RU2524426C2 - ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns - Google Patents
ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns Download PDFInfo
- Publication number
- RU2524426C2 RU2524426C2 RU2011121044/10A RU2011121044A RU2524426C2 RU 2524426 C2 RU2524426 C2 RU 2524426C2 RU 2011121044/10 A RU2011121044/10 A RU 2011121044/10A RU 2011121044 A RU2011121044 A RU 2011121044A RU 2524426 C2 RU2524426 C2 RU 2524426C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rns
- cattle
- bvdv
- virus
- chimeric
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 123
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 107
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 title claims abstract description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 claims abstract description 126
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 114
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 93
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 89
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 34
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 241000282815 Antilocapra americana Species 0.000 claims description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 241001139409 Pronghorn antelope pestivirus Species 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 abstract 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 102
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 100
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 47
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 29
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 15
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 15
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 8
- 241000282819 Giraffa Species 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- -1 coatings Substances 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 3
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 3
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 3
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N (-)-Menthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@H]1O NOOLISFMXDJSKH-KXUCPTDWSA-N 0.000 description 2
- PJRSUKFWFKUDTH-JWDJOUOUSA-N (2s)-6-amino-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]hexanoyl]amino]propanoyl]amino]acetyl]amino]propanoyl Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O PJRSUKFWFKUDTH-JWDJOUOUSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 2
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 2
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101000984570 Enterobacteria phage T4 Baseplate wedge protein gp53 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000997743 Escherichia phage Mu Serine recombinase gin Proteins 0.000 description 2
- 101000830028 Escherichia phage Mu Uncharacterized protein gp25 Proteins 0.000 description 2
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 101800001014 Non-structural protein 5A Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 238000010983 kinetics study Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 108010021753 peptide-Gly-Leu-amide Proteins 0.000 description 2
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FTLYMKDSHNWQKD-UHFFFAOYSA-N (2,4,5-trichlorophenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl FTLYMKDSHNWQKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N (2s,3s,4s,5r,6r)-6-[[(3s,4s,4ar,6ar,6bs,8r,8ar,12as,14ar,14br)-8a-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3-[(2s,3r,4s,5r,6s)-5-[(2s,3r,4s,5r)-4-[(2s,3r,4r)-3,4-dihydroxy-4-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxy-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-5-[(3s,5s, Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@H](O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@H]5CC(C)(C)CC[C@@]5([C@@H](C[C@@]4(C)[C@]3(C)CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)O)C(=O)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H]([C@@H]([C@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@](O)(CO)CO3)O)[C@H](O)CO2)O)[C@H](C)O1)O)O)OC(=O)C[C@@H](O)C[C@H](OC(=O)C[C@@H](O)C[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](CO)O1)O)[C@@H](C)CC)C(O)=O)[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DRHZYJAUECRAJM-DWSYSWFDSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFMFNYKEUDLDTL-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)C(F)(F)F YFMFNYKEUDLDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGUZGTVOIAKKC-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,2-tetrafluoroethane Chemical compound FCC(F)(F)F LVGUZGTVOIAKKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IZQAUUVBKYXMET-UHFFFAOYSA-N 2-bromoethanamine Chemical compound NCCBr IZQAUUVBKYXMET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 3-Methylhistidine Natural products CN1C=NC(CC(N)C(O)=O)=C1 BRMWTNUJHUMWMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- RFRMMZAKBNXNHE-UHFFFAOYSA-N 6-[4,6-dihydroxy-5-(2-hydroxyethoxy)-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-5-(2-hydroxypropoxy)oxane-3,4-diol Chemical compound CC(O)COC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OCCO)C(O)OC1CO RFRMMZAKBNXNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000283726 Bison Species 0.000 description 1
- 241001118702 Border disease virus Species 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 101000918303 Bos taurus Exostosin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 101100402795 Caenorhabditis elegans mtl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 235000005273 Canna coccinea Nutrition 0.000 description 1
- 240000008555 Canna flaccida Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000186811 Erysipelothrix Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- 241000282818 Giraffidae Species 0.000 description 1
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000243976 Haemonchus Species 0.000 description 1
- 108010034145 Helminth Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000606831 Histophilus somni Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920001479 Hydroxyethyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 1
- DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N N(6)-acetyl-L-lysine Chemical compound CC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O DTERQYGMUDWYAZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N N(pros)-methyl-L-histidine Chemical compound CN1C=NC=C1C[C@H](N)C(O)=O JDHILDINMRGULE-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N N-formyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC=O PYUSHNKNPOHWEZ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241001147660 Neospora Species 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000243795 Ostertagia Species 0.000 description 1
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000365689 Pudu Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000589157 Rhizobiales Species 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 241001481789 Rupicapra Species 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- 208000012936 Sheep disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 239000004147 Sorbitan trioleate Substances 0.000 description 1
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 241000982634 Tragelaphus eurycerus Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241001416177 Vicugna pacos Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 241001080519 Zera Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002718 aborted fetus Anatomy 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229940041011 carbapenems Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940097362 cyclodextrins Drugs 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 229940112141 dry powder inhaler Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 108700030379 flavivirus NS3 Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006057 immunotolerant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007915 intraurethral administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 229960004873 levomenthol Drugs 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 239000002353 niosome Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000003182 parenteral nutrition solution Substances 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 150000007660 quinolones Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 229940085605 saccharin sodium Drugs 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019337 sorbitan trioleate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000391 sorbitan trioleate Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940115922 streptococcus uberis Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000009974 thixotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003871 white petrolatum Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
- C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок. При этом указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка. Также описаны способы и наборы для лечения или предупреждения распространения инфекции, вызванной вирусом диареи крупного рогатого скота, а также способы и наборы для дифференцировки между вакцинированными животными и животными, инфицированными вирусом дикого типа. Изобретение может быть использовано в качестве иммуногенных композиций и вакцин в животноводстве. 12 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 5 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к новым химерным пестивирусам и к их применению в иммуногенных композициях и вакцинах. Оно также относится к способам и наборам для лечения или предупреждения распространения инфекции вирусом диареи крупного рогатого скота. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению химерных пестивирусов в способах и наборах для дифференцировки между вакцинированными животными и животными, инфицированными вирусом дикого типа.
Предшествующий уровень техники
Пестивирусы, включая вирус диареи крупного рогатого скота (вирус BVD или BVDV), были выделены из нескольких видов животных, как домашних, так и диких. Идентифицированные хозяева BVDV включают буйвола, антилопу, северного оленя и разные виды оленя, в то время как уникальные виды пестивируса были идентифицированы у жирафов и вилорогой антилопы. BVDV представляет собой небольшой РНК-вирус из семейства Flaviviridae. Он является близкородственным в отношении других пестивирусов, которые являются возбудителями пограничной болезни у овец и классической свиной лихорадки у свиней. Недавно в качестве возбудителя фетальной инфекции поросят в Австралии был идентифицирован дивергентный пестивирус, названный пестивирус Бунгованна (Bungowannah).
Заболевание, вызванное BVDV, в частности, у крупного рогатого скота, является широко распространенным и может быть экономически разрушительным. Инфекция BVDV у крупного рогатого скота может приводить к проблемам при размножении и может вызывать выкидыши или преждевременные роды. BVDV способен проходить через плаценту беременных самок крупного рогатого скота и может приводить к рождению хронически инфицированных (PI) телят, которые являются иммунотолерантными в отношении данного вируса и устойчиво виремическими в течение остальной части их жизни. Инфицированный крупный рогатый скот также может проявлять «вирусную диарею», характеризующуюся повышенной температурой, диареей, кашлем и образованием язв на слизистой оболочке пищеварительной системы. Эти хронически инфицированные животные служат источником распространения вируса в стаде для последующих вспышек вирусной диареи и сильно предрасположены к инфекции микроорганизмами, ответственными за возникновение кишечных заболеваний или пневмонии.
BVDV классифицируют на один из двух биотипов. Вирусы биотипа «ср» индуцируют цитопатическое действие на культивируемые клетки, тогда как вирусы нецитопатического или «ncp» биотипа не индуцируют такое действие. Кроме того, распознают два главных генотипа (тип 1 и 2), оба из которых, как было показано, вызывают ряд клинических синдромов.
Вирионы BVDV имеют диаметр от 40 до 60 нм. Нуклеокапсид BVDV состоит из одной молекулы РНК и белка капсида С. Данный нуклеокапсид окружен липидной мембраной с двумя гликопротеинами, Е1 и Е2, заякоренными в ней. Третий гликопротеин, Erns, является слабо ассоциированным с данной оболочкой. Геном BVDV имеет длину приблизительно 12,5 тысяч пар оснований и содержит одну открытую рамку считывания, расположенную между 5' и 3' нетранслируемыми областями (NTR). Полипротеин приблизительно 438 кДа транслируется с этой открытой рамки считывания и подвергается процессингу клеточными и вирусными протеазами по меньшей мере на одиннадцать структурных и неструктурных (NS) вирусных белков (Tautz, et al., J. Virol. 71:5415-5422 (1997); Xu, et al., J. Virol. 71:5312-5322 (1997); Elbers, et al., J. Virol. 70:4131-4135 (1996); и Wiskerchen, et al., Virology 184:341-350 (1991)). Порядок генома BVDV представляет собой p20/Npro, р14/С, gp48/Erns, gp25/Е1, gp53/Е2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, p58/NS5A и p75/NS5B. Три белка оболочки, gp48/Erns, gp25/Е1 и gp53/Е2, являются сильно гликозилированными. Ernz (ранее названный Е0 или gp48) образует гомодимеры, ковалентно связанные дисульфидами. Отсутствие гидрофобной мембранной якорной области свидетельствует о том, что Erns является слабоассоциированным с данной оболочкой. Erns индуцирует высокие титры антител у инфицированного крупного рогатого скота, но антисыворотка имеет ограниченную активность, нейтрализующую вирус.
Среди доступных в настоящее время вакцин против BVDV имеются вакцины, которые содержат химически инактивированный вирус дикого типа. Эти вакцины обычно требуют введения множества доз и приводят к кратковременному иммунному ответу; они также не защищают против переноса вируса плоду. Сообщали о субъединичной вакцине на основе очищенного белка Е2 у овец. Несмотря на то, что эта вакцина, по-видимому, защищает плоды от инфицирования, защита ограничена только гомологичным штаммом вируса и нет корреляции между титрами антител и защитой.
Модифицированные живые (ML) вакцины против BVDV продуцировали с использованием вируса, который был аттенуирован повторными пассированиями в клетках животных, являющихся представителями крупного рогатого скота или свиней, или посредством химически индуцированных мутаций, которые придают данному вирусу чувствительный к температуре фенотип. Оказалось, что одной дозы вакцины на основе MLV BVDV достаточно для обеспечения защиты от инфекции, и длительность иммунитета у вакцинированного крупного рогатого скота может сохраняться годами. Кроме того, сообщали о перекрестной защите при использовании вакцин на основе MLV (Martin, et al., In "Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases", 75:183 (1994)). Однако существующие вакцины на основе MLV не обеспечивают возможность дифференцировки вакцинированных животных от животных, инфицированных естественным путем.
Таким образом, очевидно, что существует потребность в новых вакцинах для контролирования распространения BVDV. Такая вакцина(ы) может оказаться бесценной в будущих национальных или региональных программах по искоренению BVDV и также может быть объединена с другими вакцинами крупного рогатого скота, представляя существенное достижение в данной промышленности. Более эффективной вакциной для контролирования и мониторинга распространения BVDV является «маркерная» вакцина. Такая вакцина может либо содержать дополнительную антигенную детерминанту, которая не присутствует в вирусе дикого типа, либо не иметь антигенную детерминанту, которая присутствует в вирусе дикого типа. В отношении первой, у вакцинированных животных устанавливается иммунный ответ к «маркерной» иммуногенной детерминанте, тогда как у невакцинированных животных он не устанавливается. Используя иммунологический анализ, направленный против маркерной детерминанты, вакцинированных животных можно отличить от невакцинированных животных, инфицированных естественным образом, по присутствию антител к этой маркерной детерминанте. В случае последней стратегии, у животных, инфицированных вирусом дикого типа, устанавливается иммунный ответ к маркерной детерминанте, тогда как у неинфицированных вакцинированных животных не устанавливается в результате того, что данная детерминанта не присутствует в маркированной вакцине. Используя иммунологический анализ, направленный против маркерной детерминанты, инфицированных животных можно отличить от вакцинированных неинфицированных животных. В обоих случаях посредством отбраковки инфицированных животных стадо с течением времени может освободиться от BVDV. Помимо пользы устранения угрозы заболевания BVDV, сертификация стада как не содержащего BVDV имеет непосредственную экономическую пользу свободы торговли.
Краткое изложение сущности изобретения
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок, и где указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный; синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, как он описан выше, где гетерологичный Erns белок указанного химерного пестивируса или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка происходят из пестивируса, выбранного из группы, состоящей из пестивируса северного оленя, пестивируса жирафа и пестивируса вилорогой антилопы.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, как он описан выше, где гетерологичный Erns белок указанного химерного пестивируса имеет по меньшей мере один Erns эпитоп, который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложен химерный пестивирус, как он описан выше, где в гетерологичном Erns белке указанного химерного пестивируса отсутствует по меньшей мере один Erns эпитоп, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена культура химерного пестивируса, как он описан выше.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена линия клеток или клетка-хозяин, содержащие химерный пестивирус, как он описан выше.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена молекула полинуклеотида, кодирующая химерный пестивирус, как он описан выше.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая данный химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.
В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, где ветеринарно приемлемый носитель представляет собой адъювант.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, где указанный химерный вирус является живым аттенуированным.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, где указанный химерный пестивирус является инактивированным.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, как она описана выше, дополнительно содержащая один или более чем один дополнительный антиген, полезный для лечения или предупреждения распространения одного или более чем одного дополнительного патогенного микроорганизма у животного.
