RU2519229C2 - Агенты, уменьшающие количество в-клеток, такие как антитела против cd20 или их фрагменты, для лечения синдрома хронической усталости - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к применению агента, уменьшающего количество B-клеток, для лечения синдрома хронической усталости, а также к способу лечения синдрома хронической усталости, включающему стадию введения агента, уменьшающего количество В-клеток, страдающему им индивидууму. Агент, уменьшающий количество B-клеток, может представлять собой предпочтительно гуманизированное уменьшающее количество B-клеток антитело против CD20 или фрагмент этого антитела, связывающий CD20. Применение данной группы изобретений, основанной на истощении количества В-клеток, эффективно в лечении синдрома хронической усталости. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 ил.,1 пр.

Description

В первом аспекте настоящее изобретение относится к антителу против CD20, уменьшающему количество B-клеток, или к фрагменту этого антитела, связывающему CD20, для лечения синдрома хронической усталости и миалгического энцефаломиелита. В частности, настоящее изобретение относится к применению моноклональных антител против CD20 или их фрагментов, которые предпочтительно гуманизированы, для лечения синдрома хронической усталости/миалгического энцефаломиелита у индивидуума, страдающего указанным заболеванием.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к агентам, уменьшающим количество B-клеток в целом, для лечения синдрома хронической усталости и миалгического энцефаломиелита у страдающего этим индивидуума.

Известный уровень техники

Синдром хронической усталости

Синдром хронической усталости (CFS) характеризуется необъяснимой тяжелой усталостью, сохраняющейся, по меньшей мере, в течение шести месяцев подряд, и существенным снижением предшествующих уровней профессиональной, социальной или личностной активности. Больные также часто испытывают постоянные или повторяющиеся симптомы, такие как ухудшение краткосрочной памяти или внимания, мышечная боль, суставная боль без признаков артрита, головная боль, нарушения сна и утомление после физической нагрузки (Fukuda K, et al., 1994, Ann Intern Med 121:953-9 et al., 1994). Хотя во многих исследованиях показаны небольшие изменения в анализах крови или радиологических исследованиях, не существует биологических маркеров или диагностических тестов.

Распространенность CFS в мире, как считается, составляет, по меньшей мере, 0,5% и отношение женщины:мужчины равно 3:1 (Wyller VB. 2007, Acta Neurol Scand Suppl 187:7-14).

Этиология CFS остается неясной. Различные гипотезы включают иммунологические, вирусные, нейроэндокринологические и психологические механизмы. Патогенез CFS, как предполагается, является мультифакторным и вовлекает как факторы хозяина, так и окружающей среды (Devanur & Kerr 2006).

В недавнем обзоре за ноябрь 2007 г., описывающем приоритеты текущих исследований CFS, подчеркивается срочная необходимость выяснения патогенеза (Kerr JR et al., 2007, J Clin Pathol 60:113-6).

Многие больные, страдающие CFS, имеют историю острой вирусной инфекции, предшествующей развитию усталости. Хотя по данным исследований существуют доказательства активации иммунной системы, механизмы заболевания остаются неизвестными. В 2001 г. сформировалась группа для совместных исследований в плане выяснения молекулярных механизмов CFS с целью разработки диагностического теста, а также разработки руководства по более специфичному лечению (Devanur LD, Kerr JR. 2006, J Clin Virol 37:139-50).

Проведено несколько работ по экспрессии генов при CFS, показывающих, что существуют специфичные, но не комплексные изменения генов, согласующиеся с дисфункцией иммунного ответа и защитных механизмов. Одно исследование на микроматрицах показало дифференциальную экспрессию 16 генов при CFS, предполагающее активацию Т-клеток и нарушение нейрональной функции и функции митохондрий (Kaushik N, et. al., 2005, J Clin Pathol 58:826-32). В другом исследовании на микроматрицах с использованием серийных образцов суммарной РНК мононуклеарных клеток периферической крови от больных с развитием CFS после инфицирования вирусом Эпштейна-Барра (EBV) и также от индивидуумов с инфицированием EBV без развития усталости заключалось, что происходит нарушение регуляции нескольких генов, влияющих на функцию митохондрий и клеточный цикл (Vernon SD, et аl., 2006, BMC Infect Dis 6:15). В другом исследовании экспрессии генов при CFS предполагалось нарушение генов, чувствительных к физической нагрузке, включая несколько генов, вовлеченных в мембранный транспорт, и гены ионных каналов (Whistler T, et al., 2005, BMC Physiol 5:5). Недавно анализ генных сетей при CFS выявил семь отдельных геномных подклассов с различиями в клинической представленности и тяжести заболевания (Kerr J, et al., 2007, J Clin Pathol). Несколько других исследований было посвящено глобальной экспрессии генов при CFS (Fang H, et al., 2006, Pharmacogenomics 7:429-40; Whistler T, et al., 2003, J Transl Med 1:10). Данные по экспрессии генов не являются окончательными, но предполагают, что при CFS существуют нарушения экспрессии генов, представляющих различные клеточные функции, и могут указывать на то, что заболевание имеет гетерогенный патогенез.

Преобладающей темой исследования CFS является поддерживаемое нарушение иммунной регуляции после острых экзогенных стимулов, таких как вирусная инфекция. Среди микробных патогенов, описываемых как связанные с CFS, находятся вирус Эпштейна-Барра (Lerner AM, et al., 2004, In Vivo 18:101-6), энтеровирус (Chia JK, Chia AY. 2007, J Clin Pathol), парвовирус B19 (Matano S, et al., 2003, Intern Med 42:903-5), цитомегаловирус (Lerner AM, et al., 2002, In Vivo 16:153-9), вирус герпеса человека типа 6 (Chapenko S, et al., 2006, J Clin Virol 37 Suppl 1:S47-51; Komaroff AL. 2006, J Clin Virol 37 Suppl 1:S39-46), Chlamydia pneumoniae (Nicolson GL, et al., 2003, Apmis 111:557-66). Однако данные являются противоречивыми (Soto NE, Straus SE., 2000, Herpes 7:46- 50).

В недавнем исследовании постинфекционного синдрома усталости не найдено различий в продукции цитокинов ex vivo в течение периода в 12 месяцев по сравнению с контролями сразу после выздоровления от инфекции (Vollmer-Conna U, et al., 2007, Clin Infect Dis 45:732-5). Другие заявляют, что, несмотря на доказательство активации иммунной системы, что продемонстрировано по росту количества активированных Т-клеток и повышенным уровням цитокинов, больные CFS могут обладать пониженной функцией иммунных клеток с низкой цитотоксичностью NK-клеток и дефицитом иммуноглобулинов (Patarca R. 2001, Ann N Y Acad Sci 933: 185-200).

Другие авторы сообщали о высоком числе циркулирующих В-лимфоцитов, измененных подклассах NK-клеток также с повышенной экспрессией молекул адгезии по сравнению с контролями (Tirelli U, et al., 1994, Scand J Immunol 40:601-8), в то время как в другом исследовании показано снижение CD56+ NK-клеток и снижение CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов у больных CFS (Racciatti D, et al., 2004, Int J Immunopathol Pharmacol 17:57-62). Было обнаружено также, что Т- и NK-клетки больных CFS экспрессируют на более низком уровне белок внутриклеточных гранул перфорин, что указывает на пониженную способность опосредовать цитотоксичность.

В одном исследовании показано несколько аномалий в лабораторных маркерах, связанных с иммунной функцией, у больных CFS (Klimas NG, et al., 1990, J Clin Microbiol 28:1403-10). Наиболее постоянным результатом была пониженная цитотоксичность NK-клеток, но также повышение CD8+ Т-клеток, увеличенное количество CD20+ B-клеток и повышение подкласса B-клеток, коэкспрессирующих CD20 и CD5 (Klimas et al., 1990). Эти данные были в некоторой степени поддержаны исследованием, сообщавшим об экспансии активированных CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов наряду с заметным снижением активности NK-клеток у больных CFS (Barker E, et al., 1994. Clin Infect Dis 18 Suppl 1:S136-41).

В недавнем исследовании, сравнивающем больных CFS с контролями, сообщалось о снижении экспрессии CD69 на Т-клетках и NK-клетках после митогенной стимуляции in vitro, указывающем на нарушение в ранней активации клеточного иммунитета, опосредуемого этими клетками (Mihaylova I, et al., 2007, Neuro Endocrinol Lett 28:477-83).

Однако данные по нарушению иммунной регуляции при CFS являются противоречивыми, и в исследовании, сравнивающем подклассы лимфоцитов у больных CFS с подклассами у больных депрессией, множественным склерозом и у здорового контроля, не найдено различий в подклассах Т-, В- или NK-клеток (Robertson MJ, et al., 2005, Clin Exp Immunol 141:326-32). Сходно в обзоре по иммунологии при CFS заключалось, что исследования, проведенные в данной области, характеризуются различным качеством, и что невозможно обнаружить совпадающего паттерна иммунологических аномалий (Lyall M, et al., 2003, J Psychosom Res 55:79-90).

