RU2541153C1 - Dipropionate betulin composition - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: anti-tumour composition of a betulin derivative with a biocompatible carrier, wherein the betulin derivative is presented by betulin dipropionate, while the biocompatible carrier is arabinogalactane in certain proportions; the composition is prepared by a mechanic activation of betulin dipropionate with arabinogalactane.

EFFECT: composition possesses the pronounced anti-tumour activity and the improved solubility.

2 cl, 2 dwg, 4 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к производству композиций фармакологически активных веществ.The invention relates to the pharmaceutical industry, in particular to the production of compositions of pharmacologically active substances.

Дипропионат бетулина (ДПБ) - 3β, 28-дипропиокси-луп 20 (29)-ен является сложным эфиром пропионовой кислоты и бетулина.Betulin dipropionate (DPB) - 3β, 28-dipropoxy-loop 20 (29) -en is an ester of propionic acid and betulin.

Бетулин и его производные обладают уникальными фармакологическими свойствами - противоопухолевыми, антиоксидантными, противовирусными и другими [Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. №13. С.1-30]. Пропионовая кислота входит в состав некоторых лекарственных средств (ибупрофен, феноболин, напроксен и другие ненаркотические анальгетики, а также нестероидные противовоспалительные средства), душистых веществ [Зефиров Н.С., Кулов Н.Н. и др. Химическая энциклопедия. Т.4. - М.: Научное издательство «Большая российская энциклопедия», 1995. С.107-108]. Целенаправленная химическая модификация природных биологически активных соединений приводит к получению веществ, которые обладают более низкой токсичностью и широким спектром фармакологической активности.Betulin and its derivatives have unique pharmacological properties - antitumor, antioxidant, antiviral and others [Tolstikov GA, Flekhter OB, Shults E.E., Baltina LA, Tolstikov AG Betulin and its derivatives. Chemistry and biological activity // Chemistry in the interests of sustainable development. 2005. No. 13. S.1-30]. Propionic acid is part of some drugs (ibuprofen, phenobolin, naproxen and other non-narcotic analgesics, as well as non-steroidal anti-inflammatory drugs), fragrances [Zefirov N.S., Kulov N.N. et al. Chemical encyclopedia. T.4. - M .: Scientific publishing house "Big Russian Encyclopedia", 1995. P.107-108]. Purposeful chemical modification of natural biologically active compounds leads to the production of substances that have lower toxicity and a wide range of pharmacological activity.

Известно, что ацилаты бетулинола проявляют противоопухолевое действие [Флехтер О.Б., Бореко Е.И., Нигматулина Л.Р., Павлова Н.И., Медведева Н.И., Николаева С.Н., Третьякова Е.В., Савинова О.В., Балтина Л.А., Карачурина Л.Т., Галин Ф.З., Зарудий Ф.С., Толстиков Г.А. Синтез и фармакологическая активность ацилированных оксимов бетулоновой кислоты и 28-оксо-аллобетулона // Химико-фармацевтический журнал. Т.38. №3. 2004. С.31-34]. Среди ацилатов бетулинола выявлены высокоактивные вещества, такие как диникотинат, бисгемисукцинат, бисгемифиалат бетулинола и другие, проявляющие гепатопротекторную и анти-ВИЧ активность. Диникотинат бетулинола способствует восстановлению уровня маркерных ферментов сыворотки крови, щелочной фосфотазы и билирубина и обладает антиоксидантными свойствами. Диацетат бетулина [3β,28-диацетокси-луп-20(29)-ен(1)] проявляет гиполипидемические, желчегонные, антиоксидантные свойства [Василенко Ю.К., Семенченко В.Ф., Фролова Л.М. и др. Фармакологические свойства тритерпеноидов коры березы. Эксперим. и клин. фармакол. 1993. Т. 56. №4. С.53-55].It is known that betulinol acylates exhibit an antitumor effect [Flekhter OB, Boreko EI, Nigmatulina LR, Pavlova NI, Medvedeva NI, Nikolaeva SN, Tretyakova EV , Savinova O.V., Baltina L.A., Karachurina L.T., Galin F.Z., Zarudy F.S., Tolstikov G.A. Synthesis and pharmacological activity of acylated oximes of betulonic acid and 28-oxo-allobetulone // Chemical and Pharmaceutical Journal. T.38. Number 3. 2004. S.31-34]. Among the betulinol acylates, highly active substances were identified, such as dinicotinate, bishemisuccinate, betulinol bishemifialate and others exhibiting hepatoprotective and anti-HIV activity. Betulinol dinicotinate helps to restore the level of serum marker enzymes, alkaline phosphatase and bilirubin and has antioxidant properties. Betulin diacetate [3β, 28-diacetoxy-loop-20 (29) -en (1)] exhibits lipid-lowering, choleretic, antioxidant properties [Vasilenko Yu.K., Semenchenko V.F., Frolova L.M. et al. Pharmacological properties of triterpenoids of birch bark. Experiment and wedge. pharmacol. 1993. T. 56. No. 4. S.53-55].