В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложена иммуногенная композиция, содержащая молекулу полинуклеотида, кодирующую химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, где ветеринарно приемлемый носитель представляет собой адъювант.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, где указанный химерный пестивирус является живым аттенуированным.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, где указанный химерный пестивирус является инактивированным.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, как она описана выше, дополнительно содержащая один или более чем один дополнительный антиген, полезный для лечения или предупреждения распространения одного или более чем одного дополнительного патогенного микроорганизма у животного.
В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложена вакцина, содержащая полинуклеотидную молекулу, кодирующую химерный пестивирус, как он описан выше, и ветеринарно приемлемый носитель.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен набор, содержащий в по меньшей мере одном контейнере вакцину, содержащую химерный пестивирус, как он описан выше.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ лечения или предупреждения распространения инфекции вирусом диареи крупного рогатого скота, где животному вводят вакцину, содержащую химерный пестивирус, как он описан выше.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ вакцинирования животного, где указанному животному вводят пестивирусную DIVA-вакцину (вакцину, разработанную с возможностью дифференцировки инфицированных животных от вакцинированных), и где указанная пестивирусная DIVA-вакцина содержит химерный пестивирус, как он описан выше, где дополнительно указанный химерный пестивирус имеет по меньшей мере один Erns эпитоп, который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
В отдельном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ вакцинирования животного, где указанному животному вводят пестивирусную DIVA-вакцину, и где указанная DIVA-вакцина содержит химерный пестивирус, как он описан выше, где дополнительно в указанном химерном пестивирусе отсутствует по меньшей мере один Еrns эпитоп, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ дифференцировки между животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, и животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, где животное, вакцинированное указанной вакциной, генерирует антитела к по меньшей мере одному Erns эпитопу, который присутствует в химерном пестивирусе указанной вакцины, но который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, включающий стадии:
а) получения образца сыворотки от животных;
б) проведения анализа указанных образцов на присутствие или отсутствие антител;
в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной; и
г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV дикого типа.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен способ дифференцировки между животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, и животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, где животное, инфицированное вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, генерирует антитела к по меньшей мере одному Erns эпитопу, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе указанной вакцины, включающий стадии:
а) получения образца сыворотки от животных;
б) проведения анализа указанных образцов на присутствие или отсутствие антител;
в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV дикого типа; и
г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предложен диагностический набор для дифференцировки между животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, и животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, содержащий реагенты, способные к обнаружению антител к по меньшей мере одному Erns эпитопу, который присутствует в химерном пестивирусе данной вакцины, но который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложен диагностический набор для дифференцировки между животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, и животным, вакцинированным вакциной, содержащей химерный пестивирус, как он описан выше, содержащий реагенты, способные к обнаружению антител к по меньшей мере одному Erns эпитопу, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе данной вакцины.
В еще одном воплощении согласно настоящему изобретению предложено антитело, которое распознает эпитоп Erns, который присутствует в химерном пестивирусе, как он описан выше, но который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
В другом воплощении согласно настоящему изобретению предложено антитело, которое распознает эпитоп, присутствующий в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе, как он описан выше.
В другом воплощении химерный пестивирус, как он здесь описан, используют в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекций, вызванных BVDV.
Подробное описание изобретения
Следующие определения можно применять в отношении терминов, используемых при описании воплощений данного изобретения. Следующими определениями заменяют любые противоречащие определения, содержащиеся в каждом отдельном источнике, включенном сюда посредством ссылки.
Если здесь не определено иначе, научные и технические термины, используемые в контексте настоящего изобретения, должны иметь значения, которые наиболее понятны обычным специалистам в данной области. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе должны включать множественное число, и термины во множественном числе должны включать единственное число.
Термин «аминокислота», как он использован здесь, относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, которые функционируют способом, аналогичным аминокислотам, встречающимся в природе. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также те аминокислоты, которые позднее модифицируются, например гидроксипролин, карбоксиглутамат и O-фосфосерин. Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот, аминокислоты, не являющиеся природными, такие как a- и a-двухзамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты, также могут быть подходящими компонентами для полипептидов по настоящему изобретению. Примеры нестандартных аминокислот включают 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,N-триметиллизин, ε-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты.
Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же самую базовую химическую структуру, что и аминокислота, встречающаяся в природе, то есть углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и группу R. Типичные аналоги аминокислот включают, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид и метионин метилсульфония. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют ту же самую основную химическую структуру, что и аминокислота, встречающаяся в природе. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, имеющим структуру, которая отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которая функционирует аналогичным образом, что и аминокислота, встречающаяся в природе.
Аминокислоты могут здесь быть названы либо их общепринятыми трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (Международный союз теоретической и прикладной химии - Международный союз биохимии).
Подразумевается, что термин «животное», как он использован здесь, включает любое животное, которое является чувствительным к инфекциям BVDV, включая, но не ограничиваясь видами жвачных животных, овец, коз и свиней, как одомашненных, так и диких.
Термин «антитело» или «антитела», как он использован здесь, относится к молекуле иммуноглобулина, способной к связыванию с антигеном посредством распознавания эпитопа. Антитела могут быть поликлональной смесью или моноклональными. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, происходящими из естественных источников или из рекомбинантных источников, или могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела могут существовать в ряде форм, включая, например, такие как Fv, Fab', F(ab')2, а также в виде одиночных цепей.
Термин «антиген», как он использован здесь, относится к молекуле, которая содержит один или более чем один эпитоп (линейный, конформационный или оба), который при воздействии на субъекта будет индуцировать иммунный ответ, который является специфичным в отношении этого антигена. Термин «антиген» может относиться к аттенуированным, инактивированным или модифицированным живым бактериям, вирусам, грибам, паразитам или другим микробам. Термин «антиген», как он использован здесь, также может относиться к субъединичному антигену, который является отдельным и разобщен от целого организма, с которым данный антиген ассоциирован в природе. Термин «антиген» также может относиться к антителам, таким как антиидиотипические антитела или их фрагменты, и к мимеотопам синтетических пептидов, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп). Термин «антиген» также может относиться к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, как, например, в подходах по иммунизации ДНК.
Термины «BVDV», «изоляты BVDV» или «штаммы BVDV», как они использованы здесь, относятся к вирусам диареи крупного рогатого скота, включая, но не ограничиваясь типом I и типом II, которые состоят из вирусного генома, ассоциированных белков и других химических компонентов (таких как липиды). Специалистам в данной области техники известен ряд вирусов диареи крупного рогатого скота типа I и типа II, и они доступны, например, в Американской коллекции типовых культур (АТТС®). Вирус диареи крупного рогатого скота имеет геном в форме РНК. РНК может подвергаться обратной транскрипции в ДНК для использования в клонировании. Таким образом, сделанные здесь ссылки на нуклеиновую кислоту и последовательности вируса диареи крупного рогатого скота, охватывают как последовательности вирусной РНК, так и последовательности ДНК, происходящие из последовательностей данной вирусной РНК.
Термины «линия клеток» или «клетка-хозяин», как они использованы здесь, означают прокариотическую или эукариотическую клетку, в которой вирус может реплицироваться и/или сохраняться.
Термин «химерный» или «химера», как он использован здесь, означает микроорганизм, например вирус, содержащий генетические или физические компоненты, происходящие из более чем одного предшественника.
Термин «культура», как он использован здесь, означает популяцию клеток или микроорганизмов, растущую в отсутствие других видов или типов.
Термин «DIVA», как он использован здесь, означает вакцину, которая способна дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных.
«Эпитоп» представляет собой специфичный сайт антигена, который связывается с рецептором Т-клетки или со специфичным антителом и обычно содержит от примерно 3 аминокислотных остатков до примерно 20 аминокислотных остатков.
Термин «гетерологичный», как он использован здесь, означает происходящий из другого вида или штамма.
Термин «гомологичный», как он использован здесь, означает происходящий из того же самого вида или штамма.
Термин «иммуногенная композиция», как он использован здесь, означает композицию, которая генерирует иммунный ответ (то есть имеет иммуногенную активность), когда ее вводят животному саму по себе или с фармацевтически приемлемым носителем. Иммунный ответ может быть клеточным иммунным ответом, опосредованным главным образом цитотоксическими Т-клетками, или гуморальным иммунным ответом, опосредованным главным образом хелперными Т-клетками, которые, в свою очередь, активируют В-клетки, приводя к продуцированию антител.
Термин «патоген» или «патогенный микроорганизм», как он использован здесь, означает микроорганизм, например вирус, бактерию, гриб, простейшее или гельминт, который способен индуцировать или вызывать заболевание, болезнь или аномальное состояние у животного-хозяина.
Термин «пестивирус», как он использован здесь, означает РНК-вирус из рода Pestivirus семейства Flaviviridae. Пестивирусы включают, без ограничения, следующие: BVDV (тип 1 и тип 2), вирус классической чумы свиней (CSFV) и вирус пограничной болезни овец (BDV), а также пестивирусы, выделенные из таких видов как дикий кабан, буйвол, антилопа канна, бизон, альпака, олень пуду, бонго, разные виды оленей, жираф, северный олень, серна и вилорогая антилопа (Vilcekand Nettleton; Vet Microbiol. 116:1-12 (2006)).
Термин «полинуклеотидная молекула», как он использован здесь, означает органическую полимерную молекулу, состоящую из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в цепь. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) являются примерами полинуклеотидов с различной биологической функцией.
Термины «предупреждать», «предупреждающий» или «предупреждение» и тому подобное, как они использованы здесь, означают ингибирование репликации микроорганизма, ингибирование передачи микроорганизма или ингибирование внедрения микроорганизма в хозяина. Эти термины и им подобные, как они использованы здесь, также могут означать ингибирование или блокирование одного или более чем одного признака или симптома инфекции.
Термин «терапевтически эффективное количество», как он использован здесь, означает количество микроорганизма, или субъединичного антигена, или полипептидов, или молекул полинуклеотидов и их комбинаций, которое является достаточным для индуцирования иммунного ответа у субъекта, которому его вводят. Иммунный ответ может включать, без ограничения, индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета.
Термины «лечить», «лечащий» или «лечение» и тому подобное, как они использованы здесь, означают уменьшение или устранение инфекции микроорганизмом. Эти термины и им подобные, как они использованы здесь, также могут означать уменьшение репликации микроорганизма, уменьшение передачи микроорганизма или уменьшение способности микроорганизма к внедрению его в хозяина. Эти термины и им подобные, как они использованы здесь, также могут означать уменьшение, улучшение или устранение одного или более чем одного признака или симптома инфекции микроорганизмом или ускорение выздоровления от инфекции микроорганизмом.
Термины «вакцина» и «вакцинная композиция», как они использованы здесь, означают композицию, которая предупреждает или уменьшает инфекцию или которая предупреждает или ослабляет один или более чем один признак или симптом инфекции. Данные защитные эффекты вакцинной композиции против патогена обычно достигаются индуцированием у субъекта иммунного ответа, либо клеточно-опосредованного, либо гуморального иммунного ответа, либо комбинации их обоих. Говоря в общем, устранение или снижение распространения инфекции, уменьшение интенсивности признаков или симптомов или ускоренное устранение микроорганизма из инфицированных субъектов указывают на защитные эффекты вакцинной композиции. Вакцинные композиции по настоящему изобретению обеспечивают защитные эффекты против инфекций, вызванных BVDV.
Термин «вариант», как он использован здесь, относится к производному данной белковой и/или генной последовательности, где полученная последовательность по существу является той же, что и данная последовательность, не считая мутационных различий. Указанные различия могут быть встречающимися в природе или созданными синтетически либо генетически.
Термин «ветеринарно приемлемый носитель», как он использован здесь, относится к веществам, которые находятся в пределах объема надежной медицинской оценки, подходит для использования в контакте с тканями животных без нежелательной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного, соответствует приемлемому отношению польза:риск и является эффективным для его намеченного применения.
Следующее описание приведено для того, чтобы помочь специалистам в данной области техники воплотить настоящее изобретение на практике. Тем не менее, данное описание не следует истолковывать как ограничивающее настоящее изобретение ненадлежащим образом, поскольку обычные специалисты в данной области могут сделать модификации и изменения в обсуждаемых здесь воплощениях без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.
ВИРУСЫ. ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ И ВАКЦИНЫ
Согласно настоящему изобретению предложены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие один или более чем один химерный пестивирус, где указанные химерные пестивирусы включают вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок, но где указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка. Химерный пестивирус может быть выбран из группы, состоящей из химер BVDV/пестивирус северного оленя, BVDV/пестивирус жирафа и BVDV/пестивирус вилорогой антилопы, но не ограничен ими.
В одном воплощении химерный вирус на основе BVDV/пестивируса жирафа представляет собой штамм, депонированный как UC 25547 в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС®), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, США, которому присвоен номер депонирования в АТСС® РТА-9938. В одном воплощении химерный вирус на основе BVDV/пестивируса вилорогой антилопы представляет собой штамм, депонированный как UC 25548 в АТСС®, которому присвоен номер депонирования в АТСС® РТА-9939. В одном воплощении химерный вирус на основе BVDV/пестивируса северного оленя представляет собой штамм, депонированный как UC 25549 в АТСС®, которому присвоен номер депонирования АТСС® РТА-9940.
Химерные пестивирусы по настоящему изобретению можно размножать в клетках, линиях клеток и клетках-хозяевах. Указанные клетки, линии клеток или клетки-хозяева могут представлять собой, например, без ограничения, клетки млекопитающих и клетки организмов, не являющихся млекопитающими, включая клетки насекомых и растений. Клетки, линии клеток и клетки-хозяева, в которых можно размножать химерные пестивирусы по настоящему изобретению, хорошо известны и доступны обычным специалистам в данной области техники.
