RU2388826C2 - RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd - Google Patents
RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd Download PDFInfo
- Publication number
- RU2388826C2 RU2388826C2 RU2006123901/13A RU2006123901A RU2388826C2 RU 2388826 C2 RU2388826 C2 RU 2388826C2 RU 2006123901/13 A RU2006123901/13 A RU 2006123901/13A RU 2006123901 A RU2006123901 A RU 2006123901A RU 2388826 C2 RU2388826 C2 RU 2388826C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cbd
- brdgl7aca
- recombinant
- psvh0108
- acylase
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в микробиологической промышленности при получении полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков нового поколения. Предлагаются:The present invention relates to the field of biotechnology, in particular to genetic engineering, and can be used in the microbiological industry in the production of a new generation of semi-synthetic cephalosporin antibiotics. It is offered:
- рекомбинантная ДНК, кодирующая функционально активный гибридный белок BrdGl7ACA-cbd, который состоит из ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспориновой кислоты штамма Brevundimonas diminuta ВКМ B-1297 и хитин-связывающего домена хитиназы А1 Bacillus circulans;- recombinant DNA encoding a functionally active BrdGl7ACA-cbd fusion protein, which consists of acylase of glutaryl-7-aminocephalosporic acid of strain Brevundimonas diminuta VKM B-1297 and the chitin-binding domain of chitinase A1 Bacillus circulans;
- рекомбинантная плазмида pSVH0108, содержащая фрагмент ДНК, который кодирует полную аминокислотную последовательность BrdGl7ACA-cbd, и обеспечивающая высокий уровень экспрессии названного гибридного белка в клетках Escherichia coli;- a recombinant plasmid pSVH0108 containing a DNA fragment that encodes the complete amino acid sequence of BrdGl7ACA-cbd, and providing a high level of expression of the aforementioned hybrid protein in Escherichia coli cells;
- рекомбинантный штамм E.coli BL21(DE3)/pSVH0108 - продуцент гибридного белка BrdGl7ACA-cbd.- recombinant E. coli strain BL21 (DE3) / pSVH0108 - producer of the BrdGl7ACA-cbd fusion protein.
Уровень техникиState of the art
Gl7ACA-ацилазы [1] относятся к обширному семейству пенициллин-амидаз (EC 3.5.1.11), способных превращать пенициллины и цефалоспорины в ценные промежуточные соединения, используемые при производстве полусинтетических бета-лактамных антибиотиков нового поколения [2, 3].Gl7ACA acylases [1] belong to the extensive family of penicillin amidases (EC 3.5.1.11), capable of converting penicillins and cephalosporins into valuable intermediates used in the production of new generation semi-synthetic beta-lactam antibiotics [2, 3].
В связи с потребностью в наращивании объема производства этой широко применяемой ныне группы антибиотиков [4-6] усовершенствование известных методов получения необходимых для их синтеза ферментов, в том числе с помощью технологий рекомбинантных ДНК, представляет несомненный практический интерес.In connection with the need to increase the production volume of this widely used group of antibiotics [4-6], the improvement of known methods for producing the enzymes necessary for their synthesis, including using recombinant DNA technologies, is of undoubted practical interest.
К настоящему времени известны первичные структуры генов бактериальных Gl7ACA-ацилаз из различных штаммов Pseudomonas; описаны рекомбинантные плазмидные ДНК, обеспечивающие синтез этих ферментов в клетках E.coli и Bacillus subtilis, а также способы получения рекомбинантных форм ферментов с их использованием [1, 7-12].To date, the primary gene structures of bacterial Gl7ACA acylases from various strains of Pseudomonas are known; Recombinant plasmid DNAs are described that provide the synthesis of these enzymes in E. coli and Bacillus subtilis cells, as well as methods for producing recombinant forms of enzymes using them [1, 7-12].
Общими недостатками известных методов гетерологичной экспрессии Gl7ACA-ацилаз являются невысокий уровень синтеза рекомбинантного продукта [7], сложности процессов масштабирования ферментации штаммов [8-10] и освобождения полученных препаратов Gl7ACA-ацилаз от примесей, в частности от неспецифических бета-лактамаз [5].Common disadvantages of the known methods of heterologous expression of Gl7ACA acylases are the low level of synthesis of the recombinant product [7], the complexity of the processes for scaling the fermentation of strains [8-10] and the release of the obtained Gl7ACA acylases from impurities, in particular from non-specific beta-lactamases [5].
Устранение указанных недостатков может быть достигнуто на пути разработки новых систем экспрессии Gl7ACA-ацилазы, обеспечивающих повышение выхода активного фермента и упрощение методов его очистки. Поскольку одним из наиболее эффективных способов очистки белка является аффинная хроматография [13], в последние годы получили широкое распространение системы экспрессии для получения рекомбинантных белковых продуктов в форме гибридных белков, содержащих вспомогательный полипептид, специфически связывающийся с соединением, которое применяется в качестве лиганда при последующей очистке белка аффинной хроматографией. Получение гибридных белков, хотя и является достаточно простым и эффективным методом, сопряжено с некоторыми сложностями, одной из которых является возможность частичной или полной утраты активности вследствие модификации структуры молекулы белка после связывания его с вспомогательным полипептидом. В подобных ситуациях может быть предусмотрено последующее расщепление гибридного белка (дополнительная стадия) на составляющие под действием химических или энзиматических агентов, однако введение процедуры расщепления экспрессированного гибридного белка требует проведения последующей дополнительной очистки.The elimination of these disadvantages can be achieved by developing new systems for the expression of Gl7ACA acylase, which increase the yield of the active enzyme and simplify its purification methods. Since one of the most effective methods of protein purification is affinity chromatography [13], in recent years, an expression system has been widely used to obtain recombinant protein products in the form of hybrid proteins containing an auxiliary polypeptide that specifically binds to a compound that is used as a ligand for subsequent purification protein affinity chromatography. Obtaining hybrid proteins, although it is a fairly simple and effective method, is fraught with some difficulties, one of which is the possibility of partial or complete loss of activity due to modification of the structure of the protein molecule after binding to an auxiliary polypeptide. In such situations, subsequent cleavage of the fusion protein (additional step) into constituents by chemical or enzymatic agents may be provided, however, the introduction of a cleavage procedure for the expressed fusion protein requires subsequent further purification.
С учетом указанной особенности получения ферментов в виде гибридных белков принципиальным моментом является поиск комбинации целевого и вспомогательного белка, в которой присутствие дополнительного компонента в препарате фермента не будет негативно сказываться на свойствах целевого продукта, а объединение предназначенного для очистки полипептида с интересующим белком, в свою очередь, не приведет к уменьшению его специфической связывающей активности. Конструирование гибридного белка с такими свойствами упрощает очистку целевого продукта и при этом гарантирует полное сохранение его активности в составе слитого белка. При удачном выборе дополнительного компонента рекомбинантные ферменты в гибридной конструкции оказываются полностью подготовленными к использованию в качестве иммобилизованного препарата, если это предусмотрено технологическим процессом.Taking into account the indicated feature of obtaining enzymes in the form of hybrid proteins, the crucial point is the search for a combination of the target and auxiliary protein, in which the presence of an additional component in the enzyme preparation will not adversely affect the properties of the target product, and the combination of the protein intended for purification with the protein of interest, , will not lead to a decrease in its specific binding activity. The construction of a hybrid protein with such properties simplifies the purification of the target product and at the same time guarantees the complete preservation of its activity in the composition of the fusion protein. With the successful selection of an additional component, the recombinant enzymes in the hybrid design are fully prepared for use as an immobilized preparation, if this is provided for by the technological process.
Что касается Gl7ACA-ацилазы, то попытки осуществить ее экспрессию в форме слитого белка по существу ограничиваются получением производного, несущего 6 дополнительных N-концевых гистидиновых остатков [14], которые традиционно используются для последующей хроматографической очистки многих рекомбинантных белков. Однако сорбенты для His-tag форм, как правило, являются достаточно дорогостоящими и мало пригодными для последующего прямого использования в составе биокатализаторов, что существенно ограничивает область их практического применения.As for Gl7ACA acylase, attempts to express it in the form of a fusion protein are essentially limited to obtaining a derivative carrying 6 additional N-terminal histidine residues [14], which are traditionally used for subsequent chromatographic purification of many recombinant proteins. However, sorbents for His-tag forms, as a rule, are quite expensive and not very suitable for subsequent direct use in biocatalysts, which significantly limits the scope of their practical application.
В настоящем изобретении была поставлена задача экспрессии гибридного белка, включающего Gl7ACA-ацилазу, в котором бы полностью сохранялась функциональная активность обеих его составляющих, а его иммобилизованная форма при этом могла бы непосредственно применяться в процессе биотрансформации, а также разработки векторов и систем, необходимых для его получения.The present invention was tasked with the expression of a hybrid protein, including Gl7ACA acylase, which would fully preserve the functional activity of both its components, and its immobilized form could be directly used in the process of biotransformation, as well as the development of vectors and systems necessary for its receipt.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Решение задачи получения любого функционально-активного гибридного белка включает следующие этапы:The solution to the problem of obtaining any functionally active hybrid protein includes the following steps:
а) дизайн конструкции гена гибридного белка, предполагающий оптимальную с точки зрения сохранения функциональной активности комбинацию целевого и вспомогательного белка; б) получение и объединение с помощью методов рекомбинантных ДНК нуклеотидных последовательностей, кодирующих компоненты гибридного белка; в) выбор клеток-хозяев и создание векторных конструкций для экспрессии гибридного белка в избранной гетерологичной системе; г) оптимизацию условий продукции и очистки гибридного белка.a) the design design of the gene of the hybrid protein, suggesting an optimal combination of the target and auxiliary protein from the point of view of preserving the functional activity; b) obtaining and combining, using recombinant DNA methods, nucleotide sequences encoding components of a fusion protein; c) selection of host cells and creation of vector constructs for expression of the hybrid protein in a selected heterologous system; d) optimization of production conditions and purification of the hybrid protein.
