RU2436793C1 - Agent having antioxidant, hepatoprotector and anti-inflammatory properties - Google Patents

Abstract

FIELD: chemistry.

SUBSTANCE: invention relates to ursolic acid derivatives of formula (I):

. The compounds have marked antioxidant activity, as well as hepatoprotector and anti-inflammatory properties and can be used in medicine as medicinal agents. The method of producing the compounds is based on converting ursolic acid obtained from juice production wastes.

EFFECT: improved properties of compounds.

1 cl, 6 ex, 4 tbl

Description

Изобретение относится к лекарственным средствам с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью, конкретно к производным урсоловой кислоты формулы I:The invention relates to medicines with antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory activity, specifically to ursolic acid derivatives of the formula I:

2-((1S,2R,4aS,6aS,6bR,10S,12aR,12bR,14bS)-10-гидрокси-1,2,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбонилокси) уксусной кислоте (или карбоксиметиловому эфиру 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты) формулы Iа, 1S,2R,4аS,6аS,6bR,10S,12аR,12bR,14bS)-10-ацетокси-1,2,6а,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4а,5,6,6а,6b,7,8,8а,9,10,11,12,12а,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоновой кислоте (или ацетату урсоловой кислоты) формулы Ib и 2-((1S,2R,4aS,6aS,6bR,10S,12aR,12bR,14bS)-10-гидрокси-1,2,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-эйкозагидропицен-4а-карбоксамидо)уксусной кислоте (N-[3-гидрокси-28-оксоурсан-12-ен-28-ил]-глицину) формулы Ic, которые могут использоваться в медицине в качестве лекарственных средств, обладающих комплексной антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.2 - ((1S, 2R, 4aS, 6aS, 6bR, 10S, 12aR, 12bR, 14bS) -10-hydroxy-1,2,6a, 6b, 9,9,12a-heptamethyl-1,2,3,4 , 4a, 5,6,6a, 6b, 7,8,8a, 9,10,11,12,12a, 12b, 13,14b-eicosahydropicene-4a-carbonyloxy) acetic acid (or 3-hydroxy-ursan carboxymethyl ether) -12-en-28-oic acid) of the formula Ia, 1S, 2R, 4aS, 6aS, 6bR, 10S, 12aR, 12bR, 14bS) -10-acetoxy-1,2,6a, 6b, 9,9,12a heptamethyl-1,2,3,4,4a, 5,6,6a, 6b, 7,8,8a, 9,10,11,12,12a, 12b, 13,14b-eicosahydropicene-4a-carboxylic acid (or ursolic acid acetate) of the formula Ib and 2 - ((1S, 2R, 4aS, 6aS, 6bR, 10S, 12aR, 12bR, 14bS) -10-hydroxy-1,2,6a, 6b, 9,9,12a-heptamethyl- 1,2,3,4,4a, 5,6,6a, 6b, 7,8,8a, 9,10,11,12,12a, 12b, 13,14b-eicosahydropicene-4a-carboxamido) acetic acid (N - [3-hydroxy-28-oxoursan-12-en- 28-yl] -glycine) of formula Ic, which can be used in medicine as drugs with complex antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory activity.

Препараты на основе растительных соединений благодаря своему комплексному лечебному эффекту и низкой токсичности являются одними из наиболее востребованных на рынке лекарственных средств [М.Д.Машковский. Лекарственные средства (в двух томах). М.: Новая волна, 1996, Т.1, с.603; Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М.: Медицина, 1979, с.61-65.]Preparations based on herbal compounds due to their complex therapeutic effect and low toxicity are among the most popular drugs on the market [M.D. Mashkovsky. Medicines (in two volumes). M .: New wave, 1996, T. 1, S. 603; Medicines approved for use in the USSR. Ed. M.A. Klyueva, E.A. Babayana. M .: Medicine, 1979, S. 61-65.]

Известно, что производные урсоловой кислоты проявляют высокую биологическую активность. Например, у бензилурсолата была обнаружена фотопротекторная активность, которая проявлялась в виде действия, препятствующего старению кожи [Патент US 6338854, Matsumoto K., Tsuruoka H., Fujiwara N., Nishimori Y., Kenjo Y. Photoaging skin-care preparation and method of treating wrinkled skin. 15.01.2002].Ursolic acid derivatives are known to exhibit high biological activity. For example, photoprotective activity was found in benzylursolate, which manifested itself as an anti-aging action [Patent US 6338854, Matsumoto K., Tsuruoka H., Fujiwara N., Nishimori Y., Kenjo Y. Photoaging skin-care preparation and method of treating wrinkled skin. 01/15/2002].

