RU2428477C2 - RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN - Google Patents
RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN Download PDFInfo
- Publication number
- RU2428477C2 RU2428477C2 RU2009118273/10A RU2009118273A RU2428477C2 RU 2428477 C2 RU2428477 C2 RU 2428477C2 RU 2009118273/10 A RU2009118273/10 A RU 2009118273/10A RU 2009118273 A RU2009118273 A RU 2009118273A RU 2428477 C2 RU2428477 C2 RU 2428477C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dsd
- pgd
- gal
- galactosidase
- plasmid dna
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
ВВЕДЕНИЕINTRODUCTION
Наиболее перспективными методами рециклизации бета-галактазидов на предприятиях, а также освобождения молочных продуктов от лактозы, которая может быть аллергенной для человеческого организма, является ферментативный способ гидролиза этих соединений как растворимыми формами соответствующих ферментов, так и иммобилизованными.The most promising methods for the recycling of beta-galactazides in enterprises, as well as for the release of dairy products from lactose, which may be allergenic to the human body, are the enzymatic method of hydrolysis of these compounds as soluble forms of the corresponding enzymes, and immobilized.
Они позволяют перерабатывать сырье без образования загрязняющих аддуктов, которые требуют сложных систем очистки продукта.They allow you to process raw materials without the formation of polluting adducts that require complex product cleaning systems.
Иммобилизация бета-галактозидаз на доступных сорбентах (например, на декстранах) позволяет понизить производственные затраты, в частности затраты вследствие постоянного уноса фермента из жидкой фазы и потери его активности при повышении температуры, а также позволяет повысить срок службы фермента и производительность процесса.The immobilization of beta-galactosidases on accessible sorbents (for example, dextrans) allows to reduce production costs, in particular costs due to the constant entrainment of the enzyme from the liquid phase and the loss of its activity with increasing temperature, and also allows to increase the service life of the enzyme and process performance.
Для иммобилизации бета-галактозидаз как в промышленности, так и в медицине до настоящего времени используют химические способы, при этом возрастает срок службы фермента, что незначительно снижает себестоимость процесса гидролиза бета-галактозидов, по сравнению с использованием растворимых форм фермента, однако при химической иммобилизации происходит значительная инактивация фермента, при этом использующиеся химические реагенты, обладая токсичностью, загрязняют продукт и ограничивают его использование в пищевой промышленности.Chemical methods are still used to immobilize beta-galactosidases both in industry and in medicine, while the enzyme's service life is increased, which slightly reduces the cost of the process of hydrolysis of beta-galactosides, in comparison with the use of soluble forms of the enzyme, however, with chemical immobilization significant inactivation of the enzyme, while the chemicals used, having toxicity, pollute the product and limit its use in the food industry.
Для использования в пищевой промышленности большое будущее имеют бета-галактозидазы, обладающие повышенной термостабильностью, способностью аффинно связываться с соответствующим субстратом при широком диапазоне рН. Произвести подобный ферментный препарат возможно при использовании штаммов бактерий, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген бета-галактозидазы с улучшенными свойствами.For use in the food industry, beta-galactosidases, with increased thermal stability, the ability to affinity bind to the corresponding substrate over a wide pH range, have a great future. It is possible to produce a similar enzyme preparation by using strains of bacteria transformed with plasmid DNA carrying the beta-galactosidase gene with improved properties.
Науке известен рекомбинантный белок, обладающий активностью бета-галактозидазы (UniProt № Y 08557, SEQ ID NO: 3 приложения). Известна рекомбинантная плазмида, содержащая ген соответствующей бета-галактозидазы. Получен штамм E.coli DH5α, экспрессирующий данный белок, однако в таком виде этот фермент может быть иммобиллизован только химическими методами, которые, как известно, удорожают процесс. Известен способ иммобилизации бета-галактозидазы на пористом кремнеземе (авторское свидетельство СССР 1317024 А1, класс С12 от 15.04.87 г.); способ химической иммобилизации на активированной диметилацетамидом целлюлозе (авторское свидетельство СССР 1567625 А1, класс С 11/04, 11/12 от 30.05.90 г.). Данные методы требуют высокоочищенного фермента, который можно получить лишь в результате длительной многостадийной его очистки.A recombinant protein having beta-galactosidase activity (UniProt No. Y 08557, SEQ ID NO: 3 applications) is known to science. A recombinant plasmid is known that contains the gene for the corresponding beta-galactosidase. A strain of E. coli DH5α expressing this protein was obtained, however, in this form, this enzyme can be immobilized only by chemical methods, which are known to make the process more expensive. A known method of immobilization of beta-galactosidase on porous silica (USSR copyright certificate 1317024 A1, class C12 from 04/15/87); Chemical immobilization method on cellulose activated by dimethylacetamide (USSR author's certificate 1567625 A1, class C 11/04, 11/12 from 05/30/90). These methods require a highly purified enzyme, which can be obtained only as a result of prolonged multi-stage purification.
