cord of rats from the control group 3 months after surgery. FIG. 8A is a general view, hematoxylin and eosin staining; FIG. 8B, FIG. 8B is a region indicated by a rectangle in FIG. 8A; FIG. 8B - immunohistochemical detection of β-III-tubulin (secondary antibodies conjugated to Alexa 546); FIG. 8B is the staining of DAPI cores. Images were obtained by the bright field method (Fig. 8A), epifluorescence microscopy (Fig. 8B, Fig. 8B). Where: HB - nerve fibers, SC - capsule wall.
Для оценки биосовместимости материалов in vitro проводили культивирование нейральных стволовых клеток фетального мозга крыс с использованием в качестве матриксной подложки образцов, полученных по примеру 1. В качестве контроля клетки наносили на дно лунок планшета из полистирола или инкубировали на поверхности геля, сформированного из раствора пектина. Результаты культивирования нейральных стволовых клеток представлены на Фиг. 1. На Фиг. 1А представлен результат культивирования клеток на полистироле, где были обнаружены отдельные клетки униполярной, биполярной и триангулярной формы с короткими отростками, однако большинство клеток сохраняли сферическую форму, а значительная часть клеток формировала типичные конгломераты клеток - нейросферы. В культуре нейральных клеток на поверхности гидрогеля, сформированного из раствора пектина (Фиг. 1Б), практически не наблюдали рассеянных отростчатых клеток, вместе с тем, как и в предшествующем случае, для данного образца было отмечено формирование плотных нейросфер с редким высеванием клеток по периферии; формирование отростков и выраженных признаков дифференцировки не было отмечено для клеток, культивированных на данном материале. В культуре нейральных стволовых клеток на поверхности матриксного материала в форме гидрогеля (Фиг. 1 В) наблюдали формирование типичных нейросфер, однако характер распластывания клеток на периферии нейросфер на поверхности субстрата и морфология отростков значительно отличались от таковых контрольных культур. Так, в культуре нейральных клеток на матриксном материале наблюдали формирование длинных отростков, простирающихся на значительные расстояния от границ нейросфер. Жизнеспособность клеток во всех трех культурах достоверно не отличалась. Это доказывает, что полученный матриксный материал способен поддерживать жизнеспособные культуры клеток, не является токсичным и обеспечивает формирование длинных отростков нервных проводников.To assess the biocompatibility of materials in vitro, rat fetal neural stem cells were cultured using the samples obtained in Example 1 as a matrix substrate. As a control, cells were applied to the bottom of the polystyrene plate wells or incubated on the surface of a gel formed from a pectin solution. The results of culturing neural stem cells are presented in FIG. 1. In FIG. 1A presents the result of culturing cells on polystyrene, where individual cells of a unipolar, bipolar and triangular shape with short processes were found, however, most of the cells retained a spherical shape, and a significant part of the cells formed typical conglomerates of cells - neurospheres. In the culture of neural cells on the surface of the hydrogel formed from the pectin solution (Fig. 1B), scattered process cells were practically not observed, however, as in the previous case, the formation of dense neurospheres with rare seeding of cells on the periphery was noted for this sample; the formation of processes and pronounced signs of differentiation were not observed for cells cultured on this material. In the culture of neural stem cells on the surface of the matrix material in the form of a hydrogel (Fig. 1B), the formation of typical neurospheres was observed, however, the nature of the spreading of cells on the periphery of the neurospheres on the substrate surface and the morphology of the processes were significantly different from those of the control cultures. So, in the culture of neural cells on matrix material, the formation of long processes extending over considerable distances from the boundaries of the neurospheres was observed. Cell viability in all three cultures was not significantly different. This proves that the obtained matrix material is able to maintain viable cell cultures, is not toxic, and ensures the formation of long processes of nerve conductors.
В другом эксперименте проверяли скорость биодеградации материалов. Для этой цели из образцов, полученных по примеру 4, с помощью специального пробойника высекали диски диаметром 0,5 см, которые имплантировали подкожно крысам. В эксперименте использовали 36 белых крыс-самок линии Wistar массой около 250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария. Животных вводили в наркоз внутримышечным введением смеси золетила (2 мг/кг) и ксилазина (4 мг/кг). На спине выстригали шерсть и обрабатывали операционное поле раствором йода на 70% спирте. Разрезали кожу парамедиально и тупым рассечением делали карманы. В каждый карман помещали по одному имплантату. Каждому животному имплантировали 4 диска. В качестве контроля одной группе животных имплантировали диски, сформированные из пектина, а другой группе проводили имплантацию стерильной коллагеновой губки. Кожу ушивали шелком. Рану повторно обрабатывали спиртовым раствором и тетрациклином. Сразу после операции и в последующие три дня вводили подкожно профилактическую дозу антибиотика (цефтриаксон 40 мгк/г).In another experiment, the biodegradation rate of materials was checked. For this purpose, from the samples obtained in example 4, using a special punch, discs with a diameter of 0.5 cm were cut, which were implanted subcutaneously in rats. In the experiment, 36 white Wistar female rats weighing about 250 g were used. Animals were kept under standard vivarium conditions. The animals were anesthetized by intramuscular injection of a mixture of zoetil (2 mg / kg) and xylazine (4 mg / kg). The hair was cut off on the back and the surgical field was treated with a solution of iodine in 70% alcohol. The skin was cut paramedially and pockets were made with blunt dissection. One implant was placed in each pocket. Each animal was implanted with 4 discs. As a control, disks formed from pectin were implanted in one group of animals, and a sterile collagen sponge was implanted in the other group. The skin was sutured with silk. The wound was re-treated with an alcohol solution and tetracycline. Immediately after surgery and in the next three days, a prophylactic dose of an antibiotic was administered subcutaneously (ceftriaxone 40 mg / g).
Животных выводили из эксперимента на сроках 10 дней, 1 месяц, 3 месяца глубоким эфирным наркозом. Извлекали имплантаты, фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере, в течение суток. Образцы отмывали фосфатным буфером и переводили в абсолютный этанол через серию водных растворов этанола. Заливали в парафин по стандартной методике. Изготавливали поперечные срезы толщиной 5 мкм. Окрашивали гематоксилином-эозином для выявления общей морфологии.Animals were removed from the experiment for 10 days, 1 month, 3 months with deep ether anesthesia. The implants were removed, fixed in 4% paraformaldehyde prepared on phosphate buffer for 24 hours. Samples were washed with phosphate buffer and transferred to absolute ethanol through a series of aqueous ethanol solutions. Poured into paraffin according to standard methods. Cross sections were made with a thickness of 5 μm. Hematoxylin-eosin stained for general morphology.