Установлено, что дипропионат бетулинола в дозе 4000 мг/кг нетоксичен (испытания на токсичность были проведены в аккредитованном испытательном центре г. Красноярска), но его фармакологическая активность не изучена. Основным препятствием для использования дипропионата бетулина в качестве лечебного средства для внутреннего и наружного применения является низкая биологическая доступность, связанная с плохой растворимостью.It was found that betulinol dipropionate at a dose of 4000 mg / kg is non-toxic (toxicity tests were carried out in an accredited testing center in Krasnoyarsk), but its pharmacological activity has not been studied. The main obstacle to the use of betulin dipropionate as a therapeutic agent for internal and external use is the low bioavailability associated with poor solubility.

Известны разные способы увеличения растворимости и повышения биологической доступности лекарственных и биологически активных веществ, одним из которых является создание композиций с водорастворимыми носителями.There are various ways to increase solubility and increase the bioavailability of medicinal and biologically active substances, one of which is the creation of compositions with water-soluble carriers.

Известно фунгицидное средство, включающее в качестве активного ингредиента тебуконазол и природные или синтетические водорастворимые полимеры в массовом соотношении тебуконазол : водорастворимые полимеры 1:(1-5) соответственно, при этом его получают путем механохимического взаимодействия тебуконазола с водорастворимыми полимерами [Патент РФ №2469536, опубл. 20.12.2012 г.].A fungicidal agent is known, including tebuconazole and natural or synthetic water-soluble polymers in the mass ratio of tebuconazole: water-soluble polymers 1: (1-5), respectively, as an active ingredient, while it is obtained by mechanochemical interaction of tebuconazole with water-soluble polymers [RF Patent No. 2469536, publ. . December 20, 2012].

Известно лекарственное средство, представляющее собой комплекс нифедипина с арабиногалактаном при весовом соотношении компонентов нифедипин : арабиногалактан, равном 1:(10-40), полученное механической обработкой в планетарной мельнице при ускорении 60 g, обладающее лучшей по сравнению с исходным анитигипертензивной активностью [Патент РФ №2391980, опубл. 20.06.2010]. С помощью механической обработки получены также композиции с арабиногалактаном (АГ) труднорастворимых лекарственных веществ (ЛВ): сибазона, мезапама, азалептина, индометацина в соотношении АВ:АГ=1:(5-20), обладающих противовоспалительным и транквилизирующим действием [Патент РФ №2337710, опубл.20.06.2008], композиция на основе дигидрокверцетина и арабиногалактана, обладающая капилляропротекторными свойствами, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит основной карбонат магния [Патент РФ №2451517, опубл. 27.05.2012], и тем, что часть дигидрокверцетина заменена гликопротеином из акации японской [Патент РФ №2421215, опубл. 20.06.2011]. В последнем случае для получения используют также валковую мельницу для уменьшения механического воздействия. Недостатком этих изобретений является их узкая направленность на конкретные лекарственные средства и использование определенных мелющих аппаратов. Данные препараты не обладают одновременно капилляроукрепляющими свойствами, противоязвенной и противоопухолевой активностью как бетулин и его производные.A drug is known, which is a complex of nifedipine with arabinogalactan with a weight ratio of nifedipine: arabinogalactan components equal to 1: (10-40), obtained by machining in a planetary mill at an acceleration of 60 g, which has a better antihypertensive activity compared to the original [RF Patent No. 2391980, publ. 06/20/2010]. Compositions with arabinogalactan (AG) of sparingly soluble medicinal substances (ARs): sibazon, mezapam, azaleptin, indomethacin in the ratio AB: AG = 1: (5-20), which have anti-inflammatory and tranquilizing effects [RF Patent No. 2337710], were also obtained by mechanical processing. , publ. 20.06.2008], a composition based on dihydroquercetin and arabinogalactan, which has capillar-protective properties, characterized in that it additionally contains basic magnesium carbonate [RF Patent No. 2451517, publ. 05/27/2012], and the fact that part of the dihydroquercetin has been replaced by Japanese acacia glycoprotein [RF Patent No. 2421215, publ. 06/20/2011]. In the latter case, a roller mill is also used to obtain to reduce mechanical stress. The disadvantage of these inventions is their narrow focus on specific drugs and the use of certain grinding devices. These drugs do not simultaneously have capillary-strengthening properties, antiulcer and antitumor activity like betulin and its derivatives.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является композиция бетулина с биосовместимыми носителями - полиэтиленгликолем и поливинилпирролидоном, при следующем соотношении компонентов: бетулин (активное вещество) - 10-25%, полимерный носитель - 75-90%, полученная механической активацией в мельнице-активаторе в течение 10-30 мин при нагрузке на мелющие тела не более 20 g и соотношении массы смеси к массе мелющих тел 1:30 [Патент РФ №2401118. Опубл. 10.10.2010].Closest to the proposed invention is a composition of betulin with biocompatible carriers - polyethylene glycol and polyvinylpyrrolidone, with the following ratio of components: betulin (active substance) - 10-25%, polymer carrier - 75-90%, obtained by mechanical activation in an activator mill for 10 -30 min when the load on the grinding media is not more than 20 g and the ratio of the mass of the mixture to the mass of grinding media is 1:30 [RF Patent No. 2401118. Publ. 10/10/2010].

Недостатком данной композиции является использование в качестве носителей синтетических полимеров.The disadvantage of this composition is the use of synthetic polymers as carriers.

Задача настоящего изобретения состоит в расширении ассортимента фармакологически активных композиций на основе производных бетулина и природных полимерных носителей.The objective of the present invention is to expand the range of pharmacologically active compositions based on betulin derivatives and natural polymer carriers.