Наряду с гипотезами о нарушении иммунной регуляции при CFS, в качестве механизма заболевания предполагалась аутоиммунная реакция на эндогенные вазоактивные нейропептиды (Staines DR., 2005, Med Hypotheses 64:539-42), однако она не поддержана научными данными. Автор также предположил наличие сходных механизмов в этиологии фибромиалгии, множественного склероза и бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона и синдрома детской внезапной смерти, выдвигая гипотезу о том, что аутоиммунная реакция против вазоактивных нейропептидов, действующих в качестве гормонов, нейротрансмиттеров, иммуномодуляторов и нейротрофических факторов, может объяснить сложные клинические картины этих заболеваний. Однако нет документальных подтверждений наличия аутоантител к этим нейропептидам при CFS.

В одном исследовании изучали присутствие циркулирующих антител против мышц и ЦНС у больных CFS и у контролей и не обнаружили патогенных антител. В другом сообщении об антиядерных антителах при CFS заключалось, что такая связь отсутствует (Skowera A, et al., 2002, Clin Exp Immunol 129:354-8), тогда как в другом исследовании общих аутоантител и антител против специфических антигенов нейронов обнаружены более высокие титры антител против белка 2, связанного с микротрубочками, и оцДНК при CFS (Vernon SD, Reeves WC. 2005, J Autoimmune Dis 2:5). В единственном исследовании показано присутствие аутоантител против мускаринового холинергического рецептора в подгруппе больных CFS (Tanaka S, et al., 2003, Int J Mol Med 12:225-30), описаны также более высокие уровни аутоантител против нерастворимых клеточных антигенов при CFS по сравнению с контролями (von Mikeecz A., et al., 1997, Arthritis Rheum 40: 295-305).

Однако не существует прямого доказательства с совпадающими данными в отношении присутствия патогенных аутоантител или опосредованных Т-лимфоцитами аутоиммунных реакций. Не получено непрямого доказательства в виде воссоздания заболевания CFS в животной модели путем иммунизации антигенами, аналогичными (предполагаемым) аутоантигенам человека.

В настоящее время CFS не определен как аутоиммунное заболевание, и последний протокол фармакологического лечения при CFS по обзору Кочаряна утверждает, что его этиология неизвестна. (Rawson KM, et al., 2007. Pharmacological treatments for chronic fatigue syndrome in adults. (Protocol) Cochrane Database of Systematic Reviews, Issue 4. Art. No.: CD006813.)

Другими гипотезами патогенеза CFS являются дисфункция тромбоцитов крови (Kennedy G, et al., 2006, Blood Coagul Fibrinolysis 17:89-92), неврологические (Natelson BH, et al., 2005, Clin Diagn Lab Immunol 12:52-5), нейроэндокринные (Van Den Eede F, et al., 2007, Neuropsychobiology 55:112-20), метаболические или автономные нарушения, дисфункция ионных каналов (Chaudhuri A, et al., 2000, Med Hypotheses 54:59-63), дефицит цинка (Maes M, et al., 2006, J Affect Disord 90:141-7), экспозиция с токсинами или предшествующие вакцинации (Appel S, et al., 2007, Autoimmunity 40:48-53). Другие сосредоточились на аномальном ответе на физическую нагрузку с нарушением внутриклеточной иммунной регуляции как возможном механизме патогенеза CFS (Nijs J, et al., 2004, Med Hypotheses 62:759-65). Также постинфекционное нарушение способности к синтезу n-3 и n-6 длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот выдвигалось в качестве важного момента патофизиологии CFS (Puri BK. 2007, J Clin Pathol 60:122-4).

Следовательно, последние обзоры по CFS в известных журналах констатируют, что заболевание в настоящее время имеет неизвестную причину (Hampton T. 2006, Jama 296:2915; Hooper M. 2007, J Clin Pathol 60:466-71; Prins JB, et al., 2006, Lancet 367:346-55). Таким образом, в отношении этиологии и патогенеза CFS не появилось никакой целостной картины.

Современное лечение CFS

Из-за отсутствия знания точного патогенеза и в связи с неизвестным причинным механизмом не существует стандартного лечения, специфичного для CFS. В систематическом обзоре заключалось, что CFS должен быть связан с «биопсихосоциальной моделью» с акцентом на прогрессирующую мышечную реабилитацию в сочетании с лечением поведенческих и когнитивных расстройств (Maquet et al., 2006, Ann Readapt Med Phys 49:337-47, 418-27).

Неизвестная этиология CFS, вероятно, является причиной осуществления необыкновенно малого количества исследований, оценивающих терапию, основанную на биологической гипотезе.

Так как большая часть доказательств предполагает нарушение регуляции иммунной системы, вероятно, ускоряемое экзогенным стимулом, в двух исследованиях оценено использование внутривенного гамма-глобулина для CFS. Одно является описанием случаев у трех больных CFS после острого инфицирования парвовирусом B19, которых лечили в течение 5 дней внутривенным иммуноглобулином с улучшением клинических симптомов и разрешением нарушения регуляции цитокинов (Kerr et al., 2003., Clin Infect Dis 36:e100-6). В двойном слепом контролируемом плацебо рандомизированном исследовании 71 молодого человека с CFS проводили три отдельные инфузии гамма-глобулина в месяц с функциональным улучшением у группы, получавшей гамма-глобулин, при контроле раз в шесть месяцев со средней продолжительностью 18 месяцев. В первые шесть месяцев испытания сообщалось об улучшении как у группы с плацебо, так и у группы с лечением гамма-глобулином (Rowe 1997, J Psychiatr Res 31:133-47).

В пилотном исследовании, представленном в виде реферата (Lamprecht 2001, Meeting of the American association of chronic fatigue syndrome (AACFS). Seattle), шесть больных CFS получали этанерсепт (энбрел, т.е., гибридный белок рецептора p75 фактора некроза опухолей человека и Fc, который представляет собой растворимый конкурент рецептора TNF, действующий как ингибитор опосредованного TNF клеточного ответа) и сообщалось о клиническом улучшении.

Среди других терапевтических стратегий использовали валганцикловир для лечения 12 больных с длительно продолжающейся усталостью и повышенными титрами антител против вируса Эпштейна-Барра или вируса-6 герпеса человека и у девяти получили улучшение симптомов, однако с неопределенностью в отношении того, опосредовались ли эти эффекты противовирусным действием или иммуномодуляцией (Kogelnik AM,. 2006., J Clin Virol 37 Suppl 1:S33-8). Лечение азитромицином, антибиотиком с иммуномодулирующими свойствами, давало улучшение в 59% из 99 больных CFS (Vermeulen & Scholte 2006, J Transl Med 4:34).

В недавнем обзоре приоритетов современных исследований по CFS (Kerr et al., 2007, J Clin Pathol 60:113-6) поддерживаются новые исследования, сфокусированные на понимании молекулярного патогенеза заболевания, тестировании пригодных биомаркеров и имеющие целью разработку специфичного лечения. Доступны разнообразные молекулярные методы, и они используются для этой цели, включая анализы всеобъемлющей экспрессии генов с использованием микроматриц.

Ритуксимаб как пример антител, уменьшающих количество B-клеток в В-клеточной лимфоме и при аутоиммунных заболеваниях

Ритуксимаб (мабтера, RITUXAN®) представляет собой моноклональное антитело, направленное против эпитопа во внеклеточной части трансмембранной молекулы CD20. Антитело является гибридом антитела человека и мыши, в котором фрагмент антигенсвязывающей части (Fab) является мышиным, а фрагмент части Fc получен от человека. Белок CD20 экспрессируется на В-лимфоцитах, но не на стволовых клетках или на зрелых плазматических клетках. CD20 экспрессируется также на подавляющем большинстве В-клеточных лимфом. CD20 вовлечен в регуляцию трансмембранной проводимости кальция и прогрессии клеточного цикла, но точная его функция неизвестна (Janas et al., 2005, Biochem Soc Symp:165-75). При связывании ритуксимаба с CD20 опосредуется иммунологическое уничтожение клеток путем связывания комплемента с частью Fc с активацией каскада комплемента, а также путем активации антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (Glennie et al., 2007, Mol Immunol 44:3823-37).

Молекула не интернализуется или сбрасывается с плазматической мембраны после связывания с ритуксимабом, что позволяет моноклональному антителу сохраняться на клеточной поверхности, продолжая осуществлять иммунологическую атаку.