В течение всего срока эксперимента не было отмечено ухудшения состояния животных. Ни одно животное не погибло. В области имплантации не наблюдали макроскопических признаков воспаления - покраснения, отека.Throughout the duration of the experiment, there was no deterioration in the condition of the animals. Not a single animal has died. In the area of implantation, no macroscopic signs of inflammation were observed - redness, swelling.
Через 10 дней после имплантации были выявлены существенные различия в морфологии имплантатов из пектина и заявляемого матриксного материала. Пектиновый матрикс в значительной степени деградировал. В него проникли клетки, сформировали новую ткань, окружавшую островки еще недеградировавшего матрикса (Фиг. 2А, 2Б). Имплантат окружала капсула толщиной 99±18 мкм, состоявшая из фибробластов и синтезируемых ими коллагеновых волокон (Фиг. 2А). В этом слое фибробластов выявлялись многочисленные сосуды. Они являлись источником макрофагов, заселявших имплантат (Фиг. 2Б).10 days after implantation, significant differences were revealed in the morphology of pectin implants and the inventive matrix material. The pectin matrix has largely degraded. Cells penetrated into it, formed a new tissue surrounding the islands of the still non-degraded matrix (Fig. 2A, 2B). The implant was surrounded by a capsule 99 ± 18 μm thick, consisting of fibroblasts and the collagen fibers synthesized by them (Fig. 2A). Numerous vessels were detected in this layer of fibroblasts. They were the source of macrophages that populated the implant (Fig. 2B).
Разработанный матриксный материал деградировал в гораздо меньшей степени через 10 дней после имплантации (Фиг. 2В). В области имплантации сохранялась значительная часть имплантированного материала. Отчетливо выделялась центральная часть имплантата, не заселенная клетками. На периферии происходила активная инфильтрация имплантата клетками, в первую очередь фибробластами. Клетки заселяли имплантат не хаотично, а проникали в него друг за другом, образуя цепочки клеток, параллельные краю имплантата. Имплантат окружала рыхлая фиброзная капсула толщиной 104±10 мкм. Наблюдалась активная васкуляризация не только соединительной ткани, окружающей имплантат, но и самого матрикса (Фиг. 2Г). Через 10 дней после имплантации наблюдали процесс инфильтрации коллагенового имплантата нейтрофилами, макрофагами и фибробластами. При этом этот процесс шел неравномерно. В одних случаях (28%) в раннем периоде после имплантации коллагеновый имплантат был обильно инфильтрован клетками (фиг. 2Д), в других случаях (72%) не наблюдали значительной инфильтрации материала клетками, фрагмент коллагенового имплантата был окружен плотной фиброзной капсулой толщиной 48±12 мкм (фиг. 2Е). Через 1 месяц фрагменты коллагенового имплантата уже не выявлялись в области имплантации.The developed matrix material degraded to a much lesser extent 10 days after implantation (Fig. 2B). In the field of implantation, a significant part of the implanted material was preserved. The central part of the implant, not populated by cells, was clearly distinguished. Active implant infiltration by cells, primarily fibroblasts, occurred on the periphery. The cells did not populate the implant randomly, but penetrated into it one after another, forming chains of cells parallel to the edge of the implant. The implant was surrounded by a loose fibrous capsule 104 ± 10 μm thick. Active vascularization was observed not only of the connective tissue surrounding the implant, but also of the matrix itself (Fig. 2G). 10 days after implantation, the process of collagen implant infiltration by neutrophils, macrophages and fibroblasts was observed. Moreover, this process was uneven. In some cases (28%), in the early period after implantation, the collagen implant was abundantly infiltrated by cells (Fig. 2D), in other cases (72%), no significant infiltration of the material by cells was observed, a fragment of the collagen implant was surrounded by a dense fibrous capsule 48 ± 12 thick μm (Fig. 2E). After 1 month, fragments of the collagen implant were no longer detected in the area of implantation.
В области имплантации пектинового и разработанного матриксного материала клетки, ответственные за воспалительную реакцию, были немногочисленны. Выявлялись единичные лимфоциты, нейтрофилы не выявлялись. Очевидно, воспалительная реакция на собственно процесс имплантации к этому сроку уже завершилась. Имплантированные матриксы являлись иммуногически инертными и не вызывали существенной воспалительной реакции.In the area of implantation of pectin and developed matrix material, the cells responsible for the inflammatory response were few. Single lymphocytes were detected, neutrophils were not detected. Obviously, the inflammatory reaction to the implantation process itself has already been completed by this time. The implanted matrices were immunologically inert and did not cause a significant inflammatory reaction.
Через 1 месяц после имплантации пектиновый матрикс был в значительной степени резорбирован и замещен собственными тканями реципиента. На данном сроке наблюдали преобразование ткани, сформированной в области имплантации. Ткань приобретала сетчатый вид (Фиг. ЗА). Ячейки этой сетки местами сливались в полости, выстланные веретеновидными узкими клетками - фиброцитами. Внутри полостей присутствовали отростчатые клетки со слабоокрашенной цитоплазмой, округлым или овальным ядром - фибробласты. Фиброзная капсула уменьшилась, ее толщина составляла 32±12 мкм. Через 3 месяца ремоделированная зона имплантации уменьшилась в размере, при этом сохраняла ту же морфологию, что и на сроке 1 месяц (Фиг. 3Б). Фиброзная капсула, окружающая имплантат, полностью исчезла.1 month after implantation, the pectin matrix was substantially resorbed and replaced by the recipient's own tissues. At this time, the transformation of tissue formed in the implantation area was observed. The fabric acquired a mesh look (Fig. FOR). The cells of this grid merged in places in cavities lined with spindle-shaped narrow cells - fibrocytes. Inside the cavities there were process cells with a slightly stained cytoplasm, a round or oval nucleus - fibroblasts. The fibrous capsule decreased, its thickness was 32 ± 12 μm. After 3 months, the remodeled implantation zone decreased in size, while maintaining the same morphology as for 1 month (Fig. 3B). The fibrous capsule surrounding the implant has completely disappeared.