Но известен способ получения слитных белков с целлюлозосвязывающими доменами для иммобилизации и очистки белков на грануллированной целлюлозе (Patent US 5137819, Kilborn, et. al., 11.08.92).But there is a method for producing fusion proteins with cellulose-binding domains for immobilizing and purifying proteins on granulated cellulose (Patent US 5137819, Kilborn, et. Al., 11.08.92).
Однако производство гранулированной целлюлозы как носителя не имеет широкого распространения и сопряжено с рядом сложностей, удорожающих процесс и конечный продукт, к тому же константа диссоциации (Кд) при связывании целлюлозосвязывающего домена и гранул целлюлозы составляет 10-6-10-7.However, the production of granular cellulose as a carrier is not widespread and involves a number of difficulties that make the process and the final product more expensive, in addition, the dissociation constant (K d ) when binding the cellulose-binding domain and cellulose granules is 10 -6 -10 -7 .
В генбанке же аннотирована последовательность декстрансвязывающего домена (ДСД) [1, 2], который в виде автономного белка способен показывать на порядок большую прочность связывания с декстрановыми сорбентами (Кд=10-9), промышленное производство которых более широко представлено, в отличие от производства грануллированной целлюлозы.In the genebank, the sequence of the dextran binding domain (DSD) is annotated [1, 2], which in the form of an autonomous protein is able to show an order of magnitude greater binding strength with dextran sorbents (K d = 10 -9 ), the industrial production of which is more widely represented, unlike production of granulated cellulose.
Технический результат данного изобретения заключается в создании экспрессионной плазмиды pGD-10 с геном белка ДСД-сп-β-ГАЛ (SEQ ID NO: 1 приложения), создании самого слитного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, обладающего, с одной стороны, бета-галактозидазной активностью, а с другой - способностью связываться с декстранами при повышенной температуре (65-75°С).The technical result of this invention is to create an expression plasmid pGD-10 with the gene protein DSD-SP-β-GAL (SEQ ID NO: 1 application), the creation of the most fused protein DSD-SP-β-GAL, having, on the one hand, beta -galactosidase activity, and on the other - the ability to bind to dextrans at elevated temperatures (65-75 ° C).
Данный технический результат достигается созданием химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, содержащего декстрансвязывающий домен ДСД из - Leuconosfcoc mesenteroides, соединенный через глицин-сериновый спейсер (GSGSGSGSGSGA) с термостабильной бета-галактозидазой из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter Ethanolicus.This technical result is achieved by the creation of the chimeric protein DSD-cn-β-HAL, containing the dextran-binding domain of the DSD from Leuconosfcoc mesenteroides, connected via a glycine-serine spacer (GSGSGSGSGSGA) to a thermostable beta-galactosidase from a thermophilic microorganism Ethanobacter.
Также данный технический результат достигается созданием рекомбинантной плазмидной ДНК pGD-10 5111 п.н. (SEQ ID NO: 1 приложения), содержащей синтетический оперон с геном слитного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, включающий ранний промотор бактериофага Т5, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок ДСД-сп-β-ГАЛ (115-2802 п.н.) и терминатор транскрипции; ген бета-лактамазы, детерминирующий устойчивость к антибиотику ампициллину, и сайт инициации репликации типа ColE1. Таким образом, рекомбинантная плазмидная ДНК pGD-10 обеспечивает экспрессию белка ДСД-сп-β-ГАЛ в клетках E.coli.Also, this technical result is achieved by the creation of recombinant plasmid DNA pGD-10 5111 bp (SEQ ID NO: 1 appendix) containing a synthetic operon with the gene for the DSD-cn-β-GAL fusion protein, including the early promoter of the T5 bacteriophage, the nucleotide sequence encoding the protein DSD-cn-β-GAL (115-2802 bp ) and a transcription terminator; a beta-lactamase gene that determines antibiotic resistance to ampicillin, and a ColE1-type replication initiation site. Thus, pGD-10 recombinant plasmid DNA provides expression of the DSD-cn-β-GAL protein in E. coli cells.
Указанный технический результат достигается также тем, что штамм E.coli DH5a, трансформированный экспрессионным плазмидлным вектором pGD-10, является продуцентом целевого химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.The specified technical result is also achieved by the fact that the E. coli strain DH5a, transformed with the expression plasmid vector pGD-10, is a producer of the target chimeric protein DSD-cn-β-GAL.
На фиг.1 представлена экспрессионная плазмида pGD-10 с геном белка ДСД-сп-β-ГАЛ.Figure 1 presents the expression plasmid pGD-10 with the protein gene DSD-SP-β-GAL.