Технический результат изобретения - создано противоопухолевая композиция на основе дипропионата бетулина и растворимого природного полимерного носителя арабиногалактана.The technical result of the invention is an antitumor composition based on betulin dipropionate and a soluble natural polymer carrier arabinogalactan.

Технический результат достигается тем, что композиция производного бетулина с биосовместимым носителем, согласно изобретению, обладает противоопухолевыми свойствами, а в качестве производного бетулина включает дипропионат бетулина, в качестве биосовместимого носителя - арабиногалактан, при соотношении компонентов, масс. %: дипропионат бетулина - 10%, арабиногалактан - остальное, при этом ее получают механохимической активацией исходных компонентов. Композиция на основе дипропионата бетулина представляет собой порошок белого цвета с желтоватым оттенком.The technical result is achieved in that the composition of the betulin derivative with a biocompatible carrier, according to the invention, has antitumor properties, and includes betulin dipropionate as a betulin derivative, arabinogalactan as a biocompatible carrier, with a ratio of components, masses. %: betulin dipropionate - 10%, arabinogalactan - the rest, while it is obtained by mechanochemical activation of the starting components. The composition based on betulin dipropionate is a white powder with a yellowish tinge.

Арабиногалактан (АГ) - водорастворимый природный дешевый, доступный и нетоксичный полисахарид, выделяемый из древесины лиственницы, обладающий комплексом уникальных свойств. Арабиногалактан безвреден и разрешен для применения в качестве добавок к продуктам питания и в биологически активные добавки. Он имеет низкую среднечисленную молекулярную массу, гарантирующую повышенную водорастворимость создаваемых композиций. Макромолекула АГ имеет разветвленное строение, что способствует прочному удерживанию низкомолекулярных веществ.Arabinogalactan (AG) is a water-soluble natural cheap, affordable and non-toxic polysaccharide isolated from larch wood, which has a complex of unique properties. Arabinogalactan is harmless and approved for use as additives in food and biologically active additives. It has a low number average molecular weight, which guarantees increased water solubility of the created compositions. The macromolecule AG has a branched structure, which contributes to the strong retention of low molecular weight substances.

Данную композицию получают следующим образом.This composition is prepared as follows.

Исходные компоненты - дипропионат бетулина и арабиногалактан - получают по оригинальным методикам [Патент РФ №2469043 «Способ получения дипропионата бетулинола» и патент РФ №2280040 «Способ получения арабиногалактана»] с чистотой не менее 95%. Композицию получают путем совместной механической обработки исходных компонентов, не приводящей к их деструкции, в мельнице-активаторе в течение 10-30 минут при нагрузке на мелющие тела не более 10 g и соотношении массы смеси к массе мелющих тел 1:30. Для предотвращения деструкции исходных компонентов могут быть использованы высокоэнергонапряженные мельницы-активаторы с охлаждаемыми реакторами, причем плотность материала реактора и мелющих тел не должна превышать плотность стали, или аппараты с пониженной нагрузкой на мелющие тела. Одним из таких аппаратов является мельница SPEX 8000 (CertiPrep Corp., США).The starting components — betulin dipropionate and arabinogalactan — are prepared according to original procedures [RF Patent No. 2469043 “Method for the preparation of betulinol dipropionate” and RF patent No. 2280040 “Method for the preparation of arabinogalactan”] with a purity of at least 95%. The composition is obtained by joint mechanical processing of the starting components, which does not lead to their destruction, in the activator mill for 10-30 minutes with a load on the grinding media of not more than 10 g and a ratio of the mass of the mixture to the mass of grinding media 1:30. To prevent the degradation of the starting components, high-energy-activated activator mills with cooled reactors can be used, and the density of the material of the reactor and grinding media should not exceed the density of steel, or apparatus with a reduced load on the grinding media. One of such devices is a mill SPEX 8000 (CertiPrep Corp., USA).

Растворение АГ и его смесей с ДПБ в воде проводили в тестере растворимости Varian 705 DS. В сосуд с водой помещали 200 мг АГ или 180 мг АГ и 20 мг ДАБ и выдерживали при постоянном перемешивании при 37°C в течение 2-48 часов. После чего раствор отфильтровывали с помощью фильтров с диаметром пор 0.2 мкм. Фильтраты подвергали выпариванию при пониженном давлении и температуре 35-40°C (ротационный испаритель ИР-1М, Россия). При этом получали остаток в виде тонкой прозрачной пленки, которая при вторичном растворении в воде полностью переходит в раствор. Для определения содержания ДПБ навеску остатка массой 9-10 мг подвергали трехкратной экстракции 1 мл хлороформа. Полученный экстракт выпаривали и проводили растворение в 1 мл этанола. Содержание ДПБ определяли хроматографически с помощью хроматографа Милихром А-02 (ЗАО «ЭкоНова», Россия) (N2301 2.0*75 мм, ProntoSIL 120-5С18 AQ, 35°C, H₂O (А) - CH₃CN (В), 80-100-100% В, 100 мкл/мин). Содержание ДПБ определяли на длине волны 200 и 210 нм. Полученные значения концентраций пересчитывали на массу навески образца, взятой для растворения.The dissolution of AG and its mixtures with DPB in water was carried out in a Varian 705 DS solubility tester. 200 mg of AH or 180 mg of AH and 20 mg of DAB were placed in a vessel of water and kept under constant stirring at 37 ° C for 2-48 hours. After that, the solution was filtered using filters with a pore diameter of 0.2 μm. The filtrates were evaporated under reduced pressure and a temperature of 35-40 ° C (rotary evaporator IR-1M, Russia). In this case, the residue was obtained in the form of a thin transparent film, which, when dissolved again in water, completely passes into solution. To determine the DPB content, a weighed portion of the residue weighing 9–10 mg was subjected to three times extraction with 1 ml of chloroform. The resulting extract was evaporated and dissolved in 1 ml of ethanol. The DPB content was determined chromatographically using a Milichrom A-02 chromatograph (EkoNova CJSC, Russia) (N2301 2.0 * 75 mm, ProntoSIL 120-5С18 AQ, 35 ° C, H ₂ O (A) - CH ₃ CN (B), 80-100-100% B, 100 μl / min). The DPB content was determined at a wavelength of 200 and 210 nm. The obtained concentration values were converted to the weight of a sample taken for dissolution.