Химерные пестивирусы по настоящему изобретению можно ослабить или инактивировать перед применением в иммуногенной композиции или вакцине. Способы аттенуации и инактивации хорошо известны специалистам в данной области техники. Способы аттенуации включают, без ограничения, серийный пассаж в культуре клеток на подходящей линии клеток, ультрафиолетовое облучение и химический мутагенез. Способы инактивации включают, без ограничения, обработку формалином, бета-проприолактоном (BPL) или бинарным этиленимином (ВЕ1) или другие способы, известные специалистам в данной области техники.
Инактивацию формалином можно проводить смешиванием суспензии данного вируса с 37%-ным формальдегидом до конечной концентрации формальдегида 0,05%. Эту смесь вирус-формальдегид смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 24 часов при комнатной температуре. Смесь инактивированного вируса затем тестируют на остаточный живой вирус путем оценки роста на подходящей линии клеток.
Инактивацию BEI можно проводить смешиванием суспензии вируса по настоящему изобретению с 0,1 М BEI (2-бром-этиламин в 0,175 н. NaOH) до конечной концентрации BEI 1 мМ. Эту смесь вирус-BEI смешивают путем постоянного перемешивания в течение приблизительно 48 часов при комнатной температуре с последующим добавлением 1,0 М тиосульфата натрия до конечной концентрации 0,1 мМ. Смешивание продолжают в течение еще двух часов. Смесь инактивированного вируса тестируют на остаточный живой вирус путем оценки роста на подходящей линии клеток.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут включать один или более чем один ветеринарно приемлемый носитель. Термин «ветеринарно приемлемый носитель», как он использован здесь, включает все и любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие всасывание, и тому подобное. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Изотонические агенты могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу, известные среди прочих специалистам в данной области техники. Стабилизаторы включают альбумин, известный среди прочих специалисту в данной области техники. Консерванты включают мертиолат, известный среди прочих специалисту в данной области техники.
Адъюванты включают, без ограничения, адъювантную систему RIBI (Ribi Inc.), квасцы, гель на основе гидроксида алюминия, эмульсии типа «масло-в-воде», эмульсии типа «вода-в-масле», такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) или другие фракции сапонина, монофосфориллипид А, липид-аминный адъювант авридин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин или мурамил-дипептид, известные среди многих других специалистам в данной области техники. Количества и концентрации адъювантов и добавок, полезных в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены квалифицированным специалистом. В одном воплощении согласно настоящему изобретению предусмотрены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от примерно 50 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта. В другом воплощении адъювант включен в количестве от примерно 100 мкг до примерно 1500 мкг, или от примерно 250 мкг до примерно 1000 мкг, или от примерно 350 мкг до примерно 750 мкг. В другом воплощении адъювант включен в количестве примерно 500 мкг/2 мл дозу иммуногенной композиции или вакцины.
Иммуногенные композиции и вакцины также могут включать антибиотики. Такие антибиотики включают, без ограничения, антибиотики из классов аминогликозидов, карбапенемов, цефалоспоринов, гликопептидов, макролидов, пенициллинов, полипептидов, хинолонов, сульфонамидов и тетрациклинов. В одном воплощении в настоящем изобретении предусмотрены иммуногенные композиции и вакцины, содержащие от примерно 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотика. В другом воплощении иммуногенные композиции и вакцины содержат от примерно 5 мкг/мл до примерно 55 мкг/мл антибиотика, или от примерно 10 мкг/мл до примерно 50 мкг/мл антибиотика, или от примерно 15 мкг/мл до примерно 45 мкг/мл антибиотика, или от примерно 20 мкг/мл до примерно 40 мкг/мл антибиотика, или от примерно 25 мкг/мл до примерно 35 мкг/мл антибиотика. В еще одном воплощении иммуногенные композиции и вакцины содержат менее чем примерно 30 мкг/мл антибиотика.
Иммуногенные композиции и вакцины по данному изобретению могут дополнительно включать один или более чем один другой иммуномодулирующий агент, такой как, например, интерлейкины, интерфероны или другие цитокины, подходящие количества которых могут быть определены квалифицированным специалистом.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут включать одну или более чем одну полинуклеотидную молекулу, кодирующую химерный пестивирус. В иммуногенных композициях или вакцинах можно использовать молекулы либо ДНК, либо РНК, кодирующие весь геном химерного пестивируса, или одну или более чем одну открытую рамку считывания. Молекулу ДНК или РНК можно вводить в отсутствие других агентов или ее можно вводить совместно с агентом, облегчающим поглощение клеткой (например, с липосомами или катионными липидами). Общее содержание полинуклеотидов в иммуногенной композиции или вакцине в целом будет составлять от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 5,0 мг/мл. В другом воплощении общее содержание полинуклеотидов в иммуногенной композиции или вакцине будет составлять от примерно 1 мкг/мл до примерно 4,0 мг/мл, или от примерно 10 мкг/мл до примерно 3,0 мг/мл, или от примерно 100 мкг/мл до примерно 2,0 мг/мл. Вакцины и методики вакцинации, в которых используют нуклеиновые кислоты (ДНК или мРНК), подробно описаны в данной области техники, например, в патенте США №5703055, патенте США №5580859, патенте США №5589466, которые все включены в данное описание посредством ссылки.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению также могут включать дополнительные антигены BVDV, например антигены, описанные в патенте США №6060457, патенте США №6015795, патенте США №6001613 и патенте США №5593873, которые все включены в данное описание посредством ссылки.
В дополнение к одному или более чем одному химерному пестивирусу иммуногенные композиции и вакцины могут включать другие антигены. Антигены могут находиться в форме инактивированного цельного или частичного препарата микроорганизма или в форме антигенных молекул, полученных методиками генной инженерии или химическим синтезом. Другие антигены, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, антигены, происходящие от таких патогенных бактерий, как Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Bacillus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Mycoplasma bovis, Mycobacteriuin bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio spp., серовары Salmonella enterica и Leptospira spp. Антигены также могут происходить от патогенных грибов, таких как Candida, простейших, таких как Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babes/a spp., Giardia spp., или гельминтов, таких как Ostertagia, Coopelia, Haemonchus и Fasciola. Дополнительные антигены включают патогенные вирусы, такие как коронавирус крупного рогатого скота, герпесвирусы-1,3,6 крупного рогатого скота, вирус парагриппа крупного рогатого скота, респираторно-синтициальный вирус крупного рогатого скота, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус чумы, вирус ящура, вирус бешенства и вирус гриппа.
ФОРМЫ. ДОЗИРОВКИ. ПУТИ ВВЕДЕНИЯ
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению можно вводить животным для индуцирования эффективного иммунного ответа против BVDV. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены способы стимулирования эффективного иммунного ответа против BVDV путем введения животному терапевтически эффективного количества описанных здесь иммуногенной композиции или вакцины по настоящему изобретению.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению могут быть изготовлены в разных формах, в зависимости от пути введения. Например, иммуногенные композиции и вакцины могут быть изготовлены в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для применения посредством инъекции, или изготовлены в лиофилизированных формах с использованием методик сублимационной сушки. Лиофилизированные иммуногенные композиции и вакцины обычно хранят при примерно 4°С, и их можно растворять в стабилизирующем растворе, например физиологическом растворе и/или HEPES, с адъювантом или без него. Иммуногенные композиции и вакцины также могут быть изготовлены в форме суспензий или эмульсий.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению включают терапевтически эффективное количество одного или более чем одного из вышеописанных химерных пестивирусов. Очищенные вирусы можно использовать непосредственно в иммуногенной композиции или вакцине или можно дополнительно аттенуировать или инактивировать. Типично иммуногенная композиция или вакцина содержит от примерно 1×102 до примерно 1×1012 вирусных частиц, или от примерно 1×103 до примерно 1×1011 вирусных частиц, или от примерно 1×104 до примерно 1×1010 вирусных частиц, или от примерно 1×105 до примерно 1×109 вирусных частиц, или от примерно 1×106 до примерно 1×108 вирусных частиц. Точное количество вируса в иммуногенной композиции или вакцине, эффективное для обеспечения защитного эффекта, может быть определено квалифицированным специалистом.
Иммуногенные композиции и вакцины обычно содержат ветеринарно приемлемый носитель в объеме от примерно 0,5 мл до примерно 5 мл. В другом воплощении объем носителя составляет от примерно 1 мл до примерно 4 мл или от примерно 2 мл до примерно 3 мл. В другом воплощении объем носителя составляет примерно 1 мл, или составляет примерно 2 мл, или составляет примерно 5 мл. Ветеринарно приемлемые носители, подходящие для применения в иммуногенных композициях и вакцинах, могут представлять собой любые из иммуногенных композиций и вакцин, описанных выше.
Специалисты в данной области техники могут легко определить, нужно ли аттенуировать или инактивировать вирус до введения. В другом воплощении настоящего изобретения химерный пестивирус можно вводить непосредственно животному без дополнительной аттенуации. Количество вируса, которое является терапевтически эффективным, может варьировать в зависимости от конкретного используемого вируса, состояния животного и/или уровня инфекции и может быть определено квалифицированным специалистом.
Согласно способам по настоящему изобретению животным можно вводить одну дозу, или альтернативно, могут иметь место две или более чем две инокуляции с интервалами от примерно двух до примерно десяти недель. Могут потребоваться схемы бустер-иммунизации, и схему дозировки можно адаптировать для обеспечения оптимальной иммунизации. Специалисты в данной области техники могут легко определить оптимальную схему введения.
Иммуногенные композиции и вакцины можно вводить непосредственно в кровоток, в мышцу или во внутренний орган. Подходящие способы парентерального введения включают внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутриоболочечное, внутрижелудочковое, внутриуретральное, внутригрудинное, внутричерепное, внутримышечное и подкожное. Подходящие устройства для парентерального введения включают игольные (включая микроигольные) инъекторы, безыгольные инъекторы и методики инфузии.
Парентеральные препараты обычно представляют собой водные растворы, которые могут содержать эксципиенты, такие как соли, углеводы и буферы (предпочтительно с рН от примерно 3 до примерно 9, или от примерно 4 до примерно 8, или от примерно 5 до примерно 7,5, или от примерно 6 до примерно 7,5, или от примерно 7 до примерно 7,5), но для некоторых применений их можно приготовить в виде препарата более подходящим образом в виде стерильного неводного раствора или в виде сухой формы, подлежащей применению в сочетании с подходящим наполнителем, таким как стерильная апирогенная вода.
Приготовление парентеральных препаратов при стерильных условиях, например, посредством лиофилизации может быть легко осуществлено с использованием стандартных фармацевтических методик, хорошо известных специалистам в данной области техники.
Растворимость соединений, используемых в приготовлении парентеральных растворов, можно увеличить путем использования подходящих методик приготовления препаратов, известных квалифицированному специалисту, таких как включение агентов, увеличивающих растворимость, включая буферы, соли, поверхностно-активные вещества, липосомы, циклодекстрины и тому подобное.
Препараты для парентерального введения можно приготовить в виде препаратов с немедленным и/или модифицированным высвобождением. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты с отсроченным, замедленным, импульсным, контролируемым, направленным и запрограммированным высвобождением. Таким образом, соединения по данному изобретению можно приготовить в виде препарата в виде твердого, полутвердого вещества или тиксотропной жидкости для введения в виде имплантированного депо-препарата, обеспечивающего модифицированное высвобождение активного соединения. Примеры таких препаратов включают стенты, покрытые лекарственным средством, и микросферы из поли(с//-молочной-полигликолевой)кислоты (PGLA).
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению также можно вводить местно на кожу или слизистую, то есть дермально или трансдермально. Типичные препараты для этой цели включают гели, гидрогели, лосьоны, растворы, кремы, мази, присыпки, повязки, пены, пленки, накожные пластыри, облатки, имплантаты, губки, волокна, бандажи и микроэмульсии. Также можно использовать липосомы. Типичные носители включают спирт, воду, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, глицерин, полиэтиленгликоль и пропиленгликоль. Могут быть включены усилители проникновения. См., например, Finnin and Morgan, J. Pharm Sci, 88(10):955-958(1999).
Другие способы местного введения включают доставку электропорацией, ионофорезом, фонофорезом, сонофорезом и микроигольную или безыгольную инъекцию (например, Powderject™, Bioject™ и так далее).
Препараты для местного введения можно приготовить в виде препарата с немедленным и/или модифицированным высвобождением. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты с отсроченным, замедленным, импульсным, контролируемым, направленным или запрограммированным высвобождением.
Иммуногенные композиции и вакцины также можно вводить интраназально или посредством ингаляции обычно в форме сухого порошка (либо одного, либо в виде смеси, например в сухой смеси с лактозой или в виде частиц из смешанных компонентов, например смешанных с фосфолипидами, такими как фосфатидилхолин), из ингалятора сухого порошка или в виде аэрозольного спрэя из контейнера под давлением, насоса, пульверизатора, распылителя (предпочтительно распылителя с использованием электрогидродинамики для создания мелкодисперсного тумана) или небулайзера, с использованием подходящего пропеллента, такого как 1,1,1,2-тетрафторэтан или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан, или без него. Для интраназального применения порошок может содержать биоадгезивный агент, например хитозан или циклодекстрин.
Контейнер под давлением, насос, пульверизатор, распылитель или небулайзер содержит раствор или суспензию соединения(й) по данному изобретению, содержащую, например, этанол, водный этанол или подходящий альтернативный агент для диспергирования, солюбилизирования или пролонгирования высвобождения активного агента, пропеллент(ы) в качестве растворителя и возможное поверхностно-активное вещество, такое как сорбитантриолеат, олеиновая кислота или олигомолочная кислота.
