RU2553338C2

RU2553338C2 - Pseudomonas azotoformans STRAIN FOR CLEANING SEA WATER AND COASTAL AREAS FROM OIL IN HIGH LATITUDE CONDITIONS

Info

Publication number: RU2553338C2
Application number: RU2013138575/10A
Authority: RU
Inventors: Мария Юрьевна Маркарова; Татьяна Николаевна Щемелинина; Игорь Алексеевич Заикин; Марина Анатольевна Чиковани; Валерий Валентинович Кравченко
Original assignee: Открытое акционерное общество "Нефтяная компания "ЛУКОЙЛ"
Priority date: 2013-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2015-06-10
Also published as: RU2013138575A

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. The Pseudomonas azotoformans is deposited under registration number VKM B-2762D and is used to clean marine ecosystems from contamination by oil and oil products.

EFFECT: invention enables to break down heavy paraffins and polyaromatic compounds in contaminated sea water in the temperature range of +1 to +20°C.

2 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки морских экосистем от загрязнений нефтью, в течение 3-10 суток в диапазоне температур от +1°С до +20°С.The invention relates to the field of biotechnology and relates to the production of a new strain of bacteria effective for cleaning marine ecosystems from oil pollution for 3-10 days in the temperature range from + 1 ° C to + 20 ° C.

Известен штамм Pseudomonas putida 36 (авт.св. SU 1076446 А1, 1984, бюл. №81), пригодный для очистки от нефти и нефтепродуктов пресной и морской воды (до 7,5% солености) в широком диапазоне температур (10-26°С).Known strain Pseudomonas putida 36 (autosw. SU 1076446 A1, 1984, bull. No. 81), suitable for purification from oil and oil products of fresh and sea water (up to 7.5% salinity) in a wide temperature range (10-26 ° FROM).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°С и снижении уровня растворенного кислорода.The disadvantage of the strain is the decrease in the efficiency of water purification from oil at temperatures below + 10 ° C and a decrease in the level of dissolved oxygen.

Известен штамм Mycobacterium flavescens (патент RU 2053296 C1, 1996, бюл. №3), обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов.Known strain of Mycobacterium flavescens (patent RU 2053296 C1, 1996, bull. No. 3), which has a high ability to utilize oil and oil products.

Недостатком штамма является его высокая чувствительность к температуре среды и насыщенности среды кислородом.The disadvantage of the strain is its high sensitivity to ambient temperature and oxygen saturation.

Известен штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б (патент RU 2129603 C1, 1999, бюл. №22), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-26°С).Known strain of Mycobacterium species CCM B 65-B (patent RU 2129603 C1, 1999, bull. No. 22), used to clean water and soil from oil and oil products in a wide temperature range (10-26 ° C).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°С и снижения уровня растворенного кислорода, что не позволяет ожидать эффективной очистки донных отложений от нефти.The disadvantage of the strain is a decrease in the efficiency of water purification from oil at temperatures below + 10 ° C and a decrease in the level of dissolved oxygen, which does not allow us to expect effective purification of bottom sediments from oil.

Задача изобретения - получение штамма бактерий, обеспечивающего разрушение тяжелых парафинов и полиароматических соединений в загрязненных морских водоемов от нефти в диапазоне температур от +1°С до +20°С при низком содержании кислорода.The objective of the invention is to obtain a strain of bacteria that ensures the destruction of heavy paraffins and polyaromatic compounds in contaminated marine water from oil in the temperature range from + 1 ° C to + 20 ° C with a low oxygen content.

Штамм Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D выделен в 2010 году из накопительной культуры проб загрязненного нефтью донного грунта солоновато-водного озера с глубины 1,0 м в зоне хронического нефтяного загрязнения путем высева водного разведения испытуемой пробы методом предельных разведений аликвоты по 100 мкл на поверхность агаризованной среды с жидкими алканами. Авторский номер КМ-161СА. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер BKM B-2762D.The strain Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D was isolated in 2010 from an accumulative culture of samples of oil-contaminated bottom soil of a brackish-water lake from a depth of 1.0 m in the zone of chronic oil pollution by plating the water dilution of the test sample by limiting dilutions of an aliquot of 100 μl onto an agarized surface environments with liquid alkanes. Author number KM-161CA. The strain was deposited in the All-Russian collection of microorganisms of the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, number BKM B-2762D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид не значится.In the classification of microorganisms by pathogenicity groups of the Sanitary and Epidemiological Rules SP 1.3.2322-08 of May 1, 2008, “Safety of work with microorganisms of the III-IV pathogenicity (danger) groups and pathogens of parasitic diseases” this species does not appear.