Рентгенофазовый анализ (РФА) механоактивированных порошков проводили с использованием дифрактометра D8 DISCOVER с двухкоординатным детектором (Bruker), CuK_α-излучение, 2θ=5÷40. ИК-спектры получали методом нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в диапазоне частот 4000-500 см^-1 на Фурье ИК-спектрометре Digilab Excalibur 3100 (Varian) без прессования образцов. Молекулярно-массовое распределение (ММР) образцов исследовали методом гель-проникающей хроматографии на хроматографе Agilent 1200 с рефрактометрическим детектором 1260 Infinity (PL aquagel-OH 40 300*7.5 мм, 30°C, 0,1 М LiNO₃ 1 мл/мин). Калибровка осуществлялась с помощью стандартных образцов декстранов (SIGMA-ALDRICH) с молекулярными массами 10600, 20000, 41272, 70000.X-ray phase analysis (XRD) of mechanically activated powders was carried out using a D8 DISCOVER diffractometer with a two-coordinate detector (Bruker), CuK _α radiation, 2θ = 5–40. IR spectra were obtained by the method of impaired total internal reflection (ATR) in the frequency range 4000-500 cm ^-1 on a Fourier transform IR spectrometer Digilab Excalibur 3100 (Varian) without pressing the samples. The molecular weight distribution (MMP) of the samples was studied by gel permeation chromatography on an Agilent 1200 chromatograph with a 1260 Infinity refractometric detector (PL aquagel-OH 40 300 * 7.5 mm, 30 ° C, 0.1 M LiNO ₃ 1 ml / min). Calibration was carried out using standard dextran samples (SIGMA-ALDRICH) with molecular weights of 10600, 20,000, 41272, 70,000.

Изобретение поясняется конкретными примерами.The invention is illustrated by specific examples.

Пример 1. Физическую смесь, состоящую из 0,02 г дипропионата бетулина и 0,18 г АГ, без проведения механоактивации растворяли в 250 мл дистиллированной воды при 37°C в течение 24 часов. Полученный раствор центрифугировали и фильтровали. Из фильтрата удаляли воду с помощью ротационного испарителя, после чего сухой остаток исследовали методом ВЭЖХ.Example 1. A physical mixture consisting of 0.02 g of betulin dipropionate and 0.18 g of AH was dissolved in 250 ml of distilled water at 37 ° C for 24 hours without mechanical activation. The resulting solution was centrifuged and filtered. Water was removed from the filtrate using a rotary evaporator, after which the dry residue was examined by HPLC.

Пример 2. Смесь, состоящую из 0,2 г дипропионата бетулина и 1,8 г АГ, активировали в мельнице SPEX 8000 (CertiPrep Corp., США) в стальном барабане объемом 40 мл с мелющими телами в виде стальных шаров диаметром 6 мм и ускорением мелющих тел 8-10 g, загрузка шаров - 60 г. Механическую обработку проводили в течение 15 минут, после чего смесь подвергали растворению в дистиллированной воде по примеру 1 (см. табл.1).Example 2. A mixture consisting of 0.2 g of betulin dipropionate and 1.8 g of AG was activated in a SPEX 8000 mill (CertiPrep Corp., USA) in a 40 ml steel drum with grinding media in the form of steel balls with a diameter of 6 mm and acceleration grinding media 8-10 g, loading balls - 60 g. The mechanical treatment was carried out for 15 minutes, after which the mixture was subjected to dissolution in distilled water according to example 1 (see table 1).

Пример 3. Смесь, состоящую из 0.2 г дипропоната бетулина и 1.8 г АГ, активировали в мельнице SPEX 8000 (CertiPrep Corp., США) в стальном барабане объемом 40 мл с мелющими телами в виде стальных шаров диаметром 6 мм и ускорением мелющих тел 8-10 g, загрузка шаров - 60 г. Механическую обработку проводили в течение 30 минут, после чего смесь подвергали растворению в дистиллированной воде по примеру 1 (см. табл.1).Example 3. A mixture consisting of 0.2 g of betulin diproponate and 1.8 g of AG was activated in a SPEX 8000 mill (CertiPrep Corp., USA) in a 40 ml steel drum with grinding bodies in the form of steel balls with a diameter of 6 mm and acceleration of grinding bodies 8- 10 g, loading balls - 60 g. Mechanical processing was carried out for 30 minutes, after which the mixture was subjected to dissolution in distilled water according to example 1 (see table 1).