Перед применением в виде препарата в форме сухого порошка или суспензии лекарственный продукт обычно микронизируют до подходящего размера для доставки посредством ингаляции (обычно менее чем примерно 5 микрон). Этого можно достигнуть любым подходящим способом измельчения, таким как размол на спиральной струйной мельнице, размол на струйной мельнице с псевдоожиженным слоем, технология для сверхкритических жидкостей для образования наночастиц, гомогенизация под высоким давлением или сушка распылением.
Капсулы (изготовленные, например, из желатина или гидроксипропилметилцеллюлозы), блистеры и картриджи для применения в ингаляторе или инсуффляторе можно изготовить в виде препарата так, чтобы они содержали порошковую смесь соединения по данному изобретению, подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал, и модификатор эффективности, такой как лейцин, маннит или стеарат магния. Лактоза может быть безводной или находиться в форме моногидрата. Другие подходящие эксципиенты включают декстран, глюкозу, мальтозу, сорбит, ксилит, фруктозу, сахарозу и трегалозу.
Подходящий препарат в виде раствора для применения в распылителе с использованием электрогидродинамики для создания мелкодисперсного тумана может содержать от примерно 1 мкг до примерно 20 мг соединения по данному изобретению на одно срабатывание, и объем при срабатывании может варьировать от примерно 1 мкл до примерно 100 мкл. В другом воплощении количество соединения на одно срабатывание может варьировать от примерно 100 мкг до примерно 15 мг, или от примерно 500 мкг до примерно 10 мг, или от примерно 1 мг до примерно 10 мг, или от примерно 2,5 мкг до примерно 5 мг. В другом воплощении объем при срабатывании может варьировать от примерно 5 мкл до примерно 75 мкл, или от примерно 10 мкл до примерно 50 мкл, или от примерно 15 мкл до примерно 25 мкл. Типичный препарат может содержать соединение по данному изобретению, пропиленгликоль, стерильную воду, этанол и хлорид натрия. Альтернативные растворители, которые можно использовать вместо пропиленгликоля, включают глицерин и полиэтиленгликоль.
Препараты для введения ингаляцией/интраназального введения можно приготовить в виде препаратов с немедленным и/или модифицированным высвобождением с использованием, например, PGLA. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты с отсроченным, замедленным, импульсным, контролируемым, направленным и запрограммированным высвобождением.
В случае ингаляторов сухого порошка и аэрозолей единицу дозировки обычно определяют посредством клапана, который доставляет отмеренное количество. Единицы дозировки согласно данному изобретению обычно подгоняют так, чтобы вводить отмеренную дозу или «впрыск», содержащие от примерно 10 нг до примерно 100 мкг соединения по данному изобретению. В другом воплощении количество соединения, введенного в отмеренной дозе, составляет от примерно 50 нг до примерно 75 мкг, или от примерно 100 нг до примерно 50 мкг, или от примерно 500 нг до примерно 25 мкг, или от примерно 750 нг до примерно 10 мкг, или от примерно 1 мкг до примерно 5 мкг. Общая суточная доза обычно находится в интервале от примерно 1 мкг до примерно 100 мг, которую можно вводить в одной дозе или, более общепринято, в виде раздельных доз на протяжении суток. В другом воплощении общая суточная доза может варьировать от примерно 50 мкг до примерно 75 мг, или от примерно 100 мкг до примерно 50 мг, или от примерно 500 мкг до примерно 25 мг, или от примерно 750 мкг до примерно 10 мг, или от примерно 1 мг до примерно 5 мг.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению также можно вводить в ротовую полость или перорально, то есть вводить в организм субъекта через рот или посредством ротовой полости, и это введение включает проглатывание или транспорт через слизистую рта (например, сублингвальное или трансбуккальное всасывание) или и то, и другое. В те препараты по изобретению, которые предназначены для введения в ротовую полость или перорального введения, можно добавлять подходящие корригенты, такие как ментол и левоментол, или подсластители, такие как сахарин или сахарин натрия.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению можно вводить ректально или вагинально, например, в виде суппозитория, пессария или клизмы. Масло какао является традиционной основой суппозитория, но при необходимости могут быть использованы разные альтернативы. Препараты для ректального/вагинального введения могут быть приготовлены в виде препарата с немедленным и/или модифицированным высвобождением. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты с отсроченным, замедленным, импульсным, контролируемым, направленным и запрограммированным высвобождением.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению также можно вводить непосредственно в глаз или в ухо, обычно в форме капель микронизированной суспензии или раствора в изотоничном стерильном физиологическом растворе с подведенным рН. Другие препараты, подходящие для глазного и ушного введения, включают мази, биоразлагаемые (например, губки с абсорбируемым гелем, коллаген) и бионеразлагаемые (например, силиконовые) имплантаты, облатки, линзы и системы в виде частиц или везикул, такие как ниосомы или липосомы. Полимер, такой как поперечно-сшитая полиакриловая кислота, поливиниловый спирт, гиалуроновая кислота, целлюлозный полимер, например гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза или метилцеллюлоза, или гетерополисахаридный полимер, например желатиновая камедь, может быть включен вместе с консервантом, таким как хлорид бензалкония. Такие препараты также можно доставлять ионофорезом.
Препараты для глазного/ушного введения можно готовить в виде препаратов с немедленным и/или модифицированным высвобождением. Препараты с модифицированным высвобождением включают препараты с отсроченным, замедленным, импульсным, контролируемым, направленным и запрограммированным высвобождением.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению можно использовать в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения распространения у животного инфекции вирусом диареи крупного рогатого скота.
Иммуногенные композиции и вакцины по настоящему изобретению можно использовать в изготовлении лекарственного средства для введения животному, где данное лекарственное средство представляет собой DIVA-вакцину на основе пестивируса, содержащую химерный пестивирус, включающий вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок, и где указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка. В одном воплощении химерный пестивирус имеет по меньшей мере один Erns эпитоп, который не присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа. В другом воплощении химерный пестивирус не имеет по меньшей мере одного Erns эпитопа, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа.
ДЕТЕКТИРОВАНИЕ. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ
Согласно настоящему изобретению предложены способы определения происхождения пестивируса, присутствующего в животном субъекте.
Вакцинация, в которой используют DIVA-вакцину, т.е. вакцину, которая способна дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных, обеспечивает средство определения происхождения пестивируса, присутствующего в животном субъекте. Эту дифференцировку можно осуществлять любым из разных диагностических способов, включающих, без ограничения, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), Вестерн-блоттинг и ПЦР (полимеразная цепная реакция). Эти и другие способы полностью признаны и известны обычному специалисту в данной области техники.
Химерные пестивирусы по настоящему изобретению можно отличить от штаммов BVDV дикого типа как по их геномному составу, так и по экспрессируемым белкам. Такое отличие дает возможность установить различие между вакцинированными и инфицированными животными. Например, можно осуществить определение того, несет ли животное, тестируемое положительным в отношении BVDV в определенных лабораторных тестах, штамм BVDV дикого типа или химерный пестивирус по настоящему изобретению, полученный ранее посредством вакцинации.
Ряд анализов можно использовать для проведения данного определения. Например, вирус можно выделять из животного, тестируемого как положительное в отношении BVDV, и можно использовать анализы на основе нуклеиновых кислот для определения присутствия генома химерного пестивируса, указывающего на предшествующую вакцинацию. Анализы на основе нуклеиновых кислот включают саузерн- или нозерн-блоттинг, ПЦР и секвенирование. В качестве альтернативы, можно использовать анализы на основе белка. В анализах на основе белка клетки или ткани, подозреваемые на наличие инфекции, можно выделять из животного, тестируемого как положительное в отношении BVDV. Из таких клеток или тканей можно получить клеточные экстракты и можно подвергнуть их, например, вестерн-блоттингу с использованием соответствующих антител против вирусных белков, которые могут четко идентифицировать присутствие либо химерного пестивируса, инокулированного ранее, либо BVDV дикого типа.
Степень и природу иммунных ответов, индуцированных у животного, можно оценить с использованием ряда методик. Например, можно собрать сыворотку от инокулированных животных и протестировать ее на присутствие или отсутствие специфичных антител в отношении химерного вируса, например, в традиционном анализе по нейтрализации вируса. Обнаружение отвечающих цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) в лимфоидных тканях может быть достигнуто такими анализами, как пролиферация Т-клеток, в качестве указания на индукцию клеточного иммунного ответа. Релевантные методики хорошо описаны в данной области техники, например, Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
НАБОРЫ
Ввиду того, что может быть желательным введение иммуногенной композиции или вакцины в комбинации с дополнительными соединениями, например, с целью лечения конкретного заболевания или состояния, в пределах объема настоящего изобретения находится то, что иммуногенную композицию или вакцину можно с удобством включить или объединить в форме набора, подходящего для введения или совместного введения композиций.
Таким образом, наборы по настоящему изобретению могут содержать одну или более чем одну отдельную фармацевтическую композицию, по меньшей мере одна из которых представляет собой иммуногенную композицию или вакцину согласно настоящему изобретению, и средство для раздельного хранения указанных композиций, такое как контейнер, разделенная бутыль или разделенная упаковка из фольги. Примером такого набора является шприц и игла и тому подобное. Набор по настоящему изобретению является особенно подходящим для введения разных лекарственных форм, например пероральной или парентеральной, для введения отдельных композиций с разными интервалами дозирования или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. Для помощи тому, кто вводит композицию по настоящему изобретению, данный набор обычно включает указания по введению.
Другой набор по настоящему изобретению может включать один или более чем один реагент, полезный для детекции и дифференцировки между животным, инфицированным BVDV, и животным, вакцинированным химерным пестивирусом. Набор может включать реагенты для анализа образца на присутствие целого BVDV или полипептидов, эпитопов или полинуклеотидных последовательностей BVDV, которые не присутствуют в химерном пестивирусе данной иммуногенной композиции или вакцины. В качестве альтернативы, наборы по настоящему изобретению могут включать реагенты для анализа образца на присутствие химерного пестивируса или полипептидов, эпитопов или полинуклеотидных последовательностей, которые не присутствуют в BVDV дикого типа. Присутствие вируса, полипептидов или полинуклеотидных последовательностей можно определить с использованием антител, ПЦР, гибридизации и других способов обнаружения, известных специалистам в данной области техники.
Другой набор по настоящему изобретению может предоставить реагенты для обнаружения антител против конкретных эпитопов. Данные эпитопы либо присутствуют в химерном пестивирусе по настоящему изобретению и не присутствуют в BVDV дикого типа, или альтернативно, присутствуют в BVDV дикого типа и не присутствуют в химерном пестивирусе по настоящему изобретению. Такие реагенты являются полезными для анализа образца на присутствие антител и хорошо известны и доступны обычному специалисту в данной области техники. Присутствие антител можно определить с использованием стандартных способов обнаружения, известных специалистам в данной области техники.
В определенных воплощениях наборы могут включать комплект напечатанных инструкций или этикетку, указывающую, что данный набор является полезным для детекции и дифференцировки животных, инфицированных BVDV, от животных, вакцинированных химерным пестивирусом.
АНТИТЕЛО. АНТИТЕЛА
Антитела могут быть либо моноклональными, поликлональными, либо рекомбинантными. Соответственно, антитела могут быть получены против иммуногена или его части. Например, синтетический пептид на основе аминокислотной последовательности иммуногена, или полученный рекомбинантно методиками клонирования, или продукт природного гена и/или его части могут быть выделены и использованы в качестве иммуногена. Иммуногены можно использовать для продуцирования антител стандартной методикой продукции антител, хорошо известной специалистам в данной области техники, как, например, в общем описано у Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988) и Borrebaeck, "Antibody Engineering - A Practical Guide", W.H. Freeman and Co. (1992). Фрагменты антител также можно получать из антител способами, известными специалистам в данной области техники, и они включают Fab, F(ab')2 и Fv.
При продуцировании антител скрининг на желательное антитело можно осуществлять стандартными в иммунологии способами, известными в данной области техники. Методики, которые не описаны конкретно, обычно представляют собой как описано в Stites, et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton and Lange, Norwalk, CT (1994) и Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980). В общем, предпочтительными типами иммуноанализов являются ELISA и вестерн-блоттинг. Оба анализа являются хорошо известными специалистам в данной области техники. В данных анализах можно использовать как поликлональные, так и моноклональные антитела. Антитело может быть связанным с субстратом на твердой подложке или конъюгированным с детектируемой группировкой, или как связанным, так и конъюгированным, как хорошо известно в данной области техники (для общего обзора по конъюгации флуоресцентных или ферментативных группировок см. Johnstone and Thorpe, "Immunochemistry in Practice", Blackwell Scientific Publications, Oxford (1982)). Связывание антител с субстратом на твердой подложке также хорошо известно в данной области техники (для общего обзора см. Harlow and Lane (1988) and Borrebaeck (1992)). Детектируемые группировки, предусмотренные для использования в настоящем изобретении, могут включать, без ограничения, флуоресцентные, металлические, ферментативные и радиоактивные маркеры, такие как биотин, золото, ферритин, щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, пероксидаза, уреаза, флуоресцеин, родамин, тритий, 14С, а также йодирование.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Конструирование и серологическая характеризация химерных пестивирусов
E. coli К12 GM2163 [F-ara-14, leuB6, thi-1, fhuA31, lacY1, tsx-78, galK2, galT22, supE44, hisG4, rpsL136, (Str), xyl-5, mtl-1, dam13::Tn9(Camr), dcm-6, mcrB1, hsdR2(rk-mk-),mcrA] имеет плазмиду, содержащую полноразмерную геномную кДНК штамма NADL вируса диареи крупного рогатого скота (BVDV-NADL), полученную от доктора R. Donis, University of Nebraska.
