RU2562857C1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCL2h-1I1G, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛЕГКОЙ ЦЕПИ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCH2g-1I1G, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-18, И РЕКОМБИНАНТНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА fh1I1G, ОБЛАДАЮЩЕЕ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ИНТЕРЛЕЙКИН-18 - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии. Предложены рекомбинантные плазмидные ДНК pCL2h-1I1G и pCH2g-1I1G, обеспечивающие в эукариотических клетках синтез легкой и тяжелой цепей антитела человека fh1I1G, способное связывать интерлейкин-18; а также антитело, полученное из эукариотических клеток, трансфицированных такими рекомбинантными плазмидными ДНК. Данное изобретение позволяет получить антитело, способное связывать с интерлейкин-18 и обладающее свойствами выделенного полноразмерного антитела человека класса IgG1, что может найти применение в терапии. 3 н.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.

Description

Группа изобретений относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии и предназначено для получения в клетках млекопитающих рекомбинантного полноразмерного антитела человека класса IgG1, обладающего способностью специфически связывать интерлейкин-18.

Интерлейкин-18 является плейотропным провоспалительным цитокином. Он участвует в формировании врожденного и приобретенного иммунных ответов, играя важную роль в противоинфекционных и противоопухолевых защитных реакциях организма. Повышение концентрации интерлейкина-18 в организме сопровождает развитие ряда воспалительных и аутоиммунных патологий [1]. Поэтому блокирование его биологической активности является особенно привлекательной терапевтической мишенью.

Стратегии снижения уровня интерлейкина-18 включают в себя разработку как специфических, так и неспецифических ингибиторов активности этого цитокина [1]. К факторам, блокирующим его действие, относятся интерлейкин-18-связывающий белок, ингибиторы синтеза и высвобождения интерлейкина-18, а также специфические антитела к интерлейкину-18. Использование для терапии интерлейкин-18-связывающего белка затруднительно, так как его концентрация в сыворотке крови велика. Достаточно перспективным в медицине считается применение человеческих моноклональных антител. Известно, что их получение с помощью традиционной гибридомной технологии связано с определенными трудностями. Использование же сывороточных препаратов зачастую не удовлетворяет требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам. Альтернативным решением данной проблемы является конструирование моноклональных антител путем объединения вариабельных специфических доменов IgG человека, отобранных из комбинаторных фаговых библиотек антител человека, и константных доменов иммуноглобулина человека. К настоящему времени такие антитела сконструированы против ряда антигенов [2, 3, 4].

В литературе описаны моноклональные одноцепочечные антитела человека, полученные с помощью методов фагового дисплея из комбинаторных библиотек антител человека [5, 6]. Известны аналоги векторных плазмид, используемых для экспрессии полностью человеческих антител. К таким аналогам относятся плазмидные ДНК рСН37 и pCL37 (патент RU 2317330 С2, оп. 20.02.2008), предназначенные для экспрессии человеческого антитела против вируса осповакцины и плазмидные ДНКрСШ и pCLl (патент RU 2285043 С2, оп. 10.10.2006), предназначенные для экспрессии человеческого антитела против вируса Эбола.

Наиболее близкими аналогами к заявляемой группе изобретений -прототипом, являются: а) рекомбинантная плазмидная ДНК pCAG-hl8-108Н, полученная на базе экспрессирующего плазмидного вектора pCAG-Н, кодирующего константные домены IgG 1-типа человека, вставкой гена, кодирующего вариабельный домен тяжелой цепи моноклонального одноцепочечного антитела человека h 18-108, связывающего интерлейкин-18; б) рекомбинантная плазмидная ДНК pCAG-hl8-108L, полученная на

базе экспрессирующего плазмидного вектора pCAG-L, кодирующего константный домен каппа-типа, вставкой гена, кодирующего вариабельный домен легкой цепи моноклонального одноцепочечного антитела человека h18-108, связывающего интерлейкин-18; и рекомбинантное полноразмерное антитело человека класса IgG1 h18-108-IgG, обладающее способностью связывать интерлейкин-18, полученное из эукариотических клеток линии СНО, трансфицированных рекомбинантными плазмидами pCAG-h18-108H и pCAG-h18-108L [6].