Важным преимуществом урсоловой кислоты можно считать доступную ресурсную базу. Урсоловую кислоту высокой чистоты можно легко получать из отходов производства соков - шротов клюквы [Патент РФ 181636, Шевцов С.А., Ралдугин В.А., Щукин Г.И. Способ получения урсоловой кислоты. Опубл. 27.09.1995] и черноплодной рябины [Патент РФ №2329048, Л.П.Козлова, Е.В.Малыхин, С.М.Обут, С.А.Попов, О.П.Шеремет. Способ получения урсоловой кислоты. Опубл. 20.07.2008.]. В ряде растительных источников встречается ацетат урсоловой кислоты, в частности, ацетаты тритерпеновых кислот содержатся в экстрактах, получаемых из отходов пищевой промышленности, однако выделение их в чистом виде является затруднительным [Л.П.Козлова, Т.П.Кукина, С.М.Обут, Л.Г.Овсянникова, Л.М.Покровский, С.А.Попов, О.И.Сальникова, О.П.Шеремет. Отходы пилотной наработки урсоловой кислоты из ягодных шротов как источник БАВ. Материалы III Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», г.Барнаул, 23-27 апреля 2007 г., Т.2, с.314-317]. Таким образом, урсоловая кислота может являться перспективным базовым соединением для получения производных с комплексной фармакологической активностью.An important advantage of ursolic acid can be considered an accessible resource base. Ursolic acid of high purity can be easily obtained from waste products of juice - cranberry meal [RF Patent 181636, Shevtsov SA, Raldugin VA, Schukin GI A method of producing ursolic acid. Publ. 09/27/1995] and chokeberry [RF Patent No. 2329048, L.P. Kozlova, E.V. Malykhin, S.M. Obut, S.A. Popov, and O.P.Sheremet. A method of producing ursolic acid. Publ. 07/20/2008.]. Ursolic acid acetate is found in a number of plant sources, in particular, triterpenic acid acetates are found in extracts obtained from food industry wastes, however, their pure isolation is difficult [L.P. Kozlova, T.P. Kukina, S.M. Obut, L.G. Ovsyannikova, L.M. Pokrovsky, S.A. Popov, O.I.Salnikova, O.P.Sheremet. Waste of pilot production of ursolic acid from berry meal as a source of biologically active substances. Materials of the III All-Russian Scientific Conference "New Advances in Chemistry and Chemical Technology of Plant Raw Materials", Barnaul, April 23-27, 2007, Vol.2, p.314-317]. Thus, ursolic acid can be a promising base compound for the preparation of derivatives with complex pharmacological activity.

Задачей настоящего изобретения является поиск лекарственных средств с комплексной антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.The present invention is the search for drugs with complex antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory activity.

Задача решается использованием соединений общей формулы I:The problem is solved using the compounds of general formula I:

в качестве лекарственных средств с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью.as medicines with antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory activity.

Аналогом заявляемого средства по фармакологическим свойствам является дигидрокверцетин [(2R,3R)-3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаванон] формулы (II).An analogue of the claimed drug according to pharmacological properties is dihydroquercetin [(2R, 3R) -3,5,7,3 ', 4'-pentahydroxyflavanone] of the formula (II).

Прототипом и ближайшим структурным аналогом заявляемого средства является пентациклический тритерпеноид - урсоловая кислота III.The prototype and the closest structural analogue of the claimed drug is a pentacyclic triterpenoid - ursolic acid III.

Соединением сравнения по противовоспалительным свойствам является нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция "Fluka" BioChemika).Comparison compound for anti-inflammatory properties is the non-steroidal anti-inflammatory drug indomethacin (substance "Fluka" BioChemika).

По литературным данным ацетат урсоловой кислоты оказывал синергический эффект на специфическое ингибирование куркуминоидами индуцибельной циклооксигеназы-2 в культуре мышиных клеток RAW 264.7 [US 2002/0068098, WO 03/007975 A1 (Ashini Naturaceuticals, Inc), "Curcuminoid Compositions Exhibiting Synergistic Inhibition of the Expression and/or Activity of Cyclooxigenase-2"]. Антиоксидантная, гепатопротекторная и противовоспалительная активность индивидуального соединения 1b ранее не исследовалась.According to published data, ursolic acid acetate had a synergistic effect on specific curcuminoid inhibition of inducible cyclooxygenase-2 in a murine cell culture RAW 264.7 [US 2002/0068098, WO 03/007975 A1 (Ashini Naturaceuticals, Inc), "Curcuminoid Compositions Inhibiting Syningner and / or Activity of Cyclooxigenase-2 "]. The antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory activity of individual compound 1b has not been previously studied.