Описание процесса достижения технического результатаDescription of the process to achieve a technical result
§1. Создание плазмидного экспрессионного вектора pGD-10§one. Creating a plasmid expression vector pGD-10
§1.1. Химический синтез олигонуклеотидов§1.1. Chemical synthesis of oligonucleotides
Олигонуклеотиды были синтезированы твердофазным амидофосфитным методом с помощью синтезатора АСМ-100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12% ПААГ (ЗАО «СИНТОЛ», ЗАО «Евроген»).Oligonucleotides were synthesized by the solid-phase amidophosphite method using an ASM-100-2 synthesizer (Novosibirsk) and purified by electrophoresis in 12% SDS page (ZAO SINTOL, ZAO Evrogen).
§1.2. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides§1.2. Obtaining and cloning of the DSD gene from Leuconostoc mesenteroides
Ген декстрансвязывающего домена (ДСД) был получен благодаря ПЦР с помощью прямого и обратного праймеров (сайты рестриктаз подчеркнуты), фланкирующих генную последовательность ДСД, при этом в качестве ДНК-матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides.The dextran binding domain (DSD) gene was obtained by PCR using direct and reverse primers (restriction enzyme sites are underlined) flanking the DSD gene sequence, and the chromosomal DNA Leuconostoc mesenteroides was used as the DNA template.
Праймеры:Primers:
ПЦР проводили на приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). 25 мкл реакционной смеси содержали: 2,5 мкл Taq pol PCR buffer 10× (СибЭнзим), дНТФ в конечной концентрации 400 мкМ, 4×10-7 М каждого праймера, 1 мкл Taq pol (СибЭнзим) 5 ед. активности на реакционный объем, в качестве ДНК-матрицы использовалась хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides. На реакционную смесь наслаивали 40 мкл вазелинового масла.PCR was performed on a Tertsik device (DNA technology, Russia). 25 μl of the reaction mixture contained: 2.5 μl Taq pol PCR buffer 10 × (SibEnzyme), dNTP in a final concentration of 400 μM, 4 × 10 -7 M of each primer, 1 μl Taq pol (SibEnzyme) 5 units. activity per reaction volume, Leuconostoc mesenteroides chromosomal DNA was used as a DNA template. 40 μl of liquid paraffin was layered onto the reaction mixture.
Параметры амплификации:Amplification Parameters:
95°С - 5 мин; (94°С - 5 с, 60°С - 30 с, 72°С - 40 с)×30; 72°С - 5 мин; 10°С - хранение. Режим амплификации - точный.95 ° C for 5 minutes; (94 ° C - 5 s, 60 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s) × 30; 72 ° C for 5 minutes; 10 ° C - storage. The amplification mode is accurate.
Продукт амплификации размером 416 п.н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этанолом и ресуспендировали в буфере TrisHCl 0,05 mM, рН 7,5. Для клонирования ПЦР-продукта он встраивался в коммерческий вектор pQE6 (Quageen, USA) методом лигирования полученных рестрикционных фрагментов по сайтам рестрикции Ncol, BglII/BamHI (при лигировании по одинаковым липким концам сайты BglII и BamHI исчезают). Лигирование проводилось посредством ДНК-лигазы фага Т4 при 4°С в соответствующем буфере в течение 24 часов.Amplification product of 416 bp treated with chloroform, reprecipitated with ethanol and resuspended in TrisHCl buffer 0.05 mM, pH 7.5. To clone the PCR product, it was inserted into the commercial pQE6 vector (Quageen, USA) by ligation of the obtained restriction fragments at the Ncol, BglII / BamHI restriction sites (when ligating at the same sticky ends, the BglII and BamHI sites disappear). Ligation was carried out using T4 phage DNA ligase at 4 ° C in an appropriate buffer for 24 hours.
Лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli M15, которые затем отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками (ампициллин, канамицин). Затем плазмидная ДНК (pQEDBD) выделялась методом SDS щелочного лизиса, проверялась методом рестрикционного анализа и секвенирования на автоматическом секвенаторе.E. coli M15 cells were transformed with a ligase mixture, which were then selected on antibiotic LB agar medium (ampicillin, kanamycin). Then plasmid DNA (pQEDBD) was isolated by SDS alkaline lysis, checked by restriction analysis and sequencing on an automatic sequencer.
§1.3. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.§1.3. Obtaining the expression plasmid pQEDBDsp with the DSD gene from Leuconostoc mesenteroides with a spacer at the C-terminus.