Недостатком прототипа является ограниченный ассортимент плазмид, пригодных для синтеза целевого продукта, а также недостаточный выход целевого продукта, поскольку транзиентный синтез полноразмерного антитела человека класса IgG1 h18-108-IgG, обладающего способностью связывать интерлейкин-18, осуществляют в течение 48 часов, тогда как современные методы позволяют осуществлять транзиентный синтез в течение 72 часов и более, существенно увеличивая выход целевого продукта.

Задачей группы изобретений является получение двух полипептидов, включающих полноразмерные легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина человека, образующих в клетках млекопитающих антитело человека класса IgG1, способное связывать интерлейкин-18 человека.

Техническим результатом группы изобретений является получение рекомбинантных плазмид, обеспечивающих синтез в эукариотических клетках антитела человека класса IgG1, и получение полноразмерного антитела человека fh1I1G, способного специфически связывать интерлейкин-18.

Указанный результат достигается путем конструирования двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых, pCL2h-1I1G, кодирует синтез полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного моноклонального антитела человека, другая, pCH2g-1I1G, - кодирует синтез полипептида со свойствами тяжелой цепи полноразмерного моноклонального антитела человека. Целевые плазмиды pCL2h-HlG и pCH2g-lHG получают встраиванием ДНК-фрагментов, кодирующих вариабельные домены антитела 1I1G, в кассетные векторные плазмиды pCL2h и pCH2g, которые кодируют лёгкую цепь каппа-типа и тяжёлую цепь изотипа IgGl антител человека [7].

Совместная трансфекция плазмидами pCL2h-HlG и pCH2g-lHG эукариотических клеток линии СНО-К1 обеспечивает синтез полипептида со свойствами полноразмерного антитела человека класса IgGl, способного связывать интерлейкин-18. Транзиентный биосинтез целевых полипептидов обеспечивается наличием в плазмидных ДНК pCL2h-HlG и pCH2g-111G цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования гена бычьего гормона роста.

Сущность группы изобретений заключается в следующем.

Генно-инженерными методами получают плазмиду pCL2h-lHG, несущую уникальный ген вариабельного домена легкой цепи антитела человека, направленного против интерлейкина-18, и плазмиду pCH2g-HlG, несущую уникальный ген вариабельного домена тяжелой цепи антитела человека, направленного против интерлейкина-18. Клетки СНО-К1, совместно трансфицированные плазмидами pCL2h-HlG и pCH2g-HlG, способны продуцировать полноразмерное антитело человека класса IgGl, способного связывать интерлейкин-18.

Исходным генетическим материалом для конструирования целевых плазмид служат следующие генно-инженерные исходные конструкции:

а) плазмидная ДНК pHEN2-lHG, содержащая ген вариабельныхдоменов тяжелой и легкой цепей моноклонального антитела 111 G противинтерлейкина-18 человека [5];

б)кассетная векторная плазмидная ДНК pCL2h, которая включает цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции, участок гена, кодирующий константный домен каппа-цепи иммуноглобулиновчеловека, ген β-лактамазы (blа), определяющий устойчивость

трансформированных плазмидой pCL2h клеток бактерий к ампициллину, и ген гигромицин фосфотрансферазы (hpt), обеспечивающий устойчивость к гигромицину В для селекции трансфицированных плазмидой pCL2h клеток млекопитающих; содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: EcoRV - 977, Hindi 11 - 1283

[7];

в) кассетная векторная плазмидная ДНК pCH2g, которая включает цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции, участок гена, кодирующий константную часть тяжёлой цепи иммуноглобулинов IgGl человека, ген β-лактамазы (blа), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCH2g клеток бактерий к ампициллину и ген устойчивости к неомицину (neo) для селекции трансфецированных плазмидой pCH2g клеток млекопитающих; содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: Xhol -999, Асс651 - 131 1 [7];