В разработанном матриксе через 1 месяц после имплантации количество клеток увеличилось, они равномерно заселили матрикс (Фиг. 3В, 3Г). Матриксный материал медленно деградировал, через 3 месяца его количество в области имплантации сократилось, но все еще оставалось существенным. Фибробласты, заселившие матрикс, ремоделировали имплантированный материал, изменяя его морфологию, в результате чего ткань, сформированная на месте имплантата, начала приобретать сетчатый вид (Фиг. 3Д). На фиг. 3Е представлена морфология области имплантации через 3 месяца на большем увеличении, на которой хорошо различимы фрагменты матриксного материала, окруженные клетками. Фиброзная капсула, окружавшая имплантат, уменьшилась. Ее толщина составляла 47±22 мкм.In the developed matrix, 1 month after implantation, the number of cells increased, they uniformly populated the matrix (Fig. 3B, 3G). The matrix material slowly degraded, after 3 months its quantity in the implantation area decreased, but still remained significant. The fibroblasts that populated the matrix remodeled the implanted material, changing its morphology, as a result of which the tissue formed at the site of the implant began to acquire a mesh appearance (Fig. 3D). In FIG. 3E shows the morphology of the implantation area after 3 months at a higher magnification, on which fragments of matrix material surrounded by cells are clearly distinguishable. The fibrous capsule surrounding the implant has decreased. Its thickness was 47 ± 22 μm.
Коллагеновая губка, имплантированная подкожно, была резорбирована в течение 2-4 недель. Через 1 месяц фрагменты коллагеновой губки уже не выявлялись в области имплантации. Через 10 дней после имплантации наблюдали процесс инфильтрации коллагеновой губки нейтрофилами, макрофагами и фибробластами. При этом этот процесс шел неравномерно. В одних случаях (28%) в раннем периоде после имплантации (10 дней) губка была обильно инфильтрована клетками (Фиг. 2В), в других случаях (72%) практически не наблюдали инфильтрации материала клетками, а фрагмент коллагеновой губки был окружен плотной фиброзной капсулой толщиной 48±12 мкм (Фиг. 2Д).The collagen sponge implanted subcutaneously was resorbed within 2-4 weeks. After 1 month, fragments of the collagen sponge were no longer detected in the area of implantation. 10 days after implantation, the process of collagen sponge infiltration by neutrophils, macrophages and fibroblasts was observed. Moreover, this process was uneven. In some cases (28%), in the early period after implantation (10 days), the sponge was abundantly infiltrated by cells (Fig. 2B), in other cases (72%) there was practically no cell infiltration of the material, and a fragment of the collagen sponge was surrounded by a dense fibrous capsule 48 ± 12 μm thick (Fig. 2D).
Из представленных результатов следует, что заявляемый матриксный материал, получаемый разработанными способами, обладает низкой скоростью биодеградации в организме млекопитающих, является биосовместимым и не токсичным in vivo.From the presented results it follows that the inventive matrix material obtained by the developed methods has a low biodegradation rate in the mammalian organism, is biocompatible and non-toxic in vivo.
Для итоговой оценки работоспособности заявляемых изобретений был проведен эксперимент, в ходе которого образцы матриксного материала, полученные по примеру 1, имплантировали в область травматического повреждения спинного мозга крыс. В качестве контроля одной группе животных имплантировали материал, сформированный из пектина, а другой группе проводили имплантацию стерильной коллагеновой губки.For a final assessment of the health of the claimed inventions, an experiment was conducted in which samples of the matrix material obtained in Example 1 were implanted in the area of traumatic damage to the spinal cord of rats. As a control, one group of animals was implanted with material formed from pectin, and a sterile collagen sponge was implanted in the other group.
Модель острой травмы спинного мозга создавали путем удаления фрагмента спинного мозга длинной 2 мм на уровне 12 грудного - 1 поясничного позвонка, согласно работам Вэрли (Woerly S., Pinet Е., De Robertis L. et al. Heterogeneous PHPMA hydrogels for tissue repair and axonal regeneration in the injured spinal cord // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 1998. Vol. 9. P. 681-711; Woerly S., Doan D., Sosa N. et al. Reconstruction of the transected cat spinal cord follow-ing NeuroGel™ implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructural studies // International Jornal of Developmental Neuroscience. 2001. Vol.19. P. 63-83).A model of acute spinal cord injury was created by removing a 2 mm long fragment of the spinal cord at the level of 12 thoracic - 1 lumbar vertebra, according to Werley S., Pinet E., De Robertis L. et al. Heterogeneous PHPMA hydrogels for tissue repair and axonal regeneration in the injured spinal cord // Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 1998. Vol. 9. P. 681-711; Woerly S., Doan D., Sosa N. et al. Reconstruction of the transected cat spinal cord follow -ing NeuroGel ™ implantation: axonal tracing, immunohistochemical and ultrastructural studies // International Jornal of Developmental Neuroscience. 2001. Vol.19. P. 63-83).
Анестезию осуществляли ингаляцией медицинского эфира. Волосяной покров на спине животного обрабатывали антисептическим раствором. Выбривали операционное поле. Зону операционного поля обрабатывали 70% этиловым спиртом.Anesthesia was performed by inhalation of medical ether. The hair on the back of the animal was treated with an antiseptic solution. They shaved the surgical field. The area of the surgical field was treated with 70% ethyl alcohol.
Кожу рассекали по спине, продольно, над позвоночником от 9 грудного до 3 поясничного позвонков. Подкожные фасции отделяли ножницами по уровню кожного разреза. С двух сторон от остистого отростка 12 грудного позвонка (Т12), вплотную к нему, выполняли 2 параллельных разреза длиной приблизительно 15 мм, отделяя мышцы от поверхности позвонка.The skin was dissected along the back, longitudinally, above the spine from 9 thoracic to 3 lumbar vertebrae. The subcutaneous fascia was separated with scissors at the level of the skin incision. On two sides of the spinous process of the 12 thoracic vertebra (T12), close to it, 2 parallel incisions were made, approximately 15 mm long, separating the muscles from the surface of the vertebra.