Создание гена ДСД-(Gly-Ser)5, кодирующего белок ДСД и глицин-сериновый спейсер, необходимый для пространственного разделения различных функциональных доменов, осуществлялось в два этапа методом «праймеропосредованной прогулки», при этом происходило постепенное наращивание С-концевой спейсерной последовательности, для чего были спланированы следующие праймеры:The creation of the DSD- (Gly-Ser) 5 gene encoding the DSD protein and the glycine-serine spacer, which is necessary for the spatial separation of various functional domains, was carried out in two stages by the method of "primer-mediated walk", while the C-terminal spacer sequence gradually increased, for what the following primers were planned for:
На первом этапе «праймеропосредованной прогулки» использовались праймеры GBD11F и RevDBD-1, на втором - GBD11F и RevDBD-2, последний спланирован внахлест с RevDBD-1. Как видно, для дальнейшего клонирования ПЦР фрагмента ДСД-(Gly-Ser)5 в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA) в праймерах были спланированы сайты эндонуклеаз рестрикции NcoI и HindIII (отмечены на праймерах подчеркиванием). В качестве матрицы для проведения ПЦР использовали плазмидную ДНК pQEDBD. Реакция проводилась в автоматическом режиме на приборе Терцик (Россия) при следующих условиях:At the first stage of the “primer-mediated walk”, the GBD11F and Rev DBD -1 primers were used, at the second - GBD11F and Rev DBD -2, the latter was planned with an overlap with Rev DBD -1. As can be seen, for further cloning of the PCR fragment of DSD- (Gly-Ser) 5 into the bacterial vector pQE6 (Quageen, USA), restriction endonucleases sites NcoI and HindIII were designed in primers (underlined in primers). PQEDBD plasmid DNA was used as a template for PCR. The reaction was carried out automatically on a Tertsik device (Russia) under the following conditions:
95°С - 5 мин; (94°С - 5 с, 60°С - 30 с, 72°С - 40 с)×30; 72°С - 5 мин; 10°С - хранение. Режим амплификации - точный.95 ° C for 5 minutes; (94 ° C - 5 s, 60 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s) × 30; 72 ° C for 5 minutes; 10 ° C - storage. The amplification mode is accurate.
Далее по сайтам рестрикции NcoI и HindIII скорректированный ген ДСД, обладающий С-концевым спейсером, был интегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA), при этом была получена экспрессионная плазмида pQEDBDsp с геном ДСД со спейсером на С-конце (SEQ ID NO: 2 приложения).Further, at the restriction sites NcoI and HindIII, the adjusted DSD gene with the C-terminal spacer was integrated into the bacterial vector pQE6 (Quageen, USA), and the expression plasmid pQEDBDsp with the DSD gene with the spacer at the C-terminus was obtained (SEQ ID NO: 2 applications).
§1.4. Получение экспрессионной плазмиды pGD-10 с геном химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ§1.4. Obtaining the expression plasmid pGD-10 with the gene of the chimeric protein DSD-cn-β-GAL
Плазмидная конструкция pGD-10 (Схема 0001) с геном химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ (SEQ ID NO: 1 приложения) была собрана посредством лигирования ранее полученных экспрессионных плазмид pQEDBDsp (с геном ДСД из Lenconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце) и pQELacZTm (pR624) (с геном термостабильной бета-галактозидазы из термофильного микроорганизма Thermoanaerobacter Ethanolicus, любезно предоставлена Сергиенко О.В. ВНИИСБРАСХН) по рестрикционным сайтам BglII/BglI и BamHI/BglI соответственно.The plasmid construct pGD-10 (Scheme 0001) with the gene for the chimeric protein DSD-cn-β-GAL (SEQ ID NO: 1 applications) was assembled by ligation of the previously obtained expression plasmids pQEDBDsp (with the gene for DSD from Lenconostoc mesenteroides with a spacer at the C-terminus ) and pQELacZTm (pR624) (with the gene for thermostable beta-galactosidase from the thermophilic microorganism Thermoanaerobacter Ethanolicus, courtesy of O.V. VNIISBRAZHN Sergienko) at the restriction sites BglII / BglI and BamHI / BglI, respectively.
Трансформацию и молекулярное субклонирование в E.coli DH5a проводили по стандартным методикам [3]. Выделение плазмидной ДНК осуществляли посредством метода SDS щелочного лизиса. Доказательство введения рекомбинантных ДНК в бактерии осуществлялось косвенным путем, на основе анализа выделенных плазмид с помощью рестрикционного скрининга. Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-сп-β-ГАЛ была подтверждена секвенированием на автоматическом секвенаторе. В итоге была проклонирована и просеквенирована последовательность гена белка ДСД-сп-β-ГАЛ (фиг.2).Transformation and molecular subcloning in E. coli DH5a was carried out according to standard methods [3]. Isolation of plasmid DNA was carried out by SDS alkaline lysis. Evidence of the introduction of recombinant DNA into bacteria was carried out indirectly, based on the analysis of isolated plasmids using restriction screening. The identity of the DSD-cn-β-GAL gene cloned in the pGD-10 vector was confirmed by sequencing on an automatic sequencer. As a result, the gene sequence of the DSD-cn-β-GAL protein was cloned and sequenced (Fig. 2).