Пример 4. Арабиногалактан массой 2 г активировали в мельнице SPEX 8000 (CertiPrep Corp., США) в стальном барабане объемом 40 мл с мелющими телами в виде стальных шаров диаметром 6 мм и ускорением мелющих тел 8-10 g, загрузка шаров - 60 г. При механической активации были отобраны пробы арабиногалактана и определены молекулярные массы (см. табл.2). По 0.02 г проб исходного и механически активированного арабиногалактана растворяли в 250 мл дистиллированной воды при 37°C в течение 24 часов. Затем проводили центрифугирование и фильтрование полученного раствора. Фильтрат подвергали испарению с помощью ротационного испарителя, и после удаления воды получали сухой остаток, при вторичном растворении которого в воде определяли молекулярную массу.Example 4. Arabinogalactan weighing 2 g was activated in a SPEX 8000 mill (CertiPrep Corp., USA) in a 40 ml steel drum with grinding media in the form of steel balls with a diameter of 6 mm and an acceleration of grinding media of 8-10 g, loading of balls - 60 g. During mechanical activation, arabinogalactan samples were taken and molecular weights were determined (see Table 2). Each 0.02 g sample of the starting and mechanically activated arabinogalactan was dissolved in 250 ml of distilled water at 37 ° C for 24 hours. Then centrifuged and filtered the resulting solution. The filtrate was evaporated using a rotary evaporator, and after removing water, a dry residue was obtained, the molecular weight of which was determined by the second dissolution of it in water.

В таблице 1 представлены данные по растворимости в воде механоактивированных смесей ДПБ-АГ.Table 1 presents data on the solubility in water of mechanically activated mixtures of DPB-AG.

Таблица 1Table 1 № п/пNo. p / p Смеси (композиции) ДПБ-АГ (1:9, масс.)Mixtures (compositions) of DPB-AG (1: 9, mass.) Внешний видAppearance Продолжительность механоактивации, минThe duration of mechanical activation, min Переход ДПБ в раствор, %The transition of DPB in solution,% 1one Механоактивированная смесь (15 мин)Mechanically activated mixture (15 min) ПорошокPowder 1010 20-2520-25 22 Механоактивированная смесь (30 мин)Mechanically activated mixture (30 min) ПорошокPowder 30thirty 20-2520-25

Из таблицы 1 видно, что увеличение времени механической активации не приводит к росту растворимости ДПБ и можно ограничиться временем механической обработки - 15 минут.From table 1 it is seen that an increase in the time of mechanical activation does not lead to an increase in the solubility of DPB and can be limited to the time of mechanical processing - 15 minutes.

В таблице 2 представлены сравнительные данные по содержанию ДПБ в воде при растворении механоактивированных в течение 15 минут смесей ДПБ с АГ и их физической смеси.Table 2 presents comparative data on the content of DPB in water when dissolving mixtures of DPB with AG and their physical mixture mechanically activated for 15 minutes.

Таблица 2table 2 Смеси (композиции) ДПБ-АГ (1:9, масс.)Mixtures (compositions) of DPB-AG (1: 9, mass.) Продолжительность растворения, чDuration of dissolution, h Концентрация ДПБ, мкг/млThe concentration of DPB, μg / ml Механоактивированная смесьMechanically activated mixture 1one 2,92.9 22 3,83.8 33 4,44.4 2121 5,35.3 2424 10,810.8 Физическая смесьPhysical mixture 2424 2,82,8

Из таблицы 2 следует, что после механической активации ДПБ с АГ содержание ДПБ в водном растворе возрастает почти в 4 раза, по сравнению с физической смесью, и составляет 10,8 мкг/мл.From table 2 it follows that after mechanical activation of DPB with AG, the content of DPB in the aqueous solution increases almost 4 times, compared with the physical mixture, and amounts to 10.8 μg / ml.

В таблице 3 приведены молекулярные массы исходного арабиногалактана и после механической активации (м/а).Table 3 shows the molecular weights of the starting arabinogalactan and after mechanical activation (m / a).

Таблица 3Table 3 № п/пNo. p / p   Средневесовая MwWeight Average Mw Среднечисловая MnNumber average Mn 1one АГ исходныйAH source 1.716Е+41.716E + 4 1.069Е+41.069E + 4 22 АГ после растворения и испарения растворителяAG after dissolution and evaporation of the solvent 1.721Е+41.721E + 4 1.189Е+41.189E + 4 33 АГ м/а 10 минAG m / a 10 min 1.288Е+41.288E + 4 0.726Е+40.726E + 4 4four АГ м/а 30 минAG m / a 30 min 1.095Е+41.095Е + 4 0.629Е+40.629E + 4 55 АГ м/а 10 мин после растворения и испарения растворителяAG m / a 10 min after dissolution and evaporation of the solvent 1.465Е+41.465Е + 4 1.027Е+41.027E + 4 66 АГ м/а 30 мин после растворения и испарения растворителяAG m / a 30 min after dissolution and evaporation of the solvent 1.526Е+41.526E + 4 1.071Е+41.071E + 4