Известен N-[3-гидрокси-28-оксиурсан-12-ен-28-ил]-глицин, обладающий цитотоксической активностью [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P.848-854. Противовоспалительная, антиоксидантная, гепатопротекторная активность для соединения 1с не была известна.Known N- [3-hydroxy-28-hydroxyursan-12-en-28-yl] -glycine with cytotoxic activity [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P.848-854. The anti-inflammatory, antioxidant, hepatoprotective activity for compound 1c was not known.

Соединение Iа получают алкилированием урсоловой кислоты III этилхлорацетатом в диметилформамиде в присутствии карбоната калия, при этом получают этиловый эфир IV, который отделяют фильтрацией после выливания реакционной смеси в воду. Этиловый эфир IV без высушивания обрабатывают раствором спиртового раствора КОН при кипячении, при этом происходит селективный гидролиз карбоксиэтильного фрагмента, после чего подкисляют и выделяют кислоту Iа.Compound Ia is prepared by alkylation of ursolic acid III with ethyl chloroacetate in dimethylformamide in the presence of potassium carbonate, whereby ethyl IV is obtained, which is separated by filtration after the reaction mixture is poured into water. Ethyl ether IV without drying is treated with a solution of an alcoholic KOH solution during boiling, and the carboxyethyl fragment is selectively hydrolyzed, then acidified and acid Ia is isolated.

Соединение Ib и Iс получают способами, приведенными в работе [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. Р.848-854].Compound Ib and Ic are prepared by the methods described in [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P. 848-854].

Биологическая активность заявленного средства изучалась путем определения антиоксидантных, гепатопротекторных и противовоспалительных свойств на беспородных мышах. В качестве препаратов сравнения использовали антиоксидант дигидрокверцетин (II) (99,9% чистоты) и нестероидный противовоспалительный препарат индометацин (субстанция «Fluka» BioChemika). Структурным аналогом заявляемого средства являлась урсоловая кислота.The biological activity of the claimed funds was studied by determining the antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory properties in outbred mice. The antioxidant dihydroquercetin (II) (99.9% purity) and the non-steroidal anti-inflammatory drug indomethacin (substance Fluka BioChemika) were used as comparison preparations. The structural analogue of the claimed drug was ursolic acid.

Для исследования антиоксидантного и гепатопротекторного эффектов была использована стандартная экспериментальная модель токсического ССl₄ гепатита у мышей. Модель воспроизводилась согласно методическим рекомендациям [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Медицина», 2005, 240 с.] Токсический гепатит моделировали путем внутрижелудочного введения мышам 25% раствора ССl₄ в растительном масле. Заявленное средство формулы I вводили в желудок в дозе 20 мг/кг в виде водно-твиновой взвеси за 1 час до гепатотоксина. Референсное соединение - дигидрокверцетин (ДКВ) - вводили аналогичным образом в дозе 50 мг/кг. Гепатопротекторный эффект определяли по снижению в сыворотке крови маркеров цитолиза - аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT), антиоксидантные свойства оценивали по уменьшению концентрации продуктов перекисного окисления (ТБКРС), определяемых по реакции с тиобарбитуровой кислотой [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207.] Пробы сыворотки крови отбирали через сутки после введения агентов. Анализ биохимических показателей проводили с использованием стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум», Германия) на биохимическом анализаторе (Фотометр 5010, Германия).To study the antioxidant and hepatoprotective effects, a standard experimental model of toxic hepatitis CCl ₄ in mice was used. The model was reproduced according to the methodological recommendations [Guide to the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. M .: OJSC "Medicine", 2005, 240 pp.] Toxic hepatitis was modeled by intragastric administration to mice of a 25% solution of CCl ₄ in vegetable oil. The claimed agent of formula I was injected into the stomach at a dose of 20 mg / kg in the form of a water-twin suspension 1 hour before hepatotoxin. The reference compound, dihydroquercetin (DHQ), was administered in a similar manner at a dose of 50 mg / kg. The hepatoprotective effect was determined by a decrease in serum markers of cytolysis - alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (ACT), antioxidant properties were evaluated by a decrease in the concentration of peroxidation products (TBKRS), determined by the reaction with thiobarbituric acid [Kamyshnikov BC Chemical Laboratory Diagnostic Handbook . Minsk: Belarus, 2000, T.2, p.207.] Serum samples were taken one day after the introduction of agents. The analysis of biochemical parameters was carried out using standard sets of reagents (Olveks Diagnosticum, Germany) on a biochemical analyzer (Photometer 5010, Germany).