г) олигонуклеотидные праймеры для конструирования плазмидных
ДНК, содержащих гены легкой и тяжелой цепи антитела человека против
интерлейкина-18 (в направлении 5' - 3'):

1. VH_dir_XhoI 5 '-G AGGTGC AGCTGCTCG AGTCTGG-3 '

2. VH_rev_Acc65I 5'-GACGGTGACCAGGGTACCCTGGCC-3'

3. VL_dir_EcoRV 5 '-GGGATATCGTG ATG ACCC AGTCCCC-3 '

4. VL_rev_HindIII 5 '-CCGTTTG ATCTC AAGCTTGGTCCC-3 '.

Полученная в результате плазмида pCL2h-lHG, кодирующая синтез в

клетках млекопитающих полипептид со свойствами легкой цепи полноразмерного антитела человека, способного связывать интерлейкин-18, характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 3,85 МДа и размер 6232 п.н.;

модирует гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи моноклонального антитела человека 1I1G соединён с константным доменом каппа-цепи иммуноглобулинов человека;

состоит из следующих элементов:

а) EcoRV / Hindi 11 - векторного фрагмента штазмиды pCL2h размером 5924 п.н., содержащего промотор-энхансер цитомегаловируса, участок гена, кодирующий константный домен каппа-цепи иммуноглобулинов человека, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции гена бычьего гормона роста, ген β-лактамазы (blа), ген гигромицин
фосфотрансферазы (hpt);

б) EcoRV / HindlII - фрагмента плазмидной ДНК pHEN2-lHG размером 308 п.н., включающего искусственный ген, кодирующий полипептид со свойствами легкой цепи моноклонального антитела человека , способного связывать интерлейкин-18.

содержит:

а) цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции;

б) искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи моноклонального антитела человека 111G соединен с константным доменом каппа-цепи иммуноглобулинов человека;

в) в качестве генетических маркеров ген β-лактамазы (blа), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCL2h-HlG клеток бактерий к ампициллину, и ген гигромицин фосфотрансферазы (hpt), обеспечивающий устойчивость к гигромицину В для селекции трансфицированных плазмидой pCL2h-111G клеток млекопитающих;

г) уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: Nhel - 896, EcoRV - 980, HindlII - 1284, Apal- 1637.

Полученная в результате плазмида pCH2g-lHG, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептид со свойствами тяжелой цепи полноразмерного антитела человека, способного связывать интерлейкин-18, характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 4,19 M Да и размер 6777 п.н.;

кодирует гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжёлой цепи моноклонального антитела человека 1I1G соединён с константной частью тяжелой цепи иммуноглобулинов человека класса IgG 1 ;

состоит из следующих элементов:

а) Xhol / Асс651 - векторного фрагмента плазмиды pCH2g размером 6449 п.н., содержащего промотор-энхансер цитомегаловируса (CMV), участок гена, кодирующий константную часть тяжёлой цепи иммуноглобулинов IgG 1 человека, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции гена бычьего гормона роста (BGH), ген β-лактамазы (blа), ген устойчивости к неомицину (neo);

б) Xhol / Асс651 - фрагмента плазмидной ДНК pHEN2-lHG размером 328 п.н., включающего искусственный ген, кодирующий полипептид со свойствами тяжелой цепи моноклонального антитела человека, способного связывать интерлейкин-18.

содержит:

а) цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции;

б) искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжёлой цепи моноклонального антитела человека соединен с константной частью тяжёлой цепи иммуноглобулинов IgG 1 человека;

в) в качестве генетических маркеров ген β-лактамазы (blа), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCH2g-lHG клеток бактерий к ампициллину и ген устойчивости к неомицину (neo) для селекции трансфецированных плазмидой pCH2g-lHG клеток млекопитающих;

г) уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: Nhel - 897, Xhol - 1001, Асс651 - 1325, Xbal -2342.