Из таблицы 3 следует, что механическая обработка приводит к механокрегингу цепей полимера, как это наблюдалось в работе [Медведева Е.Н., Неверова Н.А., Федорова Т.Е., Бабкин В.А., Метелева Е.С., Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Хвостов М.В., Долгих М.П. Структурные превращения арабиногалактана из лиственницы сибирской при механохимической обработке и биологические свойства продуктов // Химия растительного сырья. 2009. №3. С.49-56] при механической обработке АГ в других мелющих аппаратах (другого типа и другой энергонапряженности). Тем не менее, после растворения в воде молекулярная масса АГ частично восстанавливается, и можно ожидать, что это не будет оказывать большого влияния на результат.From table 3 it follows that the mechanical treatment leads to mechanocring polymer chains, as was observed in the work [Medvedeva E.N., Neverova N.A., Fedorova T.E., Babkin V.A., Meteleva E.S., Dushkin A.V., Tolstikova T.G., Khvostov M.V., Dolgikh M.P. Structural transformations of arabinogalactan from Siberian larch during mechanochemical processing and biological properties of products // Chemistry of plant raw materials. 2009. No3. S.49-56] during the mechanical treatment of AG in other grinding devices (of a different type and different energy intensity). Nevertheless, after dissolution in water, the molecular weight of AG is partially restored, and it can be expected that this will not have a big impact on the result.

Можно ожидать, что при механической обработке образуется межмолекулярный комплекс ДПБ с АГ. На фиг.1 представлены дифрактограммы механоактивированных композиций ДПБ с AT 1:9 (по массе): 1 - после 5 мин механической активации, 2 - после 15 мин механической активации, 3 - после 30 мин механической активации. На кривой 1 (активации в течение 5 мин) еще видны рефлексы, присущие ДПБ, однако после активации в течение 15 мин (кривая 2) они сильно уширяются, а после 30 мин механической обработки практически исчезают. Исчезновение рефлексов ДПБ может свидетельствовать о распределении дипропионата бетулина в матрице арабиногалактана с образованием аморфного композита. Об этом же свидетельствуют данные дифференциальной сканирующей калориметрии. На кривой ДСК механоактивированной смеси ДПБ с АГ видны лишь «следы» пика плавления ДПБ. Наличие этого пика говорит о том, что, возможно, не все вещество перешло в аморфное состояние, либо часть вещества закристаллизовалась при нагревании. Тем не менее, отсутствие на кривой ДСК истинного пика плавления ДПБ свидетельствует об образовании при механической обработке довольно прочного композита ДПБ - АГ. Это может быть или диспергирование ДПБ до наноразмерного состояния с образованием однородной механической смеси с АГ, или распределение молекул (или ансамблей молекул) ДПБ в полимере, как это предполагалось для некоторых других низкомолекулярных лекарственных субстанций в работах [Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Толстиков Г.А., Метелева Е.С. Водорастворимая лекарственная композиция и способ ее получения // Патент РФ №2337710. 2008. Бюл. 31]. Стабильность такого композита при нагревании, по-видимому, обусловлена взаимодействием компонентов при механической активации.It can be expected that, during machining, an intermolecular complex of DPB with AG is formed. Figure 1 presents the diffraction patterns of mechanically activated DPB compositions with AT 1: 9 (by weight): 1 - after 5 minutes of mechanical activation, 2 - after 15 minutes of mechanical activation, 3 - after 30 minutes of mechanical activation. On curve 1 (activation for 5 min), the reflexes inherent in DPB are still visible, however, after activation for 15 min (curve 2) they are greatly broadened, and after 30 minutes of machining they practically disappear. The disappearance of the DPB reflexes may indicate the distribution of betulin dipropionate in the arabinogalactan matrix with the formation of an amorphous composite. This is also evidenced by the data of differential scanning calorimetry. On the DSC curve of a mechanically activated mixture of DPB with AG, only “traces” of the melting peak of DPB are visible. The presence of this peak suggests that, perhaps, not all of the substance passed into an amorphous state, or part of the substance crystallized upon heating. Nevertheless, the absence on the DSC curve of the true melting peak of DPB indicates the formation of a rather strong DPB - AG composite during machining. This can be either the dispersion of DPB to a nanoscale state with the formation of a homogeneous mechanical mixture with AG, or the distribution of molecules (or ensembles of molecules) of DPB in the polymer, as was assumed for some other low molecular weight drug substances in [Dushkin AV, Tolstikova T. G., Tolstikov G.A., Meteleva E.S. Water-soluble drug composition and method for its production // RF Patent No. 2337710. 2008. Bull. 31]. The stability of such a composite upon heating is apparently due to the interaction of the components during mechanical activation.