Установлено, что средство формулы I при внутрижелудочном введении в дозе 20 мг/кг обладает высокой гепатопротекторной активностью, снижая не менее чем в 2 раза выраженность цитолитических процессов по сравнению с контролем. По величине эффекта заявленное средство не уступает урсоловой кислоте и дигидрокверцетину (табл.1).It was found that the agent of formula I, when administered intragastrically at a dose of 20 mg / kg, has a high hepatoprotective activity, reducing the severity of cytolytic processes by at least 2 times compared with the control. The magnitude of the effect of the claimed agent is not inferior to ursolic acid and dihydroquercetin (table 1).

Показано, что средство формулы I оказывает выраженное антиоксидантное действие, снижая концентрацию ТБКРС в крови соответственно в 1.6, 2.0 и 1.5 раза, тогда как эталонный препарат дигидрокверцетин и урсоловая кислота уменьшают уровень показателя не более чем в 1,3 раза (табл.2).It was shown that the agent of formula I has a pronounced antioxidant effect, reducing the concentration of TBKRS in the blood 1.6, 2.0 and 1.5 times, respectively, while the reference drug dihydroquercetin and ursolic acid reduce the level of the indicator by no more than 1.3 times (Table 2).

Противовоспалительную активность заявляемого средства исследовали на стандартной модели воспаления, вызванного гистамином [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Медицина», 2005, 240 с.]. Средство формулы I и его структурный прототип вводили внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг за 1 час до субплантарного введения флогогена. Препарат сравнения индометацин вводили тем же способом в эффективной дозе 20 мг/кг. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению, по сравнению с контролем, индекса отека, который рассчитывали в процентах как отношение разности здоровой и воспаленной лапы к массе здоровой. Выявлено, что на фоне воспаления, индуцированного гистамином, заявляемое средство проявляет достоверный противовоспалительный эффект, при этом производные Iа и Iс проявляют активность, близкую к эталонному препарату индометацину, тогда как соединения Ib - к урсоловой кислоте (таблицы 3, 4).The anti-inflammatory activity of the claimed drug was investigated on a standard model of inflammation caused by histamine [Guide to the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. M .: OJSC "Medicine", 2005, 240 pp.]. The agent of formula I and its structural prototype were administered intragastrically at a dose of 20 mg / kg 1 hour before the subplant implantation of phlogogen. The reference drug indomethacin was administered in the same manner at an effective dose of 20 mg / kg. The anti-inflammatory effect was evaluated by reducing, compared with the control, the edema index, which was calculated as a percentage as the ratio of the difference between a healthy and inflamed paw to a healthy mass. It was revealed that against the background of histamine-induced inflammation, the claimed drug exhibits a significant anti-inflammatory effect, while derivatives Ia and Ic show activity close to the reference drug indomethacin, while compounds Ib are ursolic acid (tables 3, 4).

Таким образом, заявляемое средство обладает следующими преимуществами:Thus, the claimed tool has the following advantages:

- более высоким антиоксидантным эффектом по сравнению с урсоловой кислотой и дигидрокверцетином;- a higher antioxidant effect compared with ursolic acid and dihydroquercetin;

- наличием гепатопротекторной активности, не уступающей по величине активности урсоловой кислоты и дигидрокверцетина;- the presence of hepatoprotective activity, not inferior in magnitude to the activity of ursolic acid and dihydroquercetin;

- значимым противовоспалительным действием;- significant anti-inflammatory effect;

- использованием в синтезе средства доступной урсоловой кислоты, получаемой из отходов пищевой промышленности, или бензилурсолата, получаемого из экстрактов шротов брусники.- the use in the synthesis of available ursolic acid, obtained from waste from the food industry, or benzylursolate, obtained from extracts of cowberry meal.

Изобретение иллюстрируется следующими примерамиThe invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Получение карбоксиметилового эфира 3-окси-урсан-12-ен-28-овой кислоты (Iа)Example 1. Obtaining carboxymethyl ester of 3-hydroxy-ursan-12-en-28-oic acid (Ia)

К суспензии урсоловой кислоты (0.92 г, 2 ммоль) в ДМФА (10 мл) добавляют измельченный K₂СО₃, (0.45 г, 3.3 ммоль) и этил 2-хлорацетат (0.25 г, 2 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре 4 час. Реакционную смесь выливают в воду 30 мл и отфильтровывают.To a suspension of ursolic acid (0.92 g, 2 mmol) in DMF (10 ml), crushed K ₂ CO ₃ (0.45 g, 3.3 mmol) and ethyl 2-chloroacetate (0.25 g, 2 mmol) are added. The mixture was stirred at room temperature for 4 hours. The reaction mixture was poured into water 30 ml and filtered.