Клетки RD (клетки бычьего яичка, трансформированные SV40; полученные от доктора R. Donis) поддерживали в OptiMEM, дополненной 3%-ной лошадиной сывороткой, 1% заменимых аминокислот (NEAA) в модифицированной среде Игла (MEM), 2 мМ GlutaMax и 10 мкг/мл гентамицина. Клетки ВК-6 приобретали у Pfizer Global Manufacturing (PGM). Клетки выращивали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), дополненной 5%-ной лошадиной сывороткой или донорской телячей сывороткой (PGM), 2 мМ Glutamax и 1% антибиотиком и противогрибковым средством. Все компоненты среды, за исключением тех, где это указано, были приобретены у Invitrogen (Carlsbad, CA). Все клетки поддерживали при 37°С в среде с 5%-ным CO2.
Моноклональное антитело (MAb) 15C5, специфичное к Е1""5 BVDV, приобретали у IDEXX (Westbrook, ME). MAb 20.10.6 против BVDV NS3 было предоставлено доктором Е. Dubovi (Cornell University). MAb WS 363, WS 373 и WS 371, имеющие специфичность в отношении белка Erns вируса пограничной болезни овец (BVD), были получены в Агенстве ветеринарных лабораторий (Surrey, Великобритания). Образцы бычьей сыворотки №77, №816, №1281 и №1434 получали согласно внутреннему регламенту Pfizer.
Химерные пестивирусы создавали путем замены Erns гена штамма BVDV-NADL на Е"13 ген пестивируса жирафа (С-Erns), северного оленя (R-Erns) или вилорогой антилопы (Р-Erns) с использованием метода перекрывающейся ПЦР. Использовали либо ДНК-полимеразу PfuUltra™ fusion HS (Stratagene; La Jolla, CA), либо ДНК-полимеразу высокой точности Platinum® Taq (Invitrogen). Олигонуклеотидные праймеры (с сопровождающими SEQ ID NO) для перекрывающейся ПЦР и для создания полноразмерной вирусной ДНК перечислены в Таблице 1.
Таблица 1. | ||||
Олигонуклеотидные праймеры, использованные для ПРЦ-амплификации | ||||
SEQ ID N0 | Название | Происхождение | Последовательности (5'-3') | Сайт связывания праймера (подчеркнутая последовательность) |
1 | Олиго В-5 | Т7+NADL | GTGTTAATACGACTCACTATAG TATACGAGAATTAGAAAAGGC | Промотор Т7 |
2 | Олиго 84 | NADL | GGGGGCTGTTAGAGGTCTTCC | |
3 | Олиго 127 | G-E™+NADL | AATTCCACTGGGTGATGTTCTCTC CCATTGTAACTTGAAACAAAACT | N-конец G-Erns |
4 | Олиго 128 | G-Erns | GAGAACATCACCCAGTGGAA | |
5 | Олиго 129 | G-Erns | TGCGTGGGCTCCAAACCATGT | |
6 | Олиго 130 | G-Erns+NADL | AACATGGTTTGGAGCCCACGCAGCTTCCCCTTACTGTGATGTCG | С-конец G-Erns |
7 | Олиго 131 | P-Erns+NADL | GGTTCCACTGTGTTATATTCTCTCCCATTGTAACTTGAAACAAAACT | N-конец R-Erns |
8 | Олиго 132 | R-Erns | GAGAATATAACACAGTGGAACC | |
9 | Олиго 133 | R-Erns | TGCATTAGCTCCGAACCACGTT | |
10 | Олиго 134 | Р-Erns+NADL | AACGTGGTTCGGAGCTAATGCAGCTTCCCCTTACTGTGATGTCG | С-конец R-Erns |
11 | Олиго 135 | P-Erns+NADL | GGTTCCACTGAGTTATATTCAC | N-конец P-Erns |
12 | Олиго 136 | P-Erns | TCCCATTGTAACTTGAAACAGTGAATATAACTCAGTGGAACC | |
13 | Олиго 137 | P-Erns | TGCCTGTGCCCCAAACCATGT | |
14 | Олиго 138 | Р-Erns+NADL | AACATGGTTTGGGGCACAGGCA | С-конец P-Erns |
15 | Олиго 175 | NADL | GCTTCCCCTTACTGTGATGTCGGTTATCAATAGTAGCCACAGAAT | |
16 | Олиго 177 | NADL | TCCACCCTCAATCGACGCTAAA | |
17 | Олиго 237 | CM5960 | CCCTGAGGCCTTCTGTTCTGAT | |
18 | Олиго P7 | CM5960 | CACTTGTCGGAGGTACTACTACT | |
19 | Олиго P8 | CM5960 | CTTGTCTATCTTATCTCTTATTGC | |
20 | Олиго P3 | CM5960 | ACTATCTGAACAGTTGGACAGG | |
21 | Олиго 296-1 | T7+CM53637 | GTGTTAATACGACTCACTATA | Промотор Т7 |
22 | Олиго 297 | P-Erns+CM53637 | GTATACGAGATTAGCTAAAGCCAGGTTCCACTGAGTTATATTCAC | N-конец P-Erns |
23 | Олиго 298 | Р-Erns+CM53637 | TCCTGTTACCAGCTGAAGCAGAAAACATGGTTTGGGGCACAGGCA | С-конец P-Erns |
24 | Олиго 299 | СМ53637 | TTAATGCCCTCCCTGTCTCTACCACCT | |
25 | Олиго 300 | СМ53637 | AGGATGAGGATCTAGCAGTGGATCT | |
26 | Олиго 303 | СМ53637 | CCATAGCCATCTGCTCAGACAGTA | |
27 | Олиго 92-1 | СМ53637 | GGGGCTGTCAGAGGCATCCTCTAGTC | |
28 | Олиго 321 | СМ53637 | AGCCACTACACCTGTCACGAGAAG | |
29 | Олиго 250 | NADL | CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC | С-конец NADL-C |
30 | Олиго 252 | NADL | TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC | С-конец NADL-Erns |
Плазмиду, содержащую полноразмерную кДНК BVDV-NADL, экстрагировали из dam-Е. coli К12 GM2163. Данную плазмиду метилировали in vitro метилтрансферазой dam и S-аденозилметионином (New England Biolabs; Ipswich, MA). Синтезировали и клонировали в клонирующий вектор гены G-Erns, R- Erns и Р-Erns (номера доступа GenBank NC_003678, NC_003677 и AY781152, соответственно).
Для конструирования химерной ДНК BVDV-NADL/G-Erns фрагмент BVDV-NADL, кодирующий область от 5'UTR (нетранслируемая область) до 3'-конца гена С, амплифицировали посредством ПЦР из метилированной плазмиды с праймерами Олиго В-5 и Олиго 127. Ген С-Erns амплифицировали посредством ПЦР из плазмидной ДНК, содержащей ген G- Erns, с Олиго 128 и Олиго 129. Фрагмент BVDV, кодирующий область от Е1 до 3'UTR, амплифицировали посредством ПЦР из метилированной плазмиды с Олиго 130 и Олиго 84. ПЦР-продукты очищали на геле с использованием набора для экстракции геля QIAquick (Qiagen; Valencia, CA). Очищенные ПЦР-продукты обрабатывали Dpn I и экзонуклеазой 1 (New England Biolabs). Обработанные ПЦР-продукты подвергали сборке для создания полноразмерного химерного генома BVDV-NADL/G-Erns посредством ПЦР с использованием Олиго В-5 и Олиго 84.
Для конструирования химерной ДНК BVDV-NADL/R-Erns фрагмент BVDV-NADL, кодирующий область от 5'UTR до 3'-конца гена С, амплифицировали посредством ПЦР из метилированной плазмиды с праймерами Олиго В-5 и Олиго 131. Ген R-Erns амплифицировали посредством ПЦР из плазмиды, содержащей ген R-Erns, с Олиго 132 и Олиго 133. Фрагмент BVDV, кодирующий область от Е1 до 3'UTR, амплифицировали посредством ПЦР из метилированной плазмиды с Олиго 134 и Олиго 84. ПЦР-продукты очищали на геле с использованием набора для экстракции геля QIAquick. Очищенные ПЦР-продукты обрабатывали Dpn I и экзонуклеазой 1. Обработанные ПЦР-продукты подвергали сборке для создания полноразмерного химерного генома BVDV-NADL/R-Erns посредством ПЦР с использованием Олиго В-5 и Олиго 84.
Для конструирования химерной ДНК BVDV-NADL/P-Erns фрагмент BVDV-NADL, кодирующий область от 5'UTR до 3'-конца гена С, амплифицировали посредством ПЦР из метилированной плазмиды с праймерами Олиго В-5 и Олиго 135. Ген Р-Erns амплифицировали посредством ПЦР из плазмидной ДНК, содержащей ген Р-Erns, с Олиго 136 и Олиго 137. Фрагмент BVDV, кодирующий область от Е1 до 3'UTR, амплифицировали посредством ПЦР из метилированной плазмиды с Олиго 138 и Олиго 84. ПЦР-продукты очищали на геле с использованием набора для экстракции геля QIAquick. Очищенные ПЦР-продукты обрабатывали Dpn I и экзонуклеазой 1. Обработанные ПЦР-продукты подвергали сборке для создания полноразмерного химерного генома BVDV-NADL/P-Erns посредством ПЦР с использованием Олиго В-5 и Олиго 84.
Для подтверждения последовательности химерных Erns областей фрагмент, соответствующий области от 5'UTR до Е1 каждого собранного полноразмерного химерного генома, амплифицировали посредством ПЦР с использованием Олиго В-5 и Олиго 175, и ПЦР-продукты секвенировали и анализировали.
Из плазмиды, содержащей полноразмерную кДНК BVDV-NADL или ДНК химерного BVDV-NADL/Erns, генерировали полноразмерные вирусные геномные РНК-транскрипты с использованием набора mMessage mMachine T7 Ultra (Ambion; Austin, TX). Качество и количество каждого РНК-транскрипта определяли на РНК-геле и спектрофотометре Nanodrop (Nanodrop; Wilmington, DE). Культуры клеток RD, выращенные в течение ночи в лунках 6-луночных планшетов, трансфицировали вирусной РНК с использованием реагента липофектин (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. После трансфекции клетки инкубировали при 37°С в течение 3 суток. Супернатанты собирали и хранили при -80°С.
Вирусные РНК из собранных супернатантов экстрагировали с использованием набора для выделения вирусной РНК МаgМах™ AI/ND (Ambion) согласно инструкциям производителя. РНК подвергали обратной транскрипции и область каждой химеры, кодирующую от Npro до Е1, амплифицировали с использованием праймеров Олиго 177 и Олиго 175 (Таблица 1) и системы ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) ThermoScript™ (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Затем секвенировали продукты ОТ-ПЦР.
Монослои клеток либо от трансфекции вирусной РНК, либо от инфекции вирусом фиксировали в 80%-ном ацетоне. Моноклональные антитела, специфичные в отношении BVDV или BDV, использовали в сочетании с набором антитела против мышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой, АВС Elite (Vector Laboratories; Burlingame, CA). Окраска развивалась с использованием пероксидазного субстрата VIP (Vector Laboratories).
Титры химерного вируса определяли методом серийных разведений. Пробы вируса последовательно 10-кратно разводили и переносили в 96-луночные планшеты (100 мкл на лунку) с 4-6 повторностями на разведение. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл суспензии клеток ВК-6 и данные планшеты инкубировали при 37°С в течение 4-5 суток. Вирусную инфекцию определяли как по цитопатическому эффекту (СРЕ), так и по окрашиванию на MAb. Титры вируса рассчитывали с использованием метода Спирмана-Кэрбера.
Для получения биологических клонов каждой химеры пробы вируса сначала разводили в 100 раз с последующей серией 10-кратных разведений. 100 мкл разведенных вирусов переносили в каждую лунку 96-луночного планшета с 4 повторностями на разведение. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл клеток ВК-6 и планшеты инкубировали при 37°С в течение 4 суток. Супернатанты собирали, переносили в новые планшеты и хранили при -80°С. Клетки фиксировали и окрашивали. Супернатанты из лунок, содержащих одиночные очаги вируса, собирали и наращивали в качестве вирусных маточных растворов.
Исследования кинетики роста проводили в колбах Т-25, содержащих клетки ВК-6. Когда клетки достигали приблизительно 90%-ной конфлюентности, их инфицировали каждой химерой при MOI (множественность заражения) 0,02.
После адсорбции в течение 1 ч инокулят удаляли. Клетки промывали 3 раза PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и затем добавляли 3 мл свежей ростовой среды. Затем отбирали образцы в разные моменты времени от 0 до 144 ч для определений титра.
Для теста по нейтрализации вируса замороженные маточные растворы трех химер: BVDV-NADL/Erns, родительского BVDV-NADL и BVDV-CM5960 (BVDV типа I) разводили в DMEM приблизительно до 4000 ТСID50 (доза заражения 50% культуры ткани)/мл. Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного Bovi-Shield Gold (Pfizer; New York, NY) с заранее определенными титрами против BVDV типа I и II, двухкратно последовательно разводили DMEM. 50 мкл вируса (200 TCIDso) смешивали с равным объемом разведенной сыворотки крупного рогатого скота в 96-луночных планшетах для культуры ткани (4 повторности/разведение) и инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл клеток ВК-6 и планшеты инкубировали при 37°С в течение 3-6 суток. В каждый планшет в качестве контроля также включали сыворотку, отрицательную в отношении антител против BVDV. Титры конечной точки нейтрализации сыворотки определяли как СРЕ, так и иммуногистохимией (IHC) на сутки 3 и сутки 6.
Результаты. Были сконструированы химерные ДНК BVDV-NADL/Erns, в которых ген/белок NADL Erns был заменен на Erns пестивируса жирафа (С-Erns), северного оленя (R-Erns) или вилорогой антилопы (Р-Erns). Была секвенирована плазмидная ДНК, содержащая каждую из химерных Erns областей для подтверждения аутентичности последовательности. Следующие химерные пестивирусы были депонированы в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС®), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, США 2 апреля 2009 года:
BVDV-NADL/G-Erns (PTA-9938), BVDV-NADL/P-E"18 (PTA-9939) и BVDV-NADL/R-Erns (РТА-9940), и их жизнеспособность была подтверждена АТСС® 23 апреля 2009 года.