Поставленная цель получить функционально-активный гибридный белок на основе Gl7ACA-ацилазы, пригодный для последующего применения в качестве иммобилизованного препарата, достигнута за счет того, чтоThe goal is to obtain a functional-active hybrid protein based on Gl7ACA acylase, suitable for subsequent use as an immobilized preparation, achieved due to the fact that
1) предложена рекомбинантная ДНК, кодирующая гибридный белок BrdGl7ACA-cbd, в котором в С-концевую область последовательности альфа-субъединицы ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспориновой кислоты штамма Brevundimonas diminuta ВКМ B-1297 встроен хитин-связывающий домен хитиназы А1 Bacillus circulans;1) a recombinant DNA coding for the BrdGl7ACA-cbd fusion protein has been proposed, in which a chitin-binding domain of chitinus circans A1 chitinase B1 is inserted into the C-terminal region of the alpha subunit of the acylase of the glutaryl-7-aminocephalosporic acid of Brevundimonas diminuta VKM B-1297 strain;
2) сконструирована рекомбинантная плазмида pSVH0108, содержащая рекомбинантную последовательность ДНК, которая кодирует гибридный белок BrdGl7ACA-cbd, и обеспечивающая его синтез в клетках кишечной палочки с высоким выходом;2) a recombinant plasmid pSVH0108 was constructed containing a recombinant DNA sequence that encodes a BrdGl7ACA-cbd fusion protein and ensures its synthesis in E. coli cells in high yield;
3) в результате трансформации экспрессирующей плазмидой pSVH0108 клеток штамма E.coli BL21(DE3) получен рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108, характеризующийся высоким уровнем индуцируемого синтеза и стабильной продукцией гибридного белка BrdGl7ACA-cbd, в котором активность сохраняют оба входящих в его состав белковых домена.3) as a result of transformation of cells of the E. coli strain BL21 (DE3) by expressing plasmid pSVH0108, a recombinant strain Escherichia coli BL21 (DE3) / pSVH0108 was obtained, characterized by a high level of inducible synthesis and stable production of the BrdGl7ACA-cbd fusion protein, in which both of its constituents retain activity its composition of the protein domain.
Выбор хитин-связывающего домена хитиназы А1 Bacillus circulans (CBD) в качестве вспомогательного полипептида был обусловлен тем, что хитин (хитиновый носитель), с которым он взаимодействует, имеет природное происхождение, является более дешевым по сравнению со многими другими носителями для аффинной хроматографии, а связь, которую образует включающий СВD гибридный белок с носителем, отличается физической и химической стабильностью, что позволяет использовать его многократно.The choice of the chitin-binding domain of chitinase A1 Bacillus circulans (CBD) as an auxiliary polypeptide was due to the fact that the chitin (chitin carrier) with which it interacts has a natural origin, is cheaper compared to many other affinity chromatography carriers, and the bond formed by the CBD fusion protein with the carrier is distinguished by physical and chemical stability, which allows it to be used repeatedly.
Кроме того, в известных случаях использования хитин-связывающих доменов в комбинации с активными белками они, как правило, не оказывали неблагоприятного воздействия на функцию активной составляющей.In addition, in known cases of using chitin-binding domains in combination with active proteins, they, as a rule, did not adversely affect the function of the active component.
Gl7ACA-ацилазы представляют собой гетеротетрамеры, состоящие из 2-х α и 2-х β субъединиц [15], которые формируются из одноцепочечного полипептидного предшественника. Полная кодирующая последовательность гена BrdGl7ACA-ацилазы (SEQ ID №5) получена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК, выделенной из штамма Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297, а в качестве праймеров - синтетических олигонуклеотидов с нуклеотидными последовательностями SEQ ID №1 (праймер 7_ACA_F) и SEQ ID№2 (праймер 7_ACA_R). Данная последовательность была введена в вектор рАСТ7 (фиг.1), производный от векторов рЕТ21d и pАCYC177 (см. пример 2), с получением рекомбинантной плазмиды pSVH1811 (см. пример 3).Gl7ACA acylases are heterotetramers consisting of 2 α and 2 β subunits [15], which are formed from a single chain polypeptide precursor. The complete coding sequence of the BrdGl7ACA acylase gene (SEQ ID No. 5) was obtained by polymerase chain reaction (PCR) using chromosomal DNA isolated from the Brevundimonas diminuta strain VKM B-1297 as a primer and synthetic oligonucleotides with nucleotide sequences as primers ID No. 1 (primer 7_ACA_F) and SEQ ID No. 2 (primer 7_ACA_R). This sequence was introduced into the vector pAST7 (Fig. 1), derived from the vectors pET21d and pACYC177 (see Example 2), to obtain the recombinant plasmid pSVH1811 (see Example 3).
Нуклеотидную последовательность, кодирующую хитин-связывающий домен хитиназы А1 Bacillus circulans (SEQ ID №15), получали из коммерческой плазмиды pTYB4 (New England Biolabs.)The nucleotide sequence encoding the chitin-binding domain of Bacillus circulans chitinase A1 (SEQ ID NO: 15) was obtained from the commercial plasmid pTYB4 (New England Biolabs.)
Положение CBD в структуре гибридного белка было определено на основании данных о пространственной структуре Gl7ACA-ацилазы Brevundimoinas diminuta, комплексов этого фермента с субстратом и продуктом реакции и свойствах двухсубъединичных периплазматических ферментов, подвергающихся автокаталитическому процессингу [9, 15, 16].The position of CBD in the structure of the hybrid protein was determined based on the spatial structure of the Brevundimoinas diminuta Gl7ACA acylase, the complexes of this enzyme with the substrate and reaction product, and the properties of two subunit periplasmic enzymes that undergo autocatalytic processing [9, 15, 16].
Проведенный дизайн модификаций концевых участков полипептидной цепи субъединиц показал, что предпочтительным участком для связывания CBD является С-концевая область альфа- субъединицы Gl7ACA-ацилазы, поскольку она находится на достаточно удаленном расстоянии от активного центра фермента и не принимает участия в катализе. Хотя в настоящее время нет однозначного представления о механизме удаления спейсерного пептида [15, 17], есть основания полагать, что для правильного расщепления альфа-субъединицы и спейсерного пептида важна сохранность С-концевых аминокислот альфа-субъединицы, поэтому с целью снижения вероятности отщепления СBD вместе со спейсерным участком представлялось целесообразным включить последовательность хитин-связывающего домена так, чтобы после него оставалось несколько аминокислот С-конца альфа-субъединицы. Соответственно, положение CBD в структуре гибридного белка было определено между аминокислотами R184 и T185, что предполагало встраивание последовательности, кодирующей хитин-связывающий домен, между нуклеотидами 551 и 554 гена BrdGl7ACA-ацилазы (SEQ ID №5).The design of modifications of the terminal sections of the polypeptide chain of the subunits showed that the C-terminal region of the alpha-subunit of Gl7ACA acylase is the preferred site for CBD binding, since it is at a fairly remote distance from the active center of the enzyme and does not participate in catalysis. Although at present there is no unambiguous idea about the mechanism of removal of the spacer peptide [15, 17], there is reason to believe that the conservation of the C-terminal amino acids of the alpha subunit is important for the proper cleavage of the alpha subunit and the spacer peptide, therefore, to reduce the likelihood of cleavage of CBD together with the spacer region, it seemed appropriate to include the sequence of the chitin-binding domain so that several amino acids of the C-terminus of the alpha subunit remained after it. Accordingly, the position of CBD in the structure of the hybrid protein was determined between amino acids R184 and T185, which suggested the insertion of a sequence encoding a chitin-binding domain between nucleotides 551 and 554 of the BrdGl7ACA acylase gene (SEQ ID No. 5).
Объединение последовательности, кодирующей CBD (SEQ ID №15), с последовательностью гена ацилазы было проведено в составе вектора, в который предварительно был включен ген BrdGl7ACA-ацилазы.The combination of the CBD coding sequence (SEQ ID No. 15) with the acylase gene sequence was carried out as part of a vector into which the BrdGl7ACA acylase gene was previously included.
Для создания вектора экспрессии, направляющего в клетках E.coli синтез гибридного белка, на основе плазмиды pSVH1811 был сконструирован промежуточный вектор pSVH0107, полученный путем введения в нее дополнительного сайта рестрикции Vne1 в положении 551-554 SEQ ID №5. Этот сайт был затем использован для встраивания в указанное положение гена кодирующей последовательности хитин-связывающего домена (сbd). Полученная при этом экспрессирующая рекомбинантная плазмида, обеспечивающая синтез гибридного белка BrdGl7ACA-cbd, была обозначена как pSVH0108 (фиг.2).To create an expression vector directing the synthesis of the hybrid protein in E. coli cells, the intermediate vector pSVH0107 was constructed on the basis of plasmid pSVH1811, obtained by introducing an additional Vne1 restriction site into it at position 551-554 of SEQ ID No. 5. This site was then used to insert into the indicated position of the gene the coding sequence of the chitin-binding domain (cbd). The resulting recombinant expression plasmid synthesizing the BrdGl7ACA-cbd fusion protein was designated pSVH0108 (FIG. 2).
Сравнение аминокислотных последовательностей BrdGl7ACA-cbd, BrdGl7ACA-Vne с последовательностью BrdGl7ACA-ацилазы приведено на фиг.3.A comparison of the amino acid sequences of BrdGl7ACA-cbd, BrdGl7ACA-Vne with the sequence of BrdGl7ACA-acylase is shown in Fig.3.
Путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL21(DE3) [21] сконструированной плазмидой pSVH0108, отбора и культивирования клонов трансформантов с высоким уровнем синтеза функционально-активного гибридного белка получен рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21(DE3)/ pSVH0108 - продуцент гибридного белка, состоящего из BrdGl7ACA-ацилазы, содержащей в С-концевой области последовательности альфа-субъединицы хитин-связывающий домен хитиназы А1 Bacillus circulans. Синтез BrdGl7ACA-cbd в полученном рекомбинантном штамме осуществляется при культивировании на обычных селективных средах с добавлением индуктора изопропил-D-тиогалактозида (ИПТГ) или лактозы.By transforming cells of the Escherichia coli strain BL21 (DE3) [21] with the constructed plasmid pSVH0108, selecting and culturing transformant clones with a high level of synthesis of a functionally active hybrid protein, a recombinant strain Escherichia coli BL21 (DE3) / pSVH0108, a producer of the hybrid protein consisting of AC7 Brd, was obtained -acylase containing in the C-terminal region of the alpha subunit sequence the chitin-binding domain of A1 chitinase Bacillus circulans. The synthesis of BrdGl7ACA-cbd in the resulting recombinant strain is carried out by cultivation on conventional selective media with the addition of an isopropyl-D-thiogalactoside inducer (IPTG) or lactose.
Таким образом, настоящее изобретение включает три объекта:Thus, the present invention includes three objects:
Первый объект - рекомбинантная ДНК, которая кодирует гибридный белок BrdGl7ACA-cbd, состоящий из аминокислотной последовательности ацилазы глутарил-7- аминоцефалоспориновой кислоты штамма Brevundimonas diminuta ВКМ B-1297 и хитин-связывающего домена хитиназы А1 Bacillus circulans, и характеризуется нуклеотидной последовательностью SEQ ID №16.The first object is recombinant DNA, which encodes a BrdGl7ACA-cbd fusion protein, consisting of the amino acid sequence of the glutaryl-7-aminocephalosporin acid acylase of Brevundimonas diminuta VKM B-1297 strain and the chitin-binding domain of Bacillus circulans chitinase A1, and is characterized by the nucleotide Q16 sequence N16 .
Второй объект - рекомбинантная плазмида pSVH0108, обеспечивающая синтез гибридного белка BrdGl7ACA-cbd в клетках Escherichia coli, которая образована вектором рАСТ7, состоящим из фрагмента модифицированной в области полилинкера плазмиды рЕТ21d, содержащего промотор и терминатор РНК-полимеразы фага Т7, разделенные участком полилинкера, и фрагмента плазмиды рACYC177, содержащего репликон р15А и ген устойчивости к канамицину, и последовательностью рекомбинантной ДНК по п.1, встроенной в полилинкерную область указанного вектора.The second object is the recombinant plasmid pSVH0108, which provides the synthesis of the BrdGl7ACA-cbd fusion protein in Escherichia coli cells, which is formed by the pACT7 vector, consisting of a fragment of the plasmid pET21d modified in the polylinker region, containing the promoter and terminator of the T7 fragment of RNA polymerase fragmented plasmids pACYC177 containing the replicon p15A and the kanamycin resistance gene, and the recombinant DNA sequence according to
Третий объект - рекомбинантный штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pSVH0108 - продуцент гибридного белка BrdGl7ACA-cbd.The third object is the recombinant strain Escherichia coli BL21 (DE3) / pSVH0108 - producer of the hybrid protein BrdGl7ACA-cbd.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Фиг.1 - физическая и генетическая карты вектора pACT7. Обозначены положения индикаторных сайтов рестрикции, участки промотора и терминатора РНК-полимеразы фага Т7 (Т7 пром и Т7 терм), область начала репликации (p15Aori), ген устойчивости к канамицину (обозначен KN(R), заполнение черным).Figure 1 - physical and genetic map of the vector pACT7. The positions of the indicator restriction sites, the regions of the promoter and terminator of the T7 phage RNA polymerase (T7 prom and T7 term), the region of the onset of replication (p15Aori), the kanamycin resistance gene (designated KN (R), filled with black) are indicated.
Фиг.2 - физическая и генетическая карты плазмиды pSVH0108. Обозначено положение гена BrdGl7ACA (заполнение серым), положение хитин, связывающего домена (заполнение штрихом), остальные обозначения - как на Фиг.1.Figure 2 - physical and genetic map of the plasmid pSVH0108. The position of the BrdGl7ACA gene (gray filling), the position of the chitin binding domain (filling with a dash) are indicated, the remaining designations are as in FIG.
Фиг.3 - сравнение аминокислотных последовательностей BrdGl7ACA-cbd, BrdGl7ACA-Vne с последовательностью BrdGl7ACA-ацилазы. Черным выделены последовательности, соответствующие С-концу альфа-субъединицы, подчеркнуты последовательности спейсерного пептида, курсив - CBD-домен, в рамке - rjlbhe.ofz последовательности N-конца бета-субъединицы.Figure 3 - comparison of the amino acid sequences of BrdGl7ACA-cbd, BrdGl7ACA-Vne with the sequence of BrdGl7ACA-acylase. Sequences corresponding to the C-terminus of the alpha subunit are highlighted in black, the sequences of the spacer peptide are underlined, italics are the CBD domain, in the frame are rjlbhe.ofz sequences of the N-terminus of the beta subunit.
Фиг.4 - электрофореграмма разделения в 12% ДСН-ПААГ фракций, полученных при очистке рекомбинантного белка BrdGl7ACA-cbd. Дорожки: 1 - маркер мол. веса, 2 - фракция после промывки колонки с хитининовыми гранулами после иммобилизации белка BrdGl7ACA-cbd, линия 3 - очищенный препарат BrdGl7ACA-cbd.Figure 4 is an electrophoregram of separation in 12% SDS-PAGE fractions obtained by purification of the recombinant BrdGl7ACA-cbd protein. Tracks: 1 - marker mol. weight, 2 - fraction after washing the column with chitinin granules after immobilization of BrdGl7ACA-cbd protein, line 3 - purified preparation of BrdGl7ACA-cbd.
Осуществление изобретенияThe implementation of the invention
При осуществлении изобретения помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, использовали хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [19, 20].When carrying out the invention, in addition to the methods described in detail in the following examples, the methods well-known to those skilled in the art described in the manuals of molecular biology and genetic engineering were used [19, 20].
Пример 1. Выделение гена Gl7ACA-ацилазыExample 1. Isolation of the Gl7ACA Acylase Gene
Первичные структуры генов Gl7ACA-ацилаз, выделенных из различных штаммов Pseudomonas и Brevundimonas известны (см. номера доступа в GenBank AAC34685, AAN39264, AAP68796). Эти последовательности отличаются высокой степенью консервативности, что значительно упрощает задачу выделения гена Gl7ACA-ацилазы методом ПЦР-амплификации.The primary structures of the Gl7ACA acylase genes isolated from various strains of Pseudomonas and Brevundimonas are known (see access numbers in GenBank AAC34685, AAN39264, AAP68796). These sequences are characterized by a high degree of conservatism, which greatly simplifies the task of isolating the Gl7ACA acylase gene by PCR amplification.
В качестве матрицы для получения гена Gl7ACA-ацилазы используют хромосомную ДНК штамма Brevundiminas diminuta ВКМ B-1297, а в качестве праймеров - олигонуклеотиды 7ACA_F (SEQ ID №1) и 7ACA_R (SEQ ID №2), специфичные к консервативным участкам, фланкирующим полные кодирующие последовательности известных генов Gl7ACA-ацилаз.The chromosomal DNA of the strain Brevundiminas diminuta VKM B-1297 is used as a matrix for the generation of the Gl7ACA acylase gene, and the oligonucleotides 7ACA_F (SEQ ID No. 1) and 7ACA_R (SEQ ID No. 2) specific for conserved regions flanking the full code are used as primers sequences of known Gl7ACA acylase genes.
1 мкг геномной ДНК Brevundiminas diminuta ВКМ B-1297, выделенной традиционными методами, денатурируют путем нагревания при 100° в течение 5 минут, помещают в лед и подвергают 30 циклам ПЦР с использованием набора Expand Long Template PCR system («Roche Diagnostics GmbH”, Mannheim, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя.1 μg of Brevundiminas diminuta genomic DNA VKM B-1297 isolated by conventional methods was denatured by heating at 100 ° C for 5 minutes, placed in ice and subjected to 30 PCR cycles using the Expand Long Template PCR system kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim , Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.
Смесь для ПЦР (50 мкл):Mix for PCR (50 μl):
5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера («Roche Diagnostics GmbH”);5 μl of 10-fold PCR buffer (Roche Diagnostics GmbH);
5 мкл геномной ДНК (200 нг/мкл);5 μl of genomic DNA (200 ng / μl);
5 мкл 3 мкМ праймера 7ACA_F;5 μl of 3 μM primer 7ACA_F;
5 мкл 3 мкМ праймера 7ACA_R;5 μl of 3 μM primer 7ACA_R;
5 мкл 2,5 мМ dNTP каждого вида;5 μl of 2.5 mm dNTP of each type;
25 мкл деионизованной воды;25 μl of deionized water;
1 мкл ДНК полимеразы («Roche Diagnostics GmbH”).1 μl of DNA polymerase (Roche Diagnostics GmbH).
Условия проведения ПЦР: 94°, 5' (денатурация), 94°, 30''; 50°, 30''; 72°,2' (амплификация).Conditions for PCR: 94 °, 5 '(denaturation), 94 °, 30' '; 50 °, 30``; 72 °, 2 '(amplification).