Штамм Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D растет на агаризованной среде, содержащей жидкие алканы в качестве единственного источника углерода и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками:The strain Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D grows on an agar medium containing liquid alkanes as the sole carbon source and is characterized by the following morphological, cultural and physiological characteristics:

Грамотрицательные прямые подвижные палочки с полярно расположенными жгутиками.Gram-negative straight movable sticks with polar flagella.

Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, прозрачные, белесые с желтоватым оттенком.Colonies on nutrient agar are round in shape with smooth edges, convex, transparent, whitish with a yellowish tinge.

Консистенция слизистая.The consistency of the mucosa.

Выделяет в среду дифундирующий флюоресцирующий желто-зеленый пигмент.A diffusing fluorescent yellow-green pigment is released into the medium.

Аэроб, факультиативный анаэроб, способен к денитрификации.Aerob, an optional anaerobic, is capable of denitrification.

Оксидазоположительный, каталазоположительный, хемоорганотроф.Oxide-positive, catalase-positive, chemo-organotroph.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах.The strain storage regimen is long-term storage in lyophilized form in tightly sealed glass ampoules.

Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 15 г, NaCl - 15; NaNO₃- 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.Short-term storage (for biomass preparation with intended use) - periodic reseeding - 1 time in 2 months with storage of the grown pure culture on mowed agar medium of the following composition: per 1000 ml of water - peptone 15 g, NaCl - 15; NaNO ₃ - 2.0 g; KH ₂ PO ₄ - 1.0 g; KCl - 0.5 g; MgSO ₄ × 5H ₂ O - 0.5 g; microbiological agar - 20.0; in closed tubes in the refrigerator at a temperature not higher than +6 and not lower than + 1 ° C.

Среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды: NaNO₃ - 3,0; KH₂PO₄ - 1,0; KCl - 0,5; MgSO₄5H₂O - 0,5; FeSO₄ - 0,01; NaCl - 15; пептон ферментативный - 20,0; дрожжевой экстракт (дрожжевой автолизат) - 1,0; алканы (или сырая нефть) - 10,0; рН 6,0-7,0; культивирование при 15-25°С на качалке при 220 об/мин, 3 суток.The culture medium for the following composition: per 1000 ml of water: NaNO ₃ - 3.0; KH ₂ PO ₄ - 1.0; KCl - 0.5; MgSO ₄ 5H ₂ O - 0.5; FeSO ₄ - 0.01; NaCl - 15; enzymatic peptone - 20.0; yeast extract (yeast autolysate) - 1.0; alkanes (or crude oil) - 10.0; pH 6.0-7.0; cultivation at 15-25 ° C on a rocking chair at 220 rpm, 3 days.

Способность штамма к биодеструкции нефтяных углеводородов в водной и почвенной средах изучали в лабораторных опытах, результаты приведены в примерах ниже.The ability of the strain for biodegradation of petroleum hydrocarbons in aqueous and soil media was studied in laboratory experiments, the results are shown in the examples below.

Пример 1. Изучение нефтеокисляющих свойств штамма в водной среде. Биомассу штамма Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D для проведения опытов нарабатывали на предварительно простерилизованной питательной среде, содержащей морскую воду 1000 мл (соленость 1,8%), пептон 15 г, NaNO₃- 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г, жидкие алканы 10 мг. Чистую культуру вносили в колбы, содержащие 100 мл стерильной питательной среды со скошенного агара на конце петли, колбы устанавливали на шейкер при 220 об/мин и проводили наработку биомассы в течение 3 суток при температуре +15°С. Титр клеток в готовом препарате составлял 10¹⁰ на 1 мл.Example 1. The study of the oil-oxidizing properties of the strain in the aquatic environment. For the experiments, the biomass of the strain Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D was prepared on a pre-sterilized nutrient medium containing 1000 ml of sea water (salinity 1.8%), peptone 15 g, NaNO ₃ - 2.0 g; KH ₂ PO ₄ - 1.0 g; KCl - 0.5 g; MgSO ₄ × 5H ₂ O - 0.5 g, liquid alkanes 10 mg. Pure culture was introduced into flasks containing 100 ml of sterile nutrient medium from mowed agar at the end of the loop, the flasks were mounted on a shaker at 220 rpm and biomass was produced for 3 days at a temperature of + 15 ° С. The titer of cells in the finished product was 10 ¹⁰ per 1 ml.

Затем в предварительно простерилизованную морскую воду, взятую в количестве 100 мл, вносили 5 мл нефти, добавляли 1 мл готового препарата и оставляли на 10 суток при температуре +1°С -+5°С для деструкции. Колбы периодически встряхивали. В контрольные колбы препарат не вносили. Через 30 суток проводили анализ нефтяных фракций в опытных колбах.Then, 5 ml of oil was added to pre-sterilized sea water, taken in an amount of 100 ml, 1 ml of the finished preparation was added and left for 10 days at a temperature of + 1 ° С - + 5 ° С for destruction. The flasks were shaken periodically. The drug was not added to control flasks. After 30 days, an analysis of the oil fractions in the experimental flasks was carried out.

Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.

Фиг. 1 представляет собой график разрушения нафтеновых углеводородов нефти штаммом Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D.FIG. 1 is a graph of the destruction of naphthenic oil hydrocarbons by the strain Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D.

Фиг. 2 представляет собой график динамики снижения концентрации нефти в почве в результате обработки суспензией Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D.FIG. 2 is a graph of the dynamics of a decrease in oil concentration in soil as a result of treatment with a suspension of Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D.

Как видно на Фиг. 1, исследуемый штамм эффективен для разрушения нафтеновой фракции нефти без принудительной аэрации, о чем говорит значительное снижение массовой доли алкановых соединений в диапазоне длины их цепи от 11 до 40 атомов.As seen in FIG. 1, the studied strain is effective for destroying the naphthenic oil fraction without forced aeration, as evidenced by a significant decrease in the mass fraction of alkane compounds in the range of their chain length from 11 to 40 atoms.

Оценка концентрации полиароматических соединений: таблица 1 показала, что сумма ПАУ в опыте снижается почти в 10 раз, причем массовая доля приоритетных ксенобиотиков снижается более чем в 12 раз.Assessment of the concentration of polyaromatic compounds: table 1 showed that the amount of PAHs in the experiment decreases by almost 10 times, and the mass fraction of priority xenobiotics decreases by more than 12 times.

Массовая доля растворенных углеводородов за 10 суток снижается с 5,26 до 0,15 мг/дм³.The mass fraction of dissolved hydrocarbons in 10 days is reduced from 5.26 to 0.15 mg / DM ³ .

Полученные результаты позволили сделать вывод о перспективности полученного штамма для очистки морских вод от нефти как на поверхности, так и в массе донных отложений, поскольку штамм проявляет активность при ограничении доступа кислорода (без режима принудительного аэрирования).The results obtained made it possible to draw a conclusion about the prospects of the obtained strain for purification of sea water from oil both on the surface and in the mass of bottom sediments, since the strain is active in restricting oxygen access (without forced aeration mode).

Для проверки возможности очистки от нефтяного загрязнения береговой зоны мы поставили следующий опыт.To test the possibility of cleaning up oil pollution of the coastal zone, we set the following experience.

Пример 2. Очистка от нефти поверхности почвы береговой зоны морского объектаExample 2. Purification of oil from the soil surface of the coastal zone of a marine object

Почвы береговой зоны приморских объектов, загрязненных нефтью, отличаются высоким содержанием солей. Для опыта были взяты пробы с берега загрязненного приморского объекта. Концентрация нефти в почве составила 167 мг/г. Почву по мере подсыхания увлажняли морской водой с уровнем солености 1,8%.Soils of the coastal zone of coastal objects contaminated with oil are characterized by a high salt content. For the experiment, samples were taken from the shore of a contaminated coastal facility. The oil concentration in the soil was 167 mg / g. As the soil dried, it was moistened with sea water with a salinity level of 1.8%.

Обработку почвы проводили суспензией рабочего, 1% раствора биопрепарата, из расчета 10 мл рабочего раствора на 100 г почвы трехкратно в течение опыта с периодичностью 1 раз в 2 недели. Опыт длился 2 месяца при температуре +10°С -+20°С.The soil was treated with a suspension of a working, 1% biological product solution, at the rate of 10 ml of working solution per 100 g of soil three times during the experiment with a frequency of 1 time in 2 weeks. The experiment lasted 2 months at a temperature of + 10 ° С - + 20 ° С.

Результаты опыта по динамике снижения концентрации загрязнения почвы представлены на Фиг. 2.The results of the experiment on the dynamics of reducing the concentration of soil pollution are presented in FIG. 2.

За два месяца уровень загрязнения почвы снизился до 4 мг нефти на 1 г почвы. Полученные данные позволяют рекомендовать полученный штамм для проведения очистки береговой зоны приморских объектов от нефти.In two months, the level of soil pollution decreased to 4 mg of oil per 1 g of soil. The data obtained allow us to recommend the obtained strain for cleaning the coastal zone of coastal facilities from oil.

Claims

Штамм Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D для очистки от углеводородов нефти, нафтеновых углеводородов, ароматических соединений нефти, растворенных в воде углеводородов, морских водоемов и береговой зоны морских объектов при температуре от +1°С до +20°С. The strain Pseudomonas azotoformans BKM B-2762D for the purification of hydrocarbons from oil, naphthenic hydrocarbons, aromatic compounds of oil, hydrocarbons dissolved in water, marine water bodies and the coastal zone of marine objects at temperatures from + 1 ° C to + 20 ° C.