Химерные вирусы BVDV-NADL/Erns высвобождали из клеток RD после трансфекции вирусной РНК, транскрибированной in vitro. Широкомасштабный цитопатический эффект (СРЕ) в клетках RD наблюдали через 48-72 часа после трансфекции РНК-транскриптами BVDV-NADL/G-Erns или BVDV-NADL/R-Erns. Однако при использовании вируса BVDV-NADL/P-Erns СРЕ не был явно заметным. Супернатанты культур собирали из каждой лунки и оставшиеся клетки фиксировали и окрашивали MAb антителом 20.10.6, специфичным в отношении BVDV NS3. Клетки, инфицированные одним из трех химерных пестивирусов, инкубировали с данным MAb. Вирусные РНК экстрагировали из собранных супернатантов и секвенировали для подтверждения генов Erns всех трех химер.
Данные три химеры BVDV-NADL/Erns тестировали на их реактивность с каждым из нескольких MAb против Erns, специфичных в отношении BVDV или BDV. Результаты показаны в Таблице 2. Химера BVDV-NADL/R-Erns реагировала со всеми тремя MAb против Erns BDV, тогда как ни BVDV-NADL/G-Erns, BVDV-NADL/P-Erns, ни родительский вирус BVDV-NADL не распознавались MAb против Erns BDV. BVDV-NADL/G-Erns, BVDV-NADL/R-Erns и родительский вирус NADL реагировали с пан-MAb 15С5 против Erns BVDV. MAb, специфичные в отношении либо Erns BDV, либо BVDV, не реагировали с химерой BVDV-NADL/P-Erns.
Таблица 2. | |||||
Реактивность химер BVDV-NADL/Erns в отношении Mab | |||||
MAb | Специфичность | Реактивность химеры | |||
BVDV-NADL/G-Erns | BVDV-NADUR-Erns | BVDV-NADL/P-E™ | BVDV-NADL | ||
WS 371 | BDV Erns | - | +++ | - | - |
WS 373 | BDV Erns | - | +++ | - | - |
WS 363 | BDV Erns | - | +++ | - | - |
15С5 | BVDV Erns | +++ | +++ | - | +++ |
20.10.6 | Пестивирус NS3 | +++ | +++ | ++ | +++ |
Для того чтобы определить, имели ли химерные Erns белки в вирусах какое-либо влияние на распознавание вирусных нейтрализующих эпитопов антителами от крупного рогатого скота, вакцинированного BVDV, проводили анализ нейтрализации вируса с использованием трех химер: BVDV-NADL/Erns, BVDV-NADL и BVDV-CM5960 (BVDV типа I). Использовали сыворотку от 4 коров с титром нейтрализующих антител, варьирующим от 0 до более чем 40000 (определенным ранее против BVDV-CM5960). Результаты (Таблица 3) показывают то, что титры против всех трех химер были в целом сравнимы с титрами родительского BVDV-NADL и BVDV-CM5960. Нейтрализующие титры против BVDV-NADL/P-Erns были слегка ниже, чем нейтрализующие титры против двух других химер: BVDV-NADL и BVDV-CM5960.
Таблица 3. | |||||
Нейтрализующие титры бычьей антисыворотки против химер BVDV-NADL/Erns | |||||
Крупный рогатый скот № сыворотки | Нейтрализующие титры | ||||
BVDV-NADL/G- Erns | BVDV-NADL/R-Erns | BVDV-NADL/P-Erns | BVDV-NADL | CM5960 | |
816 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 |
77 | 320 | 320 | 320 | 160 | 320 |
1281 | 6400 | 12800 | 3200 | 3200 | 25600 |
1434 | 51200 | 25600 | 6400 | 25600 | 51200 |
Три химеры BVDV-NADL/Erns биологически клонировали два раза серийным разведением. Получали три клона BVDV-NADL/G-Erns, четыре BVDV-NADL/R-Erns и три BVDV-NADL/P-Erns. Каждый из этих клонов наращивали в 1-3 раза. Результаты титрования показали, что подвергнутые наращиванию клон 1 BYDV-NADL/G-Erns, клоны 3 и 5 BVDV-NADL/R-Erns и клон 2 BVDV-NADL/P-Erns давали наивысшие титры.
Исследования кинетики роста проводили с клоном 1 BYDV-NADL/G-Erns, клоном 3 BVDV-NADL/R-Erns, клоном 2 BVDV-NADL/P-Erns и неклонированным BVDV-NADL/P-Erns. Кривые роста, генерированные от этих клонов, сравнивали с кривой родительского BVDV-NADL. Химеры BVDV-NADL/G-Erns и BVDV-NADL/R-Erns имели кинетику роста, подобную родительскому BVDV-NADL, тогда как BVDV-NADL/P-Erns рос медленнее и имел меньшие титры в каждый момент времени, чем родительский вирус и две другие химеры.
Создали три химерных вируса BVDV-NADL/Erns, в которых ген/белок NADL Erns заменяли на Erns пестивируса жирафа, северного оленя или вилорогой антилопы. Все три химеры были жизнеспособными и инфекционными как в клетках RD, так и в клетках ВК-6. Данные in vitro продемонстрировали, что химерные белки Erns не влияли на нейтрализацию данных химер антисывороткой от крупного рогатого скота, вакцинированного BVDV. Это свидетельствует о том, что нейтрализующие эпитопы на химерных вирусах, независимо от того, где они локализованы, не подвергались влиянию замен Erns.
Данные химерные вирусы имели разную кинетику роста и по-разному реагировали с моноклональными антителами против BVDV или BVDV Erns.
BVDV-NADL/G-Erns и BVDV-NADL/R-Erns имели кинетику роста, подобную родительскому вирусу, тогда как BVDV-NADL/P-Erns рос медленнее и до меньшего титра, чем родительский вирус. Как BVDV-NADL/G-Erns, так и BVDV-NADL/R-Erns реагировали с моноклональным антителом 15С5 против BVDV Erns, тогда как BVDV-NADL/P-Erns не реагировал. Результаты сравнения последовательности показали, что G-Erns и R-Erns имели более высокие сходства последовательности с BVDV NADL (75,8% и 76,2%, соответственно), чем Р-Erns (59%). Эти данные, взятые в совокупности с результатами по реактивности МАb, свидетельствуют о том, что G-Erns и R-Erns могут быть антигенно более сходными с родительским Erns, чем Р-Erns.
Пример 2. Конструирование, серологическая характеризация и тестирование эффективности вакцин-кандидатов на основе химерного пестивируса
Штамм СМ5960 BVDV типа 1 и штамм СМ53637 BVDV типа 2 получали от Pfizer Global Manufacturing. Вирусные РНК экстрагировали с использованием набора для выделения вирусной РНК MagMax™ AI/ND (Ambion) согласно инструкциям производителя. Данные РНК подвергали обратной транскрипции с генерированием кДНК, используя систему ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) ThermoScript™ (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Химерные пестивирусы создавали путем замены гена Erns СМ5960 и СМ53637 на ген Erns пестивируса вилорогой антилопы (Р-Erns), используя способ перекрывающейся ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры, использованные для ПЦР, перечислены в Таблице 1.
Для конструирования химерной ДНК CM5960/P-Erns фрагмент кДНК СМ5960 между 5'UTR и 3'-концом гена С амплифицировали посредством ПЦР от кДНК СМ5960 с праймерами Олиго В-5 и Олиго 135. Ген Р-Erns амплифицировали посредством ПЦР из плазмидной ДНК, содержащей ген Р- Erns, с Олиго 136 и Олиго 137. Третий фрагмент между началом Е1 и 3'-концом Е2 амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ5960 с праймерами Олиго 138 и Олиго 237.
Вышеописанные фрагменты очищали на геле с использованием набора для экстракции из геля QIAquick (Qiagen) и подвергали сборке посредством ПЦР для создания одного фрагмента с Олиго В-5 и Олиго 237. Фрагмент между областью Е1 и областью NS5B амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ5960 с праймерами Олиго Р7 и Олиго Р8. Другой фрагмент между областью NS5A и концом 3'UTR амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ5960 с праймерами Олиго РЗ и Олиго 84. Эти три фрагмента затем очищали на геле и подвергали сборке посредством ПЦР с Олиго В-5 и Олиго 84 для создания полноразмерного химерного генома СМ5960/Р-Erns.
Для конструирования химерной ДНК СМ53637/Р-Erns фрагмент кДНК СМ53637 между 5'UTR и 3'-концом гена С амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ53637 с праймерами Олиго 296-1 и Олиго 297. Второй фрагмент между началом Е1 и 3'-концом Е2 амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ53637 с праймерами Олиго 298 и Олиго 303. Эти два фрагмента очищали на геле и совместно с фрагментом, кодирующим ген Р-Erns (см. выше), подвергали сборке посредством ПЦР с созданием одного фрагмента, используя Олиго 296-1 и Олиго 303.
Фрагмент между областью Е1 и областью NS3 затем амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ53637 с праймерами Олиго 298 и Олиго 299. Другой фрагмент между областью NS3 и концом 3'UTR также амплифицировали посредством ПЦР из кДНК СМ53637 с праймерами Олиго 300 и Олиго 92-1. Эти два фрагмента и фрагмент, приведенный выше, очищали на геле и собирали посредством ПЦР с Олиго 296-1 и Олиго 92-1 с созданием полноразмерного химерного генома CM53637/P-Erns.
РНК-транскрипты полноразмерного вирусного генома генерировали из ДНК химерного CM5960/P-Erns и химерного CM53637/P-Erns с использованием набора mMessage mMachine T7 Ultra (Ambion). Качество и количество каждого РНК-транскрипта определяли на РНК геле. Культуры клеток RD, выращенные в течение ночи в лунках 6-луночных планшетов, трансфицировали вирусной РНК с использованием реагента липофектин (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. После трансфекции клетки инкубировали при 37°С в течение 3 суток. Данные клетки плюс супернатанты пассировали от одного до нескольких раз в клетках RD и/или ВК-6. Супернатанты затем серийно пассировали в клетках ВК-6. Супернатанты собирали и хранили при -80°С.
Для подтверждения идентичности высвобожденного рекомбинантного вируса вирусную РНК из собранных супернатантов экстрагировали с использованием набора для выделения вирусной РНК MagMax™ AI/ND (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. Данные РНК подвергали обратной транскрипции с использованием системы ОТ-ПЦР ThermoScript™ (Invitrogen) согласно инструкциям производителя и область каждой химеры между 5'UTR и Е2 или р7 амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймеров Олиго В-5 и Олиго 237 (для химеры СМ5960/Р-Erns) или Олиго 296-1 и Олиго 321 (для химеры СМ53637/Р-Erns) (Таблица 1). Продукты ОТ-ПЦР затем секвенировали.
Клеточные монослои либо от трансфекции вирусной РНК, либо от вирусной инфекции фиксировали в 80%-ном ацетоне. MAb, специфичные в отношении BVDV, использовали для иммуногистохимии в сочетании с набором антитела против мышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой АВС Elite (Vector Laboratories). Окрашивание развивалось с использованием пероксидазного субстрата VI Р (Vector Laboratories).
Результаты. Были сконструированы и высвобождены химерные вирусы СМ53637/Р-Erns и СМ53637/Р-Erns. Области от 5'UTR до Е2, включающие области химерного Erns вилорогой антилопы, были подтверждены секвенированием. Обе химеры были жизнеспособными и инфекционными и в клетках RD, и в ВК-6. При иммуногистохимическом окрашивании обе химеры не были реактивными в отношении MAb 15С5, специфичного в отношении BVDV Erns, но реактивными в отношении MAb 20.10.6, специфичного в отношении BVDV NS3.
Последовательность химерного пестивируса (BVDV-CM5960 (BVDV типа О)/Р-Erns) представлена в перечне последовательностей как SEQ ID NO: 31. Последовательность химерного пестивируса (BVDV-CM53637 (BVDV типа И)/Р-Erns) представлена в перечне последовательностей как SEQ ID NO: 32.
Химера СМ5960/Р-Erns была биологически клонирована ограниченным разведением (относительно методологии см. приведенный выше Пример 1).
Пример 3. Тестирование эффективности вакцин-кандидатов на основе химерного пестивируса в модели респираторного заболевания телят
Приобретали BVDV-отрицательных здоровых телят, случайным образом распределяли их в группы исследования и содержали под надзором осуществляющего уход ветеринара. Тестируемую вакцину объединяют со стерильным адъювантом и вводят либо внутримышечной (IM), либо подкожной (SC) инъекцией, либо интраназальной инокуляцией (IN). Вакцину дают в виде одной или двух доз. Две дозы вакцины вводят с интервалом от 21 до 28 суток.
Животных затем подвергают контрольному заражению на сутки 21-28 после последней вакцинации штаммом BVDV типа 1 или типа 2. Заражающий инокулят дают интраназально в виде 4-мл разделенной дозы, по 2 мл в ноздрю. На протяжении данного исследования также содержали контрольные группы, состоящие из невакцинированных незараженных животных и/или из невакцинированных зараженных животных.
Ежесуточно отслеживают клинические параметры, включающие ректальную температуру, депрессию, анорексию и диарею. Титры нейтрализации сыворотки определяют анализом устойчивого снижения содержания вируса в сыворотке на культуре бычьих клеток, используя последовательные разведения сыворотки в сочетании со штаммом BVDV типа 1 или 2. Выделение BVDV в культуре бычьих клеток после заражения проводят из образцов периферической крови. BVDV-положительную культуру клеток определяют путем непрямой иммунофлуоресценции. Для демонстрации защиты после заражения демонстрируют снижение частоты возникновения инфекции в вакцинированных группах по сравнению с контрольными группами.