Роль ритуксимаба в лечении В-клеточных лимфом быстро выясняется. Иммунохимиотерапия с использованием ритуксимаба в сочетании с химиотерапией или монотерапия ритуксимабом при медленно растущих лимфомах являются в настоящее время современными стандартами лечения и характеризуются улучшением общей выживаемости при наиболее обычном типе агрессивных В-клеточных лимфом (диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме) как у пожилых (Coiffier et al., 2002, N Engl J Med 346:235-42), так и более молодых больных (Pfreundschuh et al., 2006, Lancet Oncol 7:379-91), а также при наиболее обычной медленно растущей лимфоме (фолликулярной лимфоме) (Marcus et al., 2005, Blood 105:1417-23). У отобранных больных с фолликулярной лимфомой ритуксимаб используется также в качестве поддерживающей терапии после индукционной терапии путем инфузий каждые три месяца в течение двух лет, демонстрируя улучшенное общее выживание (van Oers et al., 2006, Blood 108:3295-301).

В последние годы было доказано, что ритуксимаб эффективен также в лечении аутоиммунных заболеваний, когда уменьшение количества B-клеток часто связано с клиническим улучшением, например, при ревматоидном артрите (Dass et al., 2006, Expert Opin Pharmacother 7:2559-70). Перечень различных аутоиммунных заболеваний, при которых ритуксимаб играет терапевтическую роль, растет (Sanz et al., 2007, Front Biosci 12:2546-67). Для направленной доставки к В-клеткам и для их снижения в будущем будет важна разработка антител к специфическим подклассам B-клеток (Dorner & Lipsky 2007, Expert Opin Biol Ther 7:1287-99).

Антитело ритуксимаб представляет собой сконструированное генно-инженерным способом гибридное моноклональное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20. Ритуксимаб представляет собой антитело, называемое «C2B8» в патенте США No. 5736137. RITUXAN® показан для лечения больных с рецидивирующей, или резистентной низкодифференцированной, CD20-позитивной, В-клеточной неходжкинской лимфомы. Исследования механизма действия in vitro показали, что RITUXAN® связывает комплемент человека и лизирует линии лимфоидных B-клеток путем комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Reff et al., Blood 83(2):435- 445 (1994)). Кроме того, он обладает существенной активностью в тестах антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Позднее показано, что RITUXAN® в тестах по включению меченного тритием тимидина обладает антипролиферативными эффектами и прямо индуцирует апоптоз, тогда как другие антитела против CD19 и CD20 не делают этого (Maloney et al., Blood 88(10):637a (1996)). Синергичное действие RITUXAN® и химиотерапии и токсинов наблюдалось также экспериментально. В частности, RITUXAN® сенсибилизирует устойчивые к лекарствам клеточные линии В-клеточных лимфом человека к цитотоксическим эффектам доксорубицина, CDDP, VP-16, дифтерийного токсина и рицина (Demidem et al., Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)). В преклинических исследованиях in vivo показано, что RITUXAN® уменьшает количество B-клеток в периферической крови, лимфатических узлах и костном мозге макак юго-восточной Азии, преимущественно с помощью процессов, опосредованных комплементом и клеточной токсичностью (Reff et al., Blood 83(2):435-445 (1994)). Патенты и публикации, касающиеся антител CD20, включают патенты США Nos. 5776456, 5736137, 5843439, 6399061 и 6682734, а также патентные заявки США nos US 2002/0197255 A1, US 2003/0021781 A1, US 2003/0082172 A1, US 2003/0095963 A1, US 2003/0147885 A1 (Anderson et al.); патент США No. 6455043 B1 и WO 00/09160 (Grillo-Lopez, A.); WO 00/27428 (Grillo-Lopez and White); WO 00/27433 (Grillo-Lopez and Leonard); WO 00/44788 (Braslawsky et al.); WO 01/10462 (Rastetter, W.); WO 01/10461 (Rastetter and White); WO 01/10460 (White and Grillo-Lopez); US 2001/0018041 A1, US 2003/0180292 A1, WO 01/34194 (Hanna and Hariharan); заявки США no. US 2002/0006404 и WO 02/04021 (Hanna and Hariharan); заявки США no. US 2002/0012665 A1 и WO01/74388 (Hanna, N.); заявку США no. US 2002/0058029 A1 (Hanna, N.); заявку США no. US 2003/0103971 A1 (Hariharan and Hanna); заявки США no. US 2002/0009444A1 и WO 01/80884 (Grillo-Lopez, A); WO 01/97858 (White, C); заявки США no. US 2002/0128488 A1 и WO 02/34790 (Reff, M.); WO 02/060955 (Braslawsky et al.); WO 2/096948 (Braslawsky et al.); WO 02/079255 (Reff and Davies); патенты США No. 6171586 B1 и WO 98/56418 (Lam et al.); WO 98/58964 (Raju, S.); WO 99/22764 (Raju, S.); WO 99/51642, патент США No. 6194551 B1, патент США No. 6242195 B1, патент США No. 6528624 B1 и патент США No. 6538124 (Idusogie et al.); WO 00/42072 (Presta, L.); WO 00/67796 (Curd et al.); WO 01/03734 (Grillo-Lopez et al.); заявки США no. US 2002/0004587 A1 и WO 01/77342 (Miller and Presta); заявку США no. US 2002/0197256 (Grewal, L); заявку США no. US 2003/0157108 A1 (Presta, L.); патенты США Nos. 6565827 B1, 6090365 B1, 6287537 B1, 6015542, 5843398 и 5595721, (Kaminski et al.); патенты США Nos. 5500362, 5677180, 5721108, 6120767, 6652852 B1 (Robinson et al.); патент США No. 6410391Bl (Raubitschek et al.); патенты США No. 6224866Bl и WO 00/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 01/13945 (Barbera-Guillem, E.); WO 00/67795 (Goldenberg); заявки США No. US 2003/0133930 A1 и WO 00/74718 (Goldenberg and Hansen); WO 00/76542 (Golay al.); WO 01/72333 (Wolin and Rosenblatt); патент США No. 6368596Bl (Ghetie et al.); патент США No. 6306393 и заявку США no. US 2002/0041847 A1, (Goldenberg, D.); заявки США no. US 2003/0026801 A1 (Weiner and Hartmann); WO 02/102312 (Engleman, E.); патентные заявки США No. 2003/0068664 (Albitar et al.); WO03/002607 (Leung, S.); WO 03/049694, US 2002/0009427 A1 и US 2003/0185796 A1 (Wolin et al.); WO 03/061694 (Sing and Siegall); US 2003/0219818 A1 (Bohen et al.); US 2003/0219433 A1 и WO 03/068821 (Hansen et al.); US 2003/0219818 A1 (Bohen et al.); US 2002/0136719 A1 (Shenoy et al.); WO 2004/032828 (Wahl et al.), каждая из которых специально включена в настоящее описание в качестве ссылки. См. также патент США No. 5849898 и заявку EP no. 330191 (Seed et al.); патент США No. 4861579 и EP 332865 A2 (Meyer and Weiss); USP 4861579 (Meyer et al.); WO 95/03770 (Bhat et al.); US 2003/0219433 A1 (Hansen et al.).

Профиль безопасности ритуксимаба

Профиль безопасности ритуксимаба при лечении В-клеточных лимфом хорошо известен и основывается на результатах базы данных по 370000 больных (Kavanaugh 2006, J Rheumatol Suppl 77:18-23). При лечении лимфом наиболее обычным побочным эффектом является реакция, от слабой до умеренной, при первой инфузии, вызываемая секрецией цитокинов, в первую очередь у больных с высокой исходной опухолевой массой (Solal-Celigny 2006, Leuk Res 30 Suppl 1:S16-21). В процессе инфузии могут наблюдаться аллергические реакции, обусловленные белковой природой молекулы ритуксимаба.

В отношении терапии, направленной на все B-клетки, ожидаемыми являются эффекты на гуморальный иммунитет. При продолжительном лечении и, в особенности, при поддерживающем лечении, т.е. инфузиях каждые три месяца в течение двух лет (после индукционной терапии с помощью, возможно, 6-8 инфузий ритуксимаба каждые три недели), уменьшение количества B-клеток более выражено, и большинство больных должно иметь гипогаммаглобулинемию. Однако низкие уровни иммуноглобулинов и уменьшение количества B-клеток, как полагают, не вносит существенный вклад в клинический риск инфекций.

Одним потенциальным серьезным побочным эффектом использования ритуксимаба является развитие интерстициального заболевания легких. Оно является потенциально опасным для жизни осложнением, но очень редко с только 16 случаями, описанными в литературе (Wagner et al., 2007, Am J Hematol 82:916-9).

Алгоритмы безопасности лечения ритуксимабом при хронических аутоиммунных заболеваниях используются в клинических исследованиях (Edwards et al., 2006, Best Pract Res Clin Rheumatol 20:915-28), пока при меньшем времени отслеживания. Следовательно, долгосрочный период безопасности остается в состоянии выяснения, особенно, когда ритуксимаб предполагается давать один или два раза в год в течение многих лет. Больные аутоиммунными заболеваниями часто получают инфузии ритуксимаба дважды (с промежутком в несколько недель), и эта последовательность может быть повторена через 6-12 месяцев, т.е. получают значительно меньшие дозы, чем больные лимфомой (за краткосрочный период).