Транзиентную экспрессию антитела человека fhl 11G осуществляют в клетках млекопитающих линии СНО-К1, трансфицированных

одновременно плазмидами pCL2h-lHG и pCH2g-lHG, обеспечивающими синтез полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей антитела человека, способного связывать интерлейкин-18.

Целевое антитело человека fhlllG выделяют из культуральной жидкости аффинной хроматографией на сорбенте с ковалентно иммобилизованным белком A Staphylococcus aureus. Выделенное антитело человека анализируют гель-электрофорезом в денатурирующих условиях в присутствии и в отсутствии 2-меркаптоэтанола.

Полученное антитело человека fhlllG обладает способностью связывать интерлейкин-18, что было показано при помощи прямого твердофазного иммуноанализа и иммуноблотинга. При этом интерлейкин-18 обнаруживается в растворе с концентрацией 500 нг/мл (27,3· 10"⁶ М).

Группа изобретений иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг. 1. Нуклеотидная и кодируемая ею фиг.2 аминокислотная последовательность плазмиды pCL2h-lHG, обеспечивающая синтез полипептида со свойствами легкой цепи антитела человека против интерлейкина-18. Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, жирным шрифтом выделены инициирующий и терминирующий кодоны.

Фиг. 3. Нуклеотидная и кодируемая ею фиг.4 аминокислотная последовательность плазмиды pCH2g-lHG, обеспечивающая синтез полипептида со свойствами тяжёлой цепи антитела человека против интерлейкина-18. Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, жирным шрифтом выделены инициирующий и терминирующий кодоны.

Фиг. 5. Карта плазмиды pCL2h-111 G. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. CMV promoter - цитомегаловирусный промотор; signal seq -сигнальная последовательность; VL-1I1G, human kappa constant -вариабельный и константный участки гена легкой цепи рекомбинантного антитела.

Фиг. 6. Карта плазмиды pCH2g-lHG. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. CMV promoter - цитомегаловирусный промотор; signal seq -

сигнальная последовательность; VH-1I1G, human IgGl constant -вариабельный и константный участки гена тяжелой цепи рекомбинантного антитела.

Фиг. 7. Электрофореграмма очищенного моноклонального антитела человека fh 111 G в денатурирующем 12% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - маркер молекулярных масс, 2 - целевой белок, обработанный 2-меркаптоэтанолом, 3 - целевой белок, не обработанный 2-меркаптоэтанолом.

Фиг. 8. Твердофазный иммуноанализ интерлейкина-18 с использованием моноклонального антитела человека fhlllG.

Фиг. 9. Иммуноблот-анализ рекомбинантного интерлейкина-18 (ИЛ-18) в составе клеточного лизата штамма Е. coli, продуцирующего рекомбинантный интерлейкин-18, с использованием моноклонального антитела человека fh 111 G. Дорожки: 1 - белки, выявленные с помощью fhlllG, 2 - маркер молекулярных масс.

Для лучшего понимания сущности предлагаемых изобретений, они иллюстрируются следующими примерами конкретного осуществления.

Пример 1. Конструирование плазмидной ДНК pCL2h-111 G, содержащей ген, который кодирует легкую цепь антитела человека fhlllG.

Амплификацию вариабельной области легкой цепи человеческого антитела II1G проводят в объеме 100 мкл в присутствии 100 нг pHEN2-1I1G, 50 пмолей праймеров 3 и 4, смеси dNTP (по 0.2 тМ каждого), 10 тМ Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCI, 2.5 тМ MgS0₄, 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas). Проводят 30 циклов по схеме: 95°С/40 с, 55°С/ 30 с, 72°С/1 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1 %-ном агарозном геле; полосу длиной около 326 п.н. вырезают, ДНК экстрагируют из геля любым доступным образом, например, с использованием набора "GeneJET™ Gel Extraction Kit" (Fermentas), и обрабатывают эндонуклеазами рестрикции EcoRV и HindiII, в соответствии

с методикой [8]. Продукты реакции анализируют электрофорезом в агарозном геле. Полосу размером около 308 п.н. вырезают, ДНК экстрагируют из геля.