После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализируют электрофорезом в 1% агарозном геле и выявляют гомогенный фрагмент размером около 2,2 тпн. Фрагмент выделяют из геля с помощью набора Wizard PCR Preps Kit (Promega, США) в соответствии с инструкцией производителя и подвергают автоматическому секвенированию на приборе ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с использованием праймеров BRD1 (SEQ ID №3), BRD2 (SEQ ID №4), 7ACA_F, 7ACA_R.After amplification, 5 μl of PCR mixture was analyzed by electrophoresis in a 1% agarose gel and a homogeneous fragment of about 2.2 kb was detected. The fragment was isolated from the gel using the Wizard PCR Preps Kit (Promega, USA) in accordance with the manufacturer's instructions and subjected to automatic sequencing on an ABIPrizm 3100 DNA Sequencer using primers BRD1 (SEQ ID No. 3), BRD2 (SEQ ID No. 4), 7ACA_F, 7ACA_R.
Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с базой данных GenBank с помощью программы BLAST показало, что она обладает высокой степенью гомологии с соответствующими кодирующими последовательностями других бактериальных Gl7ACА-ацилаз. На этом основании был сделан вывод о том, что полученный фрагмент соответствует гену Gl7ACA-ацилазы штамма Brevundimonas diminuta ВКМ B-1297. Установленная нуклеотидная последовательность гена BrdGl7ACA-ацилазы приведена в перечне под номером SEQ ID №5.Comparison of the obtained nucleotide sequence with the GenBank database using the BLAST program showed that it has a high degree of homology with the corresponding coding sequences of other bacterial Gl7ACA acylases. Based on this, it was concluded that the obtained fragment corresponds to the Gl7ACA acylase gene of the Brevundimonas diminuta VKM B-1297 strain. The determined nucleotide sequence of the BrdGl7ACA acylase gene is listed under SEQ ID No. 5.
Пример 2. Конструирование вектора-носителя pACT7Example 2. Construction of a vector carrier pACT7
Векторы на основе промотора фага Т7 обеспечивают высокую экспрессию гетерологичных генов в штаммах E.coli, синтезирующих T7 полимеразу, и коммерчески доступны [21]. В то же время препараты Gl7ACA-ацилаз, используемые для биотрансформации цефалоспориновых антибиотиков, не должны содержать примесей бета-лактамаз, гены которых представлены в большинстве коммерческих векторных конструкций этого типа. Поэтому для экспрессии BrdGl7ACA-ацилазы и других ферментов биотрансформации антибиотиков, свободных от примесей бета-лактамаз, целесообразно использовать векторы, несущие маркеры плазмидной устойчивости, отличные от AmpR. Такие векторы к тому же обладают более высокой сегрегационной стабильностью [21], которая может быть дополнительно повышена за счет использования репликона p15A вместо репликона ColE1 [22].Vectors based on the T7 phage promoter provide high expression of heterologous genes in E. coli strains synthesizing T7 polymerase and are commercially available [21]. At the same time, Gl7ACA-acylase preparations used for biotransformation of cephalosporin antibiotics should not contain beta-lactamase impurities, the genes of which are present in most commercial vector constructs of this type. Therefore, for the expression of BrdGl7ACA acylase and other biotransformation enzymes of antibiotics free of beta-lactamase impurities, it is advisable to use vectors carrying plasmid resistance markers other than AmpR. Moreover, such vectors have higher segregation stability [21], which can be further enhanced by using the p15A replicon instead of the ColE1 replicon [22].
Конструирование вектора pACT7, удовлетворяющего указанным условиям, проводили в несколько стадий.The construction of the pACT7 vector satisfying these conditions was carried out in several stages.
А) Конструирование промежуточной плазмиды pET21dRI.A) Construction of the intermediate plasmid pET21dRI.
C использованием метода «инвертированной ПЦР» и праймеров pETR1_F (SEQ ID №7) и pETR1_R (SEQ ID №8) на матрице пламиды pET21d [21] с использованием набора Expand Long Template PCR system получают уникальный ПЦР фрагмент размером 5,4 тпн, который выделяют из агарозного геля, как описано в примере 1. 100 нг полученного фрагмента гидролизуют 5 единицами рестриктазы EcoRI (Fermentas) и лигируют с помощью Т4 ДНК лигазы. Полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIqZ□M15 Tn10 (Tetr)] (Stratagene, США), затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяют препараты плазмидной ДНК с использованием набора Wizard MiniPreps Kit (Promega, США). Полученные образцы ДНК анализируют совместным гидролизом рестриктазами EcoRI/PstI и BamHI/PstI и отбирают «положительные» клоны, содержащие EcoRI/PstI фрагменты размером 1300 и 4100 п.н. При этом за счет делеции сайта BamHI в BamHI/PstI гидролизате ДНК плазмидных клонов присутствует уникальный фрагмент размером 5400 п.н., в то время как в препарате плазмидной ДНК pET21d, гидролизованной BamHI/PstI, обнаруживаются фрагменты размером 1300 и 4100 п.н. Несколько «положительных» клонов проверяют секвенированием с использованием праймеров Т7prom (SEQ ID №9) и T7term (SEQ ID №10) и отбирают клон с модифицированным участком полилинкера, не содержащий неспецифических мутаций, который обозначают как pET21dR1.Using the “inverted PCR” method and primers pETR1_F (SEQ ID No. 7) and pETR1_R (SEQ ID No. 8) on the plasmid matrix pET21d [21] using the Expand Long Template PCR system, a unique PCR fragment of 5.4 kb is obtained, which isolated from agarose gel, as described in example 1. 100 ng of the obtained fragment is hydrolyzed with 5 units of restriction enzyme EcoRI (Fermentas) and ligated with T4 DNA ligase. The competent ligase mixture was transformed with competent cells of the Escherichia coli strain XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacI q Z □ M15 Tn10 (Tet r )] (Stratagene, USA), then from the obtained ampicillin-resistant transformants plasmid DNA preparations were isolated using the Wizard MiniPreps Kit (Promega, USA). The resulting DNA samples were analyzed by co-hydrolysis with restriction enzymes EcoRI / PstI and BamHI / PstI and "positive" clones containing EcoRI / PstI fragments of 1300 and 4100 bp were selected. Moreover, due to deletion of the BamHI site in the BamHI / PstI plasmid clone DNA hydrolyzate, a unique fragment of 5400 bp is present, while fragments of 1300 and 4100 bp are detected in the preparation of plasmid DNA pET21d hydrolyzed by BamHI / PstI. Several “positive” clones were verified by sequencing using T7prom primers (SEQ ID NO: 9) and T7term (SEQ ID NO: 10) and a clone with a modified polylinker region without nonspecific mutations, which was designated as pET21dR1, was selected.
Б) Конструирование плазмиды pACYCpET.B) Construction of the plasmid pACYCpET.
Для получения производного вектора pET21dRI с репликоном p15A ДНК плазмиды pACYC177 [22] гидролизовали совместно рестриктазами BamHI+PstI и выделяли из агарозного геля фрагмент размером 3000 п.н., включающий область репликона р15А, ген устойчивости к канамицину и С-концевую кодирующую часть гена бета-лактамазы (устойчивости к ампициллину). Плазмиду pET21dR1 гидролизовали совместно BglII+PstI и выделяли из агарозного геля фрагмент размером 1,5 т.п.н., включающий участок полилинкера, промотор и терминатор Т7-фага и N-концевую кодирующую часть гена бета-лактамазы. Два фрагмента лигировали, полученной лигазной смесью трансформировали штамм E. Coli Xl1Blue и отбирали трансформанты, устойчивые одновременно к ампициллину и канамицину.To obtain a derivative of the pET21dRI vector with replicon p15A, plasmid DNA pACYC177 [22] was hydrolyzed together with BamHI + PstI restriction enzymes and a 3000 bp fragment was included from the agarose gel, including the p15A replicon region, kanamycin resistance gene, and C-terminal coding part of the beta gene -lactamases (resistance to ampicillin). The plasmid pET21dR1 was hydrolyzed together with BglII + PstI and a 1.5 kb fragment was isolated from the agarose gel, including the polylinker site, the T7 phage promoter and terminator, and the N-terminal coding part of the beta-lactamase gene. Two fragments were ligated; the E. coli Xl1Blue strain was transformed with the obtained ligase mixture and transformants resistant to ampicillin and kanamycin were selected.
Выделенные из культур полученных клонов плазмидные ДНК анализировали путем рестрикции эндонуклеазой SmaI и отбирали клоны, образующие фрагменты размером 3,2 и 1,2 т.п.н. Один из отобранных клонов обозначили как pACYCpET.Plasmid DNAs isolated from cultures of the obtained clones were analyzed by restriction with SmaI endonuclease and clones were selected to form 3.2 and 1.2 kb fragments. One of the selected clones was designated as pACYCpET.
В) Конструирование вектора pACT7C) Construction of the vector pACT7
Для удаления гена бета-лактамазы из вектора pACYCpET препарат плазмидной ДНК гидролизуют совместно рестриктазами NaeI/FspI, выделяют из агарозного геля фрагмент размером 3,4 т.п.н., лигируют «сам на себя» по «тупым концам» и лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма E.сoli JM109. Из отобранных канамицин-устойчивых и ампициллин-чувствительных трансформантов выделяют плазмидную ДНК и идентифицируют нужный клон по данным рестриктного анализа (наличие фрагментов размером 1,2 и 2,2 т.п.н. в SmaI-гидролизатах препаратов плазмидной ДНК).To remove the beta-lactamase gene from the pACYCpET vector, the plasmid DNA preparation is hydrolyzed together with NaeI / FspI restriction enzymes, a 3.4 kb fragment is isolated from the agarose gel, ligated onto itself at the blunt ends and the ligase mixture is transformed competent cells of E. coli strain JM109. Plasmid DNA is isolated from the selected kanamycin-resistant and ampicillin-sensitive transformants and the desired clone is identified by restriction analysis (the presence of fragments of 1.2 and 2.2 kb in SmaI hydrolysates of plasmid DNA preparations).