Сырой осадок без высушивания помещают в раствор КОН (0.4 г, 7.2 ммоль) в этаноле (10 мл). Смесь кипятят в течение 1 часа и отгоняют растворитель досуха, осадок промывают последовательно 5% соляной кислотой (20 мл), водой (3×20 мл) и сушат. Получают 0,97 г (94%) искомого соединения в виде белого порошка. Т пл. 175-178°С (разл,) α²⁵+52 (c 1.0, МеОН).The crude precipitate without drying is placed in a solution of KOH (0.4 g, 7.2 mmol) in ethanol (10 ml). The mixture is boiled for 1 hour and the solvent is distilled off to dryness, the precipitate is washed successively with 5% hydrochloric acid (20 ml), water (3 × 20 ml) and dried. 0.97 g (94%) of the title compound are obtained in the form of a white powder. T pl. 175-178 ° C (decomp.), Α ²⁵ +52 (c 1.0, MeOH).

Спектр ЯМР Н¹ (Py-d₅, 300 MHz, δ м.д.): 4.95 (АВ, Δν_AB=29.4 Гц, J_AB=15.6 (2H)); 3.39 дд (J 9.3, 6.8); 5.36 дд (J 3.5, 3.5); 2.47 д (J 11.3); 1.99 уш. с; 1.13 с; 0.88 с; 0.97 с; 0.87 с; 1.18 с; 0.89 д (J 6.4); 0.87 м. ¹ H NMR (Py-d _5, 300 MHz, δ ppm): 4.95 (AB, Δν _AB = 29.4 _{Hz, J AB = 15.6 (2H)} ); 3.39 dd (J 9.3, 6.8); 5.36 dd (J 3.5, 3.5); 2.47 d (J 11.3); 1.99 ears from; 1.13 s; 0.88 s; 0.97 s; 0.87 s; 1.18 s; 0.89 d (J 6.4); 0.87 m.

Спектр ЯМР С¹³ (Py-d₅, 75 MHz, δ_C м.д.): 174.78, 168.87, 136.47, 123.90, 76.00, 59.26, 53.67, 51.14, 46.24, 45.86, 40.25, 37.82, 37.22, 37.19, 37.02, 36.99, 35.12, 34.87, 31.33, 28.77, 26.67, 26.31, 25.92, 22.54, 21.68, 21.49, 19.16, 16.63, 15.24, 15.20, 14.44, 13.60. 15.70 к; 16.54 к; 17.30 к; 17.34 к; 18.72 т; 21.25 к; 23.59 т; 23.77 к; 24.64 т; 28.02 т; 28.40 т; 28.77 к; 30.86 т; 33.43 т; 36.96 т; 37.21 с; 39.08 т; 39.12 д; 39.29 д; 39.32 с; 39.92 с; 42.34 с; 47.96 д; 48.33 с; 53.24 д; 55.76 д; 61.35 т; 78.09 д; 126.00 д; 138.56 с; 170.97 с; 176.87 с.C ¹³ NMR spectrum (Py-d ₅ , 75 MHz, δ _C ppm): 174.78, 168.87, 136.47, 123.90, 76.00, 59.26, 53.67, 51.14, 46.24, 45.86, 40.25, 37.82, 37.22, 37.19, 37.02 , 36.99, 35.12, 34.87, 31.33, 28.77, 26.67, 26.31, 25.92, 22.54, 21.68, 21.49, 19.16, 16.63, 15.24, 15.20, 14.44, 13.60. 15.70 k; 16.54 k; 17.30 to; 17.34 k; 18.72 t; 21.25 to; 23.59 t; 23.77 k; 24.64 t; 28.02 t; 28.40 t; 28.77 k; 30.86 t; 33.43 t; 36.96 t; 37.21 s; 39.08 t; 39.12 d; 39.29 d; 39.32 s; 39.92 s; 42.34 s; 47.96 d; 48.33 s; 53.24 d; 55.76 d; 61.35 t; 78.09 d; 126.00 d; 138.56 s; 170.97 s; 176.87 p.

Получение ацетата урсоловой кислоты 1b и N-[3-гидрокси-28-оксоурсан-12-ен-28-ил]-глицина (I с) описано в работе [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P.848-854].The preparation of ursolic acid acetate 1b and N- [3-hydroxy-28-oxoursan-12-en-28-yl] -glycine (I c) is described in [Bioorg. & Med. Chem. - 2009. V.17. N 2. P.848-854].