Для сборки полноразмерного гена легкой цепи 5 мкг плазмиды pCL2h обрабатывают эндонуклеазами EcoRV и HindiII, продукты реакции анализируют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле. Полосу с линеаризированной векторной частью плазмиды вырезают, ДНК экстрагируют из геля и объединяют в реакции лигирования с 1 мкг фрагмента, полученного на этапе а), в 15 мкл реакционной смеси согласно методике [8]. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli штамм XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг плазмидных ДНК pCL2h-111G (фиг. 5) из клонов проводят рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз рестрикции НаеШ, EcoRV и Hindi 11. Структуру гена, кодирующего гибридный белок, подтверждают секвенированием (фиг. 1 ).

Пример 2. Конструирование плазмидной ДНК pCH2g-lHG, содержащей ген, который кодирует тяжелую цепь антитела человека fhlllG.

Амплификацию вариабельной области тяжелой цепи человеческого антитела 1I1G проводят в объеме 100 мкл в присутствии 100 нг pHEN2-II1G, 50 пмолей праймеров 1 и 2, смеси dNTP (по 0.2 тМ каждого), 10тМТрис-НС1, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSО₄, 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы (Fermentas). Проводят 30 циклов по схеме: 95 °С/40 с, 55 °С/30 с, 72 °С/1 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосу длиной около 354 п.н. вырезают, ДНК экстрагируют из геля любым доступным образом, например, с использованием набора "GeneJET™ Gel Extraction Kit" (Fermentas), и обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Xhol и Асс651, продукты реакции анализируют электрофорезом в агарозном геле. Полосу размером около 328 п.н. вырезают, ДНК экстрагируют из геля.

Для сборки полноразмерного гена тяжелой цепи 5 мкг плазмиды pCH2g обрабатывают эндонуклеазами рестрикции Xhol и Асс651, продукты реакции анализируют электрофорезом в 0.8%-ном агарозном геле, полосу с линеаризированной векторной частью плазмиды вырезают, ДНК экстрагируют из геля. Далее 1 мкг XhoI/Acc65I - фрагмента линеаризированной векторной части и 0,5 мкг ПЦР-фрагмента, полученного на этапе а), объединяют в реакции лигирования в 20 мкл по стандартной методике [8]. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е. coli XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-arap, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг клонов проводят рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз рестирикции Xhol и Асс651. Полученную в результате рекомбинантную плазмиду pCH2g-lHG (фиг. 6) анализируют эндонуклеазами рестрикции Haelll, Nhel и Xhol. Клоны, содержащие полноразмерный ген тяжелой цепи, анализируют секвенированием (фиг. 3).

Пример 3. Получение полноразмерного антитела человека íhlHG в эукариотических клетках млекопитающих.

Транзиентную экспрессию полноразмерного антитела человека против интерлейкина-18 осуществляют в результате совместной трансфекции клеток яичников китайского хомячка линии СНО-К1, полученными экспрессионными плазмидами pCL2h-HlG и pCH2g-lHG, содержащими гены легкой и тяжелой цепей антитела. Перед трансфекцией клетки СНО-К1 культивируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в среде DMEM (Gibco), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки. Клетки высевают на 6-луночные планшеты и выращивают до плотности 90-95%. Трансфекцию осуществляют с использованием реагента "Lipofectamine 2000" (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Для этого в 4,5 мл среды DMEM добавляют 36 мкг ДНК pCL2h-lHG и 36 мкг ДНК pCH2g-111 G. Одновременно смешивают 180 мкл реагента "Lipofectamine 2000" с 4,5 мл среды DMEM. После пятиминутной инкубации оба полученных раствора объединяют и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. После инкубации по 0,5 мл суспензии вносят в каждую лунку планшета, содержащего клетки СНО-К1. Через 4 ч после трансфекции культуральную среду в лунках заменяют на 0,5 мл среды "DMEM F12 advanced" (Gibco) с добавлением 2% сыворотки с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Invitrogen). Через 72 ч культуральную среду собирают и центрифугируют 15 мин при 15000 g. Супернатант отделяют, добавляют к нему азид натрия до концентрации 0,05% и используют для выделения антител.