§2. Создание бактериального штамма - продуцента, обеспечивающего экспрессию белка ДСД-сп-β-ГАЛ в цитоплазме клеток Е.coli§2. Creation of a bacterial strain producer producing expression of the DSD-cn-β-GAL protein in the cytoplasm of E. coli cells
Плазмидной ДНК pGD-10 с геном (ДСД-сп-β-ГАЛ) трансформировали клетки E.coli DH5a. Выбранный по результатам секвенирования продуцент E.coli DH5a выращивали на агаризованной среде LB, содержащей антибиотики ампициллин и налидиксовую кислоту для селекции, синтез белка индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в конечной концентрации 0,3 мМ, при достижении оптической плотности OD=0,9. Время индукции составляло 4,0 часа. Клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции, термолизу, после чего дебрис осаждали центрифугированием и собирали супернатант (растворимая фракция белка).The plasmid DNA pGD-10 with the gene (DSD-cn-β-GAL) transformed E. coli DH5a cells. The producer E. coli DH5a selected by sequencing was grown on LB agar medium containing antibiotics ampicillin and nalidixic acid for selection, protein synthesis was induced by the addition of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) at a final concentration of 0.3 mM, when the optical density was reached OD = 0.9. The induction time was 4.0 hours. Cell pellets were subjected to ultrasonic disintegration, thermolysis, after which debris was precipitated by centrifugation and the supernatant (soluble protein fraction) was collected.
Уровень экспрессии целевого белка (102,3 кДа) составлял от 20 до 30% от общего клеточного белка, что показал электрофорез в 10% полиакриламидном геле относительно соответствующих контролей, в присутствии додецилсульфата натрия, также на базе термолизиса при 75°С была доказана термостабильность полученного белка.The expression level of the target protein (102.3 kDa) ranged from 20 to 30% of the total cellular protein, which showed electrophoresis in 10% polyacrylamide gel relative to the corresponding controls, in the presence of sodium dodecyl sulfate, thermostability of the obtained was also proved on the basis of thermolysis at 75 ° C. squirrel.
В итоге был получен штамм, продуцирующий химерный рекомбинантный белок ДСД-сп-β-ГАЛ, растворимость которого составила порядка 80%.As a result, a strain was obtained that produced the chimeric recombinant protein DSD-cn-β-GAL, the solubility of which was about 80%.
§3. Изучение базовых свойств белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах клеток Е.coli§3. Studying the basic properties of the DSD-cn-β-GAL protein in E. coli cell lysates
§3.1. Изучение декстрансвязывающих и ферментативных свойств белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах клеток Е.coli§3.1. The study of the dextran-binding and enzymatic properties of the DSD-cn-β-GAL protein in E. coli cell lysates
Для этих целей 3 мл культуры DH5a [pGD-10] (бета-галактозидаза с ДСД) и DH5a [pQELacZTm] (термостабильная бета-галактозидаза без ДСД (LacZTm), в качестве положительного контроля) с соответствующими контролями до индукции обрабатывались по той же методике, что и в §2. Были отобраны растворимые фракции (супернатант), которые делились на две пробирки по 1,0 мл (dex(+) - с декстраном и dex(-) - без декстрана). К растворам dex(+) добавляли по 40 мг декстрана Sephadex G50, затем растворы инкубировались в течение 20 мин при 37°С, при постоянном помешивании, что необходимо было для связывания химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ с декстраном. Инкубированные пробы центрифугировались 5 мин при 4000 об/мин, после этого супернатанты (над декстраном) переносились в чистые пробирки (супернатант dex(+)).For these purposes, 3 ml of a culture of DH5a [pGD-10] (beta-galactosidase with DSD) and DH5a [pQELacZTm] (thermostable beta-galactosidase without DSD (LacZTm), as a positive control) with appropriate controls were processed using the same procedure , as in §2. Soluble fractions (supernatant) were selected, which were divided into two 1.0 ml tubes (dex (+) with dextran and dex (-) without dextran). 40 mg of Sephadex G50 dextran was added to dex (+) solutions, then the solutions were incubated for 20 min at 37 ° C, with constant stirring, which was necessary for binding of the chimeric DSD-cn-β-GAL to dextran. Incubated samples were centrifuged for 5 min at 4000 rpm, after which the supernatants (above dextran) were transferred to clean tubes (dex (+) supernatant).