Пример 4. Тестирование эффективности вакцины на основе химерного пестивируса в модели беременной коровы/теленка
BVDV-отрицательных коров и нетелей половозрелого возраста приобретают и случайным образом распределяют в вакцинируемую тест-группу или группу плацебо (контрольная группа). Коров дважды прививают внутримышечной (IM) или подкожной (SC) инъекцией либо вакцины, либо плацебо с интервалом от 21 до 28 суток. После второй вакцинации все коровы получают IM инъекцию простагландина для синхронизации течки. Коров, демонстрирующих течку, осеменяют посредством искусственного осеменения сертифицированной BVDV-отрицательной спермой. Приблизительно на 60 сутки беременности статус беременности коров устанавливают путем ректальной пальпации.
Приблизительно через 6 недель из каждой тестируемой группы случайным образом выбирают коров с подтвержденными беременностями. Каждой из этих коров проводят контрольное заражение интраназальной инокуляцией BVDV типа 1 или 2. Образцы крови отбирают в сутки заражения и в кратные интервалы после заражения с целью выделения BVDV.
Через двадцать восемь суток после заражения проводят левосторонние лапаротомии и извлекают амниотическую жидкость от каждой коровы. Непосредственно перед хирургическим вмешательством у каждой коровы берут пробы крови для анализов нейтрализации сыворотки. После родоразрешения путем кесарева сечения у каждого плода берут пробу крови. Плоды затем умерщвляют и ткани асептически собирают с целью выделения BVDV. В случаях, когда происходят спонтанные аборты, пробы крови у самок берут при обнаружении выкидыша и через две недели. Парные пробы крови и абортированных плодов подвергают серологическому тестированию и выделению вируса. Эффективность вакцины демонстрируют по отсутствию или снижению инфекции плода и по аборту на поздних сроках.
Пример 5. Диагностические анализы для дифференцировки между вакцинированным и инфицированным естественным путем крупным рогатым скотом
Крупный рогатый скот, вакцинированный вакциной по настоящему изобретению, можно подвергнуть сравнению с крупным рогатым скотом, инфицированным естественным путем BVDV дикого типа. Крупный рогатый скот разного возраста вакцинируют вакциной на основе либо живого, либо инактивированного химерного пестивируса согласно предоставленным инструкциям. Пробы сыворотки отбирают через 2-3 недели или позднее после вакцинации. Для дифференцировки между крупным рогатым скотом, который получил вакцину на основе химерного пестивируса, от крупного рогатого скота, инфицированного полевым (дикого типа) штаммом BVDV, пробы сыворотки тестируют посредством дифференциального диагностического анализа. Химерный пестивирус вызывает продукцию специфичных антител, которые связываются с Erns белком химерного пестивируса, но не с Erns белком, присутствующим на BVDV дикого типа. В контексте BVDV дикого типа верно обратное: генерируются специфичные антитела, которые распознают Erns белок, присутствующий на BVDV дикого типа, но не Erns белок, присутствующий на химерном пестивирусе. Способы анализа специфичности связывания и аффинности антитела хорошо известны в данной области техники и включают, без ограничения, такие форматы иммуноанализа, как конкурентный ELISA, прямой пептидный ELISA, разновидности вестерн-блоттинга, непрямые иммуноферментные анализы и тому подобное.
Для конкурентного ELISA в качестве источника антигенов используют целые или частичные вирусные антигены пестивируса дикого типа или химерного пестивируса, включая Erns белок (полученный естественным путем, синтетически или рекомбинантно). После покрытия планшета ELISA антигеном в щелочных условиях пробы сыворотки крупного рогатого скота и разведения добавляют вместе с оптимизированным разведением MAb, специфичного в отношении либо Erns белка BVDV дикого типа, либо Erns белка химерного пестивируса, и инкубируют в течение 30-90 мин. Для обеспечения колориметрического обнаружения связывания пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу конъюгируют с данным MAb. После промывки планшетов добавляют хромогенный субстрат, специфичный в отношении фермента, и после конечной стадии инкубации измеряют оптическую плотность каждой лунки при длине волны, подходящей для используемого субстрата. Степень ингибирования связывания меченого MAb зависит от уровня антител в сыворотке крупного рогатого скота, которые специфично распознают белок, покрывающий планшет.
В случае, когда тестируемым антигеном является химерный Erns белок (например, Erns вилорогой антилопы), присутствующий на химерном пестивирусе, отсутствие связывания mAb, специфичным в отношении Е"13 химерного пестивируса, указывает на присутствие в сыворотке крупного рогатого скота антител, которые распознают эпитоп, специфичный для данного химерного пестивируса, что указывает на вакцинацию. В противоположность этому, сыворотка от крупного рогатого скота, не иммунизированного, но инфицированного естественным путем, не будет содержать антитела, которые будут связываться с Erns белком химерного пестивируса, покрывающим планшет. Следовательно, данное mAb, специфичное в отношении Erns химерного пестивируса, будет связываться со связанным белком и приводить к последующему развитию окраски.
В случае, когда тестируемым антигеном является Erns белок, присутствующий на BVDV дикого типа, отсутствие связывания mAb, специфичным в отношении Erns BVDV дикого типа, указывает на присутствие в сыворотке крупного рогатого скота антител, которые распознают эпитоп, специфичный в отношении BVDV дикого типа, указывая на естественную инфекцию (BVDV дикого типа). В противоположность этому, сыворотка от крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной на основе химерного пестивируса, не будет содержать антитела, которые будут связываться с Erns белком BVDV дикого типа, покрывающим планшет. Следовательно, mAb, специфичные в отношении Erns BVDV дикого типа, будут связываться со связанным белком и приводить к последующему развитию окрашивания.
Для разработки такого анализа использовали следующие способы.
Во-первых, сконструировали рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий Erns BVDV-NADL. Часть белка С BVDV плюс полноразмерный Erns ген амплифицировали посредством ПЦР из плазмиды, содержащей полноразмерную кДНК BVDV-NADL с праймерами Олиго 250 (SEQ ID NO: 29; 5'-CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC-3') и Олиго 252 (SEQ ID NO: 30; 5'-TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC-3'). Данный ПЦР-продукт клонировали в pENTR™ /D-TOPO (Invitrogen) и трансформировали в компетентную Е. coli One Shot® (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Рекомбинантную плазмиду извлекали и вставку подтверждали секвенированием. Эту плазмиду обозначили pENTR-Erns. pENTR-Erns и бакуловирусную систему экспрессии BaculoDirect™ (Invitrogen) использовали для конструирования рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего Erns BVDV-NADL, согласно инструкциям производителя. Генерировали рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий Erns BVDV-NADL, очищали из бляшек, наращивали и хранили как при 4°С, так и при -80°С. Экспрессию Erns BVDV-NADL в данном рекомбинантном бакуловирусе подтверждали иммунофлуоресцентным окрашиванием и вестерн-блоттингом против MAb 15C5, специфичного в отношении Erns BVDV, следуя традиционным способам вестерн-блоттинга.
Для продукции антигена ELISA клетки SF21 в 100 мл суспензионной культуры инфицировали 0,5 мл маточного раствора рекомбинантного бакуловируса. Клетки собирали после 4 суток инкубации при 27°С. Клетки центрифугировали при низкой скорости (примерно 800 g) в течение 10 мин для того, чтобы собрать данные клетки, и один раз промывали PBS. Клетки лизировали 150 мМ NaCI, 50 мМ Tris HCI, pH 8,0 и 1% игепал (IGEPAL) CA-630. Эту смесь сперва инкубировали на льду в течение 10 минут и затем при -80°С в течение 1 часа. После оттаивания смесь осветляли центрифугированием при 1000 g в течение 15 минут. Супернатант дополнительно осветляли центрифугированием при 8000 g в течение 20 минут при 4°С. Конечный супернатант, обозначенный лизат бакуло-Erns, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.
При проведении данного анализа планшеты ELISA покрывали в течение ночи при 4°С 100 мкл/лунку моноклональным антителом MAb WB210 (Агенство ветеринарных лабораторий; тип 1, специфичное в отношении Erns BVDV), разведенным 1:1000 в карбонатно/бикарбонатном буфере (рН 9,0). На следующие сутки планшеты промывали три раза и блокировали блокирующим буфером (PBS, содержащий 1% натриевой соли казеина и 0,05% Tween 20) при 37°С в течение 1 часа. Данные планшеты затем промывали три раза блокирующим буфером, добавляли в каждую лунку 100 мкл лизата бакуло-Erns (разведенного в PBS 1:3200) и планшеты инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После трех промывок блокирующим буфером в лунки добавляли 100 мкл неразведенных проб сыворотки крупного рогатого скота, за исключением одной колонки лунок (для того чтобы она служила в качестве неконкурирующих контролей 15C5-HRP), и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После еще трех промывок блокирующим буфером в каждую лунку добавляли 100 мкл конъюгата MAb 15C5-HRP (специфичного в отношении Erns BVDV, разведенного 1:20000 в блокирующем буфере) и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. После трех промывок блокирующим буфером в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата ABTS (растворы пероксидазных субстратов А+В; KPL, США) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-60 минут для развития окрашивания. Оптическую плотность (ОП) измеряли при длине волны 405 нм. Процентную долю снижения ОП для каждой пробы сыворотки рассчитывали по следующей формуле:
[1 - (ОП пробы+средняя ОП контролей 15C5-HRP)]×100%.
Результаты
Все пробы сыворотки, которые были тестированы анализом на нейтрализацию вируса (VN) как положительные, имели более чем 82%-ное снижение ОП, за исключением пробы №13851 (Таблица 4). Все пробы сыворотки, которые были тестированы анализом на нейтрализацию вируса как отрицательные, имели менее чем 17%-ное снижение ОП, за исключением пробы №5150 (Таблица 4). Данное расхождение можно объяснить различиями в том, как проводятся данные анализы, так как в них измеряют разные антитела, и доля специфичных антител варьирует среди животных.
Таблица 4. | ||||
Пробы сыворотки, положительные и отрицательные в отношении BVDV, в конкурентном ELISA s MAb15C5 | ||||
№ ряда |
№ пробы | ОП пробы | Средняя ОП колонки, без сыворотки | % снижения |
1 | 40021 | 0,0615 | 0,907013 | 93,21950182 |
2 | 40014 | 0,0965 | 0,907013 | 89,36068171 |
3 | 40422 | 0,0639 | 0,907013 | 92,95489701 |
4 | 40372 | 0,0754 | 0,907013 | 91,68699897 |
5 | 40222 | 0,0634 | 0,907013 | 93,01002301 |
6 | 40152 | 0,0894 | 0,907013 | 90,14347093 |
7 | 13461 | 0,0663 | 0,907013 | 92,6902922 |
8 | 13851 | 0,641 | 0,907013 | 29,32846607 |
9 | 13801 | 0,1599 | 0,907013 | 82,37070472 |
10 | 13904 | 0,073 | 0,907013 | 91,95160378 |
11 | 40504 | 0,0625 | 0,907013 | 93,10924981 |
12 | 40471 | 0,0914 | 0,907013 | 89,92296693 |
13 | 35037 | 0,0639 | 0,907013 | 92,95489701 |
14 | 13690 | 0,159 | 0,907013 | 82,46993152 |
15 | 13797 | 0,0859 | 0,907013 | 90,52935294 |
16 | 6127 | 0,0886 | 0,907013 | 90,23167253 |
17 | 5138 | 0,7434 | 0,907013 | 18,03866097 |
18 | 5139 | 0,8423 | 0,907013 | 7,13473787 |
19 | 5141 | 0,7732 | 0,907013 | 14,75315128 |
20 | 5142 | 0,7475 | 0,907013 | 17,58662776 |
21 | 5144 | 0,8293 | 0,907013 | 8,568013909 |
22 | 5145 | 0,9488 | 0,907013 | -4,607100449 |
23 | 5146 | 0,9451 | 0,907013 | -4,199168038 |
24 | 5147 | 1,0138 | 0,907013 | -11,77348064 |
25 | 5148 | 0,9322 | 0,907013 | -2,7769172 |
26 | 5149 | 0,9794 | 0,907013 | -7,980811741 |
27 | 5150 | 0,1157 | 0,907013 | 87,24384325 |
Ряды 1-16: Положительные пробы сыворотки крупного рогатого скота | ||||
Ряды 17-27: Отрицательные пробы сыворотки крупного рогатого скота | ||||
- Все пробы сыворотки в ELISA использовали неразведенными |
Хотя настоящее изобретение описано со значительными подробностями со ссылкой на его определенные варианты, возможны и другие варианты. Следовательно, объем прилагаемой формулы изобретения не должен ограничиваться описанием содержащихся здесь вариантов.
Claims (13)
1. Химерный вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV), способный обеспечить возможность дифференцировки между крупным рогатым скотом, вакцинированным указанным химерным вирусом, и крупным рогатым скотом, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок, где дополнительно указанный химерный вирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из пестивируса вилорогой антилопы (Р-Erns).
2. Штамм химерного вируса диареи крупного рогатого скота CM5960/Р-Erns, полученный путем замены гена Erns штамма CM5690 BVDV на ген Erns пестивируса вилорогой антилопы (Р-Erns), для использования для дифференцировки между крупным рогатым скотом, вакцинированным указанным химерным вирусом, и крупным рогатым скотом, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа.
3. Штамм химерного вируса диареи крупного рогатого скота CM5960/Р-Erns, полученный путем замены гена Erns штамма СМ53637 BVDV на ген Erns пестивируса вилорогой антилопы (Р-Erns), для использования для дифференцировки между крупным рогатым скотом, вакцинированным указанным химерным вирусом, и крупным рогатым скотом, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа.