Пример 2. Исследование гепатопротекторных свойств на модели острого токсического гепатитаExample 2. The study of hepatoprotective properties in a model of acute toxic hepatitis

Острый токсический гепатит вызывают у беспородных самцов мышей массой 20-25 г путем однократного внутрижелудочного введения 25% раствора ССl₄ в подсолнечном масле из расчета по 0,1 мл на 10 г массы тела [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Медицина»., 2005, 240 с.]. Средство формулы I и урсоловую кислоту вводят за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Дигидрокверцетин вводят тем же способом в эффективной дозе 50 мг/кг. Контрольным животным вводят водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме.Acute toxic hepatitis is caused in outbred male mice weighing 20-25 g by a single intragastric administration of a 25% solution of CCl ₄ in sunflower oil at a rate of 0.1 ml per 10 g of body weight [Guide to experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. M .: OJSC "Medicine"., 2005, 240 S.]. The agent of formula I and ursolic acid are administered 1 hour before the reproduction of hepatitis intragastrically in the form of a suspension in distilled water with the addition of Tween-80 emulsifier at a dose of 20 mg / kg (in a volume of 0.2 ml per 10 g of animal weight). Dihydroquercetin is administered in the same manner at an effective dose of 50 mg / kg. Control animals were injected with water-twin suspension in an equivalent volume.

Каждая группа содержит по 9-10 особей.Each group contains 9-10 individuals.

Через сутки животных забивают декапитацией под легким эфирным наркозом и определяют в сыворотке крови мышей активность АЛТ, ACT с помощью стандартных наборов реактивов («Ольвекс диагностикум»).After a day, the animals are killed by decapitation under light ether anesthesia and the ALT, ACT activity is determined in the blood serum of mice using standard reagent kits (Olveks Diagnostic).

Результаты обрабатывают статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6».The results are processed statistically using the STATISTIKA 6 software package.

Установлено, что средство формулы I в условиях токсического гепатита оказывает достоверный антицитолитический эффект, снижая активность АЛТ и ACT в крови в 2,0-2,2 раза по сравнению с контролем. У агентов Iа и Ib наблюдается практически одинаковое понижение уровня обоих трансаминаз, тогда как производное Iс аналогично урсоловой кислоте и дигидрокверцетину в большей степени снижает активность АЛТ, чем ACT (соответственно в 2,8 и 1,6 раз). Однако выявленные различия между опытными и референсными не являются статистически значимыми (табл.1).It was found that the agent of formula I under conditions of toxic hepatitis has a significant anticytolytic effect, reducing the activity of ALT and ACT in the blood by 2.0-2.2 times compared with the control. For agents Ia and Ib, almost the same decrease in the level of both transaminases is observed, while the derivative Ic, like ursolic acid and dihydroquercetin, reduces ALT activity to a greater extent than ACT (2.8 and 1.6 times, respectively). However, the revealed differences between experimental and reference are not statistically significant (Table 1).

Таким образом, установлено, что средство формулы I обладает значимым гепатопротекторным действием, которое не уступает аналогичному эффекту урсоловой кислоты и дигидрокверцетина.Thus, it was found that the agent of formula I has a significant hepatoprotective effect, which is not inferior to the similar effect of ursolic acid and dihydroquercetin.

Пример 3. Исследование антиоксидантных свойств на модели острого токсического гепатитаExample 3. The study of antioxidant properties in a model of acute toxic hepatitis

Определение антиоксидантного эффекта средства формулы I проводят на модели токсического ССl₄ гепатита, описанной выше. Влияние агентов на выраженность процессов перекисного окисления липидов оценивают по уровню ТБК-реактивных соединений (ТБАРС) в сыворотке крови, которые являются вторичными продуктами перекисного окисления. Заявленное средство и агенты сравнения вводят за 1 час до воспроизведения гепатита внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Введенные дозы составляют для урсоловой кислоты и заявляемого средства формулы I - 20 мг/кг; для дигидрокверцетина - 50 мг/кг. Контрольным животным вводят водно-твиновую взвесь в эквивалентном объеме. Каждая группа содержит по 9-10 особей. Через сутки животных забивают декапитацией под легким эфирным наркозом и определяют концентрацию ТБАРС в сыворотке крови мышей общепринятым методом [Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207.] Результаты обрабатывают статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считают достоверными с вероятностью р<0,05.The antioxidant effect of the agent of formula I is determined on the model of toxic hepatitis CCl ₄ described above. The effect of agents on the severity of lipid peroxidation processes is evaluated by the level of TBA-reactive compounds (TBARS) in blood serum, which are secondary products of peroxidation. The claimed agent and comparison agents are administered 1 hour before the reproduction of hepatitis intragastrically in the form of a suspension in distilled water with the addition of Tween-80 emulsifier at a dose of 20 mg / kg (in a volume of 0.2 ml per 10 g of animal weight). The doses administered are for ursolic acid and the claimed agent of formula I — 20 mg / kg; for dihydroquercetin - 50 mg / kg. Control animals were injected with water-twin suspension in an equivalent volume. Each group contains 9-10 individuals. After a day, the animals are killed by decapitation under light ether anesthesia and the concentration of TBARS in the blood serum of mice is determined by the generally accepted method [Kamyshnikov BC Handbook of clinical and chemical laboratory diagnostics. Minsk: Belarus, 2000, Vol. 2, p.207.] The results are processed statistically using the STATISTIKA 6 software package. Differences are considered significant with a probability of p <0.05.