Осадки же dex(+) ресуспендировались в 1 мл рабочего буфера (рН 7,4). После этого ко всем пробам добавлялся хромогенный субстрат, имеющий бета-галактозидазную связь (Xgal), в конечной концентрации 0,05 мг/мл. Реакционные смеси инкубировались 10 мин при оптимальной для термостабильной бета-галактозидазы температуре 65°С, после чего производился учет результатов. При этом в отрицательных контролях (буфер с декстраном без лизата с белком) и в супернатанте пробы ДСД-сп-β-ГАЛ dex(+) растворы остались не окрашенными, в то время как растворы в положительных контролях (супернатант пробы pQELacZTm dex(+)) и в осадках опытной пробы dex(+) изменили свой цвет со светло-желтого до сине-зеленого, что говорило о расщеплении субстрата Xgal, т.е. о наличии бета-галактозидазной ферментативной активности, а соответственно, и наличии декстрансвязывающих свойств нашего белка (см. фиг.3; фиг.4).Precipitation dex (+) was resuspended in 1 ml of working buffer (pH 7.4). After that, a chromogenic substrate with a beta-galactosidase bond (Xgal) was added to all samples at a final concentration of 0.05 mg / ml. The reaction mixtures were incubated for 10 min at an optimum temperature of 65 ° C for thermostable beta-galactosidase, after which the results were taken into account. Moreover, in the negative controls (buffer with dextran without lysate with protein) and in the supernatant of the DSD-cn-β-GAL dex (+) sample, the solutions remained unstained, while the solutions in the positive controls (supernatant of the pQELacZTm dex (+) sample ) and in the sediments of the experimental sample, dex (+) changed their color from light yellow to blue-green, which indicated the cleavage of the Xgal substrate, i.e. about the presence of beta-galactosidase enzymatic activity, and accordingly, the presence of dextran binding properties of our protein (see figure 3; figure 4).
Таким образом, факт того, что окрашивание развивается преимущественно в осадочных опытных пробах dex(+), свидетельствует о декстрансвязывающих свойствах химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ. Данные свойства оценивались также и по характеру окрашивания осадков декстрана в образце dex(+) (осадок) и в положительном контроле dex(+) (осадок). Сине-зеленое окрашивание в образце белка ДСД-сп-β-ГАЛ локализуется преимущественно в области осадка декстрана, в то время как в положительном контроле, наоборот, осадок не прокрашен, а надосадочная жидкость приобрела сине-зеленый цвет. Это и отсутствие белка нужного мол. веса на 10% ПААГ в супернатанте dex(+), слитом после обработки лизата клеток с конструкцией pGD-10, декстраном, доказывает, что созданная рекомбинантная конструкция обладает декстрансвязывающими свойствами.Thus, the fact that staining develops predominantly in the dex (+) sedimentary test samples indicates the dextran binding properties of the chimeric protein DSD-cn-β-GAL. These properties were also evaluated by the character of staining of dextran sediments in the dex (+) sample (sediment) and in the positive control dex (+) (sediment). The blue-green staining in the DSD-cn-β-GAL protein sample is localized mainly in the region of the dextran precipitate, while in the positive control, on the contrary, the precipitate is not stained, and the supernatant acquired a blue-green color. This and the lack of protein of the desired mole. weight of 10% PAG in the dex (+) supernatant, fused after processing the cell lysate with the pGD-10 construct, dextran, proves that the created recombinant construct has dextran binding properties.
§3.2. Изучение бета-галактозидазной активности химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах клеток DH5a [pGD-10]§3.2. Study of the beta-galactosidase activity of the chimeric protein DSD-cn-β-HAL in lysates of DH5a cells [pGD-10]
Клетки с экспрессионной плазмидой pGD-10 выращивали в 4 мл среды LB до достижения оптической плотности 0,9 при λ=550, затем пробу индуцировали добавлением 4 мкл 0,3М ИПТГ, при этом время индукции составило 4 часа. Затем отбирали 500 мкл индуцированной культуры, осаждали 10 мин при 6000 об/мин и ресуспендировали в 500 мкл рабочего буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl; 10 мМ CaCl2, 10 мM MnCl2; 0,1 мМ β-Mercaptoethanol; pH 7,4. После этого пробу лизировали ультразвуком и избавлялись от клеточного дебриса центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин.Cells with the expression plasmid pGD-10 were grown in 4 ml of LB medium until the optical density was 0.9 at λ = 550, then the sample was induced by adding 4 μl of 0.3 M IPTG, while the induction time was 4 hours. Then, 500 μl of the induced culture was taken, precipitated for 10 min at 6000 rpm and resuspended in 500 μl of working buffer containing 50 mM Tris-HCl; 10 mM CaCl 2 , 10 mM MnCl 2 ; 0.1 mM β-Mercaptoethanol; pH 7.4. After this, the sample was lysed by ultrasound and disposed of by cell debris by centrifugation for 10 min at 13000 rpm.