Проводили ламинэктомию на уровне 12 грудного позвонка, открывая прямой доступ к спинному мозгу. Спинной мозг пересекали одноразовым лезвием скальпеля. Кровотечение останавливали гемостатической коллагеновой губкой (ОАО Лужский завод "БЕЛКОЗИН"). После остановки кровотечения отсекали фрагмент спинного мозга длиной приблизительно 2 мм.A laminectomy was performed at the level of the 12 thoracic vertebra, providing direct access to the spinal cord. The spinal cord was crossed with a disposable scalpel blade. Bleeding was stopped by a hemostatic collagen sponge (OAO Luga Plant BELKOZIN). After stopping the bleeding, a fragment of the spinal cord was cut off with a length of approximately 2 mm.
После полного гемостаза образовавшийся дефект спинного мозга в первой контрольной группе заполняли коллагеновой губкой. Во второй контрольной группе дефект заполняли пектиновым гелем, в экспериментальной группе - заявляемым матриксным материалом. Имплантат изолировали коллагеновой мембраной. После чего рану послойно ушивали.After complete hemostasis, the resulting spinal cord defect in the first control group was filled with a collagen sponge. In the second control group, the defect was filled with pectin gel, in the experimental group - with the claimed matrix material. The implant was isolated with a collagen membrane. After that, the wound was sutured in layers.
В течение трех дней после операции проводили курс антибактериальной терапии: 100 мкл 5% цефтриоксона внутрибрюшинно 2 раза в день. Осмотр оперированных животных проводили ежедневно в течение 3 месяцев до окончания эксперимента. Мочу спускали дважды в день. Трофические нарушения оценивали по общему виду крыс, потере массы тела, состоянию волосяного покрова, наличию трофических язв, пролежней.Within three days after the operation, a course of antibacterial therapy was carried out: 100 μl of 5
Животных выводили из эксперимента на сроках 10 дней, 1 месяц, 3 месяца глубоким эфирным наркозом.Animals were removed from the experiment for 10 days, 1 month, 3 months with deep ether anesthesia.
Из всех прооперированных крыс 17 животных составляли первую контрольную группу - «Коллагеновая губка». Во вторую контрольную группу - группа «Пектиновый гель» - входили 7 животных. Экспериментальная группа - группа «Матриксный материал» - включала 19 животных.Of all the rats operated, 17 animals made up the first control group - Collagen Sponge. The second control group - the group "Pectin gel" - included 7 animals. The experimental group - the matrix material group - included 19 animals.
Результаты имплантации трех типов биополимерных матриксов в область дефекта спинного мозга крыс выявили существенные различия между исследуемыми группами.The results of implantation of three types of biopolymer matrices into the spinal cord defect region of rats revealed significant differences between the studied groups.
Магниторезонансные томограммы спинного мозга крыс на 4 день после операции показали, что в первой контрольной группе, дефект в которой заполняли коллагеновой губкой, область травмы характеризовалась сильным отеком (Фиг. 4А). Эффект развития отека в группе «Матриксный материал» был выражен существенно меньше (Фиг. 4Б).Magnetic resonance imaging tomography of rat spinal cord on day 4 after surgery showed that in the first control group, the defect in which was filled with a collagen sponge, the area of injury was characterized by severe edema (Fig. 4A). The effect of the development of edema in the "Matrix material" group was expressed significantly less (Fig. 4B).
Анализ двигательной активности животных проводили на основе видеозаписей, по три кадра из которых для каждой группы представлены на Фиг. 5. В первой контрольной группе у половины животных (55,5%) в течение всего периода наблюдения сохранялась параплегия задних конечностей. Начиная с 14 сут после операции регистрировали лишь слабые движения в тазобедренных суставах, дальнейшего улучшения не происходило (Фиг. 5А). У остальных животных произошло восстановление двигательных функций, которое достигло максимума на сроке 8 недель после операции и в среднем составляло 4,3 балла по шкале оценки локомоторной активности «ВВВ». У 42,8% животных наблюдали гипертонус одной из конечностей. Более чем у половины животных наблюдали явления аутотомии - животные отгрызали задние конечности или хвост, что представлено на Фиг. 6, где показан внешний вид задних конечностей крыс из первой контрольной группы (А), второй контрольной группы - «Пектиновый гель» (Б) и группы «Матриксный материал» (В) на 60 день после сегментэктомии спинного мозга. Для животных из группы «Матриксный материал» был отмечен нормальный вид задних конечностей (фиг. 6В).Analysis of the motor activity of animals was carried out on the basis of video recordings, three frames of which for each group are presented in FIG. 5. In the first control group, half of the animals (55.5%) retained hind limb paraplegia during the entire observation period. Starting at 14 days after the operation, only weak movements in the hip joints were recorded, further improvement did not occur (Fig. 5A). The rest of the animals had a restoration of their motor functions, which reached a maximum of 8 weeks after surgery and averaged 4.3 points on the BBB locomotor activity rating scale. In 42.8% of the animals hypertension of one of the limbs was observed. Autotomy phenomena were observed in more than half of the animals — the animals gnawed off their hind limbs or tail, as shown in FIG. 6, which shows the appearance of the hind limbs of rats from the first control group (A), the second control group - “Pectin gel” (B) and the group “Matrix material” (C) on the 60th day after the spinal cord segmentectomy. For animals from the Matrix Material group, a normal view of the hind limbs was noted (Fig. 6B).
В группе «Пектиновый гель» не наблюдали восстановления двигательной активности экспериментальных животных (Фиг. 5Б). У животных наблюдали лишь слабые движения в тазобедренных суставах (1-2 балла по шкале «ВВВ»). Отличительной чертой данной группы было отсутствие выраженных явлений аутотомии и гипертонуса (фиг. 6Б).In the group "Pectin gel" did not observe the restoration of motor activity of experimental animals (Fig. 5B). Only weak movements in the hip joints were observed in animals (1-2 points on the BBB scale). A distinctive feature of this group was the absence of pronounced phenomena of autotomy and hypertonicity (Fig. 6B).
В группе «Матриксный материал» наблюдали довольно сильный разброс данных по таким показателям как восстановление двигательной активности, явления аутотомии и гипертонуса. У 1 крысы не было восстановления двигательной активности вплоть до конца эксперимента, но 1 задняя конечность при этом двигалась сразу после операции. Возможно, наличие одной рабочей задней конечности препятствовало физиологическому восстановлению второй конечности. Еще у 2 крыс тоже не было восстановления, но их вывели из эксперимента на сроке 10 дней, поэтому их дальнейшая судьба не известна. Хотя в целом у остальных животных этой группы на этом сроке двигательная активность оценивается от 1 до 6 баллов - от движений в тазобедренных суставах до активных движений в тазобедренных, коленных и голеностопных суставах.In the "Matrix Material" group, a rather strong scatter of data was observed for such indicators as restoration of motor activity, autotomy, and hypertonicity. In 1 rat, there was no restoration of motor activity until the end of the experiment, but 1 hind limb was moving immediately after the operation. Perhaps the presence of one working hind limb impeded the physiological recovery of the second limb. Another 2 rats also did not have recovery, but they were taken out of the experiment for a period of 10 days, so their further fate is not known. Although in general in other animals of this group at this time, motor activity is estimated from 1 to 6 points - from movements in the hip joints to active movements in the hip, knee and ankle joints.
Через три месяца после операции у крыс из экспериментальной группы «Матриксный материал» отмечали дальнейшее улучшение двигательной активности задних конечностей. В этой группе наблюдали крыс, способных к самостоятельному передвижению с использованием обеих задних конечностей и периодической координацией их с передними. У одной крысы восстановилась двигательная активность только в одной задней конечности. У некоторых крыс обе задние конечности сохраняли физиологическое положение и использовались для ходьбы, хотя при этом вес не удерживался подошвенными поверхностями лап. В целом восстановление двигательной активности задних конечностей крыс из экспериментальной группы «Матриксный материал» варьировало от 5 до 15 баллов по шкале «ВВВ» через три месяца после имплантации. Максимальное восстановление двигательной активности животных в 15 баллов соответствовало стабильной подошвенной ходьбе и координации между передними и задними конечностями (Фиг. 5В).Three months after the operation, rats from the experimental group “Matrix material” noted a further improvement in the motor activity of the hind limbs. In this group, rats capable of independent movement using both hind limbs and their periodic coordination with the front were observed. In one rat, motor activity was restored in only one hind limb. In some rats, both hind limbs maintained their physiological position and were used for walking, although the weight was not maintained by the plantar surfaces of the paws. In general, the restoration of the motor activity of the hind limbs of rats from the “Matrix material” experimental group ranged from 5 to 15 points on the “BBB” scale three months after implantation. The maximum recovery of motor activity of animals in 15 points corresponded to stable plantar walking and coordination between the front and rear limbs (Fig. 5B).
Гистологический анализ спинного мозга крыс, подвергнутых сегментэктомии и последующей реконструктивной терапии, выявил следующие особенности в группах.Histological analysis of the spinal cord of rats subjected to segmentectomy and subsequent reconstructive therapy revealed the following features in the groups.
Были проанализированы гистологические препараты спинного мозга крыс из групп «Коллагеновая губка» и «Матриксный материал», выведенных из эксперимента в раннем послеоперационном периоде (10 дней после сегментэктомии и реконструктивной терапии).The histological preparations of the spinal cord of rats from the groups “Collagen Sponge” and “Matrix Material” that were withdrawn from the experiment in the early postoperative period (10 days after segmentectomy and reconstructive therapy) were analyzed.
В группе «Коллагеновая губка» в области травмы спинного мозга наблюдали экспериментально созданную полость, заполненную коллагеновой губкой. Внутри губки в некоторых местах отмечали скопления эритроцитов и лимфоцитов. Не наблюдалось массивной инфильтрации имплантата клетками реципиента. Губка не способствовала консолидации рострального и каудального фрагментов мозга, разобщенных травмой.In the Collagen Sponge group, in the area of spinal cord injury, an experimentally created cavity filled with a collagen sponge was observed. Inside the sponge, in some places, accumulations of red blood cells and lymphocytes were noted. No massive infiltration of the implant by the recipient cells was observed. The sponge did not contribute to the consolidation of the rostral and caudal fragments of the brain, separated by trauma.
В группе «Матриксный материал» на этом же сроке отмечалось восстановление физической целостности спинного мозга путем консолидации с помощью материала рострального и каудального фрагментов. Часть рубца, прилежащая к ростральному участку мозга, представлена гомогенным рыхлым соединительнотканным рубцом, в котором почти не выявляются остатки геля.In the Matrix Material group, at the same time, the restoration of the physical integrity of the spinal cord through consolidation of the rostral and caudal fragments using the material was noted. The part of the scar adjacent to the rostral part of the brain is represented by a homogeneous loose connective tissue scar, in which the remains of the gel are almost not detected.
Центральную область рубца заполняют многочисленные фрагменты геля, разобщенные тяжами ткани, в которых в том числе выявляются новые сосуды. При иммуноцитохимическом маркировании нейрональных структур антителами против β-III-тубулина интенсивно окрашивается ростральная и каудальная части мозга. В области рубца выявляются единичные нервные волокна.The central region of the scar is filled with numerous fragments of the gel, separated by strands of tissue, in which new vessels are also revealed. During immunocytochemical labeling of neuronal structures with antibodies against β-III-tubulin, the rostral and caudal parts of the brain are intensively stained. In the area of the scar, single nerve fibers are detected.
В сером веществе спинного мозга в областях, прилежащих к области травмы, наблюдается гибель нейронов, особенно выраженную в каудальной части в контрольной группе. В группе «Матриксный материал» несмотря на деструктивные процессы серое вещество в каудальной части находится в более сохранной форме.In the gray matter of the spinal cord in the areas adjacent to the area of injury, neuron death is observed, especially pronounced in the caudal part in the control group. In the “Matrix material” group, despite the destructive processes, the gray matter in the caudal part is in a more preserved form.
Были проанализированы гистологические препараты спинного мозга крыс из группы «Матриксный материал» через 1 месяц после операции. Наблюдали морфологическую картину строения тканей рубца и прилежащих тканей спинного мозга, отличную от контрольной группы. У животных данной группы формировался рыхлый рубец, в котором выявлялись нейрональные структуры, маркируемые антителами против β-III-тубулина. Астроцитарная реакция на границе ростральной сохранной части мозга и рубца была слабая, не наблюдалось плотной сети астроцитов и их отростков, которой обычно отводится важная роль в блокировании регенерирующих аксонов. Астроциты в рубце не выявлялись.The histological preparations of the spinal cord of rats from the Matrix Material group were analyzed 1 month after surgery. A morphological picture of the structure of the tissues of the rumen and adjacent tissues of the spinal cord was observed, which is different from the control group. In animals of this group, a friable scar was formed in which neuronal structures marked with antibodies against β-III-tubulin were detected. The astrocytic reaction at the border of the rostral intact part of the brain and the scar was weak, there was no dense network of astrocytes and their processes, which usually plays an important role in blocking regenerating axons. Astrocytes in the rumen were not detected.
Через 3 месяца после операции в группе «Матриксный материал» наиболее типичная картина строения спинного мозга экспериментальных животных была следующей. Выявили выраженную консолидацию рострального и каудального фрагментов (Фиг. 7). В области травмы все еще выявлялись многочисленные фрагменты геля, разделенные тяжами ткани, в которых методом иммуногистохимии обнаруживались нейрональные структуры. На Фиг. 7А представлена гистологическая картина в области травматического повреждения и имплантации, выявляемая рутинным общеморфологическим окрашиванием срезов гематоксилином и эозином. Фиг. 7Б демонстрирует результат выявления нейрональных структур методом непрямого иммуногистохимического маркирования антителами против β-III-тубулина и получения изображения с помощью эпифлуоресцентной микроскопии. Область рубца была подробно изучена методом конфокальной лазерной микроскопии, которая подтвердила наличие значительного числа нейрональных структур (НС), прорастающих в имплантат (Фиг. 7В). На Фиг. 7 В видно, что отростки нейронов проникали непосредственно в гель, что подтверждает, что этот матриксный материал поддерживает регенерацию нервных проводников. В области рубца были видны макрофаги, что свидетельствует о продолжающемся процессе биодеградации имплантата (Фиг. 7Г).3 months after the operation in the Matrix Material group, the most typical picture of the structure of the spinal cord of experimental animals was as follows. The expressed consolidation of the rostral and caudal fragments was revealed (Fig. 7). In the area of the injury, numerous fragments of the gel were still detected, separated by strands of tissue in which neuronal structures were detected by immunohistochemistry. In FIG. 7A shows a histological picture in the area of traumatic injury and implantation, revealed by routine general morphological staining of sections with hematoxylin and eosin. FIG. 7B shows the result of detecting neuronal structures by indirect immunohistochemical labeling with anti-β-III-tubulin antibodies and imaging using epifluorescence microscopy. The area of the scar was studied in detail by confocal laser microscopy, which confirmed the presence of a significant number of neuronal structures (NS), germinating in the implant (Fig. 7B). In FIG. 7B shows that the processes of neurons penetrated directly into the gel, which confirms that this matrix material supports the regeneration of nerve conductors. Macrophages were visible in the scar region, indicating an ongoing implant biodegradation process (Fig. 7G).
В контрольной группе строение спинного мозга на сроке 3 месяца после операции также было неоднородным среди различных животных. Одним из распространенных вариантов - очевидно, самым неблагоприятным - стало формирование в области травмы посттравматической капсулы, которая препятствовала регенерации нервных волокон (Фиг. 8А). Некоторое количество нервных волокон прорастали по периферии, огибая капсулу, но они не были способны эффективно преодолеть этот барьер (Фиг. 8Б). Капсула состояла из значительного числа клеток, что подтверждалось окраской гистологических препаратов с помощью DAPI (Фиг. 8В). Внутреннее содержимое капсулы представлено также отчасти клетками и неклеточным содержимым. В другом случае в такой же капсуле отчетливо выявлялись полиморфноядерные нейтрофилы. Вероятно, капсула образовалась в результате слишком сильного воспалительного процесса и массивной инфильтрации лейкоцитов.In the control group, the structure of the spinal cord for a period of 3 months after surgery was also heterogeneous among various animals. One of the common options - obviously the most unfavorable - was the formation of a post-traumatic capsule in the area of injury, which prevented the regeneration of nerve fibers (Fig. 8A). A certain number of nerve fibers sprouted along the periphery, circling the capsule, but they were not able to effectively overcome this barrier (Fig. 8B). The capsule consisted of a significant number of cells, as evidenced by the staining of histological preparations using DAPI (Fig. 8B). The internal contents of the capsule are also represented in part by cells and non-cellular contents. In another case, polymorphonuclear neutrophils were distinctly detected in the same capsule. Probably, the capsule was formed as a result of too strong an inflammatory process and massive leukocyte infiltration.
В других случаях у животных наблюдали формирование слишком плотного рубца. На границе спинного мозга и рубца продолжается дегенеративный процесс, сопровождающийся формированием патологических полостей. В этой области наблюдаются многочисленные макрофаги. Фрагментов имплантированного матрикса на этом сроке не выявляется, а сами ткани рубца представляют собой очень плотно упакованные коллагеновые волокна, ориентированные в поперечном направлении, что выявлялось специфической окраской с помощью пикросириуса красного. Очевидно, аксоны были не способны преодолеть такой барьер. Плотность астроцитов на границе сохранной ткани спинного мозга и рубца повышена, по сравнению с тканью спинного мозга в норме, а также с областью имплантации матриксного геля в описанной выше экспериментальной группе. В дистальной части рубца нервные клетки и их отростки не выявляются. В контрольной группе были также животные, демонстрировавшие некоторое восстановление двигательной активности задних конечностей, которое в целом было ниже, чем в группе «Матриксный материал».In other cases, the formation of an overly dense scar was observed in animals. At the border of the spinal cord and the scar, a degenerative process continues, accompanied by the formation of pathological cavities. Numerous macrophages are observed in this area. No fragments of the implanted matrix were detected at this time, and the scar tissues themselves are very tightly packed collagen fibers oriented in the transverse direction, which was revealed by a specific color using red picrosirius. Obviously, axons were not able to overcome such a barrier. The density of astrocytes at the border of the preserved tissue of the spinal cord and scar is increased, compared with normal tissue of the spinal cord, as well as with the area of implantation of the matrix gel in the experimental group described above. In the distal part of the scar, nerve cells and their processes are not detected. In the control group there were also animals that showed some restoration of motor activity of the hind limbs, which was generally lower than in the "Matrix material" group.
В результате проведенного исследования удалось установить, что заявляемые изобретения, позволяют создать имплантируемый матриксный материал, обладающий не только биосовместимостью, продемонстрированной в экспериментах in vitro и in vivo при подкожной имплантации, но и обеспечивающей регенерацию поврежденного мозга, стимулируя частичное восстановление нервных проводников и препятствует образованию плотных структур рубца, который является непреодолимым барьером при нейрорегенерации.As a result of the study, it was possible to establish that the claimed inventions make it possible to create an implantable matrix material with not only biocompatibility demonstrated in experiments in vitro and in vivo with subcutaneous implantation, but also providing regeneration of the damaged brain, stimulating partial restoration of nerve conductors and preventing the formation of dense structures of the scar, which is an insurmountable barrier in neuroregeneration.
Представленные выше результаты подтверждают, что создан композиционный матриксный материал для нужд регенеративной медицины и тканевой биоинженерии, обладающий следующими преимуществами.The above results confirm that a composite matrix material has been created for the needs of regenerative medicine and tissue bioengineering, which has the following advantages.
1. Материал является биосовместимым и слабо иммуногенным, что наиболее выгодно отличает его от известных материалов на основе хитина и хитозана, для которых характерны достаточно выраженные иммунные реакции несмотря на ряд сходных физико-химических и функциональных свойств.1. The material is biocompatible and weakly immunogenic, which distinguishes it most favorably from the known materials based on chitin and chitosan, which are characterized by fairly pronounced immune reactions despite a number of similar physicochemical and functional properties.
2. Материал способен эффективно обеспечивать процессы регенерации тканей, в частности при имплантации в область травматического повреждения спинного мозга лабораторных животных (крыс) он способствует восстановлению локомоторных функций крыс до 8,5±3,3 баллов по шкале «ВВВ», что существенно выше, чем при использовании всех указанных аналогов.2. The material is able to efficiently provide tissue regeneration processes, in particular when implanting laboratory animals (rats) into the area of traumatic damage to the spinal cord of the laboratory animals (rats), it helps to restore locomotor functions of rats to 8.5 ± 3.3 points on the BBB scale, which is significantly higher than using all of these analogues.
3. Материал обладает свойством медленной биодеградации, обеспеченной сочетанием в составе композиционного матрикса модифицированного растительного полисахарида (пектина со степенью этерификации до 50%) и белков внеклеточного матрикса, что способствует сохранению имплантированного материала в организме млекопитающих в течение нескольких месяцев. Такая скорость биодеградации соизмерима с медленной регенерацией тканей мозга и потому обеспечивает эффективный репарационный процесс. В этом отношении материал обладает преимуществом по сравнению с таковыми на основе коллагенов, а также гиалуроновой кислоты и ее производных, которые деградируют в организме млекопитающих в течение 1 месяца, при том что репарационный процесс требует периода в несколько месяцев.3. The material has the property of slow biodegradation, provided by the combination of a modified plant polysaccharide (pectin with an esterification degree of up to 50%) and extracellular matrix proteins in the composition of the composite matrix, which contributes to the preservation of the implanted material in the body of mammals for several months. This rate of biodegradation is commensurate with the slow regeneration of brain tissue and therefore provides an effective repair process. In this regard, the material has an advantage over those based on collagen, as well as hyaluronic acid and its derivatives, which are degraded in the body of mammals within 1 month, while the repair process requires a period of several months.
4. Разработанный матрикс обладает способностью ограничивать формирование плотных структур рубца и цист с плотной оболочкой, которые возникают при естественном репарационном процессе после травматического повреждения мозга за счет миграции и адгезии клеток нейроглии и соединительной ткани. Структуры формирующегося рубца хотя и способствуют восстановлению целостности мозга, тем не менее формируют непреодолимый барьер для роста и регенерации отростков нервных клеток. Данное свойство, характерное для разработанного матрикса, является преимуществом по сравнению с чисто белковыми матриксами (на основе исключительно коллагенов, ламинина, фибронектина), которые в силу очень высоких адгезионных свойств для клеток нейроглии и соединительной ткани являются причиной формирования более плотной структуры рубца и могут создавать препятствия для регенерации аксонов.4. The developed matrix has the ability to limit the formation of dense structures of the scar and cysts with a dense membrane that occur during the natural repair process after traumatic brain damage due to migration and adhesion of neuroglia and connective tissue cells. Although the structures of the forming scar contribute to the restoration of brain integrity, they nevertheless form an insurmountable barrier to the growth and regeneration of nerve cell processes. This property, characteristic of the developed matrix, is an advantage over pure protein matrices (based solely on collagen, laminin, fibronectin), which, due to the very high adhesive properties for neuroglia and connective tissue cells, cause the formation of a denser scar structure and can create obstacles to axon regeneration.
5. Разработанный матриксный материал и способы его получения предусматривают такую схему формирования материала из отдельных компонентов, при которой процесс формирования структур гидрогеля требует исключительно физиологических условий среды и дополнительных инициирующих гелеобразование компонентов, не являющихся токсичными и применяемыми в физиологических концентрациях. Сам процесс формирования материала в виде композиционного гидрогеля протекает при 37°С, что делает возможным окончательное формирование материала внутри организма реципиента, что таким образом позволяет специалисту имплантировать не только предформированные изделия на основе композиционного материала (полученные путем преформинга), но и использовать инъекционную форму введения материала с постформингом внутри организма реципиента. Это может быть удобным при реконструкции небольших повреждений тканей или при отсутствии открытого операционного поля, доступного для хирургических манипуляций.5. The developed matrix material and methods for its preparation provide such a scheme for the formation of material from individual components, in which the process of formation of hydrogel structures requires exclusively physiological environmental conditions and additional components initiating gelation, which are not toxic and are used in physiological concentrations. The process of forming a material in the form of a composite hydrogel proceeds at 37 ° C, which makes possible the final formation of the material inside the recipient’s body, which thus allows the specialist to implant not only preformed products based on the composite material (obtained by preforming), but also to use the injection form of administration postforming material within the recipient’s body. This can be convenient when reconstructing minor tissue injuries or in the absence of an open surgical field available for surgical procedures.