В настоящее время проводятся клинические испытания новой генерации антител против CD-20, способных уменьшать количество B-клеток, и они будут, вероятно, использоваться в клинической практике через несколько лет. Например, полностью гуманизированное антитело против CD-20 офатумомаб от Glaxo-Smith-Kline находится в настоящее время на стадии клинических испытаний в отношении рецидивов В-клеточной лимфомы. Полностью гуманизированное антитело против CD-20 следующей генерации, как предполагается, приводит даже к более сильному уменьшению количества B-клеток и, следовательно, должно быть даже более эффективным при лечении В-клеточных лимфом, чем ритуксимаб. Кроме того, предполагается, что они должны проявлять меньше побочных эффектов, чем описано для ритуксимаба.

Предлагаются различные схемы лечения синдрома хронической усталости. Например, в патенте США US 2007/025375 предлагается сложная схема лечения больных, страдающих синдромом хронической усталости. Указанная схема среди прочего включает введение милнаципрана.

В связи с неизвестной этиологией CFS/ME, продолжает существовать потребность в соединениях, пригодных для эффективного лечения CFS.

Краткое описание настоящего изобретения

Настоящее изобретение направлено на предоставление новых соединений, пригодных для лечения синдрома хронической усталости. В частности, изобретатели обнаружили, что агенты, уменьшающие количество B-клеток, такие как антитела против CD20, пригодны для лечения синдрома хронической усталости.

Предпочтительно, антитела против CD20 или фрагменты этих антител, связывающие CD20, являются моноклональными антителами. Особенно предпочтительно, чтобы указанные моноклональные антитела представляли собой гуманизированные антитела, когда они вводятся индивидуумам, являющимся людьми. В настоящем изобретении также подразумевается, что антитела могут присутствовать в виде фрагментов антител, которые могут быть получены, например, рекомбинантно с помощью генной инженерии.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения синдрома хронической усталости/миалгического энцефаломиелита, включающим стадию введения терапевтически эффективного количества агента, уменьшающего количество B-клеток, например антитела против CD20, уменьшающего количество B-клеток или связывающего CD20, индивидууму, страдающему указанным заболеванием или нарушением.

Краткое описание фигур

Фигура 1:

На фигуре 1 графически представлено развитие симптомов CFS у трех больных в течение периода в один год с указанием различных вмешательств, обозначенных как ритуксимаб® и метотрексат (M). Проводится подсчет симптомов CFS, которые находятся в диапазоне от 0 до 10, где 0 обозначает отсутствие симптомов, тогда как 10 относится к очень тяжелым симптомам CFS.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение касается агентов, уменьшающих количество B-клеток, либо биологических веществ, уменьшающих количество B-клеток, таких как антитела против CD20 или связывающие CD20 фрагменты этих антител, или химических веществ, таких как небольшие молекулы, обладающие активностью, уменьшающей количество B-клеток, для лечения синдрома хронической усталости/миалгического энцефаломиелита.

В контексте настоящего изобретения термины «синдром хронической усталости (CFS)» и «миалгический энцефаломиелит (ME)» используются как синонимы.

Применяемый в настоящем описании термин «уменьшение количества B-клеток» или «активность, уменьшающая количество B-клеток», относится к способности вещества, либо химического, либо биологического вещества, например антитела, снижать уровни циркулирующих B-клеток у индивидуума. Уменьшение количества B-клеток может быть достигнуто, например, с помощью индукции клеточной смерти или снижения пролиферации.

Антиген «CD20», или «CD20», представляет собой приблизительно 35 кДа негликозилированный фосфопротеин, обнаруживаемый на поверхности более 90% B-клеток периферической крови или лимфоидных органов человека. CD20 присутствует как на нормальных В-клетках, так и на малигнизированных В-клетках, но не экспрессируется на стволовых клетках. Другие названия CD20 в литературе включают «ограниченный В-лимфоцитами антиген» и «Bp35». Антиген CD20 описан, например, в статье Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sd. (USA) 82:1766 (1985). Термин CD20 включает эквивалентные молекулы других видов, отличных от человеческих. Недавно сообщалось о низком уровне экспрессии CD20 на подклассе Т-клеток и NK-клетках.

«В-клетка» представляет собой лимфоцит, который созревает в костном мозге, и включает необученную В-клетку, В-клетку памяти или эффекторную В-клетку (плазматические клетки).

В широком смысле настоящее изобретение относится не только к применению антител или их фрагментов для лечения CFS, но и к использованию антагонистов молекулы CD20, в целом обладающих активностью, уменьшающей количество B-клеток, для лечения CFS.

«Антагонист» или «агент, уменьшающий количество B-клеток», которые используются в настоящем описании взаимозаменяемо, представляет собой молекулу, которая, например, при связывании с маркером поверхности B-клеток, таким как CD20 на В-клетках, разрушает или уменьшает количество B-клеток у млекопитающего и/или вмешивается в одну или более функций B-клеток, например, путем снижения или предотвращения гуморального ответа, вызываемого В-клеткой. Антагонист или агент, уменьшающий количество B-клеток, по настоящему изобретению способен уменьшать количество B-клеток (т.е. снижать уровни циркулирующих B-клеток) у млекопитающего, которого лечат этим агентом. Такое снижение может быть достигнуто с помощью различных механизмов, таких как антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и/или зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC), ингибирование пролиферации B-клеток и/или индукция смерти B-клеток (например, путем апоптоза). Антагонисты, включенные в объем настоящего изобретения, включают антитела, пептиды с синтетической или природной последовательностью и низкомолекулярные антагонисты, которые связываются с маркером поверхности B-клеток, необязательно конъюгированные или соединенные с цитотоксическим агентом. Предпочтительным антагонистом является антитело против CD20 или связывающий CD20 фрагмент антитела. Кроме того, предпочтительны низкомолекулярные антагонисты, такие как известный агент, уменьшающий количество B-клеток, - метотрексат.

В той мере, в которой клетки, отличные от B-клеток, экспрессируют антиген CD20, такие как подкласс Т-клеток или NK-клетки, количество этих клеток также уменьшается под действием агента, уменьшающего количество B-клеток, являющегося агентом, действующим через CD20.

Антагонисты, которые «индуцируют апоптоз», представляют собой антагонисты, которые индуцируют программируемую клеточную смерть, например B-клетки, что определяется стандартными тестами на апоптоз, такими как связывание аннексина V, фрагментация ДНК, сморщивание клетки, расширение эндоплазматического ретикулума, клеточная фрагментация и/или формирование мембранных везикул (называемых апоптотическими телами).

В настоящем описании термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные, по меньшей мере, от двух интактных антител, и фрагменты антител до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность.

В предпочтительном осуществлении антитело, пригодное для лечения CFS, представляет собой уменьшающий количество B-клеток связывающий CD20 фрагмент антитела.

«Связывающие CD20 фрагменты антител» включают часть интактного антитела, которая включает его антигенсвязывающую область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')2 и Fv фрагменты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Для целей настоящего изобретения «интактное антитело» представляет собой антитело, включающее вариабельные домены тяжелых и легких цепей, а также область Fc.

«Нативные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей варьируется среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также обладает регулярно расположенными внутрицепочечными дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь обладает на одном конце вариабельным доменом (V11), за которым следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь обладает вариабельным доменом на одном конце (V1) и константным доменом на своем другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что отдельные аминокислотные остатки образуют интерфейс между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи.

Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные части вариабельных доменов существенно отличаются по последовательности среди антител и используются при связывании и формировании специфичности каждого конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность распределяется вдоль вариабельных доменов антител неравномерно. Она концентрируется в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями, в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются областями каркаса (FRs). Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей, каждый, включает четыре FRs, принимающих главным образом конфигурацию β-складок, связанные тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли связи, а в некоторых случаях образуя часть структуры β-складок. Гипервариабельные области в каждой цепи держатся вместе в тесной близости с FRs и с гипервариабельными областями другой цепи, внося вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константные домены прямо не вовлечены в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC).

«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Эта область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой цепи и одной легкой цепи в прочной нековалентной связи. Она находится в такой конфигурации, что три гипервариабельныe области каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя антигенсвязывающий сайт на поверхности димера VH-VL. Совместно шесть гипервариабельных областей придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже единственный вариабельный домен (или половина Fv, включающая только три гипервариабельные области, специфичные для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя и с более низким сродством, чем полный связывающий сайт. Fab фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов добавлением нескольких остатков к карбоксильному концу домена CH1 тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH в настоящем описании является обозначением Fab', в котором остатки(ок) цистеина константных доменов несут, по меньшей мере, одну тиоловую группу. F(ab')2 фрагменты антитела исходно продуцируются как пары Fab' фрагментов, которые обладают цистеинами шарнирной области, связанными между собой. Известны также другие химические связи фрагментов антител. «Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) любых видов позвоночных могут быть приписаны к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (K) и лямбда (λ) на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, антитела могут быть приписаны к различным классам. Существует пять главных классов интактных антител: IgA5 IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелых цепей, которые соответствуют различным классам антител, называют a, δ, e, γ и μ, соответственно. Структура субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. «Одноцепочечный Fv» или фрагменты антител «scFv» включают домены VH и VL антитела, где эти домены присутствуют в единичной полипептидной цепи. Предпочтительно, полипептид Fv дополнительно включает полипептидный линкер между доменами VH и VL, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В качестве обзора по scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя сайтами связывания антигена, причем эти фрагменты включают вариабельный домен тяжелой цепи (V11), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V1), в одной полипептидной цепи (VH-V1). За счет использования линкера, который является слишком коротким для обеспечения образования пары из двух доменов, расположенных на одной цепи, обеспечивается образование пар с комплементарными доменами другой цепи и создание двух сайтов связывания антигена. Более подробно диатела описаны, например, в патентах EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 90:6444-6448 (1993).

Используемый в настоящем описании термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связывают один и тот же эпитоп, исключая возможные варианты, которые могут возникать во время получения моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минимальном количестве. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. В дополнение к их специфичности преимуществом моноклональных антител служит то, что они не загрязнены другими иммуноглобулинами. Определение «моноклональное» указывает на особенность антитела, получаемого из, по существу, гомогенной популяции антител, и не ограничивается необходимостью получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела для использования по настоящему изобретению могут быть получены с помощью метода гибридом, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (см., например, патент США No. 4816567). «Моноклональные антитела» могут быть также выделены из фаговых библиотек антител с помощью методов, описанных, например, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol Biol, 222:581-597 (1991). В настоящем описании «моноклональные антитела» отдельно включают «гибридные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах от отдельных видов или относящимся к отдельному классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они проявляют желаемую биологическую активность (патент США No. 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 81:6851-6855 (1984)). Представляющие интерес для настоящего писания гибридные антитела включают «приматизированные» антитела, включающие антигенсвязывающие последовательности вариабельного домена, берущие начало от отличного от человекообразного примата (например, обезьяны Старого Света, такой как бабуин, резус или макака юго-восточной Азии), и последовательности константной области человека (патент США No. 5693780). «Гуманизированные» формы отличных от человеческих (например, мышиных) антител представляют собой гибридные антитела, которые содержат минимальную последовательность из отличного от человеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки в гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области отличных от человека видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, обладающие желаемой специфичностью, сродством и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками, отличными от человеческих. Более того, гуманизированные антитела могут включать остатки, отсутствующие в реципиентном антителе и донорном антителе. Такие модификации производятся для дополнительного улучшения свойств антитела. Обычно гуманизированное антитело обычно включает, по существу, полностью, по меньшей мере, один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют петлям отличного от человеческого иммуноглобулина и все или по существу все FRs являются FRs последовательности иммуноглобулина человека, исключая отмеченные выше замену(замены) FR. Гуманизированное антитело необязательно обычно также включает, по меньшей мере, одну часть константной области иммуноглобулина, обычно иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности смотри в Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Используемый в настоящем описании термин «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность», или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (Ll), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). «Каркасными», или «FR», остатками являются остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, определенной в настоящем описании. «Чистое антитело» представляет собой антитело (как определено в настоящем описании), которое не конъюгировано с гетерологичной молекулой, такой как цитотоксическая часть или радиоактивная метка. Примеры антител, которые связывают антиген CD20, включают: "C2B8", которое теперь называют "ритуксимаб" ("RITUXAN®") (патент США No. 5736137, специально включенный в настоящее описание в качестве ссылки); меченное иттрием-[90] мышиное антитело 2B8, обозначаемое "Y2B8", или "Ibritumomab Tiuxetan" ZEVALIN® (патент США No. 5736137, специально включенный в настоящее описание в качестве ссылки); мышиный lgG2a "Bl", называемый также "тозитумомаб", необязательно меченный 131I с получением антитела "131I-Bl" (йод 1131 тозитумомаб, BEXXAR^TM) (патент США No. 5595721, специально включенный в настоящее описание в качестве ссылки); мышиное моноклональное антитело "1F5" (Press et al., Blood 69(2):584-591 (1987) и его варианты, включая "лоскутный каркас" или гуманизированное 1F5 (WO03/002607, Leung, S.; ATCC депозит HB-96450); мышиное 2H7 и гибридное 2H7 антитело (патент США No. 5677180, специально включенный в настоящее описание в качестве ссылки); гуманизированное 2H7; офатумумаб, полностью гуманизированный IgG1 против нового эпитопа на CD20 huMax-CD20 (Genmab, Denmark; WO2004/035607); AME-133 (Applied Molecular Evolution); антитело A20 или его варианты, такие как гибридное или гуманизированное антитело A20 (cA20, hA20, соответственно) (US 2003/0219433, lmmunomedics); и моноклональные антитела L27, G28-2, 93-1B3, B-CI или NU-B2, поставляемые International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., в: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). Кроме того, подходящими антителами являются, например, окрелизумаб, полностью гуманизированное антитело против CD20 от Biogen Idec/Genentech/Roche антитело GA101, гуманизированное антитело против CD20 третьего поколения от Biogen Idec/Genentech/Roche. Более того, доступны BLX-301 от Biolex Therapeutics, гуманизированное антитело против CD20 с оптимизированным гликозилированием, или велтузумаб Veltuzumab (hA20) от Immunomedics или DXL625 от Inexus Biotechnology, оба которых представляют собой гуманизированные антитела против CD20.

Более того, допускается, что для лечения CFS могут быть использованы другие агенты, уменьшающие количество B-клеток, в частности, антитела против CD22, подобные эпратузумабу, или гуманизированные антитела против CD19, подобные MDX-1342.

Термины «ритуксимаб», или "RITUXAN®" или "mabthera" в настоящем описании относятся к генетически сконструированному гибридному мышино-человеческому моноклональному антителу, направленному против антигена CD20 и обозначаемому “C2B8” в патенте США No. 5736137, специально включенном в настоящее описание в качестве ссылки, включая его фрагменты, сохраняющие способность связывать CD20. Исключительно для целей настоящего описания и если это не указано иначе «гуманизированное 2H7» относится к гуманизированному антителу, которое связывает CD20 человека, или его антигенсвязывающему фрагменту, где антитело эффективно в снижении B-клеток приматов in vivo.

Выражение «эффективное количество» агента, уменьшающего количество B-клеток, или антагониста, в частности, антитела против CD20 или его CD20-связывающего фрагмента относится к количеству агента, уменьшающего количество B-клеток, или антагониста, которое эффективно для лечения CFS. Например, антитело против CD20 для лечения синдрома хронической усталости/миалгического энцефаломиелита вводят в диапазоне от 10 мг до 5000 мг на дозу. Например, доза может находиться в диапазоне от 100 до 1000 мг/м², в частности, 500 мг/м² в виде однократной инфузии ритуксимаба. Обычно доза метотрексата находится в диапазоне от 5 мг до 30 мг в неделю.

В одном предпочтительном варианте осуществления агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой химическое вещество, например, небольшую молекулу. В данной области техники известно множество агентов, уменьшающих количество B-клеток, например известными агентами, уменьшающими количество B-клеток, являются антагонисты BAFF. Более того, известные агенты, уменьшающие количество B-клеток, включают антагонист BR3, агонисты альфа-4-интегринов и т.д. Например, метотрексат представляет собой аналог фолиевой кислоты, проявляющей активность, уменьшающую количество B-клеток. Другими пригодными агентами, уменьшающими количество B-клеток, являются малые модульные иммунофармацевтические агенты (SMIP) против CD20. Например, SMIP, действующими в качестве агентов, уменьшающих количество B-клеток, являются TRU-015 или SBI-087 от Trubion Pharmaceuticals. В качестве SMIP могут также служить одноцепочечные полипептиды, меньшие чем антитела, обладающие активностью, уменьшающей количество B-клеток.

В предпочтительном варианте осуществления для лечения синдрома хронической усталости миалгического энцефаломиелита используют сочетание антитела против CD20 и представляющего биологическое вещество агента, уменьшающего количество B-клеток, и метотрексата, представляющего химическое вещество агента, уменьшающего количество B-клеток. Введение этих веществ может быть произведено одновременно, раздельно или последовательно. Например, в первом режиме индивидууму вводят или антитело, или метотрексат, а при втором режиме вводят другой агент.

Композицию, включающую агент, уменьшающий количество B-клеток, антагонист, в частности, антитело против CD20 или CD20-связывающий фрагмент этого антитела обычно составляют, дозируют и вводят в соответствии с должной медицинской практикой. Подлежащие учету в этом контексте факторы включают стадию конкретного заболевания или нарушения, подлежащего лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного индивидуума, место доставки агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Эффективное количество агента, уменьшающего количество B-клеток, подобного антителу или фрагменту антитела, для введения обычно определяют на основании такого анализа. В качестве общей схемы, эффективное количество антагониста, вводимого парентерально, на дозу обычно находится в диапазоне от приблизительно 20 мг/м² до приблизительно 10000 мг/м² тела индивидуума путем введения одной или более доз. Иллюстративные режимы доз для интактных антител включают 375 мг/м² еженедельно × 4; 1000 мг × 2 (т.е. в 1 и 15 дни); или 1 грамм × 3. Количество антитела для введения индивидууму в однократной терапевтически эффективной дозе указанного антитела составляет от 50 до 2000 мг/м² или во множестве терапевтически эффективных доз указанного антитела или CD20-связывающего фрагмента этого антитела составляет от 50 до 2000 мг/м². Как отмечалось выше, однако, эти предлагаемые количества антитела являются предметом тщательного рассмотрения при назначении терапии. Решающим фактором при выборе подходящей дозы и схемы является получаемый результат, как отмечено выше. Агент-антагонист, уменьшающий количество B-клеток, подобный антителу, вводят с помощью любых подходящих способов, включая парентеральное, местное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное, интраназальное введение и/или введение внутрь повреждения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Предусматривается также интратекальное введение. Кроме того, агент-антагонист, уменьшающий количество B-клеток, подобный антителу, можно подходящим образом вводить путем импульсной инфузии, например, снижающимися дозами антагониста. Предпочтительно введение дозы производят путем внутривенных инъекций.

Методы получения таких уменьшающих количество B-клеток антагонистов будут описаны в настоящем описании. Антиген, используемый для получения или скрининга антагониста(антагонистов), может являться, например, растворимой формой CD20 или его частью, содержащей желаемый эпитоп. Альтернативно или дополнительно для получения или скрининга антагониста(антагонистов) могут быть использованы клетки, экспрессирующие на своей поверхности CD20. Специалистам в данной области техники должны быть очевидны другие формы CD20, пригодные для получения антагонистов.

Хотя предпочтительным антагонистом является антитело, в настоящем описании предусматриваются антагонисты, отличные от антител. Например, антагонист может включать низкомолекулярный антагонист. Библиотеки низкомолекулярных соединений могут быть подвергнуты скринингу против CD20 для идентификации низкомолекулярного соединения, которое связывается с данным антигеном. Альтернативно, низкомолекулярные соединения могут быть подвергнуты скринингу на предмет их активности, уменьшающей количество B-клеток, в целом с помощью известных методов. Низкомолекулярное соединение может быть подвергнуто дополнительному скринингу на предмет его антагонистических свойств. Антагонист может быть также пептидом, полученный путем рационального конструирования или с помощью фагового дисплея (см., например, патент WO 98/35036, опубликованный 13 августа 1998). В одном варианте осуществления предпочтительная молекула может представлять собой «имитатор CDR» или аналог антитела, сконструированный на основе CDRs антитела. В то время как такие пептиды могут быть антагонистичными сами по себе, пептид необязательно может быть соединен с цитотоксическим агентом с тем, чтобы добавить или повысить антагонистичные свойства пептида. Следующее описание служит для иллюстрации методов получения антител-антагонистов, используемых в соответствии с настоящим изобретением.

(i) Поликлональные антитела. Поликлональные антитела предпочтительно индуцируют у животных путем множественных подкожных (п/к) или внутрибрюшинных (в/бр) инъекций соответствующего антигена и адъюванта. Может быть пригодной конъюгация соответствующего антитела с белком, который является иммуногенным у подлежащих иммунизации видов, например, гемоцианином моллюска, сывороточным альбумином, тироглобулином быка или ингибитором трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например, малеимидбензоильного сульфосукцинимидного сложного эфира (присоединение через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCI2, или R1N=C=NR, где R и R1 представляют собой разные алкильные группы.

Животных иммунизируют против антигена, иммуногенных конъюгатов или производных путем объединения, например, 100 мкг или 5 мкг белка или конъюгата (для кроликов или мышей, соответственно) с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и инъекции раствора внутрикожно во множество точек. Через один месяц животных поддерживают введением от 1/5 до 1/10 от исходного количества пептида или конъюгата в полном адъюванте Фрейнда с помощью подкожной инъекции во множество точек. Спустя от семи до 14 дней у животных отбирают кровь, и сыворотку анализируют на предмет титра антител. Животных поддерживают до выхода титра на плато. Предпочтительно животных поддерживают конъюгатом того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или посредством другого сшивающего реагента. Конъюгаты могут быть также получены в культуре рекомбинантных клеток в виде гибридов белков. Для повышения иммунного ответа соответствующим образом используют также агрегирующие агенты, такие как квасцы.

(ii) Моноклональные антитела

Моноклональные антитела получают из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов, которые возникают во время продукции моноклонального антитела, причем такие варианты обычно присутствуют в минорных количествах. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на свойство антитела как не являющегося смесью отдельных или поликлональных антител. Например, моноклональные антитела могут быть получены с помощью метода гибридом, впервые описанного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантной ДНК (патент США No. 4816567).

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделить и секвенировать с помощью традиционных процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи мышиных антител). Гибридомные клетки служат предпочтительным источником таких ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в экспрессионные векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для обеспечения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Обзорные статьи по рекомбинантной экспрессии в бактериях ДНК, кодирующей антитела, включают Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). В дополнительном варианте осуществления антитела или фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, полученных с помощью методов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) описывают выделение человеческих и мышиных антител, соответственно, с использованием фаговых библиотек. В последующих публикациях описано получение высокоаффинных (нМ диапазон) человеческих антител путем перетасовки цепи (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и in vivo рекомбинации в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким образом, эти методы служат в качестве различных альтернатив традиционным гибридомным методам моноклональных антител для выделения моноклональных антител. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замены кодирующей последовательностью константных доменов тяжелой и легкой цепи человека гомологичных мышиных последовательностей (патент США No. 4816567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. ScL USA, 81:6851 (1984)) или путем ковалентного присоединения к кодирующей иммуноглобулин последовательности всей или части последовательности, кодирующей отличный от иммуноглобулина полипептид. Обычно такие отличные от иммуноглобулина полипептиды заменяют константные домены антитела или они заменяют вариабельные домены одного антигенсвязывающего сайта антитела с созданием гибридного двухвалентного антитела, включающего один антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий сайт, специфичный в отношении иного антигена.

(iii) Гуманизированные антитела

В данной области техники были описаны методы гуманизации антител, отличных от человеческих. Предпочтительно гуманизированное антитело содержит один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, отличного от человека. Эти отличные от человеческих аминокислотные остатки часто называют «импортируемыми остатками», которые обычно берут из «импортируемого» вариабельного домена. Гуманизация может быть, по существу, произведена в соответствии с методом Винтера и сотрудников (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) путем замены последовательностями гипервариабельной области соответствующих последовательностей антитела человека. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела представляют собой гибридные антитела (патент США No. 4816567), в которых по существу менее, чем весь вариабельный домен был заменен соответствующей последовательностью от видов, отличных от человека. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области и, возможно, некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов антител грызунов. Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых, используемых для получения гуманизированных антител, очень важен для снижения иммуногенности. В соответствии с так называемым методом «наилучшего соответствия» последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу против полной библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Человеческая последовательность, которая наиболее близка к таковой грызуна, принимается в качестве каркасной области (FR) человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). В другом методе используется конкретная каркасная область, полученная на основе консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи. Для нескольких разных гуманизированных антител может быть использован один и тот же каркас (Carter et al., Proc. Natl Acad. ScL USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151:2623 (1993)). Кроме того, важно, чтобы гуманизация антител происходила при сохранении высокого сродства к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительным методом гуманизированные антитела получают с помощью процесса анализа исходных последовательностей и различных воображаемых гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и знакомы специалистам в данной области техники. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и демонстрируют возможные трехмерные конформационные структуры выбранных в качестве кандидатов иммуноглобулиновых последовательностей. Исследование этих изображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании иммуноглобулиновой последовательности-кандидата, т.е. проводить анализ остатков, которые влияют на способность иммуноглобулина-кандидата связывать свой антиген. Таким путем могут быть отобраны остатки FR и сформированы из реципиентных и импортируемых последовательностей, в результате чего достигается желаемое свойство антитела, такое как повышенное сродство к антигену(антигенам)-мишени(мишеням). В целом, остатки гипервариабельной области прямо и наиболее существенно влияют на связывание антигена.

(iv) Человеческие антитела

В качестве альтернативы гуманизации могут быть получены человеческие антитела. Например, в настоящее время возможно получение трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция соединяющей области (J11) гена тяжелой цепи антитела у гибридных или мутантных в зародыше мышей приводит к полному подавлению продукции эндогенных антител. Перенос зародышевого комплекса иммуноглобулинов человека таким мутантным в зародыше мышам обычно ведет к продукции человеческих антител после предъявления антигена. Смотри, например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); и патенты США Nos. 5591669, 5589369 и 5545807. Альтернативно, метод фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) может быть использован для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из генных репертуаров вариабельного домена (V) иммуноглобулинов от неиммунизированных доноров. По этому методу гены домена V антител клонируют в рамке считывания в ген либо главного, либо минорного белка оболочки нитчатого бактериофага, такого как MI 3 или fd, и экспонируют на поверхности фаговой частицы в качестве функциональных фрагментов антитела. Поскольку нитчатая частица содержит одноцепочечную копию ДНК фагового генома, отбор на основе функциональных свойств антитела также приводит к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющее такие свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Фагофый дисплей может быть реализован во множестве форматов; в качестве их обзора см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Для фагового дисплея может быть использовано несколько источников сегментов V-генов. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) выделили широкий набор антител против оксазолона из небольшой случайной комбинаторной библиотеки V генов из селезенки иммунизированных мышей. Может быть сконструирован репертуар V генов от неиммунизированных человеческих доноров и могут быть выделены антитела против широкого спектра антигенов (включая собственные антигены), по существу, в соответствии с методами, описанными Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), или Griffith et al., EMBOJ. 12:725-734 (1993). См. также патенты США Nos. 5565332 и 5573905. Человеческие антитела могут быть также произведены активированными in vitro B-клетками (см. патенты США 5567610 и 5229275).

(v) Фрагменты антител

Были разработаны разнообразные методы получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получали посредством протеолитического гидролиза интактных антител (см., например, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однако в настоящее время эти фрагменты могут быть продуцированы прямо рекомбинантными клетками-хозяевами. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, обсуждавшихся выше. Альтернативно, фрагменты Fab'-SH могут быть прямо выделены из E. coli и химически соединены с образованием фрагментов F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Согласно другому подходу, фрагменты F(ab')2 могут быть выделены прямо из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Специалисту должны быть очевидны и другие методы продукции фрагментов антител. В других вариантах осуществления предпочтительное антитело представляет собой одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). См. WO 93/16185; патент США No. 5571894; и патент США No. 5587458. Фрагмент антитела может быть также «линейным антителом», например, как описано в патенте США 5641870. Такие линейные фрагменты антитела могут быть моноспецифическими или биспецифическими.

Фармацевтические составы

Терапевтические составы агентов, уменьшающих количество B-клеток, подобных антителам или других антагонистов, используемых по настоящему изобретению, получают для хранения путем смешивания антитела или его фрагмента, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами {Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизованных составов или водных растворов. Приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензил хлорид аммония; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, манит, трегалоза или сорбит; образующие соль противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN^TM, PLURONICS^TM или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Иллюстративные составы антитела против CD20 описаны в WO 98/56418, специально включенном в настоящее описание в качестве ссылки. В этой публикации описан жидкий состав для множества доз, включающий 40 мг/мл ритуксимаба, 25 мМ ацетата, 150 мМ трегалозы, 0,9% бензилового спирта, 0,02% полисорбата 20 при pH 5,0, имеющий минимальный срок хранения при 2-8°С два года. Другой интересующий состав против CD20 включает 10 мг/мл ритуксимаба в 9,0 мг/мл хлориде натрия, 7,35 мг/мл цитрате натрия дигидрата, 0,7 мг/мл полисорбате 80 и стерильной воде для инъекций, pH 6,5. Лиофилизованные составы, приспособленные для подкожного введения, описаны в патенте США No. 6267958 (Andya et al.). Такие лиофилизованные составы могут быть восстановлены с помощью подходящего разбавителя до высокой концентрации белка, и восстановленный состав может быть введен подкожно млекопитающему, подлежащему лечению в настоящем описании. Предусматриваются также кристаллические формы антитела или антагониста. См., например, US 2002/0136719 A1.

Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, получаемые, например, с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы или нанокапсулы) или макроэмульсии. Такие методы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Могут быть получены препараты с непрерывным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с непрерывным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антагонист, причем матрицы находятся в форме имеющих форму изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с непрерывным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полиактиды (патент США No. 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, неразрушаемый этиленвинилацетат, разрушаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и леупролида ацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. Составы, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Этого легко достичь фильтрацией через мембраны для стерильной фильтрации.

ПРИМЕРЫ

В отделении онкологии и медицинской физики клиники при университете Haukeland наблюдалось резкое симптоматическое улучшение после цитотоксической химиотерапии у 43-летней пациентки со стабильным CFS (возникшим в 1997 г. после инфекции Эпштейна-Барра). У больной развилась болезнь Ходжкина в 2003 г., которую лечили химиотерапией и облучением. У больной возник рецидив лимфомы в 2004 г., который лечили химиотерапией. Вопреки ожиданиям (больные CFS плохо переносят все типы лекарств и стресс), больная испытала значительное облегчение симптомов CFS во время и после этой химиотерапии. Изменения не связывались активностью лимфомы, и эффект продолжался в течение приблизительно 5 месяцев после химиотерапии с последующим постепенным возвращением CFS-подобных симптомов. В дополнение к цитотоксическому действию полученная химиотерапия оказала иммуномодулирующее действие. Полагают, что действие на симптомы CFS опосредовано главным образом лекарством метотрексатом, вводимым во время химиотерапии.

При рассмотрении литературы по CFS в попытке понять, с чем столкнулась наша больная во время и после противораковой химиотерапии, было сделано заключение, что вероятным объяснением испытанного заметного, но преходящего улучшения симптомов служит модификация иммунной системы. Возможно, что хроническая активация B-клеток, наблюдаемая у больных CFS, важна для симптомов, а также сообщавшихся физиологических изменений, таких как нарушения циркуляции крови в центральной нервной системе, и сообщавшейся инфильтрации лимфоцитов в ткань мозга, спинальные нервные корешки или сердечную мышцу.

Возможные формы действия уменьшения количества B-клеток могут затрагивать несколько точек, таких как взаимодействие с системой T-клеток с результирующей модификацией процессов воспаления и влияние на уровни важных плейотропных участников иммунного гомеостаза, таких как вазоактивные нейропептиды. Эти нейропептиды обладают широким спектром активности в центральной нервной системе.

Принимая во внимание эти имеющиеся данные вместе с неожиданным улучшением усталости и боли у больной CFS после иммуномодулирующей цитотоксической терапии, принято заключение, что уменьшение количества B-клеток могло бы служить концепцией, обеспечивающей лечение CFS.

В настоящее время достижение уменьшения количества B-клеток проще всего обеспечить путем использования моноклонального антитела против CD20 ритуксимаба. Предполагается, однако, что новое поколение антител против CD20 обладает, по меньшей мере, сходным действием на симптомы CFS благодаря ожидаемому обеспечению более эффективного уменьшения количества B-клеток.

Пилотный больной 1.

В качестве первого пилотного больного упомянутая выше женщина получала ритуксимаб 500 мг/м² в виде однократной инфузии после информирования об экспериментальном характере процедуры и сопутствующем риске. До лечения у нее был стабильный CFS с выраженной усталостью, и она была неспособна работать вне дома или вести домашнее хозяйство. Она использовала электрическую коляску для передвижения вне дома. Начиная с пятой-шестой недели после инфузии, она почувствовала заметное улучшение симптомов с явно меньшей усталостью, сниженной мышечной болью, сниженной жгучей болью в коже и сниженными головными болями, сопровождающееся снижением потребности в опиоидных анальгетиках. Благодаря снижению усталости, она теперь могла совершать длительные прогулки, возобновить свои любимые занятия и была способна выполнять работу по дому и заботиться о своих детях. Она также сообщила о значительном улучшении когнитивной функции, сохранении способности концентрироваться, и она снова была способна читать и, например, работать с компьютером. Эффект после первой инфузии ритуксимаба продолжался до 14 недель, затем снижался с постепенным, но не полным рецидивом симптомов CFS.

Пять месяцев спустя после первой инфузии ритуксимаба у нее опять были симптомы стабильного и инвалидизирующего CFS. Она получила новую однократную инфузию ритуксимаба в той же дозе. Через 6 недель она вновь почувствовала постепенное и глубокое избавление от всех симптомов CFS (усталости, боли, когнитивных симптомов) с выраженным влиянием на качество жизни. После второй инфузии (также в виде однократной инфузии в низкой дозе 500 мг/м²) терапевтическое действие продолжалось до 16 недели с последующим медленным и постепенным ухудшением симптомов.

Затем было решено начать еженедельное пероральное введение низкой дозы метотрексата с 18 недели после второй инфузии ритуксимаба, начиная с 7,5 мг в неделю с повышением дозы до 12, 5 мг в неделю на протяжении следующих двух месяцев. С 12 недели после начала еженедельного введения Mtx она вновь ощутила постепенное и умеренное возвращение симптомов CFS. В настоящее время она принимает Mtx на протяжении 22 недель, и она интерпретирует улучшение как умеренное и значительное, но в настоящее время не столь выраженное и быстрое, как после лечения ритуксимабом. Однако она все еще ощущает постепенное улучшение своего состояния. Развитие симптомов CFS показано на фигуре 1.

Пилотный больной 2.

Мужчина 42 лет, у которого CFS возник после инфекции Эпштейна-Барра 8 лет назад. У него отмечалась выраженная усталость, и он был не способен выполнять какую-либо работу после наступления заболевания. Он был вынужден сидеть в кресле большую часть времени. После умеренной физической нагрузки у него возникали серьезные проблемы с дыханием, усиленные мышечной болью и головными болями. У него также были вспышки лихорадки, потоотделения и диареи. У него были тяжелые когнитивные нарушения. Хотя ранее он был компьютерным инженером, он был неспособен пользоваться компьютером или читать подряд более 1-2 страниц в книге.

Он получил однократную инфузию ритуксимаба 500 мг/м². Первым улучшенным симптомом (через 3 недели после инфузии) была стойкая диарея. Начиная с 6 недели после инфузии, он ощутил выраженный ответ с резким улучшением усталости, боли, когнитивных и автономных симптомов. Затем он был способен выполнять работу руками и получать удовольствие от компьютерных игр и чтения. После относительно низкой дозы (однократная инфузия 1000 мг) эффект был наиболее выраженным до 12 недели, после чего постепенно снижался. Он и его семья описали клиническое улучшение как значительное, оказавшее выраженное влияние на качество жизни всей семьи.

Через пять месяцев после первой инфузии ритуксимаба его повторно лечили с помощью двух инфузий ритуксимаба 1000 мг с двухнедельным перерывом. Как и после первого лечения, он сначала избавился от диареи (через 3 недели). Затем, через 6 недель, он сообщил о снижении когнитивных симптомов, и через несколько дней начала улучшаться усталость.

Двойная инфузия ритуксимаба дала четкое улучшение симптомов CFS, наиболее выраженное через 16 недель после инфузии. После этого он почувствовал очень медленное и постепенное усиление своих симптомов. Однако через 5 месяцев после инфузии у него все еще был клинический ответ (он был еще в лучшем состоянии по сравнению с состоянием до лечения) (фигура 1). В настоящее время он начал еженедельное лечение низкой дозой метотрексата.

Пилотный больной 3.

У студентки 22 лет CFS развился после мононуклеоза 7 лет назад. В начале у нее была яркая клиническая картина с выраженной усталостью с болью, включая головные боли, когнитивными нарушениями и автономными симптомами. На протяжении последних четырех лет она, однако, чувствовала некоторое улучшение, но у нее все еще оставалась выраженная усталость, потребность в избыточном сне и проблемы с кишечником. У нее были умеренные когнитивные нарушения и умеренная мышечная боль.

Она получила однократную инфузию ритуксимаба 500 мг/м². Эта пациентка также ощутила улучшение от слабости кишечника через 3 недели после инфузии. Через шесть недель после инфузии она отметила некоторое уменьшение мышечной боли. В первые пять месяцев у нее также было небольшое уменьшение усталости, но преходящее и более короткое, чем у других больных.

После 6 месяцев после инфузии, однако, она ощутила выраженный клинический ответ по всем симптомам CFS до высокого уровня функциональной активности, которого она не испытывала за последние 7 лет. Она начала учиться полное время и могла без проблем читать, а также отметила заметное улучшение своей краткосрочной памяти. Это резкое улучшение теперь продолжалось в течение 4½ месяцев. В течение следующих недель она почувствовала постепенное возвращение симптомов. Теперь она получила новые инфузии ритуксимаба (две инфузии 500 мг/м², введенные с интервалом две недели).

Метотрексат (Mtx) представляет собой терапевтический агент с известными (но не очень понятными) иммуномодулирующими свойствами. При введении лекарства перорально по еженедельной схеме при ревматоидном артрите одним из его эффектов является умеренное уменьшение количества B-клеток, которое механистически сходно, но не столь выражено, с эффектом ритуксимаба (Edwards et al., NEJM, 2004. Efficacy of B-Cell Targeting Therapy with Rituximab in Patients with Rheumatoid Arthritis). У одной из трех пилотных больных (пациентки 1) лечение метотрексатом на протяжении последних 22 недель также наблюдался значимый и умеренный клинический ответ симптомов CFS, начиная с 10 недели после начала введения Mtx.

В заключение, у трех из трех пилотных больных наблюдался значительный клинический ответ после лечения ритуксимабом, у двух из них также с повторными клиническими ответами после второго лечения ритуксимабом).

У третьего больного имелось ограниченное улучшение симптомов CFS после 6 недель после инфузии ритуксимаба. Однако с 6 до 10½ месяцев после инфузии у нее имел место значительный клинический ответ по всем связанным с CFS симптомам, продолжающийся до сих пор (10½ месяцев после инфузии). Затем у нее был постепенно развивающийся рецидив, и в настоящее время она получила новое лечение ритуксимабом (две инфузии, т.е. на 47 и 49 неделях после первого лечения ритуксимабом).

Все пять эпизодов лечения у трех больных приводили к от выраженного до умеренного улучшения основных симптомов. Для этих трех больных кинетика улучшения симптомов была очень сходной, но, кроме того, у больного 3 имелся отставленный и долго продолжающийся ответ, как показано на фигуре 1. Интервал соответствует известной деградации и периоду полужизни некоторых белков, которые могут продуцироваться B-лимфоцитами. Повторное появление симптомов после лечения ритуксимабом совместимо с созреванием преплазматических B-лимфоцитов из стволовых клеток после направленного антигеном CD20 лизиса B-клеток, который опосредуется через направляемую комплементом цитотоксичность (CDC) и зависимую от антитела клеточную цитотоксичность (ADCC). Было показано, что эти незрелые B-клетки способны продуцировать белки, включая антитела.

Claims (14)

1. Применение агента, уменьшающего количество B-клеток, для лечения синдрома хронической усталости.

2. Применение по п.1, где агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой уменьшающее количество B-клеток антитело против CD20 или фрагмент этого антитела, связывающий CD20.

3. Применение по п.2, где агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой моноклональное антитело или фрагмент этого антитела, связывающий CD20.

4. Применение по п.2, где агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой гуманизированное антитело против CD20 или фрагмент этого антитела, связывающий CD20.

5. Применение по п.2, где агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой уменьшающий количество B-клеток фрагмент антитела против CD20, связывающий CD20, предпочтительно антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из F(ab')₂, F(ab'), Fab, Fv и sFv.

6. Применение по п.2, где агент, уменьшающий количество B-клеток, выбран из гуманизированных антител ритуксимаба, офатумумаба, окрелизумаба, GA101, ВСХ-301, велтузумаба или DXL 625.

7. Применение по п.1, где агент, уменьшающий количество В-клеток, представляет собой метотрексат, TRU-015 или SBI-087.

8. Применение по любому из пп.1-6 для лечения синдрома хронической усталости/миалгического энцефаломиелита, где количество уменьшающего количество B-клеток антитела против CD20 находится в диапазоне от 10 мг до 5000 мг на дозу.

9. Применение по любому из пп.1-6, где агент, уменьшающий количество В-клеток, представляет собой уменьшающее количество В-клеток антитело против CD20 или фрагмент этого антитела, связывающий CD20, для введения индивидууму в одной терапевтически эффективной дозе указанного антитела от 50 до 2000 мг/м² или в множественных терапевтически эффективных дозах от 50 до 2000 мг/м² указанного антитела против CD20 или фрагмента этого антитела, связывающего CD20.

10. Применение по любому из пп.1-6, в котором введение агента, уменьшающего количество B-клеток, осуществляют с помощью одной или двух инфузий два раза в две недели.

11. Применение по любому из пп.1-6, в котором агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой уменьшающее количество B-клеток антитело против CD20 или фрагмент антитела, связывающего CD20, которые используются в сочетании с метотрексатом, где указанный агент, уменьшающий количество B-клеток, и метотрексат, вводят одновременно, отдельно или последовательно.

12. Способ лечения синдрома хронической усталости, включающий стадию введения агента, уменьшающего количество В-клеток, как определено в любом из пп.1-9, страдающему им индивидууму.

13. Способ по п.12, в котором введение агента, уменьшающего количество B-клеток, осуществляют с помощью одной или двух инфузий два раза в две недели.

14. Способ по п.12 или 13, в котором агент, уменьшающий количество B-клеток, представляет собой уменьшающее количество B-клеток антитело против CD20 или фрагмент антитела, связывающего CD20, которые используются в сочетании с метотрексатом, где указанный агент, уменьшающий количество B-клеток, и метотрексат, вводят одновременно, отдельно или последовательно.

Images