Далее в лизатах клеток определялась собственно бета-галактозидазная активность белка ДСД-сп-β-ГАЛ по способности гидролизовать ОНФГ (орто-нитро-фенил-β-D-галактопиранозид) с образованием галактозы и окрашенного в желтый цвет соединения 2-нитрофенола.Further, in the cell lysates, the actual beta-galactosidase activity of the DSD-cn-β-HAL protein was determined by its ability to hydrolyze ONPH (ortho-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside) with the formation of galactose and the yellow-colored compound 2-nitrophenol.
Для этих целей к 0,1 мл лизата добавляли 0,7 мл рабочего буфера и 0,2 мл ОНФГ (4 мг/мл), после чего реакционную смесь инкубировали 15 мин при температуре 65°С. Останавливалась реакция добавлением раствора 1М карбоната натрия.For these purposes, 0.7 ml of working buffer and 0.2 ml of ONPH (4 mg / ml) were added to 0.1 ml of lysate, after which the reaction mixture was incubated for 15 min at a temperature of 65 ° C. The reaction was stopped by adding a solution of 1M sodium carbonate.
За единицу активности принимали количество 2-нитрофенола, образующегося за 1 мин. Концентрацию 2-нитрофенола рассчитывали спектрофотометрически при λ=420 нм. Таким образом, было рассчитано, что ферментативная активность нашего белка составила 5 ед/мкл белка при 65°С и рН 7,4.The unit of activity was taken as the amount of 2-nitrophenol formed in 1 min. The concentration of 2-nitrophenol was calculated spectrophotometrically at λ = 420 nm. Thus, it was calculated that the enzymatic activity of our protein was 5 units / μl of protein at 65 ° C and a pH of 7.4.
Далее, в приложении, приведен перечень биоинформационных последовательностей.Further, in the appendix, a list of bioinformation sequences is given.
Приложениеapplication
SEQ ID NO: 1 Нуклеотидная последовательность рекомбинантной плазмиды pGD-10 размером 5111 п.н. и аминокислотная последовательность целевого белка ДСД-сп-β-ГАЛ.SEQ ID NO: 1 The nucleotide sequence of the recombinant plasmid pGD-10 with a size of 5111 bp and the amino acid sequence of the target protein DSD-cn-β-GAL.
Список литературыBibliography
1. Suwannarangseea S., Moulisb С., Potocki-Veroneseb G., Monsanb P. / Surisa Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding, FEBS Letters, 4675-4680, - Tailand 2007.1. Suwannarangseea S., Moulisb S., Potocki-Veroneseb G., Monsanb P. / Surisa Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding, FEBS Letters, 4675-4680, - Thailand 2007.
2. Olvera С., Fernandez-Vazquez J., Ledezma-Candanoza L. / Role of the C-terminal region of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides IBT-PQ in cell anchoring, Microbiology, 3994-4002, - 2007.2. Olvera S., Fernandez-Vazquez J., Ledezma-Candanoza L. / Role of the C-terminal region of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides IBT-PQ in cell anchoring, Microbiology, 3994-4002, - 2007.
3. Маниатис Т. Молекулярное клонирование: учебник / Т.Маниатис и др. - M.: Мир, 1984. - С.450.3. Maniatis T. Molecular cloning: a textbook / T. Maniatis et al. - M .: Mir, 1984. - P. 450.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009118273/10A RU2428477C2 (en) | 2009-05-15 | 2009-05-15 | RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009118273/10A RU2428477C2 (en) | 2009-05-15 | 2009-05-15 | RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009118273A RU2009118273A (en) | 2010-11-20 |
| RU2428477C2 true RU2428477C2 (en) | 2011-09-10 |
Family
ID=44058173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009118273/10A RU2428477C2 (en) | 2009-05-15 | 2009-05-15 | RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2428477C2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520078C1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-06-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON Ag85A-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pAg85A-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD] STRAIN; Ag85A-DBD CHIMERIC PROTEIN |
| RU2520737C1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION |
| RU2546875C1 (en) * | 2013-11-20 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" Российской академии медицинских наук | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON CFP10-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pCFP10-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pCFP10-DBD] STRAIN; CFP10-DBD CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION |
| US20220002353A1 (en) * | 2018-10-29 | 2022-01-06 | Agricultural Technology Research Institute | Dextran affinity tag and use thereof |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2470072C1 (en) * | 2011-07-18 | 2012-12-20 | Фгу Государственный Институт Кровезаменителей И Медицинских Препаратов | RECOMBINANT PLASMID DNA pGD-14 CONTAINING HYBRID GENE, INCLUDING NUCLEOTIDE SEQUENCE OF DEXTRAN-BINDING DOMAIN OF BETACOCCI, JOINED WITH HUMAN INTERFERON-GAMMA GENE THROUGH ACID-LABILE SPACER, DETERMINING BIOSYNTHESIS OF CHIMERIC PROTEIN STRUCTURE |
-
2009
- 2009-05-15 RU RU2009118273/10A patent/RU2428477C2/en not_active IP Right Cessation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2520078C1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-06-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON Ag85A-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pAg85A-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD] STRAIN; Ag85A-DBD CHIMERIC PROTEIN |
| RU2520737C1 (en) * | 2013-04-25 | 2014-06-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | METHOD OF PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON FUSION PROTEIN pESAT6-DBD AND DEXTRAN, RECOMBINANT PLASMID pESAT6-DBD, STRAIN OF Escherichia coli, CHIMERIC PROTEIN ESAT6-DBD AND THEIR APPLICATION |
| RU2546875C1 (en) * | 2013-11-20 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" Российской академии медицинских наук | METHOD FOR OBTAINING IMMUNOGENIC COMPOSITION BASED ON CFP10-DBD HYBRID PROTEIN AND DEXTRANE; pCFP10-DBD RECOMBINANT PLASMIDE; Escherichia coli [pREP4, pCFP10-DBD] STRAIN; CFP10-DBD CHIMERIC PROTEIN AND THEIR APPLICATION |
| US20220002353A1 (en) * | 2018-10-29 | 2022-01-06 | Agricultural Technology Research Institute | Dextran affinity tag and use thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009118273A (en) | 2010-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7061078B2 (en) | Thermostable reverse transcriptase mutant | |
| DK166784B1 (en) | RECOMBINANT DNA SEQUENCE, A MICROORGANISM CONTAINING THE SEQUENCE AND A PROCEDURE FOR PREPARING AN EUCARYOT PROTEIN | |
| FI109810B (en) | Method for enzymatic cleavage of recombinant proteins using IgA proteins | |
| Garinot-Schneider et al. | Identification of putative active-site residues in the DNase domain of colicin E9 by random mutagenesis | |
| Mierendorf et al. | Expression and purification of recombinant proteins using the pET system | |
| JP2012531198A (en) | Bacterial expression of artificial genes for production of CRM197 and its derivatives | |
| RU2428477C2 (en) | RECOMBINANT PROTEIN CONSTRUCT DSD-sp-β-GAL EXHIBITING ENZYMATIC ACTIVITY OF THERMOSTABLE β-GALACTOSIDASE (LACTASE) AND AFFINE CONNECTABLE WITH DEXTRANE, PLASMID DNA pGD-10 DETERMINING DSD-sp-β-GAL BIOSYNTHESIS, AND Escherichia coli DH5α/PGD-10 PRODUCER STRAIN | |
| JP2000508538A (en) | Biologically active fragments of Bacillus stearothermophilus DNA polymerase | |
| Engel et al. | Murein-metabolizing enzymes from Escherichia coli: existence of a second lytic transglycosylase | |
| JP4486009B2 (en) | DNA ligase mutant | |
| JPH03501925A (en) | synthetic gene | |
| EP1173592B1 (en) | Microbial protein expression system | |
| KR100888513B1 (en) | Novel N-Acetylglucosamine-2-Epimerase and Method for Producing CMP-neuraminic acid Using the Same | |
| RU2388826C2 (en) | RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd | |
| KR20130096111A (en) | Expression vector comprising gene coding for e. coli phosphoglycerate kinase as a novel fusion partner | |
| JP4546089B2 (en) | Fusion protein | |
| EP1981978B1 (en) | Affinity polypeptide for purification of recombinant proteins | |
| KR20130141001A (en) | A novel vector system for isolation and purification of target proteins | |
| US9580488B2 (en) | Fusion tags and expression vector system for the expression of human parathyroid hormone (rhPTH) | |
| MX2011007492A (en) | Fusion proteins the process to preparation and utilization in expression systems of recombinant proteins. | |
| WO2007046556A1 (en) | Novel dna polymerase | |
| TWI712691B (en) | Dextran affinity tag and application thereof | |
| RU2265055C2 (en) | Recombinant plasmid expressing module polypeptide for delivery of photosensitizer and strain escherichia coli vkpm b-8356 - producer of module polypeptide | |
| CN112689674B (en) | Dextran affinity tag and application thereof | |
| RU2355769C1 (en) | METHOD OF PRODUCING FUNCTIONALLY ACTIVE RECOMBINANT PROTEIN OF LETHAL FACTOR ANTHRAX (LF), RECOMBINANT PLASMID DNA pETGST-LFmin, ENCODING ACTIVE LF PROTEIN AND STRAIN OF Escherichia coli BL-GSTLFmin, PRODUCING ACTIVE PROTEIN OF LETHAL FACTOR ANTHRAX |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120516 |