6. По сравнению с большинством аналогов материал обладает высокими иммобилизационными свойствами в отношении биогенных и ксеногенных субстанций различной химической структуры. За счет использования пектинов с низкой степенью этерификации формируются в процессе гелеобразования упорядоченные ячеистые структуры типа «egg-box» («коробки для яиц»). Такие структуры обладают свойством привлечения в ячеистую структуру различных субстанций. Это свойство пектинового компонента позволяет эффективно иммобилизовать другие компоненты материала.6. Compared with most analogues, the material has high immobilization properties in relation to biogenic and xenogenic substances of various chemical structures. Due to the use of pectins with a low degree of esterification, ordered cellular structures of the “egg-box” type (“egg boxes”) are formed during gelation. Such structures have the property of attracting various substances into the cellular structure. This property of the pectin component allows you to effectively immobilize other components of the material.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147902/05A RU2597085C2 (en) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | Implanted matrix material for regenerative medicine and method of its production (versions) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013147902/05A RU2597085C2 (en) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | Implanted matrix material for regenerative medicine and method of its production (versions) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013147902A RU2013147902A (en) | 2015-05-20 |
| RU2597085C2 true RU2597085C2 (en) | 2016-09-10 |
Family
ID=53283533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013147902/05A RU2597085C2 (en) | 2013-11-07 | 2013-11-07 | Implanted matrix material for regenerative medicine and method of its production (versions) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2597085C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786443C1 (en) * | 2022-04-05 | 2022-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Biodegradable 3d matrix for healing skin defects based on composite polycaprolactone |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188206C2 (en) * | 1998-04-10 | 2002-08-27 | Октафарма Аг | Method of sterilization of native collagen in liquid medium, prepared sterile native collagen, composition comprising thereof and their using |
| RU2249462C1 (en) * | 2003-08-21 | 2005-04-10 | Севастьянов Виктор Иванович | Multi-purpose heterogeneous collagen matrix applied for implantation and method for its obtaining |
| RU2321597C2 (en) * | 2002-04-19 | 2008-04-10 | Новартис Аг | Biomaterial, method for its preparing and its using, medicinal agent, implant and insert |
| RU2392287C2 (en) * | 2003-06-06 | 2010-06-20 | Хьюманотоселл Гмбх | Matrix, cellular implant and methods of obtainment and application thereof |
-
2013
- 2013-11-07 RU RU2013147902/05A patent/RU2597085C2/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2188206C2 (en) * | 1998-04-10 | 2002-08-27 | Октафарма Аг | Method of sterilization of native collagen in liquid medium, prepared sterile native collagen, composition comprising thereof and their using |
| RU2321597C2 (en) * | 2002-04-19 | 2008-04-10 | Новартис Аг | Biomaterial, method for its preparing and its using, medicinal agent, implant and insert |
| RU2392287C2 (en) * | 2003-06-06 | 2010-06-20 | Хьюманотоселл Гмбх | Matrix, cellular implant and methods of obtainment and application thereof |
| RU2249462C1 (en) * | 2003-08-21 | 2005-04-10 | Севастьянов Виктор Иванович | Multi-purpose heterogeneous collagen matrix applied for implantation and method for its obtaining |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Pegeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel //Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894. * |
| Suzuki K., Suzuki Y., Ohnishi K. et al. Pegeneration of transected spinal cord in young adult rats using freeze-dried alginate gel //Neuroreport. 1999. Vol.10. P. 2891-2894. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2786443C1 (en) * | 2022-04-05 | 2022-12-21 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Курский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Biodegradable 3d matrix for healing skin defects based on composite polycaprolactone |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013147902A (en) | 2015-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2672495C (en) | Novel injectable chitosan mixtures forming hydrogels | |
| Gnavi et al. | The use of chitosan-based scaffolds to enhance regeneration in the nervous system | |
| CN101366978B (en) | Fine particle tissue filling material for injection and preparation method thereof | |
| JP3634748B2 (en) | Temperature-controlled pH-dependent formation of ionic polysaccharide gels | |
| CN107224617B (en) | Hydrogel taking spleen extracellular matrix as raw material and preparation method thereof | |
| Xu et al. | Sustainable release of nerve growth factor for peripheral nerve regeneration using nerve conduits laden with Bioconjugated hyaluronic acid-chitosan hydrogel | |
| EP2273997B1 (en) | Method and composition for regenerating tissue with the aid of stem or bone marrow cells | |
| El Blidi et al. | Extraction methods, characterization and biomedical applications of collagen: A review | |
| KR20140100469A (en) | Threads of cross-linked hyaluronic acid and methods of use thereof | |
| AU2009266859A1 (en) | Compositions and methods for tissue filling and regeneration | |
| US20210393396A1 (en) | Dermal layer for grafting having improved graft survival rate and method for producing same | |
| CN1800372A (en) | Engineered extracellular matrix preparation method | |
| Si et al. | Control‑released basic fibroblast growth factor‑loaded poly‑lactic‑co‑glycolic acid microspheres promote sciatic nerve regeneration in rats | |
| Ramakrishnan et al. | Silk fibroin-based bioengineered scaffold for enabling hemostasis and skin regeneration of critical-size full-thickness heat-induced burn wounds | |
| Estrada et al. | Neural ECM mimetics | |
| Katiyar et al. | Novel strategies for designing regenerative skin products for accelerated wound healing | |
| KR101710639B1 (en) | Filler composition comprising nucleic acid, chitosan and hyaluronic acid for tissue augmentation and process for producing the same | |
| RU2597085C2 (en) | Implanted matrix material for regenerative medicine and method of its production (versions) | |
| KR20190096946A (en) | New Compositions Active on Adipose Cells | |
| RU2433828C1 (en) | Injection heterogenic biopolymer hydrogel for substitutional and regenerative surgery and method of its obtaining | |
| RU2695066C1 (en) | Method of treating traumatic liver fractures using a film coating based on bacterial cellulose | |
| RU2563992C2 (en) | Composite matrices based on silk fibroin, gelatine and hydroxyapatite for bone tissue regeneration | |
| CN108853595A (en) | A kind of preparation method of the crosslinking sodium hyaluronate microballoon of calcium phosphate modification | |
| KR20190012589A (en) | Gellan-gum Hydrogels Composition containing Chondroitin Sulfate | |
| KR102210056B1 (en) | Gellan gum hydrogel composition comprising demineralized bone powder of Ogolyge and use of the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20180627 |