Установлено, что заявляемое средство формулы I оказывает достоверное антиоксидантное действие, снижая соответственно для Ia, Ib и Iс в 1,6, 2,0 и 1,5 раза концентрацию ТБКРС в крови, тогда как эталонный препарат дигидрокверцетин и урсоловая кислота уменьшают уровень показателя не более чем в 1,3 раза (табл.2).It was found that the claimed agent of the formula I has a significant antioxidant effect, decreasing the concentration of TBKRS in the blood by 1.6, 2.0 and 1.5 times, respectively, for Ia, Ib and Ic, while the reference preparation dihydroquercetin and ursolic acid reduce the level of more than 1.3 times (table 2).

Таблица 2table 2 Влияние средства формулы I на уровень ТБК-реактивных соединений (мкмоль/л) в сыворотке кровиThe effect of the funds of formula I on the level of TBA-reactive compounds (μmol / l) in serum ГруппаGroup контрольthe control IаIa IbIb IсIc УКUK ДКВDKV ТБКРСTBKRS 4,9±0,54.9 ± 0.5 3,1±0,3**3.1 ± 0.3 ** 2,5±0,3**2.5 ± 0.3 ** 3,2±0,1*3.2 ± 0.1 * 3,8±0,33.8 ± 0.3 3,7±0,3*3.7 ± 0.3 * *Р<0,05; **Р<0,01 - различия с контролем достоверны* P <0.05; ** P <0.01 - differences with control are significant Р<0,05 различия с ДКВ достоверныP <0.05 differences with DQV significant К - контроль, УК - урсоловая кислота, ДКВ - дигидрокверцетин, ТБКРС - ТБК-реактивные соединения.To - control, CC - ursolic acid, DKV - dihydroquercetin, TBKRS - TBA-reactive compounds.

Таким образом, заявляемое средство обладает выраженным антиоксидантным действием, при этом Iа и Iс превосходят соответствующий эффект дигидрокверцетина в 1,2 раза, а Ib - в 1,5 раза.Thus, the claimed tool has a pronounced antioxidant effect, while Ia and Ic exceed the corresponding effect of dihydroquercetin 1.2 times, and Ib 1.5 times.

Пример 4. Исследование противовоспалительных свойств на модели гистаминового воспаленияExample 4. The study of anti-inflammatory properties in a model of histamine inflammation

Эксперименты проводят на беспородных мышах самцах массой 20-25 г. Животных делят на группы по 8 особей. Средство формулы I вводят внутрижелудочно в виде взвеси в дистиллированной воде с добавлением эмульгатора Tween-80 в дозе 20 мг/кг (в объеме 0,2 мл на 10 г массы животного). Отдельным группам мышей аналогично вводят структурный аналог урсоловую кислоту в дозе 20 мг/кг, а также эталонный противовоспалительный препарат индометацин в эффективной дозе 20 мг/кг. Контрольные животные получают эквивалентное количество водно-твиновой эмульсии. Через 1 час после введения агентов всем мышам субпланарно в заднюю лапу вводят 0,5% водный раствор гистамина по 0,05 мл/мышь. Через 5 часов после введения флогогена мышей умерщвляют путем цервикальной дислокации позвоночника, отсекают обе задние лапы, определяют массу каждой. Противовоспалительный эффект оценивают по величине индекса воспаления, который определяют как отношение разности масс воспаленной и интактной лап к массе интактной, выраженное в процентах. Результаты обрабатывают статистически с помощью пакета программ «STATISTIKA 6». Различия считают достоверными с вероятностью р<0,05.The experiments are carried out on outbred mice males weighing 20-25 g. Animals are divided into groups of 8 individuals. The agent of formula I is administered intragastrically as a suspension in distilled water with the addition of Tween-80 emulsifier at a dose of 20 mg / kg (in a volume of 0.2 ml per 10 g of animal weight). Separate groups of mice are similarly injected with a structural analogue of ursolic acid at a dose of 20 mg / kg, as well as a reference anti-inflammatory drug indomethacin in an effective dose of 20 mg / kg. Control animals receive an equivalent amount of a water-twin emulsion. 1 hour after the administration of agents, all mice were subplanarly injected with a 0.05 ml / mouse histamine 0.5% aqueous solution in the hind paw. 5 hours after phlogogen administration, mice are sacrificed by cervical dislocation of the spine, both hind legs are cut off, and the mass of each is determined. The anti-inflammatory effect is evaluated by the value of the inflammation index, which is defined as the ratio of the mass difference between the inflamed and intact paws to the intact mass, expressed as a percentage. The results are processed statistically using the STATISTIKA 6 software package. Differences are considered significant with a probability of p <0.05.