В ИК-спектрах смесей ДПБ с АГ в результате механической активации наблюдается уширение и снижение интенсивности полос в области валентных колебаний ν(O-H) (3200-3500 см^-1), ν(C=O) (1720 см^-1), ν(C-O) (1150 см^-1), что может быть вызвано аморфизацией ДПБ. Не наблюдалось достоверного сдвига полос ДПБ и АГ в механоактивированной смеси по сравнению с физической, чтобы можно было однозначно судить об образовании водородных связей между компонентами. Можно предположить, что связи между ДПБ и АГ в механоактивированных смесях осуществляются за счет Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, и образованию комплекса способствует разветвленная структура арабиногалактана.In the IR spectra of mixtures of DPB with AG as a result of mechanical activation, there is a broadening and decrease in the intensity of the bands in the region of stretching vibrations ν (OH) (3200-3500 cm ^-1 ), ν (C = O) (1720 cm ^-1 ), ν ( CO) (1150 cm ^-1 ), which may be caused by amorphization of DPB. There was no significant shift of the DPB and AG bands in the mechanically activated mixture compared to the physical one, so that it was possible to unambiguously judge the formation of hydrogen bonds between components. It can be assumed that the bonds between DPB and AG in mechanically activated mixtures are due to Van der Waals interactions, and the branched structure of arabinogalactan contributes to the formation of the complex.

Токсикологическое исследование.Toxicological research.

Проведенное токсикологическое исследование показало, что полученные механокомпозиты дипропионата бетулина с арабиногалактаном, так же как и индивидуальные вещества, в дозе 2000 мг/кг не являются ядовитыми и, согласно международной токсикологической классификации, их можно отнести к 4 классу малотоксичных веществ. Исследование фармакологической активности полученных комплексов в дальнейших экспериментах может представлять интерес для использования их в медицине.A toxicological study showed that the obtained mechanocomposites of betulin dipropionate with arabinogalactan, as well as individual substances, at a dose of 2000 mg / kg are not toxic and, according to the international toxicological classification, they can be attributed to class 4 low toxic substances. A study of the pharmacological activity of the obtained complexes in further experiments may be of interest for their use in medicine.

Изучение противоопухолевой активности комплекса дипропионата бетулина с арабиногалактаном на клетках асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) в экспериментах in vitro.The study of the antitumor activity of a complex of betulin dipropionate with arabinogalactan on Ehrlich ascites adenocarcinoma cells (AKE) in vitro.

Противоопухолевую активность МА композитов ДПБ с АГ в сравнении с чистыми ДПБ и АГ определяли по данным ионного гомеостаза и доли апоптотических и некротических асцитных клеток асцитной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) через 24 ч после воздействия препаратов.The antitumor activity of MA of DPB composites with AG compared with pure DPB and AG was determined according to ion homeostasis and the proportion of apoptotic and necrotic ascitic ascitic Ehrlich adenocarcinoma cells (AKE) 24 hours after drug exposure.

Оценку ионного гомеостаза проводили с учетом концентрации ионов натрия, калия, кальция через 3 ч после добавления препаратов. Для определения влияния исследуемых веществ на параметры ионного гомеостаза отмытые асцитные клетки инкубировали в готовой среде для культивирования с концентрацией исследуемых веществ 0,5 мг/мл в течение 3 ч при температуре 37°C, 5% CO₂ и влажности 6%. Для определения уровня внутриклеточного кальция использовали флуоресцентный зонд GreenCa²⁺, натрия - SBFI-AM, калия - PBFI-AM. Отмытые бесцветным раствором Хенкса клетки инкубировали с зондом в конечной концентрации 0,05 мг/мл в течение 30 мин при 37°C, после чего их отмывали от избытка красителя. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитометре Beckman Coulter FC500. Собственную флуоресценцию клеток без красителя принимали за нулевую.The assessment of ionic homeostasis was carried out taking into account the concentration of sodium, potassium, calcium ions 3 hours after the addition of drugs. To determine the effect of the studied substances on the parameters of ionic homeostasis, washed ascites cells were incubated in a prepared culture medium with a concentration of the studied substances of 0.5 mg / ml for 3 h at a temperature of 37 ° C, 5% CO ₂ and 6% humidity. To determine the level of intracellular calcium, a GreenCa ²⁺ fluorescent probe was used, sodium - SBFI-AM, potassium - PBFI-AM. The cells washed with a colorless Hanks solution were incubated with a probe at a final concentration of 0.05 mg / ml for 30 min at 37 ° C, after which they were washed from excess dye. Fluorescence intensity was measured on a Beckman Coulter FC500 flow cytometer. The intrinsic fluorescence of cells without dye was taken as zero.

Для определения доли апоптотических и некротических клеток отмытые асцитные клетки инкубировали в растворе Хенкса, содержащем флуоресцентные красители - Hoechst 33342 (1 мг/мл) и Propidium iodide (1 мг/мл), 10-15 мин при комнатной температуре. Количество апоптотических (ярко голубых), некротических (красных и красно-голубых) и слабо светящихся голубым живых клеток подсчитывали в режиме флуоресценции, общее количество клеток - в световом режиме в том же поле зрения. Рассчитывали процентное соотношение всех трех фракций клеток.To determine the proportion of apoptotic and necrotic cells, washed ascites cells were incubated in a Hanks solution containing fluorescent dyes - Hoechst 33342 (1 mg / ml) and Propidium iodide (1 mg / ml), 10-15 min at room temperature. The number of apoptotic (bright blue), necrotic (red and red-blue) and weakly glowing blue living cells was calculated in the fluorescence mode, the total number of cells in the light mode in the same field of view. The percentage of all three cell fractions was calculated.

Противоопухолевую активность исследуемых веществ оценивали по их способности вызывать апоптоз и некроз в клетках АКЭ.The antitumor activity of the test substances was evaluated by their ability to cause apoptosis and necrosis in AKE cells.