Пример 3. Конструирование плазмиды pSVH1811.Example 3. Construction of the plasmid pSVH1811.
Для создания плазмиды, способной направлять синтез BrdGL7ACA-ацилазы в клетках E.coli, проводили встраивание выделенного гена BrdGL7ACA-ацилазы под контроль промотора фага Т7 вектора pACT7.To create a plasmid capable of directing the synthesis of BrdGL7ACA acylase in E. coli cells, the selected BrdGL7ACA acylase gene was inserted under the control of the T7 phage promoter of the pACT7 vector.
Полученный методом ПЦР фрагмент геномной ДНК штамма Brevundiminas diminuta ВКМB-1297 содержит полную кодирующую последовательность BrdGl7ACA-ацилазы и фланкирован уникальными сайтами рестрикции EcoRI и SacI, отсутствующими в кодирующей последовательности гена для последующего направленного его встраивания под контроль промотора Т7 созданных экспрессионных векторов.The PCR fragment of the genomic DNA of the strain Brevundiminas diminuta VKMB-1297 contains the complete coding sequence of BrdGl7ACA acylase and is flanked by the unique restriction sites EcoRI and SacI, which are absent in the coding sequence of the gene for subsequent directed insertion under the control of the T7 promoter of the created expression vectors.
Выделенный из агарозного геля фрагмент гидролизуют рестриктазами EcoRI/SacI и клонируют в EcoRI/SacI вектор pACT7. Отбирают канамицин-устойчивые трансформанты штамма Escherichia coli JM109 по критерию образования фрагментов размером 2,2 и 3,4 т.п.н. в EcoRI/SacI гидролизатах полученных препаратов плазмидной ДНК.The fragment isolated from the agarose gel is hydrolyzed with restriction enzymes EcoRI / SacI and the pACT7 vector is cloned into EcoRI / SacI. Kanamycin-resistant transformants of the Escherichia coli strain JM109 were selected according to the criterion for the formation of fragments 2.2 and 3.4 kb in size. in EcoRI / SacI hydrolysates of the obtained plasmid DNA preparations.
Для селекции клона, несущего вставку с интактным геном BrdGL7ACA-ацилазы без возможных мутаций, привнесенных за счет ПЦР-амплификации, проверяют способность отобранных плазмид направлять синтез функционально-активной BrdGL7ACA-ацилазы при их переносе в штамм E.coli BL21(DE3).To select a clone carrying an insert with the intact BrdGL7ACA acylase gene without possible mutations introduced by PCR amplification, the ability of the selected plasmids to direct the synthesis of functionally active BrdGL7ACA acylases when they are transferred to E. coli BL21 (DE3) strain is tested.
Для этого индивидуальные трансформанты штамма E.coli BL21(DE3), несущие полученные плазмиды, выращивают на LB-среде, содержащей 30 мкг/мл канамицина, в объеме 5 мл до А600 1,0 ОЕ. После этого в культуры вносят ИПТГ до конечной концентрации 1 мкМ и продолжают культивирование в течение 18 часов при температуре 25-30°С. Клетки собирают центрифугированием и проводят определение активности Gl7ACA-ацилазы, для чего используют колориметрический метод, аналогичный методу, предложенному для определения 6-аминопенициллиновой кислоты [24]. 100 мкл 65 мM раствора глутарил-7-АСА в 0.1M фосфатном буфере (рН 7,0) добавляют к 900 мкл суспензии клеток, приготовленной на том же (0,1M фосфатном) буфере, содержащем 3 мг/мл клавулината калия, и инкубируют смесь при 37°С от 30 мин до 4 часов. Через определенные промежутки времени смесь центрифугируют, отбирают 500 мкл супернатанта и смешивают его с 3 мл смеси (2:1) 20% уксусной кислоты и 0,5 М раствора NaOH для остановки реакции. К пробе добавляют 0,5 мл p-диметиламинобензальдегида (PDAB) и после развития окраски измеряют поглощение при 415 нм. За одну единицу активности фермента принимается его количество, необходимое для превращения 1 мкмоль субстрата в указанных условиях в течение 1 мин инкубации.For this, individual transformants of E. coli strain BL21 (DE3) carrying the obtained plasmids are grown on LB medium containing 30 μg / ml kanamycin in a volume of 5 ml to A 600 1.0 OE. After that, IPTG is added to the cultures to a final concentration of 1 μM and cultivation is continued for 18 hours at a temperature of 25-30 ° C. Cells are harvested by centrifugation and the activity of Gl7ACA acylase is determined by using a colorimetric method similar to that proposed for the determination of 6-aminopenicillinic acid [24]. 100 μl of a 65 mM solution of glutaryl-7-ACA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) is added to 900 μl of a cell suspension prepared in the same (0.1M phosphate) buffer containing 3 mg / ml potassium clavulinate, and incubated mixture at 37 ° C for 30 minutes to 4 hours. At certain time intervals, the mixture is centrifuged, 500 μl of the supernatant are taken and mixed with 3 ml of a mixture (2: 1) of 20% acetic acid and 0.5 M NaOH solution to stop the reaction. 0.5 ml of p-dimethylaminobenzaldehyde (PDAB) was added to the sample, and after color development, absorbance was measured at 415 nm. For one unit of activity of the enzyme, the amount required for the conversion of 1 μmol of the substrate under the indicated conditions for 1 minute of incubation is taken.
Уровень определенной таким образом ацилазной активности в проанализированных штаммах колебался от 1,0 ед/мл до примерно 1,4 ед/мл культуры.The level of acylase activity determined in this way in the analyzed strains ranged from 1.0 u / ml to about 1.4 u / ml of culture.
Отобранные «положительные клоны» секвенируют и идентифицируют клон, несущий вставку с интактным геном BrdGl7ACA-ацилазы, кодирующая последовательность которого идентична последовательности, приведенной в перечне последовательностей под номером SEQ ID №5. Плазмиду, выделенную из отобранного клона, обозначают pSVH1811.The selected "positive clones" sequenced and identified a clone carrying an insert with the intact BrdGl7ACA acylase gene, the coding sequence of which is identical to the sequence shown in the sequence listing under the number SEQ ID No. 5. The plasmid isolated from the selected clone is designated pSVH1811.
Пример 4. Конструирование вектора экспрессии гибридного белка BrdGl7ACA-cbdExample 4. Construction of the expression vector of the hybrid protein BrdGl7ACA-cbd
А) Получение промежуточной плазмиды pSVH0107.A) Obtaining an intermediate plasmid pSVH0107.
Для получения вектора, позволяющего осуществлять экспрессию целевого фермента в виде гибрида с хитин-связывающим доменом, сначала проводили олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием набора QuiсkChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, США) и праймеров Apa_up (SEQ ID №11) и Apa_dn (SEQ ID №12) с целью введения сайта Vne1 в 551-554 положение гена ацилазы (SEQ ID №5), находящегося в составе плазмидного вектора pSVH1811.To obtain a vector that allows expression of the target enzyme in the form of a hybrid with a chitin-binding domain, oligonucleotide-directed mutagenesis was first performed using the QuiskChange® Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, USA) and Apa_up primers (SEQ ID No. 11) and Apa_dn (SEQ ID No. 12) to introduce the Vne1 site at 551-554 position of the acylase gene (SEQ ID No. 5), which is part of the plasmid vector pSVH1811.
После проведения реакции смесь очищали от примеси праймеров, используя «Wizard PCR preps Purification System» (Promega, США) и гидролизовали 5 единицами рестриктазы Dpn1 ((Fermentas). Полученной смесью трансформировали компетентные клетки штамма Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIqZ□M15 Tn10 (Tetr)] (Stratagene, США). Из полученных канамицин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора «Wizard MiniPreps Kit» (Promega, США). Полученные образцы ДНК анализировали при помощи ПЦР с праймерами 7АСА_R и BRD2, для чего реакционную смесь разделяли в 1% агарозном геле и выявляли единичный фрагмент размером 1260 п.н. ПЦР-продукт гидролизовали рестриктазой Vne1 и отбирали «положительные» клоны, обнаруживавшие при электрофоретическом разделении 2 фрагмента с размерами 560 и 700 п.н. (в клонах, не содержащих нужный сайт, детектируется только один фрагмент размером 1260 п.н.). Некоторые из «положительных» клонов далее были проверены секвенированием с использованием праймеров 7_АСА_R и BRD2, в результате чего был отбран клон с Vne1-сайтом в положении 551-554 гена ацилазы (SEQ ID №5), не содержащий при этом неспецифических мутаций. Плазмида, выделенная из данного клона, была обозначена как pSVH0107.After the reaction, the mixture was purified from primer impurities using the Wizard PCR preps Purification System (Promega, USA) and hydrolyzed with 5 Dpn1 restriction enzyme units ((Fermentas). The resulting mixture was transformed with competent cells of the Escherichia coli strain XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacI q Z □ M15 Tn10 (Tet r)] (Stratagene, USA). The obtained kanamycin-resistant transformants were isolated preparations of plasmid DNA using the «Wizard MiniPreps Kit» (Promega, USA). The obtained DNA samples were analyzed by PCR with primers 7ACA_R and BRD2, for which the reaction mixture was separated in 1% agarose gel and a single fragment of 1260 bp was detected. The PCR product was hydrolyzed with restriction enzyme Vne1 and "positive" clones were selected that detected 2 fragments with sizes of 560 and 700 bp during electrophoretic separation (in clones that did not contain the desired site, it was detected only one fragment of 1260 bp). Some of the “positive” clones were further verified by sequencing using primers 7_ACA_R and BRD2, as a result of which a clone with a Vne1 site at position 551-554 of the acylase gene was selected (SEQ ID No. 5 ), which does not contain nonspecific human mutations. The plasmid isolated from this clone was designated as pSVH0107.
Б) Выделение последовательности, кодирующей CBD домен хитиназы A1 B.circulans.B) Isolation of the sequence encoding the CBD domain of B. chirculans chitinase A1.
В качестве источника гена CBD домена хитиназы A1 B.circulans использовали плазмиду pTYB4 (New England Biolabs). C помощью праймеров СBD_F (SEQ ID №13) и CBD_R (SEQ ID №14) на матрице пламиды pTYB4 с использованием Pfu-полимеразы получали уникальный ПЦР фрагмент размером 0,2 т.п.н.Plasmid pTYB4 (New England Biolabs) was used as a source of the CBD gene of the B. chircinans A1 chitinase A1 domain. Using primers CBD_F (SEQ ID No. 13) and CBD_R (SEQ ID No. 14) on a pTYB4 plasmid matrix using Pfu polymerase, a unique 0.2 kb PCR fragment was obtained.
Фрагмент выделяли из геля с помощью набора «Wizard PCR Preps Kit» (Promega, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя и подвергали автоматическому секвенированию на приборе ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с использованием праймеров СBD_F и CBD_R и набора Applera «fluorescent Big dye Cycle sequencing kit». Полученная последовательность (SEQ ID №15) соответствует последовательности, кодирующей CBD-домен хитиназы А1.The fragment was isolated from the gel using the Wizard PCR Preps Kit (Promega, USA) in accordance with the manufacturer's instructions and subjected to automatic sequencing on an ABIPrizm 3100 DNA Sequencer using CBD_F and CBD_R primers and the Applera fluorescent Big dye Cycle sequencing kit kit ". The resulting sequence (SEQ ID No. 15) corresponds to the sequence encoding the CBD domain of chitinase A1.
В) Получение плазмиды pSVH0108.B) Obtaining plasmid pSVH0108.
Последовательность, кодирующую гибридный белок BrdGl7ACA-cbd, получали путем объединения содержащегося в векторе pSVH0107 фрагмента, кодирующего BrdGl7ACA и включающего дополнительный сайт Vne1, и фрагмента, кодирующего СВD-домен (см. выше).The sequence encoding the BrdGl7ACA-cbd fusion protein was obtained by combining the fragment encoding BrdGl7ACA and the additional Vne1 site contained in the pSVH0107 vector and the fragment encoding the CBD domain (see above).
Для этого 2 мкг плазмидной ДНК pSVH0107 гидролизовали рестриктазой Vne1, дефосфорилировали с помощью фосфатазы кишки теленка для предотвращения замыкания вектора «сам на себя» и выделяли из агарозного геля фрагмент размером 5,6 т.п.н. 5 мкл смеси использовали для трансформации компетентных клеток штамма E.сoli JM109 [19].For this, 2 μg of plasmid DNA pSVH0107 was hydrolyzed with restriction enzyme Vne1, dephosphorylated with calf intestine phosphatase to prevent self-looping of the vector, and a 5.6 kb fragment was isolated from the agarose gel. 5 μl of the mixture was used to transform competent cells of E. coli strain JM109 [19].
ПЦР фрагмент, кодирующий CBD-домен, также гидролизовали рестриктазой Vne1. Использовали следующие условия лигирования: 1 мкл вектора (20 нг/мкл), 1 мкл фрагмента (50 нг/мкл), 2 мкл 5-кратного лигазного буфера (Gibco-BRL), 5 мкл воды и 1 мкл Т4 ДНК лигазы (1 ед/мкл, Сибэнзим). Смесь инкубировали в течение 14 часов при 12°С, затем прогревали 15 мин при 65°С, охлаждали во льду.The PCR fragment encoding the CBD domain was also digested with restriction enzyme Vne1. The following ligation conditions were used: 1 μl vector (20 ng / μl), 1 μl fragment (50 ng / μl), 2 μl 5x ligase buffer (Gibco-BRL), 5 μl water and 1 μl T4 DNA ligase (1 unit / μl, Sibenzyme). The mixture was incubated for 14 hours at 12 ° C, then heated for 15 min at 65 ° C, cooled in ice.
Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма Escherichia coli XL1-Blue. Из полученных канамицин-устойчивых трансформантов выделяли плазмидную ДНК и отбирали «положительные» клоны методом ПЦР-скрининга с праймерами BRD2 и CBD_F по образованию ПЦР-продукта размером 1000 п.н.The competent ligase mixture was transformed with competent cells of the Escherichia coli strain XL1-Blue. Plasmid DNA was isolated from the obtained kanamycin-resistant transformants and “positive” clones were selected by PCR screening with BRD2 and CBD_F primers to produce a 1000 bp PCR product.
Несколько «положительных» клонов дополнительно проверяли сиквенированием и отбирали клон с инсерцией CBD-кодирующего фрагмента, не содержащий неспецифических мутаций. Полученную из него плазмиду обозначили как pSVH0108 (фиг.2). Данная плазмида содержала последовательность, кодирующую полный гибридный белок BrdGl7ACA-cbd (SEQ ID №16), который представляет собой аминокислотную последовательность глутарил ацилазы со вставкой CBD-домена в С-концевую область области альфа-субъединицы между аминокиcлотами R184 и T185.Several “positive” clones were further checked by sequencing and a clone with the insertion of a CBD coding fragment containing no non-specific mutations was selected. The plasmid obtained from it was designated as pSVH0108 (FIG. 2). This plasmid contained the sequence encoding the complete BrdGl7ACA-cbd fusion protein (SEQ ID NO: 16), which is the amino acid sequence of glutaryl acylase with the CBD domain inserted into the C-terminal region of the alpha subunit region between amino acids R184 and T185.
Пример 5. Получение рекомбинантного штамма-продуцента BrdGl7ACA-cbd.Example 5. Obtaining a recombinant producer strain of BrdGl7ACA-cbd.
Полученной рекомбинантной плазмидой pSVH0108 трансформировали штамм E.coli BL21 (DE3) [21] [F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), dcm, gal (DE3)].The recombinant plasmid pSVH0108 transformed the E. coli strain BL21 (DE3) [21] [F-, ompT, hsdS B (r B- , m B- ), dcm, gal (DE3)].
Поскольку первичные трансформанты DE3 - реципиентов могут заметно отличаться по уровню экспрессии целевого белка [25], для селекции наиболее активного продуцента белка BrdGl7ACA-cbd отдельные клоны трансформантов выращивали в предварительно определенных, оптимальных для продукции Gl7ACA-ацилазы условиях: клетки вносили в 50 мл среды LB, культивировали при температуре 25°С до 1,0 ОЕ при А600, после чего добавляли индуктор ИПТГ до конечной концентрации 0,2 мМ и продолжали инкубацию в течение 22 часов. Периодически отбирали аликвоты суспензии клеток выросших индивидуальных трансформантов и использовали их для определения параметров роста культуры и активности фермента. Для получения грубого экстракта осадок клеток разрушали ультразвуком с периодическим охлаждением во льду (4×30 сек с интервалом 1 мин). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием. Для определения активности фермента, которое проводили, как описано в примере 3, использовали 50 мкл полученного осветленного лизата.Since the primary transformants of DE3 recipients can differ markedly in the level of expression of the target protein [25], to select the most active producer of the BrdGl7ACA-cbd protein, individual transformant clones were grown under predefined conditions optimal for the production of Gl7ACA acylase: cells were introduced into 50 ml of LB medium , cultivated at a temperature of 25 ° C to 1.0 OE at A 600 , after which an IPTG inducer was added to a final concentration of 0.2 mM and incubation continued for 22 hours. Aliquots of cell suspensions of grown individual transformants were periodically selected and used to determine culture growth parameters and enzyme activity. To obtain a coarse extract, the cell pellet was destroyed by ultrasound with periodic cooling in ice (4 × 30 sec with an interval of 1 min). Cell debris was removed by centrifugation. To determine the activity of the enzyme, which was carried out as described in example 3, used 50 μl of the resulting clarified lysate.
Удельную активность выражали в единицах активности фермента (количество мкмолей субстрата в мин при 25°С) на мг общего белка осветленного экстракта. Содержание общего белка определялось методом Брэдфорда [19].The specific activity was expressed in units of enzyme activity (the number of micromoles of substrate per min at 25 ° C) per mg of total protein of the clarified extract. The total protein content was determined by the Bradford method [19].
На основании полученных данных был отобран трансформант №3, отличающийся лучшим накоплением биомассы и более высоким выходом функционально-активного фермента (Таблица 1). Он был обозначен BL21 (DE3)/pSVH0108 и использован в дальнейшей работе для накопления культуры и получения рекомбинантного штамма.Based on the obtained data, transformant No. 3 was selected, characterized by better biomass accumulation and a higher yield of functionally active enzyme (Table 1). It was designated BL21 (DE3) / pSVH0108 and was used in further work to accumulate culture and obtain a recombinant strain.
культуры, А600Height
Culture, A600
Пример 6. Частичная очистка гибридного белка BrdGl7ACA-cbd и его иммобилизация на хитиновом сорбенте.Example 6. Partial purification of the BrdGl7ACA-cbd fusion protein and its immobilization on a chitin sorbent.
Достаточно высокий уровень экспрессии вариантов глутарил-ацилазы в полученном штамме в определенной степени упростил задачу разработки методики частичной очистки гибридного белка, которую осуществляли, как описано ниже. Полученную биомассу рекомбинантного штамма (5 г) суспендировали в 20 мл буфера А (100 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 10 мМ ЕДТА, 0,3% цетилтриметил аммоний бромид (СТАВ), 2% глицерин) и разрушали ультразвуковой дезинтеграцией. Супернатант собирали, дебрис после промывания тем же буфером отбрасывали. Балластные белки из супернатанта осаждали сульфатом аммония при 35% насыщении, рекомбинантную BrdGl7ACA-cbd получали в виде осадка при насыщении сульфатом аммония 60%. Осадок растворяли в 10 мл буфера Б (10 мМ пирофосфат натрия, рН 8,0, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 2 мМ ЕДТА, 10% глицерин, 300 мМ NaCl) и наносили на колонку с хитиновыми гранулами (2×5 см). Колонку промывали буфером Б до исчезновения поглощения при А280, отбирали аликвоту сорбента и использовали для определения активности ацилазы и общего белка. Этапы очистки и иммобилизации отражены в Таблице 2. Методом электрофореза мы установили достаточно высокую чистоту рекомбинатной ацилазы, состоящей из двух субъединиц: бета - 54 кДа и альфа+CBD - 20 кДа.A sufficiently high level of expression of glutaryl acylase variants in the obtained strain to some extent simplified the task of developing a method for partial purification of a hybrid protein, which was carried out as described below. The resulting recombinant strain biomass (5 g) was suspended in 20 ml of buffer A (100 mm sodium phosphate, pH 8.0, 5 mm 2-mercaptoethanol, 10 mm EDTA, 0.3% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), 2% glycerol) and destroyed by ultrasonic disintegration. The supernatant was collected, debris after washing with the same buffer was discarded. Ballast proteins from the supernatant were precipitated with ammonium sulfate at 35% saturation, recombinant BrdGl7ACA-cbd was obtained as a precipitate when saturated with ammonium sulfate 60%. The precipitate was dissolved in 10 ml of buffer B (10 mm sodium pyrophosphate, pH 8.0, 5 mm 2-mercaptoethanol, 2 mm EDTA, 10% glycerol, 300 mm NaCl) and applied to a column with chitin granules (2 × 5 cm). The column was washed with buffer B until absorption disappeared at A280, an aliquot of the sorbent was taken and used to determine the activity of acylase and total protein. The stages of purification and immobilization are shown in Table 2. By electrophoresis, we established a rather high purity of the recombinant acylase consisting of two subunits: beta - 54 kDa and alpha + CBD - 20 kDa.
Полученные данные позволяют сделать вывод, что в составе созданной конструкции химерного белка полностью сохраняются свойства обеих полипептидных составляющих.The data obtained allow us to conclude that the properties of both polypeptide components are fully preserved in the structure of the created design of the chimeric protein.
осадок (60%)Ammonium sulphate
precipitate (60%)
Пример 7. Характеристика рекомбинантного штамма E.coli BL21(DE3)/ pSVH0108.Example 7. Characterization of a recombinant strain of E. coli BL21 (DE3) / pSVH0108.
Клетки полученного рекомбинантного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/ pSVH0108 характеризуется следующими признаками.The cells of the obtained recombinant strain of Escherichia coli BL21 (DE3) / pSVH0108 are characterized by the following features.
Морфологические признаки Клетки имеют продолговатую палочковидную форму, при делении не почкуются.Morphological characters Cells have an elongated rod-shaped shape; they are not budded during division.
Культуральные признакиCultural signs
Клетки хорошо растут на обычно используемых питательных средах. Время генерации около 30 мин в жидкой LB-среде. На 2-2,5% питательном агаре "Difco" образуются круглые, гладкие, желтоватые колонии с ровными краями. При выращивании на жидких LB- и YT-средах образуется интенсивная ровная мутность.Cells grow well on commonly used culture media. The generation time is about 30 minutes in a liquid LB medium. On 2-2.5% nutrient agar "Difco" round, smooth, yellowish colonies with smooth edges are formed. When grown on liquid LB and YT media, intense even turbidity forms.
Физиолого-биохимические признакиPhysiological and biochemical characteristics
Оптимальная температура культивирования - от 25 до 30°C, оптимум рН - 7,6. Источником азота служат органические соединения (в виде триптона, дрожжевого экстракта).The optimum cultivation temperature is from 25 to 30 ° C, the optimum pH is 7.6. The source of nitrogen is organic compounds (in the form of tryptone, yeast extract).
Уровень синтеза BrdGl7ACA-cbd в сконструированном штамме составляет около 100 мг/л при титре культуры 1×109 кл/мл, что следует из данных определения GL7ACA-ацилазы в образцах биомассы штамма-продуцента с помощью специфической ферментативной реакции. Величина удельной активности гибридного белка BrdGl7ACA-cbd составляет около 10000 мЕ/мг белка (Таблица 2) и близка к показателю удельной активности очищенных препаратов рекомбинантных «немодифицированных» Gl7ACA-ацилаз, описаных ранее [9-12, 15].The synthesis level of BrdGl7ACA-cbd in the constructed strain is about 100 mg / L with a culture titer of 1 × 10 9 cells / ml, which follows from the determination of GL7ACA-acylase in biomass samples of the producer strain using a specific enzymatic reaction. The specific activity of the BrdGl7ACA-cbd fusion protein is about 10,000 mU / mg of protein (Table 2) and is close to the specific activity of the purified preparations of recombinant “unmodified” Gl7ACA acylases described previously [9-12, 15].
Cписок цитированных источниковList of cited sources
1. Matsuda, A. & Komatsu, K.I. Molecular cloning and structure of the gene for 7 beta-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 163, 1222-1228 (1985).1. Matsuda, A. & Komatsu, K.I. Molecular cloning and structure of the gene for 7 beta- (4-carboxybutanamido) cephalosporanic acid acylase from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 163, 1222-1228 (1985).
2. Arroyo, M., de, 1.M., I, Acebal, C., & Castillon, M.P. Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 507-514 (2003).2. Arroyo, M., de, 1.M., I, Acebal, C., & Castillon, M.P. Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 507-514 (2003).
3. Valle, F., Balbas, P., Merino, E., & Bolivar, F. The role of penicillin amidases in nature and in industry. Trends Biochem. Sci. 16, 36-40 (1991).3. Valle, F., Balbas, P., Merino, E., & Bolivar, F. The role of penicillin amidases in nature and in industry. Trends Biochem. Sci. 16, 36-40 (1991).
4. Barber, M.S., Giesecke, U., Reichert, A., & Minas, W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 88, 179-215 (2004).4. Barber, M.S., Giesecke, U., Reichert, A., & Minas, W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 88, 179-215 (2004).
5. Kumar, K.K., Sudhakaran, V., Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., & Shewale, J.G. Cephalosporin acylases: enzyme production, structure and application in the production of 7-ACA. Hindustan Antibiot. Bull.35, 111-125 (1993).5. Kumar, K.K., Sudhakaran, V., Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., & Shewale, J.G. Cephalosporin acylases: enzyme production, structure and application in the production of 7-ACA. Hindustan Antibiot. Bull. 35, 111-125 (1993).
6. Parmar, A., Kumar, H., Marwaha, S.S., & Kennedy, J.F. Recent Trends in Enzymatic Conversion of Cephalosporin C to 7-Aminocephalosporanic Acid (7-ACA). Critical Reviews in Biotechnology 18, 1-12 (1998).6. Parmar, A., Kumar, H., Marwaha, S.S., & Kennedy, J.F. Recent Trends in Enzymatic Conversion of Cephalosporin C to 7-Aminocephalosporanic Acid (7-ACA). Critical Reviews in Biotechnology 18, 1-12 (1998).
7. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Ono, H., Kojo, H., Kohsaka, M., Ueda, Y., & Imanaka, H. Cloning and nucleotide sequencing of a novel 7 beta-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase gene of Bacillus laterosporus and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 7848-7855 (1991).7. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Ono, H., Kojo, H., Kohsaka, M., Ueda, Y., & Imanaka, H. Cloning and nucleotide sequencing of a novel 7 beta- (4-carboxybutanamido) cephalosporanic acid acylase gene of Bacillus laterosporus and its expression in Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173, 7848-7855 (1991).
8. Battistel, E., Bianchi, D., Bortolo, R., & Bonoldi, L. Purification and stability of glutaryl-7-ACA acylase from Pseudomonas sp.Appl. Biochem. Biotechnol. 69, 53-67 (1998).8. Battistel, E., Bianchi, D., Bortolo, R., & Bonoldi, L. Purification and stability of glutaryl-7-ACA acylase from Pseudomonas sp.Appl. Biochem. Biotechnol. 69, 53-67 (1998).
9. Lee, Y.S. & Park, S.S. Two-step autocatalytic processing of the glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase from Pseudomonas sp. strain GK16. J. Bacteriol. 180, 4576-4582 (1998).9. Lee, Y.S. & Park, S.S. Two-step autocatalytic processing of the glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase from Pseudomonas sp. strain GK16. J. Bacteriol. 180, 4576-4582 (1998).
10. Li, Y., Jiang, W., Yang, Y., Zhao, G., & Wang, E. Overproduction and purification of glutaryl 7-amino cephalosporanic acid acylase. Protein Expr. Purif. 12, 233-238 (1998).10. Li, Y., Jiang, W., Yang, Y., Zhao, G., & Wang, E. Overproduction and purification of glutaryl 7-amino cephalosporanic acid acylase. Protein Expr. Purif. 12, 233-238 (1998).
11. Ishiye, M. & Niwa, M. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the cephalosporin acylase gene of a Pseudomonas strain. Biochim. Biophys. Acta 1132, 233-239 (1992).11. Ishiye, M. & Niwa, M. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the cephalosporin acylase gene of a Pseudomonas strain. Biochim. Biophys. Acta 1132, 233-239 (1992).
12. Wang, E.D., Zheng, Y.G., Li, Y., Jiang, W.H., & Yang, Y.L. Expression of gene encoding GL-7ACA acylase in Escherichia coli. Sheng Wu Hua Xue. Yu Sheng Wu Wu Li Xue. Bao. (Shanghai) 34, 526-531 (2002).12. Wang, E.D., Zheng, Y.G., Li, Y., Jiang, W.H., & Yang, Y.L. Expression of gene encoding GL-7ACA acylase in Escherichia coli. Sheng Wu Hua Xue. Yu Sheng Wu Wu Li Xue. Bao. (Shanghai) 34, 526-531 (2002).
13. Sassenfeld HM. Engineering proteins for purification. Trends Biotechnol., 8, 88-93 (1990).13. Sassenfeld HM. Engineering proteins for purification. Trends Biotechnol., 8, 88-93 (1990).
14. Garcia Lopez et all. Process for modifying the enzyme 7 beta-(4-carboxybutanamido) cephalosporinacylase and purifying said enzyme in single chromatographic step. European patent EP 0839914, 1997-10-30.14. Garcia Lopez et all. Process for modifying the enzyme 7 beta- (4-carboxybutanamido) cephalosporinacylase and purifying said enzyme in single chromatographic step. European patent EP 0839914, 1997-10-30.
15. Kim, J.K., Yang, I.S., Rhee, S., Dauter, Z., Lee, Y.S., Park, S.S., & Kim, K.H. Crystal structures of glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase: insight into autoproteolytic activation. Biochemistry 42, 4084-4093 (2003).15. Kim, J.K., Yang, I.S., Rhee, S., Dauter, Z., Lee, Y.S., Park, S.S., & Kim, K.H. Crystal structures of glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase: insight into autoproteolytic activation. Biochemistry 42, 4084-4093 (2003).
16. Lee, Y.S., Kim, H.W., Lee, K.B., & Park, S.S. Involvement of arginine and tryptophan residues in catalytic activity of glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase from Pseudomonas sp.strain GK16. Biochim. Biophys. Acta 1523, 123-127 (2000).16. Lee, Y.S., Kim, H.W., Lee, K.B., & Park, S.S. Involvement of arginine and tryptophan residues in catalytic activity of glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase from Pseudomonas sp.strain GK16. Biochim. Biophys. Acta 1523, 123-127 (2000).
17. Kim, Y. & Hol, W.G. Structure of cephalosporin acylase in complex with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid and glutarate: insight into the basis of its substrate specificity. Chem.Biol. 8, 1253-1264 (2001).17. Kim, Y. & Hol, W.G. Structure of cephalosporin acylase in complex with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid and glutarate: insight into the basis of its substrate specificity. Chem. Biol. 8, 1253-1264 (2001).
18. Studier FW, Moffatt BA Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-30 (1986).18. Studier FW, Moffatt BA Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189, 113-30 (1986).
19. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989].19. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989].
20. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., & Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1997).20. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1997).
21. pET System Manual, 10th Edition Rev. B 0403, Novagen Inc. (2003)21. pET System Manual, 10th Edition Rev. B 0403, Novagen Inc. (2003)
22. Rose, R.E. The nucleotide sequence of pACYC177. Nucleic Acids Res. 16, 356 (1988).22. Rose, R.E. The nucleotide sequence of pACYC177. Nucleic Acids Res. 16, 356 (1988).
23. Reece, K.S. & Phillips, G.J. New plasmids carrying antibiotic-resistance cassettes. Gene 165, 141-142(1995).23. Reece, K.S. & Phillips, G.J. New plasmids carrying antibiotic-resistance cassettes. Gene 165, 141-142 (1995).
24. Balasingham, K., Warburton, D., Dunnill, P., & Lilly, M.D. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 276, 250-256 (1972).24. Balasingham, K., Warburton, D., Dunnill, P., & Lilly, M.D. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 276, 250-256 (1972).
25. Vethanayagam J., Flower A. Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase. Microbial Cell Factories 4, 3-10 (2005).25. Vethanayagam J., Flower A. Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase. Microbial Cell Factories 4, 3-10 (2005).
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006123901/13A RU2388826C2 (en) | 2006-07-05 | 2006-07-05 | RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2006123901/13A RU2388826C2 (en) | 2006-07-05 | 2006-07-05 | RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2006123901A RU2006123901A (en) | 2008-01-10 |
| RU2388826C2 true RU2388826C2 (en) | 2010-05-10 |
Family
ID=39019964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2006123901/13A RU2388826C2 (en) | 2006-07-05 | 2006-07-05 | RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2388826C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2447149C1 (en) * | 2011-03-24 | 2012-04-10 | Винсорт Менеджемент Инк | RECOMBINANT PLASMID DNA pMSIN4, CODING HYBRIDE POLYPEPTIDE - HUMAN INSULIN PRECURSOR, BL21(DE3)VpMSIN4-PRODUCER STRAIN OF RECOMBINANT HUMAN INSULIN, METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HUMAN INSULIN |
| RU2624022C1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-06-30 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Modified ras gene of escherichia coli bacterium, coding precursor of enzyme with penicillin g acylase activity, recombinant escherichia coli strain - producer of acylase penicillin g and method for microbiological synthesis of this enzyme |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2499047C1 (en) * | 2012-09-24 | 2013-11-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Recombinant plasmid, recombinant strain, recombinant protein bmp-7 and extraction method of recombinant protein in dimeric form |
| RU2499048C1 (en) * | 2012-09-24 | 2013-11-20 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Recombinant plasmid, recombinant strain, recombinant protein bmp-2 and extraction method of recombinant protein in dimeric form |
-
2006
- 2006-07-05 RU RU2006123901/13A patent/RU2388826C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DATABASE GenBank Ac.no * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2447149C1 (en) * | 2011-03-24 | 2012-04-10 | Винсорт Менеджемент Инк | RECOMBINANT PLASMID DNA pMSIN4, CODING HYBRIDE POLYPEPTIDE - HUMAN INSULIN PRECURSOR, BL21(DE3)VpMSIN4-PRODUCER STRAIN OF RECOMBINANT HUMAN INSULIN, METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT HUMAN INSULIN |
| RU2624022C1 (en) * | 2015-11-20 | 2017-06-30 | Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук (ФИЦ Биотехнологии РАН) | Modified ras gene of escherichia coli bacterium, coding precursor of enzyme with penicillin g acylase activity, recombinant escherichia coli strain - producer of acylase penicillin g and method for microbiological synthesis of this enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2006123901A (en) | 2008-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Volontè et al. | Optimization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase expression in E. coli | |
| KR101728906B1 (en) | A mutant enzyme for production of cephalosporin antibiotics | |
| AU718648B2 (en) | Mutant penicillin G acylases | |
| CN106906236B (en) | Sialidase gene recombinant expression vector and construction method thereof, sialidase and preparation method thereof | |
| JP3016449B2 (en) | Cephalosporin C acylase | |
| WO2017143945A1 (en) | Cephalosporin c acylase mutant | |
| CN109971743B (en) | Penicillin G acylase mutant derived from achromobacter CCM4824 and application thereof | |
| JP2007502108A (en) | Cephalosporin C acylase mutant and method for producing 7-ACA using the mutant | |
| KR20050074313A (en) | Cephalosporin c acylases | |
| RU2388826C2 (en) | RECOMBINANT DNA, WHICH CODES FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN GL7ACA-ACYLASE WITH CHITIN-BINDING DOMAIN (BrdGL7ACA-cbd) AND RECOMBINANT PLASMID pSVH0108, PROVIDING FOR ITS SYNTHESIS IN CELLS Escherichia coli, RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0108-PRODUCER BrdGL7ACA-cbd | |
| CN1062903C (en) | A new cephalosporin C acylase | |
| CN117070500A (en) | Beta-xylosidase mutant D485G with improved thermal stability and application thereof | |
| CN111172142A (en) | Cephalosporin C acylase mutant with high thermal stability | |
| WO2018165881A1 (en) | Cephalosporin c acylase mutants and applications thereof | |
| CN110129305B (en) | Cephalosporin C acylase mutant for preparing 7-ACA | |
| CN108660127A (en) | The penicillin G acylation zymogen and its coded sequence of a kind of engineer and application | |
| Khatuntseva et al. | Cloning and expression of variants of the glutaryl-7-aminocephalosporic acid acylase of the bacterium Brevundimonas diminuta in Escherichia coli cells | |
| KR102405289B1 (en) | Polypeptide having cephalosporin c acylase activity and use thereof | |
| RU2300566C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pSVH0106 PROVIDING SYNTHESIS OF Gl7ACA ACYLASE IN Escherichia coli CELLS, RECOMBINANT STRAIN OF Escherichia coli BL21(DE3)/pSVH0106 AS PRODUCER OF Gl7ACA ACYLASE | |
| RU2310688C1 (en) | RECOMBINANT DNA ENCODING FUNCTIONALLY ACTIVE HYBRID PROTEIN OF D-AMINO ACID OXYDASE WITH CHITIN-COUPLING DOMAIN (DAOcbd), pVR1 RECOMBINANT PLASMID PROVIDING SYNTHESIS THEREOF IN Escherichia coli CELLS AND RECOMBINANT Escherichia coli STRAIN C 41 (DE3)/pVR1 AS PRODUCER OF DAOcbd | |
| US20060292665A1 (en) | Glutaryl amidases and their uses | |
| CN114807102B (en) | Ethanol-resistant amidase, gene, expression vector, engineering bacterium, preparation method and application | |
| Wen et al. | Expression, purification, and characterization of His-tagged penicillin G acylase from Kluyvera citrophila in Escherichia coli | |
| Kim et al. | One-step purification of poly-his tagged penicillin G acylase expressed in E. coli | |
| WO2009013611A2 (en) | Modified esterase and its applications |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA94 | Acknowledgement of application withdrawn (non-payment of fees) |
Effective date: 20080512 |
|
| FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20080512 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180928 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200706 |