Пример 4. Выделение рекомбинантных антител с помощью аффинной хроматографии.

Культуральную жидкость в объёме около 500 мл наносят при 4°С со скоростью 0,5 мл/мин на колонку, содержащую 5 мл сорбента "Protein А Sepharose CL-4B" (GE Healthcare) и уравновешенную фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), представляющем собой раствор 100 мМ NaCl, 50 мМ Na2HPО₄ (рН 7,4 при 25°С). Элюцию осуществляют при 25°С и скорости 1 мл/мин с использованием хроматографа "BioLogic LP System" (Bio-Rad). Колонку промывают 25 мл ФСБР, после чего элюируют иммуноглобулины быка, исходно присутствующие в сыворотке, 25 мл 0,1 M цитратного буфера (рН 5,0 при 25°С). Далее 15 мл 0,1 M цитратного буфера (рН 3,0 при 25°С) элюируют антитело в пробирку, содержащую 1,5 мл 1 M буфера Трис-HCl (рН 8,0 при 25°С). Фракцию, содержащую человеческое антитело, концентрируют с помощью концентраторов "Amicon ultra-4" 30 кДа (Millipore) согласно инструкции производителя, одновременно заменяя буферный раствор на ФСБР с добавлением 0,05% азида натрия. Концентрацию антитела в образце определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм, учитывая, что раствор иммуноглобулинов IgG в концентрации 1 мг/мл при длине оптического пути 1 см характеризуется оптической плотностью около 1,41 [9]. Выход целевого продукта - антитела fhlllG - составляет 200 мкг с 1 л культуральной жидкости. Очищенные антитела человека fhlllG анализируют в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях фракционированием в 12% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия (фиг. 7).

Пример 5. Применение полноразмерного антитела человека fhlllG для твердофазного иммуноанализа интерлейкина-18.

На твердую фазу в лунки иммунологического планшета сорбируют препарат рекомбинантного интерлейкина-18 [10] в различных концентрациях (4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0313 мкг/мл). После блокировки мест неспецифического связывания раствором 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Sigma", США), инкубируют с полученным рекомбинантным антителом человека fhlllG, добавленным в концентрации 5 мкг/мл. Иммунный комплекс выявляют добавлением антивидового коньюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:10000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат ("ICN", США). В качестве отрицательного контроля в параллельных экспериментах тестируют связывание полученного рекомбинантного антитела человека ihlllG с БСА. Результаты экспериментов показывают способность полученного рекомбинантного антитела связывать рекомбинантный интерлейкин-18 человека и отсутствие взаимодействия между полученным антителом и БСА (фиг. 8). Минимальная концентрация интерлейкина-18 в растворе, выявляемая полученным антителом человека fh 111 G, составила 500 нг/мл.

Пример 6. Исследование специфичности рекомбинантного антитела человека fhlllG.

Специфичность полученного рекомбинантного антитела подтверждают с помощью иммуноблот-анализа интерлейкина-18.

Белки Е. coli, продуцирующие рекомбинантный интерлейкин-18 человека, разделяют электрофоретически в 12% полиакриламидном геле с SDS, переносят на нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкм ("Millipore", США), который после блокирования сайтов неспецифического связывания раствором 3% БСА ("Sigma", США) инкубируют с исследуемым антителом. Связавшиеся антитела выявляют добавлением коньюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:10000. Визуализцию иммунного комплекса проводят, добавляя 5-бромо-3-индоло фосфат ("Fermentas", Литва) и нитро-тетразолевый синий ("Sigma", США). Результаты показывают специфичность связывания сконструированного полноразмерного антитела с белками размером около 18 кДа и 36 кДа, соответствующими мономерной и димерной форме рекомбинантного интерлейкина-18 человека (фиг. 9).

Таким образом, впервые получены плазмидные ДНК pCL2h-lllG и pCH2g-lHG, обеспечивающие синтез полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей антитела человека, способного связывать интерлейкин-18; получено моноклональное антитело человека fhlllG, связывающее интерлейкин-18, которое обеспечивает выявление интерлейкина-18 методом иммуноанализа.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Dinarello С.А. Interleukin 1 and interleukin 18 as mediators of inflammation and the aging process // Am. J. Clin. Nutr. - 2006. - V. 83(2). - P. 447S-455S.

2. Kim S., Jang M., Stapleton J., et al. // Virology. - 2004. - Vol. 318. - P. 598-607.

3.Kausmally L., Waalen K., Lobersli I., et al. // J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85.-P. 3493-3500.

4. Williamson R.A., Burioni R., Sanna P.P. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. -1993.-Vol. 90. -P. 4141-4145.

5. Vikhrova M.A., Shveygert M.V., Khrapov E.A., et al. Selection of naturally occurring autoantibodies to interleukin-18 from phage display library // Hum. Antibodies - 2010. - V. 19(2-3). - P. 71-78.

6. Hamasaki T., Hashiguchi S., Ito Y., et al. Human anti-human IL-18 antibody recognizing the IL-18-binding site 3 with IL-18 signaling blocking activity // J. Biochem. - 2005. - V. 138(4). - P. 433-442.

7. Байков И. К., Хлусевич Я. Α., Матвеев А. Л. и др. Конструирование кассетных векторных плазмид для получения полноразмерных рекомбинантных антител // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина - 2013. - Т. 11(3). - С. 56-64.

8. Sambrook J., Fritsch Ε., Maniatis T. // Molecular Cloning. A Laboratory manual. 2^nded. Cold Spring Harbor, NY, 1989.

9. Hale G. Isolation and purification of monoclonal antibodies from tissue culture supernatant // Monoclonal antibodies. A practical approach. Shepherd Ρ and Dean C. (ed). Oxford University Press. 2000. P. 149-180.

10. Якушенко Ε.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Ε.А. и др. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 и изучение его противоопухолевой активности // Бюллетень СО РАМН - 2007. - Т. 2. - С. 23-26.

Claims (3)

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCL2h-1I1G, обеспечивающая синтез легкой цепи антитела человека против интерлейкина-18, где указанная плазмидная ДНК в соответствии с физической картой, представленной на фиг.5, имеет размер 6232 п.н., молекулярную массу 3,85 МДа, уникальные сайты рестрикции NheI (896), EcoRV (980), HindIII (1284), ApaI (1637) и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, представляющий собой легкую цепь антитела человека против интерлейкина-18.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCH2g-1I1G, обеспечивающая синтез тяжелой цепи антитела человека против интерлейкина-18, где указанная плазмидная ДНК с физической картой, представленной на фиг.6, имеет размер 6777 п.н., молекулярную массу 4,19 МДа, уникальные сайты рестрикции NheI (897), XhoI (1001), Асс65I (1325), XbaI (2342) и включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, кодирующую белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, представляющий собой тяжелую цепь антитела человека против интерлейкина-18.

3. Рекомбинантное антитело человека fh1I1G, обладающее способностью связывать интерлейкин-18, полученное из эукариотических клеток, трансфицированных рекомбинантными плазмидными ДНК pCL2h-1I1G и pCH2g-1I1G, имеющее молекулярную массу 153,4 кДа, включающее легкую и тяжелую цепи антитела человека, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, представленные на фиг.2 и 4 соответственно.

Images