Показано, что средство формулы Iа снижает выраженность отека лапы мышей в 1,9, а средство формулы Ib - в 1,5 раза. Урсоловая кислота и индометацин уменьшают отек в 1,8 и в 2,1 раза соответственно (табл.3). Таким образом, средство формулы Iа не уступает по противовоспалительной активности своему структурному аналогу и незначительно (в 1,1 раза) отличается от эталонного препарата индометацина. Средство формулы Ib по противовоспалительной активности незначительно (в 1,1 раза) отличается от урсоловой кислоты и в 1,4 раза уступает индометацину.It was shown that the agent of formula Ia reduces the severity of swelling of the paws of mice by 1.9, and the agent of formula Ib - by 1.5 times. Ursolic acid and indomethacin reduce edema by 1.8 and 2.1 times, respectively (Table 3). Thus, the agent of formula Ia is not inferior in anti-inflammatory activity to its structural analogue and slightly (1.1 times) differs from the reference drug indomethacin. The anti-inflammatory agent of formula Ib differs slightly (1.1 times) from ursolic acid and is 1.4 times inferior to indomethacin.

Таблица 3Table 3 Влияние агентов Iа и Ib на величину индекса гистаминового отека лапыThe effect of agents Ia and Ib on the value of the index of histamine swelling of the paw ГруппаGroup контрольthe control IаIa IbIb УКUK ИндометацинIndomethacin Индекс отека, %Edema index,% 29,57±3,1129.57 ± 3.11 15,21±1,65**15.21 ± 1.65 ** 19,3±2,5619.3 ± 2.56 16,82±3,00*16.82 ± 3.00 * 13,83±1,55**13.83 ± 1.55 ** *р<0,05; **р<0,01 - различия с контролем достоверны;
р<0,05 различия с индометацином достоверны.* p <0.05; ** p <0.01 - differences with control are significant;
p <0.05 differences with indomethacin significant.

Средство формулы Iс снижает выраженность отека лапы мышей в 1,9 раза, тогда как урсоловая кислота уменьшает отек в 1,8 раза, а индометацин - в 1,7 раза (табл.4). Таким образом, в условиях данного эксперимента средство формулы Iс оказывает противовоспалительное действие, не уступающее по выраженности эталонному препарату индометацину и своему структурному аналогу.The agent of formula IC reduces the severity of edema of the paws of mice by 1.9 times, while ursolic acid reduces edema by 1.8 times, and indomethacin by 1.7 times (Table 4). Thus, under the conditions of this experiment, an agent of formula Ic has an anti-inflammatory effect that is not inferior in severity to the reference drug indomethacin and its structural analogue.

Таблица 4Table 4 Влияние агента Iс на величину индекса гистаминового отека лапыThe effect of agent IC on the value of the index of histamine swelling of the paw ГруппаGroup контрольthe control (I)(I) УКUK ИндометацинIndomethacin Индекс отека, %Edema index,% 21,26±2,6321.26 ± 2.63 11,39±1,38**11.39 ± 1.38 ** 12,09±2,16*12.09 ± 2.16 * 12,50±1,83*12.50 ± 1.83 * *р<0,05; **р<0,01 - различия с контролем достоверны;
р<0,05 различия с индометацином достоверны.* p <0.05; ** p <0.01 - differences with control are significant;
p <0.05 differences with indomethacin significant.

Claims (1)

Производные урсоловой кислоты формулы I:

в качестве лекарственного средства с антиоксидантной, гепатопротекторной и противовоспалительной активностью. Ursolic acid derivatives of the formula I:

as a medicine with antioxidant, hepatoprotective and anti-inflammatory activity.