Таблица 4Table 4 Показатели выживаемости клеток АКЭ *AKE cell survival rates * ОбразецSample АГAg ДПБDPB МА композит ДПБ+АГMA composite DPB + AG КонтрольThe control Некроз, %Necrosis,% 6,6±0,86.6 ± 0.8 3,9±0,33.9 ± 0.3 5,4±0,75.4 ± 0.7 7,3±0,57.3 ± 0.5 Апоптоз, %Apoptosis,% 16,7±1,816.7 ± 1.8 25,0±3,125.0 ± 3.1 41±5,441 ± 5,4 3,1±0,83.1 ± 0.8 Общая доля элиминирующихся клетокThe total proportion of eliminated cells 23,3±2,623.3 ± 2.6 28,9±3,428.9 ± 3.4 46,4±6,146.4 ± 6.1 10,4±1,310.4 ± 1.3 Примечание: * - достоверность отличий от контроля, Р<0,05.Note: * - significance of differences from control, P <0.05.

Из таблицы 4 видно, что механокомпозит ДПБ с АГ наиболее эффективно подавлял рост раковых клеток в культуре, вызывая апоптоз по сравнению с контрольными клетками, клетками с ДПБ и с АГ. Так, доля асцитных клеток в состоянии апоптоза в контрольной пробе составила 3,1±2,8%, в состоянии некроза - 7,3±0,5%, общая доля элиминирующихся клеток АКЭ составила 10,4±1,3%. При этом доля элиминирующихся клеток АКЭ в состоянии апоптоза увеличилась под влиянием всех исследуемых веществ: в присутствии АГ более чем в 5 раз, в присутствии ДПБ - более чем в 8 раз, а в присутствии механокомпозита ДПБ с АГ - более чем в 13 раз (46,4±6,1%).Table 4 shows that the mechanocomposite of DPB with AH most effectively suppressed the growth of cancer cells in culture, causing apoptosis compared with control cells, cells with DPB and with AH. Thus, the proportion of ascitic cells in the state of apoptosis in the control sample was 3.1 ± 2.8%, in the state of necrosis - 7.3 ± 0.5%, the total proportion of eliminated AKE cells was 10.4 ± 1.3%. Moreover, the proportion of eliminated AKE cells in the state of apoptosis increased under the influence of all the studied substances: in the presence of AH more than 5 times, in the presence of DPB more than 8 times, and in the presence of a mechanocomposite of DPB with AH more than 13 times (46 , 4 ± 6.1%).

Для выявления возможных механизмов действия исследуемых веществ определяли изменение содержания кальция, натрия и калия в клетках АКЭ. Популяцию асцитных клеток в контрольных образцах делили на 2 фракции: с высокой и сниженной концентрацией катионов кальция. Исследуемые вещества - механокомпозит ДПБ с АГ, ДПБ и АГ уменьшали долю клеток с высокой концентрацией кальция, что свидетельствовало о подавлении уровня пролиферации асцитных клеток (фиг. 2 а).To identify possible mechanisms of action of the studied substances, we determined the change in the content of calcium, sodium, and potassium in AKE cells. The ascites cell population in the control samples was divided into 2 fractions: with a high and reduced concentration of calcium cations. The studied substances, the mechanocomposite of DPB with AH, DPB, and AH, reduced the proportion of cells with a high concentration of calcium, which indicated the suppression of the level of proliferation of ascites cells (Fig. 2 a).

Все исследуемые вещества снижали также концентрацию внутриклеточного калия и натрия, подтверждая запуск апоптоза клеток, причем в большей степени содержание катионов калия в клетке снижалось под воздействием механокомпозита ДПБ с АГ (фиг. 2 б, в).All studied substances also reduced the concentration of intracellular potassium and sodium, confirming the initiation of cell apoptosis, and to a greater extent the content of potassium cations in the cell decreased under the influence of the mechanocomposite DPB with AH (Fig. 2 b, c).

Таким образом, благодаря созданию противоопухолевой композиции дипропионата бетулина с арабиногалактаном расширен ассортимент фармакологически активных композиций на основе производных бетулина и природных полимерных носителей.Thus, thanks to the creation of an antitumor composition of betulin dipropionate with arabinogalactan, the range of pharmacologically active compositions based on betulin derivatives and natural polymer carriers has been expanded.

Claims (2)

1. Противоопухолевая композиция производного бетулина с биосовместимым носителем, отличающаяся тем, что в качестве производного бетулина включает дипропионат бетулина, а в качестве биосовместимого носителя - арабиногалактан при следующем соотношении компонентов, масс. %: дипропионат бетулина - 10%, арабиногалактан - остальное, при этом ее получают механической активацией дипропионата бетулина с арабиногалактаном.1. The antitumor composition of a derivative of betulin with a biocompatible carrier, characterized in that as a derivative of betulin includes betulin dipropionate, and as a biocompatible carrier - arabinogalactan in the following ratio of components, mass. %: betulin dipropionate - 10%, arabinogalactan - the rest, while it is obtained by mechanical activation of betulin dipropionate with arabinogalactan. 2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что представляет собой порошок белого цвета с желтоватым оттенком. 2. The composition according to claim 1, characterized in that it is a white powder with a yellowish tinge.

Images