4. Штамм химерного вируса диареи крупного рогатого скота, депонированный как АТСС РТА-9939 в Американской коллекции типовых культур (АТССR), для применения для дифференцировки между крупным рогатым скотом, вакцинированным указанным химерным вирусом, и крупным рогатым скотом, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа.
5. Клетка-хозяин, содержащая химерный вирус по п.1, для репликации указанного вируса.
6. Полинуклеотидная молекула, кодирующая химерный вирус по п.1.
7. Иммуногенная композиция для изготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекций, вызванных BVDV, содержащая химерный вирус по п.1 и ветеринарно приемлемый носитель.
8. Иммуногенная композиция для изготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекций, вызванных BVDV, содержащая полинуклеотидную молекулу по п.6 и ветеринарно приемлемый носитель.
9. Вакцина, содержащая химерный вирус по п.1 и ветеринарно приемлемый носитель, для дифференцировки между крупным рогатым скотом, вакцинированным указанным химерным вирусом, и крупным рогатым скотом, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа.
10. Набор, содержащий вакцину по п.9 в по меньшей мере одном контейнере и комплект напечатанных инструкций, для дифференцировки между крупным рогатым скотом, вакцинированным указанным химерным вирусом, и крупным рогатым скотом, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа.
11. Вакцина по п.9 для применения в лечении или предупреждения распространения инфекции, вызванной вирусом диареи крупного рогатого скота.
12. Способ дифференцировки между животным, вакцинированным вакциной по п.9, и животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, где животное, вакцинированное указанной вакциной, генерирует антитела к по меньшей мере одному эпитопу гетерологичного Erns белка, происходящего из пестивируса вилорогой антилопы, включающий стадии:
а) получения пробы сыворотки от животных;
б) проведения анализа указанных проб на присутствие или отсутствие антител;
в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной; и
г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV (вирус диареи крупного рогатого скота) дикого типа.
а) получения пробы сыворотки от животных;
б) проведения анализа указанных проб на присутствие или отсутствие антител;
в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной; и
г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV (вирус диареи крупного рогатого скота) дикого типа.
13. Способ дифференцировки между животным, инфицированным вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, и животным, вакцинированным вакциной по п.9, где животное, инфицированное вирусом диареи крупного рогатого скота дикого типа, генерирует антитела к по меньшей мере одному Erns эпитопу, который присутствует в вирусе диареи крупного рогатого скота дикого типа, но который не присутствует в химерном пестивирусе указанной вакцины, включающий стадии:
а) получения пробы сыворотки от животных;
б) проведения анализа указанных проб на присутствие или отсутствие антител;
в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV дикого типа; и
г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной.
а) получения пробы сыворотки от животных;
б) проведения анализа указанных проб на присутствие или отсутствие антител;
в) идентификации животного, имеющего указанные антитела, как инфицированного BVDV дикого типа; и
г) идентификации животного, не имеющего указанные антитела, как вакцинированного указанной вакциной.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11959408P | 2008-12-03 | 2008-12-03 | |
US61/119,594 | 2008-12-03 | ||
US17336309P | 2009-04-28 | 2009-04-28 | |
US61/173,363 | 2009-04-28 | ||
PCT/IB2009/055291 WO2010064164A1 (en) | 2008-12-03 | 2009-11-23 | Bovine viral diarrhea virus with a modified erns protein |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013141044/10A Division RU2013141044A (ru) | 2008-12-03 | 2013-09-06 | ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011121044A RU2011121044A (ru) | 2013-01-10 |
RU2524426C2 true RU2524426C2 (ru) | 2014-07-27 |
Family
ID=41665513
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011121044/10A RU2524426C2 (ru) | 2008-12-03 | 2009-11-23 | ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns |
RU2013141044/10A RU2013141044A (ru) | 2008-12-03 | 2013-09-06 | ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013141044/10A RU2013141044A (ru) | 2008-12-03 | 2013-09-06 | ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9567375B2 (ru) |
EP (1) | EP2373785B1 (ru) |
JP (1) | JP5744748B2 (ru) |
KR (1) | KR101453146B1 (ru) |
CN (1) | CN102239251B (ru) |
AR (1) | AR075484A1 (ru) |
AU (1) | AU2009323784B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0920982A8 (ru) |
CA (1) | CA2744750C (ru) |
CL (1) | CL2011001343A1 (ru) |
CO (1) | CO6440541A2 (ru) |
ES (1) | ES2681685T3 (ru) |
ME (1) | ME01140B (ru) |
MX (1) | MX2011005820A (ru) |
NZ (1) | NZ592979A (ru) |
RU (2) | RU2524426C2 (ru) |
TW (1) | TWI485248B (ru) |
UY (1) | UY32274A (ru) |
WO (1) | WO2010064164A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201104508B (ru) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2618841B1 (en) * | 2010-09-21 | 2016-10-19 | Intervet International B.V. | Bvdv vaccine |
WO2013027149A1 (en) * | 2011-08-24 | 2013-02-28 | Ah Usa 42 Llc | Improved vaccine diagnostics |
BR112017012484B1 (pt) * | 2014-12-19 | 2024-02-06 | Intervet International B.V | Vacina para combater tremor congênito (ct) do grupo a-ii em porcos |
US20190240311A1 (en) * | 2015-12-30 | 2019-08-08 | Intervet Inc. | Pestivirus marker vaccine |
DE102018110208A1 (de) * | 2018-04-27 | 2019-10-31 | Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover | Gentechnisch veränderte Pestiviren und deren Verwendung als Markerimpfstoff |
GB201910730D0 (en) * | 2019-07-26 | 2019-09-11 | Randox Teoranta | Bovine Pathogen Array |
CN111057132B (zh) * | 2019-10-16 | 2022-01-07 | 四川农业大学 | 牛病毒性腹泻病毒e0蛋白氨基酸及制备方法 |
CN110665002B (zh) * | 2019-10-29 | 2023-01-24 | 信阳市动物疫病预防控制中心 | 一种用于防治牛病毒性腹泻的抗体制剂及其制备方法 |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
CN112961224B (zh) * | 2021-03-26 | 2022-09-27 | 中国农业大学 | 牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用 |
CN114773438B (zh) * | 2022-05-24 | 2023-06-13 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种牛病毒性腹泻病毒e0截短蛋白、制备方法及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2158306C2 (ru) * | 1999-01-19 | 2000-10-27 | Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН | Способ выявления вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
EP1440149A2 (en) * | 2001-09-06 | 2004-07-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Infectious and attenuated bovine viral diarrhea virus clones; methods for their production and use |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5593873A (en) * | 1986-01-27 | 1997-01-14 | Syntro Corporation | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus |
US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5709865A (en) * | 1994-11-10 | 1998-01-20 | Biostar Inc. | Immunogenic composition against Bovine Viral Diarrhea Virus II glycoprotein 53 (BVDV-II gp53) |
US6001613A (en) * | 1996-05-24 | 1999-12-14 | Board Of Regents Of University Of Nebraska | Plasmid bearing a cDNA copy of the genome of bovine viral diarrhea virus, chimeric derivatives thereof, and method of producing an infectious bovine viral diarrhea virus using said plasmid |
US6060457A (en) * | 1996-06-20 | 2000-05-09 | Universite De Montreal | DNA plasmid vaccine for immunization of animals against BVDV |
EP0982402A1 (en) | 1998-08-14 | 2000-03-01 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Pestivirus vaccination |
EP2365082A1 (en) * | 2000-06-27 | 2011-09-14 | Pfizer Animal Health S.A. | BVDV virus-like particles |
US7361357B2 (en) * | 2003-07-29 | 2008-04-22 | Pfizer Inc. | Safe mutant viral vaccines |
US20090068223A1 (en) * | 2005-11-15 | 2009-03-12 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus |
-
2009
- 2009-11-23 CA CA2744750A patent/CA2744750C/en active Active
- 2009-11-23 KR KR1020117015168A patent/KR101453146B1/ko active IP Right Grant
- 2009-11-23 WO PCT/IB2009/055291 patent/WO2010064164A1/en active Application Filing
- 2009-11-23 AU AU2009323784A patent/AU2009323784B2/en active Active
- 2009-11-23 JP JP2011539129A patent/JP5744748B2/ja active Active
- 2009-11-23 RU RU2011121044/10A patent/RU2524426C2/ru active
- 2009-11-23 BR BRPI0920982A patent/BRPI0920982A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-11-23 EP EP09768236.3A patent/EP2373785B1/en active Active
- 2009-11-23 CN CN200980148483.7A patent/CN102239251B/zh active Active
- 2009-11-23 NZ NZ592979A patent/NZ592979A/xx unknown
- 2009-11-23 MX MX2011005820A patent/MX2011005820A/es active IP Right Grant
- 2009-11-23 ME MEP-2011-97A patent/ME01140B/me unknown
- 2009-11-23 ES ES09768236.3T patent/ES2681685T3/es active Active
- 2009-11-24 US US12/624,473 patent/US9567375B2/en active Active
- 2009-11-30 UY UY0001032274A patent/UY32274A/es not_active Application Discontinuation
- 2009-12-02 AR ARP090104645A patent/AR075484A1/es unknown
- 2009-12-02 TW TW098141210A patent/TWI485248B/zh active
-
2011
- 2011-06-02 CO CO11068897A patent/CO6440541A2/es not_active Application Discontinuation
- 2011-06-03 CL CL2011001343A patent/CL2011001343A1/es unknown
- 2011-06-17 ZA ZA2011/04508A patent/ZA201104508B/en unknown
-
2013
- 2013-09-06 RU RU2013141044/10A patent/RU2013141044A/ru not_active Application Discontinuation
-
2017
- 2017-02-13 US US15/430,837 patent/US20170151321A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2158306C2 (ru) * | 1999-01-19 | 2000-10-27 | Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН | Способ выявления вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции |
EP1440149A2 (en) * | 2001-09-06 | 2004-07-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Infectious and attenuated bovine viral diarrhea virus clones; methods for their production and use |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
RONECKER S, ZIMMER G, HERRLER G, GREISER-WILKE I, GRUMMER B.: "Formation of bovine viral diarrhea virus E1-E2 heterodimers is essential for virus entry and depends on charged residues in the transmembrane domains." J GEN VIROL., vol. 89, no. 9, September 2008 (2008-09), pages 2114-2121. VAN GENNIP H. G. P. ET AL: "Chimeric classical swine fever viruses containing envelope protein E or E2 of bovine viral diarrhoea virus protect pigs against challenge with CSFV and induce a distinguishable antibody response" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 19, no. 4-5, 15 October 2000 (2000-10-15), pages 447-459. DONG XN, CHEN YH.: "Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines." VACCINE, vol. 25, no. 2, 7 August 2006 (2006-08-07), pages 205-230. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102239251B (zh) | 2014-04-23 |
TWI485248B (zh) | 2015-05-21 |
KR20110091579A (ko) | 2011-08-11 |
BRPI0920982A2 (pt) | 2016-10-04 |
CO6440541A2 (es) | 2012-05-15 |
CN102239251A (zh) | 2011-11-09 |
CL2011001343A1 (es) | 2012-03-23 |
BRPI0920982A8 (pt) | 2017-09-19 |
ZA201104508B (en) | 2012-11-28 |
NZ592979A (en) | 2012-08-31 |
UY32274A (es) | 2010-06-30 |
JP2012510285A (ja) | 2012-05-10 |
US9567375B2 (en) | 2017-02-14 |
AU2009323784B2 (en) | 2013-08-15 |
AU2009323784A1 (en) | 2010-06-10 |
TW201024416A (en) | 2010-07-01 |
EP2373785B1 (en) | 2018-06-27 |
RU2013141044A (ru) | 2015-03-20 |
AR075484A1 (es) | 2011-04-06 |
ME01140B (me) | 2013-03-20 |
EP2373785A1 (en) | 2011-10-12 |
MX2011005820A (es) | 2011-06-21 |
KR101453146B1 (ko) | 2014-10-27 |
CA2744750C (en) | 2018-10-09 |
US20100136055A1 (en) | 2010-06-03 |
JP5744748B2 (ja) | 2015-07-08 |
ES2681685T3 (es) | 2018-09-14 |
CA2744750A1 (en) | 2010-06-10 |
RU2011121044A (ru) | 2013-01-10 |
US20170151321A1 (en) | 2017-06-01 |
WO2010064164A1 (en) | 2010-06-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2524426C2 (ru) | ВИРУС ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ БЕЛКОМ Erns | |
US8609827B2 (en) | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof | |
RU2561595C2 (ru) | Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs) | |
KR20080072719A (ko) | 약독화된 소 바이러스성 설사 바이러스를 포함하는 복합백신 | |
EP2658570B1 (en) | Bovine viral diarrhea virus type 1b vaccine compositions and methods | |
US20120021001A1 (en) | Marked bovine viral diarrhea virus vaccines | |
SK18232000A3 (sk) | Živá vakcína, pestivírus, bvdv pestivírus, nukleová kyselina, bvdv nukleová kyselina, spôsob oslabenia pestivírusov, spôsob výroby vakcíny, farmaceutický prostriedok s jej obsahom a jej použitie | |
CN102965348A (zh) | 具有经修饰的erns蛋白的牛病毒性腹泻病毒 | |
US8426575B2 (en) | N-linked glycosylation alteration in E1 glycoprotein of classical swine fever virus and novel classical swine fever virus vaccine | |
AU2013224704B2 (en) | Bovine viral diarrhea virus with a modified Erns protein | |
AU2016307935B2 (en) | Mycoplasma bovis compositions | |
US20150190499A1 (en) | Bovine influenza c virus compositions | |
MX2008005426A (en) | Marked bovine viral diarrhea virus vaccines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20150617 |
|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20151120 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner |