RU2439147C1 - Method of stimulation in vitro pluripotent hemopoetic stem cells - Google Patents

Abstract

FIELD: medicine. ^ SUBSTANCE: cells of bone marrow are subjected to 30-minute pre-incubation in nutrient medium which contains 1 U/ml of hyaluronidase, and are twice washed by centrifugation. After that non-adhering fraction of myelocariocytes is cultivated in nutrient medium with addition of granulocytic colony-stimulating factor. ^ EFFECT: invention makes it possible to perform efficient stimulation of pluripotent hemopoetic stem cells in vitro. ^ 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток.The invention relates to the field of experimental biology and medicine and relates to a method of in vitro stimulation of polypotent hematopoietic stem cells.

Известно большое количество способов стимуляции in vitro гемопоэтических клеток-предшественников.A large number of methods for stimulating in vitro hematopoietic progenitor cells are known.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и техническому результату прототипом является способ стимуляции гемопоэтических стволовых клеток с помощью препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), который добавляют в необходимой концентрации в культуру ткани [1].The closest in technical essence, mechanism of action and technical result of the prototype is a method of stimulating hematopoietic stem cells using the preparation of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), which is added in the required concentration to the tissue culture [1].

Недостатком данного способа является проявление его эффективности только в отношении коммитированных клеток-предшественников: грануломоноцитарных (ГМ) и гранулоцитарных (Г) колониеобразующих единиц (КОЕ) [1], и практически отсутствие таковой в отношении полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (ПГСК).The disadvantage of this method is the manifestation of its effectiveness only in relation to committed progenitor cells: granulomonocytic (GM) and granulocyte (G) colony forming units (CFU) [1], and the practically absence thereof in relation to pluripotent hematopoietic stem cells (PGSC).

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.The problem solved by this invention is to increase the efficiency of the method.

Поставленная задача достигается тем, что клетки костного мозга, которые культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% СO₂ и 100% влажности воздуха в течение 14 сут в полувязкой культуральной среде, содержащей гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, предварительно на 30 минут помещают в раствор гиалуронидазы 1 ЕД/мл.This object is achieved by the fact that bone marrow cells that are cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C, 5% CO ₂ and 100% air humidity for 14 days in a semi-viscous culture medium containing granulocyte colony stimulating factor are preliminarily placed for 30 minutes in a solution of hyaluronidase 1 IU / ml

Новым в предлагаемом изобретении является применение раствора гиалуронидазы в качестве среды для преинкубации клеточного материала, содержащего полипотентные гемопоэтические стволовые клетки.New in the present invention is the use of a solution of hyaluronidase as a medium for pre-incubation of cellular material containing pluripotent hematopoietic stem cells.

Многие заболевания системы крови зачастую не поддаются лечению существующими медикаментозными средствами. Данное обстоятельство указывает на актуальность разработки новых гемостимуляторов. При этом наиболее перспективным является создание препаратов, способных оказывать влияние на наиболее ранние кроветворные предшественники - полипотентные гемопоэтические стволовые клетки, обладающие максимально высоким ростовым потенциалом [2, 3].Many diseases of the blood system are often not amenable to treatment with existing medications. This fact indicates the relevance of the development of new hemostatic stimulants. In this case, the most promising is the creation of drugs that can affect the earliest hematopoietic precursors - polypotent hematopoietic stem cells with the highest growth potential [2, 3].

Для изучения закономерностей функционирования клеток-предшественников и исследования механизмов их регуляции в эксперименте для создания патогенитически обоснованных методов коррекции нарушений гемопоэза используют различные способы клонирования. Наиболее часто применяются методики культивирования клеточного материала in vitro [1]. При этом для эффективного клонирования необходимым условием является стимуляция кроветворных клеток. Данные способы относительно просты и доступны, но лишь при клонировании коммитированных клеток-предшественников, развитие которых, в отличие от полипотентных гемопоэтических стволовых клеток, уже детерминировано в определенном направлении. Так, существует способ клонирования КОЕ-ГМ и КОЕ-Г in vitro, где стимуляция клеток-предшественников осуществляется с помощью линейно-рестриктированного фактора роста - Г-КСФ [1]. При этом эффективность стимуляции Г-КСФ в отношении указанных клеток-предшественников определяется наличием на них специфических рецепторов к нему, а отсутствие таковой в отношении ПГСК объясняется отсутствием либо низкой экспрессией этих рецепторов на данных родоиачальных элементах [2].To study the patterns of functioning of progenitor cells and to study the mechanisms of their regulation in the experiment, various methods of cloning are used to create pathogenically substantiated methods for correcting hematopoiesis disorders. The most commonly used techniques for culturing cellular material in vitro [1]. Moreover, for efficient cloning, the necessary condition is the stimulation of hematopoietic cells. These methods are relatively simple and affordable, but only when cloning committed progenitor cells, the development of which, unlike polypotent hematopoietic stem cells, is already determined in a certain direction. So, there is a method for cloning CFU-GM and CFU-G in vitro, where the progenitor cells are stimulated using a linearly-restricted growth factor, G-CSF [1]. Moreover, the effectiveness of stimulation of G-CSF in relation to these precursor cells is determined by the presence of specific receptors on it, and the absence of such in relation to PHCS is explained by the absence or low expression of these receptors on these rhodium cells [2].

Вместе с тем, известна возможность усиления гемостимулирующего действия Г-КСФ при его введении in vivo путем дополнительного применения препаратов гиалуронидазы [4]. При этом механизмом потенцирования эффектов Г-КСФ в отношении КОЕ-ГМ является образование под влиянием гиалуронидазы in situ в гемопоэтической ткани низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты, обладающих свойствами повышать интенсивность процессов клеточного деления, из ее высокомолекулярных полимеров, составляющих основную часть межклеточного матрикса [5, 6].At the same time, the possibility of enhancing the hemostatic effect of G-CSF when it is introduced in vivo by the additional use of hyaluronidase preparations is known [4]. Moreover, the mechanism of potentiation of the effects of G-CSF in relation to CFU-GM is the formation of low- and medium-molecular forms of hyaluronic acid under the influence of hyaluronidase in situ in the hematopoietic tissue, which have the ability to increase the intensity of cell division processes from its high molecular weight polymers, which make up the bulk of the intercellular matrix [ 5, 6].

Тем не менее, способность гиалуронидазы оказывать влияние непосредственно на кроветворные клетки, тем более приводить к появлению чувствительности у полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (гранулоцито-эритроидно-моноцито-мегакариоцитарных колониеобразующих единиц [1, 2]) к Г-КСФ, реализующим свой эффекты через специфические рецепторы, которых у данных прогениторных элементов нет либо их количество чрезвычайно мало, не известна.Nevertheless, the ability of hyaluronidase to directly affect hematopoietic cells, especially lead to the appearance of sensitivity in polypotent hematopoietic stem cells (granulocyte-erythroid-monocyte-megakaryocytic colony forming units [1, 2]) to G-CSF, which realizes its effects through specific receptors that these progenitor elements do not have or their number is extremely small is not known.

Факт применения гиалуронидазы с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток, для специалиста является не очевидным.The fact of the use of hyaluronidase with the achievement of a new technical result, which consists in the effective stimulation of in vitro polypotent hematopoietic stem cells, is not obvious to a specialist.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.The claimed essential features in the aggregate showed new properties that are not explicitly derived from the prior art in this field. The present invention can be used in experimental biology and medicine with access to practical health care. An identical set of features was not found in the study of the state of the art in patent and medical literature.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».Based on the foregoing, the claimed technical solution should be considered relevant criteria: "Novelty", "Inventive step", "Industrial applicability".

Способ осуществляют следующим образом.The method is as follows.

Взвесь клеток костного мозга в концентрации лабораторных животных (мышей) помещают на 30 минут в питательную среду, содержащую 1 ЕД/мл гиалуронидазы, после чего клеточный материал дважды отмывают центрифугированием, получают неприлипающую фракцию клеток, которую помещают в среду следующего состава: 80% среды RPMI-1640, 19% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 1% метилцеллюлозы, 50 мг/л гентамицина, 5 нгмл рекомбинантного Г-КСФ и инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 14 сут.A suspension of bone marrow cells in a concentration of laboratory animals (mice) is placed for 30 minutes in a nutrient medium containing 1 U / ml hyaluronidase, after which the cell material is washed twice by centrifugation, and a non-adherent fraction of cells is obtained, which is placed in an environment of the following composition: 80% RPMI medium -1640, 19% ETS, 280 mg / l L-glutamine, 1% methyl cellulose, 50 mg / l gentamicin, 5 ngml recombinant G-CSF and incubated in a CO ₂ incubator at 37 ° C, 5% CO ₂ and 100% humidity for 14 days.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 20 шт. массой 18-20 г. Получены из питомника экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).The proposed method was studied in experiments on mice of the CBA / CaLac line (category 1 animals, conventional linear mice) in an amount of 20 pcs. weighing 18-20 g. Received from the nursery of the experimental biological clinic of laboratory animals of the Research Institute of Pharmacology SB RAMS (certificate is available).

Пример 1Example 1

Костный мозг мыши в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) поместили на 30 минут в среду RPMI-1640 («Sigma», США), содержащую 1 ЕД/мл гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ). Затем клеточный материал дважды отмыли центрифугированием и получали неприлипающую фракцию миелокариоцитов. Для этого суспензию костномозговых клеток инкубировали в течение 45 мин в среде, содержащей 90% RPMI-1640 («Sigma», США) и 10% ЭТС («Sigma», США), в пластиковых чашках Петри диаметром 35 мм при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты и помещали их в концентрации 3×10⁵ клеток в среду следующего состава: 80% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 19% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 1% метилцеллюлозы («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 5 нг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (пэг-Г-КСФ, ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск). По 0,5 мл приготовленной клеточной взвеси помещали в 24-луночные планшеты («Corning», США) в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха и инкубировали, в одном случае - 7 сут (для подсчета КОЕ-ГМ и КОЕ-Г), а в другом - 14 сут (для подсчета КОЕ-ГЭММ).The mouse bone marrow in sterile conditions (a box equipped with a laminar) was placed for 30 minutes in RPMI-1640 medium (Sigma, USA) containing 1 U / ml hyaluronidase (Lidaza, FSUE NPO Microgen, Ministry of Health of the Russian Federation). Then, the cellular material was washed twice by centrifugation and a non-adherent fraction of myelokaryocytes was obtained. For this, a suspension of bone marrow cells was incubated for 45 min in a medium containing 90% RPMI-1640 (Sigma, USA) and 10% ETS (Sigma, USA) in plastic Petri dishes with a diameter of 35 mm at 37 ° C, 5% CO ₂ and 100% humidity. After that, non-adherent myelokaryocytes were collected using a pipette and placed at a concentration of 3 × 10 ⁵ cells in an environment of the following composition: 80% RPMI-1640 medium (Sigma, USA), 19% ETS (Sigma, USA), 280 mg / l L-glutamine (Sigma, USA), 1% methylcellulose (Sigma, USA), 50 mg / l gentamicin (Sigma, USA), 5 ng / ml granulocyte colony stimulating factor (peg-G-CSF , Scientific Future Management LLC, Novosibirsk). 0.5 ml of prepared cell suspension was placed in 24-well plates (Corning, USA) in a CO ₂ incubator at 37 ° C, 5% CO ₂ and 100% air humidity and incubated, in one case, for 7 days ( for counting CFU-GM and CFU-G), and in the other - 14 days (for counting CFU-GEMM).

После этого в 7 суточных культурах подсчитывали число КОЕ-ГМ и КОЕ-Г, а в 14 суточных культурах количество КОЕ-ГЭММ. Под гранулоцитарно-макрофагальными колониями (КОЕ-ГМ) подразумевали образовавшиеся в полутвердой культуре клеточные агрегаты, содержащие 50 и более элементов грануломоноцитарного ряда, а под КОЕ-Г - образование, содержащее 30 и более клеток гранулоцитарного типа. Под колонией гранулоцито-эритроидно-моноцито-мегакариоцитарного типа (КОЕ-ГЭММ) подразумевали образовавшийся в культуре очаг гемопоэза, содержащий 300 и более клеток различных типов. Подсчет проводили под инвертированным микроскопом «Axio Observer A.1» (Carl Zeiss, Германия).After that, in 7 diurnal cultures the number of CFU-GM and CFU-G was counted, and in 14 diurnal cultures the number of CFU-GEM. Under granulocyte-macrophage colonies (CFU-GM) we mean cell aggregates formed in a semi-solid culture containing 50 or more elements of the granulomonocytic series, and CFU-G - a formation containing 30 or more granulocytic cells. A colony of granulocyte-erythroid-monocyte-megakaryocyte type (CFU-HEMM) was used to mean a hematopoietic focus formed in the culture containing 300 or more cells of various types. Counting was performed under an inverted microscope Axio Observer A.1 (Carl Zeiss, Germany).

При этом контролем служили культуры неприлипающих клеток костного мозга без добавления Г-КСФ и полученных по способу-прототипу: аналогичным описанному путем, но не подвергшихся преинкубации в растворе гиалуронидазы.In this control, cultures of non-adherent bone marrow cells served without the addition of G-CSF and obtained by the prototype method: similar to that described but not subjected to pre-incubation in a hyaluronidase solution.

В ходе эксперимента наблюдалась значительная стимуляция роста КОЕ-ГМ и КОЕ-Г при добавлении в культуру ткани миелакариоцитов, не обработанных гиалуронидазой, Г-КСФ (табл.). Однако изменений уровня колониеобазования в 14-суточной культуре не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии стимулирующего эффекта у Г-КСФ в отношении КОЕ-ГЭММ.During the experiment, significant growth stimulation of CFU-GM and CFU-G was observed with the addition of myelakaryocytes not treated with hyaluronidase, G-CSF to the tissue culture (table). However, no changes in the colony level were observed in a 14-day culture, which indicated the absence of a stimulating effect in G-CSF with respect to CFU-HEMM.

Рост КОЕ-ГМ, КОЕ-Г и КОЕ-ГЭММ под влиянием Г-КСФ в культурах клеток неприлипающих миелокариоцитов, не обработанной гиалуронидазой (1) и подвергшихся воздействию данного фермента (2), (X±m)The growth of CFU-GM, CFU-G and CFU-HEMM under the influence of G-CSF in non-adherent myelocaryocyte cell cultures not treated with hyaluronidase (1) and exposed to this enzyme (2), (X ± m)   КОЕ-ГМ, на 100 тыс. миелокариоцитовCFU-GM, per 100 thousand myelocaryocytes КОЕ-Г, на 100 тыс. миелокариоцитовCFU-G, per 100 thousand myelocaryocytes КОЕ-ГЭММ, на 100 тыс. миелокариоцитовCFU-HEMM, per 100 thousand myelokaryocytes фонbackground 8,17±0,288.17 ± 0.28 17,0±0,3717.0 ± 0.37 4,78±0,34.78 ± 0.3 1one 24,3±2,7*24.3 ± 2.7 * 36,9±4,2*36.9 ± 4.2 * 4,61±0,344.61 ± 0.34 22 31,7±1,44*#31.7 ± 1.44 * # 45,8±2,9*45.8 ± 2.9 * 16,3±1,1*#16.3 ± 1.1 * # * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при p<0,05 * - the significance of differences with background values is noted at p <0.05 # - отмечена достоверность различий с показателями в 1 группе при p<0,05# - the significance of differences with indicators in group 1 was noted at p <0.05

Вместе с тем, исследование культур клеток, подвергшихся перед инкубацией воздействию гиалуронидазы, показало не только более существенное (чем без такового) увеличение выхода коммитированных клеток-предшественников (КОЕ-ГМ и КОЕ-Г), но и значительное повышение количества полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (КОЕ-ГЭММ) в 14-суточной культуре неприлипающих миелокариоцитов: до 341% от фона (табл.).At the same time, the study of cell cultures subjected to hyaluronidase before incubation showed not only a more significant (than without) increase in the yield of committed progenitor cells (CFU-GM and CFU-G), but also a significant increase in the number of polypotent hematopoietic stem cells ( CFU-HEMM) in a 14-day culture of non-adherent myelocaryocytes: up to 341% of the background (table).

Таким образом, предварительная обработка клеточного материала, содержащего клетки-предшественники, раствором гиалуронидазы приводит к стимуляции с помощью Г-КСФ не только коммитированных, но и полипотентных кроветворных элементов in vitro. При этом появление у ПГСК способности отвечать на стимулы Г-КСФ, по-видимому, связано с модификацией под влиянием фермента рецепторного аппарата ранних родоначальных клеток крови.Thus, pretreatment of cellular material containing precursor cells with a hyaluronidase solution leads to stimulation with G-CSF of not only committed, but also polypotent hematopoietic elements in vitro. At the same time, the emergence in PSCC of the ability to respond to G-CSF stimuli, apparently, is associated with the modification of the early progenitor blood cells under the influence of the enzyme of the receptor apparatus.

Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать и клонировать in vitro полипотентные гемопоэтические стволовые клетки.The proposed method allows you to effectively stimulate and clone in vitro pluripotent hematopoietic stem cells.

ЛитератураLiterature

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.1. Goldberg E.D., Dygay A.M., Shakhov V.P. Methods of tissue culture in hematology. - Tomsk: Publishing house of TSU, 1992. - S.130-145.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск: STT, 1999. - 114 с.2. Goldberg E.D., Dygay A.M., Zhdanov V.V. The role of the hematopoiesis-inducing microenvironment in the regulation of hematopoiesis in cytostatic myelosuppression. - Tomsk: STT, 1999 .-- 114 p.

3. Чертков И.Л., Дризе Н.И., Воробьев А.И. Схема кроветворения // Терапевтический архив. - 2005. - №7. - С.5-12.3. Chertkov I.L., Drize N.I., Vorobev A.I. Hematopoiesis // Therapeutic Archive. - 2005. - No. 7. - S. 5-12.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Формирование реакций системы крови под влиянием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - №6. - С.628-633.4. Goldberg E.D., Dygay A.M., Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V. The formation of blood system reactions under the influence of granulocyte colony stimulating factor and hyaluronidase // Bul. an experiment. biol. and medicine. - 2008. - No. 6. - S. 628-633.

5. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - №12. - С.690-695.5. Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V., Digay A.M., Goldberg E.D. The role of hyaluronidase in the regulation of hematopoiesis // Bull. an experiment. biol. and medicine. - 2007. - No. 12. - S.690-695.

6. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ., Верещагин Е.И., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Андреева Т.В., Минакова М.Ю., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.6-9.6. Digay AM, Zyuzkov G.N., Zhdanov V.V., Vereshchagin E.I., Udut E.V., Khrichkova T.Yu., Simanina E.V., Stavrova L.A., Andreeva T.V. , Minakova M.Yu., Madonov P.G., Kinsht D.N. Regulation of progenitor cell functions using hyaluronidase // Vestnik RAMS. - 2009. - No. 11. - S. 6-9.

Claims (1)

Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток костного мозга, заключающийся в том, что неприлипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в питательной среде с добавлением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, отличающийся тем, что перед получением неприлипающей фракции миелокариоцитов клетки костного мозга подвергают 30-минутной преинкубации в питательной среде, содержащей 1 ЕД/мл гиалуронидазы, и дважды отмывают центрифугированием. A method of stimulating in vitro pluripotent hematopoietic bone marrow stem cells, the method is that the non-adherent fraction of myelocaryocytes is cultured in a nutrient medium with the addition of a granulocyte colony stimulating factor, characterized in that before receiving the non-adherent fraction of myelocaryocytes, the bone marrow cells are subjected to a 30-minute preincubation in nutrient medium containing 1 IU / ml hyaluronidase, and washed twice by centrifugation.